Tak for dit besøg på Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset understøttelse af CSS. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller slår kompatibilitetstilstand fra i Internet Explorer). I mellemtiden vil vi for at sikre fortsat understøttelse vise webstedet uden stilarter og JavaScript.
Genvektorer til behandling af cystisk fibrose i lungerne bør målrette de ledende luftveje, fordi perifer lungetransduktion ikke giver terapeutisk fordel. Viral transduktionseffektivitet er direkte relateret til vektorens opholdstid. Imidlertid diffunderer leveringsvæsker, såsom genbærere, naturligt ind i alveolerne under inspiration, og terapeutiske partikler af enhver form fjernes hurtigt ved mucociliær transport. Det er vigtigt, men vanskeligt at forlænge opholdstiden for genbærere i luftvejene. Genbærerkonjugerede magnetiske partikler, der kan rettes mod overfladen af ​​luftvejene, kan forbedre regional målretning. På grund af udfordringerne ved in vivo-visualisering er opførslen af ​​sådanne små magnetiske partikler på luftvejsoverfladen i nærvær af et påført magnetfelt dårligt forstået. Formålet med denne undersøgelse var at bruge synkrotronbilleddannelse til at visualisere in vivo-bevægelsen af ​​en række magnetiske partikler i luftrøret hos bedøvede rotter for at undersøge dynamikken og mønstrene af individuelle og bulkpartikeladfærd in vivo. Vi vurderede derefter også, om levering af lentivirale magnetiske partikler i nærvær af et magnetfelt ville øge transduktionseffektiviteten hos rotten. luftrør. Synkrotronrøntgenbilleddannelse afslører magnetiske partiklers opførsel i stationære og bevægelige magnetfelter in vitro og in vivo. Partikler kan ikke let trækkes langs overfladen af ​​den levende luftvej med magneter, men under transport koncentreres aflejringerne i det synsfelt, hvor magnetfeltet er stærkest. Transduktionseffektiviteten blev også seksdoblet, når lentivirale magnetiske partikler blev leveret i nærvær af et magnetfelt. Samlet set tyder disse resultater på, at lentivirale magnetiske partikler og magnetfelter kan være værdifulde tilgange til at forbedre genvektormålretning og øge transduktionsniveauer i ledende luftveje in vivo.
Cystisk fibrose (CF) skyldes variation i et enkelt gen kaldet CF transmembrane conductance regulator (CFTR). CFTR-proteinet er en ionkanal, der findes i mange epitelceller i hele kroppen, herunder de ledende luftveje, et vigtigt sted for CF-patogenese. CFTR-defekter fører til unormal vandtransport, hvilket dehydrerer luftvejsoverfladen og reducerer dybden af ​​​​luftvejsoverfladevæskelaget (ASL). Dette forringer også mucociliærtransportsystemets (MCT) evne til at fjerne inhalerede partikler og patogener fra luftvejene. Vores mål er at udvikle en lentiviral (LV) genterapi til at levere den korrekte kopi af CFTR-genet og forbedre ASL-, MCT- og lungesundheden samt at fortsætte med at udvikle nye teknologier, der er i stand til at måle disse parametre in vivo1.
LV-vektorer er en af ​​de førende kandidater til genterapi mod CF-luftveje, primært fordi de permanent kan integrere det terapeutiske gen i luftvejsbasalcellerne (luftvejsstamceller). Dette er vigtigt, fordi de kan genoprette normal hydrering og slimfjernelse ved at differentiere til funktionelle genkorrigerede CF-associerede luftvejsoverfladeceller, hvilket resulterer i livslange fordele. LV-vektorer bør rettes mod den ledende luftvej, da det er her, CF-lungesygdom begynder. Levering af vektoren dybere ned i lungen kan resultere i alveolær transduktion, men dette har ingen terapeutisk fordel ved CF. Væsker såsom genbærere migrerer dog naturligt til alveolerne ved inspiration efter levering3,4, og terapeutiske partikler fjernes hurtigt i mundhulen ved MCT. LV-transduktionseffektiviteten er direkte relateret til den tid, vektoren forbliver ved siden af ​​målcellerne for at tillade cellulær optagelse - "opholdstiden"5 - som let reduceres ved typisk regional luftstrøm samt koordineret partikelslimindfangning og MCT. For CF er evnen til at forlænge LV'ens opholdstid i luftvejene vigtig for at opnå høje niveauer af transduktion i denne region, men har indtil videre været udfordrende.
For at overvinde denne hindring foreslår vi, at LV-magnetiske partikler (MP'er) kan hjælpe på to komplementære måder. For det første kan de magnetisk styres til luftvejsoverfladen for at forbedre målretningen og hjælpe genbærerpartiklerne med at opholde sig i det ønskede luftvejsområde; og ASL) for at bevæge sig til cellelag 6. MP'er er blevet brugt i vid udstrækning som målrettede lægemiddelafgivelsesvehikler, når de binder sig til antistoffer, kemoterapeutiske lægemidler eller andre små molekyler, der binder sig til cellemembraner eller binder sig til relevante celleoverfladereceptorer og akkumuleres på tumorsteder i nærvær af statisk elektricitet. Magnetiske felter til kræftbehandling 7. Andre "hypertermiske" teknikker sigter mod at opvarme MP'er, når de udsættes for oscillerende magnetfelter, hvorved tumorceller ødelægges. Princippet for magnetisk transfektion, hvor et magnetfelt bruges som et transfektionsmiddel til at forbedre overførslen af ​​DNA til celler, anvendes almindeligvis in vitro ved hjælp af en række ikke-virale og virale genvektorer til vanskeligt transducerede cellelinjer. Effektiviteten af ​​LV-magnetotransfektion er blevet fastslået, hvor in vitro-levering af LV-MP'er til en human bronkial epitelcellelinje i nærvær af et statisk magnetfelt øger transduktionseffektiviteten med 186 gange sammenlignet med LV-vektor alene. LV-MP er også blevet anvendt på en in vitro CF-model, hvor magnetisk transfektion øgede LV-transduktion i luft-væske-grænsefladekulturer med 20 gange i nærvær af CF-sputum10. Imidlertid har in vivo-magnetotransfektion af organer fået relativt lidt opmærksomhed og er kun blevet evalueret i et par dyreforsøg. studier11,12,13,14,15, især i lungerne16,17. Ikke desto mindre er mulighederne for magnetisk transfektion i CF-lungebehandling klare. Tan et al. (2020) udtalte, at "et proof-of-concept-studie af effektiv pulmonal levering af magnetiske nanopartikler vil bane vejen for fremtidige CFTR-inhalationsstrategier til at forbedre kliniske resultater hos CF-patienter"6.
Små magnetiske partiklers opførsel på luftvejsoverflader i nærvær af et påført magnetfelt er vanskelig at visualisere og studere og derfor dårligt forstået. I andre studier udviklede vi en synkrotronudbredelsesbaseret fasekontrast-røntgenbilleddannelsesmetode (PB-PCXI) til ikke-invasivt at visualisere og kvantificere små in vivo-ændringer i ASL-dybde18 og MCT-adfærd19,20 for direkte at måle gaskanaloverfladehydrering og bruge den som en tidlig indikator for behandlingseffektivitet. Derudover bruger vores MCT-evalueringsmetode partikler med en diameter på 10-35 µm bestående af aluminiumoxid eller glas med højt brydningsindeks som MCT-markører, der er synlige ved hjælp af PB-PCXI21. Begge teknikker er egnede til visualisering af en række partikeltyper, herunder MP.
På grund af dens høje rumlige og tidsmæssige opløsning er vores PB-PCXI-baserede ASL- og MCT-analyseteknikker velegnede til at undersøge dynamikken og mønstrene af enkelt- og bulkpartikeladfærd in vivo for at hjælpe os med at forstå og optimere MP-genafgivelsesteknikker. Den tilgang, vi anvender her, stammer fra vores studier, der bruger SPring-8 BL20B2-strålelinjen, hvor vi visualiserede væskebevægelse efter sham-vektordosisafgivelse i musenes nasale og pulmonale luftveje for at hjælpe med at forklare vores ikke-ensartede genekspressionsmønstre observeret i vores dyrestudier med genbærerdosis 3,4.
Formålet med denne undersøgelse var at bruge synkrotronen PB-PCXI til at visualisere in vivo-bevægelserne af en række MP'er i luftrøret hos levende rotter. Disse PB-PCXI-billeddannelsesundersøgelser blev designet til at teste en række MP'er, magnetfeltstyrker og placeringer for at bestemme deres effekt på MP-bevægelse. Vi fremsatte den hypotese, at et eksternt påført magnetfelt ville hjælpe den leverede MP med at forblive eller bevæge sig til målområdet. Disse undersøgelser tillod os også at identificere magnetkonfigurationer, der maksimerer antallet af partikler, der tilbageholdes i luftrøret efter aflejring. I en anden serie af undersøgelser søgte vi at bruge denne optimale konfiguration til at demonstrere transduktionsmønsteret som følge af in vivo-levering af LV-MP'er til rotteluftvejene, baseret på antagelsen om, at levering af LV-MP'er i forbindelse med luftvejsmålretning ville resultere i forbedret LV-transduktionseffektivitet.
Alle dyreforsøg blev udført i henhold til protokoller godkendt af University of Adelaide (M-2019-060 og M-2020-022) og SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Forsøgene blev udført i henhold til ARRIVE-retningslinjerne.
Al røntgenbilleddannelse blev udført ved BL20XU-strålelinjen ved SPring-8-synkrotronen i Japan ved hjælp af en opsætning svarende til den, der tidligere er beskrevet21,22. Kort fortalt var forsøgsboksen placeret 245 m fra synkrotronopbevaringsringen. En afstand mellem prøve og detektor på 0,6 m anvendes til partikelbilleddannelsesundersøgelser og 0,3 m til in vivo-billeddannelsesundersøgelser for at generere fasekontrasteffekter. Der blev anvendt en monokromatisk stråleenergi på 25 keV. Billeder blev taget ved hjælp af en røntgenkonverter med høj opløsning (SPring-8 BM3) koblet til en sCMOS-detektor. Konverteren konverterer røntgenstråler til synligt lys ved hjælp af en 10 µm tyk scintillator (Gd3Al2Ga3O12), som derefter rettes mod en sCMOS-sensor ved hjælp af et × 10 mikroskopobjektiv (NA 0.3). sCMOS-detektoren var Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) med en arraystørrelse på 2048 × 2048 pixels og en rå pixelstørrelse på 6,5 × 6,5 µm. Denne opsætning giver en effektiv isotropisk pixelstørrelse på 0,51 µm og et synsfelt på cirka 1,1 mm × 1,1 mm. En eksponeringslængde på 100 ms blev valgt for at maksimere signal-støj-forholdet for magnetiske partikler i og uden for luftvejene, samtidig med at vejrtrækningsinducerede bevægelsesartefakter blev minimeret. Til in vivo-studier blev en hurtig røntgenlukker placeret i røntgenbanen for at begrænse strålingsdosis ved at blokere røntgenstrålen mellem eksponeringer.
LV-bæreren blev ikke brugt i nogen SPring-8 PB-PCXI-billedundersøgelser, fordi BL20XU-billedkammeret ikke er certificeret på biosikkerhedsniveau 2. I stedet valgte vi en række velkarakteriserede mikroplaster fra to kommercielle leverandører – der dækker en række størrelser, materialer, jernkoncentrationer og anvendelser – først for at forstå, hvordan magnetfelter påvirker mikroplasterbevægelse i glaskapillærer og derefter i levende luftveje. på overfladen. MP'er varierer i størrelse fra 0,25 til 18 μm og er lavet af en række forskellige materialer (se tabel 1), men sammensætningen af ​​hver prøve, inklusive størrelsen af ​​de magnetiske partikler i MP'en, er ukendt. Baseret på vores omfattende MCT-studier 19, 20, 21, 23, 24 forventer vi, at MP'er så små som 5 μm kan ses på luftvejens overflade, for eksempel ved at trække fortløbende billeder fra hinanden for at se forbedret synlighed af MP'ens bevægelse. En enkelt MP på 0,25 μm er mindre end billeddannelsesenhedens opløsning, men PB-PCXI forventes at detektere deres volumenkontrast og bevægelsen af ​​den overfladevæske, som de aflejres på efter aflejring.
Prøver for hver MP i tabel 1 blev fremstillet i 20 μl glaskapillærer (Drummond Microcaps, PA, USA) med en indre diameter på 0,63 mm. Korpuskulære partikler er tilgængelige i vand, mens CombiMag-partikler er tilgængelige i producentens proprietære væske. Hvert rør er halvt fyldt med væske (ca. 11 μl) og placeret på prøveholderen (se figur 1). Glaskapillærerne blev placeret vandret på prøvebordet i billeddannelsesboksen og placeret i væskens kanter. En 19 mm diameter (28 mm lang) nikkelskal-sjælden jordarts-neodym-jernbor (NdFeB) magnet (N35, kat. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) med en restmagnetisering på 1,17 Tesla blev fastgjort til et separat translationsbord for at opnå en fjernændring af dens position under billeddannelse. Røntgenbilledoptagelse begynder, når magneten er placeret ca. 30 mm over prøven, og billeder optages med en hastighed på 4 billeder pr. sekund. Under billeddannelse blev magneten bragt tæt på glaskapillarrøret (ca. 1 mm væk) og derefter transleret langs røret for at vurdere virkningerne af feltstyrke og position.
In vitro-billeddannelsesopsætning indeholdende MP-prøver i glaskapillærer på prøvens xy-translationstrin. Røntgenstrålens bane er markeret med en rød stiplet linje.
Når in vitro-synligheden af ​​MP'er var fastslået, blev en delmængde af dem testet in vivo i vildtype hun-albino Wistar-rotter (~12 uger gamle, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) og 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Rotter blev bedøvet med en blanding af Pharma (Pharma), Japan) ved intraperitoneal injektion. Efter anæstesi blev de forberedt til billeddannelse ved at fjerne pelsen omkring luftrøret, indsætte et endotrakealt rør (ET; 16 Ga iv kanyle, Terumo BCT) og immobilisere dem liggende på en specialfremstillet billedplade indeholdende en termisk pose for at opretholde kropstemperaturen 22. Billedpladen blev derefter fastgjort til prøvetranslationsbordet i billedboksen i en lille vinkel for at justere luftrøret vandret i røntgenbilledet, som vist i figur 2a.
(a) In vivo-billeddannelsesopsætning i SPring-8-billeddannelsesboksen, røntgenstrålens bane er markeret med en rød stiplet linje. (b, c) Magnetlokalisering på luftrøret blev udført eksternt ved hjælp af to ortogonalt monterede IP-kameraer. På venstre side af skærmbilledet kan man se trådsløjfen, der holder hovedet, og leveringskanylen på plads i ET-røret.
Et fjernstyret sprøjtepumpesystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) med en 100 μl glassprøjte blev forbundet til et PE10-rør (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) via en 30 Ga nål. Marker røret for at sikre, at spidsen er i den korrekte position i luftrøret, når ET-røret indsættes. Ved hjælp af mikropumpen blev sprøjtestemplet trukket tilbage, mens spidsen af ​​røret var nedsænket i MP-prøven, der skulle afgives. Det fyldte afgivelsesrør blev derefter indsat i endotrakealtuben, hvor spidsen blev placeret inden for den stærkeste del af vores forventede påførte magnetfelt. Billedoptagelse blev styret ved hjælp af en respirationsdetektor forbundet til vores Arduino-baserede timingboks, og alle signaler (f.eks. temperatur, respiration, lukkeråbning/lukning og billedoptagelse) blev optaget ved hjælp af Powerlab og LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) 22. Ved billeddannelse Da kabinettet var utilgængeligt, blev to IP-kameraer (Panasonic BB-SC382) placeret ca. 90° i forhold til hinanden og blev brugt til at overvåge positionen af magnet i forhold til luftrøret under billeddannelse (fig. 2b, c). For at minimere bevægelsesartefakter blev der optaget ét billede pr. åndedrag under sluttidestrømningsplateauet.
En magnet er fastgjort til et andet trin, der kan placeres eksternt fra ydersiden af ​​billeddannelseshuset. Forskellige magnetpositioner og -konfigurationer blev testet, herunder: Monteret i en vinkel på cirka 30° over luftrøret (konfigurationer vist i figur 2a og 3a); én magnet over dyret og den anden nedenunder, med polerne indstillet til at tiltrække (figur 3b); én magnet over dyret og den anden nedenunder, med polerne indstillet til at frastøde (figur 3c); og én magnet over og vinkelret på luftrøret (figur 3d). Når dyret og magneten er konfigureret, og den MP, der skal testes, er fyldt i sprøjtepumpen, afgives en dosis på 50 μl med en hastighed på 4 μl/sek, mens der optages billeder. Magneten bevæges derefter frem og tilbage langs eller lateralt på tværs af luftrøret, mens der fortsat optages billeder.
Magnetkonfiguration til in vivo-billeddannelse (a) en enkelt magnet over luftrøret i en vinkel på cirka 30°, (b) to magneter indstillet til at tiltrække, (c) to magneter indstillet til at frastøde, (d) en enkelt magnet over og vinkelret i luftrøret. Observatøren kiggede ned fra munden til lungerne gennem luftrøret, og røntgenstrålen passerede gennem rottens venstre side og forlod højre side. Magneten bevæges enten langs luftvejens længde eller til venstre og højre over luftrøret i retning af røntgenstrålen.
Vi søgte også at bestemme synligheden og opførslen af ​​partikler i luftvejene i fravær af forstyrrende vejrtrækning og hjertebevægelser. Derfor blev dyrene ved afslutningen af ​​billeddannelsesperioden humant aflivet for overdosis af pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Nogle dyr blev efterladt på billeddannelsesplatformen, og når vejrtrækning og hjerteslag stoppede, blev billeddannelsesprocessen gentaget, hvor en yderligere dosis MP blev tilføjet, hvis der ikke var nogen synlig MP på luftvejsoverfladen.
De optagne billeder blev fladfelt- og mørkfeltkorrigeret og derefter samlet til en film (20 billeder pr. sekund; 15-25 × normal hastighed afhængigt af respirationsfrekvens) ved hjælp af et brugerdefineret script skrevet i MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle studier af LV-genvektorlevering blev udført på Laboratory Animal Research Facility ved University of Adelaide og havde til formål at bruge resultaterne af SPring-8-eksperimentet til at vurdere, om LV-MP-levering i nærvær af et magnetfelt kunne forbedre genoverførslen in vivo. For at vurdere virkningerne af MP og magnetfelt blev to grupper af dyr behandlet: én gruppe fik LV-MP med en magnet placeret, og den anden gruppe modtog en kontrolgruppe med LV-MP uden magnet.
LV-genvektorer blev genereret ved hjælp af tidligere beskrevne metoder 25, 26. LacZ-vektoren udtrykker det nuklearlokaliserede beta-galactosidase-gen drevet af den konstitutive MPSV-promotor (LV-LacZ), som producerer et blåt reaktionsprodukt i transducerede celler, synligt i lungevævsfronter og vævssektioner. Titrering blev udført i cellekulturer ved manuelt at tælle antallet af LacZ-positive celler med et hæmocytometer for at beregne titeren i TU/ml. Bærerne kryopræserveres ved -80 °C, optøs før brug og bindes til CombiMag ved blanding i et 1:1-forhold og inkubering på is i mindst 30 minutter før levering.
Normale Sprague Dawley-rotter (n = 3/gruppe, ~2-3 blev bedøvet intraperitonealt med en blanding af 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) og 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australien) (ip) injektion og ikke-kirurgisk oral kanylering med en 16 Ga iv-kanyle. For at sikre, at det trakeale luftvejsvæv modtager LV-transduktion, blev det konditioneret ved hjælp af vores tidligere beskrevne mekaniske perturbationsprotokol, hvor den trakeale luftvejsoverflade blev gnidet aksialt med en trådkurv (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s-28. Trakeal administration af LV-MP blev derefter udført i et biologisk sikkerhedsskab cirka 10 minutter efter perturbation.
Magnetfeltet, der blev anvendt i dette eksperiment, blev konfigureret på en lignende måde som in vivo røntgenbilleddannelsesundersøgelsen, med de samme magneter holdt over luftrøret ved hjælp af destillationsstentklemmer (figur 4). Et 50 μl volumen (2 × 25 μl aliquoter) LV-MP blev leveret til luftrøret (n = 3 dyr) ved hjælp af en pipette indeholdende en gelspids som tidligere beskrevet. En kontrolgruppe (n = 3 dyr) modtog de samme LV-MP'er uden brug af en magnet. Efter infusionen er afsluttet, fjernes kanylen fra ET-røret, og dyret ekstuberes. Magneten forbliver på plads i 10 minutter, hvorefter den fjernes. Rotter modtog en subkutan dosis meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australien) efterfulgt af reversering af anæstesi ved ip-injektion af 1 mg/kg atipamazolhydrochlorid (Antisedan, Zoetis, Australien). Rotter blev holdt varme og overvåget indtil fuld restitution fra anæstesi.
LV-MP-afgivelsesanordning i et biologisk sikkerhedsskab. Den lysegrå Luer-hub på ET-røret kan ses stikke ud fra munden, og gelspidsen på pipetten, som vist på billedet, indsættes gennem ET-røret til den ønskede dybde ned i luftrøret.
En uge efter LV-MP-doseringsproceduren blev dyrene humant aflivet ved 100% CO2-inhalation, og LacZ-ekspressionen blev vurderet ved hjælp af vores standard X-gal-behandling. De tre kaudale, mest bruskagtige ringe blev fjernet for at sikre, at enhver mekanisk skade eller væskeretention fra placering af endotrakealtuber ikke blev inkluderet i analysen. Hver luftrør blev skåret på langs for at skabe to halvdele til analyse, og de blev monteret i en skål indeholdende silikonegummi (Sylgard, Dow Inc) ved hjælp af en Minutien-nål (Fine Science Tools) for at visualisere den luminale overflade. Fordelingen og mønsteret af transducerede celler blev bekræftet ved frontal fotografering ved hjælp af et Nikon-mikroskop (SMZ1500) med et DigiLite-kamera og TCapture-software (Tucsen Photonics, Kina). Billeder blev erhvervet ved 20x forstørrelse (inklusive den højeste indstilling for luftrørets fulde bredde), hvor hele luftrørets længde blev afbildet trin for trin, hvilket sikrede tilstrækkelig overlapning mellem hvert billede til at muliggøre billed-"sammensyning". Billeder fra hver luftrør blev derefter samlet i et enkelt sammensat billede ved hjælp af Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) med en plan bevægelsesalgoritme. LacZ-ekspressionsområder i sammensatte billeder af luftrøret fra hvert dyr blev kvantificeret ved hjælp af et automatiseret MATLAB-script (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet, med indstillinger på 0,35 < farvetone < 0,58, mætning > 0,15 og værdi < 0,7. Ved at tegne vævets konturer blev en maske manuelt genereret i GIMP v2.10.24 for hvert sammensat billede for at identificere vævsområdet og forhindre falske detektioner udefra det trakeale væv. De farvede områder fra alle sammensatte billeder fra hvert dyr blev summeret for at generere det samlede farvede område for det pågældende dyr. Det farvede område blev derefter divideret med det samlede maskeområde for at generere det normaliserede område.
Hvert luftrør blev indlejret i paraffin, og 5 μm snit blev skåret. Snittene blev modfarvet med neutral fast red i 5 minutter, og billeder blev erhvervet ved hjælp af et Nikon Eclipse E400-mikroskop, DS-Fi3-kamera og NIS-elementoptagelsessoftware (version 5.20.00).
Alle statistiske analyser blev udført i GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistisk signifikans blev sat til p ≤ 0,05. Normaliteten blev verificeret ved hjælp af Shapiro-Wilk-testen, og forskelle i LacZ-farvning blev vurderet ved hjælp af den uparrede t-test.
De seks MP'er beskrevet i tabel 1 blev undersøgt ved hjælp af PCXI, og synligheden er beskrevet i tabel 2. To polystyren MP'er (MP1 og MP2; henholdsvis 18 μm og 0,25 μm) var ikke synlige under PCXI, men resten af ​​prøverne var identificerbare (eksempler er vist i figur 5). MP3 og MP4 (10-15% Fe3O4; henholdsvis 0,25 μm og 0,9 μm) er svagt synlige. Selvom de indeholdt nogle af de mindste testede partikler, var MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) den mest udtalte. CombiMag-produktet MP6 er svært at få øje på. I alle tilfælde blev vores evne til at detektere MP betydeligt forbedret ved at transmittere magneten frem og tilbage parallelt med kapillærrøret. Da magneterne bevægede sig væk fra kapillærrøret, strakte partiklerne sig i lange strenge, men efterhånden som magneterne kom tættere på, og magnetfeltstyrken steg, blev partikelstrengene forkortet, da partiklerne migrerede mod kapillærrørets overflade (se supplerende video S1: MP4), hvilket øgede... partikeldensiteten på overfladen. Omvendt, når magneten fjernes fra kapillærrøret, falder feltstyrken, og MP'erne omorganiseres til lange strenge, der strækker sig fra kapillærrørets øvre overflade (se Supplerende Video S2: MP4). Når magneten holder op med at bevæge sig, fortsætter partiklerne med at bevæge sig i kort tid efter at have nået ligevægtspositionen. Når MP'en bevæger sig mod og væk fra kapillærrørets øvre overflade, trækker de magnetiske partikler typisk affaldet gennem væsken.
Synligheden af ​​MP under PCXI varierer betydeligt mellem prøverne. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6. Alle billeder vist her blev taget med en magnet placeret ca. 10 mm direkte over kapillærrøret. De tilsyneladende store cirkler er luftbobler fanget i kapillærerne, hvilket tydeligt viser de sort-hvide kantfunktioner i fasekontrastbilleddannelse. Den røde boks indeholder den kontrastforstærkende forstørrelse. Bemærk, at diametrene af magnetdiagrammerne i alle figurer ikke er i målestoksforhold og er ca. 100 gange større end vist.
Når magneten bevæges til venstre og højre langs toppen af ​​kapillærrøret, ændres vinklen på MP-strengen for at justere den med magneten (se figur 6), hvilket afgrænser magnetfeltlinjerne. For MP3-5, efter at korden når en tærskelvinkel, trækkes partiklerne langs kapillærrørets overflade. Dette resulterer ofte i, at MP'er klynger sig sammen i større grupper tæt på, hvor magnetfeltet er stærkest (se supplerende video S3: MP5). Dette er også særligt tydeligt ved billeddannelse tæt på kapillærenden, hvilket får MP'er til at aggregere og koncentrere sig ved væske-luft-grænsefladen. Partikler i MP6, som var vanskeligere at skelne end MP3-5, blev ikke trukket, når magneten bevægede sig langs kapillærrøret, men MP-strengene dissocierede, hvilket efterlod partiklerne i synsfeltet (se supplerende video S4: MP6). I nogle tilfælde, når det påførte magnetfelt blev reduceret ved at flytte magneten en stor afstand fra billedplaceringen, faldt eventuelle resterende MP'er langsomt ned til rørets bundflade ved hjælp af tyngdekraften, mens de forblev i strengen (se supplerende video S5: MP3).
Vinklen på MP-strengen ændrer sig, når magneten bevæges til højre over kapillærrøret. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6. Den røde boks indeholder den kontrastforstærkende forstørrelse. Bemærk, at de supplerende videoer er informative, da de afslører vigtig partikelstruktur og dynamisk information, som ikke kan visualiseres i disse statiske billeder.
Vores test viste, at langsom bevægelse af magneten frem og tilbage langs luftrøret letter visualiseringen af ​​MP i forbindelse med kompleks bevægelse in vivo. In vivo-test blev ikke udført, da polystyrenkugler (MP1 og MP2) ikke var synlige i kapillærrøret. Hver af de resterende fire MP'er blev testet in vivo med magnetens lange akse konfigureret over luftrøret i en vinkel på ca. 30° i forhold til lodret (se figur 2b og 3a), da dette resulterede i længere MP-kæder og var mere effektivt end magnetkonfigurationen, der var afsluttet. MP3, MP4 og MP6 blev ikke detekteret i luftrøret hos nogen levende dyr. Da rotteluftvejene blev afbildet, efter at dyrene var blevet aflivet humant, forblev partiklerne usynlige, selv når yderligere volumen blev tilføjet ved hjælp af en sprøjtepumpe. MP5 havde det højeste jernoxidindhold og var den eneste synlige partikel og blev derfor brugt til at vurdere og karakterisere MP's in vivo-adfærd.
Placering af magneten over luftrøret under MP-levering resulterede i, at mange, men ikke alle, MP'er blev koncentreret i synsfeltet. Partikler, der trænger ind i luftrøret, observeres bedst hos dyr, der er blevet aflivet humant. Figur 7 og supplerende video S6: MP5 viser hurtig magnetisk indfangning og justering af partikler på overfladen af ​​den ventrale luftrør, hvilket indikerer, at MP'er kan rettes mod de ønskede områder af luftrøret. Ved søgning mere distalt langs luftrøret efter MP-levering blev nogle MP'er fundet tættere på carina, hvilket tyder på, at magnetfeltstyrken var utilstrækkelig til at opsamle og tilbageholde alle MP'er, da de blev leveret gennem området med maksimal magnetfeltstyrke under væskeprocessen. Ikke desto mindre var postpartum MP-koncentrationerne højere omkring det afbildede område, hvilket tyder på, at mange MP'er forblev i de luftvejsområder, hvor den påførte magnetfeltstyrke var højest.
Billeder fra (a) før og (b) efter levering af MP5 i luftrøret hos en nyligt aflivet rotte med magneten placeret direkte over billedområdet. Det billedbehandlede område er placeret mellem de to bruskringe. Før levering af MP er der væske i luftvejene. Den røde boks indeholder den kontrastforstærkende forstørrelse. Disse billeder er fra videoen vist i Supplerende Video S6:MP5.
At magneten bevægede sig langs luftrøret in vivo fik MP-kæden til at ændre vinkel inden for luftvejsoverfladen på en måde, der ligner den, der ses i kapillærer (se figur 8 og supplerende video S7:MP5). I vores undersøgelse kunne MP'er dog ikke trækkes langs overfladen af ​​den levende luftvej, som de kunne med kapillærer. I nogle tilfælde vil MP-kæden blive længere, når magneten bevæger sig til venstre og højre. Interessant nok fandt vi også, at partikelstrengen ser ud til at ændre dybden af ​​overfladevæskelaget, når magneten bevæges i længderetningen langs luftrøret, og udvider sig, når magneten bevæges direkte over hovedet, og partikelstrengen roteres til en lodret position (se supplerende video S7). : MP5 kl. 0:09, nederst til højre). Det karakteristiske bevægelsesmønster ændrede sig, da magneten blev forstørret lateralt hen over toppen af ​​luftrøret (dvs. til venstre eller højre for dyret i stedet for langs luftrørets længde). Partiklerne var stadig tydeligt synlige, mens de bevægede sig, men da magneten blev fjernet fra luftrøret, blev spidserne af partikelstrengene synlige (se Supplemental Video S8:MP5, startende kl. 0:08). Dette er i overensstemmelse med den MP-adfærd, vi observerede under et påført magnetfelt i en glaskapillær.
Eksempelbilleder, der viser MP5 i luftrøret hos en levende, bedøvet rotte. (a) Magneten bruges til at optage billeder over og til venstre for luftrøret, derefter (b) efter at magneten er flyttet til højre. Den røde boks indeholder den kontrastforstærkende forstørrelse. Disse billeder er fra videoen vist i Supplemental Video S7:MP5.
Når de to poler var konfigureret i en nord-syd-orientering over og under luftrøret (dvs. tiltrækkende; fig. 3b), virkede MP-akkorderne længere og var placeret på sidevæggen af ​​luftrøret snarere end på den dorsale luftrørsoverflade (se supplerende video S9:MP5). Høje koncentrationer af partikler på et enkelt sted (dvs. luftrørets dorsale overflade) blev dog ikke detekteret efter væsketilførsel, når en dobbeltmagnetenhed blev brugt, hvilket typisk forekommer, når en enkeltmagnetenhed anvendes. Når én magnet derefter blev konfigureret til at frastøde polerne omvendt (fig. 3c), syntes antallet af partikler, der var synlige i synsfeltet, ikke at stige efter tilførsel. Opsætningen af ​​begge dobbeltmagnetkonfigurationer er udfordrende på grund af de høje magnetiske feltstyrker, der henholdsvis trækker eller skubber magneterne. Opsætningen blev derefter ændret til en enkelt magnet parallelt med luftvejen, men passerer gennem luftvejen i 90 grader, så feltlinjerne krydsede luftrørsvæggen ortogonalt (fig. 3d), en orientering designet til at bestemme, om partikelaggregering på sidevæggen kunne observeres. Imidlertid, i I denne konfiguration var der ingen identificerbar bevægelse af MP-akkumulering eller magnetbevægelse. Baseret på alle disse resultater blev en enkeltmagnetkonfiguration med 30 graders orientering (figur 3a) valgt til in vivo-genbærerstudier.
Da dyret blev gentagne gange afbildet umiddelbart efter human aflivning, betød fraværet af forstyrrende vævsbevægelse, at finere og kortere partikellinjer kunne skelnes i det klare interchondrale felt, "vaklende" i overensstemmelse med magnetens translationsbevægelse. Ikke desto mindre kan man stadig ikke tydeligt se tilstedeværelsen og bevægelsen af ​​MP6-partikler.
LV-LacZ-titeren var 1,8 × 108 TU/ml, og efter 1:1 blanding med CombiMag MP (MP6) modtog dyrene en 50 μl trakeal dosis på 9 × 107 TU/ml LV-vehikel (dvs. 4,5 × 106 TU/rotte). I disse studier fikserede vi magneten i én position i stedet for at translatere den under fødslen for at bestemme, om LV-transduktion (a) kunne forbedres sammenlignet med vektorafgivelse i fravær af et magnetfelt, og (b) kunne fokuseres. Luftvejsceller transduceres til magnetiske målområder i de øvre luftveje.
Tilstedeværelsen af ​​magneter og brugen af ​​CombiMag kombineret med LV-vektorer syntes ikke at have negative virkninger på dyrenes sundhed, ligesom vores standard LV-vektorleveringsprotokol gjorde. Frontale billeder af trakealregionen udsat for mekanisk perturbation (supplerende figur 1) indikerede, at der var signifikant højere niveauer af transduktion i gruppen af ​​dyr behandlet med LV-MP, når magneten var til stede (figur 9a). Kun en lille mængde blå LacZ-farvning var til stede i kontrolgruppen (figur 9b). Kvantificering af normaliserede X-Gal-farvede områder viste, at administration af LV-MP i nærvær af et magnetfelt producerede en forbedring på cirka 6 gange (figur 9c).
Eksempel på sammensatte billeder, der viser trakealtransduktion ved LV-MP (a) i nærvær af et magnetfelt og (b) i fravær af en magnet. (c) Statistisk signifikant forbedring i normaliseret LacZ-transduktionsareal i luftrøret ved brug af magneten (*p = 0,029, t-test, n = 3 pr. gruppe, middelværdi ± SEM).
Neutrale, hurtigt rødfarvede sektioner (eksempel vist i supplerende figur 2) viste LacZ-farvede celler til stede i et lignende mønster og placering som tidligere rapporteret.
En central udfordring for genterapi i luftvejene er fortsat den nøjagtige lokalisering af bærerpartikler til interesseområder og opnåelse af høje niveauer af transduktionseffektivitet i den bevægelige lunge i nærvær af luftstrøm og aktiv slimfjernelse. For LV-bærere designet til behandling af CF-luftvejssygdom har det hidtil været et vanskeligt mål at øge opholdstiden for bærerpartikler i de ledende luftveje. Som påpeget af Castellani et al. har brugen af ​​magnetfelter til at forbedre transduktion fordele sammenlignet med andre genleveringsmetoder såsom elektroporation, da det kan kombinere enkelhed, omkostningseffektivitet, leveringslokalisering, øget effektivitet og kortere inkubationstider samt muligvis en mindre bærerdosis10. Imidlertid er in vivo-aflejring og opførsel af magnetiske partikler i luftvejene under påvirkning af eksterne magnetiske kræfter aldrig blevet beskrevet, og det er heller ikke blevet påvist, at denne metode in vivo kan forbedre genekspressionsniveauer i intakte levende luftveje.
Vores in vitro synkrotron PCXI-eksperimenter viste, at alle partikler, vi testede, med undtagelse af polystyren MP, var synlige i den billeddannelsesopsætning, vi brugte. I nærvær af et magnetfelt danner MP'er strenge, hvis længder er relateret til partikeltype og magnetfeltstyrke (dvs. magnetens nærhed og bevægelse). Som vist i figur 10 dannes de strenge, vi observerer, fordi hver enkelt partikel magnetiseres og inducerer sit eget lokale magnetfelt. Disse separate felter får andre lignende partikler til at aggregere og forbinde sig med gruppestrenglignende bevægelser på grund af lokale kræfter fra de lokale tiltrækkende og frastødende kræfter fra andre partikler.
Skematisk illustration af (a, b) partikeltog genereret inde i væskefyldte kapillærer og (c, d) luftfyldt luftrør. Bemærk, at kapillærerne og luftrøret ikke er tegnet i målestoksforhold. Panel (a) indeholder også en beskrivelse af MP, som indeholder Fe3O4-partikler arrangeret i strenge.
Da magneten blev flyttet over kapillærrøret, nåede partikelstrengens vinkel en kritisk tærskelværdi for MP3-5 indeholdende Fe3O4, hvorefter partikelstrengen ikke længere forblev i den oprindelige position, men bevægede sig langs overfladen til en ny position.magnet.Denne effekt opstår sandsynligvis, fordi glaskapillæroverfladen er glat nok til at tillade denne bevægelse.Interessant nok opførte MP6 (CombiMag) sig ikke på denne måde, muligvis fordi partiklerne var mindre, havde forskellige belægninger eller overfladeladninger, eller fordi en proprietær bærervæske påvirkede deres evne til at bevæge sig.Billedkontrasten for CombiMag-partikler er også svagere, hvilket tyder på, at væsken og partiklerne kan have lignende densiteter og derfor ikke let bevæger sig mod hinanden.Partikler kan også sætte sig fast, hvis magneten bevæger sig for hurtigt, hvilket indikerer, at magnetfeltstyrken ikke altid kan overvinde friktionen mellem partikler i væsken, hvilket tyder på, at det måske ikke er overraskende, at magnetfeltstyrken og afstanden mellem magneten og målområdet er meget vigtige.Samlet set tyder disse resultater også på, at selvom magneter kan indfange mange MP'er, der strømmer gennem målområdet, er det usandsynligt, at magneter kan stole på at bevæge sig. CombiMag-partikler langs overfladen af ​​luftrøret. Derfor konkluderer vi, at in vivo LV-MP-studier bør anvende statiske magnetfelter til fysisk at målrette specifikke områder af luftvejstræet.
Når partikler leveres i kroppen, er de vanskelige at identificere i forbindelse med komplekst bevægeligt kropsvæv, men evnen til at detektere dem blev forbedret ved at flytte magneten vandret over luftrøret for at "vrikke" MP-strengene. Selvom live-billeddannelse er mulig, er det lettere at skelne partikelbevægelse, når dyret er blevet aflivet humant. MP-koncentrationerne var generelt højest på dette sted, når magneten var placeret over billeddannelsesområdet, selvom nogle partikler normalt blev fundet længere langs luftrøret. I modsætning til in vitro-studier kan partikler ikke trækkes langs luftrøret ved at flytte magneten. Dette fund er i overensstemmelse med, hvordan det slim, der dækker overfladen af ​​luftrøret, typisk bearbejder inhalerede partikler, fanger dem i slimet og efterfølgende fjernes af den mukociliære clearance-mekanisme.
Vi fremsatte den hypotese, at brugen af ​​magneter til tiltrækning over og under luftrøret (fig. 3b) kunne resultere i et mere ensartet magnetfelt snarere end et magnetfelt, der er stærkt koncentreret på ét punkt, hvilket potentielt kan føre til en mere ensartet fordeling af partikler. Vores foreløbige undersøgelse fandt dog ikke klare beviser, der understøtter denne hypotese. Ligeledes resulterede konfiguration af et par magneter til at frastøde (fig. 3c) ikke i mere partikelaflejring i det afbildede område. Disse to fund viser, at dobbeltmagnetopsætningen ikke signifikant forbedrer den lokale kontrol af MP-målretning, og at de resulterende stærke magnetiske kræfter er vanskelige at konfigurere, hvilket gør denne tilgang mindre praktisk. Tilsvarende øgede orientering af magneten over og gennem luftrøret (fig. 3d) heller ikke antallet af partikler, der tilbageholdes i det afbildede område. Nogle af disse alternative konfigurationer er muligvis ikke vellykkede, fordi de resulterer i lavere magnetfeltstyrker inden for aflejringsområdet. Derfor betragtes den enkelte 30-graders vinkelmagnetkonfiguration (figur 3a) som den nemmeste og mest effektive metode til in vivo-testning.
LV-MP-studiet viste, at når LV-vektorer blev kombineret med CombiMag og leveret efter fysisk perturbation i nærvær af et magnetfelt, var transduktionsniveauerne signifikant forhøjede i luftrøret sammenlignet med kontrolgruppen. Baseret på synkrotronbilleddannelsesstudierne og LacZ-resultaterne var magnetfeltet tilsyneladende i stand til at bevare LV i luftrøret og reducere antallet af vektorpartikler, der straks trængte dybt ind i lungen. Sådanne målretningsforbedringer kan føre til højere effektivitet, samtidig med at leverede titere, off-target transduktion, inflammatoriske og immune bivirkninger samt genbæreromkostninger reduceres. Det er vigtigt at bemærke, at CombiMag ifølge producenten kan bruges sammen med andre genoverførselsmetoder, herunder med andre virale vektorer (såsom AAV) og nukleinsyrer.