Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез кулланган браузер версиясе CSS өчен чикләнгән ярдәмгә ия. Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та яраклашу режимын сүндерегез). Шул ук вакытта, ярдәмне дәвам итәр өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Ystпкә кистик фиброз авыруларын дәвалау өчен ген векторлары үткәргеч һава юлларына юнәлтелергә тиеш, чөнки периферик үпкә трансдуктивлыгы терапевтик файда китерми. Вируслы үткәрү эффективлыгы векторның яшәү вакыты белән турыдан-туры бәйле. Шулай да, ген йөртүчеләр кебек җибәрү сыеклыклары илһам вакытында альвеолларга таралалар, һәм магнитлы транспортта магнитлы транспорт. airава юллары өслегенә юнәлтелгән кисәкчәләр региональ максатчанлыкны яхшырта ала. Виво визуализация проблемаларына туры китереп, кулланылган магнит кыры булган һава юлындагы мондый кечкенә магнит кисәкчәләренең үз-үзен тотышы начар аңлашыла. Бу тикшерүнең максаты синхротрон картинасын куллану иде, аннары магнит кисәкчәләренең виво хәрәкәтен күз алдына китерү. магнит кыры булганда лентивираль магнит кисәкчәләре тычкан трахеясында үткәрү эффективлыгын арттырыр иде. Синхротрон рентген тасвирламасы магнит кисәкчәләренең витрода һәм вивода стационар һәм хәрәкәт итүче магнит кисәкчәләренең тотышын ачыклый. Магнит кыры. Бергәләп, бу нәтиҗәләр лентивираль магнит кисәкчәләре һәм магнит кырлары ген векторын адреслауны яхшырту һәм вивода һава юлларын үткәрүдә транскодукция дәрәҗәсен күтәрү өчен кыйммәтле алым булырга мөмкинлеген күрсәтәләр.
Кистик фиброз (CF) CF трансмембрана үткәрү регуляторы (CFTR) дип аталган бер генның үзгәрүеннән килеп чыга. CFTR протеины - ион каналы, ул организмның күп эпителий күзәнәкләрендә, шул исәптән һава юлларын үткәрүдә, CF патогенезының төп мәйданы. сулышлы кисәкчәләрне һәм патогеннарны һава юлларыннан чистарту өчен былжыр транспорт (MCT) системасы. Безнең максат - CFTR генның дөрес күчермәсен китерү өчен, лентивираль (LV) ген терапиясен үстерү һәм ASL, MCT, үпкә сәламәтлеген яхшырту, һәм vivo1 бу параметрларны үлчәү сәләтле яңа технологияләр эшләүне дәвам итү.
LV векторлары CF һава юллары ген терапиясе өчен алдынгы кандидатларның берсе, чөнки алар терапевтик генны һава базаль күзәнәкләренә (һава юллары клеткалары) берләштерә алалар .Бу мөһим, чөнки алар гадәти гидратлашуны һәм былжырны чистартуны торгыза алалар, нәтиҗәдә гомер буе файда китерәләр. альвеолар трансдуктивлыкка китерергә мөмкин, ләкин моның CF-та бернинди терапевтик файдасы юк. Шулай да, ген йөртүчеләр кебек сыеклыклар табигый рәвештә альвеолларга күченеп китәләр3,4 һәм терапевтик кисәкчәләр тиз арада авыз куышына MCT.LV трансдуктив эффективлыгы турыдан-туры бәйле, вектор максатчан күзәнәкләр янында калалар, шулай ук ​​кәрәзле агымны киметәләр. CF, һава юлында LV яшәү вакытын озайту сәләте бу төбәктә югары трансдуктивлыкка ирешү өчен мөһим, ләкин әлегә кадәр авыр.
Бу каршылыкны җиңәр өчен, без LV магнит кисәкчәләре (MP) ике тулыландыручы ысул белән булышырга тәкъдим итәбез. Беренчедән, алар магнит белән һава юлына юнәлтелергә мөмкин, максатчанлыкны яхшырту һәм ген йөртүче кисәкчәләре кирәкле һава өлкәсендә яшәргә булышу; һәм ASL) күзәнәк катламына күчү өчен 6.МПлар антителаларга, химиотерапевтик препаратларга яки күзәнәк мембраналарына бәйләнгән яки күзәнәк өслеге рецепторларына бәйләнгән һәм статик электр булганда шеш урыннарында тупланган наркотиклар җибәрү өчен киң кулланылган. Яман шешне дәвалау өчен магнит кырлары 7. Башка "гипертермаль" ысуллар депутатларны осли торган магнит кырларына эләктереп җылытырга, шуның белән шеш күзәнәкләрен җимерергә омтылалар. Магнит трансфекциясе принцибы, магнит кыры күзәнәкләргә ДНК күчерүне көчәйтү өчен кулланыла, витрода вирус булмаган һәм вируслы ген векторлары кулланыла. LV-MPs кеше бронхиаль эпителий күзәнәк сызыгына статик магнит кыры булганда, LV векторы белән чагыштырганда 186 тапкыр арткан. LV-MP шулай ук ​​витро CF моделенә кулланылган, монда магнит трансфекциясе һава-сыек интерфейс культураларында LV трансдукциясен 20 тапкырга арттырган, ләкин виво магнитотрансфекциядә аз бәяләнгән. Тикшеренүләр11,12,13,14,15, аеруча үпкәләрдә 16,17. Шуңа да карамастан, үпкә терапиясендә магнит трансфекцияләү мөмкинлекләре ачык. Тан һ.б.
Кулланылган магнит кыры булганда һава магниты кисәкчәләренең тәртибен күз алдына китерү һәм өйрәнү авыр, һәм шулай итеп начар аңлашыла. Башка тикшеренүләрдә без синхротрон-пропагандалау нигезендә фаз-контраст рентген тасвирлау (ПБ-PCXI) ысулын эшләдек, ASL тирәнлегендә виво үзгәрүендә минутны саныйбыз. Алумина яки югары рефактив индекс пыяладан торган 10–35 мм диаметр кисәкчәләрен куллана, PB-PCXI21 ярдәмендә күренгән MCT маркерлары. Ике техника да кисәкчәләр төрләрен визуальләштерү өчен яраклы, шул исәптән MP.
Highгары киңлек һәм вакытлы резолюция аркасында, безнең PB-PCXI нигезендәге ASL һәм MCT анализлау ысуллары вивода бер һәм күп кисәкчәләр тотышының динамикасын һәм үрнәкләрен тикшерү өчен бик яраклы. Без монда кулланган ысул Спринг-8 BL20B2 нур сызыгын күзәтәбез, шомлы векторлы дымлы генны аңлатабыз. безнең ген йөртүче дозада хайваннарны өйрәнү 3,4.
Бу тикшерүнең максаты - синхротрон PB-PCXI куллану, тере тычкан трахеясында бер төркем депутатларның виво хәрәкәтен күз алдына китерү. Бу PB-PCXI сурәтләү тикшеренүләре берничә депутатны, магнит кырының көчләрен, һәм аларның MP хәрәкәтенә тәэсирен ачыклау өчен эшләнгән. Без гипотеза ясадык. трахеяда сакланган кисәкчәләр саны. Икенче тикшеренүләр сериясендә, без LV-MP-ны тычкан һава юлына виво китереп чыгару нәтиҗәсендә, бу оптималь конфигурацияне кулланырга омтылдык, LV-MP-ларны һава юлларын адреслау контекстында китерү LV трансдуктив эффективлыгын яхшыртачак дигән фаразга нигезләнеп.
Барлык хайваннарны өйрәнү Аделаида Университеты (M-2019-060 һәм M-2020-022) һәм SPring-8 Синхротрон Хайваннар Этикасы Комитеты раслаган протоколлар нигезендә үткәрелде. Экспериментлар ARRIVE күрсәтмәләре нигезендә үткәрелде.
Барлык рентген күзәтү Япониядәге SPring-8 синхротронындагы BL20XU нурында башкарылды, моңа кадәр тасвирланган охшаш көйләү ярдәмендә. Кыскасы, эксперименталь тартма синхротрон саклагыч боҗрасыннан 245 м ераклыкта урнашкан. югары резолюцияле рентген конвертер (SPring-8 BM3) sCMOS детекторына кушылган. Конвертер рентген нурларын 10 мм калынлыктагы ссинтилатор (Gd3Al2Ga3O12) ярдәмендә күренеп торган яктылыкка әйләндерә, аннары SCMOS сенсорына × 10 микроскоп максаты (NA 0.3). 2048 × 2048 пиксель һәм чимал пиксель зурлыгы 6,5 × 6,5 мм. Бу көйләү эффектив изотропик пиксель зурлыгы 0,51 мм һәм якынча 1,1 мм × 1,1 мм күренеш мәйданын күрсәтә. 100 мс озынлыктагы экспозиция озынлыгы магнит кисәкчәләренең сигнал-шу коэффициентын максимумлаштыру өчен сайланган. Рентген нуры экспозиция арасындагы рентген нурларын блоклап чикләү.
LV ташучы бернинди SPring-8 PB-PCXI сурәтләү тикшеренүләрендә кулланылмады, чөнки BL20XU сурәтләү камерасы биосефетия дәрәҗәсе 2 сертификаты түгел. Моның урынына без ике коммерция тәэмин итүчесеннән яхшы характерлы депутатлар сайлап алдык - зурлыклар, материаллар, тимер концентрацияләре һәм кушымталар - башта магнит кырларының пыяла капиллярлар эчендә MP хәрәкәтенә ничек тәэсир итүен аңлау өчен. ММП зурлыгы 0,25-18 мм тәшкил итә һәм төрле материаллардан ясала (1 таблицаны карагыз), ләкин һәр үрнәкнең составы, шул исәптән депутат эчендәге магнит кисәкчәләренең зурлыгы, билгеле түгел. Безнең киң колачлы МКТ тикшеренүләре нигезендә 19, 20, 21, 23, 24, без 5 мм зурлыктагы депутатлар трахеаль һава юлының бер-бер артлы күренүен күрәбез. μm зурлыктагы MP сурәтләү җайланмасы резолюциясеннән кечерәк, ләкин PB-PCXI аларның күләм контрастын һәм өстән сыеклыкның хәрәкәтен ачыклар дип көтелә.
1 таблицада һәр MP өчен үрнәкләр 20 μл пыяла капиллярларда (Друммонд Микрокапс, ПА, АКШ) эчке диаметры 0,63 мм булган. Корпускуляр кисәкчәләр суда бар, ә CombiMag кисәкчәләре җитештерүченең сыеклыгында бар. сыеклыкның читләрен урнаштырдылар. 19 мм диаметрлы (28 мм озынлыктагы) никель кабыгы сирәк җир неодий тимер бор (NdFeB) магнит (N35, мәче. LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) 1,17 калдыклы магнитлаштыру белән Тесла аерым тәрҗемә этабына куелган, якынча 30 мм сүрәтләнгән вакытта. секундына кадрлар. Тасвирлама вакытында магнит пыяла капилляр трубасына якын китерелде (якынча 1 мм ераклыкта), аннары кыр көче һәм позиция эффектларын бәяләү өчен труба буенча тәрҗемә ителде.
Xy тәрҗемә стадиясендә пыяла капиллярларда MP үрнәкләрен үз эченә алган витро тасвирлау. Рентген нуры юлы кызыл сызык белән билгеләнгән.
Депутатларның витро күренеше булдырылганнан соң, аларның бер өлеше кыргый типтагы хатын-кыз альбино Вистар тычканнарында (weeks 12 атна, ~ 200 г) вивода сынадылар. Фарма катнашмасы белән анестезияләнгән), Япония) интерперитон инъекциясе белән. Анестезиядән соң, алар трахея тирәсендәге мехны чыгарып, эндотрахеаль труба (ET; 16 Ga iv каннула, Терумо БКТ) куеп, супинны иммобилизацияләделәр. трахея рентген рәсемендә горизонталь, 2а рәсемдә күрсәтелгәнчә.
а) SPring-8 сүрәтләү тартмасындагы виво тасвирлама көйләүдә рентген нуры кызыл сызык белән билгеләнә.
100 μл пыяла шприц кулланып, ерактан идарә ителә торган шприц насос системасы (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 30 Га энә аша PE10 торбасына (ОД 0.61 мм, ID 0,28 мм) тоташтырылды. Депутат үрнәгендә китерелергә тиеш. Йөкләнгән тапшыру трубасы эндотрахеаль трубага кертелде, без көткән магнит кырының иң көчле өлешенә урнаштырылды. Күрсәтү алу безнең Arduino нигезендәге вакыт тартмасына тоташтырылган сулыш детекторы ярдәмендә контрольдә тотылды, һәм барлык сигналлар (мәсәлән, температура, сулыш алу, ябык ачу һәм ябу һәм рәсем алу) Powerlab һәм LabChart булганда (AD Instruments). .
Магнит икенче этапка бәйләнгән, ул картиналардан читтә урнашырга мөмкин. Төрле магнит позицияләре һәм конфигурацияләре сынадылар, шул исәптән: трахеядан якынча 30 ° почмакка куелган (2а һәм 3а рәсемнәрдә күрсәтелгән конфигурацияләр); бер магнит хайван өстендә, икенчесе аста, җәлеп итәр өчен куелган баганалар белән (3б рәсем); бер магнит хайван өстендә, икенчесе аста, баганаларны кире кагарга куелган (3с рәсем); һәм өстендә бер магнит һәм трахеяга перпендикуляр (3d рәсем) .Хайван һәм магнит конфигурацияләнгәннән һәм сыналачак MP шприц насосына салынганнан соң, 50 μл дозаны 4 μl / сек тизлектә китерегез. Рәсемнәр алуны дәвам иткәндә.
Виво тасвирлау өчен магнит конфигурациясе (а) трахея өстендә якынча 30 ° почмакта, б) ике магнит җәлеп итәр өчен, в) ике магнитны куып чыгарырга, г) трахеяда бер магнитны һәм перпендикулярны күзәтүче авыз астыннан үпкәләргә трахея аша күчте, һәм рентген нуры сул ягы белән күчте. һава юлы яки сул һәм уң трахея өстендә рентген нуры юнәлешендә.
Без шулай ук ​​сулыш һәм йөрәк хәрәкәте булмаган очракта һава юлларында кисәкчәләрнең күренүен һәм тәртибен ачыкларга тырыштык. Шуңа күрә, сурәтләү чоры ахырында хайваннар пентобарбитал дозасы өчен кеше үтерелделәр (Сомнопентил, Питман-Мур, Вашингтон Кросс, АКШ; ~ 65 мг / кг ip.). Депутат һава юлында күренде.
Алынган рәсемнәр яссы кырлы һәм кара кырлы төзәтелгәннәр, аннары кинога җыелганнар (секундына 20 кадр; сулыш тизлегенә карап 15-25 × нормаль тизлек) MATLAB (R2020a, The Mathworks) язылган махсус сценарий ярдәмендә.
Барлык LV ген векторларын тапшыру тикшеренүләре Аделаида Университетының Лаборатория Хайваннарны Тикшерү Корылмасында үткәрелде һәм SPring-8 эксперименты нәтиҗәләрен магнит кыры булганда LV-MP тапшыру вивода ген күчерүне көчәйтә аламы-юкмы икәнен бәяләү өчен кулланылды.
LV ген векторлары алдан тасвирланган 25, 26 ысуллар ярдәмендә ясалган. LacZ векторы MPSV промоутеры (LV-LacZ) белән идарә итүче атом-локальләштерелгән бета-галактозида генын белдерә, үпкә тукымалары фронтларында һәм тукымалар бүлекчәләрендә күренеп тора. TU / мл. Карьерлар -80 ° C температурада сакланган, кулланылганчы эретелгән, һәм CombiMag белән 1: 1 нисбәтендә катнашып, бозга 30 минут кала инкубацияләп бәйләнгән.
Нормаль Спрага Давли тычканнары (n = 3 / төркем, ~ 2-3) антезизацияләнде, 0,4 мг / кг медетомидин (Домитор, Илиум, Австралия) һәм 60 мг / кг кетамин (Илиум, Австралия) ай) ip) инъекция һәм хирургик булмаган авыз каннуляциясе 16 Га iv каннуласы белән. пертурбация протоколы, анда трахеаль һава юлы өслеге чыбык кәрзин белән сөртелгән (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, АКШ) 30 s28. LV-MP трахеаль администрациясе пертурбациядән соң якынча 10 минуттан соң биологик куркынычсызлык кабинетында башкарылды.
Бу экспериментта кулланылган магнит кыры виво рентген сүрәтләү өйрәнүенә охшаш итеп конфигурацияләнде, шул ук магнитлар трахея өстендә дистиллировать стент клипларын кулланып үткәрелде (4 нче рәсем). LV-MPның 50 μл күләме (2 × 25 μл аликот) трахеяга (n = 3 хайван) алдан ук тасвирланган гель очлары булган пипетаны кулланып. Магнит. Инфузия тәмамланганнан соң, каннула ET трубасыннан чыгарыла һәм хайван киңәйтелә. Магнит 10 минут дәвамында тора, аннары ул чыгарыла. Кычытканнар мелоксикамның туб асты дозасын алдылар (Илиум, Австралия), аннары анестезияне кире кайтардылар, антипазоллы гидрохлорид. анестезиядән тулысынча торгызылганчы.
Биологик куркынычсызлык шкафында LV-MP тапшыру җайланмасы. ET трубасының ачык соры Луер хабы авыздан чыкканын күрергә мөмкин һәм рәсемдә күрсәтелгән торбаның гел очлары ET трубасы аша трахеяга кирәкле тирәнлеккә кертелә.
LV-MP дозалау процедурасыннан бер атна үткәч, хайваннар 100% CO2 ингаляциясе белән кеше үтерелделәр һәм LacZ экспрессиясе безнең стандарт X-гал эшкәртү ярдәмендә бәяләнде. Өч каудаль кариллагин боҗрасы анализга кертелмәгән механик зыян яки сыеклыкның саклануы анализга кертелмәде. Dow Inc) луминаль өслекне күз алдына китерү өчен Minutien энә (Нәфис Фән Кораллары) кулланып. Трансдуктив күзәнәкләрнең таралуы һәм үрнәге Никон микроскопы (SMZ1500) ярдәмендә DigiLite камерасы һәм TCapture программасы (Tucsen Photonics, Китай) ярдәмендә фронталь фотография белән расланды. рәсемне "тегү" өчен рөхсәт итәр өчен, һәр рәсем арасында җитәрлек каплануны тәэмин итү .Аннан соң һәр трахеядан сурәтләр планлы хәрәкәт алгоритмы ярдәмендә Image Composite Editor v2.0.3 ярдәмендә бер композицион рәсемгә җыелдылар. LacZ экспрессия өлкәләре трахеяның композицион рәсемнәрендә моңарчы M35LAB скрипты кулланылды. 0,58, туендыру> 0,15, һәм кыйммәт <0.7. Тукыманың контурларын күзәтеп, тукымалар өлкәсен ачыклау һәм трахеаль тукымалардан читтә булган ялган ачыклаудан саклап калу өчен, GIMP v2.10.24 маска кул белән ясалды.
Eachәр трахея парафинга салынган һәм 5 мм бүлекчәләр киселгән. Секцияләр нейтраль тиз кызыл белән 5 минутка каршы тордылар һәм Nikon Eclipse E400 микроскопы, DS-Fi3 камерасы һәм NIS элементларын алу программасы ярдәмендә рәсемнәр алынды (5.20.00 версия).
Барлык статистик анализлар да GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) Статистика әһәмияте p ≤ 0.05 итеп куелды. Шапиро-Вилк тесты ярдәмендә нормальлек тикшерелде, һәм LacZ буяудагы аермалар яраксыз т-тест ярдәмендә бәяләнде.
1-нче таблицада сурәтләнгән алты депутат PCXI ярдәмендә тикшерелде, һәм күренүчәнлек 2-таблицада тасвирланган. Ике полистирол MP (MP1 һәм MP2; тиешенчә 18 μm һәм 0,25 μm) PCXI астында күренмәгән, ләкин калган үрнәкләр ачыкланган (мисаллар 5-нче рәсемдә күрсәтелгән) .MP3 һәм MP4 (10-15% Fe3O4 күренеп тора). сыналган иң кечкенә кисәкчәләр, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мм) иң ачык күренде. CombiMag продукт MP6ны табу авыр. Барлык очракларда да MPны табу сәләтебез магнитны капиллярга параллель тәрҗемә итү ярдәмендә сизелерлек артты. капиллярның өске өслеге (өстәмә видео S1: MP4 карагыз), өслекнең кисәкчәләр тыгызлыгын арттырыгыз. Киресенчә, магнит капиллярдан алынгач, кыр көче кими һәм депутатлар капиллярның өске өслегеннән озын сызыкларга үзгәрәләр (өстәмә видео S2: MP4 карагыз). капиллярның өске өслегеннән ерак, магнит кисәкчәләре чүп-чарны сыеклык аша алып китәләр.
PCXI астында MP-ның күренүчәнлеге үрнәкләр арасында сизелерлек үзгәрә. барлык фигуралардагы схемалар масштабланырга тиеш түгел һәм күрсәтелгәннән якынча 100 тапкыр зуррак.
Магнит капиллярның өске ягына сулга һәм уңга тәрҗемә ителгәндә, MP сызыгы почмагы магнит белән тигезләнү өчен үзгәрә (6-нчы рәсемне кара), шулай итеп магнит кыры сызыкларын билгели. MP3-5 өчен, аккорд бусага почмагына җиткәч, кисәкчәләр капиллярның өске өслегенә тартыла. Депутатларның сыек-һава интерфейсында туплануына һәм туплануына китерә торган капиллярлы очка якынрак сурәтләнгәндә ачык күренә. MP3-5-дән аеру авыррак булган MP6 кисәкчәләре магнит капилляр буйлап хәрәкәтләнгәч тартылмады, ләкин MP сызыклары аерылды, кисәкчәләр күренү кырында зур булган, магнитны күчергәндә зур булган. калган депутатлар әкрен генә трубаның аскы өслегенә төштеләр, чыбыкта калган вакытта (өстәмә видео S5: MP3 карагыз).
MP сызыгы почмагы үзгәрә, чөнки магнит капиллярның уң ягына тәрҗемә ителә. (A) MP3, (b) MP4, (c) MP5 һәм (d) MP6.
Безнең сынаулар күрсәткәнчә, магнитны трахея буйлап әкрен-артка күчерү виводагы катлаулы хәрәкәт контекстында MP-ны визуализацияләүне җиңеләйтә. Виво тест үткәрү капиллярда күренмәгәнгә, калган дүрт депутатның һәрберсе вивода сыналган, магнитның озын күчәре 3 градуска кадәр булган. Магнит конфигурациясе беткәнгә караганда эффективрак. MP3, MP4 һәм MP6 тере хайваннар трахеясында табылмады. Хайваннар кеше үтерелгәннән соң, тычкан һава юллары күз алдына китерелгәч, шприц насосы ярдәмендә өстәмә күләм өстәлгәндә дә кисәкчәләр күренми калдылар.
Депутатлар тапшыру вакытында магнитны трахея өстенә кую, күпчелек, ләкин барысы да түгел, депутатларның караш өлкәсендә туплануына китерде. Трахеяга кергән кисәкләр кеше корбаннары хайваннарында иң яхшы күзәтелә. 7 нче рәсем һәм өстәмә видео S6: MP5 тиз магнит тотуны һәм вентраль трахея өслегендә кисәкчәләрнең тигезләнүен күрсәтә. Депутатлар каринага якынрак табылды, магнит кыры көче барлык депутатларны җыю һәм саклап калу өчен җитәрлек түгел, чөнки алар сыеклык процессында максималь магнит кыры өлкәсе аша китерелгән. Шуңа да карамастан, бала тудырудан соң MP концентрацияләре имидж өлкәсе тирәсендә югарырак иде, бу күпчелек депутатларның кулланылган магнит кыры көче булган һава юлларында калганнарын күрсәтә.
Күптән түгел эйтанланган тычкан трахеясына (а) алдан һәм б) рәсемнәр магнит белән турыдан-туры сурәтләү өлкәсе өстендә урнашкан. Күрсәтелгән мәйдан ике кычыткан боҗрасы арасында урнашкан. Депутат тапшыру алдыннан, һава юлында ниндидер сыеклык бар.
Магнитны трахея буйлап вивога тәрҗемә итү MP чылбырының капиллярлардагы охшаш тәртиптә һава чылбыры почмагын үзгәртүенә китерде (8 нче рәсем һәм өстәмә видео S7: MP5 карагыз). Ләкин, безнең тикшерүдә, депутатларны тере һава юлы өстенә тартып алып булмый, алар капиллярлар белән үзгәрә. Магнит трахея буйлап озынлыкка күчерелгәндә, өслек сыеклык катламының тирәнлеге, һәм магнит турыдан-туры өскә күчкәндә һәм кисәкчәләр сызыгы вертикаль позициягә борылганда киңәя (өстәмә видео S7 карагыз). . MP пыяла капиллярында кулланылган магнит кыры астында күзәткән MP тәртибенә туры килә.
Тере наркозланган тычкан трахеясында MP5 күрсәтүче үрнәк рәсемнәр. А) Магнит трахеяның өстендә һәм сул ягында сурәтләр алу өчен кулланыла, аннары (б) магнит уңга күчерелгәннән соң. Кызыл тартмада контраст-көчәйтүче зурлау бар. Бу рәсемнәр өстәмә видео S7: MP5 күрсәтелгән видеодан.
Ике багана трахеяның өстендә һәм астыннан төньяк-көньяк юнәлештә конфигурацияләнгәндә (ягъни җәлеп итү; 3б рәсем), MP аккордлары дорсаль трахеаль өслектә түгел, ә трахея кырыенда урнашканнар (өстәмә видео S9: MP5 карагыз). кулланыла, бу гадәттә бер магнитлы җайланма кулланылганда була. Аннары бер магнит кире баганаларны кире кайтару өчен конфигурацияләнгәндә (3-нче рәсем), күренеш өлкәсендә күренгән кисәкчәләр саны китерелгәннән соң артмый кебек. Ике магнитлы конфигурацияне көйләү авыр магнит кыры аркасында магнитны тартып яки этеп җибәрә. сызыклар трахеаль стенаны ортогональ рәвештә кичтеләр (3-нче рәсем), як дивардагы кисәкчәләр агрегаты күзәтелә аламы-юкмы икәнен ачыклау өчен эшләнгән юнәлеш .Бу конфигурациядә MP туплау яки магнит хәрәкәтенең ачыкланмаган хәрәкәте юк иде.
Кеше үтерүдән соң хайван берничә тапкыр сурәтләнгәндә, буталчык тукымалар хәрәкәтенең булмавы, магнитның тәрҗемә хәрәкәтенә туры китереп, чиста интерхондраль кырда нечкә һәм кыска кисәкчәләр сызыкларын күреп була. Шуңа да карамастан, MP6 кисәкчәләренең булуын һәм хәрәкәтен әле дә ачык күрә алмыйм.
LV-LacZ титеры 1,8 × 108 TU / мл иде, һәм CombiMag MP (MP6) белән 1: 1 кушылганнан соң, хайваннар 9 × 107 TU / мл LV машинасының 50 μл трахеаль дозасын алдылар (ягъни 4,5 × 106 TU / тычкан). ) .Бу тикшеренүләрдә, магнитны эш вакытында тәрҗемә итү урынына, без магнитны бер позициядә урнаштырдык, LV трансдуктивы (а) магнит кыры булмаганда вектор җибәрү белән чагыштырганда яхшыра аламы, һәм (б) юнәлешле һава юллары күзәнәкләре югары һава юлының магнит максатлы өлкәләренә күчерелә.
Магнитлар булу һәм CombiMag куллану LV векторлары белән берлектә, безнең LV вектор җибәрү протоколы кебек үк, хайваннар сәламәтлегенә начар йогынты ясамады. Механик пертбурациягә дучар булган трахеаль өлкәнең фронталь рәсемнәре LV-MP белән эшкәртелгән хайваннар төркемендә транскодукциянең зур дәрәҗәләрен күрсәттеләр (9-нчы рәсем). контроль төркем (9б рәсем). Нормальләштерелгән X-Gal тапланган урыннарны квантлаштыру күрсәтте, LV-MP магнит кыры булганда якынча 6 тапкыр яхшырту китерде (9с рәсем).
LV-MP (а) магнит кыры булганда һәм б) магнит булмаганда трахеаль транскодукцияне күрсәтүче композицион рәсемнәр үрнәге.
Нейтраль тиз кызыл төсле бүлекләр (өстәмә рәсемдә күрсәтелгән мисал) LacZ-төсле күзәнәкләрне күрсәттеләр, алда хәбәр ителгәнчә охшаш үрнәктә һәм урында.
Airава юллары ген терапиясе өчен төп проблема ташучы кисәкчәләрне кызыклы төбәкләргә төгәл локализацияләү һәм һава агымы һәм былжырдан арыну булганда хәрәкәтләнүче үпкәдә югары дәрәҗәдәге трансдуктив эффективлыкка ирешү булып кала. CF һава юллары авыруларын дәвалау өчен эшләнгән LV йөртүчеләре өчен һава юллары эчендә йөртүче кисәкчәләренең яшәү вакытын арттыру. Кастеллани һ.б. электропорация, чөнки ул гадилекне, чыгым-эффективлыкны, тапшыруны локализацияләүне, эффективлыкны арттыруны һәм инкубация вакытын кыскартырга мөмкин, һәм, бәлки, кечерәк йөртүче дозасы10. Шулай да, тышкы магнит көчләре тәэсирендә һава юлларында магнит кисәкчәләренең виво чүпләнеше һәм тотышы беркайчан да тасвирланмаган, һәм бу ысулның мөмкинлеге тере һава юлларында ген экспрессия дәрәҗәсен күтәрү өчен күрсәтелмәгән.
Безнең витро синхротрон PCXI экспериментлары шуны күрсәтте: без тикшергән барлык кисәкчәләр, полистирол MPдан кала, без кулланган сурәтләү корпусында күренде. Магнит кыры булганда, депутатлар озынлык кисәкчәләр тибы һәм магнит кыры көче белән бәйләнгән сызыклар ясыйлар (ягъни магнитның якынлыгы һәм хәрәкәте). бүтән кисәкчәләрнең җирле җәлеп итүчән һәм репрессив көчләреннән җирле көчләр аркасында төркемчәләргә охшаган хәрәкәтләр белән тупланырга һәм тоташырга.
Схематик күрсәтү (а, б) сыеклык белән тутырылган капиллярлар эчендә барлыкка килгән кисәкчәләр поездлары һәм (в, г) һава белән тутырылган трахея. Игътибар итегез, капиллярлар һәм трахеялар масштабка тартылмыйлар.
Магнит капилляр өстендә күчерелгәндә, кисәкчәләр сызыгы почмагы MP3-5 өчен Fe3O4 булган критик бусагага җитте, аннан соң кисәкчәләр чыбыклары элеккеге хәлдә калмады, ләкин өслек буенча яңа позициягә күчте. surfaceир өсте корылмалары, яки йөртүче ташучы сыеклык аларның хәрәкәт итү сәләтенә тәэсир иттеләр. CombiMag кисәкчәләренең сурәт контрасты да көчсезрәк, сыеклык һәм кисәкчәләр охшаш тыгызлыкка ия ​​булырга мөмкин, шуңа күрә бер-берсенә җиңел генә хәрәкәт итмәскә мөмкин. Магнит кыры көче шулай ук ​​сыеклыкның кисәкчәләре арасындагы сүрелүне җиңә алмавын күрсәтә. тәкъдим итегез, магнитлар максатчан мәйдан аша агучы күп депутатларны кулга алса да, CombiMag кисәкчәләрен трахея өслегенә күчерү мөмкин түгел. Шуңа күрә без нәтиҗә ясыйбыз: VV LV-MP тикшеренүләре статистик магнит кырларын һава юлының агачларының аерым өлкәләренә юнәлтергә тиеш.
Тәнгә кисәкчәләр китерелгәч, аларны катлаулы хәрәкәт тукымасы контекстында ачыклау кыен, ләкин аларны ачыклау сәләте магнитны трахея өстендә горизонталь рәвештә MP кылларын "селкетү" өчен көчәйтелде. Тере сурәтләү мөмкин булса да, хайван кеше үтерелгәннән соң, кисәкчәләр хәрәкәтен ачыклау җиңелрәк. витро тикшеренүләренә, кисәкчәләрне магнитны тәрҗемә итеп трахея буйлап тартып алып булмый. Бу табыш трахея өслеген каплаган былжыр гадәттә сулыш кисәкчәләрен эшкәртә, аларны былжырга каплый һәм соңыннан былжыр чистарту механизмы белән чистартыла.
Без фаразладык, трахея өстендә һәм аста тарту өчен магнитлар куллану (3б рәсем) бер магнит кырына түгел, ә бердәм магнит кырына китерергә мөмкин, бу кисәкчәләрнең бертөрле таралышына китерергә мөмкин. Шулай да, безнең башлангыч тикшерүебез бу гипотезаны раслаучы ачык дәлилләр тапмады. икеләтә магнит урнаштыру MP адреслау җирле контролен сизелерлек яхшыртмый, һәм килеп чыккан көчле магнит көчләрен конфигурацияләү авыр, бу ысулны практик кулланмый. Шул ук вакытта, магнитны трахея аша юнәлтү (рәсем 3d) шулай ук ​​сурәтләнгән өлкәдә сакланган кисәкчәләр санын арттырмады. 3а) виво тестта иң җиңел һәм иң эффектив ысул булып санала.
LV-MP тикшерүе күрсәткәнчә, LV векторлары CombiMag белән кушылып, магнит кыры булганда физик пертурбациядән соң китерелгәндә, трахеяда контроль белән чагыштырганда сизелерлек арткан. Синхротрон сурәтләү тикшеренүләре һәм LacZ нәтиҗәләре нигезендә, магнит кыры LV-ны саклап кала алган, һәм үпкә тирәнлегенә үтеп керә торган вектор кисәкчәләре санын киметә ала. максатсыз трансдуктивлык, ялкынсыну һәм иммун тискәре эффектлар, һәм ген йөртүче чыгымнары. Иң мөһиме, җитештерүче сүзләре буенча, CombiMag башка ген тапшыру ысуллары белән берлектә, шул исәптән башка вируслы векторлар (AAV кебек) һәм нуклеин кислоталары белән дә кулланылырга мөмкин.