Merci fir Äre Besuch op Nature.com. D'Browserversioun, déi Dir benotzt, ënnerstëtzt CSS limitéiert. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech, en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). An der Zwëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript uweisen.
Genvektoren fir d'Behandlung vu zystischer Fibrose-Lungenerkrankung sollten déi leedend Loftweeër ofzielen, well peripher Lungentransduktioun keen therapeutesche Virdeel bitt. D'Effizienz vun der viraler Transduktioun hänkt direkt mat der Openthaltszäit vum Vektor zesummen. Wéi och ëmmer, Liwwerflëssegkeeten, wéi Genträger, diffundéieren natierlech an d'Alveolen während der Inhalatioun, an therapeutesch Partikelen vun iergendenger Form ginn duerch mukociliären Transport séier geläscht. D'Verlängerung vun der Openthaltszäit vu Genträger an den Loftweeër ass wichteg, awer schwéier z'erreechen. Genträger-konjugéiert Magnéitpartikelen, déi op d'Uewerfläch vun den Loftweeër geriicht kënne ginn, kënnen d'regional Zilsetzung verbesseren. Wéinst den Erausfuerderunge vun der In-vivo-Visualiséierung ass d'Verhale vu sou klenge Magnéitpartikelen op der Loftweeëruewerfläch a Präsenz vun engem ugewandte Magnéitfeld schlecht verstanen. D'Zil vun dëser Studie war et, Synchrotronbildgebung ze benotzen, fir d'In-vivo-Bewegung vun enger Serie vu Magnéitpartikelen an der Trachea vun anästhetiséierte Ratten ze visualiséieren, fir d'Dynamik an d'Muster vum Verhale vun eenzelnen a bulkpartikelen in vivo z'ënnersichen. Mir hunn dann och ënnersicht, ob d'Liwwerung vu lentiviralen Magnéitpartikelen a Präsenz vun engem Magnéitfeld d'Transduktiounseffizienz bei der Ratt géif erhéijen. Trachea. Synchrotron-Röntgenbildgebung weist d'Verhale vu Magnéitpartikelen a stationären a bewegende Magnéitfelder in vitro an in vivo. Partikelen kënnen net einfach mat Magnete laanscht d'Uewerfläch vun de liewegen Atemweeër gezunn ginn, awer beim Transport konzentréiere sech d'Oflagerungen am Siichtfeld, wou d'Magnéitfeld am stäerksten ass. D'Transduktiounseffizienz gouf och sechsfach erhéicht, wann lentiviral Magnéitpartikelen a Präsenz vun engem Magnéitfeld geliwwert goufen. Zesumme suggeréieren dës Resultater, datt lentiviral Magnéitpartikelen a Magnéitfelder wäertvoll Approche kënne sinn, fir d'Genvektorenzielung ze verbesseren an d'Transduktiounsniveauen an de féierende Atemweeër in vivo ze erhéijen.
Zystesch Fibrose (CF) gëtt duerch eng Variatioun an engem eenzege Gen verursaacht, deen de CF Transmembran-Konduktanzregulator (CFTR) genannt gëtt. De CFTR-Protein ass en Ionenkanal, deen a ville Epithelzellen am ganze Kierper präsent ass, dorënner an de leitenden Atemweeër, eng wichteg Plaz vun der CF-Pathogenese. CFTR-Defekter féieren zu engem anormalen Waassertransport, wouduerch d'Atemweeëruewerfläch dehydratiséiert gëtt an d'Déift vun der Flëssegkeetsschicht (ASL) vun den Atemweeër reduzéiert gëtt. Dëst beeinträchtigt och d'Fäegkeet vum mukociliäre Transportsystem (MCT), inhaléiert Partikelen a Pathogenen aus den Atemweeër ze läschen. Eist Zil ass et, eng lentiviral (LV) Gentherapie z'entwéckelen, fir déi richteg Kopie vum CFTR-Gen ze liwweren an d'ASL-, MCT- a Longengesondheet ze verbesseren, an nei Technologien weider z'entwéckelen, déi fäeg sinn, dës Parameter in vivo ze moossen1.
LV-Vektoren sinn ee vun den Haaptkandidaten fir d'Gentherapie vun den Atemweeër am CF, haaptsächlech well se dat therapeutescht Gen permanent an d'Basalzellen vun den Atemweeër (Atmungsweeër-Stammzellen) integréiere kënnen. Dëst ass wichteg, well se déi normal Hydratatioun an d'Schleimreinigung restauréiere kënnen, andeems se sech a funktionell genkorrigéiert CF-assoziéiert Atemweeër-Uewerflächenzellen differenzéieren, wat zu liewenslaange Virdeeler féiert. LV-Vektoren sollten géint déi féierend Atemweeër geriicht ginn, well hei ufänkt d'Lungenerkrankung am CF. D'Liwwerung vum Vektor méi déif an d'Lunge kann zu enger alveolarer Transduktioun féieren, awer dëst huet keen therapeutesche Virdeel bei CF. Wéi och ëmmer, Flëssegkeeten wéi Genträger migréieren natierlech an d'Alveolen no der Inhalatioun no der Liwwerung3,4 an d'therapeutesch Partikelen ginn duerch MCT séier an d'Mondhöhl geläscht. D'LV-Transduktiounseffizienz ass direkt mat der Zäit verbonnen, déi de Vektor nieft den Zilzellen bleift, fir d'zellulär Opnam z'erméiglechen - d'"Openthaltszäit"5 - déi duerch typesch regional Loftstroum souwéi koordinéiert Partikelschleimerfassung an MCT liicht reduzéiert ka ginn. Fir CF ass d'Fäegkeet, d'Openthaltszäit vun der LV an den Atemweeër ze verlängeren, wichteg fir héich Niveauen vun der Transduktioun an dëser Regioun z'erreechen, awer bis elo war et eng Erausfuerderung.
Fir dëst Hindernis ze iwwerwannen, proposéiere mir, datt LV-Magnéitpartikelen (MPs) op zwou komplementär Weeër hëllefe kënnen. Éischtens kënne se magnetesch op d'Uewerfläch vun den Atemweeër geleet ginn, fir d'Zilsetzung ze verbesseren an d'Genträgerpartikelen ze hëllefen, sech an der gewënschter Atemweeërregioun ze halen; an ASL) fir sech op d'Zellschicht 6 ze beweegen. MPs gi wäit verbreet als gezielt Medikamentenliwwerungsvehikelen agesat, wa se sech un Antikörper, Chemotherapeutika oder aner kleng Moleküle bannen, déi sech un Zellmembranen bannen oder un relevant Zelluewerflächerezeptoren bannen an sech op Tumorplazen a Präsenz vu statescher Elektrizitéit accumuléieren. Magnéitfelder fir Kriibsbehandlung 7. Aner "hyperthermal" Techniken zielen drop of, MPen ze erhëtzen, wa se oszilléierende Magnéitfelder ausgesat sinn, wouduerch Tumorzellen zerstéiert ginn. De Prinzip vun der magnéitescher Transfektioun, bei deem e Magnéitfeld als Transfektiounsmëttel benotzt gëtt, fir den Transfer vun DNA an d'Zellen ze verbesseren, gëtt allgemeng in vitro mat enger Rei vun net-viralen a viralen Genvektoren fir schwéier ze transduzéierend Zelllinnen benotzt. D'Effektivitéit vun der LV-Magnetotransfektioun gouf etabléiert, mat In-vitro-Liwwerung vu LV-MPen un eng mënschlech bronchial Epithelzelllinn a Präsenz vun engem statesche Magnéitfeld, wat d'Transduktiounseffizienz ëm den 186-fache erhéicht am Verglach mam LV-Vektor eleng. LV-MP gouf och op en In-vitro-CF-Modell ugewannt, wou d'Magnetotransfektioun d'LV-Transduktioun a Loft-Flëssegkeet-Grenzflächenkulturen ëm den 20-fache erhéicht huet a Präsenz vu CF-Sputum10. Wéi och ëmmer, in-vivo-Magnetotransfektioun vun Organer huet relativ wéineg Opmierksamkeet kritt a gouf nëmmen an e puer Déierenstudien evaluéiert. Studien11,12,13,14,15, besonnesch an de Longen16,17. Trotzdeem sinn d'Méiglechkeete fir eng magnetesch Transfektioun an der CF-Lungentherapie kloer. Tan et al. (2020) hunn erkläert, datt "eng Proof-of-Concept-Studie iwwer eng effizient Liwwerung vu magnéiteschen Nanopartikelen an d'Lunge de Wee fir zukünfteg CFTR-Inhalatiounsstrategien fräimaacht, fir d'klinesch Resultater bei CF-Patienten ze verbesseren"6.
D'Verhale vu klenge magnéitesche Partikelen op Loftweeëruewerflächen a Präsenz vun engem ugewandte Magnéitfeld ass schwéier ze visualiséieren an ze studéieren, an dofir schlecht verstanen. An anere Studien hu mir eng Synchrotron-Propagatiounsbaséiert Phasenkontrast-Röntgenbildgebung (PB-PCXI) Method entwéckelt fir net-invasiv kleng in vivo Ännerungen an der ASL-Déift18 an dem MCT-Verhalen19,20 ze visualiséieren an ze quantifizéieren, fir d'Hydratatioun vum Gaskanaluewerflächen direkt ze moossen an als fréien Indikator fir d'Behandlungseffizienz ze benotzen. Zousätzlech benotzt eis MCT-Evaluatiounsmethod Partikelen mat engem Duerchmiesser vun 10–35 µm, déi aus Aluminiumoxid oder Glas mat héijem Breechungsindex zesummegesat sinn, als MCT-Markéierer, déi mat PB-PCXI21 sichtbar sinn. Béid Technike si gëeegent fir d'Visualiséierung vun enger Rei vu Partikeltypen, dorënner MP.
Wéinst hirer héijer raimlecher an zäitlecher Opléisung sinn eis PB-PCXI-baséiert ASL- an MCT-Analysetechniken gutt geegent fir d'Dynamik an d'Muster vum Verhalen vun eenzelen a grousse Partikelen in vivo z'ënnersichen, fir eis ze hëllefen, MP-Gen-Liwwerungstechniken ze verstoen an z'optimiséieren. Den Usaz, deen mir hei uwenden, baséiert op eise Studien mat der SPring-8 BL20B2-Beamline, an där mir Flëssegkeetsbewegung no der Sham-Vektor-Dosis-Liwwerung an d'Nues- a Pulmonal-Atmungsweeër vu Mais visualiséiert hunn, fir eis net-uniform Genexpressionsmuster z'erklären, déi an eise Genträger-Dosis-Déierstudien observéiert goufen 3,4.
Zil vun dëser Studie war et, de Synchrotron PB-PCXI ze benotzen, fir d'in vivo Beweegunge vun enger Serie vu MPs an der Trachea vu liewege Ratten ze visualiséieren. Dës PB-PCXI-Bildgebungsstudien goufen entwéckelt fir eng Rei vu MPs, Magnéitfeldstäerkten a Standuerter ze testen, fir hiren Effekt op d'MP-Bewegung ze bestëmmen. Mir hunn d'Hypothes opgestallt, datt en extern ugewandte Magnéitfeld dem geliwwerte MP hëllefe géif, an der Zilregioun ze bleiwen oder sech do ze bewegen. Dës Studien hunn et eis och erlaabt, Magnetkonfiguratiounen z'identifizéieren, déi d'Zuel vun de Partikelen, déi an der Trachea no der Oflagerung zréckgehale ginn, maximéieren. An enger zweeter Serie vu Studien hu mir versicht, dës optimal Konfiguratioun ze benotzen, fir den Transduktiounsmuster ze demonstréieren, deen aus der in vivo Liwwerung vu LV-MPs an d'Ratten-Atmungsweeër resultéiert, baséiert op der Viraussetzung, datt d'Liwwerung vu LV-MPs am Kontext vun der Atmungsweeër-Zilsetzung zu enger verbesserter LV-Transduktiounseffizienz féiere géif.
All Déierstudien goufen no de Protokoller duerchgefouert, déi vun der Universitéit vun Adelaide (M-2019-060 an M-2020-022) an dem SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee guttgeheescht goufen. D'Experimenter goufen no den ARRIVE-Richtlinne duerchgefouert.
All Röntgenbildgebung gouf um BL20XU-Beamline um SPring-8 Synchrotron a Japan duerchgefouert, mat engem Setup ähnlech wéi dee virdru beschriwwen21,22. Kuerz gesot, war d'Experimentell Këscht 245 m vum Synchrotron-Späicherring ewech. Eng Distanz tëscht Prouf a Detektor vun 0,6 m gëtt fir Partikelbildgebungsstudien an 0,3 m fir In-vivo-Bildgebungsstudien benotzt fir Phasenkontrasteffekter ze generéieren. Eng monochromatesch Stralenenergie vun 25 keV gouf benotzt. Biller goufen mat engem Héichopléisende-Röntgenkonverter (SPring-8 BM3) opgeholl, deen un en sCMOS-Detektor gekoppelt ass. De Konverter konvertéiert Röntgenstralen a siichtbaart Liicht mat engem 10 µm décke Szintillator (Gd3Al2Ga3O12), deen dann op en sCMOS-Sensor mat engem × 10 Mikroskopobjektiv (NA 0.3) geriicht gëtt. Den sCMOS-Detektor war Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) mat enger Arraygréisst vun 2048 × 2048 Pixel an eng rau Pixelgréisst vu 6,5 × 6,5 µm. Dësen Opbau ergëtt eng effektiv isotrop Pixelgréisst vun 0,51 µm an e Siichtfeld vun ongeféier 1,1 mm × 1,1 mm. Eng Beliichtungsdauer vun 100 ms gouf gewielt fir de Signal-Rausch-Verhältnis vu magnéitesche Partikelen an an ausserhalb vun den Atemweeër ze maximéieren an dobäi d'Atmung-induzéiert Bewegungsartefakte ze minimiséieren. Fir In-vivo-Studien gouf e schnelle Röntgenausléiser am Röntgenwee placéiert fir d'Stralendosis ze limitéieren andeems de Röntgenstrahl tëscht de Beliichtungen blockéiert gouf.
Den LV-Carrier gouf a kengen SPring-8 PB-PCXI-Bildgebungsstudien benotzt, well d'BL20XU-Bildgebungskammer net Biosafety Level 2 zertifizéiert ass. Mir hunn amplaz eng Rei vu gutt charakteriséierten MPs vun zwéi kommerziellen Ubidder ausgewielt - déi eng Rei vu Gréissten, Materialien, Eisenkonzentratiounen an Uwendungen ofdecken - fir d'éischt ze verstoen, wéi Magnéitfelder d'MP-Bewegung a Glaskapillaren an duerno a liewegen Atmungsweeër beaflossen. op der Uewerfläch. MPe variéiere vun 0,25 bis 18 μm a gi aus verschiddene Materialien hiergestallt (kuckt Tabelle 1), awer d'Zesummesetzung vun all Prouf, inklusiv der Gréisst vun de Magnéitpartikelen am MP, ass onbekannt. Baséierend op eisen extensiven MCT-Studien 19, 20, 21, 23, 24, erwaarden mir, datt MPe sou kleng wéi 5 μm op der Tracheal-Atmungsfläche gesi kënne ginn, zum Beispill andeems hannereneen Biller subtrahéiert ginn, fir eng verbessert Visibilitéit vun der MP-Bewegung ze gesinn. En eenzegen MP vun 0,25 μm ass méi kleng wéi d'Opléisung vum Bildgebungsgerät, awer et gëtt erwaart, datt PB-PCXI hire Volumenkontrast an d'Bewegung vun der Uewerflächenflëssegkeet, op där se no der Oflagerung ofgesat ginn, detektéiert.
Prouwe fir all MP an der Tabell 1 goufen a 20 μl Glaskapillaren (Drummond Microcaps, PA, USA) mat engem bannenzegen Duerchmiesser vun 0,63 mm virbereet. Korpuskulär Partikelen sinn a Waasser verfügbar, während CombiMag Partikelen an der proprietärer Flëssegkeet vum Hiersteller verfügbar sinn. All Rouer ass hallef mat Flëssegkeet gefëllt (ongeféier 11 μl) a placéiert op den Proufhalter (kuckt Figur 1). D'Glaskapillaren goufen horizontal op der Proufbühn an der Bildgebungsbox placéiert, respektiv, an d'Kante vun der Flëssegkeet positionéiert. E Nickel-Schuel-Selten-Äerd-Neodym-Eisen-Bor (NdFeB)-Magnéit (N35, Kat. Nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) mat engem Duerchmiesser vun 19 mm (28 mm laang) an enger Nickel-Schuel-Selten-Äerd-Neodym-Eisen-Bor (NdFeB) mat enger Reschtmagnetiséierung vun 1,17 Tesla gouf un eng separat Translatiounsbühn ugeschloss, fir seng Positioun während der Bildgebung op Distanz z'änneren. D'Röntgenbildopnahm fänkt un, wann de Magnéit ongeféier 30 mm iwwer der Prouf positionéiert ass, an d'Biller ginn mat enger Rate vu 4 Biller pro Sekonn opgeholl. Wärend der Bildgebung gouf de Magnéit... no beim Glaskapillarröhr bruecht (ongeféier 1 mm ewech) an dann laanscht d'Röhr transléiert fir d'Auswierkunge vun der Feldstäerkt an der Positioun ze bewäerten.
In-vitro-Bildgebungsopbau mat MP-Prouwen a Glaskapillaren op der Xy-Translatiounsstufe vun der Prouf. De Wee vum Röntgenstral ass mat enger rouder gestrichelter Linn markéiert.
Soubal d'In-vitro-Visibilitéit vun den MPs festgestallt war, gouf eng Ënnergrupp vun hinnen in vivo a Wildtyp-Weibchen-Albino-Wistar-Ratten (~12 Wochen al, ~200 g) getest. 0,24 mg/kg Medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg Midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) a 4 mg/kg Butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). D'Ratte goufen mat enger Mëschung aus Pharma (Japan) duerch intraperitoneal Injektioun anästhetiséiert. No der Anästhesie goufe se fir d'Bildgebung virbereet, andeems d'Pelz ronderëm d'Trachea ewechgeholl, en Endotrachealröhrchen (ET; 16 Ga iv Kanül, Terumo BCT) agefouert an op enger speziell gemaachter Bildgebungsplack mat engem Thermobeutel immobiliséiert gouf, fir d'Kierpertemperatur 22 ze halen. D'Bildgebungsplack gouf dann un d'Prouftranslatiounsbühn an der Bildgebungsbox an engem liichte Wénkel befestegt, fir d'Trachea horizontal am Röntgenbild auszeriichten, wéi an der Figur gewisen. 2a.
(a) In vivo-Bildgebungsopstellung an der SPring-8-Bildgebungsbox, de Wee vum Röntgenstral ass mat enger rouder gestrichelter Linn markéiert. (b,c) D'Magnetlokaliséierung op der Trachea gouf aus der Distanz mat zwou orthogonal montéierten IP-Kameraen duerchgefouert. Op der lénkser Säit vum Bildschiermbild kann d'Drotschleef, déi de Kapp hält, an d'Aféierungskanül am ET-Röhre gesi ginn.
E ferngesteiert Sprëtzepompelsystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mat enger 100 μl Glassprëtz gouf iwwer eng 30 Ga Nol un e PE10-Schlauch (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) ugeschloss. Markéiert d'Schlauch fir sécherzestellen, datt d'Spëtzt an der richteger Positioun an der Trachea ass, wann d'ET-Schlauch agefouert gëtt. Mat der Mikropompel gouf de Sprëtzkolben zréckgezunn, während d'Spëtzt vum Schlauch an der MP-Prouf, déi agefouert soll ginn, agetaucht war. Dat geluedent Aféierungsschlauch gouf dann an den Endotrachealtubus agefouert, wouduerch d'Spëtzt am stäerksten Deel vun eisem erwaarten ugewandte Magnéitfeld placéiert gouf. D'Bilderfassung gouf mat engem Atmungsdetektor kontrolléiert, deen un eis Arduino-baséiert Timingbox ugeschloss war, an all Signaler (z.B. Temperatur, Atmung, Verschlussöffnung/Zoumaache a Bilderfassung) goufen mat Powerlab a LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) opgeholl.22. Beim Bildopnam... Wéi d'Gehäuse net zougänglech war, goufen zwou IP-Kameraen (Panasonic BB-SC382) ongeféier 90° zueneen positionéiert a goufe benotzt fir d'Positioun vum... ze iwwerwaachen. Magnet relativ zu der Trachea während der Bildgebung (Fig. 2b,c). Fir Bewegungsartefakte ze minimiséieren, gouf ee Bild pro Otemzuch während dem End-Tidal-Flow-Plateau opgeholl.
E Magnet ass un eng zweet Stuf befestegt, déi vun ausserhalb vum Bildgebungsgehäuse ewech placéiert ka ginn. Verschidde Magnetpositiounen a Konfiguratioune goufen getest, dorënner: Montéiert an engem Wénkel vun ongeféier 30° iwwer der Trachea (Konfiguratioune ginn an de Figuren 2a an 3a gewisen); ee Magnet iwwer dem Déier an deen aneren drënner, mat de Pole fir unzezéien agestallt (Figur 3b); ee Magnet iwwer dem Déier an deen aneren drënner, mat de Pole fir ofzestoussen agestallt (Figur 3c); an ee Magnet iwwer an senkrecht zu der Trachea (Figur 3d). Soubal d'Déier an de Magnet konfiguréiert sinn an den ze testen MP an d'Sprëtzepompel gelueden ass, gëtt eng Dosis vu 50 μl mat enger Rate vu 4 μl/Sek ofginn, während Biller opgeholl ginn. De Magnet gëtt dann laanscht oder lateral iwwer d'Trachea hin an hier beweegt, während weider Biller opgeholl ginn.
Magnetkonfiguratioun fir In-vivo-Bildgebung (a) een eenzege Magnet iwwer der Trachea an engem Wénkel vun ongeféier 30°, (b) zwee Magnete fir unzezéien, (c) zwee Magnete fir ofzestoussen, (d) een eenzege Magnet iwwer an senkrecht an der Trachea. Den Observateur huet vum Mond an d'Lunge duerch d'Trachea erofgekuckt, an de Röntgenstrahl ass duerch déi lénks Säit vun der Ratt gaangen an ass op déi riets Säit erauskomm. De Magnet gëtt entweder laanscht d'Längt vun den Atemweeër beweegt oder lénks a riets iwwer der Trachea a Richtung vum Röntgenstrahl.
Mir hunn och probéiert d'Visibilitéit an d'Verhale vu Partikelen an den Atemweeër ze bestëmmen, wann et keng stéierend Atmung a kardial Beweegunge gouf. Dofir goufen d'Déieren um Enn vun der Bildgebungsperiod op eng mënschlech Manéier wéinst enger Iwwerdosis Pentobarbital ëmbruecht (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). E puer Déieren goufen op der Bildgebungsplattform gelooss, a soubal d'Atmung an den Häerzschlag opgehalen hunn, gouf den Bildgebungsprozess widderholl, mat enger zousätzlecher Dosis MP, wann kee MP op der Atemweeëruewerfläch ze gesinn war.
Déi opgeholl Biller goufen am Flachfeld- a fir d'Däischterfeldkorrigéiert an duerno zu engem Film zesummegesat (20 Biller pro Sekonn; 15-25 × normal Geschwindegkeet ofhängeg vun der Atmungsfrequenz) mat Hëllef vun engem personaliséierte Skript, dat a MATLAB (R2020a, The Mathworks) geschriwwe gouf.
All Studien iwwer d'Liwwerung vu LV-Genvektoren goufen an der Laboratory Animal Research Facility vun der Universitéit vun Adelaide duerchgefouert a wollten d'Resultater vum SPring-8 Experiment benotzen, fir ze evaluéieren, ob d'Liwwerung vu LV-MP a Präsenz vun engem Magnéitfeld den Gentransfer in vivo verbessere kéint. Fir d'Effekter vum MP an dem Magnéitfeld ze evaluéieren, goufen zwou Gruppe vun Déieren behandelt: eng Grupp krut LV-MP mat engem agebaute Magnet, an déi aner Grupp krut eng Kontrollgrupp mat LV-MP ouni Magnet.
LV-Genvektoren goufen mat Hëllef vun de virdru beschriwwene Methoden 25, 26 generéiert. De LacZ-Vektor expriméiert dat nuklear-lokaliséiert Beta-Galactosidase-Gen, dat vum konstitutive MPSV-Promotor (LV-LacZ) ugedriwwe gëtt, wat e bloe Reaktiounsprodukt an transduzéierten Zellen produzéiert, dat a Lungengewebefronten a Gewebeschnëtter sichtbar ass. D'Titratioun gouf a Zellkulturen duerchgefouert andeems d'Zuel vun de LacZ-positiven Zellen manuell mat engem Hämocytometer gezielt gouf fir den Titer an TU/ml ze berechnen. D'Träger ginn bei -80 °C kryokonservéiert, virum Gebrauch opgetaut a mat CombiMag gebonnen andeems se an engem Verhältnes vun 1:1 vermëscht ginn an op Äis fir op d'mannst 30 Minutte virun der Liwwerung inkubéiert ginn.
Normal Sprague Dawley Ratten (n = 3/Grupp, ~2-3 goufen intraperitoneal mat enger Mëschung aus 0,4 mg/kg Medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) a 60 mg/kg Ketamin (Ilium, Australien) (méintlech ip) Injektioun an net-chirurgescher mëndlecher Kanülatioun mat enger 16 Ga iv Kanül anästhetiséiert. Fir sécherzestellen, datt d'Tracheal-Atmungsgewebe LV-Transduktioun kritt, gouf et mat eisem virdru beschriwwene mechanesche Stéierungsprotokoll konditionéiert, bei deem d'Tracheal-Atmungsgewebe axial mat engem Drotkuerf (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28 geriwwe gouf. Déi tracheal Verabreichung vu LV-MP gouf dann ongeféier 10 Minutte no der Stéierung an engem biologesche Sécherheetsschrank duerchgefouert.
D'Magnéitfeld, dat an dësem Experiment benotzt gouf, gouf op eng ähnlech Manéier wéi d'in vivo Röntgenbildgebungsstudie konfiguréiert, mat de selwechte Magnete, déi iwwer der Trachea mat Destillatiounsstentclips gehale goufen (Figur 4). E 50 μl Volumen (2 × 25 μl Aliquoten) LV-MP gouf an d'Trachea (n = 3 Déieren) mat enger Pipett mat enger Gelspëtz, wéi virdru beschriwwen, agefouert. Eng Kontrollgrupp (n = 3 Déieren) krut déiselwecht LV-MPs ouni d'Benotzung vun engem Magnet. Nodeems d'Infusioun ofgeschloss ass, gëtt d'Kanül aus dem ET-Röhre erausgeholl an d'Déier gëtt extubéiert. De Magnet bleift 10 Minutten op der Plaz, duerno gëtt en erausgeholl. D'Ratten kruten eng subkutan Dosis Meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australien), gefollegt vun der Ëmkéierung vun der Anästhesie duerch eng ip-Injektioun vun 1 mg/kg Atipamazolhydrochlorid (Antisedan, Zoetis, Australien). D'Ratten goufen waarm gehalen an iwwerwaacht bis se sech komplett vun der Anästhesie erholl hunn.
LV-MP-Aféierungsapparat an engem biologesche Sécherheetsschrank. Déi hellgro Luer-Hub vum ET-Schlauch kann aus dem Mond erausstinn gesi ginn an d'Gelspëtz vun der Pipett, déi op der Foto gewisen ass, gëtt duerch den ET-Schlauch bis an déi gewënscht Déift an d'Trachea agefouert.
Eng Woch no der LV-MP Doséierungsprozedur goufen d'Déieren human duerch 100% CO2-Inhalatioun ëmbruecht an d'LacZ-Expressioun gouf mat eiser Standard X-gal Behandlung bewäert. Déi dräi kaudal knorpelzeg Réng goufen ewechgeholl fir sécherzestellen, datt all mechanesch Schued oder Flëssegkeetsretentioun duerch d'Placement vun engem Endotrachealröhrchen net an der Analyse abegraff war. All Trachea gouf longitudinal geschnidden fir zwou Hälften fir d'Analyse ze kreéieren, an si goufen an enger Schossel mat Silikonkautschuk (Sylgard, Dow Inc) mat enger Minutien-Nadel (Fine Science Tools) montéiert fir d'luminal Uewerfläch ze visualiséieren. D'Verdeelung an d'Muster vun den transduzéierten Zellen goufen duerch Frontalfotografie mat engem Nikon-Mikroskop (SMZ1500) mat enger DigiLite-Kamera an TCapture-Software (Tucsen Photonics, China) bestätegt. Biller goufen mat 20-facher Vergréisserung (inklusiv der héchster Astellung fir déi voll Breet vun der Trachea) opgeholl, woubäi déi ganz Längt vun der Trachea Schrëtt fir Schrëtt ofgebild gouf, sou datt genuch Iwwerlappung tëscht all Bild garantéiert ass fir d'Bild "ze stécken". Biller vun all Trachea goufen dann zesummegesat a ... en eenzegt Kompositbild mat Hëllef vum Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) mat engem Planar-Beweegungsalgorithmus.LacZ-Expressiounsberäicher a Kompositbiller vun der Trachea vun all Déier goufen mat engem automatiséierte MATLAB-Skript (R2020a, MathWorks) quantifizéiert, wéi virdru beschriwwen, mat Astellungen vun 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 a Value < 0,7.Andeems d'Konturen vum Gewief nogezunn goufen, gouf eng Mask manuell am GIMP v2.10.24 fir all Kompositbild generéiert, fir d'Gewiefsfläch z'identifizéieren an all falsch Detektiounen vun ausserhalb vum Trachealgewebe ze verhënneren.Déi gefierft Beräicher vun alle Kompositbiller vun all Déier goufen zesummegefaasst, fir déi total gefierft Fläch fir dat Déier ze generéieren.Déi gefierft Fläch gouf dann duerch déi total Maskfläch gedeelt, fir déi normaliséiert Fläch ze generéieren.
All Trachea gouf a Paraffin agebett a 5 μm Schnëtter goufe geschnidden. D'Schnëtter goufe 5 Minutte laang mat neutralem Fast Red gegéintgefierft an d'Biller goufe mat engem Nikon Eclipse E400 Mikroskop, enger DS-Fi3 Kamera an enger NIS Element Capture Software (Versioun 5.20.00) opgeholl.
All statistesch Analysen goufen am GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) duerchgefouert. Déi statistesch Bedeitung gouf op p ≤ 0,05 festgeluecht. D'Normalitéit gouf mam Shapiro-Wilk-Test verifizéiert, an Ënnerscheeder an der LacZ-Färbung goufen mam ongepaarten t-Test bewäert.
Déi sechs MPs, déi an der Tabell 1 beschriwwe sinn, goufen mat PCXI ënnersicht, an d'Visibilitéit gëtt an der Tabell 2 beschriwwen. Zwee Polystyrol-MPs (MP1 an MP2; 18 μm respektiv 0,25 μm) waren net ënner PCXI sichtbar, awer de Rescht vun de Prouwe konnten identifiéiert ginn (Beispiller sinn an der Figur 5 gewisen). MP3 an MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm respektiv 0,9 μm) sinn nëmme schwaach sichtbar. Obwuel MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) e puer vun de klengsten geteste Partikelen enthält, war et am stäerksten. De CombiMag-Produkt MP6 ass schwéier ze gesinn. An alle Fäll gouf eis Fäegkeet, MP z'entdecken, däitlech verbessert, andeems de Magnet parallel zum Kapillar hin an hier gewiesselt gouf. Wéi d'Magnete sech vum Kapillar ewechbeweegt hunn, hunn d'Partikelen sech a laange Schnëtter verlängert, awer wéi d'Magnete méi no koumen an d'Magnéitfeldstäerkt zougeholl huet, hunn sech d'Partikelschnëtter verkierzt, wéi d'Partikelen op d'Uewerfläch vum Kapillar migréiert sinn (kuckt den Ergänzungsvideo S1: MP4), wat d'... Partikeldicht vun der Uewerfläch. Am Géigendeel, wann de Magnet aus der Kapillär erausgeholl gëtt, hëlt d'Feldstäerkt of an d'MPs arrangéieren sech a laang Ketten, déi sech vun der ieweschter Uewerfläch vun der Kapillär ausdehnen (kuckt den Ergänzungsvideo S2:MP4). Nodeems de Magnet opgehalen huet sech ze beweegen, beweege sech d'Partikelen eng kuerz Zäit weider, nodeems se d'Gläichgewiichtspositioun erreecht hunn. Wann den MP sech op d'Uewerfläch vun der Kapillär Richtung a vun do ewech beweegt, zéien d'Magnéitpartikelen typescherweis den Dreck duerch d'Flëssegkeet.
D'Visibilitéit vun MP ënner PCXI variéiert däitlech tëscht de Proben. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 an (d) MP6. All Biller, déi hei gewise ginn, goufen mat engem Magnet gemaach, deen ongeféier 10 mm direkt iwwer dem Kapillar läit. Déi scheinbar grouss Kreesser si Loftblosen, déi an de Kapillaren agespaart sinn, a weisen d'schwaarz-wäiss Kantenmerkmale vun der Phasenkontrastbildgebung kloer. Déi rout Këscht enthält d'Kontrastverstäerkend Vergréisserung. Notéiert datt d'Duerchmiesser vun de Magnetschemaen an alle Figuren net maßstabsgeméisseg sinn a ronn 100 Mol méi grouss sinn wéi gewisen.
Wann de Magnet laanscht d'Spëtzt vum Kapillar no lénks a riets beweegt gëtt, ännert sech de Wénkel vun der MP-String fir sech mam Magnet auszeriichten (kuckt Figur 6), wouduerch d'Magnéitfeldlinne markéiert ginn. Fir MP3-5 ginn d'Partikelen, nodeems den Akkord e Schwellwénkel erreecht huet, laanscht d'Uewerfläch vum Kapillar gezunn. Dëst féiert dacks dozou, datt MPen sech a méi grouss Gruppen no bei der Plaz gruppéieren, wou d'Magnéitfeld am stäerksten ass (kuckt Ergänzungsvideo S3:MP5). Dëst ass och besonnesch evident wann d'Bildgebung no beim Kapillarende gemaach gëtt, wouduerch d'MPen sech op der Grenzfläch tëscht Flëssegkeet a Loft aggregéieren a konzentréieren. D'Partikelen am MP6, déi méi schwéier z'ënnerscheeden waren wéi am MP3-5, goufen net gezunn, wéi de Magnet laanscht d'Kapillar beweegt gouf, mä d'MP-Stringe sinn dissoziéiert, wouduerch d'Partikelen am Siichtfeld bliwwe sinn (kuckt Ergänzungsvideo S4:MP6). A verschiddene Fäll, wann dat ugewandt Magnéitfeld reduzéiert gouf andeems de Magnet eng grouss Distanz vun der Bildgebungsplaz ewech geréckelt gouf, sinn all verbleiwen MPen duerch d'Schwéierkraaft lues a lues op déi ënnescht Uewerfläch vum Rouer erofgaang, während se an der String bliwwe sinn (kuckt Ergänzungsvideo S5: MP3).
De Wénkel vun der MP-Schnouer ännert sech, wann de Magnet iwwer dem Kapillar no riets transléiert gëtt. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 an (d) MP6. Déi rout Këscht enthält d'Kontrastverstäerkend Vergréisserung. Et ass ze bemierken, datt déi zousätzlech Videoen informativ sinn, well se wichteg Informatiounen iwwer d'Partikelstruktur an d'dynamesch Struktur weisen, déi an dëse statesche Biller net visualiséiert kënne ginn.
Eis Tester hunn gewisen, datt d'Lues vum Magnet hin an hier laanscht d'Trachea d'Visualiséierung vum MP am Kontext vun enger komplexer Bewegung in vivo erliichtert. In vivo Tester goufen net duerchgefouert, well Polystyrolperlen (MP1 an MP2) net an der Kapillärkanal sichtbar waren. Jiddwer vun de verbleiwenen véier MPs gouf in vivo getest, woubei d'Magnetlängachs iwwer der Trachea an engem Wénkel vu ronn 30° zur Vertikal konfiguréiert war (kuckt d'Figuren 2b an 3a), well dëst zu méi laangen MP-Ketten gefouert huet a méi effektiv war wéi d'Magnetkonfiguratioun ofgeschloss. MP3, MP4 an MP6 goufen an der Trachea vun kenge liewegen Déieren nogewise. Wéi d'Ratten-Loftweeër no der mënschlecher Ofschafung vun den Déieren ofgebild goufen, sinn d'Partikelen onsichtbar bliwwen, och wann zousätzlecht Volumen mat enger Sprëtzpompel bäigefüügt gouf. MP5 hat den héchsten Eisenoxidgehalt a war dat eenzegt sichtbaart Partikel, a gouf dofir benotzt fir d'in vivo Verhalen vum MP ze bewäerten an ze charakteriséieren.
D'Plazéierung vum Magnet iwwer d'Trachea während der MP-Liwwerung huet dozou gefouert, datt vill, awer net all, MPen am Siichtfeld konzentréiert waren. Partikelen, déi an d'Trachea kommen, kënnen am beschten bei mënschlech geafferten Déieren observéiert ginn. Figur 7 an Ergänzungsvideo S6: MP5 weist eng séier magnéitesch Erfaassung an Ausriichtung vu Partikelen op der Uewerfläch vun der ventraler Trachea, wat drop hiweist, datt MPen op déi gewënscht Regioune vun der Trachea geriicht kënne ginn. Beim Sich no der MP-Liwwerung méi distal laanscht d'Trachea goufen e puer MPen méi no bei der Carina fonnt, wat drop hiweist, datt d'Magnéitfeldstäerkt net ausreechend war, fir all MPen ze sammelen an ze halen, well se während dem Flëssegkeetsprozess duerch d'Regioun mat maximaler Magnéitfeldstäerkt geliwwert goufen. Trotzdem waren d'MP-Konzentratioune postpartal méi héich ronderëm de gebildete Beräich, wat drop hiweist, datt vill MPen an den Atemweeërregiounen bliwwe sinn, wou déi ugewandte Magnéitfeldstäerkt am héchsten war.
Biller vun (a) virun an (b) no der Aféierung vun MP5 an d'Trachea vun enger kierzlech euthanaséierter Ratt, wou de Magnet direkt iwwer dem Bildgebungsberäich positionéiert ass. De gezeechente Beräich läit tëscht den zwéi Knorpelréng. Virun der Aféierung vun MP ass e bësse Flëssegkeet an den Atemweeër. Déi rout Këscht enthält d'Kontrastverstäerkend Vergréisserung. Dës Biller sinn aus dem Video, deen am Ergänzungsvideo S6:MP5 gewisen gëtt.
D'Translatioun vum Magnet laanscht d'Trachea in vivo huet dozou gefouert, datt d'MP-Kette hire Wénkel an der Loftweeëruewerfläch geännert huet, op eng ähnlech Manéier wéi déi a Kapillaren (kuckt Figur 8 an den Ergänzungsvideo S7:MP5). Wéi och ëmmer, an eiser Studie konnten MPs net laanscht d'Uewerfläch vun de liewegen Loftweeër gezunn ginn, wéi et bei Kapillaren de Fall war. A verschiddene Fäll gëtt d'MP-Kette méi laang, wann de Magnet no lénks a riets beweegt. Interessanterweis hu mir och festgestallt, datt d'Partikelstrang d'Déift vun der Uewerflächenflëssegkeetsschicht ännert, wann de Magnet an der Längslinn laanscht d'Trachea beweegt gëtt, an sech ausdehnt, wann de Magnet direkt iwwer d'Loftweeër beweegt gëtt an d'Partikelstrang an eng vertikal Positioun gedréit gëtt (kuckt den Ergänzungsvideo S7). : MP5 um 0:09, ënnen riets). Dat charakteristescht Bewegungsmuster huet sech geännert, wéi de Magnet iwwer d'Spëtzt vun der Trachea lateral transléiert gouf (dat heescht, no lénks oder riets vum Déier anstatt laanscht d'Längt vun der Trachea). D'Partikelen ware weiderhin kloer ze gesinn, wéi se sech beweegt hunn, awer wéi de Magnet aus der Trachea erausgeholl gouf, goufen d'Spëtze vun de Partikelstrécke sichtbar (kuckt den Ergänzungsvideo S8:MP5, ugefaange bei 0:08). Dëst entsprécht dem MP-Verhalen, dat mir ënner engem ugewandte Magnéitfeld an enger Glaskapillar observéiert hunn.
Beispillbiller, déi MP5 an der Trachea vun enger lieweger, narkotizéierter Ratt weisen. (a) De Magnet gëtt benotzt fir Biller iwwer an lénks vun der Trachea ze kréien, dann (b) nodeems de Magnet no riets geréckelt gouf. Déi rout Këscht enthält d'Kontrastverstäerkend Vergréisserung. Dës Biller sinn aus dem Video, deen am Ergänzungsvideo S7:MP5 gewisen gëtt.
Wann déi zwee Pole an enger Nord-Süd-Orientéierung iwwer an ënner der Trachea konfiguréiert waren (d.h. unzéien; Fig. 3b), hunn d'MP-Akkorden méi laang ausgesinn a ware sech op der Säitewand vun der Trachea anstatt op der dorsaler Trachealfläch lokaliséiert (kuckt Ergänzungsvideo S9:MP5). Wéi och ëmmer, goufen héich Konzentratioune vu Partikelen op enger eenzeger Plaz (d.h. der dorsaler Uewerfläch vun der Trachea) no der Flëssegkeetsliwwerung net detektéiert, wann en Duebelmagnet-Apparat benotzt gouf, wat typescherweis geschitt wann en Eenzelmagnet-Apparat benotzt gëtt. Wann dann ee Magnet konfiguréiert gouf fir d'Pole ëmgedréint ofzewieren (Fig. 3c), schéngt d'Zuel vun de Partikelen, déi am Siichtfeld sichtbar sinn, no der Liwwerung net eropgaang ze sinn. D'Opstellung vun deenen zwou Duebelmagnet-Konfiguratiounen ass eng Erausfuerderung wéinst den héije Magnéitfeldstäerkten, déi d'Magnete respektiv zéien oder drécken. D'Opstellung gouf dann op en eenzege Magnet geännert, deen parallel zu den Atemweeër leeft, awer 90 Grad duerch d'Atemweeër geet, sou datt d'Feldlinnen d'Trachealwand orthogonal kräizen (Fig. 3d), eng Orientéierung déi entwéckelt gouf fir ze bestëmmen ob Partikelaggregatioun op der Säitewand observéiert ka ginn. Wéi och ëmmer, an An dëser Konfiguratioun gouf keng identifizéierbar Bewegung vun der MP-Akkumulatioun oder Magnetbewegung festgestallt. Baséierend op all dëse Resultater gouf eng Konfiguratioun mat engem eenzege Magnet an enger 30-Grad-Orientéierung (Figur 3a) fir In-vivo-Genträgerstudien ausgewielt.
Wéi d'Déier direkt no der humaner Ermuerdung widderholl fotograféiert gouf, huet d'Feele vu verwiesselnder Gewiefsbewegung bedeit, datt méi fein a méi kuerz Partikellinnen am kloren interchondrale Feld erkannt konnte ginn, "wackeleg" am Aklang mat der translatorescher Bewegung vum Magnet. Trotzdem kann d'Präsenz an d'Bewegung vun MP6-Partikelen nach ëmmer net kloer gesi ginn.
Den LV-LacZ-Titer war 1,8 × 108 TU/ml, an no enger Mëschung vun 1:1 mat CombiMag MP (MP6) kruten d'Déieren eng 50 μl Trachealdosis vun 9 × 107 TU/ml LV-Trajekt (dh 4,5 × 106 TU/Ratt). An dëse Studien hu mir de Magnet, amplaz während der Gebuert ze transléieren, an enger Positioun fixéiert fir ze bestëmmen ob d'LV-Transduktioun (a) am Verglach mat der Vektorliwwerung ouni Magnéitfeld verbessert ka ginn, an (b) fokusséiert ka ginn. Loftweeërzellen ginn an magnetesch Zilregiounen vun den ieweschten Loftweeër transduzéiert.
D'Präsenz vu Magneten an d'Benotzung vu CombiMag a Kombinatioun mat LV-Vektoren schéngen keng negativ Auswierkungen op d'Déieregesondheet ze hunn, sou wéi och eist Standard-LV-Vektor-Liwwerprotokoll. Frontalbiller vun der Trachealregioun, déi mechanescher Stéierung ausgesat war (Ergänzungsfigur 1) hunn ugedeit, datt et däitlech méi héich Transduktiounsniveauen an der Grupp vun Déieren gouf, déi mat LV-MP behandelt goufen, wann de Magnet präsent war (Figur 9a). Nëmmen eng kleng Quantitéit u bloer LacZ-Färbung war an der Kontrollgrupp präsent (Figur 9b). D'Quantifizéierung vun normaliséierten X-Gal-gefierfte Beräicher huet gewisen, datt d'Administratioun vu LV-MP a Präsenz vun engem Magnéitfeld eng ongeféier 6-fache Verbesserung verursaacht huet (Figur 9c).
Beispiller vu Kompositbiller, déi d'Trachealtransduktioun duerch LV-MP weisen (a) a Präsenz vun engem Magnéitfeld an (b) ouni Magnet. (c) Statistesch signifikant Verbesserung vun der normaliséierter LacZ-Transduktiounsfläch an der Trachea bei der Benotzung vum Magnet (*p = 0,029, t-Test, n = 3 pro Grupp, Moyenne ± SEM).
Neutral, séier rout gefierft Schnëtter (Beispill an der Ergänzungsfigur 2 gewisen) hunn LacZ-gefierft Zellen an engem ähnleche Muster a Standuert wéi virdru beschriwwen gewisen.
Eng Schlësselherausfuerderung fir d'Gentherapie vun den Atemweeër bleift déi genee Lokaliséierung vun Trägerpartikelen a Regiounen vun Interesse an d'Erreeche vun héijen Niveauen vun Transduktiounseffizienz an der bewegender Long a Präsenz vu Loftstroum an aktiver Schleimreinigung. Fir LV-Träger, déi fir d'Behandlung vu CF-Atemweeërkrankungen entwéckelt goufen, war d'Erhéijung vun der Openthaltszäit vun den Trägerpartikelen an de féierende Atemweeër e bis elo schwéier ze erkennen Zil. Wéi vum Castellani et al. betount, huet d'Benotzung vu Magnéitfelder fir d'Transduktioun ze verbesseren Virdeeler am Verglach mat anere Genliwwerungsmethoden wéi Elektroporatioun, well se Einfachheet, Käschteeffizienz, Liwwerlokaliséierung, erhéicht Effizienz a méi kuerz Inkubatiounszäiten, a méiglecherweis eng méi kleng Trägerdosis kombinéiere kann10. Wéi och ëmmer, d'in vivo Oflagerung a Verhale vu Magnéitpartikelen an den Atemweeër ënner dem Afloss vun externen Magnéitkräften ass ni beschriwwe ginn, an d'Machbarkeet vun dëser Method ass och in vivo fir d'Genexpressionsniveauen an intakte liewegen Atemweeër ze verbesseren, nach gouf tatsächlech d'Machbarkeet vun dëser Method in vivo demonstréiert fir d'Genexpressionsniveauen an intakte liewegen Atemweeër ze erhéijen.
Eis In-vitro-Synchrotron-PCXI-Experimenter hunn gewisen, datt all Partikelen, déi mir getest hunn, mat Ausnam vum Polystyrol-MP, an der Bildgebungsopstellung sichtbar waren, déi mir benotzt hunn. A Präsenz vun engem Magnéitfeld bilden MPen Ketten, deenen hir Längt mam Partikeltyp an der Magnéitfeldstäerkt (dh Proximitéit a Bewegung vum Magnéit) zesummenhänken. Wéi an der Figur 10 gewisen, ginn d'Ketten, déi mir observéieren, doduerch geformt, datt all eenzel Partikel magnetiséiert gëtt an hiert eegent lokalt Magnéitfeld induzéiert. Dës separat Felder verursaachen, datt aner ähnlech Partikelen sech zesummesetzen a verbannen, mat Gruppkettenähnleche Beweegungen, déi duerch lokal Kräften aus den lokalen unzéienden a ofstoussenden Kräften vun anere Partikelen entstinn.
Schema déi (a, b) Partikelzich weist, déi a flësseg gefëllte Kapillaren an (c, d) loftgefëllte Trachea generéiert ginn. Bemierkt datt d'Kapillaren an d'Trachea net no Moossstaf gezeechent sinn. Panel (a) enthält och eng Beschreiwung vum MP, deen Fe3O4 Partikelen enthält, déi a Ketten arrangéiert sinn.
Wéi de Magnet iwwer d'Kapillär geréckelt gouf, huet de Wénkel vun der Partikelstrang eng kritesch Schwell fir MP3-5 mat Fe3O4 erreecht, duerno ass d'Partikelstrang net méi an der ursprénglecher Positioun bliwwen, mä huet sech laanscht d'Uewerfläch op eng nei Positioun beweegt. Magnet. Dësen Effekt trëtt wahrscheinlech op, well d'Glaskapilläruewerfläch glat genuch ass, fir dës Bewegung z'erméiglechen. Interessanterweis huet sech MP6 (CombiMag) net esou verhalen, méiglecherweis well d'Partikel méi kleng waren, verschidde Beschichtungen oder Uewerflächeladungen haten, oder eng propriétaire Trägerflëssegkeet hir Bewegungsfäegkeet beaflosst huet. De Bildkontrast vun de CombiMag-Partikelen ass och méi schwaach, wat drop hiweist, datt d'Flëssegkeet an d'Partikelen ähnlech Dicht hunn a sech dofir net einfach openeen zoubeweegen. Partikelen kënnen och hänke bleiwen, wann de Magnet sech ze séier beweegt, wat drop hiweist, datt d'Magnéitfeldstäerkt d'Reibung tëscht de Partikelen an der Flëssegkeet net ëmmer iwwerwanne kann, wat drop hiweist, datt et vläicht net iwwerraschend ass, datt d'Magnéitfeldstäerkt an den Ofstand tëscht dem Magnet an der Zilfläch ganz wichteg sinn. Zesummegeholl suggeréieren dës Resultater och, datt, obwuel Magnete vill MPen opfänke kënnen, déi duerch d'Zilfläch fléissen, et onwahrscheinlech ass, datt een sech op Magnete verloossen kann, fir sech ze beweegen. CombiMag-Partikelen laanscht d'Uewerfläch vun der Trachea. Dofir schléissen mir, datt in vivo LV-MP-Studien statesch Magnéitfelder benotze solle fir spezifesch Regioune vum Loftweebeem kierperlech unzespriechen.
Wann Partikelen an de Kierper agefouert ginn, si se schwéier am Kontext vu komplexem bewegendem Kierpergewebe z'identifizéieren, awer d'Fäegkeet, se z'entdecken, gouf verbessert andeems de Magnet horizontal iwwer d'Trachea gewiesselt gouf, fir d'MP-Sträng ze "wackelen". Och wann eng Live-Bildgebung méiglech ass, ass et méi einfach, d'Partikelbewegung z'erkennen, nodeems d'Déier op eng mënschlech Manéier ëmbruecht gouf. D'MP-Konzentratioune waren op dëser Plaz am héchsten, wann de Magnet iwwer dem Bildgebungsberäich positionéiert war, obwuel e puer Partikelen normalerweis méi wäit laanscht d'Trachea fonnt goufen. Am Géigesaz zu In-vitro-Studien kënnen d'Partikelen net duerch d'Translatioun vum Magnet laanscht d'Trachea gezunn ginn. Dës Erkenntnis entsprécht der Aart a Weis, wéi de Schleim, deen d'Uewerfläch vun der Trachea beschichtet, typescherweis inhaléiert Partikelen veraarbecht, se am Schleim afänkt an duerno duerch de mukociliäre Clearance-Mechanismus gereinegt gëtt.
Mir hunn d'Hypothes opgestallt, datt d'Benotzung vu Magnete fir d'Attraktioun iwwer an ënner der Trachea (Fig. 3b) zu engem méi eenheetleche Magnéitfeld féiere kéint, anstatt zu engem Magnéitfeld, dat op engem Punkt staark konzentréiert ass, wat potenziell zu enger méi eenheetlecher Verdeelung vu Partikelen féiere kéint. Eis Virstudie huet awer keng kloer Beweiser fonnt, déi dës Hypothese ënnerstëtzen. Och d'Konfiguratioun vun engem Paar Magnete fir ofzestoen (Fig. 3c) huet net zu méi Partikeloflagerung am ofgebildte Beräich gefouert. Dës zwou Erkenntnisser weisen, datt den Duebelmagnet-Setup d'lokal Kontroll vum MP-Zil net wesentlech verbessert, an datt déi resultéierend staark Magnéitkräfte schwéier ze konfiguréieren sinn, wat dësen Usaz manner praktesch mécht. Ähnlech huet d'Orientéierung vum Magnet iwwer an duerch d'Trachea (Fig. 3d) och d'Zuel vun de Partikelen, déi am ofgebildte Beräich zréckgehale goufen, net erhéicht. E puer vun dësen alternativen Konfiguratioune kéinten net erfollegräich sinn, well se zu méi niddrege Magnéitfeldstäerkten am Oflagerungsberäich féieren. Dofir gëllt déi eenzeg 30-Grad-Wénkelmagnetkonfiguratioun (Figur 3a) als déi einfachst an effizientst Method fir In-vivo-Tester.
D'LV-MP-Studie huet gewisen, datt wann LV-Vektoren mat CombiMag kombinéiert a nom physesche Stéierungsprozess an der Präsenz vun engem Magnéitfeld geliwwert goufen, d'Transduktiounsniveauen an der Trachea am Verglach mat der Kontrollgrupp däitlech erhéicht waren. Baséierend op de Synchrotron-Bildgebungsstudien an de LacZ-Resultater war d'Magnéitfeld anscheinend fäeg, d'LV an der Trachea ze erhalen an d'Zuel vun de Vektorpartikelen ze reduzéieren, déi direkt déif an d'Lunge andrénge sinn. Sou Verbesserunge vum Zilgeriicht kënnen zu enger méi héijer Effizienz féieren, während gläichzäiteg d'geliwwert Titeren, Off-Target-Transduktioun, entzündlech an immun Niewewierkungen, a Genträgerkäschte reduzéiert ginn. Wichteg ass, datt laut dem Hiersteller CombiMag a Verbindung mat anere Gentransfermethoden benotzt ka ginn, dorënner mat anere virale Vektoren (wéi AAV) an Nukleinsäuren.