Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem pro CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro renovato utaris (aut modum compatibilitatis in Internet Explorer deactivare). Interea, ut continua sustentatio praestetur, situm sine stylis et JavaScript demonstrabimus.
Vectores genorum ad curationem morbi pulmonis fibrosis cysticae vias respiratorias conductivas petere debent, quia transductio pulmonis peripherica beneficium therapeuticum non praebet. Efficacia transductionis viralis directe cum tempore residentiae vectoris coniungitur. Attamen, fluida traditionis, ut vectores genorum, naturaliter in alveolos durante inspiratione diffundunt, et particulae therapeuticae cuiuslibet formae celeriter per translationem mucociliarem purgantur. Prolongatio temporis residentiae vectorum in viis respiratoriis magni momenti est sed difficile ad obtinendum. Particulae magneticae vectoribus genorum coniugatae, quae ad superficiem viarum respiratoriarum dirigi possunt, directionem regionalem emendare possunt. Ob difficultates visualisationis in vivo, modus agendi talium particularum magneticarum parvarum in superficie viarum respiratoriarum in praesentia campi magnetici applicati parum intellegitur. Propositum huius studii erat uti imagine synchrotron ad visualizandum motum in vivo seriei particularum magneticarum in trachea murium anesthetizatorum ad examinandum dynamicam et exempla modi agendi particularum individualium et aggregatarum in vivo. Deinde etiam aestimavimus utrum traditio particularum magneticarum lentiviralis in praesentia campi magnetici efficaciam transductionis in trachea murium augeret. Synchrotron Radiographia per radios X mores particularum magneticarum in campis magneticis stationariis et mobilibus in vitro et in vivo revelat. Particulae facile per superficiem viae respiratoriae viventis magnetibus trahi non possunt, sed durante transportatione, deposita in campo visionis concentrantur ubi campus magneticus fortissimus est. Efficacia transductionis etiam sextuplo aucta est cum particulae magneticae lentivirales in praesentia campi magnetici adlatae sunt. Haec omnia simul suggerunt particulas magneticas lentivirales et campos magneticos accessus utiles esse posse ad meliorem designationem vectoris genorum et ad gradus transductionis in viis respiratoriis conducentibus in vivo augendos.
Fibrosis cystica (FC) variatione unius geni, qui regulator conductantiae transmembranalis FC (CFTR) appellatur, causatur. Proteina CFTR est canalis ionicus qui in multis cellulis epithelialibus per totum corpus praesens est, inter quas viae respiratoriae conducentes, quae locus principalis pathogenesis FC sunt. Defectus CFTR ad transportationem aquae abnormalem ducunt, superficiem viae respiratoriae dehydrantes et profunditatem strati liquidi superficiei viae respiratoriae (ASL) minuentes. Hoc etiam facultatem systematis transportationis mucociliaris (MCT) ad particulas inhalatas et pathogena e viis respiratoriis purganda impedit. Propositum nostrum est therapiam genicam lentiviralem (LV) evolvere ad exemplar correctum geni CFTR tradendum et salutem ASL, MCT, et pulmonum emendandam, et novas technologias evolvere capaces hos parametros in vivo metiendi pergere.
Vectores ventriculi sinistri (LV) inter candidatos praecipuos pro therapia genica viae respiratoriae fibrosis cysticae (FC) numerantur, praecipue quia gen therapeuticum in cellulas basales viae respiratoriae (cellulas matrices viae respiratoriae) perpetuo integrare possunt. Hoc magni momenti est quia hydrationem normalem et purgationem muci restituere possunt per differentiationem in cellulas superficiales viae respiratoriae CF-associatas, gene correcto functionales, quod beneficia per totam vitam affert. Vectores LV contra vias respiratorias conductivas dirigi debent, quia hic morbus pulmonis CF incipit. Traditio vectoris altius in pulmonem transductionem alveolarem efficere potest, sed hoc nullum beneficium therapeuticum in FC habet. Attamen, fluida, ut vectores genorum, naturaliter ad alveolos migrant post inspirationem post traditionem3,4 et particulae therapeuticae celeriter in cavitatem oralem per MCT eliminantur. Efficacia transductionis LV directe relata est ad tempus quo vector iuxta cellulas destinatas manet ut absorptionem cellularem permittat – "tempus residentiae"5 – quod facile reducitur per fluxum aeris regionalem typicum necnon per captionem muci particularum coordinatam et MCT. Pro FC, facultas tempus residentiae LV intra vias respiratorias prolongandi magni momenti est ad gradus transductionis altos in hac regione consequendos, sed hactenus difficile fuit.
Ad hoc impedimentum superandum, proponimus particulas magneticas LV (MP) duobus modis complementariis auxilium ferre posse. Primo, magnetice ad superficiem viae respiratoriae dirigi possunt ut melius directionem attingant et adiuvent particulas vectores genorum in regione viae respiratoriae desiderata manere; et (ASL) ut ad stratum cellulare 6 moveantur. MP late adhibitae sunt ut vehicula directa ad medicamenta administranda cum se anticorporibus, medicamentis chemotherapeuticis, vel aliis moleculis parvis ligant quae membranis cellularibus adhaerent vel receptoribus superficiei cellularis pertinentibus ligant et in locis tumoris in praesentia electricitatis staticae accumulant. Campi Magnetici ad Curationem Cancri 7. Aliae technicae "hyperthermicae" microplagulas (MP) calefacere student cum campis magneticis oscillantibus exponuntur, ita cellulas tumoris destruentes. Principium transfectionis magneticae, in quo campus magneticus ut agens transfectionis ad translationem DNA ad cellulas augendam adhibetur, vulgo in vitro adhibetur utens serie vectorum genicorum non-viralium et viralium pro stirpibus cellularum difficilibus ad transducendum. Efficacia magnetotransfectionis LV stabilita est, cum in vitro traditione LV-MP ad stirpem cellularum epithelialium bronchialem humanam in praesentia campi magnetici statici, efficientiam transductionis 186-pliciter augens comparata cum vectore LV solo. LV-MP etiam ad exemplar CF in vitro applicatum est, ubi transfectio magnetica transductionem LV in culturis interfaciei aeris-liquidi 20-pliciter auxit in praesentia sputi CF 10. Attamen, magnetotransfectio organorum in vivo relative parvam attentionem accepit et tantum in paucis studiis animalium aestimata est 11,12,13,14,15, praesertim in... pulmones16,17. Nihilominus, occasiones transfectionis magneticae in therapia pulmonis fibrosis cysticae (CF) manifestae sunt. Tan et al. (2020) affirmaverunt "studium probationis conceptus efficacis traditionis pulmonalis nanoparticularum magneticarum viam sternere futuris strategiis inhalationis CFTR ad meliorem exitum clinicum in aegris CF"6.
Habitus particularum magneticarum parvarum in superficiebus viarum respiratoriarum sub praesentia campi magnetici applicati difficulter visualizatur et investigatur, ideoque parum intellectum est. In aliis studiis, methodum imaginandi radiographiam cum contrasto phasium (PB-PCXI) fundatam in propagatione synchrotronis elaboravimus, ut mutationes minutas in vivo in profunditate ASL18 et habitu MCT19,20 non invasive visualizaremus et quantificaremus, ut hydrationem superficiei canalis gasii directe metiremur, et ut indicem praecocem efficaciae curationis adhiberemus. Praeterea, methodus nostra aestimationis MCT particulas 10-35 µm diametri, ex alumina vel vitro alto indice refractionis compositas, ut indices MCT visibiles utens PB-PCXI21, utitur. Ambae technicae aptae sunt ad visualizationem variorum generum particularum, incluso MP.
Propter altam resolutionem spatialem et temporalem, nostrae rationes analysis ASL et MCT, quae in PB-PCXI fundantur, apte aptae sunt ad examinandas dynamicas et exempla actionis particularum singularum et magnarum in vivo, ut nobis adiuvent ad intellegendas et optimizandas rationes traditionis geni MP. Modus quem hic adhibemus ex studiis nostris derivat utens linea radiorum SPring-8 BL20B2, in quo motum fluidi post traditionem dosis vectoris fictae in vias respiratorias nasales et pulmonares murium visualizavimus, ut adiuvarent ad explicanda exempla expressionis geni non uniformia quae in studiis nostris in animalibus cum dosi vectoris geni observata sunt 3,4.
Propositum huius studii erat synchrotronem PB-PCXI adhibere ad motus in vivo seriei microscoporum magneticorum (MP) in trachea murium viventium visualizandos. Haec studia imaginum PB-PCXI destinata sunt ad seriem MP, roboris campi magnetici, et locorum examinandum, ut effectum eorum in motum MP determinarent. Hypothesim fecimus campum magneticum externe applicatum MP traditum adiuturum esse ut ad aream destinatam maneret vel moveretur. Haec studia etiam nobis permiserunt ut configurationes magnetorum identificaremus quae numerum particularum in trachea post depositionem retentarum maximizant. In secunda serie studiorum, hanc configurationem optimalem uti quaesivimus ad demonstrandum exemplar transductionis ex traditione in vivo MP LV ad vias respiratorias murium resultantem, fundati in assumptione quod traditio MP LV in contextu designationis viarum respiratoriarum efficientiam transductionis LV emendatam effectura esset.
Omnia studia animalium secundum protocolla ab Universitate Adelaidensi (M-2019-060 et M-2020-022) et a Commissione Ethica Animalium Synchrotronis SPring-8 probata peracta sunt. Experimenta secundum normas ARRIVE peracta sunt.
Omnes imagines radiographicae in linea radiorum BL20XU apud synchrotron SPring-8 in Iaponia peractae sunt, apparatu simili ei quod antea descriptum est21,22. Breviter, arca experimentalis 245 m ab anulo repositionis synchrotronis sita erat. Distantia inter exemplar et detectorem 0.6 m ad studia imaginum particularum et 0.3 m ad studia imaginum in vivo ad effectus contrastus phasis generandos adhibetur. Energia fasciculi monochromatici 25 keV adhibita est. Imagines captae sunt utens convertore radiorum X altae resolutionis (SPring-8 BM3) cum detectore sCMOS coniuncto. Convertor radios X in lucem visibilem convertit utens scintillatore 10 µm crasso (Gd3Al2Ga3O12), qui deinde ad sensorem sCMOS dirigitur utens obiectivo microscopii × 10 (NA 0.3). Detector sCMOS erat Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Iaponia) cum magnitudine ordinata... 2048 × 2048 elementa imaginum et magnitudo elementaris cruda 6.5 × 6.5 µm. Haec dispositio magnitudinem elementaris isotropicam effectivam 0.51 µm et campum visionis circiter 1.1 mm × 1.1 mm producit. Longitudo expositionis 100 ms electa est ad rationem signi ad strepitum particularum magneticarum intra et extra vias respiratorias maximizandam, dum artefacta motus respiratione inducta minimizabantur. Pro studiis in vivo, obturator radiorum X celeris in via radiorum X positus est ad dosim radiationis limitandam per obstructionem fasciculi radiorum X inter expositiones.
Vector LV in nullis studiis imaginum SPring-8 PB-PCXI adhibitus est, quia camera imaginum BL20XU non est certificata Biosafety Level 2. Potius, seriem microscopium magneticorum (MP) bene characterizatorum a duobus praebitoribus commercialibus delegimus—varias magnitudines, materias, concentrationes ferri, et applicationes tegentes—primum ad intellegendum quomodo campi magnetici motum MP intra capillaria vitrea, deinde in viis respiratoriis viventibus afficiunt. in superficie. Microscopia magnetica (MP) magnitudine variant ab 0.25 ad 18 μm et ex variis materiis fiunt (vide Tabulam 1), sed compositio cuiusque exempli, incluso magnitudine particularum magneticarum intra MP, ignota est. Fundati in nostris studiis MCT amplis 19, 20, 21, 23, 24, exspectamus MP tam parvas quam 5 μm videri posse in superficie viae aereae trachealis, exempli gratia subtrahendo imagines continuas ad meliorem visibilitatem motus MP videndam. Unum MP 0.25 μm magnitudinis minor est quam resolutio instrumenti imaginandi, sed PB-PCXI exspectatur ut contrastum voluminis eorum et motum fluidi superficialis in quo post depositionem deponuntur detegat.
Exempla pro singulis MP in Tabula 1 in vasis capillaribus vitreis 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) cum diametro interno 0.63 mm praeparata sunt. Particulae corpusculares in aqua praesto sunt, dum particulae CombiMag in fluido proprietario fabricatoris praesto sunt. Quisque tubus dimidio liquido repletus est (circiter 11 μl) et in porta-exempli positus est (vide Figuram 1). Vasa capillaria vitrea horizontaliter in scaena exempli in arca imaginandi posita sunt, respective, et ad margines fluidi posita. Magnetem niccoli testae rarae terrae neodymii ferri borii (NdFeB) 19 mm diametro (28 mm longum) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) cum magnetizatione residua 1.17 Tesla scaenae translationis separatae adnexum est ut positionem eius remote mutaret durante imaginatione. Acquisitio imaginum radiorum X incipit cum magnes circiter 30 mm supra exemplum positus est, et imagines acquiruntur celeritate 4 imaginum per secundum. Durante imaginatione, magnes adlatus est... prope tubum capillarem vitreum (circiter 1 mm distantem) et deinde per tubum translata ad effectus roboris campi et positionis aestimandos.
Apparatus imaginum *in vitro* continens exempla MP in vasis capillaribus vitreis in scaena translationis xy exemplaris. Iter fasciculi radiorum X linea rubra punctata notatur.
Postquam visibilitas microplasticorum (MP) in vitro constituta est, pars eorum in vivo in muribus Wistar albinis feminis generis sylvestris (~12 hebdomades natae, ~200 g) probata est. 0.24 mg/kg medetomidinum (Domitor®, Zenoaq, Iaponia), 3.2 mg/kg midazolamum (Dormicum®, Astellas Pharma, Iaponia) et 4 mg/kg butorphanolum (Vetorphale®, Meiji Seika) adhibita sunt. Muri mixtura medetomidini (Pharma), Iaponiae) per injectionem intraperitonealem anesthetizati sunt. Post anaesthesiam, ad imaginandum praeparati sunt per remotionem pilorum circa tracheam, insertionem tubi endotrachealis (ET; 16 Ga cannula iv, Terumo BCT) et immobilizationem supinarum in lamina imaginandi ad usum facta, sacculum thermalem continentem ad temperaturam corporis conservandam [22]. Lamina imaginandi deinde scaenae translationis exemplaris in arca imaginandi levi angulo adfixa est ut tracheam horizontaliter in imagine radiographica alignaret, ut in Figura demonstratur. 2a.
(a) In vivo apparatu imaginum in capsa imaginum SPring-8 disposito, via fasciculi radiorum X linea rubra punctata notata est. (b,c) Locatio magnetis in trachea remote peracta est duabus cameris IP orthogonaliter positis. In latere sinistro imaginis veli, ansus metallicus caput tenens videri potest, et cannula traditionis intra tubum ET posita.
Systema antliae syringae remote gubernatae (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), syringa vitrea 100 μl utens, tubo PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) per acum 30 Ga connexum est. Tubum nota ut apex in situ correcto in trachea sit cum tubus ET inseritur. Microantlia utens, embolus syringae extractus est dum apex tubi in specimine MP ad trahendum immergebatur. Tubus trahens onustus deinde in tubum endotrachealem insertus est, apex intra partem maximam campi magnetici applicati exspectati collocatus. Acquisitio imaginum per detectorem respirationis, capsae temporalis Arduino fundatae connexae, moderata est, et omnia signa (e.g., temperatura, respiratio, apertura/clausura obturatoris et acquisitio imaginum) per Powerlab et LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 notata sunt. Dum imagines capiebantur, cum clausura inaccessibilis esset, duae camerae IP (Panasonic BB-SC382) circiter 90° inter se positae sunt et ad positionem magnetis relativam monitorandam adhibitae sunt. ad tracheam per imaginationem (Fig. 2b,c). Ad artefacta motus minuenda, una imago per respirationem per planitiem fluxus aestus finalis acquisita est.
Magnetem secundo scaeno adnectitur, quod remote extra receptaculum imaginum collocari potest. Variae positiones et configurationes magnetis probatae sunt, inter quas: ad angulum circiter 30° supra tracheam positum (configurationes in Figuris 2a et 3a monstrantur); unus magnes supra animal et alter infra, cum polis ad attrahendum (Figura 3b); unus magnes supra animal et alter infra, cum polis ad repellendum (Figura 3c); et unus magnes supra et perpendiculariter ad tracheam (Figura 3d). Postquam animal et magnes configurati sunt et MP probandum in antliam syringeticam impositum est, dosis 50 μl celeritate 4 μl/sec da dum imagines acquiruntur. Deinde magnes huc illuc secundum vel lateraliter trans tracheam movetur dum imagines acquirere pergit.
Configuratio magnetis ad imagines in vivo capiendas: (a) magnes singularis supra tracheam ad angulum circiter 30°, (b) duo magnetes ad attrahendum, (c) duo magnetes ad repellendum, (d) magnes singularis supra et perpendiculariter in trachea. Observator ab ore ad pulmones per tracheam deorsum spectavit, et fasciculus radiorum X per latus sinistrum muris transiit et latus dextrum exiit. Magnes vel per longitudinem viae respiratoriae movetur vel sinistra et dextra supra tracheam in directionem fasciculi radiorum X.
Etiam visibilitatem et mores particularum in viis respiratoriis, absente respiratione et motu cardiaco perturbantibus, determinare quaesivimus. Ergo, post finem periodi imaginandi, animalia propter nimium pentobarbitali (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg intraperitoneale) humaniter necata sunt. Quaedam animalia in suggestu imaginandi relicta sunt, et postquam respiratio et pulsus cordis cessaverunt, processus imaginandi repetitus est, dosi addita MP addendo si nullum MP in superficie viarum respiratoriarum apparebat.
Imagines captae, et in campo plano et in campo obscuro correctae, deinde in pelliculam (viginti imagines per secundum; quindecim-vingt-quinque × celeritas normalis secundum frequentiam respirationis) compositae sunt, utens scripto proprio in MATLAB (R2020a, The Mathworks) scripto.
Omnia studia traditionis geni vectoris LV in Laboratorio Investigationis Animalium apud Universitatem Adelaidensem peracta sunt, et propositum eorum erat ut eventus experimenti SPring-8 adhiberentur ad diiudicandum num traditio LV-MP in praesentia campi magnetici translationem geni in vivo augere posset. Ad effectus MP et campi magnetici aestimandos, duo greges animalium tractati sunt: ​​uni gregi LV-MP cum magnete posito datum est, alteri autem gregi gregem comparativum cum LV-MP sine magnete accepit.
Vectores genorum LV generati sunt methodis antea descriptis [25, 26]. Vector LacZ exprimit genum beta-galactosidasis localizatum in nucleo, a promotore constitutivo MPSV (LV-LacZ) impulsum, quod productum reactionis caeruleum in cellulis transductis producit, visibile in frontibus textus pulmonis et sectionibus textus. Titratio peracta est in culturis cellularum numerando manualiter numerum cellularum LacZ positivarum cum haemocytometro ad calculandum titrum in TU/ml. Vectores cryoconservantur ad -80°C, liquefiunt ante usum, et ligantur cum CombiMag miscendo ad rationem 1:1 et incubando in glacie per saltem 30 minuta ante traditionem.
Muri Sprague Dawley normales (n = 3/coetus, ~2-3 intraperitonealiter anesthetizati sunt mixtura medetomidini 0.4 mg/kg (Domitor, Ilium, Australia) et 60 mg/kg ketamini (Ilium, Australia) (mensium) intraperitoneale) iniectione et cannulatione orali non chirurgica cum cannula intravenosa 16 Ga. Ut textus viae respiratoriae trachealis transductionem ventriculi sinistri (LV) acciperet, conditionati sunt utens protocollo perturbationis mechanicae antea descripto, in quo superficies viae respiratoriae trachealis axialiter cum calatho metallico (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28 perfricata est. Administratio trachealis LV-MP deinde in armario securitatis biologicae circiter 10 minutis post perturbationem peracta est.
Campus magneticus in hoc experimento adhibitus simili modo ac in studio radiographico in vivo configuratus est, cum eisdem magnetibus supra tracheam tenentibus utens fibulis distillationis stent (Figura 4). Volumen 50 μl (2 × 25 μl aliquotae) LV-MP in tracheam immissum est (n = 3 animalia) utens pipetta continente apicem gelatinosum, ut antea descriptum est. Grex testis (n = 3 animalia) eadem LV-MP sine usu magnetis accepit. Postquam infusio completa est, cannula e tubo ET removetur et animal extubatur. Magnet in loco manet per 10 minuta, deinde removetur. Muribus dosis subcutanea meloxicami (1 ml/kg) (Ilium, Australia) data est, deinde anaesthesiae iniectio intraperitonealis 1 mg/kg atipamazoli hydrochloridi (Antisedan, Zoetis, Australia) inversio. Muribus calidis servatum est et observatum est donec plena recuperatio ab anaesthesia esset.
Instrumentum ad trahendum LV-MP in armario securitatis biologicae. Coniunctio Luer grisea pallida tubi ET ex ore prominentis videri potest, et apex gelatinosus pipettae in imagine depictae per tubum ET ad profunditatem desideratam in tracheam inseritur.
Una hebdomade post administrationem LV-MP, animalia humaniter necata sunt per inhalationem CO2 100% et expressio LacZ aestimata est utens curatione nostra consueta X-gal. Tres anuli caudales cartilaginosi maxime remoti sunt ut curaretur ne ulla laesio mechanica aut retentio liquidorum ex collocatione tubi endotrachealis in analysi includeretur. Quaeque trachea longitudinaliter secta est ut duae partes ad analysin crearentur, et in disco continente gummi siliconis (Sylgard, Dow Inc) impositae sunt utens acu Minutien (Fine Science Tools) ad superficiem luminalem visualizandam. Distributio et exemplar cellularum transductarum confirmatae sunt photographica frontali utens microscopio Nikon (SMZ1500) cum camera DigiLite et programmate TCapture (Tucsen Photonics, Sina). Imagines acquisitae sunt ad magnificationem 20x (inclusa maxima configuratione pro plena latitudine tracheae), cum tota longitudine tracheae gradatim depicta, satis superpositionis inter singulas imagines curando ut "sutura" imaginum permitteretur. Imagines ex qualibet trachea deinde assemblatae sunt. In unam imaginem compositam utens Editore Composito Imaginum v2.0.3 (Microsoft Research) algorithmo motus plani utens. Areae expressionis LacZ in imaginibus compositis tracheae ex unoquoque animali quantificatae sunt utens scripto MATLAB automatico (R2020a, MathWorks) ut antea descriptum est, utens optionibus 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, et Value < 0.7. Delineando contornos textus, larva manualiter generata est in GIMP v2.10.24 pro unaquaque imagine composita ut area textus identificaretur et quaslibet detectiones falsas extra textum trachealem vitarentur. Areae tinctae ex omnibus imaginibus compositis ex unoquoque animali summatae sunt ut aream tinctam totalem pro illo animali generaret. Area tincta deinde divisa est per aream larvae totalem ut aream normalizatam generaret.
Tracheae singulae paraffino inclusae sunt et sectiones 5 μm crassitudine sectae sunt. Sectiones contratinctae sunt rubro neutro rapido per 5 minuta et imagines acquisitae sunt microscopio Nikon Eclipse E400, camera DS-Fi3 et programmate NIS element capture (versione 5.20.00).
Omnes analyses statisticae in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) peractae sunt. Significatio statistica ad p ≤ 0.05 constituta est. Normalitas per probationem Shapiro-Wilk verificata est, et differentiae in tinctione LacZ per probationem t non pares aestimatae sunt.
Sex microparticulae (MP) in Tabula 1 descriptae per PCXI examinatae sunt, et visibilitas in Tabula 2 describitur. Duo MP polystyreni (MP1 et MP2; 18 μm et 0.25 μm respective) sub PCXI non visibiles erant, sed reliqua exempla identificabilia erant (exempla in Figura 5 monstrantur). MP3 et MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm et 0.9 μm respective) leviter visibiles sunt. Quamquam aliquas ex minimis particulis probatis continet, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) maxime conspicua erat. Productum CombiMag MP6 difficile est conspicere. In omnibus casibus, facultas nostra detegendi MP significanter aucta est per translationem magnetis ultro citroque parallelam capillari. Cum magnetes a capillari recesserunt, particulae in longis filis extensae sunt, sed cum magnetes propius accederent et vis campi magnetici augeretur, fila particularum contracta sunt dum particulae versus superficiem superiorem capillaris migrabant (vide Video Supplementum). S1: MP4), densitatem particularum superficiei augens. Contra, cum magnes e capillari removetur, vis campi minuitur et microparticulae (MP) in longas filas a superficie superiore capillaris extendentes se reorganizant (vide Video Supplementarium S2:MP4). Postquam magnes moveri desiit, particulae per breve tempus moveri pergunt postquam ad positionem aequilibrii pervenerunt. Dum MP ad superficiem superiorem capillaris et ab ea recedit, particulae magneticae plerumque fragmenta per fluidum trahunt.
Visibilitas MP sub PCXI inter exempla significanter variat. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6. Omnes imagines hic monstratae captae sunt magnete circiter 10 mm directe supra capillare sito. Circuli magni apparentes sunt bullae aeris in capillaribus inclusae, clare ostendentes lineamenta marginum nigra et alba imaginum contrastus phasis. Arca rubra continet amplificationem contrastum augentem. Nota diametros schematum magnetis in omnibus figuris non esse ad scalam et circiter 100 vicibus maiores esse quam monstrantur.
Dum magnes ad sinistram et ad dextram per summum capillaris translatur, angulus filamenti MP mutatur ut cum magnete congruat (vide Figuram 6), ita lineas campi magnetici delineans. Pro MP3-5, postquam chorda angulum liminalem attingit, particulae per superficiem superiorem capillaris trahuntur. Hoc saepe efficit ut MP in maiores greges prope locum ubi campus magneticus fortissimus est congregantur (vide Video Supplementum S3:MP5). Hoc etiam praecipue manifestum est cum imagines prope finem capillaris capiuntur, quod MP aggregari et concentrari facit ad interfaciem fluidi-aeris. Particulae in MP6, quae difficilius discerni poterant quam MP3-5, non trahebantur dum magnes per capillarem movebatur, sed filamenti MP dissociabantur, particulas in campo visionis relinquentes (vide Video Supplementum S4:MP6). In quibusdam casibus, cum campus magneticus applicatus imminutus est movendo magnetem magnam distantiam a loco imaginis, quaelibet MP residua lente ad superficiem inferiorem tubi gravitate descendebant dum in filamento manebant (vide Video Supplementum S5: MP3).
Angulus filamenti MP mutatur dum magnes ad dextram supra capillare translatur. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6. Arca rubra amplificationem contrastum augentem continet. Nota videos supplementarios informativos esse, cum structuram particularum et informationem dynamicam magni momenti, quae in his imaginibus staticis visualizari non potest, patefaciant.
Experimenta nostra demonstraverunt magnetem lente huc illucque per tracheam movere visualizationem MP in contextu motus complexi in vivo faciliorem reddere. Experimenta in vivo non peracta sunt, quia granula polystyreni (MP1 et MP2) in capillari non visibiles erant. Singula ex quattuor MP reliquis in vivo probata sunt cum axe longo magnetis supra tracheam ad angulum circiter 30° ad verticalem configurato (vide Figuras 2b et 3a), quia hoc longiores catenas MP effecit et efficacius erat quam configuratio magnetis terminata. MP3, MP4 et MP6 in trachea ullius animalis vivi non detecta sunt. Cum viae respiratoriae muris postquam animalia humaniter necata sunt depictae sunt, particulae invisibiles manebant etiam cum volumen additum per antliam syringeticam additum est. MP5 maximum contentum oxidi ferri habebat et sola particula visibilis erat, et ideo adhibita est ad aestimandum et describendum mores MP in vivo.
Magnetem super tracheam positum durante traditione MP effecit ut multae, sed non omnes, MP in campo visionis concentrarentur. Particulae tracheam intrantes optime observantur in animalibus humaniter sacrificatis. Figura 7 et Video Supplementum S6: MP5 ostendit celerem captionem magneticam et ordinationem particularum in superficie tracheae ventralis, quod indicat MP ad regiones desideratas tracheae dirigi posse. Cum distaliter per tracheam post traditionem MP quaereretur, quaedam MP propius carinae inventa sunt, quod suggerit vim campi magnetici insufficientem fuisse ad omnes MP colligendas et retinendas, cum per regionem maximae vis campi magnetici durante processu fluidi traditae essent. Nihilominus, concentrationes MP postpartum altiores erant circa aream imaginatam, quod suggerit multas MP in regionibus viarum respiratoriarum remansisse ubi vis campi magnetici applicata maxima erat.
Imagines ab (a) ante et (b) post traditionem MP5 in tracheam muris nuper euthanasiati, magnete directe supra aream imaginandi posito. Area imaginata inter duos anulos cartilagineos sita est. Ante traditionem MP, aliquid liquidi in via respiratoria est. Arca rubra amplificationem contrastum augentem continet. Hae imagines ex video in Video Supplementario S6:MP5 monstrato sunt.
Motus magnetis per tracheam in vivo effecit ut catena microplastica (MP) angulum intra superficiem viae respiratoriae mutaret modo simili ei qui in vasis capillaribus videtur (vide Figuram 8 et Video Supplementum S7:MP5). Attamen, in nostro studio, MP non potuerunt per superficiem viae respiratoriae viventis trahi sicut cum vasis capillaribus. In quibusdam casibus, catena MP longior fiet dum magnes ad sinistram et ad dextram movetur. Interesse est quod etiam invenimus seriem particularum profunditatem strati fluidi superficialis mutare cum magnes longitudinaliter per tracheam movetur, et expandere cum magnes directe supra movetur et series particularum ad positionem verticalem rotatur (vide Video Supplementum S7). MP5 hora 0:09, in imo dextra). Modus motus proprius mutatus est cum magnes trans summum tracheae lateraliter translatus est (hoc est, ad sinistram vel dextram animalis potius quam secundum longitudinem tracheae). Particulae adhuc clare visibiles erant dum movebantur, sed cum magnes a trachea remotus est, apices filorum particularum visibiles factae sunt (vide Video Supplementarium S8:MP5, incipiens a 0:08). Hoc congruit cum comportamento MP quod observavimus sub campo magnetico applicato in capillari vitreo.
Exempla imaginum MP5 in trachea muris vivi anesthetizati ostendentia. (a) Magnetes ad imagines supra et ad laevam tracheae acquirendas adhibetur, deinde (b) postquam magnes ad dextram movetur. Arca rubra amplificationem contrastum augentem continet. Hae imagines ex video in Video Supplementario S7:MP5 monstrato sunt.
Cum duo poli in orientatione septentrionali-meridionali supra et infra tracheam configurati essent (i.e. attrahentes; Fig. 3b), chordae MP longiores apparuerunt et in pariete laterali tracheae potius quam in superficie dorsali tracheae sitae erant (vide Video Supplementarium S9:MP5). Attamen, altae concentrationes particularum in uno loco (i.e., superficie dorsali tracheae) non detectae sunt post distributionem fluidi cum instrumentum dualis magnetis adhibitum est, quod typice fit cum instrumentum unius magnetis adhibitum est. Deinde, cum unus magnes configuratus est ad polos inversos repellendos (Fig. 3c), numerus particularum in campo visionis visibilium non videbatur crescere post distributionem. Dispositio utriusque configurationis dualis magnetis difficilis est propter altas vires campi magnetici quae magnetes trahunt vel impellunt, respective. Dispositio deinde mutata est ad singulum magnetem parallelum viae respiratoriae sed per vias respiratorias transeuntem ad 90 gradus ita ut lineae campi parietem trachealem orthogonaliter transirent (Fig. 3d), orientatione destinata ad determinandum num aggregatio particularum in pariete laterali observari posset. Attamen, in hoc... In configuratione, nullus motus accumulationis MP aut motus magnetici identificabilis erat. His omnibus resultatis innixa, configuratio unius magnetis, orientationis 30 graduum (Figura 3a) pro studiis in vivo de vectoribus genorum electa est.
Cum animal statim post caedem humanam iterum atque iterum depictum esset, absentia motus textuum perturbantis significabat lineas particularum tenuiores et breviores in claro campo interchondrali discerni posse, "vacillantes" secundum motum translationis magnetis. Nihilominus, praesentia et motus particularum MP6 clare videre non licet.
Titulus LV-LacZ erat 1.8 × 10⁶ TU/ml, et post mixturam 1:1 cum CombiMag MP (MP6), animalia dosem trachealem 50 μl vehiculi LV 9 × 10⁷ TU/ml (i.e., 4.5 × 10⁶ TU/rat) acceperunt. In his studiis, loco magnetis transferendi durante partu, magnetem in una positione fiximus ad determinandum utrum transductio LV (a) meliorari posset comparata cum traditione vectoris in absentia campi magnetici, et (b) dirigi posset. Cellulae viae respiratoriae ad regiones magneticas destinatas viae respiratoriae superioris transducuntur.
Praesentia magnetorum et usus CombiMag cum vectoribus LV coniuncti effectus adversos in salutem animalium habere non videbantur, sicut nostrum protocollum traditionis vectoris LV consuetum. Imagines frontales regionis trachealis perturbationi mechanicae subiectae (Figura Supplementaria 1) indicabant gradus transductionis significanter altiores esse in grege animalium LV-MP tractatorum cum magnes praesens erat (Figura 9a). Solum parva quantitas tinctionis caeruleae LacZ in grege testigo aderat (Figura 9b). Quantificatio arearum X-Gal normalizatarum tinctarum ostendit administrationem LV-MP in praesentia campi magnetici emendationem circiter sextuplo effecisse (Figura 9c).
Exempla imaginum compositarum transductionem trachealem per LV-MP ostendentia (a) in praesentia campi magnetici et (b) in absentia magnetis. (c) Emendatio statisticaliter significativa in area transductionis LacZ normalizata intra tracheam cum magnete adhibito (*p = 0.029, t-test, n = 3 per gregem, media ± SEM).
Sectiones neutraliter celeriter rubro tinctae (exemplum in Figura Supplementi 2 monstratum) cellulas LacZ tinctas in simili forma et loco praesentes ostenderunt, ut antea relatum est.
Clavis difficultas therapiae genicae viarum respiratoriarum manet accurata localizatio particularum vectorum in regiones desideratas et assecutio altarum efficaciae transductionis graduum in pulmone mobili, praesentibus fluxus aëris et purgatione muci activa. Pro vectoribus ventriculi sinistri (LV) ad morbum viarum respiratoriarum fibrosis cysticae (FC) tractandum destinatis, auctio temporis residentiae particularum vectorum intra vias respiratorias conducentes meta hactenus difficilis fuit. Ut Castellani et al. demonstraverunt, usus camporum magneticorum ad transductionem emendandam commoda habet comparatus aliis methodis traditionis genorum, ut electroporatione, cum simplicitatem, efficaciam sumptuum, localizationem traditionis, efficaciam auctam, et tempora incubationis breviora, et fortasse minorem dosim vectoris10, coniungere possit. Attamen, depositio et modus vivendi particularum magneticarum in viis respiratoriis sub influxu virium magneticarum externarum numquam descriptus est, nec revera possibilitas huius methodi in vivo demonstrata est ad gradus expressionis genorum in viis respiratoriis viventibus integris augendos.
Experimenta nostra in vitro synchrotron PCXI demonstraverunt omnes particulas quas probavimus, excepto polystyreno MP, in apparatu imaginario a nobis adhibito visibiles fuisse. In praesentia campi magnetici, MP fila formant quarum longitudines cum genere particularum et robore campi magnetici (id est, proximitate et motu magnetis) coniunguntur. Ut in Figura 10 demonstratur, fila quae observamus formantur quia singulae particulae magnetizantur et suum campum magneticum localem inducunt. Haec campi separati alias particulas similes aggregare et coniungere faciunt, cum motibus filorum similibus gregibus ob vires locales ex viribus attractivis et repulsivis localibus aliarum particularum.
Schema ostendens (a,b) series particularum intra capillaria fluido plena generatas et (c,d) tracheam aere plenam. Nota capillaria et tracheam non ad scalam depictas esse. Pars (a) etiam descriptionem MP continet, quod particulas Fe3O4 in filis dispositas continet.
Cum magnes supra capillare moveretur, angulus seriei particularum limen criticum pro MP3-5 Fe3O4 continente attigit, post quod series particularum non iam in loco originali mansit, sed secundum superficiem magnetis ad novam positionem movebatur. Hic effectus probabiliter evenit quia superficies capillaris vitreae satis levis est ut hic motus fieri possit. Interesse est quod MP6 (CombiMag) hoc modo non se gessit, fortasse quia particulae minores erant, vel quia diversa strata vel onera superficialia habebant, vel quia fluidum vector proprium facultatem movendi earum affecit. Contrastus imaginis particularum CombiMag etiam debilior est, quod suggerit fluidum et particulas densitates similes habere posse et ideo non facile inter se moveri. Particulae etiam haerere possunt si magnes nimis celeriter movetur, quod indicat vim campi magnetici non semper frictionem inter particulas in fluido superare posse, quod suggerit fortasse non mirum esse vim campi magnetici et distantiam inter magnetem et aream scopum magni momenti esse. Haec omnia simul sumpta etiam suggerunt, quamquam magnetes multa MP quae per aream scopum fluunt capere possunt, improbabile esse magnetibus fidendum esse ut moveant. Particulae CombiMag secundum superficiem tracheae. Ergo concludimus studia in vivo LV-MP campos magneticos staticos adhibere debere ad regiones specificas arboris viae respiratoriae physice petendas.
Cum particulae in corpus inferuntur, difficile est eas identificare in contextu textus corporis complexi mobilis, sed facultas eas detegendi aucta est per translationem magnetis horizontaliter supra tracheam ad fila microscopia microscopica "movenda". Quamquam imago viva fieri potest, facilius est motum particularum discernere postquam animal humaniter occisum est. Concentrationes microscopiae microscopicae plerumque maximae erant in hoc loco cum magnes supra aream imaginandi positus erat, quamquam aliquae particulae plerumque ulterius in trachea inveniebantur. Dissimiliter studiis in vitro, particulae non possunt per tracheam trahi translatione magnetis. Hoc inventum congruit cum modo quo mucus qui superficiem tracheae tegit typice particulas inhalatas tractat, eas in muco captans et deinde per mechanismum purgationis mucociliaris purgat.
Hypothesim fecimus ut usus magnetium ad attractionem supra et infra tracheam (Fig. 3b) campum magneticum uniformiorem, potius quam campum magneticum uno loco valde concentratum, fortasse ad distributionem particularum uniformiorem duceret. Attamen, studium nostrum praeliminare non invenit claras probationes ad hanc hypothesim sustinendam. Similiter, configuratio par magnetum ad repellendum (Fig. 3c) non effecit maiorem depositionem particularum in area depicta. Haec duo inventa demonstrant configurationem duorum magnetum non significanter emendare moderationem localem designationis MP, et vires magneticas fortes resultantes difficiles esse ad configurandum, hanc methodum minus practicam reddentes. Similiter, orientatio magnetis supra et per tracheam (Fig. 3d) etiam non auxit numerum particularum retentarum in area depicta. Nonnullae ex his configurationibus alternativis fortasse non prosperae erunt quia minores vires campi magnetici intra aream depositionis efficiunt. Ergo, configuratio magnetis unius anguli 30 graduum (Figura 3a) habetur methodus facillima et efficacissima ad probationes in vivo.
Studium LV-MP demonstravit, cum vectores LV cum CombiMag coniungrentur et post perturbationem physicam in praesentia campi magnetici administrarentur, gradus transductionis in trachea significanter auctos esse comparatis cum controlibus. Secundum studia synchrotronis et resultata LacZ, campus magneticus videtur LV intra tracheam conservare et numerum particularum vectorum quae statim in pulmonem alte penetraverunt reducere. Tales emendationes directionis ad maiorem efficaciam ducere possunt, dum titros administratos, transductionem extra scopum, effectus secundarios inflammatorios et immunitarios, et sumptus vectorum genorum minuunt. Magni momenti est, secundum fabricatorem, CombiMag una cum aliis methodis translationis genorum, etiam cum aliis vectoribus viralibus (ut AAV) et acidis nucleicis, adhiberi posse.