Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad užtikrintumėte geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Genų vektoriai, skirti cistinės fibrozės plaučių ligai gydyti, turėtų būti nukreipti į laidžiuosius kvėpavimo takus, nes periferinė plaučių transdukcija nesuteikia terapinės naudos. Virusų transdukcijos efektyvumas yra tiesiogiai susijęs su vektoriaus rezidavimo laiku. Tačiau pernešimo skysčiai, tokie kaip genų nešėjai, įkvėpimo metu natūraliai difunduoja į alveoles, o bet kokios formos terapinės dalelės greitai pašalinamos mukociliariniu transportu. Svarbu, bet sunku pasiekti genų nešėjų rezidavimo laiką kvėpavimo takuose. Su genų nešėjais konjuguotos magnetinės dalelės, kurias galima nukreipti į kvėpavimo takų paviršių, gali pagerinti regioninį taikymą. Dėl in vivo vizualizavimo iššūkių tokių mažų magnetinių dalelių elgesys kvėpavimo takų paviršiuje, esant taikomam magnetiniam laukui, yra menkai suprantamas. Šio tyrimo tikslas buvo panaudoti sinchrotroninį vaizdavimą, kad būtų galima vizualizuoti magnetinių dalelių serijos judėjimą anestezuotų žiurkių trachėjoje in vivo, siekiant ištirti individualių ir bendrų dalelių elgesio dinamiką ir modelius in vivo. Tada taip pat įvertinome, ar lentivirusinių magnetinių dalelių perdavimas esant magnetiniam laukui padidintų transdukcijos efektyvumą žiurkių trachėjoje. Sinchrotroninis rentgeno vaizdavimas atskleidžia magnetinių dalelių elgesį. dalelės nejudančiuose ir judančiuose magnetiniuose laukuose in vitro ir in vivo. Dalelių negalima lengvai tempti gyvų kvėpavimo takų paviršiumi magnetais, tačiau transportavimo metu nuosėdos susikaupia regėjimo lauke, kuriame magnetinis laukas yra stipriausias. Transdukcijos efektyvumas taip pat padidėjo šešis kartus, kai lentivirusinės magnetinės dalelės buvo tiekiamos esant magnetiniam laukui. Šie rezultatai rodo, kad lentivirusinės magnetinės dalelės ir magnetiniai laukai gali būti vertingi metodai, siekiant pagerinti genų vektorių taikymą ir padidinti transdukcijos lygį laidžiuose kvėpavimo takuose in vivo.
Cistinę fibrozę (CF) sukelia vieno geno, vadinamo CF transmembraniniu laidumo reguliatoriumi (CFTR), pakitimas. CFTR baltymas yra jonų kanalas, esantis daugelyje epitelio ląstelių visame kūne, įskaitant laidžiuosius kvėpavimo takus, kurie yra pagrindinė CF patogenezės vieta. CFTR defektai sukelia nenormalų vandens pernašą, dehidratuoja kvėpavimo takų paviršių ir sumažina kvėpavimo takų paviršiaus skysčio (ASL) sluoksnio storį. Tai taip pat sutrikdo mukociliarinės pernašos (MCT) sistemos gebėjimą pašalinti įkvėptas daleles ir patogenus iš kvėpavimo takų. Mūsų tikslas – sukurti lentivirusinę (LV) genų terapiją, kuri teiktų teisingą CFTR geno kopiją ir pagerintų ASL, MCT ir plaučių sveikatą, bei toliau kurti naujas technologijas, galinčias matuoti šiuos parametrus in vivo1.
LV vektoriai yra vieni iš pagrindinių kandidatų CF kvėpavimo takų genų terapijai, daugiausia dėl to, kad jie gali visam laikui integruoti terapinį geną į kvėpavimo takų bazines ląsteles (kvėpavimo takų kamienines ląsteles). Tai svarbu, nes jie gali atkurti normalią hidrataciją ir gleivių pašalinimą, diferencijuodamiesi į funkcines, su genu pakoreguotas CF susijusias kvėpavimo takų paviršiaus ląsteles, o tai duoda naudos visą gyvenimą. LV vektoriai turėtų būti nukreipti prieš laidžiuosius kvėpavimo takus, nes čia prasideda CF plaučių liga. Vektoriaus patekimas giliau į plaučius gali sukelti alveolių transdukciją, tačiau tai neturi terapinės naudos sergant CF. Tačiau skysčiai, tokie kaip genų nešėjai, natūraliai migruoja į alveoles įkvėpus po įvedimo3,4, o terapinės dalelės greitai pašalinamos į burnos ertmę MCT. LV transdukcijos efektyvumas yra tiesiogiai susijęs su tuo, kiek laiko vektorius išlieka šalia tikslinių ląstelių, kad būtų galima jį pasisavinti ląstelėse – „išlikimo laiku“5 – kurį lengvai sutrumpina įprastas regioninis oro srautas, taip pat koordinuotas dalelių gleivių surinkimas ir MCT. Sergant CF, gebėjimas pailginti LV buvimo laiką kvėpavimo takuose yra svarbus norint pasiekti aukštą transdukcijos lygį šiame regione, tačiau iki šiol tai buvo sudėtinga.
Siekdami įveikti šią kliūtį, manome, kad LV magnetinės dalelės (MP) gali padėti dviem papildomais būdais. Pirma, jas galima magnetiškai nukreipti į kvėpavimo takų paviršių, kad būtų pagerintas taikymas ir padėtų genų nešiklių dalelėms išlikti norimoje kvėpavimo takų srityje; ir ASL) judėti į 6 ląstelės sluoksnį. MP buvo plačiai naudojamos kaip tikslinės vaistų pernašos priemonės, kai jos jungiasi prie antikūnų, chemoterapinių vaistų ar kitų mažų molekulių, kurios jungiasi prie ląstelių membranų arba prie atitinkamų ląstelės paviršiaus receptorių ir kaupiasi naviko vietose, esant statinei elektrai. Magnetiniai laukai vėžio gydymui 7. Kitos „hiperterminės“ technikos siekia įkaitinti MP, kai jie veikiami svyruojančių magnetinių laukų, taip sunaikinant naviko ląsteles. Magnetinės transfekcijos principas, kai magnetinis laukas naudojamas kaip transfekcijos agentas DNR perdavimui į ląsteles pagerinti, dažniausiai naudojamas in vitro, naudojant įvairius nevirusinius ir virusinius genų vektorius sunkiai transdukuojamoms ląstelių linijoms. LV magnetotransfekcijos efektyvumas buvo nustatytas, kai in vitro LV-MP buvo pernešti į žmogaus bronchų epitelio ląstelių liniją esant statiniam magnetiniam laukui, o tai padidino transdukcijos efektyvumą 186 kartus, palyginti su vien LV vektoriaus naudojimu. LV-MP taip pat buvo pritaikytas in vitro CF modeliui, kur magnetinė transfekcija padidino LV transdukciją oro ir skysčio sąsajos kultūrose 20 kartų, esant CF skrepliams10. Tačiau organų magnetotransfekcijai in vivo buvo skirta palyginti mažai dėmesio ir ji buvo įvertinta tik keliuose tyrimuose su gyvūnais11,12,13,14,15, ypač plaučiuose16,17. Nepaisant to, magnetinės transfekcijos galimybės CF plaučių terapijos rezultatai yra aiškūs. Tan ir kt. (2020) teigė, kad „efektyvaus magnetinių nanodalelių tiekimo į plaučius koncepcijos įrodymo tyrimas atvers kelią būsimoms CFTR įkvėpimo strategijoms, siekiant pagerinti CF pacientų klinikinius rezultatus“6.
Mažų magnetinių dalelių elgesį kvėpavimo takų paviršiuose veikiant magnetiniam laukui sunku vizualizuoti ir tirti, todėl tai menkai suprantama. Kituose tyrimuose sukūrėme sinchrotroninio sklidimo pagrindu veikiantį fazinio kontrasto rentgeno vaizdinimo (PB-PCXI) metodą, skirtą neinvaziškai vizualizuoti ir kiekybiškai įvertinti nedidelius ASL gylio18 ir MCT elgesio19,20 pokyčius in vivo, siekiant tiesiogiai išmatuoti dujų kanalo paviršiaus hidrataciją ir naudoti kaip ankstyvą gydymo veiksmingumo rodiklį. Be to, mūsų MCT vertinimo metodas naudoja 10–35 µm skersmens daleles, sudarytas iš aliuminio oksido arba didelio lūžio rodiklio stiklo, kaip MCT žymenis, matomus naudojant PB-PCXI21. Abu metodai tinka įvairių tipų dalelių, įskaitant MP, vizualizavimui.
Dėl didelės erdvinės ir laikinės skiriamosios gebos mūsų PB-PCXI pagrįsti ASL ir MCT analizės metodai puikiai tinka tirti pavienių ir birių dalelių elgsenos dinamiką ir modelius in vivo, siekiant padėti mums suprasti ir optimizuoti MP genų tiekimo metodus. Mūsų naudojamas metodas pagrįstas mūsų tyrimais, naudojant SPring-8 BL20B2 spindulių liniją, kurioje vizualizavome skysčio judėjimą po fiktyvaus vektoriaus dozės tiekimo į pelių nosies ir plaučių kvėpavimo takus, kad paaiškintume mūsų nevienalyčius genų raiškos modelius, pastebėtus mūsų atliktuose genų nešėjų dozės tyrimuose su gyvūnais3,4.
Šio tyrimo tikslas buvo panaudoti sinchrotroninį PB-PCXI vizualizuoti MP serijos judėjimą gyvų žiurkių trachėjoje in vivo. Šie PB-PCXI vaizdavimo tyrimai buvo skirti išbandyti įvairius MP, magnetinio lauko stiprumus ir vietas, siekiant nustatyti jų poveikį MP judėjimui. Mes iškėlėme hipotezę, kad išoriškai veikiantis magnetinis laukas padėtų pristatytam MP išlikti arba judėti į tikslinę sritį. Šie tyrimai taip pat leido mums nustatyti magnetų konfigūracijas, kurios maksimaliai padidina dalelių, sulaikytų trachėjoje po nusėdimo, skaičių. Antroje tyrimų serijoje siekėme panaudoti šią optimalią konfigūraciją, kad pademonstruotume transdukcijos modelį, atsirandantį in vivo pateikus LV-MP į žiurkių kvėpavimo takus, remiantis prielaida, kad LV-MP pateikus taikant kvėpavimo takus, pagerėtų LV transdukcijos efektyvumas.
Visi tyrimai su gyvūnais buvo atlikti pagal Adelaidės universiteto (M-2019-060 ir M-2020-022) ir SPring-8 sinchrotroninių gyvūnų etikos komiteto patvirtintus protokolus. Eksperimentai buvo atlikti pagal ARRIVE gaires.
Visi rentgeno spindulių vaizdiniai tyrimai buvo atlikti BL20XU spindulių linijoje SPring-8 sinchrotrone Japonijoje, naudojant panašią į anksčiau aprašytą konfigūraciją21,22. Trumpai tariant, eksperimentinė dėžė buvo 245 m atstumu nuo sinchrotrono saugojimo žiedo. Dalelių vaizdavimo tyrimams naudojamas 0,6 m atstumas tarp mėginio ir detektoriaus, o in vivo vaizdavimo tyrimams – 0,3 m, siekiant sukurti fazinio kontrasto efektus. Buvo naudojama 25 keV monochromatinė spindulio energija. Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant didelės skiriamosios gebos rentgeno spindulių keitiklį (SPring-8 BM3), prijungtą prie sCMOS detektoriaus. Keitiklis konvertuoja rentgeno spindulius į matomą šviesą naudodamas 10 µm storio scintiliatorių (Gd3Al2Ga3O12), kuris vėliau nukreipiamas į sCMOS jutiklį, naudojant × 10 mikroskopo objektyvą (NA 0,3). sCMOS detektorius buvo „Orca-Flash4.0“ („Hamamatsu Photonics“, Japonija), kurio matricos dydis 2048 × 2048 pikselių ir neapdoroto pikselio dydis – 6,5 × 6,5 µm. Ši konfigūracija leidžia pasiekti efektyvų izotropinį pikselio dydį – 0,51 µm, o matymo lauką – maždaug 1,1 mm × 1,1 mm. 100 ms ekspozicijos trukmė buvo pasirinkta siekiant maksimaliai padidinti magnetinių dalelių signalo ir triukšmo santykį kvėpavimo takų viduje ir išorėje, kartu sumažinant kvėpavimo sukeltus judesio artefaktus. In vivo tyrimams rentgeno spindulių kelyje buvo įdėtas greitas rentgeno spindulių užraktas, siekiant apriboti radiacijos dozę blokuojant rentgeno spindulių pluoštą tarp ekspozicijų.
LV nešiklis nebuvo naudojamas jokiuose SPring-8 PB-PCXI vaizdinimo tyrimuose, nes BL20XU vaizdavimo kamera nėra sertifikuota pagal 2 biologinio saugumo lygį. Vietoj to, iš dviejų komercinių tiekėjų pasirinkome gerai apibūdintų MP asortimentą – apimantį įvairių dydžių, medžiagų, geležies koncentracijų ir pritaikymų – pirmiausia siekdami suprasti, kaip magnetiniai laukai veikia MP judėjimą stikliniuose kapiliaruose, o vėliau ir gyvų kvėpavimo takuose. ant paviršiaus. MP dydis svyruoja nuo 0,25 iki 18 μm ir yra pagaminti iš įvairių medžiagų (žr. 1 lentelę), tačiau kiekvieno mėginio sudėtis, įskaitant MP esančių magnetinių dalelių dydį, nežinoma. Remiantis mūsų atliktais išsamiais MCT tyrimais 19, 20, 21, 23, 24, tikimės, kad trachėjos kvėpavimo takų paviršiuje galima matyti net 5 μm dydžio MP, pavyzdžiui, atėmus iš eilės einančius kadrus, kad būtų geriau matomas MP judėjimas. Vienas 0,25 μm dydžio MP yra mažesnis nei vaizdo gavimo įrenginio skiriamoji geba, tačiau tikimasi, kad PB-PCXI aptiks jų tūrinį kontrastą ir paviršiaus skysčio, ant kurio jie nusėda po nusėdimo, judėjimą.
Kiekvieno 1 lentelėje nurodyto MP mėginiai buvo paruošti 20 μl stikliniuose kapiliaruose („Drummond Microcaps“, PA, JAV), kurių vidinis skersmuo yra 0,63 mm. Korpuskulinės dalelės yra vandenyje, o „CombiMag“ dalelės – gamintojo patentuotame skystyje. Kiekvienas mėgintuvėlis yra pusiau užpildytas skysčiu (maždaug 11 μl) ir uždėtas ant mėginio laikiklio (žr. 1 pav.). Stikliniai kapiliarai buvo horizontaliai uždėti ant mėginio stovo vaizdavimo dėžutėje ir išdėstyti skysčio kraštais. Prie atskiro transliacijos stovo buvo pritvirtintas 19 mm skersmens (28 mm ilgio) nikelio apvalkalo retųjų žemių neodimio geležies boro (NdFeB) magnetas (N35, kat. nr. LM1652, „Jaycar Electronics“, Australija), kurio liekamasis įmagnetėjimas yra 1,17 teslos, kad būtų galima nuotoliniu būdu pakeisti jo padėtį vaizdavimo metu. Rentgeno vaizdų gavimas prasideda, kai magnetas yra maždaug 30 mm virš mėginio, o vaizdai gaunami 4 kadrų per sekundę greičiu. Vaizdavimo metu magnetas buvo priartintas prie stiklinio kapiliaro. vamzdyje (maždaug 1 mm atstumu) ir tada stumiamas išilgai vamzdžio, siekiant įvertinti lauko stiprumo ir padėties poveikį.
In vitro vaizdinimo įranga, kurioje MP mėginiai yra stikliniuose kapiliaruose ant mėginio xy transliacijos staliuko. Rentgeno spindulių kelias pažymėtas raudona punktyrine linija.
Nustačius MP matomumą in vitro, jų pogrupis buvo išbandytas in vivo su laukinio tipo albinosėmis Wistar žiurkėmis (apie 12 savaičių amžiaus, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidino (Domitor®, Zenoaq, Japonija), 3,2 mg/kg midazolamo (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonija) ir 4 mg/kg butorfanolio (Vetorphale®, Meiji Seika). Žiurkėms buvo sušvirkšta intraperitoninė anestezija (Pharma, Japonija) mišiniu. Po anestezijos jos buvo paruoštos vaizdavimui pašalinant kailį aplink trachėją, įkišant endotrachėjinį vamzdelį (ET; 16 Ga iv kaniulė, Terumo BCT) ir imobilizuojant jas ant nugaros ant specialiai pagamintos vaizdinimo plokštelės su terminiu maišeliu kūno temperatūrai palaikyti. 22 Tada vaizdinimo plokštelė buvo pritvirtinta prie mėginio perkėlimo stovo vaizdavimo dėžutėje šiek tiek kampu, kad trachėja rentgeno nuotraukoje būtų horizontaliai sulygiuota, kaip parodyta paveiksle. 2a.
(a) In vivo vaizdavimo įranga SPring-8 vaizdavimo dėžutėje, rentgeno spindulių kelias pažymėtas raudona punktyrine linija. (b, c) Magneto lokalizacija trachėjoje buvo atlikta nuotoliniu būdu, naudojant dvi statmenai sumontuotas IP kameras. Ekrano vaizdo kairėje pusėje matyti galvutę laikanti vielinė kilpa ir ET vamzdelyje esanti tiekimo kaniulė.
Nuotolinio valdymo švirkšto siurblio sistema (UMP2, „World Precision Instruments“, Sarasota, FL) su 100 μl stikliniu švirkštu buvo prijungta prie PE10 vamzdelio (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) per 30 Ga adatą. Pažymėkite vamzdelį, kad įkišant ET vamzdelį, jo galiukas būtų teisingoje padėtyje trachėjoje. Naudojant mikrosiurblį, švirkšto stūmoklis buvo ištrauktas, o vamzdelio galiukas buvo panardintas į tiekiamą MP mėginį. Užpildytas tiekimo vamzdelis buvo įkištas į endotrachėjinį vamzdelį, jo galiuką pastatant stipriausioje numatomo taikomo magnetinio lauko dalyje. Vaizdo gavimas buvo kontroliuojamas naudojant kvėpavimo detektorių, prijungtą prie mūsų „Arduino“ pagrindu sukurtos laiko dėžutės, o visi signalai (pvz., temperatūra, kvėpavimas, sklendės atidarymas/uždarymas ir vaizdo gavimas) buvo registruojami naudojant „Powerlab“ ir „LabChart“ („AD Instruments“, Sidnėjus, Australija) 22. Kai vaizdo gavimo metu kamera buvo nepasiekiama, dvi IP kameros („Panasonic BB-SC382“) buvo išdėstytos maždaug 90° kampu viena kitos atžvilgiu ir buvo naudojamos magneto padėčiai trachėjos atžvilgiu stebėti. vaizdavimo metu (2b, c pav.). Siekiant sumažinti judesio artefaktus, potvynio ir atoslūgio pabaigos tėkmės plokštumos metu buvo užfiksuotas vienas vaizdas per kiekvieną įkvėpimą.
Prie antrojo etapo pritvirtintas magnetas, kurį galima pastatyti nuotoliniu būdu iš vaizdo gavimo korpuso išorės. Buvo išbandytos įvairios magnetų padėtys ir konfigūracijos, įskaitant: sumontuotą maždaug 30° kampu virš trachėjos (konfigūracijos parodytos 2a ir 3a paveiksluose); vieną magnetą virš gyvūno, o kitą apačioje, o polius nustatytus traukti (3b paveikslas); vieną magnetą virš gyvūno, o kitą apačioje, o polius nustatyti stumia (3c paveikslas); ir vieną magnetą virš trachėjos ir statmenai jai (3d paveikslas). Kai gyvūnas ir magnetas sukonfigūruoti ir tiriamasis MP įdėtas į švirkšto pompą, 50 μl dozė tiekiama 4 μl/s greičiu, tuo pačiu metu gaunant vaizdus. Tada magnetas judinamas pirmyn ir atgal išilgai arba į šonus skersai trachėjos, toliau gaunant vaizdus.
Magneto konfigūracija in vivo vaizdavimui: (a) vienas magnetas virš trachėjos maždaug 30° kampu, (b) du magnetai, nustatyti traukti, (c) du magnetai, nustatyti stumia, (d) vienas magnetas virš trachėjos ir statmenai jai. Stebėtojas žiūrėjo žemyn nuo burnos į plaučius per trachėją, o rentgeno spindulys praėjo pro žiurkės kairę pusę ir išėjo iš dešinės pusės. Magnetas judinamas arba išilgai kvėpavimo takų, arba į kairę ir į dešinę virš trachėjos rentgeno spindulių kryptimi.
Taip pat siekėme nustatyti dalelių matomumą ir elgseną kvėpavimo takuose, kai nėra painiojančio kvėpavimo ir širdies veiklos. Todėl vaizdinimo laikotarpio pabaigoje gyvūnai buvo humaniškai numarinti dėl pentobarbitalio perdozavimo („Somnopentil“, „Pitman-Moore“, Vašingtono Krosingas, JAV; ~65 mg/kg i.p.). Kai kurie gyvūnai buvo palikti ant vaizdavimo platformos, o kvėpavimui ir širdies plakimui sustojus, vaizdinimo procesas buvo pakartotas, pridedant papildomą MP dozę, jei MP nebuvo matomas kvėpavimo takų paviršiuje.
Gauti vaizdai buvo pakoreguoti pagal plokščio ir tamsaus lauko efektus, o tada sujungti į filmą (20 kadrų per sekundę; 15–25 kartus didesnis nei įprastas greitis, priklausomai nuo kvėpavimo dažnio), naudojant MATLAB (R2020a, „The Mathworks“) parašytą skriptą.
Visi LV genų vektorių pernešimo tyrimai buvo atlikti Adelaidės universiteto Laboratorinių gyvūnų tyrimų centre, o jų tikslas buvo panaudoti SPring-8 eksperimento rezultatus siekiant įvertinti, ar LV-MP pernešimas esant magnetiniam laukui gali sustiprinti genų perdavimą in vivo. Siekiant įvertinti MP ir magnetinio lauko poveikį, buvo gydytos dvi gyvūnų grupės: vienai grupei buvo duodamas LV-MP su pritvirtintu magnetu, o kitai grupei – kontrolinė grupė su LV-MP be magneto.
LV geno vektoriai buvo sukurti naudojant anksčiau aprašytus metodus 25, 26. LacZ vektorius ekspresuoja branduolyje lokalizuotą beta-galaktozidazės geną, kurį valdo konstitucinis MPSV promotorius (LV-LacZ), kuris transdukuotose ląstelėse gamina mėlyną reakcijos produktą, matomą plaučių audinio frontuose ir audinių pjūviuose. Titravimas buvo atliktas ląstelių kultūrose rankiniu būdu suskaičiuojant LacZ teigiamų ląstelių skaičių hemocitometru, kad būtų galima apskaičiuoti titrą TU/ml. Nešėjai kriokonservuojami -80 °C temperatūroje, prieš naudojimą atšildomi ir surišami su CombiMag sumaišant santykiu 1:1 ir inkubuojant ant ledo mažiausiai 30 minučių prieš tiekimą.
Normalios Sprague Dawley žiurkės (n = 3/grupė, ~2-3) buvo anestezuojamos intraperitoniniu būdu 0,4 mg/kg medetomidino (Domitor, Ilium, Australija) ir 60 mg/kg ketamino (Ilium, Australija) mišiniu (1 mėnesio amžiaus) intraperitonine injekcija ir neskausmingu būdu įvedus per burną 16 Ga intraveninę kaniulę. Siekiant užtikrinti, kad trachėjos kvėpavimo takų audinys gautų kairiojo skilvelio transdukciją, jis buvo kondicionuojamas naudojant anksčiau aprašytą mechaninio perturbacijos protokolą, kurio metu trachėjos kvėpavimo takų paviršius buvo trinamas ašine kryptimi vieliniu krepšeliu (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, JAV) 30 s28. Tada, praėjus maždaug 10 minučių po perturbacijos, trachėja buvo anestezuojama LV-MP biologinės saugos spintoje.
Šiame eksperimente naudotas magnetinis laukas buvo sukonfigūruotas panašiai kaip ir in vivo rentgeno spindulių vaizdinimo tyrime, naudojant tuos pačius magnetus, laikomus virš trachėjos naudojant distiliavimo stento spaustukus (4 pav.). 50 μl tūris (2 × 25 μl alikvotinės dalys) LV-MP buvo įleista į trachėją (n = 3 gyvūnai) naudojant pipetę su gelio antgaliu, kaip aprašyta anksčiau. Kontrolinė grupė (n = 3 gyvūnai) gavo tuos pačius LV-MP, nenaudojant magneto. Baigus infuziją, kaniulė išimama iš ET vamzdelio ir gyvūnas ekstubuojamas. Magnetas lieka vietoje 10 minučių, tada išimamas. Žiurkėms buvo suleista poodinė meloksikamo dozė (1 ml/kg) („Ilium“, Australija), po to anestezija buvo panaikinta intraperitonealine 1 mg/kg atipamazolo hidrochlorido („Antisedan“, „Zoetis“, Australija) injekcija. Žiurkės buvo laikomos šiltai ir stebimos, kol visiškai atsigavo po anestezijos.
LV-MP tiekimo įtaisas biologinio saugumo spintoje. Matyti, kaip iš burnos kyšo šviesiai pilka ET vamzdelio Luerio jungtis, o paveikslėlyje parodytas gelio pipetės galiukas per ET vamzdelį įkišamas į trachėją iki norimo gylio.
Praėjus savaitei po LV-MP dozavimo procedūros, gyvūnai buvo humaniškai numarinti įkvėpus 100 % CO2, o LacZ raiška buvo įvertinta naudojant mūsų standartinį X-gal gydymą. Trys labiausiai kremzliniai uodegos žiedai buvo pašalinti, siekiant užtikrinti, kad analizėje nebūtų įtraukti jokie mechaniniai pažeidimai ar skysčių susilaikymas dėl endotrachėjinio vamzdelio įdėjimo. Kiekviena trachėja buvo išilgai perpjauta, kad būtų sukurtos dvi pusės analizei, ir jos buvo įdėtos į indą su silikonine guma (Sylgard, Dow Inc), naudojant Minutien adatą (Fine Science Tools), kad būtų galima vizualizuoti liuminalinį paviršių. Transdukuotų ląstelių pasiskirstymas ir modelis buvo patvirtinti frontalios fotografijos būdu, naudojant Nikon mikroskopą (SMZ1500) su DigiLite kamera ir TCapture programine įranga (Tucsen Photonics, Kinija). Vaizdai buvo gauti 20 kartų padidinimu (įskaitant didžiausią nustatymą visam trachėjos pločiui), o visas trachėjos ilgis buvo vaizduojamas žingsnis po žingsnio, užtikrinant pakankamą kiekvieno vaizdo persidengimą, kad būtų galima „sujungti“. Tada vaizdai iš kiekvienos trachėjos buvo surinkti į Vienas sudėtinis vaizdas naudojant „Image Composite Editor v2.0.3“ („Microsoft Research“) ir plokštuminio judėjimo algoritmą. LacZ raiškos sritys kiekvieno gyvūno trachėjos sudėtiniuose vaizduose buvo kiekybiškai įvertintos naudojant automatizuotą MATLAB skriptą („R2020a“, „MathWorks“), kaip aprašyta anksčiau, naudojant 0,35 < atspalvio < 0,58, sodrumo > 0,15 ir reikšmės < 0,7 nustatymus. Atsekant audinio kontūrus, kiekvienam sudėtiniam vaizdui GIMP v2.10.24 programoje buvo rankiniu būdu sugeneruota kaukė, siekiant nustatyti audinio plotą ir užkirsti kelią bet kokiems klaidingiems aptikimams iš išorės, esančių už trachėjos audinio ribų. Nudažytos sritys iš visų sudėtinių vaizdų iš kiekvieno gyvūno buvo susumuotos, kad būtų gautas bendras to gyvūno nudažytas plotas. Tada nudažytas plotas buvo padalytas iš bendro kaukės ploto, kad būtų gautas normalizuotas plotas.
Kiekviena trachėja buvo įmerkta į parafiną ir išpjauti 5 μm storio pjūviai. Pjūviai 5 minutes buvo dažomi neutralia ryškia raudona spalva, o vaizdai gauti naudojant „Nikon Eclipse E400“ mikroskopą, DS-Fi3 kamerą ir NIS elementų fiksavimo programinę įrangą (5.20.00 versija).
Visos statistinės analizės atliktos naudojant „GraphPad Prism v9“ („GraphPad Software, Inc.“). Statistinis reikšmingumas nustatytas ties p ≤ 0,05. Normalumas patikrintas naudojant Shapiro-Wilk testą, o LacZ dažymo skirtumai įvertinti naudojant neporinį t testą.
Šeši 1 lentelėje aprašyti MP buvo ištirti naudojant PCXI, o matomumas aprašytas 2 lentelėje. Du polistireno MP (MP1 ir MP2; atitinkamai 18 μm ir 0,25 μm) nebuvo matomi naudojant PCXI, tačiau likę mėginiai buvo atpažįstami (pavyzdžiai pateikti 5 paveiksle). MP3 ir MP4 (atitinkamai 10–15 % Fe3O4; 0,25 μm ir 0,9 μm) yra silpnai matomi. Nors juose yra keletas mažiausių tirtų dalelių, MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 μm) buvo ryškiausias. „CombiMag“ produktą MP6 sunku pastebėti. Visais atvejais mūsų gebėjimą aptikti MP žymiai pagerino magneto perkėlimas pirmyn ir atgal lygiagrečiai kapiliarui. Magnetams tolstant nuo kapiliaro, dalelės išsitiesė ilgomis stygomis, tačiau magnetams artėjant ir didėjant magnetinio lauko stiprumui, dalelių stygos trumpėjo, dalelėms migruojant link kapiliaro viršutinio paviršiaus (žr. papildomą vaizdo įrašą S1: MP4), didėjant dalelių tankiui. paviršiaus. Ir atvirkščiai, kai magnetas pašalinamas iš kapiliaro, lauko stiprumas sumažėja ir MP persitvarko į ilgas stygas, besitęsiančias nuo kapiliaro viršutinio paviršiaus (žr. papildomą vaizdo įrašą S2:MP4). Magnetui nustojus judėti, dalelės dar trumpą laiką juda pasiekusios pusiausvyros padėtį. MP judant link kapiliaro viršutinio paviršiaus ir tolyn nuo jo, magnetinės dalelės paprastai tempia šiukšles per skystį.
MP matomumas taikant PCXI labai skiriasi tarp mėginių. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ir (d) MP6. Visi čia parodyti vaizdai buvo padaryti magnetu, esančiu maždaug 10 mm tiesiai virš kapiliarų. Dideli matomi apskritimai yra kapiliaruose įstrigę oro burbuliukai, aiškiai rodantys fazinio kontrasto vaizdavimo juodos ir baltos spalvos kraštus. Raudoname langelyje pavaizduotas kontrastą stiprinantis padidinimas. Atkreipkite dėmesį, kad visuose paveiksluose magnetų schemų skersmenys nėra mastelio ir yra maždaug 100 kartų didesni nei parodyta.
Magnetui judant į kairę ir į dešinę išilgai kapiliaro viršaus, MP stygos kampas keičiasi, kad sutaptų su magnetu (žr. 6 pav.), taip apibrėžiant magnetinio lauko linijas. MP3-5 atveju, kai chorda pasiekia slenksčio kampą, dalelės yra tempiamos išilgai kapiliaro viršutinio paviršiaus. Dėl to MP dažnai susitelkia į didesnes grupes netoli tos vietos, kur magnetinis laukas yra stipriausias (žr. papildomą vaizdo įrašą S3:MP5). Tai taip pat ypač akivaizdu vaizduojant arti kapiliaro galo, dėl ko MP agreguojasi ir koncentruojasi skysčio ir oro sąsajoje. MP6 dalelės, kurias buvo sunkiau atskirti nei MP3-5, nebuvo tempiamos magnetui judant išilgai kapiliaro, tačiau MP stygos disocijuojosi, palikdamos daleles matymo lauke (žr. papildomą vaizdo įrašą S4:MP6). Kai kuriais atvejais, kai taikomas magnetinis laukas buvo sumažintas perkeliant magnetą dideliu atstumu nuo vaizdavimo vietos, likę MP lėtai nusileido ant vamzdelio apatinio paviršiaus veikiant gravitacijai, likdami stygoje (žr. papildomą vaizdo įrašą S5:MP3).
MP stygos kampas keičiasi, kai magnetas slenka į dešinę virš kapiliaro. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ir (d) MP6. Raudoname langelyje yra kontrastą didinantis padidinimas. Atkreipkite dėmesį, kad papildomi vaizdo įrašai yra informatyvūs, nes juose atskleidžiama svarbi dalelių struktūra ir dinaminė informacija, kurios negalima vizualizuoti šiuose statiniuose vaizduose.
Mūsų bandymai parodė, kad lėtas magneto judinimas pirmyn ir atgal palei trachėją palengvina MP vizualizaciją sudėtingo judėjimo kontekste in vivo. In vivo bandymai nebuvo atlikti, nes kapiliare nebuvo matomi polistireno karoliukai (MP1 ir MP2). Kiekvienas iš likusių keturių MP buvo išbandytas in vivo, magneto ilgąją ašį sukonfigūruotą virš trachėjos maždaug 30° kampu vertikalės atžvilgiu (žr. 2b ir 3a paveikslus), nes tai lėmė ilgesnes MP grandines ir buvo efektyvesnis nei nutraukta magneto konfigūracija. MP3, MP4 ir MP6 nebuvo aptikti jokių gyvų gyvūnų trachėjoje. Kai žiurkių kvėpavimo takai buvo vaizduojami po to, kai gyvūnai buvo humaniškai numarinti, dalelės liko nematomos net ir pridėjus papildomo tūrio naudojant švirkšto pompą. MP5 turėjo didžiausią geležies oksido kiekį ir buvo vienintelė matoma dalelė, todėl buvo naudojama MP elgsenai in vivo įvertinti ir apibūdinti.
Uždėjus magnetą virš trachėjos MP tiekimo metu, daugelis, bet ne visi MP buvo sutelkti regėjimo lauke. Į trachėją patekusios dalelės geriausiai stebimos humaniškai paaukotuose gyvūnuose. 7 paveikslas ir papildomas S6 vaizdo įrašas: MP5 rodo greitą magnetinį dalelių surinkimą ir išsidėstymą ant ventralinės trachėjos paviršiaus, o tai rodo, kad MP gali būti nukreipti į norimas trachėjos sritis. Ieškant distaliau palei trachėją po MP tiekimo, kai kurie MP buvo rasti arčiau vingio, o tai rodo, kad magnetinio lauko stiprumas buvo nepakankamas visiems MP surinkti ir išlaikyti, nes jie buvo tiekiami per maksimalaus magnetinio lauko stiprumo sritį skysčio proceso metu. Nepaisant to, po gimdymo MP koncentracijos buvo didesnės aplink vaizduojamą sritį, o tai rodo, kad daugelis MP liko kvėpavimo takų srityse, kur taikomas magnetinio lauko stiprumas buvo didžiausias.
Vaizdai iš (a) ir (b) po MP5 suleidimo į neseniai užmigdytos žiurkės trachėją, magnetą pastatius tiesiai virš vaizdavimo srities. Vaizduojama sritis yra tarp dviejų kremzlės žiedų. Prieš MP suleidimą kvėpavimo takuose yra šiek tiek skysčio. Raudoname langelyje pavaizduotas kontrastą didinantis vaizdas. Šie vaizdai yra iš vaizdo įrašo, parodyto papildomame vaizdo įraše S6:MP5.
Magneto judėjimas trachėja in vivo sukėlė MP grandinės kampą kvėpavimo takų paviršiuje panašiai kaip kapiliaruose (žr. 8 paveikslą ir papildomą S7 vaizdo įrašą: MP5). Tačiau mūsų tyrime MP negalėjo būti tempiami gyvų kvėpavimo takų paviršiumi, kaip tai būtų galima daryti su kapiliarais. Kai kuriais atvejais MP grandinė ilgėja, magnetui judant į kairę ir į dešinę. Įdomu tai, kad taip pat nustatėme, jog dalelių virvelė, atrodo, keičia paviršinio skysčio sluoksnio gylį, kai magnetas judinamas išilgai trachėjos, ir plečiasi, kai magnetas judinamas tiesiai virš galvos ir dalelių virvelė pasukama į vertikalią padėtį (žr. papildomą S7 vaizdo įrašą). MP5, 0:09 min., apačioje dešinėje). Būdingas judėjimo modelis pasikeitė, kai magnetas buvo stumiamas per trachėjos viršų į šonus (t. y. į kairę arba į dešinę nuo gyvūno, o ne išilgai trachėjos). Dalelės vis dar buvo aiškiai matomos judant, bet kai magnetas buvo pašalintas iš trachėjos, dalelių stygų galiukai tapo matomi (žr. papildomą vaizdo įrašą S8:MP5, pradedant nuo 0:08). Tai atitinka MP elgseną, kurią stebėjome veikiant magnetiniam laukui stikliniame kapiliare.
Pavyzdiniai vaizdai, kuriuose rodomas MP5 gyvos anestezuotos žiurkės trachėjoje. (a) Magnetas naudojamas vaizdams gauti virš ir kairėje nuo trachėjos, tada (b) po to, kai magnetas perkeliamas į dešinę. Raudoname langelyje yra kontrastą didinantis padidinimas. Šie vaizdai yra iš vaizdo įrašo, parodyto papildomame vaizdo įraše S7:MP5.
Kai du poliai buvo sukonfigūruoti šiaurės-pietų kryptimi virš ir po trachėja (t. y. traukiantys; 3b pav.), MP chordos atrodė ilgesnės ir buvo išsidėsčiusios trachėjos šoninėje sienelėje, o ne ant nugarinio trachėjos paviršiaus (žr. papildomą vaizdo įrašą S9:MP5). Tačiau, naudojant dviejų magnetų įtaisą, po skysčio tiekimo nebuvo aptikta didelė dalelių koncentracija vienoje vietoje (t. y. trachėjos nugariniame paviršiuje), kas paprastai nutinka, kai naudojamas vieno magneto įtaisas. Tada, kai vienas magnetas buvo sukonfigūruotas atstumti atvirkščiai esančius polius (3c pav.), matymo lauke matomų dalelių skaičius po tiekimo, regos lauke, nepadidėjo. Abiejų dviejų magnetų konfigūracijų nustatymas yra sudėtingas dėl didelio magnetinio lauko stiprumo, kuris atitinkamai traukia arba stumia magnetus. Tada konfigūracija buvo pakeista į vieną magnetą, lygiagretų kvėpavimo takams, bet einantį per kvėpavimo takus 90 laipsnių kampu, kad lauko linijos kirstų trachėjos sienelę ortogonaliai (3d pav.). Ši orientacija skirta nustatyti, ar galima pastebėti dalelių agregaciją ant šoninės sienelės. Tačiau šioje konfigūracijoje nebuvo... nebuvo nustatyta jokio MP kaupimosi ar magneto judėjimo. Remiantis visais šiais rezultatais, in vivo genų nešiotojų tyrimams buvo pasirinkta vieno magneto, 30 laipsnių orientacijos konfigūracija (3a pav.).
Kai gyvūnas buvo pakartotinai vaizduojamas iškart po humaniško nužudymo, dėl to, kad nebuvo jokio painiojančio audinių judėjimo, aiškiame tarpchondriniame lauke buvo galima įžiūrėti smulkesnes ir trumpesnes dalelių linijas, „svirduliuojančias“ pagal magneto slenkamąjį judesį. Nepaisant to, MP6 dalelių buvimas ir judėjimas vis dar negali būti aiškiai matomi.
LV-LacZ titras buvo 1,8 × 108 TU/ml, o po 1:1 sumaišymo su CombiMag MP (MP6), gyvūnai gavo 50 μl trachėjos dozę – 9 × 107 TU/ml LV tirpiklio (t. y. 4,5 × 106 TU/žiurkei). Šiuose tyrimuose, užuot transliavę magnetą gimdymo metu, fiksavome magnetą vienoje padėtyje, siekdami nustatyti, ar LV transdukcija (a) gali būti pagerinta, palyginti su vektoriaus perdavimu nesant magnetinio lauko, ir (b) ar ją galima sufokusuoti. Kvėpavimo takų ląstelės transdukuojamos į viršutinių kvėpavimo takų magnetinius taikinius.
Magnetų buvimas ir „CombiMag“ naudojimas kartu su LV vektoriais, kaip ir mūsų standartinis LV vektorių tiekimo protokolas, neturėjo neigiamo poveikio gyvūnų sveikatai. Trachėjos srities, paveiktos mechaniniu trikdymu, priekiniai vaizdai (1 papildomas pav.) parodė, kad gyvūnų grupėje, gydytoje LV-MP, esant magnetui, transdukcijos lygis buvo žymiai didesnis (9a pav.). Kontrolinėje grupėje buvo tik nedidelis kiekis mėlyno LacZ dažymo (9b pav.). Normalizuotų X-Gal dažytų sričių kiekybinis įvertinimas parodė, kad LV-MP įvedimas esant magnetiniam laukui pagerino maždaug 6 kartus (9c pav.).
Sudėtinių vaizdų pavyzdžiai, rodantys trachėjos transdukciją LV-MP (a) esant magnetiniam laukui ir (b) be magneto. (c) Statistiškai reikšmingas normalizuoto LacZ transdukcijos ploto trachėjoje pagerėjimas naudojant magnetą (*p = 0,029, t-testas, n = 3 kiekvienoje grupėje, vidurkis ± SEM).
Neutraliai greitai raudonai nudažytos sekcijos (pavyzdys parodytas papildomame 2 paveiksle) parodė LacZ dažytas ląsteles, esančias panašiame modelyje ir vietoje, kaip nurodyta anksčiau.
Pagrindinis kvėpavimo takų genų terapijos iššūkis išlieka tiksli nešiklių dalelių lokalizacija į dominančias sritis ir aukšto transdukcijos efektyvumo pasiekimas judančiuose plaučiuose, esant oro srautui ir aktyviam gleivių pašalinimui. LV nešikliams, skirtiems CF kvėpavimo takų ligai gydyti, nešiklių dalelių buvimo laiko laidžiuose kvėpavimo takuose padidinimas iki šiol buvo nepasiekiamas tikslas. Kaip pažymėjo Castellani ir kt., magnetinių laukų naudojimas transdukcijai pagerinti turi pranašumų, palyginti su kitais genų tiekimo metodais, tokiais kaip elektroporacija, nes jis gali derinti paprastumą, ekonomiškumą, tiekimo lokalizaciją, padidintą efektyvumą ir trumpesnį inkubacijos laiką, o galbūt ir mažesnę nešiklio dozę10. Tačiau magnetinių dalelių nusėdimas ir elgesys kvėpavimo takuose in vivo veikiant išorinėms magnetinėms jėgoms niekada nebuvo aprašytas, taip pat nebuvo įrodytas šio metodo tinkamumas in vivo padidinti genų ekspresijos lygį sveikuose gyvuose kvėpavimo takuose.
Mūsų in vitro sinchrotroniniai PCXI eksperimentai parodė, kad visos mūsų tirtos dalelės, išskyrus polistireninį MP, buvo matomos mūsų naudotoje vaizdavimo sistemoje. Esant magnetiniam laukui, MP sudaro stygas, kurių ilgis priklauso nuo dalelių tipo ir magnetinio lauko stiprumo (t. y. magneto artumo ir judėjimo). Kaip parodyta 10 paveiksle, stebimos stygos susidaro dėl to, kad kiekviena atskira dalelė yra įmagnetinta ir indukuoja savo vietinį magnetinį lauką. Šie atskiri laukai sukelia kitų panašių dalelių agregaciją ir jungimąsi, o grupiniai stygų pavidalo judesiai atsiranda dėl vietinių jėgų, atsirandančių dėl kitų dalelių vietinių traukos ir stūmos jėgų.
Schemoje pavaizduotos (a, b) dalelių virtinės, susidariusios skysčiu užpildytuose kapiliaruose, ir (c, d) oru užpildyta trachėja. Atkreipkite dėmesį, kad kapiliarai ir trachėja nėra nubraižyti pagal mastelį. (a) skydelyje taip pat pateiktas MP aprašymas, kuriame yra stygomis išsidėsčiusios Fe3O4 dalelės.
Kai magnetas buvo judinamas virš kapiliaro, dalelių virvelės kampas pasiekė kritinę MP3-5, kuriame yra Fe3O4, ribą, po kurios dalelių virvelė nebeišliko pradinėje padėtyje, o judėjo paviršiumi į naują padėtį. Šis efektas greičiausiai atsiranda todėl, kad stiklinio kapiliaro paviršius yra pakankamai lygus, kad šis judėjimas įvyktų. Įdomu tai, kad MP6 (CombiMag) taip nesielgė, galbūt todėl, kad dalelės buvo mažesnės, turėjo skirtingas dangas ar paviršiaus krūvius arba patentuotas nešiklio skystis paveikė jų judėjimo gebėjimą. CombiMag dalelių vaizdo kontrastas taip pat yra silpnesnis, o tai rodo, kad skystis ir dalelės gali turėti panašų tankį ir todėl nelengvai judėti viena kitos link. Dalelės taip pat gali įstrigti, jei magnetas juda per greitai, o tai rodo, kad magnetinio lauko stiprumas ne visada gali įveikti trintį tarp dalelių skystyje, todėl galbūt nestebina, kad magnetinio lauko stiprumas ir atstumas tarp magneto ir taikinio srities yra labai svarbūs. Apibendrinus, šie rezultatai taip pat rodo, kad nors magnetai gali pagauti daug MP, tekančių per taikinio sritį, mažai tikėtina, kad magnetais galima pasikliauti, kad CombiMag dalelės judėtų išilgai. trachėjos paviršiaus. Todėl darome išvadą, kad in vivo LV-MP tyrimuose turėtų būti naudojami statiniai magnetiniai laukai, kad būtų galima fiziškai paveikti konkrečius kvėpavimo takų medžio regionus.
Kai dalelės patenka į kūną, jas sunku atpažinti sudėtingai judančių kūno audinių kontekste, tačiau gebėjimas jas aptikti buvo pagerintas horizontaliai perkeliant magnetą virš trachėjos, kad „judintų“ MP stygas. Nors tiesioginis vaizdavimas yra įmanomas, dalelių judėjimą lengviau pastebėti, kai gyvūnas humaniškai numarinamas. MP koncentracijos paprastai buvo didžiausios šioje vietoje, kai magnetas buvo virš vaizdavimo srities, nors kai kurios dalelės paprastai buvo aptinkamos toliau trachėjoje. Priešingai nei in vitro tyrimuose, dalelių negalima tempti trachėja perkeliant magnetą. Šis atradimas atitinka tai, kaip gleivės, dengiančios trachėjos paviršių, paprastai apdoroja įkvėptas daleles, sulaikydamos jas gleivėse ir vėliau pašalindamos jas mukociliariniu klirenso mechanizmu.
Mes iškėlėme hipotezę, kad magnetų naudojimas traukai virš ir po trachėja (3b pav.) gali sukelti tolygesnį magnetinį lauką, o ne labai koncentruotą magnetinį lauką, dėl kurio dalelės gali pasiskirstyti tolygiau. Tačiau mūsų preliminarus tyrimas nerado aiškių įrodymų, patvirtinančių šią hipotezę. Panašiai, dviejų magnetų konfigūravimas atstumiančiai jėgai (3c pav.) nepadidino dalelių nusėdimo vaizduojamame plote. Šie du rezultatai rodo, kad dviejų magnetų konfigūracija reikšmingai nepagerina MP nukreipimo vietinės kontrolės ir kad susidariusias stiprias magnetines jėgas sunku konfigūruoti, todėl šis metodas yra mažiau praktiškas. Panašiai, magneto orientavimas virš trachėjos ir per ją (3d pav.) taip pat nepadidino vaizduojamame plote sulaikytų dalelių skaičiaus. Kai kurios iš šių alternatyvių konfigūracijų gali būti nesėkmingos, nes jos sumažina magnetinio lauko stiprumą nusėdimo plote. Todėl vieno 30 laipsnių kampo magneto konfigūracija (3a pav.) laikoma lengviausiu ir efektyviausiu in vivo bandymų metodu.
LV-MP tyrimas parodė, kad kai LV vektoriai buvo derinami su CombiMag ir tiekiami po fizinio sujudinimo magnetinio lauko akivaizdoje, transdukcijos lygis trachėjoje žymiai padidėjo, palyginti su kontrolinėmis grupėmis. Remiantis sinchrotroninio vaizdinimo tyrimais ir LacZ rezultatais, magnetinis laukas, matyt, sugebėjo išsaugoti LV trachėjoje ir sumažinti vektorių dalelių, kurios iš karto prasiskverbė giliai į plaučius, skaičių. Toks taikinio patobulinimas gali padidinti veiksmingumą, kartu sumažinant tiekiamų titrų kiekį, netikslinės transdukcijos riziką, uždegiminį ir imuninį šalutinį poveikį bei genų nešiotojų išlaidas. Svarbu tai, kad, pasak gamintojo, CombiMag galima naudoti kartu su kitais genų perdavimo metodais, įskaitant kitus virusinius vektorius (pvz., AAV) ir nukleorūgštis.