Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozottan támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon egy frissített böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A cisztás fibrózis tüdőbetegség kezelésére szolgáló génvektoroknak a vezető légutakat kell célozniuk, mivel a perifériás tüdőtranszdukció nem biztosít terápiás előnyt. A vírustranszdukció hatékonysága közvetlenül összefügg a vektor tartózkodási idejével. A bejuttató folyadékok, például a génhordozók azonban természetes módon diffundálnak az alveolusokba belégzés közben, és bármilyen formájú terápiás részecskék gyorsan kiürülnek a mukociliáris transzport révén. A génhordozók tartózkodási idejének meghosszabbítása a légutakban fontos, de nehezen érhető el. A génhordozóval konjugált mágneses részecskék, amelyek a légutak felszínére irányíthatók, javíthatják a regionális célzást. Az in vivo vizualizáció kihívásai miatt az ilyen kis mágneses részecskék viselkedése a légutak felszínén alkalmazott mágneses tér jelenlétében kevéssé ismert. E tanulmány célja az volt, hogy szinkrotron képalkotás segítségével vizualizálja az altatott patkányok légcsövében lévő mágneses részecskesorozat in vivo mozgását, hogy megvizsgálja az egyes és tömeges részecskék viselkedésének dinamikáját és mintázatait in vivo. Ezután azt is értékeltük, hogy a lentivirális mágneses részecskék mágneses tér jelenlétében történő beadása növelné-e a transzdukció hatékonyságát a patkány légcsövében. A szinkrotron röntgenképalkotás feltárja a mágneses részecskék viselkedését. részecskék álló és mozgó mágneses mezőkben in vitro és in vivo. A részecskéket nem lehet könnyen a mágnesek segítségével a légutak felszínén húzni, de szállítás közben a lerakódások a látómezőben koncentrálódnak, ahol a mágneses mező a legerősebb. A transzdukciós hatékonyság szintén hatszorosára nőtt, amikor a lentivirális mágneses részecskéket mágneses mező jelenlétében juttatták be. Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a lentivirális mágneses részecskék és a mágneses mezők értékes megközelítések lehetnek a génvektorok célzásának javítására és a transzdukciós szintek növelésére a vezető légutakban in vivo.
A cisztás fibrózist (CF) egyetlen gén, a CF transzmembrán konduktancia szabályozó (CFTR) variációja okozza. A CFTR fehérje egy ioncsatorna, amely számos hámsejtben jelen van a szervezetben, beleértve a vezetőképes légutakat is, amelyek a CF patogenezisének fő helyszínei. A CFTR hibák abnormális vízszállításhoz vezetnek, dehidratálják a légutak felszínét és csökkentik a légutak felszíni folyadékrétegének (ASL) mélységét. Ez rontja a mukociliáris transzportrendszer (MCT) azon képességét is, hogy eltávolítsa a belélegzett részecskéket és kórokozókat a légutakból. Célunk egy lentivirális (LV) génterápia kifejlesztése, amely a CFTR gén helyes másolatát juttatja be, javítja az ASL, az MCT és a tüdő egészségét, valamint új technológiák fejlesztésének folytatása, amelyek képesek ezeket a paramétereket in vivo mérni1.
A bal kamrai vektorok a CF légúti génterápia egyik vezető jelöltjei, főként azért, mert képesek a terápiás gént véglegesen integrálni a légutak bazális sejtjeibe (légúti őssejtek). Ez azért fontos, mert helyreállíthatják a normális hidratációt és a nyákürítést azáltal, hogy funkcionális, génkorrigált CF-asszociált légutak felszíni sejtjeivé differenciálódnak, ami élethosszig tartó előnyöket eredményez. Az LV vektorokat a vezető légutak ellen kell irányítani, mivel itt kezdődik a CF tüdőbetegség. A vektor tüdőbe való mélyebb juttatása alveoláris transzdukciót eredményezhet, de ennek nincs terápiás előnye CF esetén. A folyadékok, például a génhordozók azonban a beadás utáni belégzéskor természetes módon az alveolusokba vándorolnak3,4, és a terápiás részecskék az MCT segítségével gyorsan kiürülnek a szájüregbe. Az LV transzdukció hatékonysága közvetlenül összefügg azzal az időtartammal, ameddig a vektor a célsejtek mellett marad, hogy lehetővé tegye a sejtes felvételt – a „tartózkodási idővel”5 –, amelyet a tipikus regionális légáramlás, valamint a koordinált részecskenyák-befogás és az MCT könnyen csökkenthet. CF esetén a bal kamra légutakban való tartózkodási idejének meghosszabbítása fontos a magas szintű transzdukció eléréséhez ebben a régióban, de eddig ez kihívást jelentett.
Ennek az akadálynak a leküzdésére azt javasoljuk, hogy a bal kamrai mágneses részecskék (MP-k) két egymást kiegészítő módon is segíthetnek. Először is, mágnesesen a légutak felszínéhez vezethetők, hogy javítsák a célzást és segítsék a génhordozó részecskéket a kívánt légutak régiójában maradni; és az ASL-ek (elektronikus jelátviteli részecskék) a 6. sejtrétegbe (sejtrétegbe) juthassanak. Az MP-ket széles körben alkalmazzák célzott gyógyszeradagoló hordozóként, amikor antitestekhez, kemoterápiás gyógyszerekhez vagy más kis molekulákhoz kötődnek, amelyek a sejtmembránokhoz tapadnak, vagy releváns sejtfelszíni receptorokhoz kötődnek, és statikus elektromosság jelenlétében a tumoros helyeken felhalmozódnak. Mágneses mezők a rákkezelésben 7. Más „hipertermikus” technikák célja, hogy a MP-ket felmelegítsék, amikor oszcilláló mágneses mezőknek vannak kitéve, ezáltal elpusztítva a tumorsejteket. A mágneses transzfekció elvét, amelyben egy mágneses mezőt használnak transzfekciós ágensként a DNS sejtekbe történő átvitelének fokozására, gyakran alkalmazzák in vitro, nem vírusos és vírusos génvektorok széles skálájával nehezen transzdukálható sejtvonalakhoz. Az LV magnetotranszfekció hatékonyságát az LV-MP-k in vitro humán hörgőhámsejtvonalba történő bejuttatásával statikus mágneses mező jelenlétében igazolták, ami 186-szorosára növelte a transzdukciós hatékonyságot az LV vektor önmagában történő alkalmazásához képest. Az LV-MP-t egy in vitro CF modellben is alkalmazták, ahol a mágneses transzfekció 20-szorosára növelte az LV transzdukciót a levegő-folyadék határfelületi kultúrákban CF köpet jelenlétében10. A szervek in vivo magnetotranszfekciója azonban viszonylag kevés figyelmet kapott, és csak néhány állatkísérletben értékelték11,12,13,14,15, különösen a tüdőben16,17. Mindazonáltal a mágneses transzfekció lehetőségei A CF tüdőterápiára vonatkozó javaslatok egyértelműek. Tan és munkatársai (2020) kijelentették, hogy „a hatékony mágneses nanorészecskék tüdőbe juttatásának koncepcióbizonyító tanulmánya utat nyit a jövőbeli CFTR inhalációs stratégiák számára a CF betegek klinikai eredményeinek javítása érdekében”6.
A kis mágneses részecskék viselkedése a légutak felületén alkalmazott mágneses tér jelenlétében nehezen látható és tanulmányozható, ezért kevéssé ismert. Más tanulmányainkban egy szinkrotronterjedésen alapuló fáziskontraszt röntgenképalkotó (PB-PCXI) módszert fejlesztettünk ki az ASL mélységének18 és az MCT viselkedésének19,20 apró in vivo változásainak non-invazív vizualizálására és számszerűsítésére, a gázcsatorna felszínének hidratációjának közvetlen mérésére és a kezelés hatékonyságának korai indikátoraként való alkalmazására. Ezenkívül az MCT értékelési módszerünk 10–35 µm átmérőjű, alumínium-oxidból vagy nagy törésmutatójú üvegből álló részecskéket használ MCT markerként, amelyek PB-PCXI21 segítségével láthatók. Mindkét technika alkalmas számos részecsketípus, köztük az MP vizualizálására.
Nagy térbeli és időbeli felbontásuknak köszönhetően PB-PCXI-alapú ASL és MCT elemzési technikáink jól alkalmazhatók az egyes és tömeges részecskék viselkedésének dinamikájának és mintázatainak in vivo vizsgálatára, amelyek segítenek megérteni és optimalizálni az MP génbeviteli technikákat. Az általunk alkalmazott megközelítés az SPring-8 BL20B2 sugárnyalábot használó tanulmányainkból származik, amelyekben a folyadékmozgást vizualizáltuk az ál-vektor dózisának egerek orr- és tüdőlégutaiba történő bejuttatása után, hogy segítsünk megmagyarázni a génhordozó dózisú állatkísérletekben megfigyelt nem egyenletes génexpressziós mintázatainkat3,4.
E tanulmány célja a szinkrotron PB-PCXI használata volt egy sor MP in vivo mozgásának vizualizálására élő patkányok légcsövében. Ezeket a PB-PCXI képalkotó vizsgálatokat úgy tervezték, hogy teszteljék a MP-k, mágneses térerősségek és helyszínek széles skáláját, hogy meghatározzák azok hatását az MP mozgására. Azt feltételeztük, hogy egy külsőleg alkalmazott mágneses tér segíti a leadott MP-t a célterületen maradni vagy oda mozdulni. Ezek a vizsgálatok lehetővé tették számunkra olyan mágneskonfigurációk azonosítását is, amelyek maximalizálják a légcsőben visszatartott részecskék számát a lerakódás után. Egy második tanulmánysorozatban ezt az optimális konfigurációt használtuk fel a bal kamrai MP-k in vivo patkány légutakba történő bejuttatásából eredő transzdukciós minta bemutatására, azon feltételezés alapján, hogy az LV-MP-k légutak célzásával történő bejuttatása javítja a bal kamrai transzdukciós hatékonyságot.
Minden állatkísérletet az Adelaide-i Egyetem (M-2019-060 és M-2020-022) és az SPring-8 Szinkrotron Állatietikai Bizottság által jóváhagyott protokollok (M-2019-060 és M-2020-022) és az SPring-8 Szinkrotron Állatietikai Bizottság szerint végeztünk. A kísérleteket az ARRIVE irányelvei szerint végeztük.
Minden röntgenképalkotást a japán SPring-8 szinkrotron BL20XU sugárnyalábján végeztek, a korábban leírtakhoz hasonló beállítást alkalmazva. Röviden, a kísérleti doboz 245 m-re volt a szinkrotron tárológyűrűjétől. A minta és a detektor közötti távolság 0,6 m a részecskeképalkotó vizsgálatokhoz és 0,3 m az in vivo képalkotó vizsgálatokhoz a fáziskontraszt-effektusok létrehozásához. 25 keV monokromatikus sugárenergiát használtak. A képeket egy nagy felbontású röntgenátalakítóval (SPring-8 BM3) rögzítették, amely egy sCMOS detektorhoz volt csatlakoztatva. Az átalakító egy 10 µm vastag szcintillátor (Gd3Al2Ga3O12) segítségével alakítja át a röntgensugarakat látható fénnyé, amelyet ezután egy sCMOS érzékelőre irányítanak egy × 10-es mikroszkóp objektív (NA 0,3) segítségével. Az sCMOS detektor az Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japán) volt, amelynek tömbmérete 2048 × 2048 pixel és 6,5 × 6,5 µm nyers pixelméret. Ez a beállítás 0,51 µm effektív izotróp pixelméretet és körülbelül 1,1 mm × 1,1 mm látómezőt eredményez. 100 ms expozíciós időt választottak a légutak belsejében és kívül lévő mágneses részecskék jel-zaj arányának maximalizálása, miközben minimalizálják a légzés által kiváltott mozgási műtermékeket. In vivo vizsgálatokhoz egy gyors röntgenredőnyt helyeztek a röntgensugár útvonalába, hogy korlátozzák a sugárterhelést a röntgensugár blokkolásával az expozíciók között.
Az LV hordozót nem használták egyetlen SPring-8 PB-PCXI képalkotó vizsgálatban sem, mivel a BL20XU képalkotó kamra nem rendelkezik 2. szintű biológiai biztonsági tanúsítvánnyal. Ehelyett két kereskedelmi beszállítótól származó, jól jellemzett MP-k széles választékát választottuk ki – amelyek a méretek, anyagok, vaskoncentrációk és alkalmazások széles skáláját fedik le –, hogy először megértsük, hogyan befolyásolják a mágneses mezők az MP mozgását az üvegkapillárisokban, majd az élő légutakban. a felszínen. Az MP-k mérete 0,25 és 18 μm között változik, és különféle anyagokból készülnek (lásd az 1. táblázatot), de az egyes minták összetétele, beleértve az MP-ben lévő mágneses részecskék méretét is, ismeretlen. Kiterjedt MCT-tanulmányaink19, 20, 21, 23, 24 alapján arra számítunk, hogy akár 5 μm-es MP-k is láthatók a légcső légútjainak felszínén, például ha egymást követő képkockákat kivonunk az MP mozgásának jobb láthatósága érdekében. Egyetlen 0,25 μm méretű MP kisebb, mint a képalkotó eszköz felbontása, de a PB-PCXI várhatóan érzékeli a térfogati kontrasztjukat és a felszíni folyadék mozgását, amelyre lerakódnak a lerakódás után.
Az 1. táblázatban szereplő egyes MP-k mintáit 20 μl-es üvegkapillárisokban (Drummond Microcaps, PA, USA) készítettük elő, 0,63 mm belső átmérővel. A korpuszkuláris részecskék vízben, míg a CombiMag részecskék a gyártó saját folyadékában kaphatók. Mindegyik csövet félig folyadékkal töltöttük fel (kb. 11 μl), és a mintatartóra helyeztük (lásd az 1. ábrát). Az üvegkapillárisokat vízszintesen helyeztük a képalkotó dobozban lévő mintaasztalra, és a folyadék széleihez igazítottuk. Egy 19 mm átmérőjű (28 mm hosszú) nikkelhéjú ritkaföldfém neodímium vas-bór (NdFeB) mágnest (N35, kat. szám: LM1652, Jaycar Electronics, Ausztrália) csatlakoztattunk egy különálló eltolási asztalhoz, amelynek maradék mágnesezettsége 1,17 Tesla volt, hogy a helyzetét távolról is megváltoztassa a képalkotás során. A röntgenfelvétel akkor kezdődik, amikor a mágnest körülbelül 30 mm-rel a minta fölé helyezzük, és a képeket másodpercenként 4 képkocka sebességgel készítjük. A képalkotás során a mágnest az üvegkapilláris közelébe vittük. csőben (kb. 1 mm távolságra), majd a cső mentén eltolva felméri a térerősség és a pozíció hatásait.
In vitro képalkotó berendezés, amely MP mintákat tartalmaz üvegkapillárisokban a minta xy-tengelyirányú transzlációs tárgyasztalán. A röntgensugár útját piros szaggatott vonal jelöli.
Miután a MP-k in vitro láthatóságát megállapították, egy részhalmazukat in vivo tesztelték vad típusú nőstény albínó Wistar patkányokban (~12 hetesek, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidint (Domitor®, Zenoaq, Japán), 3,2 mg/kg midazolámot (Dormicum®, Astellas Pharma, Japán) és 4 mg/kg butorfanolt (Vetorphale®, Meiji Seika) intraperitoneális injekcióval altattak. Az altatás után a patkányokat a légcső körüli szőrzet eltávolításával, egy endotracheális tubus (ET; 16 Ga iv. kanül, Terumo BCT) behelyezésével és hanyatt fekve, egy egyedi készítésű képalkotó lemezre történő rögzítéssel készítették elő, amely egy hőzsákot tartalmazott a testhőmérséklet fenntartása érdekében.22 A képalkotó lemezt ezután enyhe szögben a képalkotó dobozban lévő minta transzlációs tárgyasztalhoz rögzítették, hogy a légcső vízszintesen illeszkedjen a röntgenfelvételen, ahogy az a 1. ábrán látható. 2a.
(a) In vivo képalkotó beállítás az SPring-8 képalkotó dobozban, a röntgensugár útját piros szaggatott vonal jelöli. (b,c) A mágneses lokalizációt a légcsőben távolról végezték két merőlegesen elhelyezett IP-kamera segítségével. A képernyőkép bal oldalán látható a fejet tartó dróthurok, valamint a bevezető kanül az ET-csőben.
Egy távirányítású fecskendőpumpa-rendszert (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) egy 100 μl-es üvegfecskendővel csatlakoztattunk egy PE10 csőhöz (külső átmérő 0,61 mm, belső átmérő 0,28 mm) egy 30 Ga tűn keresztül. Jelöljük meg a csövet, hogy a hegye a megfelelő helyzetben legyen a légcsőben az ET cső behelyezésekor. A mikropumpa segítségével a fecskendő dugattyúját kihúztuk, miközben a cső hegye a beadandó MP mintába merült. A feltöltött beadó csövet ezután behelyeztük az endotracheális csőbe, a hegyet a várhatóan alkalmazott mágneses tér legerősebb részébe helyezve. A képalkotást egy légzésdetektorral vezéreltük, amely az Arduino alapú időzítő dobozunkhoz volt csatlakoztatva, és az összes jelet (pl. hőmérséklet, légzés, redőny nyitása/zárása és képalkotás) a Powerlab és a LabChart (AD Instruments, Sydney, Ausztrália) segítségével rögzítettük.22. Képalkotás során, amikor a kamra nem volt hozzáférhető, két IP-kamerát (Panasonic BB-SC382) helyeztünk el egymáshoz képest körülbelül 90°-os szögben, és ezekkel figyeltük a mágnes légcsőhöz viszonyított helyzetét. képalkotás közben (2b, c ábra). A mozgási műtermékek minimalizálása érdekében lélegzetvételenként egy képet készítettek az árapály-végi áramlási plató alatt.
Egy mágnes van rögzítve egy második fokozathoz, amely a képalkotó házon kívülről, távolról is elhelyezhető. Különböző mágnespozíciókat és konfigurációkat teszteltek, beleértve: Körülbelül 30°-os szögben a légcső fölé szerelve (a konfigurációk a 2a. és 3a. ábrán láthatók); egy mágnes az állat felett, a másik alatt, a pólusok vonzóra állítva (3b. ábra); egy mágnes az állat felett, a másik alatt, a pólusok taszítóra állítva (3c. ábra); és egy mágnes a légcső felett és arra merőlegesen (3d. ábra). Miután az állat és a mágnes konfigurálva van, és a tesztelendő MP-t behelyezték a fecskendőpumpába, adjon le 50 μl-es adagot 4 μl/másodperc sebességgel, miközben képeket készít. A mágnest ezután előre-hátra mozgatják a légcső mentén vagy oldalirányban, miközben folytatják a képek készítését.
Mágneskonfiguráció in vivo képalkotáshoz (a) egyetlen mágnes a légcső felett körülbelül 30°-os szögben, (b) két mágnes vonzóra beállítva, (c) két mágnes taszítóra beállítva, (d) egyetlen mágnes a légcső felett és arra merőlegesen. A megfigyelő a szájtól a légcsövön keresztül a tüdejébe nézett, és a röntgensugár áthaladt a patkány bal oldalán, majd a jobb oldalon kilépett. A mágnest vagy a légutak mentén, vagy a légcső felett balra és jobbra mozgatták a röntgensugár irányában.
Arra is törekedtünk, hogy meghatározzuk a részecskék láthatóságát és viselkedését a légutakban zavaró légzés és szívmozgás hiányában. Ezért a képalkotási időszak végén az állatokat pentobarbitál-túladagolás (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip) miatt humánusan leöltük. Néhány állatot a képalkotó platformon hagytunk, és amint a légzés és a szívverés leállt, a képalkotási folyamatot megismételtük, további MP adagot adva hozzá, ha nem volt látható MP a légutak felszínén.
A felvett képeket sík- és sötétlátóterű korrigálták, majd egy MATLAB-ban írt egyedi szkript (R2020a, The Mathworks) segítségével filmmé állították össze (20 képkocka/másodperc; a légzésszámtól függően a normál sebesség 15-25-szöröse).
Minden LV génvektor bejuttatási vizsgálatot az Adelaide-i Egyetem Laboratóriumi Állatkutató Intézetében végeztek, és céljuk az SPring-8 kísérlet eredményeinek felhasználása volt annak felmérésére, hogy az LV-MP mágneses tér jelenlétében történő bejuttatása fokozhatja-e a génátvitelt in vivo. Az MP és a mágneses tér hatásainak felméréséhez két állatcsoportot kezeltek: az egyik csoport LV-MP-t kapott mágnessel, a másik csoport pedig egy kontrollcsoportot, amely LV-MP-t kapott mágnes nélkül.
Az LV génvektorokat korábban leírt módszerekkel állítottuk elő25, 26. A LacZ vektor a konstitutív MPSV promóter (LV-LacZ) által vezérelt, magban lokalizált béta-galaktozidáz gént expresszálja, amely kék reakcióterméket termel a transzdukált sejtekben, amely látható a tüdőszövet frontjaiban és a szövetmetszetekben. A titrálást sejtkultúrákban végeztük úgy, hogy manuálisan megszámoltuk a LacZ-pozitív sejtek számát hemocitométerrel, hogy kiszámítsuk a titert TU/ml-ben. A hordozókat -80 °C-on kriokonzerváljuk, felhasználás előtt felengedjük, majd 1:1 arányú keveréssel és legalább 30 perces jégen történő inkubálással CombiMag-hoz kötjük a beadás előtt.
Normál Sprague Dawley patkányokat (n = 3/csoport, ~2-3) intraperitoneálisan altattunk 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Ausztrália) és 60 mg/kg ketamin (Ilium, Ausztrália) keverékével, hónapos korban, ip. injekcióval, majd nem sebészeti úton, 16 Ga iv. kanüllel orális kanüllel. Annak érdekében, hogy a tracheális légutak szövete bal kamrai transzdukciót kapjon, a korábban leírt mechanikus perturbációs protokollunkkal kondicionáltuk, amelyben a tracheális légutak felületét axiálisan dörzsöltük egy drótkosárral (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 másodpercig28. A bal kamrai-MP tracheális beadását ezután egy biológiai biztonsági fülkében végeztük körülbelül 10 perccel a perturbáció után.
Az ebben a kísérletben használt mágneses mezőt hasonló módon konfigurálták, mint az in vivo röntgenvizsgálatnál, ugyanazokat a mágneseket tartották a légcső felett desztillációs stentkapcsok segítségével (4. ábra). 50 μl térfogatú (2 × 25 μl aliquot) LV-MP-t juttattak a légcsőbe (n = 3 állat) egy gélvéggel ellátott pipettával, a korábban leírtak szerint. Egy kontrollcsoport (n = 3 állat) ugyanazokat az LV-MP-ket kapta mágnes használata nélkül. Az infúzió befejezése után a kanült eltávolították az ET-csőből, és az állatot extubálták. A mágnes 10 percig a helyén maradt, majd eltávolították. A patkányok szubkután meloxicamot (1 ml/kg) (Ilium, Ausztrália) kaptak, majd az anesztéziát 1 mg/kg atipamazol-hidroklorid (Antisedan, Zoetis, Ausztrália) ip. injekcióval fordították meg. A patkányokat melegen tartották és megfigyelés alatt tartották az anesztézia teljes felgyógyulásáig.
LV-MP adagolóeszköz biológiai biztonsági fülkében. Az ET cső világosszürke Luer-csatlakozója kiáll a szájból, és a képen látható pipetta géles hegyét az ET csövön keresztül a kívánt mélységig a légcsőbe kell bevezetni.
Egy héttel az LV-MP adagolási eljárás után az állatokat humánusan 100%-os CO2 belélegzéssel leöltük, és a LacZ expresszióját standard X-gal kezelésünkkel értékeltük. A három farokvégi, legporcosabb gyűrűt eltávolítottuk, hogy biztosítsuk, hogy az endotracheális tubus behelyezéséből eredő mechanikai sérülések vagy folyadékretenció ne szerepeljen az elemzésben. Mindegyik légcsövet hosszirányban elvágtuk, hogy két felét képezzünk az elemzéshez, és ezeket egy szilikon gumit (Sylgard, Dow Inc) tartalmazó edénybe helyeztük Minutien tű (Fine Science Tools) segítségével a lumen felszínének vizualizálására. A transzdukált sejtek eloszlását és mintázatát frontális fényképezéssel igazoltuk Nikon mikroszkóp (SMZ1500) segítségével, DigiLite kamerával és TCapture szoftverrel (Tucsen Photonics, Kína). A képeket 20-szoros nagyítással készítettük (beleértve a légcső teljes szélességéhez tartozó legnagyobb beállítást is), a légcső teljes hosszát lépésről lépésre leképezve, biztosítva az egyes képek közötti megfelelő átfedést a kép „összeillesztése” érdekében. Ezután az egyes légcsövekről készült képeket egy… egyetlen kompozit kép az Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) segítségével, síkmozgási algoritmust használva. Az egyes állatok légcsőjének kompozit képein a LacZ expressziós területeket egy automatizált MATLAB szkripttel (R2020a, MathWorks) számszerűsítettük a korábban leírtak szerint, 0,35 < Színárnyalat < 0,58, Telítettség > 0,15 és Érték < 0,7 beállításokkal. A szövet kontúrjainak megrajzolásával manuálisan létrehoztunk egy maszkot a GIMP v2.10.24-ben minden kompozit képhez, hogy azonosítsuk a szövetterületet és megakadályozzuk a légcsőszöveten kívülről érkező téves észleléseket. Az egyes állatok összes kompozit képéről származó festett területeket összeadtuk, hogy megkapjuk az adott állat teljes festett területét. A festett területet ezután elosztottuk a teljes maszkterülettel, hogy megkapjuk a normalizált területet.
Minden egyes légcsövet paraffinba ágyaztunk, és 5 μm-es metszeteket vágtunk belőlük. A metszeteket 5 percig semleges, gyors vörös festékkel kontrasztfestettük, majd a képeket Nikon Eclipse E400 mikroszkóppal, DS-Fi3 kamerával és NIS element capture szoftverrel (5.20.00 verzió) készítettük.
Minden statisztikai elemzést a GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) szoftverrel végeztünk. A statisztikai szignifikanciát p ≤ 0,05-nek vettük. A normalitás vizsgálatát Shapiro-Wilk teszttel, a LacZ festődésbeli különbségeket pedig párosítatlan t-próbával értékeltük.
Az 1. táblázatban leírt hat MP-t PCXI segítségével vizsgálták, a láthatóságot a 2. táblázat tartalmazza. Két polisztirol MP (MP1 és MP2; 18 μm és 0,25 μm) nem volt látható PCXI alatt, de a többi minta azonosítható volt (példák az 5. ábrán láthatók). Az MP3 és MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm és 0,9 μm) halványan látható. Bár a legkisebb vizsgált részecskék közül néhányat tartalmazott, az MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) volt a legkifejezettebb. A CombiMag termék MP6 nehezen észrevehető. Minden esetben az MP kimutatásának képességét jelentősen javította a mágnes oda-vissza mozgatása a kapillárissal párhuzamosan. Amikor a mágnesek eltávolodtak a kapilláristól, a részecskék hosszú szálakban nyúltak ki, de ahogy a mágnesek közelebb értek és a mágneses térerősség nőtt, a részecskeszálak lerövidültek, ahogy a részecskék a kapilláris felső felülete felé vándoroltak (lásd az S1. kiegészítő videót: MP4), növelve a részecskesűrűséget. a felületről. Ezzel szemben, amikor a mágnest eltávolítják a kapillárisból, a térerősség csökken, és a MP-k hosszú szálakká rendeződnek át, amelyek a kapilláris felső felületéről nyúlnak ki (lásd az S2. kiegészítő videót: MP4). Miután a mágnes mozgása leáll, a részecskék az egyensúlyi helyzet elérése után még rövid ideig tovább mozognak. Ahogy az MP a kapilláris felső felülete felé és attól távolodik, a mágneses részecskék jellemzően magukkal húzzák a törmeléket a folyadékon keresztül.
Az MP láthatósága PCXI alatt jelentősen eltér a minták között. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 és (d) MP6. Az itt látható összes képet egy, a kapilláris felett körülbelül 10 mm-rel elhelyezett mágnessel készítették. A látható nagy körök a kapillárisokban rekedt légbuborékok, amelyek tisztán mutatják a fáziskontraszt képalkotás fekete-fehér széleit. A piros doboz a kontrasztnövelő nagyítást mutatja. Megjegyzendő, hogy a mágneses ábrák átmérője nem méretarányos, és körülbelül 100-szor nagyobb a bemutatottnál.
Ahogy a mágnes balra és jobbra mozog a kapilláris tetején, az MP húr szöge megváltozik, hogy egy vonalba kerüljön a mágnessel (lásd a 6. ábrát), így kijelölve a mágneses tér vonalait. Az MP3-5 esetében, miután a húr eléri a küszöbszöget, a részecskék a kapilláris felső felületén húzódnak. Ez gyakran azt eredményezi, hogy az MP-k nagyobb csoportokba csoportosulnak a mágneses tér legerősebb helyéhez közel (lásd az S3. kiegészítő videót: MP5). Ez különösen akkor is szembetűnő, ha a kapilláris vége közelében képalkotást végeznek, ami az MP-k aggregálódásához és a folyadék-levegő határfelületen való koncentrálódásához vezet. Az MP6 részecskéi, amelyeket nehezebb volt megkülönböztetni, mint az MP3-5-öt, nem húzódtak magukkal, amikor a mágnes a kapilláris mentén mozgott, hanem az MP húrok disszociáltak, így a részecskék a látómezőben maradtak (lásd az S4. kiegészítő videót: MP6). Bizonyos esetekben, amikor az alkalmazott mágneses teret a mágnesnek a képalkotási helytől való nagy távolságra történő mozgatásával csökkentették, a megmaradt MP-k a gravitáció hatására lassan a cső aljára süllyedtek, miközben a húrban maradtak (lásd az S5. kiegészítő videót: MP3).
Az MP-szál szöge változik, ahogy a mágnes jobbra tolódik a kapilláris felett. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 és (d) MP6. A piros mező a kontrasztnövelő nagyítást tartalmazza. Megjegyzendő, hogy a kiegészítő videók informatívak, mivel fontos részecskeszerkezetet és dinamikus információkat tárnak fel, amelyeket ezeken a statikus képeken nem lehet megjeleníteni.
Tesztjeink azt mutatták, hogy a mágnes lassú előre-hátra mozgatása a légcső mentén megkönnyíti az MP vizualizációját komplex mozgások kontextusában in vivo. In vivo teszteket nem végeztünk, mivel a polisztirol gyöngyök (MP1 és MP2) nem voltak láthatók a kapillárisban. A fennmaradó négy MP-t in vivo teszteltük úgy, hogy a mágnes hossztengelye a légcső felett, a függőlegeshez képest körülbelül 30°-os szögben volt konfigurálva (lásd a 2b. és 3a. ábrát), mivel ez hosszabb MP-láncokat eredményezett, és hatékonyabb volt, mint a mágneses konfiguráció leállítása. MP3, MP4 és MP6 részecskéket nem észleltünk egyetlen élő állat légcsövében sem. Amikor a patkányok légútjait az állatok humánus leölése után képalkotó vizsgálatnak vetettük alá, a részecskék láthatatlanok maradtak, még akkor is, ha fecskendőpumpával további térfogatot adtunk hozzá. Az MP5 tartalmazta a legmagasabb vas-oxid-tartalmat, és ez volt az egyetlen látható részecske, ezért az MP in vivo viselkedésének felmérésére és jellemzésére használtuk.
A mágnesnek a légcső fölé helyezése az MP beadása során azt eredményezte, hogy sok, de nem az összes MP a látómezőben koncentrálódott. A légcsőbe jutó részecskék a humánusan feláldozott állatokon figyelhetők meg a legjobban. 7. ábra és S6. kiegészítő videó: Az MP5 a részecskék gyors mágneses befogását és elrendeződését mutatja a ventrális légcső felszínén, ami azt jelzi, hogy a MP-k a légcső kívánt régióiba irányíthatók. Amikor az MP beadása után a légcső mentén disztálisabban kerestünk, néhány MP-t közelebb találtunk a carinához, ami arra utal, hogy a mágneses térerősség nem volt elegendő az összes MP összegyűjtéséhez és megtartásához, mivel azok a folyadékfolyamat során a maximális mágneses térerősség régióján keresztül jutottak be. Mindazonáltal a szülés utáni MP-koncentrációk magasabbak voltak a képalkotó terület körül, ami arra utal, hogy sok MP a légutak régióiban maradt, ahol az alkalmazott mágneses térerősség a legnagyobb volt.
(a) képek az MP5 beadása előtt és után egy nemrég elaltatott patkány légcsövébe, a mágnest közvetlenül a képalkotó terület felett helyezve. A képalkotó terület a két porcgyűrű között található. Az MP beadása előtt némi folyadék van a légutakban. A piros doboz a kontrasztanyagot fokozó nagyítást mutatja. Ezek a képek az S6:MP5 kiegészítő videóban bemutatott videóból származnak.
A mágnes légcső mentén történő mozgatása in vivo az MP-lánc szögének megváltozását okozta a légutak felszínén, hasonlóan a kapillárisoknál megfigyelhetőhöz (lásd a 8. ábrát és az S7. kiegészítő videót: MP5). Tanulmányunkban azonban az MP-k nem húzódtak végig az élő légutak felszínén, ahogyan azt a kapillárisok tudták. Bizonyos esetekben az MP-lánc hosszabb lesz, ahogy a mágnes balra és jobbra mozog. Érdekes módon azt is megállapítottuk, hogy a részecskefüzér megváltoztatja a felszíni folyadékréteg mélységét, amikor a mágnest hosszirányban mozgatjuk a légcső mentén, és kitágul, amikor a mágnest közvetlenül a feje fölé mozgatjuk, és a részecskefüzért függőleges helyzetbe forgatjuk (lásd az S7. kiegészítő videót). : MP5 0:09-nél, jobb alsó sarokban). A mozgás jellegzetes mintázata megváltozott, amikor a mágnest a légcső tetején laterálisan (azaz az állattól balra vagy jobbra, nem pedig a légcső hosszában) mozgattuk. A részecskék továbbra is tisztán láthatóak voltak mozgás közben, de amikor a mágnest eltávolítottuk a légcsőből, a részecskefüzérek végei láthatóvá váltak (lásd a kiegészítő videót S8:MP5, 0:08-tól kezdődően). Ez összhangban van az MP viselkedésével, amelyet üvegkapillárisban alkalmazott mágneses tér alatt figyeltünk meg.
Példaképek az MP5-ről egy élő, altatott patkány légcsövében. (a) A mágnessel a légcső felett és bal oldalán, majd (b) a mágnes jobbra mozgatása után készíthetők képek. A piros mező a kontrasztnövelő nagyítást tartalmazza. Ezek a képek az S7:MP5 kiegészítő videóban bemutatott videóból származnak.
Amikor a két pólust észak-déli irányban, a légcső felett és alatt konfigurálták (azaz vonzó irányban; 3b. ábra), az MP húrok hosszabbnak tűntek, és a légcső oldalfalán helyezkedtek el, nem pedig a légcső hátsó felszínén (lásd az S9. kiegészítő videót: MP5). Azonban egyetlen helyen (azaz a légcső hátsó felszínén) nem észleltek nagy részecskekoncentrációkat folyadékadagolás után, amikor kettős mágneses eszközt használtak, ami jellemzően egyetlen mágneses eszköz használatakor fordul elő. Ezután, amikor az egyik mágnest úgy konfigurálták, hogy taszítsa a fordított pólusokat (3c. ábra), a látómezőben látható részecskék száma nem tűnt növekvőnek a beadás után. Mindkét kettős mágneses konfiguráció beállítása kihívást jelent a mágneseket húzó, illetve lökő nagy mágneses térerősség miatt. A beállítást ezután egyetlen, a légúttal párhuzamos, de a légúton 90 fokban áthaladó mágnesre változtatták, így a térvonalak merőlegesen keresztezték a légcső falát (3d. ábra), ez az orientáció annak meghatározására szolgált, hogy megfigyelhető-e részecskeaggregáció az oldalfalon. Ebben a konfigurációban azonban... Nem volt azonosítható MP-felhalmozódási vagy mágneses mozgás. Mindezen eredmények alapján egyetlen mágneses, 30 fokos orientációs konfigurációt (3a. ábra) választottunk az in vivo génhordozó-vizsgálatokhoz.
Amikor az állatot közvetlenül a humánus leölés után ismételten leképezték, a zavaró szövetmozgás hiánya azt jelentette, hogy finomabb és rövidebb részecskevonalak voltak kivehetők a tiszta interkondrális mezőben, „remegve”, összhangban a mágnes transzlációs mozgásával. Mindazonáltal az MP6 részecskék jelenléte és mozgása továbbra sem látható tisztán.
Az LV-LacZ titer 1,8 × 108 TU/ml volt, és a CombiMag MP-vel (MP6) 1:1 arányú keverés után az állatok 50 μl légcsődózist kaptak, amely 9 × 107 TU/ml LV vivőanyagot tartalmazott (azaz 4,5 × 106 TU/patkány). Ezekben a vizsgálatokban a mágnes szülés közbeni transzlációja helyett egy pozícióban rögzítettük a mágnest annak meghatározására, hogy (a) javítható-e a LV transzdukció a mágneses tér hiányában történő vektorbevitelhez képest, és (b) fókuszálható-e. A léguti sejteket a felső légutak mágneses célterületeire transzdukálják.
A mágnesek jelenléte és a CombiMag alkalmazása bal kamrai vektorokkal kombinálva nem tűnt káros hatással az állatok egészségére, ahogyan a standard bal kamrai vektor beadási protokollunk sem. A mechanikai perturbációnak kitett légcső régió frontális képei (1. kiegészítő ábra) azt mutatták, hogy az LV-MP-vel kezelt állatok csoportjában szignifikánsan magasabb transzdukciós szint volt megfigyelhető, amikor a mágnes jelen volt (9a. ábra). A kontrollcsoportban csak kis mennyiségű kék ​​LacZ festődés volt jelen (9b. ábra). A normalizált X-Gal festett területek mennyiségi meghatározása azt mutatta, hogy az LV-MP mágneses tér jelenlétében történő beadása körülbelül 6-szoros javulást eredményezett (9c. ábra).
Példaképek a LV-MP által végzett tracheális transzdukcióról (a) mágneses tér jelenlétében és (b) mágnes hiányában. (c) Statisztikailag szignifikáns javulás a normalizált LacZ transzdukciós területen a tracheán belül a mágnes használatakor (*p = 0,029, t-teszt, n = 3 csoportonként, átlag ± SEM).
A semleges, gyorsan vörösre festett metszetek (példa a 2. kiegészítő ábrán) a LacZ-festett sejteket hasonló mintázatban és helyen mutatták, mint ahogyan azt korábban közöltük.
A légúti génterápia egyik fő kihívása továbbra is a hordozórészecskék pontos lokalizációja az érdeklődésre számot tartó régiókban, valamint a magas szintű transzdukciós hatékonyság elérése a mozgó tüdőben légáramlás és aktív nyákürítés jelenlétében. A CF légúti betegség kezelésére tervezett LV hordozók esetében a hordozórészecskék tartózkodási idejének növelése a vezető légutakban eddig elérhetetlen cél volt. Ahogy Castellani és munkatársai rámutattak, a mágneses mezők használata a transzdukció javítására előnyökkel jár más génbeviteli módszerekkel, például az elektroporációval szemben, mivel ötvözi az egyszerűséget, a költséghatékonyságot, a beviteli lokalizációt, a megnövekedett hatékonyságot és a rövidebb inkubációs időket, és esetleg kisebb hordozódózist is eredményezhet. A mágneses részecskék in vivo lerakódását és viselkedését a légutakban külső mágneses erők hatására azonban még soha nem írták le, és valójában nem is bizonyították in vivo, hogy ez a módszer fokozza a génexpressziós szintet ép élő légutakban.
In vitro szinkrotron PCXI kísérleteink azt mutatták, hogy a polisztirol MP kivételével az összes tesztelt részecske látható volt az általunk használt képalkotó berendezésben. Mágneses tér jelenlétében az MP-k húrokat alkotnak, amelyek hossza a részecske típusától és a mágneses tér erősségétől (azaz a mágnes közelségétől és mozgásától) függ. Amint a 10. ábrán látható, a megfigyelt húrok úgy alakulnak ki, hogy minden egyes részecske mágnesezett és saját lokális mágneses mezőt indukál. Ezek a különálló mezők más hasonló részecskék aggregálódását és összekapcsolódását okozzák, csoportos húrszerű mozgásokat hozva létre más részecskék lokális vonzó és taszító erőinek lokális erői miatt.
A folyadékkal töltött kapillárisokban keletkező részecskesorok (a, b) és a levegővel töltött légcső (c, d) vázlatos ábrázolása. Megjegyzendő, hogy a kapillárisok és a légcső nem méretarányosak. Az (a) panel a MP leírását is tartalmazza, amely szálakban elrendezett Fe3O4 részecskéket tartalmaz.
Amikor a mágnest a kapilláris fölé mozgatták, a részecskefüzér szöge elérte a kritikus küszöbértéket az Fe3O4-et tartalmazó MP3-5 esetében, amely után a részecskefüzér már nem maradt az eredeti helyén, hanem a felület mentén egy új pozícióba mozdult el.mágnes.Ez a hatás valószínűleg azért következik be, mert az üvegkapilláris felülete elég sima ahhoz, hogy ez a mozgás bekövetkezhessen.Érdekes módon az MP6 (CombiMag) nem viselkedett így, valószínűleg azért, mert a részecskék kisebbek voltak, eltérő bevonattal vagy felületi töltéssel rendelkeztek, vagy egy saját fejlesztésű vivőfolyadék befolyásolta a mozgásképességüket.A CombiMag részecskék képkontrasztja is gyengébb, ami arra utal, hogy a folyadék és a részecskék hasonló sűrűségűek lehetnek, és ezért nem könnyen mozdulnak egymás felé.A részecskék akkor is elakadhatnak, ha a mágnes túl gyorsan mozog, ami azt jelzi, hogy a mágneses térerősség nem mindig tudja leküzdeni a folyadékban lévő részecskék közötti súrlódást, ami arra utal, hogy talán nem meglepő, hogy a mágneses térerősség és a mágnes és a célterület közötti távolság nagyon fontos.Összefoglalva, ezek az eredmények azt is sugallják, hogy bár a mágnesek sok MP-t képesek befogni, amelyek átáramlanak a célterületen, nem valószínű, hogy a mágnesekre támaszkodni lehet a CombiMag részecskék mozgatásában a... a légcső felszínén. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy az in vivo LV-MP vizsgálatoknak statikus mágneses mezőket kell alkalmazniuk a légutak specifikus régióinak fizikai megcélzására.
Amikor részecskék jutnak be a testbe, nehéz azonosítani őket a komplex, mozgó testszövetek kontextusában, de a detektálás képességét fokozta a mágnes vízszintes mozgatása a légcső fölé, hogy „megremegtesse” az MP-szálakat. Bár az élő képalkotás lehetséges, a részecskék mozgását könnyebb észrevenni, miután az állatot humánusan leölték. Az MP-koncentrációk általában ezen a helyen voltak a legmagasabbak, amikor a mágnest a képalkotó terület fölé helyezték, bár néhány részecske általában a légcső mentén is megtalálható volt. Az in vitro vizsgálatokkal ellentétben a részecskéket nem lehet a mágnes mozgatásával a légcső mentén húzni. Ez a megállapítás összhangban van azzal, ahogyan a légcső felszínét bevonó nyálka jellemzően feldolgozza a belélegzett részecskéket, csapdába ejti azokat a nyálkában, majd a mukociliáris clearance mechanizmus segítségével eltávolítja azokat.
Azt feltételeztük, hogy a légcső felett és alatt elhelyezett mágnesek vonzása (3b. ábra) egyenletesebb mágneses teret eredményezhet, mint egy olyan mágneses teret, amely egy ponton erősen koncentrálódik, ami potenciálisan a részecskék egyenletesebb eloszlásához vezethet. Előzetes tanulmányunk azonban nem talált egyértelmű bizonyítékot erre a hipotézisre. Hasonlóképpen, egy pár taszító mágnes konfigurálása (3c. ábra) nem eredményezett több részecske lerakódását a képalkotó területen. Ez a két megállapítás azt mutatja, hogy a kettős mágneses elrendezés nem javítja jelentősen az MP célzás lokális szabályozását, és hogy az így létrejövő erős mágneses erőket nehéz konfigurálni, ami kevésbé praktikussá teszi ezt a megközelítést. Hasonlóképpen, a mágnes légcső feletti és azon keresztüli orientálása (3d. ábra) szintén nem növelte a képalkotó területen visszatartott részecskék számát. Ezen alternatív konfigurációk némelyike ​​​​lehet, hogy nem lesz sikeres, mert alacsonyabb mágneses térerősséget eredményez a lerakódási területen belül. Ezért az egyetlen 30 fokos szögmágneses konfiguráció (3a. ábra) a legegyszerűbb és leghatékonyabb módszernek tekinthető az in vivo teszteléshez.
Az LV-MP vizsgálat kimutatta, hogy amikor a LV vektorokat CombiMag-gal kombinálták, és fizikai perturbáció után, mágneses tér jelenlétében adták be, a transzdukciós szintek szignifikánsan megnőttek a légcsőben a kontrollcsoporthoz képest. A szinkrotron képalkotó vizsgálatok és a LacZ eredmények alapján a mágneses tér látszólag képes volt megőrizni a LV-t a légcsőben, és csökkenteni a tüdőbe azonnal mélyen behatoló vektorrészecskék számát. Az ilyen célzási fejlesztések nagyobb hatékonysághoz vezethetnek, miközben csökkentik a leadott titereket, a célponton kívüli transzdukciót, a gyulladásos és immun mellékhatásokat, valamint a génhordozó költségeit. Fontos megjegyezni, hogy a gyártó szerint a CombiMag más génátviteli módszerekkel együtt is alkalmazható, beleértve más vírusvektorokat (például AAV-t) és nukleinsavakat is.