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O vectors gene mo le togafitia o le cystic fibrosis lung disease e tatau ona faʻatatau i le conducting airways auā o le peripheral lung transduction e le maua ai le aoga faʻamalolo. O le lelei o le viral transduction e fesoʻotaʻi tonu lava ma le taimi e nofo ai vector. Peitaʻi, o vai e tuʻuina atu e pei o gene carriers e masani ona sosolo atu i totonu o le alveoli i le taimi o le manava, ma o vaega faʻamalolo o soʻo se ituaiga e vave ona faʻamamāina e ala i le mucociliary transport. O le faʻalauteleina o le taimi e nofo ai gene carriers i totonu o le airways e taua ae faigata ona ausia. O gene carrier-conjugated magnetic particles e mafai ona faʻasino i luga o le airways e mafai ona faʻaleleia atili ai le faʻatatauina o le itulagi. Ona o luʻitau o le in vivo visualization, o le amioga o ia tamaʻi magnetic particles i luga o le airway i le i ai o se magnetic field faʻaaogaina e le malamalama lelei. O le faʻamoemoega o lenei suʻesuʻega o le faʻaaogaina lea o le synchrotron imaging e vaʻaia ai le in vivo motion o se faʻasologa o magnetic particles i le trachea o isumu na faʻamoe e suʻesuʻe ai le dynamics ma mamanu o amioga a tagata taʻitoʻatasi ma le tele o particles i vivo. Ona matou iloiloina lea pe o le tuʻuina atu o le lentiviral magnetic particles i le i ai o se magnetic field o le a faʻateleina ai le lelei o le transduction i le trachea o le isumu. Synchrotron X-ray O ata o loʻo faʻaalia ai amioga a vaega maneta i totonu o fanua maneta e le minoi ma fealuaʻi i totonu o le vitro ma totonu o le tino ola. E le faigofie ona tosoina vaega i luga o le fogāeleele ola i maneta, ae i le taimi o felauaiga, o mea e teu ai e faʻaputu i le vaega e sili ona malosi ai le fanua maneta. Na faʻateleina foʻi le lelei o le transduction i le ono taimi ina ua tuʻuina atu vaega maneta lentiviral i le i ai o se fanua maneta. Faʻatasi ai, o nei taunuuga e faʻaalia ai o vaega maneta lentiviral ma fanua maneta atonu o ni auala taua e faʻaleleia atili ai le faʻatatauina o gene vector ma faʻateleina ai le maualuga o le transduction i le faʻatautaia o ala maneta i totonu o le tino ola.
O le Cystic fibrosis (CF) e mafua mai i le eseesega i totonu o se tasi gene e taʻua o le CF transmembrane conductance regulator (CFTR). O le porotini CFTR o se auala ion o loʻo iai i le tele o sela epithelial i le tino atoa, e aofia ai auala e tafe ai ala ea, o se nofoaga autu o le pathogenesis o le CF. O faʻaletonu o le CFTR e oʻo atu ai i le felauaiga sese o le vai, faʻamago le fogāeleele o le ala ea ma faʻaitiitia ai le loloto o le vaega vai o le fogāeleele o le ala ea (ASL). O lenei mea e faʻalavelaveina ai foʻi le mafai e le faiga o felauaiga mucociliary (MCT) ona faʻamamā vaega ma siama mai ala ea. O la matou sini o le atinaʻeina lea o se togafitiga o le lentiviral (LV) gene e tuʻuina atu ai le kopi saʻo o le CFTR gene ma faʻaleleia atili ai le ASL, MCT, ma le soifua maloloina o mama, ma ia faʻaauau pea ona atinaʻe ni tekinolosi fou e mafai ona fuaina nei faʻailoga i vivo1.
O vectors LV o se tasi o sui tauva sili ona taʻutaʻua mo le togafitiga o le CF airway gene, ona e mafai ona latou faʻapipiʻi tumau le gene therapeutic i totonu o sela basal airway (airway stem cells). E taua tele lenei mea aua e mafai ona latou toe faʻafoʻisia le faʻasusu masani ma le faʻamamaina o le mucus e ala i le faʻavasegaina i totonu o sela o le airway ua faʻasaʻoina e le gene-encountered CF, ma iʻu ai i faʻamanuiaga mo le olaga atoa. E tatau ona faʻasaga le vectors LV i le airway conducting, aua o le mea lea e amata ai le faʻamaʻi o le mama CF. O le tuʻuina atu o le vector i totonu o le mama e ono iʻu ai i le alveolar transduction, ae e leai se aoga faʻamalolo i le CF. Peitaʻi, o vai e pei o gene carriers e masani ona malaga atu i le alveoli pe a uma ona manava pe a uma ona fanau3,4 ma o vaega faʻamalolo e vave ona faʻamamaina i totonu o le gutu e le MCT. O le lelei o le LV transduction e fesoʻotaʻi tonu lava ma le umi o le taimi e tumau ai le vector i tafatafa o sela faʻatatau e faʻataga ai le faʻaaogaina o le cellular - le "taimi e nofo ai"5 - lea e faigofie ona faʻaitiitia e le masani ai o le ea faʻaitulagi faʻapea foʻi ma le puʻeina o le mucus o le particle ma le MCT. Mo le CF, o le mafai ona faʻalauteleina le taimi e nofo ai le LV i totonu o le airway e taua tele e ausia ai le maualuga o le transduction i lenei itulagi, ae o loʻo faigata tele i le taimi nei.
Ina ia foia lenei faafitauli, matou te fautua atu o vaega maneta LV (MPs) e mafai ona fesoasoani i ni auala se lua e fesoasoani faatasi. Muamua, e mafai ona taialaina i latou i le auala maneta i luga o le ea e faaleleia atili ai le taulaiga ma fesoasoani i vaega e feaveaia ai kene e nonofo i le vaega ea e manaomia; ma le ASL) e siitia atu i le vaega sela 6. Ua faaaogaina lautele MPs o ni auala e momoli ai fualaau faasaina pe a latou fusifusia i antibodies, vailaau chemotherapy, po o isi mole mole laiti e pipii i membrane o le sela po o le fusifusia i tagata e taliaina le ea i luga o le sela ma faaputu i nofoaga o le tumo i le i ai o le eletise tumau. Fanua Maneta mo Togafitiga o le Kanesa 7. O isi metotia "hyperthermal" e faʻamoemoe e faʻavevela MPs pe a faʻaalia i latou i fanua maneta oscillating, ma faʻaumatia ai sela o le tumo. O le mataupu faavae o le transfection magnetic, lea e faʻaaogaina ai se fanua maneta o se sui transfection e faʻaleleia atili ai le fesiitaiga o le DNA i sela, e masani ona faʻaaogaina i vitro e faʻaaoga ai le tele o vectors gene e le o viral ma viral mo laina sela e faigata ona transduce. Ua faʻamautuina le aoga o le LV magnetotransfection, faʻatasi ai ma le tuʻuina atu i vitro o LV-MPs i se laina sela epithelial bronchial o le tagata i le i ai o se fanua maneta tumau, faʻateleina ai le lelei o le transduction e 186-fold pe a faʻatusatusa i le LV vector na o ia. Ua faʻaaogaina foi le LV-MP i se faʻataʻitaʻiga CF i vitro, lea na faʻateleina ai e le transfection magnetic le transduction LV i aganuu fesoʻotaʻiga a le ea-liquid e 20-fold i le i ai o le CF sputum10. Peitaʻi, o le in vivo magnetotransfection o totoga e leʻi tele se gauai na maua ma naʻo ni nai suʻesuʻega a manu11,12,13,14,15 na iloiloina, aemaise lava i le mama16,17. E ui i lea, o avanoa mo le magnetic transfection i le togafitiga o mama CF e manino lava. Na taʻua e Tan et al.(2020) "o se suʻesuʻega faʻamaonia o le faʻatinoina lelei o le magnetic nanoparticle pulmonary delivery o le a saunia ai le ala mo fuafuaga faʻamama CFTR i le lumanaʻi e faʻaleleia atili ai taunuʻuga faʻapitoa i tagata mamaʻi CF"6.
O le amioga a ni tama'i vaega maneta i luga o le auala ea i le i ai o se fanua maneta ua fa'aogaina e faigata ona va'aia ma su'esu'eina, ma o lea e le malamalama lelei ai. I isi su'esu'ega, na matou atia'e ai se metotia o le synchrotron-propagation-based phase-contrast X-ray imaging (PB-PCXI) e le afaina ai le va'aia ma le fuaina o suiga laiti i totonu o le tino i le loloto o le ASL18 ma le amioga a le MCT19,20 e fua sa'o ai le fa'asusuina o le fogaeleele o le kesi ma fa'aaoga o se fa'ailoga vave o le aoga o togafitiga. E le gata i lea, o la matou metotia o le iloiloga o le MCT e fa'aaoga ai vaega e 10–35 µm le lautele e faia i le alumina po'o le tioata fa'asino maualuga e pei o fa'ailoga MCT e va'aia e fa'aaoga ai le PB-PCXI21. O metotia uma e lua e talafeagai mo le va'aia o le tele o ituaiga vaega, e aofia ai le MP.
Ona o lona maualuga o le iugafono fa'ale-spatial ma le taimi, o a matou metotia au'ili'iliga ASL ma MCT e fa'avae i luga o le PB-PCXI e matua fetaui lelei lava mo le su'esu'eina o le gaioiga ma mamanu o amioga a le vaega e tasi ma le tele i totonu o le tino ola e fesoasoani ia i matou e malamalama ma fa'aleleia atili ai metotia o le tu'uina atu o le MP gene. O le auala matou te fa'aaogaina iinei e mafua mai i a matou su'esu'ega e fa'aaoga ai le SPring-8 BL20B2 beamline, lea na matou va'aia ai le gaioiga o le vai i le mae'a ai o le tu'uina atu o le sham vector dose i totonu o le nasal ma le pulmonary airways o isumu e fesoasoani e fa'amatalaina ai a matou mamanu fa'aalia o le gene e le tutusa na matauina i a matou su'esu'ega o manu e feavea'i ai le gene 3,4.
O le fa'amoemoega o lenei su'esu'ega o le fa'aaogaina lea o le synchrotron PB-PCXI e va'ai fa'aletino ai gaioiga o se fa'asologa o MP i totonu o le trachea o isumu ola. O nei su'esu'ega ata o le PB-PCXI na mamanuina e fa'ata'ita'i ai le tele o MP, malosiaga o le fanua maneta, ma nofoaga e iloa ai lo latou a'afiaga i gaioiga a le MP. Na matou manatu o le a fesoasoani le fanua maneta e fa'aaogaina i fafo i le MP e tu'uina atu e tumau pe siitia atu i le nofoaga fa'amoemoeina. O nei su'esu'ega na mafai ai fo'i ona matou fa'ailoaina ni fa'atulagaga o maneta e fa'ateleina ai le aofa'i o vaega o lo'o taofia i totonu o le trachea pe a uma ona tu'u i totonu. I se fa'asologa lona lua o su'esu'ega, na matou sailia ai e fa'aaoga lenei fa'atulagaga sili ona lelei e fa'aalia ai le mamanu o le transduction e mafua mai i le tu'uina atu o LV-MP i totonu o le tino i le ea o isumu, e fa'avae i luga o le manatu o le tu'uina atu o LV-MP i le tulaga o le fa'atatauina o le ea o le a i'u ai i le fa'aleleia atili o le lelei o le LV transduction.
Sa faia suʻesuʻega uma i manu e tusa ai ma faʻatonuga na faʻamaonia e le Iunivesite o Adelaide (M-2019-060 ma le M-2020-022) ma le SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Sa faia faʻataʻitaʻiga e tusa ai ma taʻiala a le ARRIVE.
O ata uma o le X-ray sa faia i le BL20XU beamline i le SPring-8 synchrotron i Iapani, e faʻaaoga ai se seti e tutusa ma le mea na faʻamatalaina muamua21,22. I se aotelega, o le pusa faʻataʻitaʻi sa tu i le 245 m mai le mama teuina o le synchrotron. O le mamao o le faʻataʻitaʻiga-i-le-detector e 0.6 m e faʻaaogaina mo suʻesuʻega o ata o vaega ma le 0.3 m mo suʻesuʻega o ata in vivo e faʻatupu ai ni aafiaga o le eseesega o vaega. O le malosi o le ave monochromatic e 25 keV sa faʻaaogaina. O ata na puʻeina e faʻaaoga ai se faʻaliliuga X-ray maualuga (SPring-8 BM3) ua faʻapipiʻi i se faʻamatalaga sCMOS. O le faʻaliliuga e liua ai ave X i le malamalama vaaia e faʻaaoga ai se scintillator mafiafia e 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), lea e faʻasino atu i se sensor sCMOS e faʻaaoga ai se × 10 microscope objective (NA 0.3). O le faʻamatalaga sCMOS o le Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Iapani) faʻatasi ai ma le tele o le array o 2048 × 2048 pixels ma le tele o le pixel mata e 6.5 × 6.5 µm. O lenei seti e maua ai se tele o le pixel isotropic aoga e 0.51 µm ma se va'aiga e tusa ma le 1.1 mm × 1.1 mm. O le umi o le fa'aaliga e 100 ms na filifilia e fa'ateleina ai le fua fa'atatau o le signal-to-noise o vaega maneta i totonu ma fafo atu o le ea a'o fa'aitiitia ai mea e mafua mai i le manava. Mo su'esu'ega in vivo, na tu'u ai se pupuni vave o le X-ray i le auala X-ray e fa'atapula'a ai le tele o le radiation e ala i le poloka o le ave o le X-ray i le va o fa'aaliga.
E leʻi faʻaaogaina le LV carrier i soʻo se suʻesuʻega ata o le SPring-8 PB-PCXI auā e leʻi faʻamaonia le Biosafety Level 2 i le potu ata o le BL20XU. Nai lo lea, na matou filifilia se vaega o MP ua faʻamatalaina lelei mai ni kamupani faʻapisinisi se lua—e aofia ai le tele o lapopoʻa, meafaitino, malosi o le uʻamea, ma faʻaoga—muamua ia malamalama pe faʻapefea ona aʻafia e fanua maneta le gaioiga o le MP i totonu o alatoto tioata, ona sosoo ai lea ma ala ea ola. i luga o le fogaeleele. E eseese le lapopo'a o MP mai le 0.25 i le 18 μm ma e faia mai i le tele o meafaitino (tagai i le Laulau 1), ae o le tuufaatasiga o fa'ata'ita'iga ta'itasi, e aofia ai le lapopo'a o vaega maneta i totonu o le MP, e le o iloa. E fa'avae i luga o a matou su'esu'ega lautele a le MCT 19, 20, 21, 23, 24, matou te fa'amoemoe o MP e laiti e pei o le 5 μm e mafai ona va'aia i luga o le ea o le tracheal, mo se fa'ata'ita'iga e ala i le to'esea o fa'avaa sosoo e va'ai ai i le fa'aleleia atili o le va'aia o le gaioiga a le MP. O se MP e tasi e 0.25 μm le lapo'a e la'ititi ifo nai lo le iugafono o le masini ata, ae o le PB-PCXI e fa'amoemoe e iloa ai le eseesega o le voluma ma le gaioiga o le vai i luga o le fogaeleele lea e teuina ai i latou pe a uma ona teuina.
O faʻataʻitaʻiga mo MP taʻitasi i le Laulau 1 na saunia i totonu o kapilera tioata e 20 μl (Drummond Microcaps, PA, ISA) ma le lautele i totonu e 0.63 mm. O vaega o le tino e maua i le vai, ae o vaega o le CombiMag e maua i le vai a le kamupani gaosi oloa. O paipa taʻitasi e afa ona faʻatumuina i le vai (pe tusa ma le 11 μl) ma tuʻu i luga o le mea e uu ai faʻataʻitaʻiga (tagai Ata 1). O kapilera tioata na tuʻu faʻalava i luga o le tulaga faʻataʻitaʻiga i totonu o le pusa ata, ma tuʻu pito o le vai. O se maneta nickel shell rare earth neodymium iron boron (NdFeB) e 19 mm le lautele (28 mm le umi) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Ausetalia) faʻatasi ai ma le magnetization totoe o le 1.17 Tesla na faʻapipiʻi i se isi vaega faʻaliliuga e ausia ai le Suia o lona tulaga mamao i le taimi o le ata. E amata le mauaina o ata X-ray pe a tuʻu le maneta pe tusa ma le 30 mm i luga aʻe o le faʻataʻitaʻiga, ma maua ata i le fua faatatau o le 4 faʻavaa i le sekone. I le taimi o le ata, na aumaia le maneta e latalata i le paipa kapilera tioata (pe tusa ma le 1 mm le mamao) ona fa'aliliuina lea i luga o le paipa e iloilo ai aafiaga o le malosi o le fanua ma le tulaga.
O le fa'atulagaga o ata in vitro o lo'o i ai fa'ata'ita'iga MP i totonu o alatoto tioata i luga o le fa'ata'ita'iga xy translation stage. O le ala o le ave o le X-ray ua fa'ailogaina i se laina mumu manifinifi.
Ina ua maeʻa ona faʻamautuina le vaʻaia o MP i totonu o le vitro, na faia ai se suʻega i totonu o le tino i isumu fafine Wistar albino ituaiga vao (~12 vaiaso le matutua, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Iapani), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Iapani) ma le 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Na faʻamoe isumu i se faʻafefiloi o Pharma), Iapani) e ala i le tui intraperitoneal. Ina ua maeʻa le faʻamoe, sa saunia i latou mo le faia o ata e ala i le aveeseina o le fulufulu o loʻo siomia ai le trachea, faʻapipiʻi se endotracheal tube (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) ma faʻamautu i latou i luga o se ipu ata faʻapitoa o loʻo i ai se taga vevela e faʻatumauina ai le vevela o le tino 22. Ona faʻapipiʻi lea o le ipu ata i le vaega faʻaliliuga faʻataʻitaʻi i totonu o le pusa ata i se tulimanu laʻititi e faʻatulaga ai le trachea i se tulaga faʻalava i le ata X-ray, e pei ona faʻaalia i le Ata 2a.
(a) O le fa'atulagaina o le ata i totonu o le pusa ata SPring-8, o le ala o le ave o le X-ray ua fa'ailogaina i se laina mumu manifinifi. (b,c) O le fa'atulagaina o le maneta i luga o le trachea na faia mamao e fa'aaoga ai ni meapueata IP se lua ua fa'apipi'i fa'atasi. I le itu agavale o le ata o le lau, e mafai ona va'aia le uaea o lo'o uuina le ulu, ma le cannula e tu'uina atu i totonu o le paipa ET.
O se faiga pamu tui e pulea mamao (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) e faʻaaoga ai se tui tioata 100 μl na faʻapipiʻi i le paipa PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) e ala i se nila 30 Ga. Faʻailoga le paipa e faʻamautinoa ai o loʻo i ai le pito i le tulaga saʻo i totonu o le trachea pe a faʻapipiʻi le paipa ET. Faʻaaoga le pamu laiti, na aveese le plunger o le tui aʻo faʻasusu le pito o le paipa i totonu o le faʻataʻitaʻiga MP e tuʻuina atu. Ona faʻapipiʻi lea o le paipa tuʻuina atu ua utaina i totonu o le paipa endotracheal, ma tuʻu ai le pito i totonu o le vaega sili ona malosi o le matou fanua maneta faʻamoemoeina. O le mauaina o ata na pulea e faʻaaoga ai se masini e iloa ai le manava na faʻapipiʻi i la matou pusa taimi Arduino, ma o faʻailoga uma (e pei o le vevela, manava, tatala/tapuni o le pupuni ma le mauaina o ata) na puʻeina e faʻaaoga ai le Powerlab ma le LabChart (AD Instruments, Sydney, Ausetalia) 22. A o faia le pueina o ata A o le mafai ona oʻo atu i le pusa, e lua meapueata IP (Panasonic BB-SC382) na tuʻuina i le tusa ma le 90° le tasi i le isi ma na faʻaaoga e mataʻituina ai le tulaga o le maneta e fa'atatau i le trachea i le taimi o le faia o ata (Ata 2b,c). Ina ia fa'aitiitia ai mea e fai mai ai le gaioiga, e tasi le ata na maua i le manava ta'itasi i le taimi o le fa'ai'uga o le tafega o le tai.
O se maneta ua fa'apipi'i i se vaega lona lua e mafai ona tu'u mamao ese mai fafo o le pusa o ata. O tulaga ma fa'atulagaga eseese o maneta na fa'ata'ita'iina, e aofia ai: Fa'apipi'i i se tulimanu e tusa ma le 30° i luga a'e o le trachea (fa'atulagaga o lo'o fa'aalia i Ata 2a ma le 3a); tasi le maneta i luga a'e o le manu ma le isi i lalo, fa'atasi ai ma pou ua seti e tosina mai (Ata 3b); tasi le maneta i luga a'e o le manu ma le isi i lalo, fa'atasi ai ma pou ua seti e tete'e (Ata 3c); ma le tasi le maneta i luga ma fa'asaga sa'o i le trachea (Ata 3d). A uma ona fa'atulagaina le manu ma le maneta ma ua uta le MP e fa'ata'ita'iina i totonu o le pamu syringe, tu'uina atu se tui e 50 μl i le fua faatatau o le 4 μl/sekone a'o pu'eina ata. Ona fa'agaoioi lea o le maneta i luma ma luma i luga po'o le itu i luga o le trachea a'o fa'aauau pea ona pu'eina ata.
Fa'atulagaga o le maneta mo le faia o ata i totonu o le tino ola (a) o se maneta e tasi i luga a'e o le trachea i se tulimanu e tusa ma le 30°, (b) o maneta e lua ua seti e tosina mai, (c) o maneta e lua ua seti e tete'e atu, (d) o se maneta e tasi i luga ma fa'asaga i totonu o le trachea. Na tilotilo ifo le tagata matau mai le gutu i mama e ala i le trachea, ma o le ave o le X-ray na ui atu i le itu tauagavale o le isumu ma alu ese atu i le itu taumatau. O le maneta e minoi i le umi o le auala ea pe agavale ma taumatau i luga a'e o le trachea i le itu o le ave o le X-ray.
Sa matou sailia foʻi le iloa ma le amio a vaega laiti i totonu o ala ea e aunoa ma le fenumiai o le manava ma le gaioiga o le fatu. O le mea lea, i le faaiuga o le vaitaimi o le pueina o ata, sa fasiotia ai manu i se auala agaalofa ona o le soona tele o le pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ISA; ~65 mg/kg ip). O nisi manu sa tuua i luga o le tulaga o ata, ma ina ua taofi le manava ma le tata o le fatu, sa toe faia le faagasologa o ata, ma faaopoopo atu se isi tui o le MP pe afai e leai se MP na vaaia i luga o le ala ea.
O ata na maua na fa'asa'oina i le fanua mafolafola ma le fanua pogisa ona tu'ufa'atasia lea i se tifaga (20 fa'avaa i le sekone; 15-25 × saoasaoa masani e fa'atatau i le saoasaoa o le manava) e fa'aaoga ai se tusitusiga fa'apitoa na tusia i le MATLAB (R2020a, The Mathworks).
O suʻesuʻega uma o le tuʻuina atu o le LV gene vector sa faia i le Laboratory Animal Research Facility i le Iunivesite o Adelaide ma sa faʻamoemoe e faʻaaoga taunuuga o le faʻataʻitaʻiga SPring-8 e iloilo ai pe mafai e le tuʻuina atu o le LV-MP i le i ai o se fanua maneta ona faʻaleleia atili le fesiitaiga o kene i totonu o le tino. Ina ia iloilo aafiaga o le MP ma le fanua maneta, e lua vaega o manu na togafitia: o le tasi vaega na tuʻuina atu i ai le LV-MP ma se maneta ua tuʻu, ma le isi vaega na maua se vaega faʻatonutonu ma le LV-MP e aunoa ma se maneta.
Sa fa'atupuina vectors o le LV gene e fa'aaoga ai metotia ua uma ona fa'amatalaina 25, 26. O le vector LacZ e fa'aalia ai le nuclear-localized beta-galactosidase gene e fa'atautaia e le constitutive MPSV promoter (LV-LacZ), lea e maua ai se oloa lanumoana o le tali atu i totonu o sela ua fa'aliliuina, e va'aia i luma o a'ano o le mama ma vaega o a'ano. Sa fa'atinoina le titration i totonu o fa'ato'aga o sela e ala i le faitauina lima o le aofa'i o sela LacZ positive i se hemocytometer e fuafua ai le titer i le TU/ml. O mea e feavea'i ai e fa'asaoina i le -80 °C, fa'amaluluina a'o le'i fa'aaogaina, ma fusifusia i le CombiMag e ala i le palu fa'atasi i le fua fa'atatau 1:1 ma fa'asusu i luga o le aisa mo le itiiti ifo i le 30 minute a'o le'i tu'uina atu.
O isumu Sprague Dawley masani (n = 3/vaega, ~2-3 na fa'amoe i totonu o le peritoneal i se fa'afefiloi o le 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Ausetalia) ma le 60 mg/kg ketamine (Ilium, Ausetalia) masina le matutua) ip) tui ma le cannulation gutu e le fa'aogaina se taotoga i le 16 Ga iv cannula. Ina ia mautinoa o lo'o maua e le a'ano o le ea tracheal le LV transduction, na fa'atulagaina e fa'aaoga ai la matou fa'asologa o le fa'alavelave fa'amekanika na fa'amatalaina muamua, lea na olo ai le luga o le ea tracheal i le itu tauagavale i se ato uaea (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ISA) 30 s28. Ona faia lea o le tu'uina atu o le LV-MP i le tracheal i totonu o se kapeneta saogalemu fa'aola pe tusa ma le 10 minute talu ona fa'alavelaveina.
O le fanua maneta na faʻaaogaina i lenei faʻataʻitaʻiga na faʻatulagaina i se auala tutusa ma le suʻesuʻega ata X-ray in vivo, faʻatasi ai ma maneta tutusa o loʻo uuina i luga aʻe o le trachea e faʻaaoga ai kilipa stent distillation (Ata 4). O se voluma e 50 μl (2 × 25 μl aliquots) o le LV-MP na tuʻuina atu i totonu o le trachea (n = 3 manu) e faʻaaoga ai se pipette o loʻo i ai se pito gel e pei ona faʻamatalaina muamua. O se vaega faʻatonutonu (n = 3 manu) na maua LV-MP tutusa e aunoa ma le faʻaaogaina o se maneta. A maeʻa le faʻafefiloi, ona aveese lea o le cannula mai le ET tube ma faʻaoso le manu. O le maneta e tumau i le nofoaga mo le 10 minute, ona aveese lea. Na maua e isumu se tui subcutaneous o le meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Ausetalia) sosoo ai ma le toe faʻafoʻisia o le faʻagase e ala i le tui ip o le 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Ausetalia). Na tausia isumu ia mafanafana ma mataʻituina seʻia oʻo ina toe malosi atoatoa mai le faʻagase.
O le masini e tu'uina atu ai le LV-MP i totonu o se kapeneta saogalemu fa'aola. O le ogatotonu efuefu vaivai o le paipa ET e mafai ona va'aia o lo'o aliali mai i fafo o le gutu ma o le pito gel o le pipette o lo'o fa'aalia i le ata ua fa'aofiina i totonu o le paipa ET i le loloto e mana'omia i totonu o le trachea.
I le vaiaso e tasi talu ona maeʻa le faiga o le faʻaaogaina o le LV-MP, na fasiotia ai manu i se auala agaalofa e ala i le manavaina o le 100% o le CO2 ma na iloiloina le faʻaalia o le LacZ e faʻaaoga ai la matou togafitiga masani X-gal. O mama e tolu o le cartilaginous caudal na aveeseina e faʻamautinoa ai e le aofia ai soʻo se faʻaleagaina faʻamekanika poʻo le taofia o le vai mai le tuʻuina o le endotracheal tube i le auiliiliga. O trachea taʻitasi na tipiina i le umi e fai ai ni afa se lua mo le auiliiliga, ma na faʻapipiʻiina i totonu o se ipu o loʻo i ai le silicone rubber (Sylgard, Dow Inc) e faʻaaoga ai se nila Minutien (Fine Science Tools) e vaʻaia ai le luminal surface. O le tufatufaina ma le mamanu o sela na faʻaliliuina na faʻamaonia e ala i le pueina o ata i luma e faʻaaoga ai se Nikon microscope (SMZ1500) faʻatasi ai ma se meapueata DigiLite ma le polokalama TCapture (Tucsen Photonics, Saina). Na maua ata i le 20x magnification (e aofia ai le seti aupito maualuga mo le lautele atoa o le trachea), faʻatasi ai ma le umi atoa o le trachea na faʻaalia i lea laʻasaga ma lea laʻasaga, ma faʻamautinoa le lava o le felagolagomaʻi i le va o ata taʻitasi e faʻatagaina ai le "suʻisuʻi" o ata. O ata mai trachea taʻitasi na ona tu'ufa'atasia lea i se ata tu'ufa'atasi e tasi e fa'aaoga ai le Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) e fa'aaoga ai se algorithm planar motion. O vaega o le fa'aalia o LacZ i ata tu'ufa'atasi o le trachea mai manu ta'itasi na fa'atatauina e fa'aaoga ai se tusitusiga MATLAB otometi (R2020a, MathWorks) e pei ona fa'amatalaina muamua, e fa'aaoga ai fa'atulagaga o le 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, ma le Value < 0.7. I le su'esu'eina o foliga o le a'ano, na faia ai se ufimata i le GIMP v2.10.24 mo ata tu'ufa'atasi ta'itasi ina ia iloa ai le vaega o le a'ano ma puipuia ai so'o se iloa sese mai fafo atu o le a'ano o le tracheal. O vaega ua valiina mai ata tu'ufa'atasi uma mai manu ta'itasi na fa'aopoopoina e maua ai le aofa'i o le vaega ua valiina mo lena manu. Ona vaevaeina lea o le vaega ua valiina i le aofa'i o le vaega o le ufimata e maua ai le vaega ua fa'atulagaina.
Sa fa'apipi'iina trachea ta'itasi i le paraffin ma tipiina vaega e 5 μm. Sa valiina vaega i le lanu mumu vave mo le 5 minute ma sa pu'eina ata e fa'aaoga ai le microscope Nikon Eclipse E400, meapueata DS-Fi3 ma le polokalama pu'eina elemene NIS (lomiga 5.20.00).
O au'ili'iliga fa'amaumauga uma sa fa'atinoina i le GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). O le taua fa'amaumauga sa fa'atulaga i le p ≤ 0.05. Sa fa'amaonia le tulaga masani e fa'aaoga ai le suega Shapiro-Wilk, ma o eseesega i le valivali LacZ sa iloiloina e fa'aaoga ai le suega t-e le'i fa'apa'iaina.
O MP e ono o loʻo faʻamatalaina i le Laulau 1 na suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le PCXI, ma o le vaʻaia o loʻo faʻamatalaina i le Laulau 2. E lua polystyrene MP (MP1 ma le MP2; 18 μm ma le 0.25 μm, i le faasologa) e leʻi vaʻaia i lalo o le PCXI, ae o isi faʻataʻitaʻiga na mafai ona iloa (o faʻataʻitaʻiga o loʻo faʻaalia i le Ata 5). O le MP3 ma le MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm ma le 0.9 μm, i le faasologa) e le o vaʻaia lelei. E ui o loʻo i ai nisi o vaega laiti na faʻataʻitaʻiina, o le MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) na sili ona iloga. O le oloa CombiMag MP6 e faigata ona iloa. I tulaga uma, o lo matou gafatia e iloa ai le MP na matua faʻaleleia atili e ala i le faʻaliliuina o le maneta i luma ma luma e tutusa ma le capillary. Ina ua siitia ese maneta mai le capillary, na faʻalauteleina vaega i ni manoa uumi, ae a o latalata mai maneta ma faʻateleina le malosi o le fanua maneta, na faʻapuʻupuʻu manoa o vaega a o siitia atu vaega agai i le pito i luga o le capillary (tagai i le Vitio Faʻaopoopo S1: MP4), faʻateleina le le mafiafia o vaega o le fogāeleele. I se isi itu, a aveese le maneta mai le capillary, e faʻaitiitia le malosi o le fanua ma toe faʻatulaga MP i ni manoa uumi e faʻaloaloa mai le pito i luga o le capillary (tagai i le Supplementary Video S2:MP4). A maeʻa ona taofi le gaoioi o le maneta, e faʻaauau pea ona gaoioi vaega mo sina taimi puʻupuʻu pe a uma ona oʻo i le tulaga paleni. A o agai atu le MP i luma ma le pito i luga o le capillary, e masani ona tosoina e vaega maneta otaota i totonu o le vai.
E matuā eseese lava le va'aia o le MP i lalo o le PCXI i le va o fa'ata'ita'iga. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ma le (d) MP6. O ata uma o lo'o fa'aalia iinei na pu'eina i se maneta e tusa ma le 10 mm tonu i luga a'e o le capillary. O li'o tetele e foliga mai o ni pulupulu ea o lo'o maileia i totonu o capillaries, o lo'o fa'aalia manino ai foliga uliuli ma pa'epa'e o le pito o le ata o le eseesega o le vaega. O lo'o i ai i le pusa mumu le fa'ateleina o le fa'aleleia atili o le eseesega. Manatua o le lautele o le fa'ata'ita'iga o le maneta i ata uma e le o fa'atatauina ma e tusa ma le 100 taimi e sili atu nai lo le mea o lo'o fa'aalia.
A o fa'aliliuina le maneta i le agavale ma le taumatau i luga o le capillary, e suia le tulimanu o le manoa MP e fa'atatau i le maneta (tagai Ata 6), ma fa'ailoa ai laina o le fanua maneta. Mo le MP3-5, a mae'a ona o'o le chord i se tulimanu fa'atapula'a, e tosoina vaega i luga o le pito i luga o le capillary. E masani ona mafua ai ona fa'aputuina MP i ni vaega tetele e lata ane i le mea e sili ona malosi ai le fanua maneta (tagai Vitio Fa'aopoopo S3:MP5). E manino fo'i lenei mea pe a faia se ata e lata ane i le pito o le capillary, lea e mafua ai ona fa'apotopoto ma fa'aputu MP i le va o le vai ma le ea. O vaega i le MP6, ia e sili atu ona faigata ona iloa nai lo le MP3-5, e le'i tosoina a'o gaoioi le maneta i luga o le capillary, ae na vavae'ese manoa MP, ma tu'ua ai vaega i le va'aiga (tagai Vitio Fa'aopoopo S4:MP6). I nisi tulaga, pe a fa'aitiitia le fanua maneta e ala i le fa'agaoioia o le maneta i se mamao tele mai le nofoaga o le ata, so'o se MP o totoe e alu ifo malie i le pito i lalo o le paipa e ala i le kalave a'o tumau pea i totonu o le manoa (tagai Vitio Fa'aopoopo S5: MP3).
E suia le tulimanu o le manoa MP a'o fa'aliliuina le maneta i le taumatau i luga a'e o le capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ma le (d) MP6. O lo'o i totonu o le pusa mumu le fa'alauteleina e fa'aleleia ai le eseesega. Ia manatua o vitio fa'aopoopo e fa'amatalaga aua e fa'aalia ai le fausaga taua o vaega ma fa'amatalaga fa'agaoioia e le mafai ona va'aia i nei ata tumau.
O a matou suʻega na faʻaalia ai o le faʻagaoioi malie o le maneta i luma ma luma i luga o le trachea e faʻafaigofie ai le vaʻaia o le MP i le tulaga o gaioiga faigata i totonu o le tino. E leʻi faia suʻega i totonu o le tino ona e leʻi vaʻaia ni polystyrene beads (MP1 ma le MP2) i totonu o le capillary. O MP taʻitasi e fa o totoe na suʻeina i totonu o le tino ma le long axis o le maneta ua faʻatulagaina i luga aʻe o le trachea i le tulimanu e tusa ma le 30° i le faʻatulagaina (tagai Ata 2b ma le 3a), aua o lenei mea na mafua ai ona umi atu filifili MP ma e sili atu le aoga nai lo le faʻamutaina o le faʻatulagaga o le maneta. E leʻi iloa MP3, MP4 ma le MP6 i totonu o le trachea o soʻo se manu ola. Ina ua faʻaalia ata o ala ea o isumu ina ua uma ona fasiotia manu i se auala agaalofa, na tumau pea le le vaaia o vaega e tusa lava pe faʻaopoopoina le voluma faʻaopoopo e faʻaaoga ai se pamu syringe. O le MP5 sa i ai le maualuga o le iron oxide content ma na o le pau lea o le vaega vaaia, ma o lea na faʻaaogaina e iloilo ma faʻamatalaina ai amioga i totonu o le tino o le MP.
O le tuʻuina o le maneta i luga o le trachea i le taimi o le tuʻuina atu o le MP na mafua ai ona tele, ae le o mea uma, o MP na faʻapotopotoina i le vaʻaiga. O vaega e ulufale atu i le trachea e sili ona matauina i manu na fasia ma le agaalofa. Ata 7 ma le Vitio Faʻaopoopo S6: O le MP5 o loʻo faʻaalia ai le vave puʻeina o le maneta ma le faʻatulagaina o vaega i luga o le trachea ventral, e faʻaalia ai e mafai ona faʻasino MP i vaega manaʻomia o le trachea. A o suʻesuʻeina i se auala mamao i luga o le trachea pe a uma le tuʻuina atu o le MP, o nisi MP na maua e latalata i le carina, o loʻo faʻaalia ai e le lava le malosi o le fanua maneta e aoina ma taofia ai MP uma, aua na tuʻuina atu i le vaega o le malosi sili o le fanua maneta i le taimi o le faʻagasologa o le vai. E ui i lea, o le maualuga o le MP postpartum sa maualuga atu i le vaega na pueina ata, o loʻo faʻaalia ai o le tele o MP na tumau i vaega o le ea lea e sili ona maualuga ai le malosi o le fanua maneta na faʻaaogaina.
Ata mai le (a) a'o le'i ma le (b) ina ua mae'a ona tu'uina atu le MP5 i totonu o le trachea o se isumu na fa'ato'ā fa'aumatia fa'atasi ai ma le maneta o lo'o tu sa'o i luga a'e o le vaega o ata. O le vaega o ata o lo'o i le va o mama o le cartilage e lua. A'o le'i tu'uina atu le MP, o lo'o i ai sina vai i totonu o le ea. O le pusa mumu o lo'o i ai le fa'alauteleina e fa'aleleia ai le eseesega. O nei ata e mai le vitio o lo'o fa'aalia i le Vitio Fa'aopoopo S6:MP5.
O le fa'aliliuina o le maneta i luga o le trachea i totonu o le tino ola na mafua ai ona suia le tulimanu o le filifili MP i totonu o le fogā'ele'ele o le ea i se auala e tutusa ma le mea e va'aia i totonu o capillaries (tagai i le Ata 8 ma le Vitio Fa'aopoopo S7:MP5). Peita'i, i la matou su'esu'ega, e le mafai ona tosoina MP i luga o le fogā'ele'ele o le ea ola e pei ona mafai i capillaries. I nisi tulaga, o le a umi atu le filifili MP pe a gaoioi le maneta i le agavale ma le taumatau. O le mea e malie ai, na matou iloa ai fo'i o le manoa o le vaega e foliga mai e suia ai le loloto o le vaega o le vai i luga pe a gaoioi le maneta i le umi i luga o le trachea, ma fa'alautele pe a gaoioi sa'o le maneta i luga ma fa'ata'amilo le manoa o le vaega i se tulaga fa'atulagaina (tagai i le Vitio Fa'aopoopo S7). : MP5 i le 0:09, pito i lalo taumatau). Na suia le mamanu masani o le gaioiga ina ua faaliliuina le maneta i luga o le pito i luga o le trachea i autafa (o lona uiga, i le agavale po o le taumatau o le manu nai lo le umi o le trachea). Sa manino lava le vaaia o vaega laiti a o latou gaoioi, ae ina ua aveese le maneta mai le trachea, na amata ona vaaia pito o manoa o vaega laiti (tagai i le Vitio Faaopoopo S8:MP5, amata i le 0:08). E ogatasi lea ma le amioga a le MP na matou matauina i lalo o se fanua maneta ua faaaogaina i totonu o se kapila tioata.
O ata fa'ata'ita'i o lo'o fa'aalia ai le MP5 i totonu o le trachea o se isumu ola ua fa'amoe. (a) E fa'aaogaina le maneta e pu'e ai ata i luga ma le agavale o le trachea, ona (b) a mae'a ona fa'agaoioi le maneta i le taumatau. O lo'o i totonu o le pusa mumu le fa'alauteleina e fa'aleleia ai le eseesega. O nei ata e mai le vitio o lo'o fa'aalia i le Supplementary Video S7:MP5.
Ina ua fa'atulagaina pou e lua i le itu i matu-saute i luga ma lalo o le trachea (e pei o le tosina mai; Ata 3b), na foliga umi atu MP chords ma sa i luga o le puipui o le trachea nai lo le luga o le dorsal tracheal (tagai i le Supplementary Video S9:MP5). Peita'i, o le maualuga o le aofa'i o vaega i se nofoaga e tasi (e pei o le pito i tua o le trachea) e le'i iloa pe a uma ona tu'uina atu le vai pe a fa'aogaina se masini dual-magnet, lea e masani ona tupu pe a fa'aogaina se masini single-magnet. Ona fa'atulagaina lea o se tasi magnet e tete'e atu i pou ua fa'aliliuina (Ata 3c), o le aofa'i o vaega o lo'o va'aia i le va'aiga e foliga mai e le'i fa'ateleina pe a uma ona tu'uina atu. O le fa'atulagaina o fa'atulagaga dual-magnet e lua e faigata ona o le malosi maualuga o le magnetic field e tosoina pe tulei ai magnet. Ona suia lea o le fa'atulagaina i se magnet e tasi e tutusa ma le auala ea ae ui atu i le auala ea i le 90 tikeri ina ia sopo'ia e laina o le fanua le puipui o le tracheal orthogonally (Ata 3d), o se fa'atulagaga ua mamanuina e iloa ai pe mafai ona matauina le fa'aputuga o vaega i le puipui i le itu. Peita'i, i totonu i lenei fa'atulagaga, e leai se gaioiga e mafai ona iloa o le fa'aputuga MP po'o le gaioiga o le maneta. E fa'avae i luga o nei taunu'uga uma, o se fa'atulagaga fa'atulagaina e tasi le maneta, 30-tikeri (Ata 3a) na filifilia mo su'esu'ega o le avefe'au o kene i totonu o le tino ola.
Ina ua toe faia pea lava pea ata o le manu i le taimi lava na maeʻa ai le fasiotia faaletagata, o le leai o se fenumiai o le gaioiga o aano o lona uiga e mafai ona iloa atu ni laina manifinifi ma pupuu o vaega laiti i le fanua manino i le va o chondral, "gatete" e tusa ai ma le gaioiga faaliliu a le maneta. Ae ui i lea, e le mafai lava ona iloa manino le i ai ma le gaioiga o vaega MP6.
O le titer LV-LacZ e 1.8 × 108 TU/ml, ma ina ua maeʻa le palu faʻatasi ma le CombiMag MP (MP6) i le fua faʻatatau 1:1, na maua ai e manu se tui e 50 μl o le tracheal e 9 × 107 TU/ml LV vehicle (e pei o le 4.5 × 106 TU/iole). I nei suʻesuʻega, nai lo le faʻaliliuina o le maneta i le taimi o le faʻafanau, na matou faʻamauina le maneta i le tasi tulaga e iloa ai pe mafai ona faʻaleleia le LV transduction (a) pe a faʻatusatusa i le vector delivery i le leai o se magnetic field, ma le (b) e mafai ona taulaʻi. O sela o le ea e faʻaliliuina i vaega faʻatatau maneta o le ea pito i luga.
O le i ai o maneta ma le faʻaaogaina o le CombiMag faʻatasi ai ma vectors LV e foliga mai e leai ni aʻafiaga leaga i le soifua maloloina o manu, e pei ona faia i la matou faiga masani o le tuʻuina atu o vector LV. O ata pito i luma o le vaega o le tracheal na faia i ai le faʻalavelave faʻamekanika (Ata Faʻaopoopo 1) na faʻaalia ai o loʻo i ai le maualuga tele o le transduction i le vaega o manu na togafitia i le LV-MP pe a i ai le maneta (Ata 9a). E naʻo sina vaega itiiti o le vali lanumoana LacZ na i ai i le vaega pulea (Ata 9b). O le fuaina o vaega ua faʻatulagaina o le vali X-Gal na faʻaalia ai o le tuʻuina atu o le LV-MP i le i ai o se fanua maneta na maua ai se faʻaleleia atili e tusa ma le 6-fold (Ata 9c).
Fa'ata'ita'iga o ata tu'ufa'atasi o lo'o fa'aalia ai le fa'aliliuina o le trachea e le LV-MP (a) i le i ai o se fanua maneta ma le (b) i le leai o se maneta. (c) Fa'aleleia atili fa'amaumauga taua i le vaega masani o le fa'aliliuina o le LacZ i totonu o le trachea pe a fa'aogaina le maneta (*p = 0.029, t-test, n = 3 i le vaega ta'itasi, averesi ± SEM).
O vaega lanu mumu vavave e le masani ai (faʻataʻitaʻiga o loʻo faʻaalia i le Ata Faʻaopoopo 2) na faʻaalia ai sela ua valiina i le LacZ o loʻo i ai i se mamanu ma le nofoaga tutusa e pei ona lipotia muamua.
O se luʻitau autū mo le togafitiga o kenera o le ea o loʻo tumau pea le faʻatulagaina saʻo o vaega feaveaʻi i vaega e fiafia i ai ma le ausiaina o tulaga maualuga o le lelei o le transduction i totonu o le mama feʻaveaʻi i le i ai o le ea ma le faʻamamaina o le mucus malosi. Mo avefeʻau LV ua mamanuina e togafitia ai le faʻamaʻi o le ea CF, o le faʻateleina o le taimi e nofo ai vaega feaveaʻi i totonu o ea ea o loʻo faʻatautaia o se sini e leʻi malamalama i ai. E pei ona taʻua e Castellani et al., o le faʻaaogaina o fanua maneta e faʻaleleia atili ai le transduction e iai ona lelei pe a faʻatusatusa i isi metotia o le tuʻuina atu o kenera e pei o le electroporation, aua e mafai ona tuʻufaʻatasia le faigofie, taugofie, faʻatulagaina o le tuʻuina atu, faʻateleina le lelei, ma taimi puʻupuʻu o le incubation, ma atonu o se laʻititi o le avefeʻau10. Peitaʻi, o le in vivo deposition ma amioga o vaega maneta i totonu o ea i lalo o le faatosinaga o malosiaga maneta mai fafo e leʻi faʻamatalaina lava, e leʻi faʻaalia moni lava le aoga o lenei metotia i totonu o le vivo e faʻaleleia atili ai le tulaga o le faʻaalia o kenera i ea olaola.
O a matou faʻataʻitaʻiga in vitro synchrotron PCXI na faʻaalia ai o vaega uma na matou faʻataʻitaʻiina, vagana ai le polystyrene MP, na vaʻaia i le faʻatulagaga ata na matou faʻaaogaina. I le i ai o se fanua maneta, e fausia ai e MP ni manoa e fesoʻotaʻi le umi ma le ituaiga o vaega ma le malosi o le fanua maneta (e pei o le latalata ma le gaioiga o le maneta). E pei ona faʻaalia i le Ata 10, o manoa matou te matauina e fausia ona o vaega taʻitasi ua faʻamanetaina ma faʻaosofia ai lona lava fanua maneta i le lotoifale. O nei fanua eseese e mafua ai ona faʻapotopoto ma fesoʻotaʻi isi vaega tutusa, faʻatasi ai ma gaioiga faʻaputu e pei o manoa ona o malosiaga i le lotoifale mai malosiaga tosina ma teteʻe i le lotoifale o isi vaega.
O le ata fa'atusa o lo'o fa'aalia ai le (a,b) o vaega o lo'o gaosia i totonu o kapilali e tumu i vai ma le (c,d) trachea e tumu i le ea. Ia matau o kapilali ma trachea e le'o tusia i le fua. O le laupapa (a) o lo'o iai fo'i se fa'amatalaga o le MP, lea o lo'o iai vaega Fe3O4 o lo'o fa'atulagaina i ni manoa.
Ina ua siitia le maneta i luga aʻe o le capillary, na oʻo atu ai le tulimanu o le manoa o le fasi i se tulaga taua mo le MP3-5 o loʻo i ai le Fe3O4, ma mulimuli ane na le toe tumau ai le manoa o le fasi i le tulaga muamua, ae na siitia i luga o le fogāeleele i se tulaga fou. maneta. Atonu e tupu lenei aafiaga ona o le fogāeleele o le capillary tioata e lava lona lamolemole e mafai ai ona tupu lenei gaioiga. O le mea e malie ai, e leʻi amio faapenei le MP6 (CombiMag), atonu ona o le laiti o fasi, e eseese ufiufi poʻo totogi o luga, pe na aʻafia ai e se vai e feaveaʻi ai lo latou gafatia e gaoioi. O le eseesega o ata o fasi CombiMag e vaivai foi, ma fautua mai ai o le vai ma fasi atonu e tutusa le mafiafia ma o lea e le faigofie ai ona agai le tasi i le isi. E mafai foi ona pipii fasi pe afai e vave tele le gaoioi o le maneta, e faailoa mai ai e le mafai e le malosi o le fanua maneta ona faatoilaloina le feeseeseaʻiga i le va o fasi i le vai, ma fautua mai ai atonu e le o se mea e ofo ai le malosi o le fanua maneta ma le mamao i le va o le maneta ma le eria o loʻo faʻamoemoeina. A tuʻufaʻatasia, o nei taunuuga e fautua mai ai foi, e ui lava e mafai e maneta ona puʻeina le tele o MP e tafe i le eria o loʻo faʻamoemoeina, ae e le foliga mai e mafai ona faʻalagolago i ai maneta. e fa'agaoioi ai vaega o le CombiMag i luga o le trachea. O le mea lea, matou te fa'ai'uina ai o su'esu'ega LV-MP in vivo e tatau ona fa'aogaina ai fanua fa'amaneta tumau e fa'atatau faaletino i vaega patino o le la'au o le ea.
A tuʻuina atu ni vaega i totonu o le tino, e faigata ona iloa i le tulaga o le fealuaʻi o le tino, ae o le mafai ona iloa na faʻaleleia atili e ala i le faʻaliliuina o le maneta i luga aʻe o le trachea e "faʻagaeʻetia" ai manoa MP. E ui e mafai ona faia ni ata ola, ae e faigofie ona iloa le gaioiga o vaega pe a uma ona fasiotia le manu i se auala agaalofa. O le maualuga o le MP e masani lava ona maualuga i lenei nofoaga pe a tuʻu le maneta i luga aʻe o le vaega o ata, e ui o nisi vaega e masani ona maua i tafatafa o le trachea. E ese mai i suʻesuʻega in vitro, e le mafai ona tosoina vaega i luga o le trachea e ala i le faʻaliliuina o le maneta. O lenei sailiga e ogatasi ma le auala e masani ona faʻagasolo ai e le mucus e ufiufi ai le fogāeleele o le trachea vaega e manava i totonu, e puʻeina i latou i le mucus ma mulimuli ane faʻamamāina e le faiga faʻamamāina o le mucociliary.
Sa matou manatu o le faʻaaogaina o maneta mo le tosina atu i luga ma lalo o le trachea (Ata 3b) atonu e iʻu ai i se fanua maneta e sili atu ona tutusa, nai lo se fanua maneta e matua faʻapotopotoina i le tasi tulaga, e ono iʻu ai i se tufatufaina atu o vaega. Peitaʻi, o la matou suʻesuʻega muamua e leʻi maua ai ni faʻamaoniga manino e lagolago ai lenei manatu. E faʻapena foʻi, o le faʻatulagaina o se paga o maneta e teteʻe (Ata 3c) e leʻi iʻu ai i le tele o le teuina o vaega i le vaega o loʻo faʻaalia. O nei suʻesuʻega e lua e faʻaalia ai o le faʻatulagaina o le maneta-lua e le faʻaleleia atili ai le pulea faʻalotoifale o le MP targeting, ma o le malosi malosi o le maneta e faigata ona faʻatulagaina, ma faʻaitiitia ai le aoga o lenei auala. E faʻapena foʻi, o le faʻatulagaina o le maneta i luga ma totonu o le trachea (Ata 3d) e leʻi faʻateleina ai foʻi le aofaʻi o vaega o loʻo taofia i le vaega o loʻo faʻaalia. O nisi o nei faʻatulagaga eseese atonu e le manuia ona e iʻu ai i le maualalo o le malosi o le fanua maneta i totonu o le vaega o loʻo teuina. O le mea lea, o le faʻatulagaina o le maneta tulimanu e 30-tikeri (Ata 3a) e manatu o le auala sili ona faigofie ma sili ona lelei mo le suʻega i totonu o le tino.
O le suʻesuʻega a le LV-MP na faʻaalia ai ina ua tuʻufaʻatasia vectors LV ma CombiMag ma tuʻuina atu ina ua maeʻa le faʻalavelave faʻaletino i le i ai o se fanua maneta, na matua faʻateleina le maualuga o le transduction i le trachea pe a faʻatusatusa i vaega faʻatonutonu. E faʻavae i luga o suʻesuʻega o ata synchrotron ma taunuuga o le LacZ, e foliga mai na mafai e le fanua maneta ona faʻasaoina le LV i totonu o le trachea ma faʻaitiitia le aofaʻi o vector particles na vave ona sosolo loloto i totonu o le mama. O ia faʻaleleia atili o le faʻatatauina e ono oʻo atu ai i le maualuga o le aoga aʻo faʻaitiitia ai titers na tuʻuina atu, transduction off-target, inflammatory ma aʻafiaga o le puipuiga o le tino, ma tau o le avefeʻau o kene. O le mea taua, e tusa ai ma le kamupani gaosi oloa, e mafai ona faʻaaogaina le CombiMag faʻatasi ma isi metotia o le fesiitaiga o kene, e aofia ai ma isi viral vectors (e pei o le AAV) ma nucleic acids.