Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte ondersteuning vir CSS. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer afskakel). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript vertoon.
Geenvektore vir die behandeling van sistiese fibrose-longsiekte moet die geleidende lugweë teiken, want perifere longtransduksie bied nie terapeutiese voordeel nie. Virale transduksie-effektiwiteit hou direk verband met vektorverblyftyd. Afleweringsvloeistowwe soos geendraers diffundeer egter natuurlik in die alveoli tydens inspirasie, en terapeutiese deeltjies van enige vorm word vinnig deur mukosiliêre vervoer verwyder. Die verlenging van die verblyftyd van geendraers in die lugweë is belangrik, maar moeilik om te bereik. Geendraer-gekonjugeerde magnetiese deeltjies wat na die oppervlak van die lugweë gerig kan word, kan streeksgerigtheid verbeter. As gevolg van die uitdagings van in vivo-visualisering, word die gedrag van sulke klein magnetiese deeltjies op die lugwegoppervlak in die teenwoordigheid van 'n toegepaste magnetiese veld swak verstaan. Die doel van hierdie studie was om sinkrotronbeelding te gebruik om die in vivo-beweging van 'n reeks magnetiese deeltjies in die tragea van verdoofde rotte te visualiseer om die dinamika en patrone van individuele en massadeeltjiegedrag in vivo te ondersoek. Ons het toe ook beoordeel of die aflewering van lentivirale magnetiese deeltjies in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld die transduksie-effektiwiteit in die rot sou verhoog. tragea. Sinkrotron-X-straalbeelding onthul die gedrag van magnetiese deeltjies in stilstaande en bewegende magnetiese velde in vitro en in vivo. Deeltjies kan nie maklik met magnete oor die oppervlak van die lewende lugweg gesleep word nie, maar tydens vervoer word die neerslae gekonsentreer in die gesigsveld waar die magnetiese veld die sterkste is. Transduksie-doeltreffendheid is ook sesvoudig verhoog toe lentivirale magnetiese deeltjies in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld afgelewer is. Saam dui hierdie resultate daarop dat lentivirale magnetiese deeltjies en magnetiese velde waardevolle benaderings kan wees om geenvektor-teikenstelling te verbeter en transduksievlakke in geleidende lugweë in vivo te verhoog.
Sistiese fibrose (SF) word veroorsaak deur variasie in 'n enkele geen genaamd die SF transmembraangeleidingsreguleerder (SFTR). Die SFTR-proteïen is 'n ioonkanaal wat in baie epiteelselle dwarsdeur die liggaam teenwoordig is, insluitend die geleidende lugweë, 'n belangrike plek van SF-patogenese. SFTR-defekte lei tot abnormale watervervoer, wat die lugwegoppervlak dehidreer en die diepte van die lugwegoppervlakvloeistoflaag (ASL) verminder. Dit benadeel ook die vermoë van die mukosiliêre vervoerstelsel (MCT) om ingeasemde deeltjies en patogene uit die lugweë te verwyder. Ons doel is om 'n lentivirale (LV) geenterapie te ontwikkel om die korrekte kopie van die CFTR-geen te lewer en ASL-, MCT- en longgesondheid te verbeter, en om voort te gaan met die ontwikkeling van nuwe tegnologieë wat hierdie parameters in vivo kan meet1.
LV-vektore is een van die voorste kandidate vir CF-lugweggeenterapie, hoofsaaklik omdat hulle die terapeutiese geen permanent in die lugwegbasale selle (lugwegstamselle) kan integreer. Dit is belangrik omdat hulle normale hidrasie en slymopruiming kan herstel deur te differensieer in funksionele geen-gekorrigeerde CF-geassosieerde lugwegoppervlakselle, wat lewenslange voordele tot gevolg het. LV-vektore moet teen die geleidende lugweg gerig word, aangesien dit is waar CF-longsiekte begin. Aflewering van die vektor dieper in die long kan lei tot alveolêre transduksie, maar dit het geen terapeutiese voordeel in CF nie. Vloeistowwe soos geendraers migreer egter natuurlik na die alveoli na inspirasie na aflewering3,4 en terapeutiese deeltjies word vinnig deur MCT in die mondholte opgeklaar. LV-transduksie-effektiwiteit is direk verwant aan die tydsduur wat die vektor langs teikenselle bly om sellulêre opname toe te laat – die "verblyftyd"5 – wat maklik verminder word deur tipiese streekslugvloei sowel as gekoördineerde deeltjie-slymopname en MCT. Vir CF is die vermoë om die verblyftyd van die LV binne die lugweg te verleng belangrik om hoë vlakke van transduksie in hierdie streek te bereik, maar was tot dusver uitdagend.
Om hierdie struikelblok te oorkom, stel ons voor dat LV magnetiese deeltjies (MP's) op twee komplementêre maniere kan help. Eerstens kan hulle magneties na die lugwegoppervlak gelei word om teikenstelling te verbeter en die geendraerdeeltjies te help om in die verlangde lugweggebied te bly; en ASL) om na sellaag 6 te beweeg. MP's is wyd gebruik as geteikende geneesmiddelafleweringsvoertuie wanneer hulle bind aan teenliggaampies, chemoterapeutiese middels of ander klein molekules wat aan selmembrane heg of aan relevante seloppervlakreseptore bind en by tumorplekke ophoop in die teenwoordigheid van statiese elektrisiteit. Magnetiese Velde vir Kankerbehandeling 7. Ander "hipertermiese" tegnieke is daarop gemik om MP's te verhit wanneer hulle blootgestel word aan ossillerende magnetiese velde, waardeur tumorselle vernietig word. Die beginsel van magnetiese transfeksie, waarin 'n magnetiese veld as 'n transfeksie-agent gebruik word om die oordrag van DNS na selle te verbeter, word algemeen in vitro gebruik deur 'n reeks nie-virale en virale geenvektore vir moeilik-transduceerbare sellyne te gebruik. Die doeltreffendheid van LV-magnetotransfeksie is vasgestel, met in vitro aflewering van LV-MP's aan 'n menslike brongiale epiteelsellyne in die teenwoordigheid van 'n statiese magnetiese veld, wat die transduksie-effektiwiteit met 186 keer verhoog in vergelyking met LV-vektor alleen. LV-MP is ook toegepas op 'n in vitro CF-model, waar magnetiese transfeksie LV-transduksie in lug-vloeistof-koppelvlakkulture met 20 keer verhoog het in die teenwoordigheid van CF-sputum10. In vivo magnetotransfeksie van organe het egter relatief min aandag gekry en is slegs in 'n paar diere geëvalueer. studies11,12,13,14,15, veral in die longe16,17. Nietemin is die geleenthede vir magnetiese transfeksie in CF-longterapie duidelik. Tan et al. (2020) het verklaar dat "'n bewys-van-konsep-studie van doeltreffende magnetiese nanopartikel-pulmonale aflewering die weg sal baan vir toekomstige CFTR-inasemingsstrategieë om kliniese uitkomste in CF-pasiënte te verbeter"6.
Die gedrag van klein magnetiese deeltjies op lugwegoppervlaktes in die teenwoordigheid van 'n toegepaste magnetiese veld is moeilik om te visualiseer en te bestudeer, en dus swak verstaan. In ander studies het ons 'n sinchrotron-voortplantingsgebaseerde fasekontras-X-straalbeelding (PB-PCXI) metode ontwikkel om klein in vivo veranderinge in ASL-diepte18 en MCT-gedrag19,20 nie-indringend te visualiseer en te kwantifiseer om gaskanaaloppervlakhidrasie direk te meet en te gebruik as 'n vroeë aanduiding van behandelingsdoeltreffendheid. Daarbenewens gebruik ons ​​MCT-evalueringsmetode deeltjies met 'n deursnee van 10-35 µm wat bestaan ​​uit alumina of hoë brekingsindeksglas as MCT-merkers wat sigbaar is met behulp van PB-PCXI21. Beide tegnieke is geskik vir die visualisering van 'n reeks deeltjietipes, insluitend MP.
As gevolg van die hoë ruimtelike en temporale resolusie, is ons PB-PCXI-gebaseerde ASL- en MCT-analisetegnieke goed geskik vir die ondersoek van die dinamika en patrone van enkel- en grootmaatdeeltjiegedrag in vivo om ons te help om MP-geen-afleweringstegnieke te verstaan ​​en te optimaliseer. Die benadering wat ons hier gebruik, is afgelei van ons studies met behulp van die SPring-8 BL20B2-straallyn, waarin ons vloeistofbeweging na skynvektor-dosisaflewering in die nasale en pulmonale lugweë van muise gevisualiseer het om ons nie-uniforme geen-ekspressiepatrone wat in ons geendraerdosis-dierstudies waargeneem is 3,4 te help verduidelik.
Die doel van hierdie studie was om die sinkrotron PB-PCXI te gebruik om die in vivo bewegings van 'n reeks MP's in die tragea van lewende rotte te visualiseer. Hierdie PB-PCXI-beeldstudies is ontwerp om 'n reeks MP's, magnetiese veldsterktes en liggings te toets om hul effek op MP-beweging te bepaal. Ons het gehipotetiseer dat 'n ekstern toegepaste magnetiese veld die afgelewerde MP sou help om in die teikenarea te bly of daarheen te beweeg. Hierdie studies het ons ook toegelaat om magneetkonfigurasies te identifiseer wat die aantal deeltjies wat in die tragea na afsetting behoue ​​bly, maksimeer. In 'n tweede reeks studies het ons gepoog om hierdie optimale konfigurasie te gebruik om die transduksiepatroon te demonstreer wat voortspruit uit in vivo aflewering van LV-MP's aan die rotlugweg, gebaseer op die aanname dat die aflewering van LV-MP's in die konteks van lugwegteikening tot verbeterde LV-transduksie-doeltreffendheid sou lei.
Alle dierestudies is uitgevoer volgens protokolle wat goedgekeur is deur die Universiteit van Adelaide (M-2019-060 en M-2020-022) en die SPring-8 Sinkrotron Dieretiekkomitee. Eksperimente is uitgevoer volgens ARRIVE-riglyne.
Alle X-straalbeelding is uitgevoer by die BL20XU-straallyn by die SPring-8-sinkrotron in Japan, met behulp van 'n opstelling soortgelyk aan dié wat voorheen beskryf is21,22. Kortliks, die eksperimentele boks was 245 m van die sinkrotronbergingsring geleë. 'n Monster-tot-detektor-afstand van 0.6 m word gebruik vir deeltjiebeeldingstudies en 0.3 m vir in vivo-beeldingstudies om fasekontraseffekte te genereer. 'n Monochromatiese straalenergie van 25 keV is gebruik. Beelde is vasgelê met behulp van 'n hoë-resolusie X-straalomskakelaar (SPring-8 BM3) gekoppel aan 'n sCMOS-detektor. Die omskakelaar skakel X-strale om na sigbare lig met behulp van 'n 10 µm dik sintillator (Gd3Al2Ga3O12), wat dan na 'n sCMOS-sensor gerig word met behulp van 'n × 10 mikroskoopobjektief (NA 0.3). Die sCMOS-detektor was Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) met 'n skikkingsgrootte van 2048 × 2048 pixels en 'n rou pixelgrootte van 6.5 × 6.5 µm. Hierdie opstelling lewer 'n effektiewe isotropiese pixelgrootte van 0.51 µm en 'n gesigsveld van ongeveer 1.1 mm × 1.1 mm. 'n Blootstellingslengte van 100 ms is gekies om die sein-tot-ruisverhouding van magnetiese deeltjies binne en buite die lugweg te maksimeer terwyl asemhalingsgeïnduseerde bewegingsartefakte geminimaliseer word. Vir in vivo studies is 'n vinnige X-straalsluiter in die X-straalpad geplaas om die stralingsdosis te beperk deur die X-straalbundel tussen blootstellings te blokkeer.
Die LV-draer is nie in enige SPring-8 PB-PCXI-beeldstudies gebruik nie, omdat die BL20XU-beeldkamer nie Biosafety Level 2-gesertifiseerd is nie. In plaas daarvan het ons 'n reeks goed gekarakteriseerde MP's van twee kommersiële verskaffers gekies – wat 'n reeks groottes, materiale, ysterkonsentrasies en toepassings dek – eers om te verstaan ​​hoe magnetiese velde MP-beweging binne glaskapillêre en dan in lewende lugweë beïnvloed. op die oppervlak. MP's wissel in grootte van 0.25 tot 18 μm en word van 'n verskeidenheid materiale gemaak (sien Tabel 1), maar die samestelling van elke monster, insluitend die grootte van die magnetiese deeltjies binne die MP, is onbekend. Gebaseer op ons uitgebreide MCT-studies 19, 20, 21, 23, 24, verwag ons dat MP's so klein as 5 μm op die trageale lugwegoppervlak gesien kan word, byvoorbeeld deur opeenvolgende rame af te trek om verbeterde sigbaarheid van MP-beweging te sien. 'n Enkele 0.25 μm-grootte MP is kleiner as die resolusie van die beeldtoestel, maar daar word verwag dat PB-PCXI hul volumekontras en die beweging van die oppervlakvloeistof waarop hulle na afsetting neergelê word, sal opspoor.
Monsters vir elke MP in Tabel 1 is voorberei in 20 μl glaskapillêre (Drummond Microcaps, PA, VSA) met 'n binnediameter van 0.63 mm. Korpuskulêre deeltjies is beskikbaar in water, terwyl CombiMag-deeltjies beskikbaar is in die vervaardiger se eie vloeistof. Elke buis is halfvol met vloeistof (ongeveer 11 μl) en op die monsterhouer geplaas (sien Figuur 1). Die glaskapillêre is horisontaal op die monsterstadium in die beeldboks geplaas, onderskeidelik, en die rande van die vloeistof geposisioneer. 'n 19 mm deursnee (28 mm lank) nikkeldop seldsame aarde neodymium yster boor (NdFeB) magneet (N35, kat. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australië) met 'n residuele magnetisasie van 1.17 Tesla is aan 'n aparte translasiestadium geheg om sy posisie op afstand tydens beeldvorming te verander. X-straalbeeldverkryging begin wanneer die magneet ongeveer 30 mm bokant die monster geposisioneer is, en beelde word teen 'n tempo van 4 rame per sekonde verkry. Tydens beeldvorming is die magneet naby die glaskapillêre buis gebring (ongeveer 1 mm weg) en dan langs die buis verskuif om die effekte van veldsterkte en posisie te bepaal.
In vitro-beeldopstelling wat MP-monsters in glaskapillêre op die monster se xy-translasiestadium bevat. Die pad van die X-straalbundel word met 'n rooi stippellyn gemerk.
Sodra die in vitro sigbaarheid van MP's vasgestel is, is 'n subgroep van hulle in vivo getoets in wildetipe vroulike albino Wistar-rotte (~12 weke oud, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidien (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) en 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Rotte is verdoof met 'n mengsel van Pharma (Japan) deur intraperitoneale inspuiting. Na narkose is hulle voorberei vir beeldvorming deur die pels rondom die tragea te verwyder, 'n endotrageale buis (ET; 16 Ga iv-kanule, Terumo BCT) in te voeg en hulle in rugliggende posisies te immobiliseer op 'n pasgemaakte beeldplaat wat 'n termiese sak bevat om liggaamstemperatuur 22 te handhaaf. Die beeldplaat is toe aan die monstertranslasiestadium in die beeldboks teen 'n effense hoek geheg om die tragea horisontaal in die X-straalbeeld in lyn te bring, soos getoon in Figuur 2. 2a.
(a) In vivo-beeldopstelling in die SPring-8-beeldboks, die pad van die X-straalbundel word met 'n rooi stippellyn gemerk. (b, c) Magneetlokalisering op die tragea is op afstand uitgevoer met behulp van twee ortogonaal gemonteerde IP-kameras. Aan die linkerkant van die skermbeeld kan die draadlus wat die kop vashou, gesien word, en die afleweringskanule in plek binne die ET-buis.
'n Afstandbeheerde spuitpompstelsel (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) met behulp van 'n 100 μl-glasspuit is via 'n 30 Ga-naald aan 'n PE10-buis (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) gekoppel. Merk die buis om te verseker dat die punt in die korrekte posisie in die tragea is wanneer die ET-buis ingesit word. Met behulp van die mikropomp is die spuitsuier teruggetrek terwyl die punt van die buis in die MP-monster gedompel was wat afgelewer moes word. Die gelaaide afleweringsbuis is toe in die endotrageale buis geplaas, wat die punt binne die sterkste deel van ons verwagte toegepaste magnetiese veld geplaas het. Beeldverkryging is beheer met behulp van 'n respirasiedetektor wat aan ons Arduino-gebaseerde tydsberekeningsboks gekoppel is, en alle seine (bv. temperatuur, respirasie, sluiteropening/sluiting en beeldverkryging) is opgeneem met behulp van Powerlab en LabChart (AD Instruments, Sydney, Australië) 22. Wanneer beeldvorming plaasvind Toe die omhulsel ontoeganklik was, is twee IP-kameras (Panasonic BB-SC382) teen ongeveer 90° tot mekaar geposisioneer en is gebruik om die posisie van die ... te monitor. magneet relatief tot die tragea tydens beeldvorming (Fig. 2b, c). Om bewegingsartefakte te minimaliseer, is een beeld per asemteug verkry gedurende die eind-getyvloei-plateau.
'n Magneet is aan 'n tweede stadium geheg wat op afstand van buite die beeldbehuising geleë kan wees. Verskeie magneetposisies en -konfigurasies is getoets, insluitend: Gemonteer teen 'n hoek van ongeveer 30° bokant die tragea (konfigurasies getoon in Figure 2a en 3a); een magneet bokant die dier en die ander onder, met pole gestel om aan te trek (Figuur 3b); een magneet bokant die dier en die ander onder, met die pole gestel om af te stoot (Figuur 3c); en een magneet bokant en loodreg op die tragea (Figuur 3d). Sodra die dier en magneet gekonfigureer is en die spuitpomp wat getoets moet word, in die spuitpomp gelaai is, lewer 'n dosis van 50 μl teen 'n tempo van 4 μl/sek terwyl beelde verkry word. Die magneet word dan heen en weer langs of lateraal oor die tragea beweeg terwyl beelde voortgesit word.
Magneetkonfigurasie vir in vivo-beelding (a) 'n enkele magneet bokant die tragea teen 'n hoek van ongeveer 30°, (b) twee magnete gestel om aan te trek, (c) twee magnete gestel om af te stoot, (d) 'n enkele magneet bokant en loodreg in die tragea. Die waarnemer het van die mond af na die longe deur die tragea gekyk, en die X-straalbundel het deur die rot se linkerkant gegaan en die regterkant verlaat. Die magneet word óf langs die lengte van die lugweg óf links en regs bokant die tragea in die rigting van die X-straalbundel beweeg.
Ons het ook gepoog om die sigbaarheid en gedrag van deeltjies in die lugweë te bepaal in die afwesigheid van verwarrende asemhaling en kardiale beweging. Daarom is diere aan die einde van die beeldvormingsperiode op 'n menslike wyse doodgemaak vir 'n oordosis pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, VSA; ~65 mg/kg ip). Sommige diere is op die beeldvormingsplatform gelaat, en sodra asemhaling en hartklop gestop het, is die beeldvormingsproses herhaal, met 'n bykomende dosis MP bygevoeg indien geen MP op die lugwegoppervlak sigbaar was nie.
Die verkrygde beelde is platveld- en donkerveldkorrigeer en toe in 'n film saamgestel (20 rame per sekonde; 15-25 × normale spoed afhangende van asemhalingstempo) met behulp van 'n pasgemaakte skrip geskryf in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle LV-geenvektor-afleweringstudies is by die Laboratoriumdiernavorsingsfasiliteit aan die Universiteit van Adelaide uitgevoer en het ten doel gehad om die resultate van die SPring-8-eksperiment te gebruik om te bepaal of LV-MP-aflewering in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld geenoordrag in vivo kan verbeter. Om die effekte van MP en magnetiese veld te bepaal, is twee groepe diere behandel: een groep het LV-MP met 'n magneet gekry, en die ander groep het 'n kontrolegroep met LV-MP sonder 'n magneet ontvang.
LV-geenvektore is gegenereer met behulp van voorheen beskryfde metodes 25, 26. Die LacZ-vektor druk die kern-gelokaliseerde beta-galaktosidase-geen uit wat aangedryf word deur die konstitutiewe MPSV-promotor (LV-LacZ), wat 'n blou reaksieproduk in getransduseerde selle produseer, sigbaar in longweefselfronte en weefselseksies. Titrasie is in selkulture uitgevoer deur die aantal LacZ-positiewe selle handmatig met 'n hemositometer te tel om die titer in TU/ml te bereken. Draers word by -80 °C kriopreserveer, voor gebruik ontdooi en aan CombiMag gebind deur teen 'n 1:1-verhouding te meng en vir ten minste 30 minute voor aflewering op ys te inkubeer.
Normale Sprague Dawley-rotte (n = 3/groep, ~2-3 is intraperitoneaal verdoof met 'n mengsel van 0.4 mg/kg medetomidien (Domitor, Ilium, Australië) en 60 mg/kg ketamien (Ilium, Australië) (maande oue) ip) inspuiting en nie-chirurgiese orale kanulasie met 'n 16 Ga iv-kanule. Om te verseker dat die trageale lugwegweefsel LV-transduksie ontvang, is dit gekondisioneer met behulp van ons voorheen beskryfde meganiese perturbasieprotokol, waarin die trageale lugwegoppervlak aksiaal gevryf is met 'n draadmandjie (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, VSA) 30 s28. Trageale toediening van LV-MP is toe ongeveer 10 minute na perturbasie in 'n biologiese veiligheidskabinet uitgevoer.
Die magnetiese veld wat in hierdie eksperiment gebruik is, is op 'n soortgelyke wyse as die in vivo X-straalbeeldstudie gekonfigureer, met dieselfde magnete wat bo die tragea gehou is met behulp van distillasiestentklemme (Figuur 4). 'n Volume van 50 μl (2 × 25 μl aliquots) LV-MP is in die tragea (n = 3 diere) toegedien met behulp van 'n pipet met 'n gelpunt soos voorheen beskryf. 'n Kontrolegroep (n = 3 diere) het dieselfde LV-MP's ontvang sonder die gebruik van 'n magneet. Nadat die infusie voltooi is, word die kannule uit die ET-buis verwyder en die dier word geëkstubeer. Die magneet bly vir 10 minute in plek, dan word dit verwyder. Rotte het 'n subkutane dosis meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Australië) ontvang, gevolg deur omkering van narkose deur ip-inspuiting van 1 mg/kg atipamasoolhidrochloried (Antisedan, Zoetis, Australië). Rotte is warm gehou en gemonitor totdat hulle volledig van narkose herstel het.
LV-MP-toedieningsapparaat in 'n biologiese veiligheidskabinet. Die liggrys Luer-hub van die ET-buis kan gesien word wat uit die mond uitsteek en die gelpunt van die pipet wat in die prentjie getoon word, word deur die ET-buis tot die verlangde diepte in die tragea geplaas.
Een week na die LV-MP doseringsprosedure is diere op 'n menslike wyse doodgemaak deur 100% CO2-inaseming en LacZ-ekspressie is geassesseer met behulp van ons standaard X-gal-behandeling. Die drie kaudale mees kraakbeenringe is verwyder om te verseker dat enige meganiese skade of vloeistofretensie van endotrageale buisplasing nie in die analise ingesluit is nie. Elke tragea is in die lengte gesny om twee helftes vir analise te skep, en hulle is in 'n bakkie met silikoonrubber (Sylgard, Dow Inc) gemonteer met behulp van 'n Minutien-naald (Fine Science Tools) om die luminale oppervlak te visualiseer. Die verspreiding en patroon van getransduseerde selle is bevestig deur frontale fotografie met behulp van 'n Nikon-mikroskoop (SMZ1500) met 'n DigiLite-kamera en TCapture-sagteware (Tucsen Photonics, China). Beelde is verkry met 20x vergroting (insluitend die hoogste instelling vir die volle breedte van die tragea), met die volle lengte van die tragea stap vir stap afgebeeld, wat voldoende oorvleueling tussen elke beeld verseker om beeld-"steekwerk" moontlik te maak. Beelde van elke tragea is toe saamgestel in 'n Enkele saamgestelde beeld met behulp van die Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) wat 'n planêre bewegingsalgoritme gebruik. LacZ-ekspressie-areas in saamgestelde beelde van die tragea van elke dier is gekwantifiseer met behulp van 'n outomatiese MATLAB-skrip (R2020a, MathWorks) soos voorheen beskryf, met instellings van 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 en Value < 0.7. Deur die kontoere van die weefsel na te spoor, is 'n masker handmatig in GIMP v2.10.24 gegenereer vir elke saamgestelde beeld om die weefselarea te identifiseer en enige vals deteksies van buite die trageale weefsel te voorkom. Die gekleurde areas van alle saamgestelde beelde van elke dier is opgesom om die totale gekleurde area vir daardie dier te genereer. Die gekleurde area is toe gedeel deur die totale maskerarea om die genormaliseerde area te genereer.
Elke tragea is in paraffien ingebed en 5 μm snitte is gesny. Snitte is vir 5 minute met neutrale vinnige rooi gekleur en beelde is verkry met behulp van 'n Nikon Eclipse E400 mikroskoop, DS-Fi3 kamera en NIS element vaslegging sagteware (weergawe 5.20.00).
Alle statistiese ontledings is uitgevoer in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistiese betekenisvolheid is gestel op p ≤ 0.05. Normaliteit is geverifieer met behulp van die Shapiro-Wilk-toets, en verskille in LacZ-kleuring is beoordeel met behulp van die ongepaarde t-toets.
Die ses MP's wat in Tabel 1 beskryf word, is met behulp van PCXI ondersoek, en die sigbaarheid word in Tabel 2 beskryf. Twee polistireen MP's (MP1 en MP2; onderskeidelik 18 μm en 0.25 μm) was nie sigbaar onder PCXI nie, maar die res van die monsters was identifiseerbaar (voorbeelde word in Figuur 5 getoon). MP3 en MP4 (10-15% Fe3O4; onderskeidelik 0.25 μm en 0.9 μm) is vaagweg sigbaar. Alhoewel dit van die kleinste deeltjies wat getoets is, bevat, was MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) die mees prominente. Die CombiMag-produk MP6 is moeilik om raak te sien. In alle gevalle is ons vermoë om MP op te spoor aansienlik verbeter deur die magneet heen en weer parallel met die kapillêr te verskuif. Toe die magnete van die kapillêr wegbeweeg het, het die deeltjies in lang stringe verleng, maar soos die magnete nader gekom het en die magneetveldsterkte toegeneem het, het die deeltjiesnare verkort soos die deeltjies na die boonste oppervlak van die kapillêr gemigreer het (sien Aanvullende Video S1: MP4), wat die ... verhoog het. deeltjiedigtheid van die oppervlak. Omgekeerd, wanneer die magneet van die kapillêr verwyder word, neem die veldsterkte af en die MP's herrangskik in lang stringe wat vanaf die boonste oppervlak van die kapillêr strek (sien Aanvullende Video S2: MP4). Nadat die magneet ophou beweeg het, beweeg die deeltjies vir 'n kort tydjie nadat hulle die ewewigsposisie bereik het. Soos die MP na en weg van die boonste oppervlak van die kapillêr beweeg, sleep die magnetiese deeltjies tipies die puin deur die vloeistof.
Die sigbaarheid van MP onder PCXI wissel aansienlik tussen monsters. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6. Alle beelde wat hier getoon word, is geneem met 'n magneet wat ongeveer 10 mm direk bokant die kapillêre geleë is. Die oënskynlike groot sirkels is lugborrels wat in die kapillêre vasgevang is, wat die swart en wit randkenmerke van fasekontrasbeelding duidelik toon. Die rooi blokkie bevat die kontrasversterkende vergroting. Let daarop dat die diameters van die magneetskemas in alle figure nie volgens skaal is nie en ongeveer 100 keer groter is as wat getoon word.
Soos die magneet links en regs langs die bokant van die kapillêr getransleer word, verander die hoek van die MP-snaar om met die magneet in lyn te kom (sien Figuur 6), wat die magnetiese veldlyne afbaken. Vir MP3-5, nadat die koord 'n drempelhoek bereik, word die deeltjies langs die boonste oppervlak van die kapillêr gesleep. Dit lei dikwels daartoe dat MP's in groter groepe saamgroepeer naby waar die magnetiese veld die sterkste is (sien Aanvullende Video S3: MP5). Dit is ook veral duidelik wanneer beelde naby die kapillêre einde geneem word, wat veroorsaak dat MP's by die vloeistof-lug-koppelvlak aggregeer en konsentreer. Deeltjies in MP6, wat moeiliker was om te onderskei as MP3-5, is nie gesleep terwyl die magneet langs die kapillêr beweeg het nie, maar die MP-snare het gedissosieer, wat die deeltjies in die gesigsveld gelaat het (sien Aanvullende Video S4: MP6). In sommige gevalle, toe die toegepaste magnetiese veld verminder is deur die magneet 'n groot afstand van die beeldligging te beweeg, het enige oorblywende MP's stadig deur swaartekrag na die onderste oppervlak van die buis afgedaal terwyl hulle in die snaar gebly het (sien Aanvullende Video S5: MP3).
Die hoek van die MP-string verander soos die magneet na regs bo die kapillêr getransleer word. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6. Die rooi blokkie bevat die kontrasversterkende vergroting. Let daarop dat die aanvullende video's insiggewend is, aangesien hulle belangrike deeltjiestruktuur en dinamiese inligting openbaar wat nie in hierdie statiese beelde gevisualiseer kan word nie.
Ons toetse het getoon dat die stadige heen-en-weer beweging van die magneet langs die tragea die visualisering van MP in die konteks van komplekse beweging in vivo vergemaklik. In vivo-toetsing is nie uitgevoer nie, aangesien polistireenkrale (MP1 en MP2) nie in die kapillêr sigbaar was nie. Elk van die oorblywende vier MP's is in vivo getoets met die magneet se langas wat bo die tragea gekonfigureer is teen 'n hoek van ongeveer 30° tot die vertikaal (sien Figure 2b en 3a), aangesien dit langer MP-kettings tot gevolg gehad het en meer effektief was as die beëindigde magneetkonfigurasie. MP3, MP4 en MP6 is nie in die tragea van enige lewende diere opgespoor nie. Toe die rotlugweë afgebeeld is nadat die diere op 'n menslike wyse doodgemaak is, het die deeltjies onsigbaar gebly, selfs toe bykomende volume met 'n spuitpomp bygevoeg is. MP5 het die hoogste ysteroksiedinhoud gehad en was die enigste sigbare deeltjie, en is dus gebruik om die in vivo-gedrag van MP te bepaal en te karakteriseer.
Die plasing van die magneet oor die tragea tydens MP-aflewering het daartoe gelei dat baie, maar nie alle, MP's in die gesigsveld gekonsentreer is nie. Deeltjies wat die tragea binnedring, word die beste waargeneem in diere wat op 'n menslike wyse geoffer is. Figuur 7 en Aanvullende Video S6: MP5 toon vinnige magnetiese vaslegging en belyning van deeltjies op die oppervlak van die ventrale tragea, wat aandui dat MP's na die verlangde streke van die tragea gerig kan word. Toe meer distaal langs die tragea na MP-aflewering gesoek is, is sommige MP's nader aan die carina gevind, wat daarop dui dat die magnetiese veldsterkte onvoldoende was om alle MP's te versamel en te behou, aangesien hulle deur die gebied van maksimum magnetiese veldsterkte tydens die vloeistofproses afgelewer is. Nietemin was postpartum MP-konsentrasies hoër rondom die afgebeelde area, wat daarop dui dat baie MP's in die lugwegstreke gebly het waar die toegepaste magnetiese veldsterkte die hoogste was.
Beelde van (a) voor en (b) na aflewering van MP5 in die tragea van 'n onlangs geëuthanaseerde rot met die magneet direk bokant die beeldarea geplaas. Die afgebeelde area is tussen die twee kraakbeenringe geleë. Voor MP-aflewering is daar vloeistof in die lugweg. Die rooi blokkie bevat die kontrasversterkende vergroting. Hierdie beelde is van die video wat in Aanvullende Video S6:MP5 getoon word.
Deur die magneet in vivo langs die tragea te verskuif, het die MP-ketting van hoek binne die lugwegoppervlak verander op 'n manier soortgelyk aan dié wat in kapillêre gesien word (sien Figuur 8 en Aanvullende Video S7:MP5). In ons studie kon MP's egter nie langs die oppervlak van die lewende lugweg gesleep word soos met kapillêre nie. In sommige gevalle sal die MP-ketting langer word soos die magneet links en regs beweeg. Interessant genoeg het ons ook gevind dat die deeltjiestring die diepte van die oppervlakvloeistoflaag verander wanneer die magneet in die lengte langs die tragea beweeg word, en dit uitbrei wanneer die magneet direk bokant beweeg word en die deeltjiestring na 'n vertikale posisie geroteer word (sien Aanvullende Video S7). : MP5 om 0:09, regs onder). Die kenmerkende bewegingspatroon het verander toe die magneet lateraal oor die bokant van die tragea getransleer is (dit wil sê na links of regs van die dier eerder as langs die lengte van die tragea). Die deeltjies was steeds duidelik sigbaar terwyl hulle beweeg het, maar toe die magneet van die tragea verwyder is, het die punte van die deeltjiesnare sigbaar geword (sien Aanvullende Video S8:MP5, beginnend by 0:08). Dit stem ooreen met die MP-gedrag wat ons waargeneem het onder 'n toegepaste magnetiese veld in 'n glaskapillêr.
Voorbeeldbeelde wat MP5 in die tragea van 'n lewendige, verdoofde rot toon. (a) Die magneet word gebruik om beelde bo en links van die tragea te verkry, dan (b) nadat die magneet na regs geskuif is. Die rooi blokkie bevat die kontrasversterkende vergroting. Hierdie beelde is afkomstig van die video wat in Aanvullende Video S7:MP5 getoon word.
Toe die twee pole in 'n noord-suid-oriëntasie bo en onder die tragea gekonfigureer is (d.w.s. aantrekkend; Fig. 3b), het die MP-koorde langer voorgekom en was hulle op die sywand van die tragea geleë eerder as op die dorsale trageale oppervlak (sien Aanvullende Video S9:MP5). Hoë konsentrasies deeltjies op 'n enkele plek (d.w.s. die dorsale oppervlak van die tragea) is egter nie na vloeistoftoediening opgespoor toe 'n dubbelmagneettoestel gebruik is nie, wat tipies voorkom wanneer 'n enkelmagneettoestel gebruik word. Toe een magneet dan gekonfigureer is om die pole omgekeerd af te stoot (Fig. 3c), het die aantal deeltjies wat in die gesigsveld sigbaar was, nie na toediening toegeneem nie. Die opstelling van beide dubbelmagneetkonfigurasies is uitdagend as gevolg van die hoë magnetiese veldsterktes wat die magnete onderskeidelik trek of stoot. Die opstelling is toe verander na 'n enkele magneet parallel met die lugweg, maar wat teen 90 grade deur die lugweg beweeg sodat die veldlyne die trageale wand ortogonaal kruis (Fig. 3d), 'n oriëntasie wat ontwerp is om te bepaal of deeltjie-aggregasie op die sywand waargeneem kan word. In Met hierdie konfigurasie was daar geen identifiseerbare beweging van MP-akkumulasie of magneetbeweging nie. Gebaseer op al hierdie resultate, is 'n enkelmagneet-, 30-grade-oriëntasiekonfigurasie (Figuur 3a) gekies vir in vivo geendraerstudies.
Toe die dier herhaaldelik afgeneem is onmiddellik na menslike doodmaak, het die afwesigheid van verwarrende weefselbeweging beteken dat fyner en korter deeltjielyne in die duidelike interchondrale veld onderskei kon word, "wiebelrig" in lyn met die translasionele beweging van die magneet. Nietemin kan die teenwoordigheid en beweging van MP6-deeltjies steeds nie duidelik gesien word nie.
Die LV-LacZ-titer was 1.8 × 108 TU/ml, en na 1:1-menging met CombiMag MP (MP6) het diere 'n 50 μl trageale dosis van 9 × 107 TU/ml LV-draer (d.w.s. 4.5 × 106 TU/rot) ontvang. In hierdie studies, in plaas daarvan om die magneet tydens kraam te transleer, het ons die magneet in een posisie vasgemaak om te bepaal of LV-transduksie (a) verbeter kon word in vergelyking met vektoraflewering in die afwesigheid van 'n magnetiese veld, en (b) gefokus kon word. Lugwegselle word getransduseer na magnetiese teikengebiede van die boonste lugweg.
Die teenwoordigheid van magnete en die gebruik van CombiMag gekombineer met LV-vektore het nie nadelige gevolge vir dieregesondheid gehad nie, soos ook ons ​​standaard LV-vektor-afleweringsprotokol. Frontale beelde van die trageale gebied wat aan meganiese versteuring onderwerp is (Aanvullende Fig. 1) het aangedui dat daar beduidend hoër vlakke van transduksie was in die groep diere wat met LV-MP behandel is toe die magneet teenwoordig was (Fig. 9a). Slegs 'n klein hoeveelheid blou LacZ-kleuring was teenwoordig in die kontrolegroep (Fig. 9b). Kwantifisering van genormaliseerde X-Gal-gekleurde areas het getoon dat toediening van LV-MP in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld 'n ongeveer 6-voudige verbetering tot gevolg gehad het (Fig. 9c).
Voorbeeld saamgestelde beelde wat trageale transduksie deur LV-MP toon (a) in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld en (b) in die afwesigheid van 'n magneet. (c) Statisties beduidende verbetering in genormaliseerde LacZ-transduksie-area binne die tragea wanneer die magneet gebruik word (*p = 0.029, t-toets, n = 3 per groep, gemiddelde ± SEM).
Neutrale vinnig rooi-gekleurde snitte (voorbeeld getoon in Aanvullende Fig. 2) het LacZ-gekleurde selle getoon wat in 'n soortgelyke patroon en ligging teenwoordig was as voorheen gerapporteer.
'n Belangrike uitdaging vir lugweg-geenterapie bly die akkurate lokalisering van draerdeeltjies na streke van belang en die bereiking van hoë vlakke van transduksie-doeltreffendheid in die bewegende long in die teenwoordigheid van lugvloei en aktiewe slymopruiming. Vir LV-draers wat ontwerp is om CF-lugwegsiekte te behandel, was die verhoging van die verblyftyd van draerdeeltjies binne die geleidende lugweë 'n tot dusver ontwykende doelwit. Soos deur Castellani et al. uitgewys, het die gebruik van magnetiese velde om transduksie te verbeter voordele in vergelyking met ander geen-afleweringsmetodes soos elektroporasie, aangesien dit eenvoud, koste-effektiwiteit, afleweringslokalisering, verhoogde doeltreffendheid en korter inkubasietye, en moontlik 'n kleiner draerdosis10, kan kombineer. Die in vivo-afsetting en gedrag van magnetiese deeltjies in die lugweë onder die invloed van eksterne magnetiese kragte is egter nog nooit beskryf nie, en die uitvoerbaarheid van hierdie metode is ook nie in vivo gedemonstreer om geen-ekspressievlakke in intakte lewende lugweë te verbeter nie.
Ons in vitro sinchrotron PCXI-eksperimente het getoon dat alle deeltjies wat ons getoets het, met die uitsondering van polistireen MP, sigbaar was in die beeldopstelling wat ons gebruik het. In die teenwoordigheid van 'n magneetveld vorm MP's stringe waarvan die lengtes verband hou met deeltjietipe en magnetiese veldsterkte (d.w.s. nabyheid en beweging van die magneet). Soos getoon in Figuur 10, word die stringe wat ons waarneem gevorm deurdat elke individuele deeltjie gemagnetiseer word en sy eie plaaslike magneetveld veroorsaak. Hierdie afsonderlike velde veroorsaak dat ander soortgelyke deeltjies saamsmelt en verbind, met groepstringagtige bewegings as gevolg van plaaslike kragte van die plaaslike aantrekkings- en afstotingskragte van ander deeltjies.
Skematiese voorstelling van (a, b) deeltjietreine wat binne vloeistofgevulde kapillêre en (c, d) luggevulde tragea gegenereer word. Let daarop dat die kapillêre en tragea nie volgens skaal geteken is nie. Paneel (a) bevat ook 'n beskrywing van die MP, wat Fe3O4-deeltjies bevat wat in stringe gerangskik is.
Toe die magneet bo die kapillêr beweeg is, het die hoek van die deeltjiestring 'n kritieke drempel bereik vir MP3-5 wat Fe3O4 bevat, waarna die deeltjiestring nie meer in die oorspronklike posisie gebly het nie, maar langs die oppervlak na 'n nuwe posisie beweeg het.magneet.Hierdie effek sal waarskynlik voorkom omdat die glaskapillêroppervlak glad genoeg is om hierdie beweging toe te laat.Interessant genoeg het MP6 (CombiMag) nie so opgetree nie, moontlik omdat die deeltjies kleiner was, verskillende bedekkings of oppervlakladings gehad het, of 'n eie draervloeistof hul vermoë om te beweeg, beïnvloed het.Die beeldkontras van CombiMag-deeltjies is ook swakker, wat daarop dui dat die vloeistof en deeltjies soortgelyke digthede kan hê en dus nie maklik na mekaar toe beweeg nie.Deeltjies kan ook vassteek as die magneet te vinnig beweeg, wat aandui dat die magneetveldsterkte nie altyd die wrywing tussen deeltjies in die vloeistof kan oorkom nie, wat daarop dui dat dit miskien nie verbasend is dat die magneetveldsterkte en die afstand tussen die magneet en die teikenarea baie belangrik is nie.Saamgevat dui hierdie resultate ook daarop dat, terwyl magnete baie MP's kan vasvang wat deur die teikenarea vloei, dit onwaarskynlik is dat daar op magnete staatgemaak kan word om te beweeg. CombiMag-deeltjies langs die oppervlak van die tragea. Daarom kom ons tot die gevolgtrekking dat in vivo LV-MP-studies statiese magnetiese velde moet gebruik om spesifieke streke van die lugwegboom fisies te teiken.
Wanneer deeltjies in die liggaam afgelewer word, is dit moeilik om hulle te identifiseer in die konteks van komplekse bewegende liggaamsweefsel, maar die vermoë om hulle op te spoor, is verbeter deur die magneet horisontaal bo die tragea te verskuif om die MP-snare te "wikkel". Alhoewel lewendige beeldvorming moontlik is, is dit makliker om deeltjiebeweging te onderskei sodra die dier op 'n menslike wyse doodgemaak is. MP-konsentrasies was oor die algemeen die hoogste op hierdie plek toe die magneet bo die beeldarea geplaas was, hoewel sommige deeltjies gewoonlik verder langs die tragea gevind is. In teenstelling met in vitro-studies, kan deeltjies nie langs die tragea gesleep word deur die magneet te verskuif nie. Hierdie bevinding stem ooreen met hoe die slym wat die oppervlak van die tragea bedek, tipies ingeasemde deeltjies verwerk, hulle in die slym vasvang en vervolgens deur die mukosiliêre klaringmeganisme skoongemaak word.
Ons het gehipotetiseer dat die gebruik van magnete vir aantrekkingskrag bo en onder die tragea (Fig. 3b) moontlik 'n meer eenvormige magnetiese veld tot gevolg kan hê, eerder as 'n magnetiese veld wat op een punt hoogs gekonsentreerd is, wat moontlik tot 'n meer eenvormige verspreiding van deeltjies kan lei. Ons voorlopige studie het egter geen duidelike bewyse gevind om hierdie hipotese te ondersteun nie. Net so het die konfigurasie van 'n paar magnete om af te weer (Fig. 3c) nie tot meer deeltjieafsetting in die afgebeelde area gelei nie. Hierdie twee bevindinge toon dat die dubbelmagneetopstelling nie die plaaslike beheer van MP-teikening beduidend verbeter nie, en dat die gevolglike sterk magnetiese kragte moeilik is om te konfigureer, wat hierdie benadering minder prakties maak. Net so het die oriëntasie van die magneet bo en deur die tragea (Fig. 3d) ook nie die aantal deeltjies wat in die afgebeelde area behoue ​​bly, verhoog nie. Sommige van hierdie alternatiewe konfigurasies is moontlik nie suksesvol nie, want dit lei tot laer magnetiese veldsterktes binne die afsettingsarea. Daarom word die enkele 30-grade hoekmagneetkonfigurasie (Figuur 3a) as die maklikste en doeltreffendste metode vir in vivo-toetsing beskou.
Die LV-MP-studie het getoon dat wanneer LV-vektore met CombiMag gekombineer en na fisiese versteuring in die teenwoordigheid van 'n magnetiese veld afgelewer is, transduksievlakke in die tragea beduidend verhoog is in vergelyking met die kontroles. Gebaseer op die sinkrotronbeeldstudies en LacZ-resultate, was die magnetiese veld blykbaar in staat om die LV binne die tragea te bewaar en die aantal vektordeeltjies wat onmiddellik diep in die long binnegedring het, te verminder. Sulke teikenverbeterings kan lei tot hoër doeltreffendheid terwyl afgelewerde titers, transduksie buite die teiken, inflammatoriese en immuun newe-effekte, en geendraerkoste verminder word. Dit is belangrik dat CombiMag volgens die vervaardiger saam met ander geenoordragmetodes gebruik kan word, insluitend met ander virale vektore (soos AAV) en nukleïensure.