Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on CSS-i jaoks piiratud tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Seni kuvame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Tsüstilise fibroosiga kopsuhaiguse raviks mõeldud geenvektorid peaksid olema suunatud juhtivatele hingamisteedele, kuna perifeerne kopsuülekanne ei anna terapeutilist kasu. Viiruse ülekande efektiivsus on otseselt seotud vektori viibimisajaga. Siiski difundeeruvad manustamisvedelikud, näiteks geenikandjad, loomulikult alveoolidesse sissehingamise ajal ja mis tahes vormis terapeutilised osakesed eemaldatakse kiiresti mukotsiliaarse transpordi teel. Geenikandjate viibimisaja pikendamine hingamisteedes on oluline, kuid raskesti saavutatav. Geenikandjatega konjugeeritud magnetosakesed, mida saab suunata hingamisteede pinnale, võivad parandada regionaalset sihtimist. In vivo visualiseerimise raskuste tõttu on selliste väikeste magnetosakeste käitumine hingamisteede pinnal rakendatud magnetvälja juuresolekul halvasti mõistetav. Selle uuringu eesmärk oli kasutada sünkrotronkuvamist, et visualiseerida magnetosakeste seeria liikumist anesteseeritud rottide hingetorus in vivo, et uurida üksikute ja massiliste osakeste käitumise dünaamikat ja mustreid in vivo. Seejärel hindasime ka seda, kas lentiviiruse magnetosakeste manustamine magnetvälja juuresolekul suurendaks transduktsiooni efektiivsust roti hingetorus. Sünkrotronröntgenkuvamine näitab magnetosakeste käitumist. osakesed statsionaarsetes ja liikuvates magnetväljades in vitro ja in vivo. Osakesi ei saa elavate hingamisteede pinnal magnetitega kergesti lohistada, kuid transpordi ajal koonduvad ladestused vaatevälja, kus magnetväli on tugevam. Transduktsiooni efektiivsus suurenes ka kuuekordselt, kui lentiviiruse magnetosakesed manustati magnetvälja juuresolekul. Kokkuvõttes viitavad need tulemused sellele, et lentiviiruse magnetosakesed ja magnetväljad võivad olla väärtuslikud lähenemisviisid geenivektori sihtimise parandamiseks ja transduktsioonitasemete suurendamiseks juhtivates hingamisteedes in vivo.
Tsüstiline fibroos (CF) on põhjustatud ühe geeni, CF transmembraanse juhtivuse regulaatori (CFTR), variatsioonist. CFTR-valk on ioonkanal, mida leidub paljudes epiteelirakkudes kogu kehas, sealhulgas juhtivates hingamisteedes, mis on CF patogeneesi peamine koht. CFTR-i defektid põhjustavad ebanormaalset veetransporti, dehüdreerivad hingamisteede pinda ja vähendavad hingamisteede pinna vedelikukihi (ASL) sügavust. See kahjustab ka mukotsiliaarse transpordi (MCT) süsteemi võimet eemaldada hingamisteedest sissehingatud osakesi ja patogeene. Meie eesmärk on töötada välja lentiviraalne (LV) geeniteraapia, mis annaks CFTR-geeni õige koopia ja parandaks ASL-i, MCT-i ja kopsude tervist, ning jätkata uute tehnoloogiate väljatöötamist, mis on võimelised neid parameetreid in vivo mõõtma.
LV vektorid on ühed juhtivad kandidaadid tsüstilise fibroosiga hingamisteede geeniteraapias, peamiselt seetõttu, et nad suudavad terapeutilise geeni püsivalt integreerida hingamisteede basaalrakkudesse (hingamisteede tüvirakkudesse). See on oluline, sest nad suudavad taastada normaalse hüdratsiooni ja lima eritumise, diferentseerudes funktsionaalseteks geenikorrigeeritud tsüstilise fibroosiga seotud hingamisteede pinnarakkudeks, mille tulemuseks on elukestev kasu. LV vektorid peaksid olema suunatud juhtivate hingamisteede vastu, kuna just sealt algab tsüstilise fibroosiga kopsuhaigus. Vektori viimine sügavamale kopsu võib põhjustada alveolaarset transduktsiooni, kuid sellel pole tsüstilise fibroosi korral terapeutilist kasu. Siiski migreeruvad vedelikud, näiteks geenikandjad, pärast manustamist sissehingamisel loomulikult alveoolidesse3,4 ja terapeutilised osakesed erituvad MCT abil kiiresti suuõõnde. LV transduktsiooni efektiivsus on otseselt seotud ajaga, mille jooksul vektor jääb sihtrakkude kõrvale, et võimaldada rakkude omastamist – „viibimisaeg“5 –, mida saab hõlpsasti vähendada tüüpilise regionaalse õhuvoolu, samuti koordineeritud osakeste lima püüdmise ja MCT abil. Tsüstilise fibroosi korral on LV viibimisaja pikendamine hingamisteedes oluline, et saavutada selles piirkonnas kõrge transduktsioonitase, kuid seni on see olnud keeruline.
Selle takistuse ületamiseks pakume välja, et LV magnetosakesed (MP-d) võivad aidata kahel teineteist täiendaval viisil. Esiteks saab neid magnetiliselt suunata hingamisteede pinnale, et parandada sihtimist ja aidata geenikandjate osakestel püsida soovitud hingamisteede piirkonnas; ja ASL-id) liikuda 6. rakukihile. MP-sid on laialdaselt kasutatud sihipäraste ravimite manustamisvahenditena, kui nad seonduvad antikehade, keemiaravimite või muude väikeste molekulidega, mis kinnituvad rakumembraanidele või seonduvad asjakohaste rakupinna retseptoritega ja akumuleeruvad kasvaja kohtades staatilise elektri juuresolekul. Magnetväljad vähiravis 7. Teiste „hüpertermiliste” meetodite eesmärk on MP-sid kuumutada võnkuvate magnetväljade mõjul, hävitades seeläbi kasvajarakud. Magnettransfektsiooni põhimõtet, mille kohaselt kasutatakse transfektsiooniagensina magnetvälja DNA ülekande parandamiseks rakkudesse, kasutatakse tavaliselt in vitro, kasutades mitmesuguseid mitteviiruslikke ja viiruslikke geenivektoreid raskesti transdutseeritavate rakuliinide jaoks. LV magnetotransfektsiooni efektiivsus on kindlaks tehtud LV-MP-de in vitro manustamisega inimese bronhide epiteeli rakuliinile staatilise magnetvälja juuresolekul, suurendades transduktsiooni efektiivsust 186 korda võrreldes ainult LV vektori kasutamisega. LV-MP-d on rakendatud ka in vitro tsüstilise fibroosi mudelis, kus magnetilist transfektsiooni abil suurenes LV transduktsioon õhu-vedeliku liidese kultuurides CF röga juuresolekul 20 korda10. Elundite in vivo magnetotransfektsioonile on aga pööratud suhteliselt vähe tähelepanu ja seda on hinnatud vaid vähestes loomkatsetes11,12,13,14,15, eriti kopsudes16,17. Sellest hoolimata on magnetilist transfektsiooni võimalused tsüstilise fibroosiga kopsuravi tulemused on selged. Tan jt (2020) väitsid, et „tõhusa magnetnanoosakeste kopsu manustamise kontseptsioonitõestus sillutab teed tulevastele CFTR-i inhalatsioonistrateegiatele, et parandada tsüstilise fibroosiga patsientide kliinilisi tulemusi“6.
Väikeste magnetosakeste käitumist hingamisteede pindadel rakendatud magnetvälja juuresolekul on raske visualiseerida ja uurida ning seetõttu on see halvasti mõistetav. Teistes uuringutes töötasime välja sünkrotronlevi baasil põhineva faasikontraströntgenkuvamise (PB-PCXI) meetodi, et mitteinvasiivselt visualiseerida ja kvantifitseerida väikeseid muutusi in vivo ASL-i sügavuses18 ja MCT-käitumises19,20, et otseselt mõõta gaasikanali pinna hüdratsiooni ja kasutada seda ravi efektiivsuse varajase indikaatorina. Lisaks kasutab meie MCT hindamismeetod 10–35 µm läbimõõduga osakesi, mis koosnevad alumiiniumoksiidist või kõrge murdumisnäitajaga klaasist, MCT-markeritena, mis on nähtavad PB-PCXI21 abil. Mõlemad meetodid sobivad mitmesuguste osakeste tüüpide, sealhulgas MP, visualiseerimiseks.
Tänu oma kõrgele ruumilisele ja ajalisele lahutusvõimele sobivad meie PB-PCXI-põhised ASL- ja MCT-analüüsitehnikad hästi üksikute ja massiliste osakeste käitumise dünaamika ja mustrite uurimiseks in vivo, mis aitab meil mõista ja optimeerida MP-geenide manustamise tehnikaid. Meie siin kasutatav lähenemisviis tuleneb meie uuringutest, milles kasutati SPring-8 BL20B2 kiirejoont, milles visualiseerisime vedeliku liikumist pärast võltsvektori annuse manustamist hiirte nina- ja kopsu hingamisteedesse, et aidata selgitada meie geenikandjate annuse loomkatsetes täheldatud ebaühtlaseid geeniekspressiooni mustreid3,4.
Selle uuringu eesmärk oli kasutada sünkrotroni PB-PCXI, et visualiseerida MP-de seeria in vivo liikumist elusrottide hingetorus. Need PB-PCXI pildiuuringud olid kavandatud MP-de, magnetvälja tugevuste ja asukohtade testimiseks, et määrata nende mõju MP liikumisele. Meie hüpotees oli, et väline magnetväli aitab manustatud MP-l sihtpiirkonda jääda või sinna liikuda. Need uuringud võimaldasid meil tuvastada ka magneti konfiguratsioone, mis maksimeerivad pärast ladestumist hingetorusse jäänud osakeste arvu. Teises uuringute seerias püüdsime kasutada seda optimaalset konfiguratsiooni, et demonstreerida LV-MP-de in vivo manustamisest roti hingamisteedesse tulenevat transduktsioonimustrit, lähtudes eeldusest, et LV-MP-de manustamine hingamisteede sihtimise kontekstis parandab LV transduktsiooni efektiivsust.
Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt Adelaide'i ülikooli (M-2019-060 ja M-2020-022) ja SPring-8 sünkrotronloomade eetikakomitee poolt heakskiidetud protokollidele. Katsed viidi läbi vastavalt ARRIVE'i suunistele.
Kõik röntgenpildid tehti Jaapanis SPring-8 sünkrotroni BL20XU kiirejoonel, kasutades eelnevalt kirjeldatule sarnast seadistust21,22. Lühidalt, eksperimentaalne kast asus sünkrotroni salvestusrõngast 245 m kaugusel. Osakeste pildistamise uuringutes kasutatakse proovi ja detektori vahelist kaugust 0,6 m ja in vivo pildistamise uuringutes faasikontrastefektide tekitamiseks 0,3 m. Kasutati monokromaatilist kiireenergiat 25 keV. Pildid jäädvustati suure eraldusvõimega röntgenmuunduriga (SPring-8 BM3), mis oli ühendatud sCMOS-detektoriga. Muundur muundab röntgenikiirguse nähtavaks valguseks, kasutades 10 µm paksust stsintillaatorit (Gd3Al2Ga3O12), mis seejärel suunatakse sCMOS-andurile, kasutades × 10 mikroskoobi objektiivi (NA 0,3). sCMOS-detektor oli Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jaapan) massiivi suurusega 2048 × 2048 pikslit ja töötlemata piksli suurus 6,5 × 6,5 µm. See seadistus annab efektiivse isotroopse piksli suuruse 0,51 µm ja vaatevälja ligikaudu 1,1 mm × 1,1 mm. Särituse pikkus 100 ms valiti, et maksimeerida magnetosakeste signaali-müra suhet hingamisteedes ja väljaspool, minimeerides samal ajal hingamisest tingitud liikumise artefakte. In vivo uuringuteks paigutati röntgenikiirguse teele kiire röntgenkatik, et piirata kiirgusdoosi, blokeerides röntgenkiire särituste vahel.
LV-kandjat ei kasutatud üheski SPring-8 PB-PCXI pildiuuringus, kuna BL20XU pildikamber ei ole sertifitseeritud 2. taseme bioohutuse kohaselt. Selle asemel valisime kahelt kommertstarnijalt hulga hästi iseloomustatud MP-sid – mis hõlmasid erinevaid suurusi, materjale, raua kontsentratsioone ja rakendusi –, et kõigepealt mõista, kuidas magnetväljad mõjutavad MP liikumist klaaskapillaarides ja seejärel elavates hingamisteedes. pinnal. MP-de suurus on vahemikus 0,25 kuni 18 μm ja need on valmistatud erinevatest materjalidest (vt tabel 1), kuid iga proovi koostis, sealhulgas MP-s sisalduvate magnetosakeste suurus, on teadmata. Meie ulatuslike MCT-uuringute 19, 20, 21, 23, 24 põhjal eeldame, et hingetoru hingamisteede pinnal on näha MP-sid, mis on väiksemad kui 5 μm, näiteks lahutades järjestikuseid kaadreid, et näha MP liikumise paremat nähtavust. Üks 0,25 μm suurune MP on väiksem kui pildistusseadme eraldusvõime, kuid PB-PCXI peaks tuvastama nende mahu kontrasti ja pinnavedeliku liikumist, millele nad pärast ladestumist ladestuvad.
Iga tabelis 1 esitatud MP proovid valmistati 20 μl klaaskapillaarides (Drummond Microcaps, PA, USA) sisediameetriga 0,63 mm. Korpuskulaarsed osakesed on saadaval vees, samas kui CombiMagi osakesed on saadaval tootja patenteeritud vedelikus. Iga toru täideti pooleldi vedelikuga (umbes 11 μl) ja asetati proovihoidikusse (vt joonis 1). Klaaskapillaarid asetati horisontaalselt pildistamiskasti proovialusele ja paigutati vedeliku servadele. 19 mm läbimõõduga (28 mm pikk) nikkelkestaga haruldaste muldmetallide neodüüm-raudboori (NdFeB) magnet (N35, kat. nr LM1652, Jaycar Electronics, Austraalia) jääkmagneetuvuse 1,17 Teslat kinnitati eraldi translatsioonialusele, et saavutada pildistamise ajal selle asukoha kaugmuutus. Röntgenpildi saamine algab siis, kui magnet asetatakse proovist umbes 30 mm kõrgusele ja pilte salvestatakse kiirusega 4 kaadrit sekundis. Pildistamise ajal viidi magnet klaaskapillaari lähedale. torust (umbes 1 mm kaugusel) ja seejärel nihutatakse mööda toru, et hinnata väljatugevuse ja asukoha mõju.
In vitro pildistamise seadistus, mis sisaldab MP-proove klaaskapillaarides proovi xy-telje translatsioonilaval. Röntgenikiirguse tee on tähistatud punase katkendjoonega.
Kui MP-de in vitro nähtavus oli kindlaks tehtud, testiti nende alamhulka in vivo metsiktüüpi emastel albiino Wistari rottidel (~12 nädalat vanad, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidiini (Domitor®, Zenoaq, Jaapan), 3,2 mg/kg midasolaami (Dormicum®, Astellas Pharma, Jaapan) ja 4 mg/kg butorfanooli (Vetorphale®, Meiji Seika). Rotid tuimestati intraperitoneaalselt süstitava seguga (Pharma, Jaapan). Pärast anesteesiat valmistati rotid pildistamiseks ette, eemaldades hingetoru ümbritseva karva, sisestades endotrahheaalse toru (ET; 16 Ga iv kanüül, Terumo BCT) ja fikseerides rotid selili spetsiaalselt valmistatud pildistamisplaadile, mis sisaldas termokotti kehatemperatuuri hoidmiseks. Seejärel kinnitati pildistamisplaat pildistamiskastis oleva proovi translatsioonialuse külge väikese nurga all, et joondada hingetoru röntgenpildil horisontaalselt, nagu on näidatud joonisel 2a.
(a) In vivo pildistamise seadistus SPring-8 pildistamiskastis, röntgenkiire tee on tähistatud punase katkendliku joonega. (b, c) Magneti lokaliseerimine hingetorul viidi läbi eemalt, kasutades kahte ortogonaalselt paigaldatud IP-kaamerat. Ekraanipildi vasakul küljel on näha pead hoidvat traatsilmust ja ET-torus olevat manustamiskanüüli.
Kaugjuhtimisega süstlapumba süsteem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), mis kasutas 100 μl klaasist süstalt, ühendati PE10 toruga (välisläbimõõt 0,61 mm, sisediameeter 0,28 mm) 30 Ga nõela abil. Märgistage toru, et veenduda, et ots on ET-toru sisestamisel hingetorus õiges asendis. Mikropumba abil tõmmati süstlakolb välja, samal ajal kui toru ots oli manustatavas MP-proovis. Seejärel sisestati laetud manustamistoru endotrahheaaltorusse, asetades otsa meie eeldatava rakendatava magnetvälja tugevaimasse ossa. Kujutise omandamist kontrolliti hingamisdetektoriga, mis oli ühendatud meie Arduino-põhise ajastuskastiga, ja kõik signaalid (nt temperatuur, hingamine, katiku avanemine/sulgemine ja pildi omandamine) salvestati Powerlabi ja LabCharti (AD Instruments, Sydney, Austraalia) abil.22. Pildistamisel Kui korpus oli ligipääsmatu, paigutati kaks IP-kaamerat (Panasonic BB-SC382) üksteise suhtes ligikaudu 90° nurga all ja neid kasutati magneti asukoha jälgimiseks hingetoru suhtes. pildistamise ajal (joonis 2b, c). Liikumisartefaktide minimeerimiseks saadi lõpuloodete voolu platoo ajal üks pilt hingetõmbe kohta.
Teise etapi külge on kinnitatud magnet, mille saab paigutada pildistamiskorpusest eemale. Testiti erinevaid magneti positsioone ja konfiguratsioone, sealhulgas: paigaldatud umbes 30° nurga all hingetoru kohale (konfiguratsioonid on näidatud joonistel 2a ja 3a); üks magnet looma kohale ja teine ​​alla, poolused on seatud ligitõmbavaks (joonis 3b); üks magnet looma kohale ja teine ​​alla, poolused on seatud tõukavaks (joonis 3c); ja üks magnet hingetoru kohale ja sellega risti (joonis 3d). Kui loom ja magnet on konfigureeritud ning testitav MP on süstlapumpa laaditud, manustage 50 μl annust kiirusega 4 μl/s, samal ajal pilte jäädvustades. Seejärel liigutatakse magnetit edasi-tagasi mööda hingetoru või külgsuunas, jätkates samal ajal piltide jäädvustamist.
Magneti konfiguratsioon in vivo pildistamiseks (a) üks magnet hingetoru kohal umbes 30° nurga all, (b) kaks magnetit, mis on seatud ligitõmbamiseks, (c) kaks magnetit, mis on seatud tõukamiseks, (d) üks magnet hingetoru kohal ja risti sellega. Vaatleja vaatas suust alla läbi hingetoru kopsudesse ja röntgenikiir läbis roti vasaku külje ning väljus paremal küljel. Magnetit liigutatakse kas mööda hingamisteed või vasakule ja paremale hingetoru kohal röntgenikiire suunas.
Samuti püüdsime määrata osakeste nähtavust ja käitumist hingamisteedes segava hingamise ja südametegevuse puudumisel. Seetõttu surmati pildistamisperioodi lõpus loomad pentobarbitaali üledoosi (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg i.p.) tõttu humaanselt. Mõned loomad jäeti pildistamisplatvormile ja kui hingamine ja südamelöökide peatumine lõppes, korrati pildistamisprotsessi, lisades täiendava annuse MP-d, kui MP-d ei olnud hingamisteede pinnal nähtav.
Saadud kujutisi korrigeeriti lame- ja tumevälja suhtes ning seejärel pandi need filmiks (20 kaadrit sekundis; 15–25 × normaalne kiirus, olenevalt hingamissagedusest), kasutades MATLABis kirjutatud kohandatud skripti (R2020a, The Mathworks).
Kõik LV geenivektori manustamise uuringud viidi läbi Adelaide'i ülikooli laboriloomade uurimiskeskuses ja nende eesmärk oli kasutada SPring-8 eksperimendi tulemusi, et hinnata, kas LV-MP manustamine magnetvälja juuresolekul võib in vivo geeniülekannet suurendada. MP ja magnetvälja mõju hindamiseks raviti kahte loomarühma: ühele rühmale manustati LV-MP-d koos magnetiga ja teisele rühmale manustati kontrollrühma LV-MP-d ilma magnetita.
LV geenivektorid genereeriti eelnevalt kirjeldatud meetodite 25, 26 abil. LacZ vektor ekspresseerib tuumas lokaliseeritud beeta-galaktosidaasi geeni, mida juhib konstitutiivne MPSV promootor (LV-LacZ), mis tekitab transdutseeritud rakkudes sinise reaktsioonisaaduse, mis on nähtav kopsukoe rindel ja koesektsioonides. Tiitrimine viidi läbi rakukultuurides, loendades käsitsi LacZ-positiivsete rakkude arvu hemotsütomeetriga, et arvutada tiiter TU/ml-des. Kandjaid krüokonserveeritakse temperatuuril -80 °C, sulatatakse enne kasutamist ja seotakse CombiMagiga, segades suhtega 1:1 ja inkubeerides jääl vähemalt 30 minutit enne manustamist.
Normaalsed Sprague Dawley rotid (n = 3/rühm, ~2-3) anesteseeriti intraperitoneaalselt 0,4 mg/kg medetomidiini (Domitor, Ilium, Austraalia) ja 60 mg/kg ketamiini (Ilium, Austraalia) seguga (i.p.) ühe kuu vanused rotid ja mittekirurgiline suu kaudu kanüülimine 16 Ga i.v. kanüüliga. Selleks, et tagada hingetoru hingamisteede koe transduktsiooni, konditsioneeriti seda meie eelnevalt kirjeldatud mehaanilise perturbatsiooniprotokolli abil, mille kohaselt hingetoru hingamisteede pinda hõõruti aksiaalselt traatkorviga (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 sekundit28. Seejärel viidi läbi LV-MP trahheaalne manustamine bioloogilise ohutuse kapis umbes 10 minutit pärast perturbatsiooni.
Selles katses kasutatud magnetväli konfigureeriti sarnaselt in vivo röntgenuuringuga, kus samad magnetid hoiti hingetoru kohal destillatsioonistentklambrite abil (joonis 4). 50 μl maht (2 × 25 μl alikvoote) LV-MP-d manustati hingetorusse (n = 3 looma) geelotsikuga pipeti abil, nagu eelnevalt kirjeldatud. Kontrollrühm (n = 3 looma) sai samu LV-MP-sid ilma magneti kasutamiseta. Pärast infusiooni lõppu eemaldatakse kanüül ET-torust ja loom ekstubeeritakse. Magnet jääb paika 10 minutiks, seejärel eemaldatakse. Rottidele manustati subkutaanselt meloksikaami (1 ml/kg) (Ilium, Austraalia), millele järgnes anesteesia tühistamine 1 mg/kg atipamasoolvesinikkloriidi (Antisedan, Zoetis, Austraalia) intraperitoneaalse süstimisega. Rotte hoiti soojas ja jälgiti kuni anesteesiast täieliku taastumiseni.
LV-MP manustamisseade bioloogilise ohutuse kapis. ET-toru helehall Lueri-ühendus on suust väljaulatuv ja pildil näidatud pipeti geelots sisestatakse ET-toru kaudu hingetorusse soovitud sügavusele.
Nädal pärast LV-MP doseerimisprotseduuri humaanselt surmati loomad 100% CO2 sissehingamise teel ja LacZ ekspressiooni hinnati meie standardse X-gal-ravi abil. Kolm kõige kõhrelisemat rõngast eemaldati, et veenduda, et endotrahheaaltoru paigutamisest tingitud mehaanilised kahjustused või vedelikupeetus ei oleks analüüsi kaasatud. Iga hingetoru lõigati pikisuunas, et luua analüüsiks kaks poolt, ja need paigutati silikoonkummist (Sylgard, Dow Inc) valmistatud nõusse, kasutades Minutieni nõela (Fine Science Tools), et visualiseerida luminaalset pinda. Transdutseeritud rakkude jaotust ja mustrit kinnitati frontaalfotograafia abil, kasutades Nikoni mikroskoopi (SMZ1500) koos DigiLite kaamera ja TCapture tarkvaraga (Tucsen Photonics, Hiina). Pildid saadi 20-kordse suurendusega (kaasa arvatud hingetoru täislaiuse suurim seadistus), kusjuures kogu hingetoru pikkust pildistati samm-sammult, tagades iga pildi piisava kattumise, et võimaldada piltide "õmblemist". Seejärel pandi iga hingetoru pildid kokku Üksik liitpilt, kasutades Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ja tasapinnalise liikumise algoritmi. Iga looma hingetoru liitpiltide LacZ ekspressioonialad kvantifitseeriti automatiseeritud MATLAB-skripti (R2020a, MathWorks) abil, nagu eelnevalt kirjeldatud, kasutades sätteid 0,35 < toon < 0,58, küllastus > 0,15 ja väärtus < 0,7. Koe kontuuride jälgimisega genereeriti GIMP v2.10.24-s iga liitpildi jaoks käsitsi mask, et tuvastada koeala ja vältida valetuvastusi väljastpoolt hingetoru kude. Iga looma kõigi liitpiltide värvitud alad summeeriti, et saada selle looma koguvärvitud ala. Seejärel jagati värvitud ala maski kogupindalaga, et saada normaliseeritud ala.
Iga hingetoru sisestati parafiini ja lõigati 5 μm paksused lõigud. Lõike värviti neutraalse kiirpunasega 5 minutit ja pildid saadi Nikon Eclipse E400 mikroskoobi, DS-Fi3 kaamera ja NIS elementide jäädvustamise tarkvara (versioon 5.20.00) abil.
Kõik statistilised analüüsid viidi läbi programmis GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistiline olulisus määrati väärtuseks p ≤ 0,05. Normaalsust kontrolliti Shapiro-Wilki testiga ja LacZ värvumise erinevusi hinnati paaritu t-testi abil.
Tabelis 1 kirjeldatud kuut MP-d uuriti PCXI abil ja nähtavust on kirjeldatud tabelis 2. Kaks polüstüreenist MP-d (MP1 ja MP2; vastavalt 18 μm ja 0,25 μm) ei olnud PCXI abil nähtavad, kuid ülejäänud proovid olid tuvastatavad (näited on toodud joonisel 5). MP3 ja MP4 (vastavalt 10–15% Fe3O4; 0,25 μm ja 0,9 μm) on nõrgalt nähtavad. Kuigi need sisaldasid mõningaid väikseimaid testitud osakesi, oli MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) kõige selgemini nähtav. CombiMagi produkti MP6 on raske märgata. Kõigil juhtudel paranes meie võime MP-d tuvastada märkimisväärselt magneti edasi-tagasi liigutamine kapillaariga paralleelselt. Kui magnetid kapillaarist eemaldusid, venisid osakesed pikkadeks stringideks, kuid magnetite lähenedes ja magnetvälja tugevuse suurenedes lühenesid osakeste stringid, kui osakesed liikusid kapillaari ülemise pinna poole (vt lisavideot S1: MP4), suurendades osakeste tihedust. pinnast. Vastupidiselt, kui magnet kapillaarist eemaldatakse, väheneb väljatugevus ja MP-d paigutuvad pikkadeks stringideks, mis ulatuvad kapillaari ülemisest pinnast välja (vt lisavideot S2:MP4). Pärast magneti liikumise peatumist jätkavad osakesed liikumist veel lühikest aega pärast tasakaaluasendi saavutamist. Kui MP liigub kapillaari ülemise pinna poole ja sellest eemale, lohistavad magnetosakesed prahti tavaliselt läbi vedeliku.
MP nähtavus PCXI all on proovide lõikes väga erinev. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ja (d) MP6. Kõik siin näidatud pildid on tehtud magnetiga, mis paiknes umbes 10 mm kaugusel kapillaarist. Nähtavad suured ringid on kapillaaridesse kinni jäänud õhumullid, mis näitavad selgelt faasikontrastpildistamise mustvalgeid servajooni. Punane kast sisaldab kontrasti suurendavat suurendust. Pange tähele, et magneti skeemide läbimõõdud kõigil joonistel ei ole skaala järgi ja on umbes 100 korda suuremad kui näidatud.
Kui magnetit liigutatakse kapillaari ülaosas vasakule ja paremale, muutub MP-nööri nurk magnetiga joondamiseks (vt joonis 6), mis piiritleb magnetvälja jõujooni. MP3-5 puhul lohistatakse osakesi pärast seda, kui akord saavutab lävinurga, mööda kapillaari ülemist pinda. See põhjustab sageli MP-de koondumist suurematesse rühmadesse lähedale kohale, kus magnetväli on tugevaim (vt lisavideot S3:MP5). See on eriti ilmne ka kapillaari otsa lähedal pildistamisel, mis põhjustab MP-de agregeerumist ja kontsentreerumist vedeliku ja õhu piirile. MP6 osakesi, mida oli MP3-5-st raskem eristada, ei lohistatud magneti liikumisel mööda kapillaari, kuid MP-nöörid dissotsieerusid, jättes osakesed vaatevälja (vt lisavideot S4:MP6). Mõnel juhul, kui rakendatud magnetvälja vähendati magneti pildistamiskohast suurele kaugusele liigutamisega, laskusid kõik ülejäänud MP-d gravitatsiooni abil aeglaselt toru alumisele pinnale, jäädes samal ajal nööri sisse (vt lisavideot S5:MP3).
MP-nööri nurk muutub, kui magnetit kapillaari kohal paremale nihutatakse. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ja (d) MP6. Punane kast sisaldab kontrasti võimendavat suurendust. Pange tähele, et lisavideod on informatiivsed, kuna need näitavad olulist osakeste struktuuri ja dünaamilist teavet, mida nendel staatilistes piltides ei saa visualiseerida.
Meie testid näitasid, et magneti aeglane edasi-tagasi liigutamine mööda hingetoru hõlbustab MP visualiseerimist keerulise liikumise kontekstis in vivo. In vivo testimist ei teostatud, kuna polüstüreenhelmed (MP1 ja MP2) ei olnud kapillaaris nähtavad. Ülejäänud nelja MP-d testiti in vivo, magneti pikiteljega, mis oli konfigureeritud hingetoru kohale umbes 30° nurga all vertikaali suhtes (vt joonised 2b ja 3a), kuna see andis pikemad MP-ahelad ja oli efektiivsem kui magneti konfiguratsiooni lõpetamine. MP3, MP4 ja MP6 ei tuvastatud ühegi eluslooma hingetorus. Kui rottide hingamisteid pildistati pärast loomade humaanset surmamist, jäid osakesed nähtamatuks isegi siis, kui süstlapumba abil lisati täiendavat mahtu. MP5-l oli kõrgeim raudoksiidi sisaldus ja see oli ainus nähtav osake ning seetõttu kasutati seda MP in vivo käitumise hindamiseks ja iseloomustamiseks.
Magneti asetamine hingetoru kohale MP manustamise ajal tõi kaasa paljude, kuid mitte kõigi MP-de koondumise vaatevälja. Hingetorusse sisenevaid osakesi on kõige parem jälgida humaanselt ohverdatud loomadel. Joonis 7 ja lisavideo S6: MP5 näitab osakeste kiiret magnetilist püüdmist ja joondumist ventraalse hingetoru pinnal, mis näitab, et MP-sid saab suunata hingetoru soovitud piirkondadesse. Pärast MP manustamist hingetoru distaalsemalt otsides leiti mõned MP-d karinale lähemal, mis viitab sellele, et magnetvälja tugevus ei olnud kõigi MP-de kogumiseks ja säilitamiseks piisav, kuna need manustati vedelikuprotsessi ajal maksimaalse magnetvälja tugevuse piirkonna kaudu. Sellest hoolimata olid sünnitusjärgsed MP kontsentratsioonid pildistamispiirkonnas kõrgemad, mis viitab sellele, et paljud MP-d jäid hingamisteede piirkondadesse, kus rakendatud magnetvälja tugevus oli kõrgeim.
Pildid (a) enne ja (b) pärast MP5 manustamist hiljuti eutaneeritud roti hingetorusse, kus magnet on paigutatud otse pildistamisala kohale. Pildistatav ala asub kahe kõhrerõnga vahel. Enne MP manustamist on hingamisteedes vedelikku. Punane kast sisaldab kontrasti võimendavat suurendust. Need pildid pärinevad videost, mis on näidatud lisavideos S6:MP5.
Magneti liigutamine mööda hingetoru in vivo põhjustas MP-ahela nurga muutuse hingamisteede pinnal sarnaselt kapillaaride puhul täheldatule (vt joonis 8 ja lisavideo S7:MP5). Meie uuringus ei saanud aga MP-sid elavate hingamisteede pinnal lohistada, nagu see oli võimalik kapillaaride puhul. Mõnel juhul pikeneb MP-ahel, kui magnet liigub vasakule ja paremale. Huvitaval kombel leidsime ka, et osakeste kett näib muutvat pinnavedeliku kihi sügavust, kui magnetit liigutatakse pikisuunas mööda hingetoru, ja laieneb, kui magnetit liigutatakse otse pea kohale ja osakeste kett pööratakse vertikaalasendisse (vt lisavideo S7). MP5 kell 0:09, all paremal). Liikumise iseloomulik muster muutus, kui magnetit liigutati hingetoru ülaosas külgsuunas (st loomast vasakule või paremale, mitte piki hingetoru pikkust). Osakesed olid liikumise ajal endiselt selgelt nähtavad, kuid kui magnet hingetorust eemaldati, muutusid osakeste ahelate otsad nähtavaks (vt lisavideot S8:MP5, alates 0:08). See on kooskõlas MP käitumisega, mida täheldasime klaaskapillaaris rakendatud magnetvälja all.
Näidispildid, mis näitavad MP5-d elusa tuimestatud roti hingetorus. (a) Magnetiga saadakse pildid hingetorust ülalt ja vasakult ning seejärel (b) pärast magneti liigutamist paremale. Punane kast sisaldab kontrasti võimendavat suurendust. Need pildid pärinevad videost, mis on näidatud lisavideos S7:MP5.
Kui kaks poolust olid konfigureeritud põhja-lõuna suunas hingetoru kohal ja all (st tõmbusid ligi; joonis 3b), tundusid MP-akordid pikemad ja asusid hingetoru külgseinal, mitte hingetoru dorsaalsel pinnal (vt lisavideot S9:MP5). Kahe magnetiga seadme kasutamisel ei tuvastatud pärast vedeliku manustamist ühes kohas (st hingetoru dorsaalsel pinnal) suuri osakeste kontsentratsioone, mis tavaliselt juhtub ühe magnetiga seadme kasutamisel. Seejärel, kui üks magnet oli konfigureeritud pooluste vastupidiseks tõrjumiseks (joonis 3c), ei paistnud vaateväljas nähtavate osakeste arv pärast manustamist suurenevat. Mõlema kahe magnetiga konfiguratsiooni seadistamine on keeruline tänu suurele magnetvälja tugevusele, mis vastavalt magneteid tõmbab või lükkab. Seejärel muudeti seadistust üheks magnetiks, mis on paralleelne hingamisteedega, kuid läbib hingamisteed 90-kraadise nurga all, nii et väljajooned ristuvad hingetoru seinaga ortogonaalselt (joonis 3d), mis on orientatsioon, mille eesmärk on teha kindlaks, kas külgseinal on võimalik täheldada osakeste agregatsiooni. Selles konfiguratsioonis aga... MP akumuleerumise ega magneti liikumise tuvastatavat liikumist ei täheldatud. Kõigi nende tulemuste põhjal valiti in vivo geenikandjate uuringuteks ühe magnetiga 30-kraadise orientatsiooniga konfiguratsioon (joonis 3a).
Kui looma kohe pärast humaanset tapmist korduvalt pildistati, tähendas segava koeliikumise puudumine seda, et selges interkondraalses väljas oli eristatavad peenemad ja lühemad osakeste jooned, mis „värisesid“ magneti translatsioonilise liikumisega kooskõlas. Sellest hoolimata ei ole MP6 osakeste olemasolu ja liikumist ikka veel selgelt näha.
LV-LacZ tiiter oli 1,8 × 108 TU/ml ja pärast 1:1 segamist CombiMag MP-ga (MP6) said loomad 50 μl trahheaalse annuse 9 × 107 TU/ml LV vehiikulit (st 4,5 × 106 TU/rott). Nendes uuringutes fikseerisime magneti sünnituse ajal translokatsiooni asemel ühes asendis, et teha kindlaks, kas LV transduktsiooni (a) saab parandada võrreldes vektori manustamisega magnetvälja puudumisel ja (b) kas seda saab fokuseerida. Hingamisteede rakud transdutseeritakse ülemiste hingamisteede magnetilistele sihtpiirkondadele.
Magnetite olemasolu ja CombiMagi kasutamine koos LV vektoritega ei paistnud loomade tervisele kahjulikku mõju avaldavat, nagu ka meie standardne LV vektori manustamise protokoll. Mehaanilise häirituse allutatud trahhea piirkonna frontaalpildid (lisajoonis 1) näitasid, et magneti juuresolekul oli LV-MP-ga ravitud loomade rühmas transduktsiooni tase oluliselt kõrgem (joonis 9a). Kontrollrühmas esines ainult väike kogus sinist LacZ värvumist (joonis 9b). Normaliseeritud X-Gal värvitud alade kvantifitseerimine näitas, et LV-MP manustamine magnetvälja juuresolekul andis ligikaudu 6-kordse paranemise (joonis 9c).
Näidiskomposiitkujutised, mis näitavad LV-MP abil trahhea transduktsiooni (a) magnetvälja juuresolekul ja (b) magneti puudumisel. (c) Statistiliselt oluline paranemine normaliseeritud LacZ transduktsioonipiirkonnas trahheas magneti kasutamisel (*p = 0,029, t-test, n = 3 rühma kohta, keskmine ± SEM).
Neutraalsed kiiresti punaseks värvunud lõigud (näide on toodud lisajoonisel 2) näitasid LacZ-värvitud rakke sarnases mustris ja asukohas nagu eelnevalt teatatud.
Hingamisteede geeniteraapia peamiseks väljakutseks on endiselt kandjaosakeste täpne lokaliseerimine huvipakkuvatesse piirkondadesse ja kõrge transduktsioonitõhususe saavutamine liikuvas kopsus õhuvoolu ja aktiivse limaerituse korral. Tsüstilise hingamisteede haiguse raviks mõeldud LV-kandjate puhul on kandjaosakeste viibimisaja pikendamine juhtivates hingamisteedes seni olnud raskesti saavutatav eesmärk. Nagu Castellani jt on välja toonud, on magnetväljade kasutamisel transduktsiooni parandamiseks eeliseid võrreldes teiste geenide kohaletoimetamise meetoditega, näiteks elektroporatsiooniga, kuna see ühendab lihtsuse, kulutõhususe, kohaletoimetamise lokaliseerimise, suurenenud efektiivsuse ja lühemad inkubatsiooniajad ning võib-olla ka väiksema kandjaannuse. Magnetosakeste in vivo sadestumist ja käitumist hingamisteedes väliste magnetjõudude mõjul pole aga kunagi kirjeldatud ega ole tegelikult tõestatud selle meetodi teostatavust in vivo geenide ekspressioonitaseme suurendamiseks tervetes elavates hingamisteedes.
Meie in vitro sünkrotroni PCXI katsed näitasid, et kõik meie testitud osakesed, välja arvatud polüstüreen MP, olid meie kasutatud pildistamisseadmes nähtavad. Magnetvälja juuresolekul moodustavad MP-d stringe, mille pikkus on seotud osakese tüübi ja magnetvälja tugevusega (st magneti läheduse ja liikumisega). Nagu joonisel 10 näidatud, moodustuvad meie vaadeldavad stringid tänu sellele, et iga üksik osake magnetiseerub ja indutseerib oma lokaalse magnetvälja. Need eraldi väljad põhjustavad teiste sarnaste osakeste agregeerumist ja ühendumist, kus teiste osakeste lokaalsete tõmbe- ja tõukejõudude lokaalsete jõudude tõttu toimuvad grupi stringilaadsed liikumised.
Skeem, mis näitab (a, b) vedelikuga täidetud kapillaarides ja (c, d) õhuga täidetud hingetorus tekkivaid osakeste ronge. Pange tähele, et kapillaarid ja hingetoru ei ole joonistatud skaala järgi. Paneelil (a) on ka MP kirjeldus, mis sisaldab rõngastena paiknevaid Fe3O4 osakesi.
Kui magnetit kapillaari kohal liigutati, saavutas osakeste stringi nurk kriitilise läve MP3-5, mis sisaldas Fe3O4, jaoks, mille järel osakeste string ei püsinud enam algasendis, vaid liikus mööda pinda uude asendisse. See efekt tekib tõenäoliselt seetõttu, et klaasist kapillaari pind on piisavalt sile, et see liikumine toimuks. Huvitaval kombel MP6 (CombiMag) nii ei käitunud, võib-olla seetõttu, et osakesed olid väiksemad, neil olid erinevad katted või pinnalaengud või mõjutas patenteeritud kandevedelik nende liikumisvõimet. CombiMagi osakeste pildi kontrastsus on samuti nõrgem, mis viitab sellele, et vedelikul ja osakestel võib olla sarnane tihedus ja seetõttu ei liigu nad kergesti üksteise poole. Osakesed võivad ka kinni jääda, kui magnet liigub liiga kiiresti, mis näitab, et magnetvälja tugevus ei suuda alati vedelikus olevate osakeste vahelist hõõrdumist ületada, mis viitab sellele, et pole ehk üllatav, et magnetvälja tugevus ja magneti ning sihtmärgiala vaheline kaugus on väga olulised. Kokkuvõttes viitavad need tulemused ka sellele, et kuigi magnetid suudavad püüda kinni palju sihtmärgiala kaudu voolavaid MP-sid, on ebatõenäoline, et magnetitele saab loota CombiMagi osakeste liigutamisel mööda seda. hingetoru pinnale. Seetõttu järeldame, et in vivo LV-MP uuringutes tuleks kasutada staatilisi magnetvälju, et füüsiliselt sihtida hingamisteede puu spetsiifilisi piirkondi.
Kui osakesi kehasse toimetatakse, on neid keerukate liikuvate kehakudede kontekstis raske tuvastada, kuid nende tuvastamise võimet parandati magneti horisontaalselt hingetoru kohal liigutamisega, et MP-nööre "vehkida". Kuigi reaalajas pildistamine on võimalik, on osakeste liikumist lihtsam tuvastada pärast looma humaanset surmamist. MP kontsentratsioonid olid selles kohas üldiselt kõrgeimad, kui magnet asus pildistamisala kohal, kuigi mõned osakesed leiti tavaliselt kaugemal hingetorust. Erinevalt in vitro uuringutest ei saa osakesi magneti liigutamisega mööda hingetoru lohistada. See leid on kooskõlas sellega, kuidas hingetoru pinda katva lima tavaliselt töötleb sissehingatud osakesi, püüdes need lima sisse ja seejärel mukotsiliaarse kliirensi mehhanismi abil eemaldatakse.
Meie hüpotees oli, et magnetite kasutamine hingetoru kohal ja all ligitõmbamiseks (joonis 3b) võib põhjustada ühtlasema magnetvälja, mitte aga ühes punktis kontsentreeritud magnetvälja, mis võib viia osakeste ühtlasema jaotumiseni. Meie eeluuring ei leidnud aga selle hüpoteesi toetuseks selgeid tõendeid. Samuti ei põhjustanud kahe magneti konfigureerimine tõukamiseks (joonis 3c) suuremat osakeste ladestumist pildistamispiirkonnas. Need kaks tulemust näitavad, et kahe magnetiga seadistus ei paranda oluliselt MP sihtimise lokaalset kontrolli ja et tekkivad tugevad magnetjõud on keerulised konfigureerida, mis muudab selle lähenemisviisi vähem praktiliseks. Samamoodi ei suurendanud magneti orienteerimine hingetoru kohal ja läbi selle (joonis 3d) pildistamispiirkonnas kinnipeetud osakeste arvu. Mõned neist alternatiivsetest konfiguratsioonidest ei pruugi olla edukad, kuna need põhjustavad ladestuspiirkonnas madalamat magnetvälja tugevust. Seetõttu peetakse ühe 30-kraadise nurga all oleva magneti konfiguratsiooni (joonis 3a) in vivo testimiseks lihtsaimaks ja tõhusamaks meetodiks.
LV-MP uuring näitas, et kui LV vektorid kombineeriti CombiMagiga ja manustati pärast füüsilist häiritust magnetvälja juuresolekul, suurenesid transduktsioonitasemed hingetorus kontrollrühmaga võrreldes oluliselt. Sünkrotronkuvamise uuringute ja LacZ tulemuste põhjal suutis magnetväli ilmselt säilitada LV hingetorus ja vähendada vektorosakeste arvu, mis tungisid kohe sügavale kopsu. Sellised sihtimise täiustused võivad viia suurema efektiivsuseni, vähendades samal ajal manustatud tiitreid, sihtmärgivälist transduktsiooni, põletikulisi ja immuunseid kõrvaltoimeid ning geenikandjate kulusid. Oluline on see, et tootja sõnul saab CombiMagi kasutada koos teiste geeniülekande meetoditega, sealhulgas teiste viirusvektorite (näiteks AAV) ja nukleiinhapetega.