Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS өчен чикләнгән ярдәм күрсәтелә. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без сезгә яңартылган браузер кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, ярдәмне дәвам итү өчен, без сайтны стильләрсез һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Муковисцидозлы үпкә авыруын дәвалау өчен ген векторлары үткәрүче сулыш юлларына юнәлтелергә тиеш, чөнки периферик үпкә трансдукциясе терапевтик файда китерми. Вирус трансдукциясенең нәтиҗәлелеге векторның яшәү вакытына турыдан-туры бәйле. Ләкин, ген йөртүчеләр кебек сыеклыклар сулыш алу вакытында альвеолаларга табигый рәвештә тарала, һәм теләсә нинди формадагы терапевтик кисәкчәләр мукоцилиар транспорт белән тиз арада чыгарыла. Ген йөртүчеләрнең сулыш юлларында яшәү вакытын озайту мөһим, ләкин моңа ирешү авыр. Сулыш юллары өслегенә юнәлтелергә мөмкин булган ген йөртүчеләр белән конъюгацияләнгән магнит кисәкчәләре региональ максатчанлыкны яхшырта ала. In vivo визуализацияләү кыенлыклары аркасында, кулланылган магнит кыры булганда сулыш юллары өслегендәге мондый кечкенә магнит кисәкчәләренең үз-үзен тотышы начар аңлашыла. Бу тикшеренүнең максаты - анестезияләнгән тычканнарның трахеясендә магнит кисәкчәләре сериясенең in vivo хәрәкәтен визуализацияләү өчен синхротрон сурәтләүне куллану, in vivo аерым һәм күләмле кисәкчәләрнең үз-үзен тотышы динамикасын һәм үрнәкләрен тикшерү. Аннары без шулай ук ​​магнит кыры булганда лентивируслы магнит кисәкчәләрен китерү тычканнарда трансдукция нәтиҗәлелеген арттырачакмы-юкмы икәнен бәяләдек. трахея. Синхротрон рентген сурәтләү магнит кисәкчәләренең стационар һәм хәрәкәтләнүче магнит кырларында in vitro һәм in vivo үз-үзен тотышын күрсәтә. Кисәкчәләрне магнитлар белән тере һава юлы өслеге буйлап җиңел сөйрәп алып булмый, ләкин ташу вакытында утырмалар магнит кыры иң көчле булган күрү кырында тупланган. Лентивирус магнит кисәкчәләре магнит кыры булганда китерелгәндә, трансдукция нәтиҗәлелеге дә алты тапкыр арткан. Бу нәтиҗәләр бергәләп лентивирус магнит кисәкчәләре һәм магнит кырлары ген векторын максатчан куллануны яхшырту һәм in vivo үткәргеч һава юлларында трансдукция дәрәҗәсен арттыру өчен кыйммәтле алымнар булырга мөмкин дип күрсәтә.
Муковисцидоз (КФ) CF трансмембраналы үткәрүчәнлек регуляторы (CFTR) дип аталган бер генның үзгәрүе аркасында килеп чыга. CFTR аксымы - организмдагы күп эпителий күзәнәкләрендә, шул исәптән үткәргеч һава юлларында, урнашкан ион каналы, бу КФ патогенезының төп урыны. CFTR җитешсезлекләре су ташуның аномаль булуына, һава юллары өслеген сусызландыруга һәм һава юллары өслеге сыеклыгы (ASL) катламының тирәнлеген киметүгә китерә. Бу шулай ук ​​мукоцилиар транспорт (MCT) системасының сулыш юлларыннан ингаляцияләнгән кисәкчәләрне һәм патогеннарны чистарту сәләтен какшата. Безнең максатыбыз - CFTR генының дөрес күчермәсен бирү һәм ASL, MCT һәм үпкә сәламәтлеген яхшырту өчен лентивирус (LV) ген терапиясен эшләү, һәм бу параметрларны in vivo1 үлчәү сәләтенә ия яңа технологияләрне эшләүне дәвам итү.
Сол култык векторлары CF һава юлы ген терапиясе өчен төп кандидатларның берсе булып тора, нигездә, алар терапевтик генны һава юлы базаль күзәнәкләренә (һава юлы күзәнәк күзәнәкләренә) даими рәвештә интеграцияли алалар. Бу мөһим, чөнки алар функциональ геннар белән төзәтелгән CF белән бәйле һава юлы өслеге күзәнәкләренә дифференциацияләнеп, нормаль гидратацияне һәм лайла чистартуын торгыза алалар, бу гомерлек файда китерә. Сол култык векторлары үткәрүче һава юлына каршы юнәлтелергә тиеш, чөнки нәкъ менә монда CF үпкә авыруы башлана. Векторны үпкәгә тирәнрәк кертү альвеоляр трансдукциягә китерергә мөмкин, ләкин моның CF өчен терапевтик файдасы юк. Ләкин, ген йөртүчеләр кебек сыеклыклар, бала тудырганнан соң сулыш алганда альвеолаларга табигый рәвештә күчә3,4 һәм терапевтик кисәкчәләр MCT ярдәмендә тиз арада авыз куышлыгына чыгарыла. Сол култык трансдукциясенең нәтиҗәлелеге турыдан-туры векторның максатлы күзәнәкләр янында калу вакыты озынлыгына бәйле, бу күзәнәкнең үзләштерүенә мөмкинлек бирә - "тору вакыты"5 - ул гадәти региональ һава агымы, шулай ук ​​координацияләнгән кисәкчәләрнең лайла тотуы һәм MCT белән җиңел генә кими. Сол култык венасы өчен, сул култык венасы эчендә тору вакытын озайту мөмкинлеге бу өлкәдә югары дәрәҗәдәге трансдукциягә ирешү өчен мөһим, ләкин шулай... бик катлаулы булды.
Бу киртәне җиңү өчен, без сол карынча магнит кисәкчәләренең (СМ) ике өстәмә ысул белән ярдәм итә алуын фаразлыйбыз. Беренчедән, аларны магнит ярдәмендә һава юллары өслегенә юнәлтергә мөмкин, максатчанлыкны яхшырту һәм ген йөртүче кисәкчәләрнең теләгән һава юллары өлкәсендә урнашуына ярдәм итү өчен; һәм ASL) күзәнәк катламына күчү өчен 6.СМлар антитәнчекләргә, химиотерапевтик препаратларга яки күзәнәк мембраналарына яки күзәнәк өслеге рецепторларына бәйләнгән һәм статик электр булганда шеш урыннарында тупланучы башка кечкенә молекулаларга бәйләнгәндә, даруларны максатчан җиткерү чаралары буларак киң кулланыла. Яман шешне дәвалау өчен магнит кырлары 7. Башка "гипертермаль" ысуллар тирбәлүче магнит кырларына дучар булганда MPларны җылытуга, шуның белән шеш күзәнәкләрен юк итүгә юнәлтелгән. ДНКны күзәнәкләргә күчерүне көчәйтү өчен магнит кыры трансфекция агенты буларак кулланыла торган магнит трансфекция принцибы гадәттә in vitro шартларында төрле вируслы булмаган һәм вируслы ген векторларын кулланып кулланыла. LV магнитотрансфекциясенең нәтиҗәлелеге расланган, статик магнит кыры булганда LV-MPларны кеше бронхиаль эпителий күзәнәк линиясенә in vitro китерү, LV векторы белән генә чагыштырганда трансдукция нәтиҗәлелеген 186 тапкыр арттыра. LV-MP шулай ук ​​in vitro CF моделенә дә кулланылган, анда магнит трансфекциясе CF какырыгы булганда һава-сыеклык чикләрендә LV трансдукциясен 20 тапкыр арттырган10. Ләкин, органнарны in vivo магнитотрансфекцияләүгә аз игътибар бирелгән һәм ул берничә хайванда гына бәяләнгән. тикшеренүләр11,12,13,14,15, бигрәк тә үпкәләрдә16,17. Шулай да, CF үпкә терапиясендә магнит трансфекциясе мөмкинлекләре ачык. Тан һ.б. (2020) "магнит нанокисәкчәләрен үпкәгә нәтиҗәле китерүнең концепциясен исбатлау тикшеренүе CFTR ингаляция стратегияләре өчен юл ачачак, CF пациентларында клиник нәтиҗәләрне яхшырту өчен"6 дип белдерделәр.
Кулланылган магнит кыры булганда һава юллары өслекләрендә кечкенә магнит кисәкчәләренең үз-үзен тотышын күз алдына китерү һәм өйрәнү авыр, шуңа күрә алар начар аңлашыла. Башка тикшеренүләрдә без синхротрон таралуга нигезләнгән фазалы-контрастлы рентген сурәтләү (PB-PCXI) ысулын эшләдек, ул ASL тирәнлегендәге18 һәм MCT үз-үзен тотышындагы19,20 вак үзгәрешләрне инвазив булмаган рәвештә күз алдына китерү һәм санлаштыру өчен кулланыла, бу газ каналы өслеге гидратациясен турыдан-туры үлчәү өчен кулланыла һәм дәвалау нәтиҗәлелегенең иртә күрсәткече буларак кулланыла. Моннан тыш, безнең MCT бәяләү ысулы PB-PCXI21 ярдәмендә күренерлек MCT маркерлары буларак алюминий оксидыннан яки югары сыну күрсәткече пыяладан торган 10–35 мкм диаметрлы кисәкчәләрне куллана. Ике ысул да төрле кисәкчә төрләрен, шул исәптән MPны визуализацияләү өчен яраклы.
Югары киңлек һәм вакыт чишелеше аркасында, безнең PB-PCXI нигезендәге ASL һәм MCT анализ ысуллары in vivo шартларында аерым һәм күп күләмле кисәкчәләрнең үз-үзен тотышы динамикасын һәм үрнәкләрен тикшерү өчен бик уңайлы, бу безгә MP геннарын җиткерү ысулларын аңларга һәм оптимальләштерергә ярдәм итә. Монда без кулланган ысул SPring-8 BL20B2 нур сызыгы ярдәмендә үткәрелгән тикшеренүләрдән килеп чыга, анда без тычканнарның борын һәм үпкә тын юлларына ялган вектор дозасын җиткергәннән соң сыеклык хәрәкәтен күз алдына китердек, бу безнең ген йөртүче дозалы хайваннар тикшеренүләрендә күзәтелгән тигез булмаган ген экспрессия үрнәкләрен аңлатырга ярдәм итә 3,4.
Бу тикшеренүнең максаты - тере тычканнарның трахеясендәге берничә MP хәрәкәтен in vivo визуализацияләү өчен синхротрон PB-PCXI куллану иде. Бу PB-PCXI сурәтләү тикшеренүләре MP хәрәкәтенә йогынтысын билгеләү өчен төрле MP диапазонын, магнит кыры көчләрен һәм урнашуларын тикшерү өчен эшләнгән. Без тышкы кулланылыштагы магнит кыры бирелгән MPның максатлы өлкәдә калырга яки хәрәкәт итәргә ярдәм итәчәк дип фаразладык. Бу тикшеренүләр шулай ук ​​​​безгә утыртылганнан соң трахеяда сакланган кисәкчәләр санын максимальләштерә торган магнит конфигурацияләрен ачыкларга мөмкинлек бирде. Икенче тикшеренүләр сериясендә без бу оптималь конфигурацияне LV-MPларны in vivo тычканның һава юлына китерү нәтиҗәсендә барлыкка килгән трансдукция схемасын күрсәтү өчен кулланырга тырыштык, бу һава юлларын максатчан куллану контекстында LV-MPларны китерү LV трансдукция нәтиҗәлелеген яхшыртачак дигән фаразга нигезләнеп эшләнде.
Барлык хайваннар өстендәге тикшеренүләр Аделаида Университеты (M-2019-060 һәм M-2020-022) һәм SPring-8 Синхротрон Хайваннар Этикасы Комитеты тарафыннан расланган протоколлар нигезендә үткәрелде. Экспериментлар ARRIVE күрсәтмәләренә туры китереп үткәрелде.
Барлык рентген сурәтләүләре Япониядәге SPring-8 синхротронындагы BL20XU нур линиясендә, элек тасвирланганга охшаш җайланма кулланып башкарылды21,22. Кыскасы, эксперименталь тартма синхротрон саклау боҗрасыннан 245 м ераклыкта урнашкан. Фаза контрасты эффектларын булдыру өчен кисәкчәләрне сурәтләү тикшеренүләре өчен 0,6 м һәм in vivo сурәтләү тикшеренүләре өчен 0,3 м үрнәктән детекторга кадәр ара кулланыла. 25 кэВ монохроматик нур энергиясе кулланылды. Рәсемнәр sCMOS детекторына тоташтырылган югары ачыклыклы рентген конвертеры (SPring-8 BM3) ярдәмендә төшерелде. Конвертер рентген нурларын күренмә яктылыкка 10 мкм калынлыктагы сцинтиллятор (Gd3Al2Ga3O12) ярдәмендә үзгәртә, аннары ул × 10 микроскоп объективын (NA 0.3) кулланып sCMOS сенсорына юнәлтелә. sCMOS детекторы Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) иде, аның зурлыгы ... 2048 × 2048 пиксель һәм чимал пиксель зурлыгы 6,5 × 6,5 мкм. Бу җайланма 0,51 мкм эффектив изотроп пиксель зурлыгын һәм якынча 1,1 мм × 1,1 мм күрү кырын бирә. Сулыш алу белән бәйле хәрәкәт артефактларын минимальләштерү белән беррәттән, сулыш юллары эчендәге һәм тышындагы магнит кисәкчәләренең сигнал-шау нисбәтен максимальләштерү өчен 100 мс экспозиция озынлыгы сайланды. In vivo тикшеренүләре өчен, экспозицияләр арасында рентген нурын блоклау юлы белән нурланыш дозасын чикләү өчен рентген юлына тиз рентген запасы урнаштырылды.
LV йөртүчесе бернинди SPring-8 PB-PCXI сурәтләү тикшеренүләрендә дә кулланылмады, чөнки BL20XU сурәтләү камерасы 2 нче дәрәҗәдәге биокуркынычсызлык сертификатына ия түгел. Киресенчә, без ике коммерция тәэмин итүчесеннән яхшы характерланган MP диапазонын сайладык - төрле зурлыкларны, материалларны, тимер концентрацияләрен һәм кулланылышларын үз эченә алды - башта магнит кырларының MP хәрәкәтенә пыяла капиллярларда, аннары тере һава юлларында ничек тәэсир итүен аңлау өчен. өслектә. MPларның зурлыгы 0,25 дән 18 мкм га кадәр һәм төрле материаллардан ясалган (1 нче таблицаны карагыз), ләкин һәр үрнәкнең составы, шул исәптән MP эчендәге магнит кисәкчәләренең зурлыгы, билгесез. Безнең киң колачлы MCT тикшеренүләребезгә нигезләнеп 19, 20, 21, 23, 24, без 5 мкм га кадәр кечкенә MPларны трахея һава юллары өслегендә күрергә мөмкин дип көтәбез, мәсәлән, MP хәрәкәтенең яхшырак күренүен күрү өчен бер-бер артлы кадрларны алып ташлау юлы белән. Бер 0,25 мкм зурлыктагы MP сурәтләү җайланмасының чишелешеннән кечерәк, ләкин PB-PCXI аларның күләм контрастын һәм алар утыртылганнан соң өслек сыеклыгының хәрәкәтен ачыклар дип көтелә.
1 нче таблицадагы һәр MP өчен үрнәкләр эчке диаметры 0,63 мм булган 20 мкл пыяла капиллярларда (Drummond Microcaps, PA, АКШ) әзерләнде. Корпускуляр кисәкчәләр суда, ә CombiMag кисәкчәләре җитештерүченең махсус сыеклыгында бар. Һәр пробирка яртылаш сыеклык белән тутырылган (якынча 11 мкл) һәм үрнәк тотучыга урнаштырылган (1 нче рәсемне карагыз). Пыяла капиллярлар, тиешенчә, сурәтләү тартмасындагы үрнәк этабына горизонталь рәвештә урнаштырылган һәм сыеклыкның кырыйларын урнаштырган. 19 мм диаметрлы (28 мм озынлыктагы) никель кабыгы булган сирәк очрый торган җир неодимий тимер бор (NdFeB) магниты (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия), сурәтләү вакытында аның урынын ерактан үзгәртү өчен аерым күчерү этабына беркетелгән. Рентген сурәте алу магнит үрнәк өстендә якынча 30 мм булганда башлана һәм сурәтләр секундына 4 кадр тизлегендә алына. Рәсемләү вакытында магнит якын китерелде. пыяла капилляр трубканы (якынча 1 мм ераклыкта) кулланып, аннары трубка буйлап күчереп, кыр көченең һәм урнашуының йогынтысын бәяләгез.
XY трансляция стадиясендәге пыяла капиллярлардагы MP үрнәкләрен үз эченә алган in vitro сурәтләү җайланмасы. Рентген нурының юлы кызыл пунктир сызык белән билгеләнгән.
MPларның in vitro күренүчәнлеге билгеләнгәч, аларның бер өлеше кыргый типтагы ана альбинос Вистар тычканнарында (~12 атналык, ~200 г) in vivo тикшерелде. 0,24 мг/кг медетомидин (Domitor®, Zenoaq, Япония), 3,2 мг/кг мидазолам (Dormicum®, Astellas Pharma, Япония) һәм 4 мг/кг буторфанол (Vetorphale®, Meiji Seika) тычканнарына Pharma (Japan) катнашмасы белән корсак эченә инъекция ясап наркоз бирелде. Наркоздан соң, алар трахея тирәсендәге йонны алып, эндотрахеаль трубка (ET; 16 Ga iv канюлясы, Terumo BCT) куеп һәм тән температурасын саклап калу өчен термокапчыклы махсус ясалган сурәтләү пластинасында аркасына ятып иммобилизацияләнеп сурәтләү өчен әзерләнде 22. Аннары сурәтләү пластинасы сурәтләү тартмасындагы үрнәк күчерү этабына рентген сурәтендә трахеяны горизонталь рәвештә тигезләү өчен бераз почмак астында беркетелде, 2а рәсемдә күрсәтелгәнчә.
(a) SPring-8 сурәтләү тартмасында in vivo сурәтләү җайланмасында рентген нуры юлы кызыл өзек сызык белән билгеләнгән.(b,c) Трахеяда магнит локализациясе ике ортогональ урнаштырылган IP камера ярдәмендә дистанцион рәвештә башкарылды. Экран сурәтенең сул ягында башны тотып торган чыбык элмәге, ә ET трубкасы эчендәге тапшыру канюлясы күренә.
100 мкл пыяла шприц кулланып, дистанцион идарә ителә торган шприц насос системасы (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) 30 Ga энә аша PE10 трубкасына (OD 0.61 мм, ID 0.28 мм) тоташтырылды. ET трубкасын урнаштырганда, очы трахеяда дөрес урында булуын тәэмин итү өчен трубканы билгеләгез. Микронасос ярдәмендә, трубканың очы китереләчәк MP үрнәгенә чумдырылганда, шприц поршенье алынды. Аннары йөкләнгән тапшыру трубкасы эндотрахеаль трубкага урнаштырылды, очы көтелгән магнит кырының иң көчле өлешенә урнаштырылды. Рәсем алу безнең Arduino нигезендәге вакыт тартмасына тоташтырылган сулыш алу детекторы ярдәмендә контрольдә тотылды, һәм барлык сигналлар (мәсәлән, температура, сулыш алу, капкачны ачу/ябу һәм рәсем алу) Powerlab һәм LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) 22 ярдәмендә язып алынды. Рәсем алу вакытында. Корпуска керү мөмкин булмаганда, ике IP камера (Panasonic BB-SC382) бер-берсенә якынча 90° почмакта урнаштырылды һәм кулланылды. сурәтләү вакытында магнитның трахеягә карата урнашуын күзәтү өчен (2b,c рәсемнәр). Хәрәкәт артефактларын минимальләштерү өчен, су басуы агымы платосы вакытында һәр сулыш өчен бер сурәт алынды.
Икенче баскычка магнит беркетелгән, ул сурәтләү корпусы тышыннан ерактан урнаштырыла ала. Төрле магнит позицияләре һәм конфигурацияләре тикшерелде, шул исәптән: Трахея өстендә якынча 30° почмакта урнаштырылган (конфигурацияләр 2a һәм 3a рәсемнәрендә күрсәтелгән); бер магнит хайван өстендә, икенчесе аста, полюслар җәлеп итү өчен урнаштырылган (3b рәсем); бер магнит хайван өстендә, икенчесе аста, полюслар этәрү өчен урнаштырылган (3c рәсем); һәм бер магнит трахея өстендә һәм аңа перпендикуляр (3d рәсем). Хайван һәм магнит конфигурацияләнгәннән һәм тикшереләчәк MP шприц насосына урнаштырылганнан соң, сурәтләр алганда 50 мкл дозаны 4 мкл/сек тизлектә бирегез. Аннары магнит сурәтләр алганда трахея буйлап яки яннан алга һәм артка хәрәкәтләндерелә.
In vivo сурәтләү өчен магнит конфигурациясе (а) трахея өстендә якынча 30° почмакта урнашкан бер магнит, (б) җәлеп итү өчен урнаштырылган ике магнит, (в) этәрү өчен урнаштырылган ике магнит, (г) трахея өстендә һәм аңа перпендикуляр урнашкан бер магнит. Күзәтүче авыздан трахея аша үпкәләргә карады, һәм рентген нуры тычканның сул ягыннан үтеп, уң ягыннан чыкты. Магнит я сулыш юллары буйлап, яки рентген нуры юнәлешендә трахея өстендә сулга һәм уңга хәрәкәтләнә.
Шулай ук, без сулыш алу һәм йөрәк хәрәкәте бозылмаган очракта, һава юлларындагы кисәкчәләрнең күренүчәнлеген һәм үз-үзен тотышын билгеләргә тырыштык. Шуңа күрә, сурәтләү чоры ахырында, пентобарбиталның артык дозасын куллану сәбәпле хайваннар кешелекле рәвештә үтерелде (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, АКШ; ~65 мг/кг ip). Кайбер хайваннар сурәтләү платформасында калдырылды, һәм сулыш алу һәм йөрәк тибеше туктагач, сурәтләү процессы кабатланды, һава юллары өслегендә MP күренмәсә, өстәмә MP дозасы өстәлде.
Алынган рәсемнәр яссы һәм караңгы кырларда төзәтелде, аннары MATLAB (R2020a, The Mathworks) телендә язылган махсус сценарий ярдәмендә фильмга җыелды (секундына 20 кадр; сулыш алу ешлыгына карап 15-25 × нормаль тизлек).
Барлык сол карынча ген векторын җиткерү тикшеренүләре Аделаида Университетының Лаборатория Хайваннар тикшеренүләре үзәгендә үткәрелде һәм SPring-8 эксперименты нәтиҗәләрен магнит кыры булганда сол карынча-MP җиткерү in vivo ген күчерүен көчәйтә аламы-юкмы икәнен бәяләү өчен куллануны максат итеп куйды. MP һәм магнит кырының йогынтысын бәяләү өчен ике төркем хайваннар дәваланды: бер төркемгә магнит урнаштырылган сол карынча-MP бирелде, ә икенче төркемгә магнитсыз сол карынча-MP белән контроль төркем бирелде.
LV ген векторлары элек тасвирланган 25, 26 ысуллары ярдәмендә булдырылган. LacZ векторы MPSV промоторы (LV-LacZ) тарафыннан идарә ителә торган ядро-локализацияләнгән бета-галактозидаза генын белдерә, ул трансдукцияләнгән күзәнәкләрдә зәңгәр реакция продуктын җитештерә, ул үпкә тукымаларының алгы өлешләрендә һәм тукыма кисәкләрендә күренә. Титрлау күзәнәк культураларында LacZ уңай күзәнәкләр санын кул белән санап, гемоцитометр ярдәмендә титрны TU/млда исәпләү юлы белән башкарылды. Йөк ташучылар -80 °C температурада криоконсервацияләнә, кулланыр алдыннан эретелә һәм 1:1 нисбәтендә катнаштырып һәм китерү алдыннан ким дигәндә 30 минут бозда инкубацияләнеп CombiMag белән бәйләнә.
Гадәти Sprague Dawley тычканнарына (n = 3/төркем, ~2-3) 0,4 мг/кг медетомидин (Domitor, Ilium, Австралия) һәм 60 мг/кг кетамин (Ilium, Австралия) айлык) ип) инъекциясе катнашмасы белән корсак эченә анестезия ясалды һәм 16 Ga вена эченә канюля белән хирургик булмаган авыз куышлыгына канюляция ясалды. Трахея сулыш юллары тукымасы сол карын трансдукциясен кабул итүен тәэмин итү өчен, ул безнең элек тасвирланган механик пертурбация протоколы ярдәмендә кондицияләнде, анда трахея сулыш юллары өслеге чыбык себет белән күчәр буенча ышкылды (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, АКШ) 30 с28. Аннары пертурбациядән якынча 10 минут узгач, трахеягә сол карын перфорациясе-MP кулланылды, бу биологик куркынычсызлык шкафында башкарылды.
Бу экспериментта кулланылган магнит кыры in vivo рентген сурәтләү тикшеренүенә охшаш рәвештә конфигурацияләнгән, шул ук магнитлар трахея өстендә дистилляция стент кыскычлары ярдәмендә тотып торылган (4 нче рәсем). Элегрәк тасвирланганча, гель очы булган пипетка ярдәмендә трахеягә (n = 3 хайван) 50 мкл күләмдәге (2 × 25 мкл аликвот) LV-MP кертелгән. Контроль төркеменә (n = 3 хайван) магнит кулланмыйча шул ук LV-MP бирелгән. Инфузия тәмамланганнан соң, канюля ET трубкасыннан алына һәм хайван экстубацияләнә. Магнит 10 минут урынында кала, аннары ул алына. Тычканнарга мелоксикамның тире астына дозасы (1 мл/кг) бирелгән (Ilium, Австралия), аннары 1 мг/кг атипамазол гидрохлориды (Antisedan, Zoetis, Австралия) ип инъекциясе белән наркозны кире кайтару юлы белән. Тычканнар җылы хәлдә тотылган һәм наркоздан тулысынча савыкканчы күзәтелгән.
Биологик куркынычсызлык шкафындагы LV-MP бирү җайланмасы. ET трубкасының ачык соры төстәге Люэр үзәге авыздан чыгып торганын күрергә мөмкин, һәм рәсемдә күрсәтелгән пипетканың гель очы ET трубкасы аша трахеягә кирәкле тирәнлеккә кертелә.
LV-MP дозалау процедурасыннан соң бер атна үткәч, хайваннар 100% CO2 ингаляциясе белән кешелекле рәвештә үтерелде, һәм LacZ экспрессиясе безнең стандарт X-gal эшкәртү ярдәмендә бәяләнде. Эндотрахеаль трубка урнаштырудан механик зыян яки сыеклык тоткарлануы анализга кертелмәвен тәэмин итү өчен, өч каудаль иң кимерчәк боҗрасы алынды. Анализ өчен ике ярты ясау өчен һәр трахея буйга киселде, һәм алар люминаль өслекне күрү өчен Minutien энәсен (Fine Science Tools) кулланып силикон каучуклы савытка (Sylgard, Dow Inc) урнаштырылды. Трансдукцияләнгән күзәнәкләрнең таралышы һәм үрнәге DigiLite камерасы һәм TCapture программасы (Tucsen Photonics, Кытай) белән Nikon микроскопы (SMZ1500) кулланып фронталь фотога төшерү ярдәмендә расланды. Рәсемнәр 20 тапкыр зурайту белән алынды (трахеянең тулы киңлеге өчен иң югары көйләүне дә кертеп), трахеянең бөтен озынлыгы этап-этап белән сурәтләнде, бу һәр рәсем арасында рәсемне "тегү" мөмкинлеген бирү өчен җитәрлек каплануны тәэмин итте. Рәсемнәрдән аннары һәр трахея яссы хәрәкәт алгоритмын кулланып, Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ярдәмендә бер композит рәсемгә җыелды. Һәр хайванның трахеясының композит рәсемнәрендәге LacZ экспрессия өлкәләре алдан тасвирланганча автоматик MATLAB скрипты (R2020a, MathWorks) ярдәмендә 0.35 < Төс < 0.58, Туендыру > 0.15 һәм Value < 0.7 көйләүләрен кулланып санлаштырылды. Тукыма контурларын күзәтеп, GIMP v2.10.24 версиясендә һәр композит рәсем өчен кул белән битлек булдырылды, бу тукыма өлкәсен ачыклау һәм трахея тукымасыннан тыш ялган ачыклауларны булдырмас өчен эшләнде. Һәр хайванның барлык композит рәсемнәреннән буялган өлкәләр шул хайван өчен буялган гомуми мәйданны булдыру өчен кушылды. Аннары буялган мәйдан гомуми битлек мәйданына бүленеп, нормальләштерелгән мәйдан булдырылды.
Һәр трахея парафинга күмелде һәм 5 мкм кисемтәләр киселде. Кисемтәләр 5 минут дәвамында нейтраль тиз кызыл буяу белән капма-каршы буялды һәм рәсемнәр Nikon Eclipse E400 микроскопы, DS-Fi3 камерасы һәм NIS элементларын төшерү программасы (5.20.00 версиясе) ярдәмендә алынды.
Барлык статистик анализлар GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) программасында башкарылды. Статистик әһәмият p ≤ 0,05 итеп билгеләнде. Нормаллык Шапиро-Вилк тесты ярдәмендә тикшерелде, ә LacZ буялышындагы аермалар парланмаган t-тест ярдәмендә бәяләнде.
1 нче таблицада сурәтләнгән алты MP PCXI ярдәмендә тикшерелде, һәм күренүчәнлек 2 нче таблицада сурәтләнә. PCXI астында ике полистирол MP (MP1 һәм MP2; 18 мкм һәм 0,25 мкм) күренмәде, ләкин калган үрнәкләр ачык иде (мисаллар 5 нче рәсемдә күрсәтелгән). MP3 һәм MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 мкм һәм 0,9 мкм) начар күренә. Сыналган иң кечкенә кисәкчәләрнең кайберләрен үз эченә алса да, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) иң ачык күренде. CombiMag продукты MP6ны күрү авыр. Барлык очракларда да, магнитны капиллярга параллель рәвештә алга һәм артка күчерү аркасында MPны ачыклау сәләтебез сизелерлек артты. Магнитлар капиллярдан ераграк киткәч, кисәкчәләр озын чылбырлар рәвешендә сузылды, ләкин магнитлар якынайгач һәм магнит кыры көче арткан саен, кисәкчәләр капиллярның өске өслегенә таба күчкәндә кисәкчәләр чылбырлары кыскарды (өстәмә S1 видеосын карагыз: MP4), өслекнең кисәкчәләр тыгызлыгын арттыра. Киресенчә, магнит капиллярдан алынганда, кыр көче кими һәм MPлар капиллярның өске өслегеннән сузылган озын җепләргә әйләнә (өстәмә видео S2 карагыз: MP4). Магнит хәрәкәт итүдән туктаганнан соң, кисәкчәләр тигезлек хәленә җиткәннән соң кыска вакыт хәрәкәт итүләрен дәвам итәләр. MP капиллярның өске өслегенә таба һәм аннан ераграк хәрәкәт иткәндә, магнит кисәкчәләре гадәттә чүп-чарны сыеклык аша сөйрәп үткәрәләр.
PCXI астындагы MP күренә торганлыгы үрнәкләр арасында шактый аерылып тора.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 һәм (d) MP6. Монда күрсәтелгән барлык рәсемнәр дә капилляр өстендә якынча 10 мм урнашкан магнит белән төшерелгән. Күренгән зур түгәрәкләр - капиллярларда тотылган һава күбекләре, фазалы контрастлы сурәтләүнең кара һәм ак кырый үзенчәлекләрен ачык күрсәтә. Кызыл рамкада контрастны көчәйтүче зурайту бар. Барлык рәсемнәрдәге магнит схемаларының диаметрлары масштабланмаган һәм күрсәтелгәннән якынча 100 тапкыр зуррак икәнен истә тотыгыз.
Магнит капилляр өске өлеше буйлап сулга һәм уңга күчкәндә, MP кылының почмагы магнит белән тигезләнешкә үзгәрә (6 нчы рәсемне карагыз), шулай итеп магнит кыры сызыкларын билгели. MP3-5 өчен, хорда чик почмагына җиткәч, кисәкчәләр капилляр өске өслеге буйлап сөйрәлә. Бу еш кына MPларның магнит кыры иң көчле булган урынга якын зуррак төркемнәргә туплануына китерә (S3 өстәмә видеосын карагыз: MP5). Бу, бигрәк тә, капилляр очына якын сурәтләү вакытында ачык күренә, бу MPларның агрегациясенә һәм сыеклык-һава чигендә туплануына китерә. MP6дагы MP3-5кә караганда аеру авыррак булган кисәкчәләр, магнит капилляр буйлап хәрәкәт иткәндә сөйрәлмәде, ләкин MP кыллары диссоциацияләнде, кисәкчәләрне күрү кырында калдырды (S4 өстәмә видеосын карагыз: MP6). Кайбер очракларда, магнитны сурәтләү урыныннан зур ераклыкка күчерү аркасында кулланылган магнит кыры киметелгәч, калган MPлар гравитация ярдәмендә трубканың аскы өслегенә әкрен генә төште, ә кылда калды (S5 өстәмә видеосын карагыз: MP3).
Магнит капилляр өстендә уңга күчкәндә, MP җебенең почмагы үзгәрә.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 һәм (d) MP6. Кызыл рамкада контрастны көчәйтүче зурайту бар. Өстәмә видеоларның мәгълүмати булуына игътибар итегез, чөнки алар бу статик рәсемнәрдә күз алдына китереп булмый торган мөһим кисәкчәләр структурасын һәм динамик мәгълүматны ача.
Безнең сынаулар күрсәткәнчә, магнитны трахея буйлап әкрен генә алга-артка күчерү in vivo катлаулы хәрәкәт контекстында MP визуализациясен җиңеләйтә. In vivo сынаулары үткәрелмәде, чөнки полистирол бөртекләре (MP1 һәм MP2) капиллярда күренмәде. Калган дүрт MPның һәрберсе in vivo магнитның озын күчәре трахея өстендә вертикальгә якынча 30° почмакта урнаштырылган килеш сыналды (2b һәм 3a рәсемнәрен карагыз), чөнки бу MP чылбырларының озынрак булуына китерде һәм магнит конфигурациясе тәмамланганнан да нәтиҗәлерәк булды. MP3, MP4 һәм MP6 бернинди тере хайваннарның трахеясында да табылмады. Хайваннар кешечә үтерелгәннән соң тычкан сулыш юллары сурәтләнгәндә, шприц насосы ярдәмендә өстәмә күләм өстәлсә дә, кисәкчәләр күренми калды. MP5 иң югары тимер оксиды күләменә ия иде һәм бердәнбер күренүче кисәкчә иде, шуңа күрә MP ның in vivo үз-үзен тотышын бәяләү һәм характерлау өчен кулланылды.
MP бирү вакытында магнитны трахея өстенә кую нәтиҗәсендә күп кенә MPлар күрү кырында тупланырга мөмкин, ләкин барысы да түгел. Трахеягә кергән кисәкчәләрне кешелекле рәвештә корбан ителгән хайваннарда күзәтергә мөмкин. 7 нче рәсем һәм өстәмә видео S6: MP5 вентраль трахея өслегендәге кисәкчәләрнең тиз магнит тотылуын һәм тигезләнешен күрсәтә, бу MPларның трахеянең теләгән өлкәләренә юнәлтелергә мөмкинлеген күрсәтә. MP бирүдән соң трахея буйлап дисталь яктан эзләгәндә, кайбер MPлар каринага якынрак табылды, бу магнит кыры көченең барлык MPларны җыю һәм саклап калу өчен җитәрлек булмавын күрсәтә, чөнки алар сыеклык процессы вакытында максималь магнит кыры көче өлкәсе аша җиткерелде. Шулай да, бала тудырганнан соң MP концентрациясе сурәтләнгән өлкә тирәсендә югарырак булды, бу күп MPларның кулланылган магнит кыры көче иң югары булган һава юллары өлкәләрендә калуын күрсәтә.
Күптән түгел эвтаназияләнгән тычканның трахеясенә MP5 кертелгәнче һәм (b) төшерелгәннән соңгы рәсемнәр, магнит турыдан-туры сурәтләү өлкәсе өстендә урнаштырылган. Рәсемләнгән өлкә ике кимерчәк боҗрасы арасында урнашкан. MP кертелгәнче, сулыш юлларында бераз сыеклык бар. Кызыл рамкада контрастны көчәйтүче зурайту күрсәтелгән. Бу рәсемнәр S6:MP5 өстәмә видеосында күрсәтелгән видеодан алынган.
Магнитны трахея буйлап in vivo күчерү MP чылбырының һава юлы өслегендәге почмакны капиллярларда күренгәнчә үзгәртүенә китерде (8 нче рәсемне һәм S7 өстәмә видеосын карагыз: MP5). Ләкин, безнең тикшеренүдә MPларны тере һава юлы өслеге буйлап капиллярлардагы кебек сөйрәп алып булмый иде. Кайбер очракларда, магнит сулга һәм уңга хәрәкәт иткәндә MP чылбыры озыная. Кызыклысы шунда ки, без шулай ук ​​магнит трахея буйлап буйга хәрәкәт иткәндә кисәкчәләр чылбырының өслек сыеклык катламының тирәнлеген үзгәртүен һәм магнит турыдан-туры өскә күчерелгәндә һәм кисәкчәләр чылбыры вертикаль позициягә әйләндерелгәндә киңәюен ачыкладык (S7 өстәмә видеосын карагыз). : MP5 0:09 сәгатьтә, аскы уң якта). Магнит трахеянең өске өлеше буйлап янга күчерелгәндә (ягъни, трахея озынлыгы буенча түгел, ә хайванның сулына яки уңына) хәрәкәтнең характерлы схемасы үзгәрде. Кисәкчәләр хәрәкәт иткәндә дә ачык күренә иде, ләкин магнит трахеядән алынгач, кисәкчә җепләренең очлары күренә башлады (0:08 сәгатьтән башлап, S8:MP5 өстәмә видеосын карагыз). Бу пыяла капиллярда магнит кыры кулланылганда күзәтелгән MP үз-үзен тотышы белән туры килә.
Тере анестезияләнгән тычканның трахеясендә MP5 күрсәтүче мисал рәсемнәр.(а) Магнит трахея өстендә һәм сул ягында рәсемнәр алу өчен кулланыла, аннары (б) магнит уңга күчерелгәннән соң. Кызыл рамкада контрастны көчәйтүче зурайту бар. Бу рәсемнәр S7:MP5 өстәмә видеосында күрсәтелгән видеодан алынган.
Ике полюс трахея өстендә һәм астында төньяк-көньяк юнәлешендә урнаштырылганда (ягъни җәлеп итү; 3b рәсем), MP хордалары озынрак күренде һәм трахеяның дорсаль өслегендә түгел, ә ян стенасында урнашкан иде (өстәмә S9:MP5 видеосын карагыз). Ләкин, ике магнитлы җайланма кулланылганда, сыеклык җибәрелгәннән соң, бер урында (ягъни трахеяның дорсаль өслегендә) кисәкчәләрнең югары концентрациясе ачыкланмады, бу гадәттә бер магнитлы җайланма кулланылганда була. Аннары бер магнит полюсларны кире этәрү өчен көйләнгәндә (3c рәсем), күрү кырында күренгән кисәкчәләр саны җибәрелгәннән соң артмаган кебек. Ике ике магнитлы конфигурацияне урнаштыру, магнитларны тарта торган яки этәрә торган югары магнит кыры көчләре аркасында катлаулы. Аннары урнаштыру һава юлына параллель, ләкин һава юлыннан 90 градуста үтүче бер магнитка үзгәртелде, шуңа күрә кыр сызыклары трахея стенасын ортогональ рәвештә кисеп үтте (3d рәсем), бу юнәлеш ян стенадагы кисәкчәләр агрегациясен күзәтеп буламы-юкмы икәнен билгеләү өчен эшләнгән. Шулай да, бу конфигурациядә MP туплануының яки ​​магнит хәрәкәтенең ачыкланырлык хәрәкәте булмады. Барлык бу нәтиҗәләргә нигезләнеп, in vivo ген йөртүче тикшеренүләре өчен бер магнитлы, 30 градуслы ориентация конфигурациясе (3а рәсем) сайланды.
Хайванны кешелекле үтерүдән соң кабат-кабат сурәткә төшергәндә, буталчык тукымаларның хәрәкәте булмау сәбәпле, ачык интерхондраль кырда магнитның трансляция хәрәкәтенә туры китереп "тибрәнеп" торган нечкә һәм кыскарак кисәкчә сызыклары күренергә мөмкин булган. Шуңа да карамастан, MP6 кисәкчәләренең булуын һәм хәрәкәтен ачык күрә алмыйлар.
LV-LacZ титры 1,8 × 108 TU/мл тәшкил итте, һәм CombiMag MP (MP6) белән 1:1 катнашмасыннан соң, хайваннарга 9 × 107 TU/мл LV транспорт чарасының 50 мкл трахея дозасы бирелде (ягъни 4,5 × 106 TU/күсе). Бу тикшеренүләрдә, бала тудыру вакытында магнитны күчерү урынына, без магнитны бер позициягә урнаштырдык, шул ук вакытта магнит кыры булмаганда, LV трансдукциясен вектор җиткерү белән чагыштырганда яхшыртып буламы, һәм (б) фокуслаштырып буламы икәнен ачыклау өчен. Һава юлы күзәнәкләре югары сулыш юлларының магнит максатлы өлкәләренә трансдукцияләнә.
Магнитларның булуы һәм CombiMagны сол карынча векторлары белән берлектә куллану хайваннар сәламәтлегенә тискәре йогынты ясамаган кебек, безнең стандарт сол карынча векторын җиткерү протоколы да шулай ук. Механик пертурбациягә дучар ителгән трахея өлкәсенең фронталь рәсемнәре (Өстәмә 1 нче рәсем) магнит булганда сол карынча-MP белән дәваланган хайваннар төркемендә трансдукция дәрәҗәләренең шактый югары булуын күрсәтте (9а рәсем). Контроль төркемендә зәңгәр LacZ буявы аз гына күләмдә булган (9б рәсем). Нормальләштерелгән X-Gal буялган өлкәләрнең саннарын билгеләү күрсәткәнчә, магнит кыры булганда сол карынча-MP куллану якынча 6 тапкыр яхшыруга китергән (9в рәсем).
LV-MP ярдәмендә трахея трансдукциясен күрсәтүче композит рәсемнәрнең мисалы (а) магнит кыры булганда һәм (б) магнит булмаганда.(в) Магнит кулланганда трахея эчендә нормальләштерелгән LacZ трансдукция өлкәсендә статистик яктан әһәмиятле яхшыру (*p = 0.029, t-тест, төркемдә n = 3, уртача ± SEM).
Нейтраль тиз кызыл төскә буялган кисемтәләр (мисал 2 нче өстәмә рәсемдә күрсәтелгән) элек хәбәр ителгәнчә охшаш үрнәктә һәм урында LacZ белән буялган күзәнәкләрне күрсәтте.
Һава юллары ген терапиясе өчен төп кыенлык - ташучы кисәкчәләрнең кызыксыну өлкәләренә төгәл урнашуы һәм һава агымы һәм актив лайла чистарту булганда хәрәкәт итүче үпкәдә югары трансдукция нәтиҗәлелегенә ирешү. CF һава юллары авыруларын дәвалау өчен эшләнгән сол карынча ташучылары өчен, ташучы кисәкчәләрнең үткәрүче һава юлларында яшәү вакытын арттыру әлегә кадәр мөмкин булмаган максат булып тора. Кастеллани һ.б. билгеләп үткәнчә, трансдукцияне яхшырту өчен магнит кырларын куллану электропорация кебек башка ген җиткерү ысуллары белән чагыштырганда өстенлекләргә ия, чөнки ул гадилекне, чыгымнарны нәтиҗәле куллануны, җиткерү локализациясен, нәтиҗәлелекне арттыруны һәм инкубация вакытын кыскартуны, һәм, мөгаен, ташучы дозасын кечерәк итә ала10. Ләкин, тышкы магнит көчләре йогынтысында һава юлларында магнит кисәкчәләренең in vivo урнашуы һәм үз-үзен тотышы беркайчан да тасвирланмаган, шулай ук ​​бу ысулның in vivo тере һава юлларында ген экспрессиясе дәрәҗәсен арттыру өчен мөмкинлеге дә күрсәтелмәгән.
Безнең in vitro синхротрон PCXI экспериментлары күрсәткәнчә, без сынаган барлык кисәкчәләр дә, полистирол MPдан кала, без кулланган сурәтләү җайланмасында күренә. Магнит кыры булганда, MPлар озынлыклары кисәкчәләр төренә һәм магнит кыры көченә (ягъни магнитның якынлыгы һәм хәрәкәте) бәйле чылбырлар барлыкка китерә. 10 нчы рәсемдә күрсәтелгәнчә, без күзәткән чылбырлар һәр аерым кисәкчәнең магнитлашуы һәм үзенең локаль магнит кырын индукцияләве аркасында барлыкка килә. Бу аерым кырлар башка охшаш кисәкчәләрнең агрегациясенә һәм тоташуына китерә, башка кисәкчәләрнең локаль җәлеп итү һәм этәрү көчләреннән локаль көчләр аркасында төркем чылбыры сыман хәрәкәтләр барлыкка килә.
Схема (а, б) сыеклык белән тулы капиллярлар эчендә һәм (в, г) һава белән тулы трахея эчендә барлыкка килгән кисәкчәләр рәтләрен күрсәтә. Капиллярлар һәм трахея масштаб буенча сызылмаганлыгын исәпкә алыгыз. (а) панелендә шулай ук ​​җепләр рәвешендә урнашкан Fe3O4 кисәкчәләрен үз эченә алган MP тасвирламасы да бар.
Магнит капилляр өстеннән күчерелгәч, кисәкчәләр җебенең почмагы Fe3O4 булган MP3-5 өчен критик чиккә җитте, аннан соң кисәкчәләр җебе баштагы урында калмады, ә өслек буенча яңа урынга күчте. магнит. Бу эффект, мөгаен, пыяла капилляр өслеге бу хәрәкәтнең барлыкка килүен тәэмин итәрлек дәрәҗәдә шома булганга күрә барлыкка килергә мөмкин. Кызыклысы шунда ки, MP6 (CombiMag) мондый хәлдә калмады, бәлки, кисәкчәләр кечерәк булганга, төрле капламалар яки өслек зарядлары булганга, яки махсус йөртүче сыеклык аларның хәрәкәт итү сәләтенә тәэсир иткәнгә. CombiMag кисәкчәләренең сурәт контрасты да көчсезрәк, бу сыеклык һәм кисәкчәләрнең охшаш тыгызлыкка ия ​​булуын һәм шуңа күрә бер-берсенә җиңел хәрәкәт итмәвен күрсәтә. Әгәр магнит бик тиз хәрәкәт итсә, кисәкчәләр дә ябышып калырга мөмкин, бу магнит кыры көченең сыеклыктагы кисәкчәләр арасындагы ышкылуны һәрвакыт җиңә алмавын күрсәтә, бу, бәлки, магнит кыры көченең һәм магнит белән максат өлкәсе арасындагы ераклыкның бик мөһим булуына гаҗәп түгеллеген күрсәтә. Бергәләп караганда, бу нәтиҗәләр шулай ук ​​магнитлар максат өлкәсе аша агып үтүче күп MPларны тота алса да, магнитларга таянып булмый дигәнне күрсәтә. CombiMag кисәкчәләрен трахея өслеге буйлап хәрәкәтләндерә. Шуңа күрә, без in vivo LV-MP тикшеренүләрендә һава юлы агачының билгеле бер өлкәләренә физик яктан тәэсир итү өчен статик магнит кырларын кулланырга кирәк дигән нәтиҗәгә киләбез.
Кисәкчәләр тәнгә китерелгәндә, аларны катлаулы хәрәкәтләнүче тән тукымалары контекстында ачыклау кыен, ләкин аларны ачыклау мөмкинлеге магнитны трахея өстендә горизонталь рәвештә күчереп, MP җепләрен "селкетү" ярдәмендә яхшыртылды. Тере сурәтләү мөмкин булса да, хайван кешечә үтерелгәннән соң кисәкчәләр хәрәкәтен ачыклау җиңелрәк. MP концентрациясе, гадәттә, магнит сурәтләү өлкәсе өстендә урнашканда, бу урында иң югары булган, гәрчә кайбер кисәкчәләр гадәттә трахея буйлап ераграк табылган. In vitro тикшеренүләреннән аермалы буларак, магнитны күчереп, кисәкчәләрне трахея буйлап сөйрәп булмый. Бу ачыш трахея өслеген каплаган лайланың гадәттә суланган кисәкчәләрне эшкәртеп, аларны лайлада тотып калуы һәм аннары лайла-цилиар чистарту механизмы ярдәмендә чистартуы белән туры килә.
Без трахея өстендә һәм астында тартылу өчен магнитлар куллану (3б рәсем) бер ноктада югары концентрацияләнгән магнит кыры урынына бердәмрәк магнит кыры барлыкка китерергә мөмкин дип фаразладык, бу кисәкчәләрнең тигезрәк таралуына китерергә мөмкин. Ләкин безнең башлангыч тикшеренү бу гипотезаны раслаучы ачык дәлилләр тапмады. Шулай ук, магнит парын этеп җибәрү өчен конфигурацияләү (3в рәсем) сурәтләнгән өлкәдә кисәкчәләрнең күбрәк урнашуына китермәде. Бу ике ачыш ике магнитлы урнаштыруның MP максатчанлыгын локаль контрольдә тотуны сизелерлек яхшыртмавын һәм нәтиҗәдә барлыкка килгән көчле магнит көчләрен конфигурацияләү авыр булуын күрсәтә, бу алымны азрак гамәли итә. Шул ук рәвешле, магнитны трахея өстендә һәм аша юнәлтү (3г рәсем) шулай ук ​​сурәтләнгән өлкәдә сакланган кисәкчәләр санын арттырмады. Бу альтернатив конфигурацияләрнең кайберләре уңышлы булмаска мөмкин, чөнки алар утыру өлкәсендә магнит кыры көчәнешенең кимүенә китерә. Шуңа күрә, бер 30 градуслы почмаклы магнит конфигурациясе (3а рәсем) in vivo сынау өчен иң җиңел һәм иң нәтиҗәле ысул дип санала.
LV-MP тикшеренүе күрсәткәнчә, LV векторлары CombiMag белән берләштерелгәндә һәм магнит кыры булганда физик пертурбациядән соң бирелгәндә, трахеяда трансдукция дәрәҗәләре контроль төркем белән чагыштырганда сизелерлек арткан. Синхротрон сурәтләү тикшеренүләре һәм LacZ нәтиҗәләренә нигезләнеп, магнит кыры LVны трахея эчендә саклап кала алган һәм үпкәгә шунда ук тирән үтеп кергән вектор кисәкчәләре санын киметә алган. Мондый максатчан яхшыртулар югарырак нәтиҗәлелеккә китерергә мөмкин, шул ук вакытта бирелгән титрларны, максаттан тыш трансдукцияне, ялкынсыну һәм иммун тискәре йогынтыларны һәм ген йөртүчеләр чыгымнарын киметә. Иң мөһиме, җитештерүче сүзләренчә, CombiMag башка ген күчерү ысуллары белән берлектә кулланылырга мөмкин, шул исәптән башка вирус векторлары (мәсәлән, AAV) һәм нуклеин кислоталары белән.