Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да искључите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Генски вектори за лечење цистичне фиброзе плућа требало би да циљају проводне дисајне путеве јер периферна плућна трансдукција не пружа терапеутску корист. Ефикасност вирусне трансдукције је директно повезана са временом задржавања вектора. Међутим, течности за испоруку, као што су носиоци гена, природно дифундују у алвеоле током инспирације, а терапеутске честице било ког облика се брзо уклањају мукоцилијарним транспортом. Продужавање времена задржавања носилаца гена у дисајним путевима је важно, али тешко постићи. Магнетне честице конјуговане са носиоцем гена које се могу усмерити на површину дисајних путева могу побољшати регионално циљање. Због изазова визуелизације in vivo, понашање таквих малих магнетних честица на површини дисајних путева у присуству примењеног магнетног поља је слабо схваћено. Циљ ове студије био је да се користи синхротронско снимање за визуелизацију in vivo кретања низа магнетних честица у трахеји анестезираних пацова како би се испитала динамика и обрасци понашања појединачних и масовних честица in vivo. Затим смо такође проценили да ли би испорука лентивирусних магнетних честица у присуству магнетног поља повећала ефикасност трансдукције у трахеји пацова. Синхротронско рендгенско снимање открива... понашање магнетних честица у стационарним и покретним магнетним пољима in vitro и in vivo. Честице се не могу лако вући дуж површине живих дисајних путева магнетима, али током транспорта, наслаге се концентришу у видном пољу где је магнетно поље најјаче. Ефикасност трансдукције је такође повећана шест пута када су лентивирусне магнетне честице испоручене у присуству магнетног поља. Заједно, ови резултати сугеришу да лентивирусне магнетне честице и магнетна поља могу бити вредни приступи за побољшање циљања генских вектора и повећање нивоа трансдукције у проводљивим дисајним путевима in vivo.
Цистична фиброза (ЦФ) је узрокована варијацијом у једном гену који се назива ЦФ трансмембрански регулатор проводљивости (ЦФТР). ЦФТР протеин је јонски канал који је присутан у многим епителним ћелијама широм тела, укључујући и проводне дисајне путеве, главно место патогенезе ЦФ. ЦФТР дефекти доводе до абнормалног транспорта воде, дехидрације површине дисајних путева и смањења дубине слоја течности на површини дисајних путева (АСЛ). Ово такође нарушава способност мукоцилијарног транспортног система (МКТ) да очисти удахнуте честице и патогене из дисајних путева. Наш циљ је да развијемо лентивирусну (ЛВ) генску терапију како бисмо испоручили исправну копију ЦФТР гена и побољшали здравље АСЛ, МКТ и плућа, и да наставимо са развојем нових технологија способних за мерење ових параметара in vivo1.
ЛВ вектори су један од водећих кандидата за генску терапију дисајних путева код ЦФ, углавном зато што могу трајно интегрисати терапеутски ген у базалне ћелије дисајних путева (матичне ћелије дисајних путева). Ово је важно јер могу да обнове нормалну хидратацију и чишћење слузи диференцијацијом у функционалне ћелије површине дисајних путева повезане са ЦФ, кориговане геном, што резултира доживотним користима. ЛВ вектори треба да буду усмерени против проводних дисајних путева, јер ту почиње болест плућа код ЦФ. Испорука вектора дубље у плућа може довести до алвеоларне трансдукције, али то нема терапеутску корист код ЦФ. Међутим, течности као што су носиоци гена природно мигрирају у алвеоле након инспирације након испоруке3,4 и терапеутске честице се брзо уклањају у усну дупљу помоћу МЦТ. Ефикасност ЛВ трансдукције је директно повезана са дужином времена које вектор остаје поред циљних ћелија како би се омогућило ћелијско усвајање – „време боравка“5 – које се лако смањује типичним регионалним протоком ваздуха, као и координираним хватањем честица слузи и МЦТ. За ЦФ, способност продужења времена боравка ЛВ унутар дисајних путева је важна за постизање високих нивоа трансдукције у овом региону, али је до сада била изазовна.
Да би се превазишла ова препрека, сугеришемо да магнетне честице (МП) леве коморе (ЛК) могу помоћи на два комплементарна начина. Прво, могу се магнетно водити до површине дисајних путева како би се побољшало циљање и помогло честицама носачима гена да се задрже у жељеном региону дисајних путева; и (АСЛ) да би се преместиле у ћелијски слој 6. МП се широко користе као средства за циљану испоруку лекова када се везују за антитела, хемотерапеутске лекове или друге мале молекуле који се везују за ћелијске мембране или се везују за релевантне рецепторе на површини ћелија и акумулирају на местима тумора у присуству статичког електрицитета. Магнетна поља за лечење рака 7. Друге „хипертермалне“ технике имају за циљ да загреју МП када су изложени осцилирајућим магнетним пољима, чиме се уништавају туморске ћелије. Принцип магнетне трансфекције, у коме се магнетно поље користи као трансфекционо средство за побољшање преноса ДНК у ћелије, обично се користи in vitro коришћењем низа невирусних и вирусних генских вектора за ћелијске линије које је тешко трансдуковати. Ефикасност ЛВ магнетотрансфекције је утврђена, са in vitro испоруком ЛВ-МП у ћелијску линију људског бронхијалног епитела у присуству статичког магнетног поља, повећавајући ефикасност трансдукције за 186 пута у поређењу са самим ЛВ вектором. ЛВ-МП је такође примењен на in vitro ЦФ модел, где је магнетна трансфекција повећала ЛВ трансдукцију у културама интерфејса ваздух-течност за 20 пута у присуству ЦФ спутума10. Међутим, in vivo магнетотрансфекција органа је добила релативно мало пажње и процењена је само у неколико студија на животињама11,12,13,14,15, посебно у плућа16,17. Ипак, могућности за магнетну трансфекцију у терапији плућа за ЦФ су јасне. Тан и др. (2020) су изјавили да ће „студија доказивања концепта ефикасне плућне испоруке магнетних наночестица отворити пут будућим стратегијама инхалације ЦФТР-а за побољшање клиничких исхода код пацијената са ЦФ“6.
Понашање малих магнетних честица на површинама дисајних путева у присуству примењеног магнетног поља је тешко визуализовати и проучавати, те је стога слабо схваћено. У другим студијама, развили смо методу фазно-контрастног рендгенског снимања засновану на синхротронском пропагацији (PB-PCXI) за неинвазивну визуализацију и квантификацију ситних in vivo промена у дубини ASL18 и понашању MCT19,20 како бисмо директно измерили хидратацију површине гасног канала и користили је као рани индикатор ефикасности лечења. Поред тога, наша метода MCT евалуације користи честице пречника 10–35 µm састављене од алуминијума или стакла високог индекса преламања као MCT маркере видљиве помоћу PB-PCXI21. Обе технике су погодне за визуализацију низа типова честица, укључујући MP.
Због високе просторне и временске резолуције, наше технике анализе ASL и MCT засноване на PB-PCXI су веома погодне за испитивање динамике и образаца понашања појединачних и масовних честица in vivo како би нам помогле да разумемо и оптимизујемо технике испоруке MP гена. Приступ који овде користимо потиче из наших студија коришћењем SPring-8 BL20B2 снопа, у којима смо визуализовали кретање течности након испоруке лажне векторске дозе у назалне и плућне дисајне путеве мишева како бисмо објаснили наше неуниформне обрасце експресије гена примећене у нашим студијама на животињама са дозама носача гена 3,4.
Циљ ове студије био је да се користи синхротрон PB-PCXI за визуелизацију in vivo кретања низа микроплазматских ћелија у трахеји живих пацова. Ове PB-PCXI студије снимања су дизајниране да тестирају низ микроплазматских ћелија, јачине магнетног поља и локација како би се утврдио њихов утицај на кретање микроплазматских ћелија. Претпоставили смо да би споља примењено магнетно поље помогло да испоручени микроплазматски ћелија остане или се помери ка циљаном подручју. Ове студије су нам такође омогућиле да идентификујемо конфигурације магнета које максимизирају број честица задржаних у трахеји након таложења. У другој серији студија, покушали смо да користимо ову оптималну конфигурацију да бисмо демонстрирали образац трансдукције који је резултат in vivo испоруке леве претплатничких ћелија (ЛП) у дисајне путеве пацова, на основу претпоставке да би испорука ЛП-П у контексту циљања дисајних путева резултирала побољшаном ефикасношћу трансдукције ЛП.
Све студије на животињама су спроведене у складу са протоколима које је одобрио Универзитет у Аделаиди (M-2019-060 и M-2020-022) и Комитет за етику синхротрона на животињама SPring-8. Експерименти су спроведени у складу са смерницама ARRIVE.
Сва рендгенска снимања су извршена на линији снопа BL20XU на синхротрону SPring-8 у Јапану, користећи поставку сличну оној која је претходно описана21,22. Укратко, експериментална кутија је била удаљена 245 м од синхротронског прстена за складиштење. Удаљеност између узорка и детектора од 0,6 м користи се за студије снимања честица и 0,3 м за in vivo студије снимања ради генерисања ефеката фазног контраста. Коришћена је енергија монохроматског снопа од 25 keV. Слике су снимљене помоћу конвертора рендгенских зрака високе резолуције (SPring-8 BM3) повезаног са sCMOS детектором. Конвертор претвара рендгенске зраке у видљиву светлост користећи сцинтилатор дебљине 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), који се затим усмерава на sCMOS сензор користећи микроскопски објектив × 10 (NA 0,3). sCMOS детектор је био Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Јапан) са величином низа од 2048 × 2048 пиксела и величина сирових пиксела од 6,5 × 6,5 µm. Ова поставка даје ефективну изотропну величину пиксела од 0,51 µm и видно поље од приближно 1,1 mm × 1,1 mm. Дужина експозиције од 100 ms је изабрана да би се максимизирао однос сигнал-шум магнетних честица унутар и изван дисајних путева, а истовремено минимизирали артефакти кретања изазвани дисањем. За in vivo студије, брзи рендгенски затварач је постављен у путању рендгенских зрака како би се ограничила доза зрачења блокирањем рендгенског снопа између експозиција.
Носач LV није коришћен ни у једној SPring-8 PB-PCXI студији снимања јер комора за снимање BL20XU није сертификована за биолошку безбедност нивоа 2. Уместо тога, одабрали смо низ добро окарактерисаних микроплазматских елемената од два комерцијална добављача - који покривају низ величина, материјала, концентрација гвожђа и примена - прво да бисмо разумели како магнетна поља утичу на кретање микроплазматских елемената унутар стаклених капилара, а затим и у живим дисајним путевима. на површини. МП се крећу у величини од 0,25 до 18 μм и направљени су од различитих материјала (видети Табелу 1), али састав сваког узорка, укључујући величину магнетних честица унутар МП, није познат. На основу наших опсежних МЦТ студија 19, 20, 21, 23, 24, очекујемо да се МП величине чак и до 5 μм могу видети на површини трахеалног дисајног пута, на пример одузимањем узастопних фрејмова како би се видела побољшана видљивост кретања МП. Један МП величине 0,25 μм је мањи од резолуције уређаја за снимање, али се очекује да ПБ-ПЦXИ детектује њихов запремински контраст и кретање површинске течности на којој су депоновани након депозиције.
Узорци за сваки МП у Табели 1 припремљени су у стакленим капиларама од 20 μl (Drummond Microcaps, PA, САД) са унутрашњим пречником од 0,63 mm. Корпускуларне честице су доступне у води, док су CombiMag честице доступне у произвођачевој патентираној течности. Свака епрувета је до пола напуњена течношћу (приближно 11 μl) и постављена на држач узорка (видети слику 1). Стаклене капиларе су постављене хоризонтално на постоље за узорак у кутији за снимање, респективно, и позициониране су на ивице течности. Магнет пречника 19 mm (дужине 28 mm) од никл љуске, ретких земаља, неодимијума, гвожђа и бора (NdFeB) (N35, кат. бр. LM1652, Jaycar Electronics, Аустралија) са резидуалном магнетизацијом од 1,17 Тесла био је причвршћен за посебно постоље за транслацију како би се постигла даљинска промена његовог положаја током снимања. Снимање рендгенских слика почиње када је магнет постављен приближно 30 mm изнад узорка, а слике се снимају брзином од 4 кадра у секунди. Током снимања, магнет је био приближен... стаклена капиларна цев (на удаљености од око 1 мм), а затим померана дуж цеви да би се проценили ефекти јачине поља и положаја.
Поставка за ин витро снимање која садржи МП узорке у стакленим капиларама на постољу за xy транслацију узорка. Путања рендгенског снопа је означена црвеном испрекиданом линијом.
Када је утврђена видљивост микроплазматских ћелија in vitro, један подскуп је тестиран in vivo на женским албино Вистар пацовима дивљег типа (старости ~12 недеља, ~200 г). 0,24 мг/кг медетомидина (Домитор®, Зеноак, Јапан), 3,2 мг/кг мидазолама (Дормикум®, Астелас Фарма, Јапан) и 4 мг/кг буторфанола (Веторфале®, Меији Сеика). Пацови су анестезирани смешом (Фарма), Јапан) интраперитонеалном ињекцијом. Након анестезије, припремљени су за снимање уклањањем крзна око трахеје, уметањем ендотрахеалне цеви (ЕТ; 16 Ga и.в. канила, Терумо БЦТ) и имобилизацијом у лежећем положају на прилагођеној плочи за снимање која садржи термичку кесу за одржавање телесне температуре 22. Плоча за снимање је затим причвршћена за постоље за транслацију узорка у кутији за снимање под благим углом како би се трахеја хоризонтално поравнала на рендгенском снимку, као што је приказано на слици. 2а.
(а) Поставка за снимање in vivo у кутији за снимање SPring-8, путања рендгенског снопа је означена црвеном испрекиданом линијом. (б, ц) Локализација магнета на трахеји је извршена даљински помоћу две ортогонално постављене IP камере. На левој страни слике екрана може се видети жичана петља која држи главу и канила за испоруку на месту унутар ЕТ цеви.
Систем шприц пумпе са даљинским управљањем (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) користећи стаклени шприц од 100 μl повезан је са PE10 цеви (спољни пречник 0,61 mm, унутрашњи пречник 0,28 mm) преко игле од 30 Ga. Означите цев како бисте осигурали да је врх у исправном положају у трахеји приликом уметања ЕТ цеви. Користећи микропумпу, клип шприца је извучен док је врх цеви био уроњен у МП узорак који треба да се испоручи. Напуњена цев за испоручивање је затим уметнута у ендотрахеалну цев, постављајући врх унутар најјачег дела очекиваног примењеног магнетног поља. Снимање слике је контролисано помоћу детектора дисања повезаног са нашом кутијом за мерење времена заснованом на Arduino-у, а сви сигнали (нпр. температура, дисање, отварање/затварање затварача и снимање слике) су снимљени помоћу Powerlab-а и LabChart-а (AD Instruments, Сиднеј, Аустралија) 22. Приликом снимања Када кућиште није било приступачно, две IP камере (Panasonic BB-SC382) су постављене под углом од приближно 90° једна у односу на другу и коришћене су за праћење положаја магнета у односу на... до трахеје током снимања (Сл. 2б, ц). Да би се минимизирали артефакти кретања, снимљена је једна слика по удисају током платоа протока на крају плимног периода.
Магнет је причвршћен за другу фазу која се може поставити удаљено од кућишта за снимање. Тестирани су различити положаји и конфигурације магнета, укључујући: Монтиран под углом од приближно 30° изнад трахеје (конфигурације приказане на сликама 2а и 3а); један магнет изнад животиње, а други испод, са половима подешеним да се привлаче (слика 3б); један магнет изнад животиње, а други испод, са половима подешеним да се одбијају (слика 3ц); и један магнет изнад и нормално на трахеју (слика 3д). Када се животиња и магнет конфигуришу и МП који се тестира убаци у шприц пумпу, испоручите дозу од 50 μl брзином од 4 μl/s док се снимају слике. Магнет се затим помера напред-назад дуж или бочно преко трахеје док се наставља снимање слика.
Конфигурација магнета за in vivo снимање (а) један магнет изнад трахеје под углом од приближно 30°, (б) два магнета подешена да привлаче, (ц) два магнета подешена да одбијају, (д) ​​један магнет изнад и управно у трахеји. Посматрач је гледао надоле од уста до плућа кроз трахеју, а рендгенски сноп је прошао кроз леву страну пацова и изашао на десној страни. Магнет се или помера дуж дисајних путева или лево и десно изнад трахеје у смеру рендгенског снопа.
Такође смо желели да утврдимо видљивост и понашање честица у дисајним путевима у одсуству збуњујућег дисања и срчаног рада. Стога су на крају периода снимања животиње хумано убијене због предозирања пентобарбиталом (Сомнопентил, Питман-Мур, Вашингтон Кросинг, САД; ~65 мг/кг ип). Неке животиње су остављене на платформи за снимање, а када су дисање и откуцаји срца престали, процес снимања је поновљен, додајући додатну дозу МП ако МП није био видљив на површини дисајних путева.
Добијене слике су кориговане у равном и тамном пољу, а затим састављене у филм (20 кадрова у секунди; 15-25 × нормална брзина у зависности од фреквенције дисања) коришћењем прилагођеног скрипта написаног у MATLAB-у (R2020a, The Mathworks).
Све студије испоруке ЛВ генског вектора спроведене су у Лабораторијском истраживачком центру за животиње на Универзитету у Аделаиди и имале су за циљ да се користе резултати експеримента SPring-8 како би се проценило да ли испорука ЛВ-МП у присуству магнетног поља може побољшати пренос гена in vivo. Да би се проценили ефекти МП и магнетног поља, третиране су две групе животиња: једној групи је дат ЛВ-МП са постављеним магнетом, а друга група је примила контролну групу са ЛВ-МП без магнета.
Вектори LV гена су генерисани коришћењем претходно описаних метода 25, 26. LacZ вектор експресује нуклеарно локализовани ген бета-галактозидазе, који је вођен конститутивним MPSV промотором (LV-LacZ), који производи плави реакциони производ у трансдукованим ћелијама, видљив на фронтовима плућног ткива и пресецима ткива. Титрација је извршена у ћелијским културама ручним бројањем LacZ позитивних ћелија хемоцитометром да би се израчунао титар у TU/ml. Носачи су криоконзервирани на -80 °C, одмрзнути пре употребе и везани за CombiMag мешањем у односу 1:1 и инкубацијом на леду најмање 30 минута пре испоруке.
Нормални пацови Sprague Dawley (n = 3/група, ~2-3) су анестезирани интраперитонеално смешом 0,4 мг/кг медетомидина (Domitor, Илиум, Аустралија) и 60 мг/кг кетамина (Илиум, Аустралија) старији од месец дана) ип) ињекцијом и нехируршком оралном канулацијом са 16 Ga ив канилом. Да би се осигурало да ткиво трахеалних дисајних путева прими ЛВ трансдукцију, условљено је коришћењем нашег претходно описаног протокола механичке пертурбације, у којем је површина трахеалних дисајних путева аксијално трљана жичаном корпом (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, САД) 30 s28. Трахеална примена ЛВ-МП је затим извршена у биолошко безбедносном кабинету приближно 10 минута након пертурбације.
Магнетно поље коришћено у овом експерименту конфигурисано је на сличан начин као у in vivo студији рендгенског снимања, са истим магнетима држаним изнад трахеје помоћу дестилационих стент клипова (Слика 4). Запремина од 50 μl (2 × 25 μl аликвота) LV-MP је убризгана у трахеју (n = 3 животиње) помоћу пипете која садржи гел врх као што је претходно описано. Контролна група (n = 3 животиње) примила је исте LV-MP без употребе магнета. Након што је инфузија завршена, канила се уклања из ЕТ цеви и животиња се екстубира. Магнет остаје на месту 10 минута, а затим се уклања. Пацови су примили поткожну дозу мелоксикама (1 ml/kg) (Ilium, Аустралија), након чега је уследила реверзија анестезије ип ињекцијом 1 mg/kg атипамазол хидрохлорида (Antisedan, Zoetis, Аустралија). Пацови су држани на топлом и праћени до потпуног опоравка од анестезије.
Уређај за испоруку ЛВ-МП у биолошко-безбедносном ормарићу. Светло сиви Луер наставак ЕТ цеви може се видети како вири из уста, а гел врх пипете приказан на слици се убацује кроз ЕТ цев до жељене дубине у трахеју.
Недељу дана након поступка дозирања LV-MP, животиње су хумано убијене инхалацијом 100% CO2, а експресија LacZ је процењена коришћењем нашег стандардног X-gal третмана. Три каудална најхрскавичавија прстена су уклоњена како би се осигурало да било какво механичко оштећење или задржавање течности од постављања ендотрахеалне цеви није укључено у анализу. Свака трахеја је уздужно пресечена да би се створиле две половине за анализу, и постављене су у посуду која садржи силиконску гуму (Sylgard, Dow Inc) коришћењем Minutien игле (Fine Science Tools) да би се визуелизовала луминална површина. Дистрибуција и образац трансдукованих ћелија потврђени су фронталном фотографијом коришћењем Nikon микроскопа (SMZ1500) са DigiLite камером и TCapture софтвером (Tucsen Photonics, Кина). Слике су снимљене при увећању од 20 пута (укључујући највеће подешавање за пуну ширину трахеје), при чему је цела дужина трахеје снимљена корак по корак, осигуравајући довољно преклапање између сваке слике како би се омогућило „спајање“ слика. Слике из сваке трахеје су затим састављене у једну. композитна слика помоћу програма Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) са алгоритам планарног кретања. Области експресије LacZ у композитним сликама трахеје сваке животиње квантификоване су коришћењем аутоматизованог MATLAB скрипта (R2020a, MathWorks) као што је претходно описано, користећи подешавања од 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 и Value < 0,7. Праћењем контура ткива, маска је ручно генерисана у GIMP v2.10.24 за сваку композитну слику како би се идентификовала област ткива и спречиле било какве лажне детекције изван ткива трахеје. Обојене области са свих композитних слика сваке животиње су сабране да би се генерисала укупна обојена површина за ту животињу. Обојена површина је затим подељена са укупном површином маске да би се генерисала нормализована површина.
Свака трахеја је уграђена у парафин и исечени су пресеци од 5 μm. Пресеци су контрастно обојени неутралном брзом црвеном бојом током 5 минута, а слике су снимљене коришћењем микроскопа Nikon Eclipse E400, DS-Fi3 камере и NIS софтвера за снимање елемената (верзија 5.20.00).
Све статистичке анализе су спроведене у програму GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Статистичка значајност је постављена на p ≤ 0,05. Нормалност је проверена помоћу Шапиро-Вилковог теста, а разлике у LacZ бојењу су процењене коришћењем неспареног t-теста.
Шест МП описаних у Табели 1 испитано је помоћу PCXI, а видљивост је описана у Табели 2. Два полистиренска МП (МП1 и МП2; 18 μm и 0,25 μm, респективно) нису била видљива под PCXI, али су остали узорци били идентификовани (примери су приказани на Слици 5). МП3 и МП4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm и 0,9 μm, респективно) су слабо видљиви. Иако садржи неке од најмањих тестираних честица, МП5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) је био најизраженији. Производ CombiMag МП6 је тешко уочити. У свим случајевима, наша способност детекције МП је значајно побољшана померањем магнета напред-назад паралелно са капиларом. Када су се магнети удаљавали од капиларе, честице су се протезале у дугим низовима, али како су се магнети приближавали и јачина магнетног поља повећавала, низови честица су се скраћивали како су честице мигрирале ка горњој површини капиларе (видети Додатни видео S1: МП4), повећавајући... Густина честица површине. Насупрот томе, када се магнет уклони из капиларе, јачина поља се смањује и микрочастици се преуређују у дугачке струне које се протежу од горње површине капиларе (видети Додатни видео S2:MP4). Након што магнет престане да се креће, честице настављају да се крећу кратко време након што достигну равнотежни положај. Како се микрочастица креће ка горњој површини капиларе и од ње, магнетне честице обично вуку остатке кроз течност.
Видљивост МП под PCXI значајно варира између узорака. (а) МП3, (б) МП4, (ц) МП5 и (д) МП6. Све слике приказане овде су снимљене магнетом који се налази приближно 10 мм директно изнад капиларе. Привидни велики кругови су мехурићи ваздуха заробљени у капиларама, јасно показујући црно-беле ивице фазно контрастног снимања. Црвени оквир садржи увећање које појачава контраст. Треба напоменути да пречници шематских приказа магнета на свим сликама нису у размери и да су приближно 100 пута већи него што је приказао.
Како се магнет помера лево и десно дуж врха капиларе, угао МП струне се мења како би се поравнао са магнетом (видети слику 6), чиме се оцртавају линије магнетног поља. Код МП3-5, након што тетива достигне гранични угао, честице се вуку дуж горње површине капиларе. Ово често доводи до тога да се МП групишу у веће групе близу места где је магнетно поље најјаче (видети Додатни видео S3:MP5). Ово је такође посебно очигледно када се снима близу краја капиларе, што узрокује да се МП агрегирају и концентришу на граници флуид-ваздух. Честице у МП6, које је било теже разазнати него у МП3-5, нису вукле док се магнет кретао дуж капиларе, већ су се МП струне дисоцирале, остављајући честице у видном пољу (видети Додатни видео S4:MP6). У неким случајевима, када је примењено магнетно поље смањено померањем магнета на велику удаљеност од места снимања, сви преостали МП су се полако спуштали на доњу површину цеви гравитацијом док су остајали у струни (видети Додатни видео S5: MP3).
Угао МП жице се мења како се магнет помера удесно изнад капиларе. (а) МП3, (б) МП4, (ц) МП5 и (д) МП6. Црвени оквир садржи увећање за побољшање контраста. Треба напоменути да су додатни видео снимци информативни јер откривају важне информације о структури честица и динамичким информацијама које се не могу визуализовати на овим статичким сликама.
Наши тестови су показали да полако померање магнета напред-назад дуж трахеје олакшава визуелизацију МП у контексту сложеног кретања in vivo. Тестирање in vivo није спроведено јер полистиренске перле (МП1 и МП2) нису биле видљиве у капилари. Сваки од преостала четири МП је тестиран in vivo са дугом осом магнета конфигурисаном изнад трахеје под углом од око 30° у односу на вертикалу (видети слике 2б и 3а), јер је то резултирало дужим МП ланцима и било је ефикасније него конфигурација са прекинутим магнетом. МП3, МП4 и МП6 нису детектовани у трахеји ниједне живе животиње. Када су дисајни путеви пацова снимљени након што су животиње хумано убијене, честице су остале невидљиве чак и када је додата додатна запремина помоћу шприц пумпе. МП5 је имао највећи садржај гвожђе оксида и био је једина видљива честица, па је стога коришћен за процену и карактеризацију понашања МП in vivo.
Постављање магнета преко трахеје током испоруке МП резултирало је концентрацијом многих, али не свих, МП у видном пољу. Честице које улазе у трахеју најбоље се примећују код хумано жртвованих животиња. Слика 7 и додатни видео С6: МП5 показује брзо магнетно хватање и поравнање честица на површини вентралне трахеје, што указује да се МП могу усмерити у жељене регионе трахеје. Приликом претраживања дисталније дуж трахеје након испоруке МП, неки МП су пронађени ближе карини, што сугерише да јачина магнетног поља није била довољна да сакупи и задржи све МП, јер су испоручени кроз регион максималне јачине магнетног поља током процеса флуида. Ипак, постпорођајне концентрације МП биле су веће око снимљеног подручја, што сугерише да су многи МП остали у регионима дисајних путева где је примењена јачина магнетног поља била највећа.
Слике из (а) пре и (б) након убризгавања МП5 у трахеју недавно еутаназираног пацова са магнетом постављеним директно изнад подручја снимања. Снимљено подручје се налази између два хрскавичава прстена. Пре убризгавања МП, у дисајним путевима се налази мало течности. Црвени оквир садржи увећање за појачавање контраста. Ове слике су из видеа приказаног у Додатном видеу S6:MP5.
Транслација магнета дуж трахеје in vivo довела је до промене угла МП ланца унутар површине дисајних путева на начин сличан оном који се види у капиларама (видети слику 8 и додатни видео S7:MP5). Међутим, у нашој студији, МП ланци нису могли бити вучени дуж површине живих дисајних путева као што су могли са капиларима. У неким случајевима, МП ланац ће се продужити како се магнет креће лево и десно. Занимљиво је да смо такође открили да низ честица изгледа мења дубину површинског слоја течности када се магнет помера уздужно дуж трахеје и шири се када се магнет помера директно изнад главе и низ честица се ротира у вертикални положај (видети додатни видео S7). : MP5 у 0:09, доле десно). Карактеристични образац кретања се променио када је магнет транслиран преко врха трахеје латерално (то јест, лево или десно од животиње, а не дуж дужине трахеје). Честице су и даље биле јасно видљиве док су се кретале, али када је магнет уклоњен из трахеје, врхови низова честица су постали видљиви (видети Додатни видео S8:MP5, почев од 0:08). Ово је у складу са понашањем MP које смо посматрали под дејством примењеног магнетног поља у стакленој капилари.
Пример слике која приказује МП5 у трахеји живог анестезираног пацова. (а) Магнет се користи за снимање слика изнад и лево од трахеје, затим (б) након што се магнет помери удесно. Црвени оквир садржи увећање за појачавање контраста. Ове слике су из видеа приказаног у Додатном видеу S7:MP5.
Када су два пола била конфигурисана у оријентацији север-југ изнад и испод трахеје (тј. привлачећи се; Сл. 3б), МП акорди су изгледали дуже и налазили су се на бочном зиду трахеје, а не на дорзалној површини трахеје (видети Додатни видео С9:МП5). Међутим, високе концентрације честица на једној локацији (тј. дорзална површина трахеје) нису детектоване након испоруке течности када је коришћен уређај са два магнета, што се обично дешава када се користи уређај са једним магнетом. Затим, када је један магнет конфигурисан да одбија полове обрнуто (Сл. 3ц), број честица видљивих у видном пољу није се повећавао након испоруке. Подешавање обе конфигурације са два магнета је изазовно због високих јачина магнетног поља које вуку или гурају магнете, респективно. Подешавање је затим промењено на један магнет паралелан дисајним путевима, али који пролази кроз дисајне путеве под углом од 90 степени тако да линије поља прелазе зид трахеје ортогонално (Сл. 3д), оријентација дизајнирана да утврди да ли се може посматрати агрегација честица на бочном зиду. Међутим, у овој конфигурацији, Није било уочљивог кретања акумулације МП или кретања магнета. На основу свих ових резултата, за in vivo студије носача гена изабрана је конфигурација са једним магнетом и оријентацијом од 30 степени (слика 3а).
Када је животиња више пута снимана одмах након хуманог убиства, одсуство збуњујућег кретања ткива значило је да су се финије и краће линије честица могле разазнати у јасном интерхондралном пољу, „климаве“ у складу са транслационим кретањем магнета. Ипак, још увек се не може јасно видети присуство и кретање MP6 честица.
Титар LV-LacZ био је 1,8 × 108 TU/ml, а након мешања 1:1 са CombiMag MP (MP6), животиње су примиле 50 μl трахеалне дозе од 9 × 107 TU/ml LV носача (тј. 4,5 × 106 TU/пацов). У овим студијама, уместо транслације магнета током порођаја, фиксирали смо магнет у једном положају како бисмо утврдили да ли се LV трансдукција (а) може побољшати у поређењу са векторском испоруком у одсуству магнетног поља и (б) може ли се фокусирати. Ћелије дисајних путева се трансдукују у магнетне циљне регионе горњих дисајних путева.
Присуство магнета и употреба CombiMag-а у комбинацији са LV векторима нису имали негативне ефекте на здравље животиња, као ни наш стандардни протокол за испоруку LV вектора. Фронталне слике трахеалног региона подвргнутог механичком поремећају (Допунска слика 1) показале су да су постојали значајно виши нивои трансдукције у групи животиња третираних LV-MP када је магнет био присутан (Слика 9а). Само мала количина плавог LacZ бојења била је присутна у контролној групи (Слика 9б). Квантификација нормализованих X-Gal обојених подручја показала је да је примена LV-MP у присуству магнетног поља произвела приближно 6 пута веће побољшање (Слика 9ц).
Пример композитних слика које приказују трахеалну трансдукцију помоћу LV-MP (а) у присуству магнетног поља и (б) у одсуству магнета. (ц) Статистички значајно побољшање нормализоване површине LacZ трансдукције унутар трахеје при коришћењу магнета (*p = 0,029, t-тест, n = 3 по групи, средња вредност ± SEM).
Неутрално брзо црвено обојени пресеци (пример приказан на Додатној слици 2) показали су ћелије обојене LacZ-ом присутне у сличном обрасцу и локацији као што је претходно објављено.
Кључни изазов за генску терапију дисајних путева остаје прецизна локализација честица носача у регионима од интереса и постизање високог нивоа ефикасности трансдукције у покретном плућу у присуству протока ваздуха и активног чишћења слузи. За носаче леве коморе (ЛК) дизајниране за лечење ЦФ болести дисајних путева, повећање времена задржавања честица носача унутар проводљивих дисајних путева до сада је био недостижан циљ. Како су истакли Кастелани и др., употреба магнетних поља за побољшање трансдукције има предности у поређењу са другим методама испоруке гена као што је електропорација, јер може да комбинује једноставност, исплативост, локализацију испоруке, повећану ефикасност и краће време инкубације, а могуће и мању дозу носача10. Међутим, таложење и понашање магнетних честица in vivo у дисајним путевима под утицајем спољашњих магнетних сила никада није описано, нити је заправо изводљивост ове методе in vivo демонстрирана да побољша нивое експресије гена у нетакнутим живим дисајним путевима.
Наши in vitro синхротронски PCXI експерименти показали су да су све честице које смо тестирали, са изузетком полистиренског MP, биле видљиве у систему снимања који смо користили. У присуству магнетног поља, MP формирају низове чије су дужине повезане са типом честице и јачином магнетног поља (тј. близином и кретањем магнета). Као што је приказано на слици 10, низови које посматрамо настају зато што је свака појединачна честица магнетизована и индукује сопствено локално магнетно поље. Ова одвојена поља узрокују да се друге сличне честице агрегирају и повезују, са групним кретањима сличним низовима услед локалних сила од локалних привлачних и одбојних сила других честица.
Шематски приказ (а, б) низова честица генерисаних унутар капилара испуњених течношћу и (ц, д) трахеје испуњене ваздухом. Треба напоменути да капилари и трахеја нису нацртани у размери. Панел (а) такође садржи опис МП, који садржи честице Fe3O4 распоређене у низове.
Када је магнет померен изнад капиларе, угао низа честица достигао је критични праг за МП3-5 који садржи Fe3O4, након чега низ честица више није остајао у првобитном положају, већ се померао дуж површине до новог положаја.магнет.Овај ефекат се вероватно јавља зато што је површина стаклене капиларе довољно глатка да омогући ово кретање.Занимљиво је да се МП6 (CombiMag) није понашао на овај начин, вероватно зато што су честице биле мање, имале различите премазе или површинска наелектрисања, или је заштићена течност носач утицала на њихову способност кретања.Контраст слике CombiMag честица је такође слабији, што сугерише да течност и честице могу имати сличне густине и стога се не крећу лако једна према другој.Честице се такође могу заглавити ако се магнет креће пребрзо, што указује на то да јачина магнетног поља не може увек да превазиђе трење између честица у течности, што сугерише да можда није изненађујуће да су јачина магнетног поља и растојање између магнета и циљаног подручја веома важни.Узети заједно, ови резултати такође сугеришу да, иако магнети могу да ухвате многе МП које протичу кроз циљано подручје, мало је вероватно да се на магнете може ослонити да се крећу. CombiMag честице дуж површине трахеје. Стога закључујемо да in vivo LV-MP студије треба да користе статичка магнетна поља за физичко циљање одређених региона стабла дисајних путева.
Када се честице унесу у тело, тешко их је идентификовати у контексту сложеног покретног телесног ткива, али је способност њиховог откривања побољшана хоризонталним померањем магнета изнад трахеје како би се „померали“ МП нити. Иако је снимање уживо могуће, лакше је разазнати кретање честица када је животиња хумано убијена. Концентрације МП су генерално биле највеће на овој локацији када је магнет био постављен изнад подручја снимања, иако су се неке честице обично налазиле даље дуж трахеје. За разлику од ин витро студија, честице се не могу вући дуж трахеје померањем магнета. Ово откриће је у складу са начином на који слуз која прекрива површину трахеје обично обрађује удисане честице, заробљавајући их у слузи и потом их уклања механизмом мукоцилијарног чишћења.
Претпоставили смо да употреба магнета за привлачење изнад и испод трахеје (слика 3б) може резултирати уједначенијим магнетним пољем, уместо магнетног поља које је високо концентрисано у једној тачки, што потенцијално доводи до уједначеније расподеле честица. Међутим, наша прелиминарна студија није пронашла јасне доказе који би подржали ову хипотезу. Слично томе, конфигурисање пара магнета за одбијање (слика 3ц) није резултирало већим таложењем честица у снимљеном подручју. Ова два налаза показују да поставка са два магнета не побољшава значајно локалну контролу МП циљања и да је резултујуће јаке магнетне силе тешко конфигурисати, што овај приступ чини мање практичним. Слично томе, оријентација магнета изнад и кроз трахеју (слика 3д) такође није повећала број честица задржаних у снимљеном подручју. Неке од ових алтернативних конфигурација можда неће бити успешне јер резултирају нижим јачинама магнетног поља унутар подручја таложења. Стога се конфигурација са једним магнетом под углом од 30 степени (слика 3а) сматра најлакшом и најефикаснијом методом за in vivo тестирање.
Студија LV-MP показала је да када су LV вектори комбиновани са CombiMag-ом и испоручени након физичког поремећаја у присуству магнетног поља, нивои трансдукције су значајно повећани у трахеји у поређењу са контролама. На основу студија синхротронског снимања и резултата LacZ-а, магнетно поље је очигледно било у стању да сачува LV унутар трахеје и смањи број векторских честица које су одмах продрле дубоко у плућа. Таква побољшања циљања могу довести до веће ефикасности, уз смањење испоручених титара, трансдукције ван циља, инфламаторних и имунолошких нежељених ефеката и трошкова носача гена. Важно је напоменути да се, према произвођачу, CombiMag може користити у комбинацији са другим методама преноса гена, укључујући и друге вирусне векторе (као што је AAV) и нуклеинске киселине.