Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom afișa site-ul fără stiluri și JavaScript.
Vectorii genetici pentru tratamentul bolii pulmonare cu fibroză chistică ar trebui să vizeze căile respiratorii conductoare, deoarece transducția pulmonară periferică nu oferă beneficii terapeutice. Eficiența transducției virale este direct legată de timpul de rezidență al vectorului. Cu toate acestea, fluidele de administrare, cum ar fi purtătorii de gene, difuzează în mod natural în alveole în timpul inspirului, iar particulele terapeutice de orice formă sunt eliminate rapid prin transport mucociliar. Prelungirea timpului de rezidență al purtătorilor de gene în căile respiratorii este importantă, dar dificil de realizat. Particulele magnetice conjugate cu purtători de gene care pot fi direcționate către suprafața căilor respiratorii pot îmbunătăți direcționarea regională. Din cauza provocărilor vizualizării in vivo, comportamentul unor astfel de particule magnetice mici pe suprafața căilor respiratorii în prezența unui câmp magnetic aplicat este puțin înțeles. Scopul acestui studiu a fost de a utiliza imagistica sincrotron pentru a vizualiza mișcarea in vivo a unei serii de particule magnetice în traheea șobolanilor anesteziați pentru a examina dinamica și modelele de comportament al particulelor individuale și în vrac in vivo. Apoi, am evaluat, de asemenea, dacă administrarea de particule magnetice lentivirale în prezența unui câmp magnetic ar crește eficiența transducției în traheea șobolanului. Sincrotron Imagistica cu raze X dezvăluie comportamentul particulelor magnetice în câmpuri magnetice staționare și în mișcare in vitro și in vivo. Particulele nu pot fi ușor târâte de-a lungul suprafeței căilor respiratorii vii cu magneți, dar în timpul transportului, depozitele sunt concentrate în câmpul vizual unde câmpul magnetic este cel mai puternic. Eficiența transducției a fost, de asemenea, crescută de șase ori atunci când particulele magnetice lentivirale au fost administrate în prezența unui câmp magnetic. Împreună, aceste rezultate sugerează că particulele magnetice lentivirale și câmpurile magnetice pot fi abordări valoroase pentru îmbunătățirea direcționării vectorilor genetici și creșterea nivelurilor de transducție în căile respiratorii conductoare in vivo.
Fibroza chistică (FC) este cauzată de variația unei singure gene numită regulator al conductanței transmembranare a FC (CFTR). Proteina CFTR este un canal ionic prezent în multe celule epiteliale din organism, inclusiv în căile respiratorii conductoare, un loc major al patogenezei FC. Defectele CFTR duc la un transport anormal al apei, deshidratând suprafața căilor respiratorii și reducând adâncimea stratului de lichid de la suprafața căilor respiratorii (ASL). Acest lucru afectează, de asemenea, capacitatea sistemului de transport mucociliar (MCT) de a elimina particulele și agenții patogeni inhalați din căile respiratorii. Scopul nostru este de a dezvolta o terapie genică lentivirală (LV) pentru a furniza copia corectă a genei CFTR și a îmbunătăți sănătatea ASL, MCT și pulmonară și de a continua dezvoltarea de noi tehnologii capabile să măsoare acești parametri in vivo1.
Vectorii ventriculari stângi (VS) sunt printre principalii candidați pentru terapia genică a căilor respiratorii în cazul fibrozei chistice (FC), în principal deoarece pot integra permanent gena terapeutică în celulele bazale ale căilor respiratorii (celule stem ale căilor respiratorii). Acest lucru este important deoarece pot restabili hidratarea normală și eliminarea mucusului prin diferențierea în celule funcționale de suprafață a căilor respiratorii asociate FC, corectate genetic, rezultând beneficii pe tot parcursul vieții. Vectorii VS ar trebui direcționați împotriva căilor respiratorii conductoare, deoarece aici începe boala pulmonară FC. Administrarea vectorului mai adânc în plămân poate duce la transducția alveolară, dar aceasta nu are niciun beneficiu terapeutic în FC. Cu toate acestea, fluide precum purtătorii de gene migrează în mod natural către alveole la inspirație după administrare3,4, iar particulele terapeutice sunt eliminate rapid în cavitatea bucală prin TCM. Eficiența transducției VS este direct legată de durata de timp în care vectorul rămâne lângă celulele țintă pentru a permite absorbția celulară - „timpul de rezidență”5 - care este ușor redus prin fluxul de aer regional tipic, precum și prin captarea coordonată a mucusului particulelor și TCM. În FC, capacitatea de a prelungi timpul de rezidență al VS în căile respiratorii este importantă pentru a obține niveluri ridicate de transducție în această regiune, dar până acum a fost o provocare.
Pentru a depăși acest obstacol, sugerăm că particulele magnetice (MP) ale ventriculului stâng (VS) pot ajuta în două moduri complementare. În primul rând, acestea pot fi ghidate magnetic către suprafața căilor respiratorii pentru a îmbunătăți direcționarea și a ajuta particulele purtătoare de gene să se stabilească în regiunea dorită a căilor respiratorii; și (ASL) să se deplaseze către stratul celular 6. MP-urile au fost utilizate pe scară largă ca vehicule țintite de administrare a medicamentelor atunci când se leagă de anticorpi, medicamente chimioterapeutice sau alte molecule mici care se atașează de membranele celulare sau se leagă de receptorii relevanți de pe suprafața celulară și se acumulează la locurile tumorale în prezența electricității statice. Câmpuri magnetice pentru tratamentul cancerului 7. Alte tehnici „hipertermale” urmăresc încălzirea microplasticelor (MP) atunci când acestea sunt expuse la câmpuri magnetice oscilante, distrugând astfel celulele tumorale. Principiul transfecției magnetice, în care un câmp magnetic este utilizat ca agent de transfecție pentru a spori transferul de ADN către celule, este frecvent utilizat in vitro folosind o gamă de vectori genetici non-virali și virali pentru linii celulare dificil de transdus. Eficacitatea magnetotransfecției LV a fost stabilită, prin administrarea in vitro a MP-LV către o linie celulară epitelială bronșică umană în prezența unui câmp magnetic static, crescând eficiența transducției de 186 de ori comparativ cu vectorul LV singur. MP-LV a fost aplicată și unui model FC in vitro, unde transfecția magnetică a crescut transducția LV în culturile de interfață aer-lichid de 20 de ori în prezența sputei FC10. Cu toate acestea, magnetotransfecția in vivo a organelor a primit relativ puțină atenție și a fost evaluată doar în câteva studii pe animale11,12,13,14,15, în special în plămâni16,17. Cu toate acestea, oportunitățile pentru transfecția magnetică în terapia pulmonară cu fibroză chistică sunt clare. Tan și colab. (2020) au afirmat că „un studiu demonstrativ al administrării pulmonare eficiente a nanoparticulelor magnetice va deschide calea pentru viitoarele strategii de inhalare a CFTR pentru a îmbunătăți rezultatele clinice la pacienții cu fibroză chistică”6.
Comportamentul particulelor magnetice mici pe suprafețele căilor respiratorii în prezența unui câmp magnetic aplicat este dificil de vizualizat și studiat și, prin urmare, slab înțeles. În alte studii, am dezvoltat o metodă de imagistică cu raze X cu contrast de fază bazată pe propagarea sincrotronului (PB-PCXI) pentru a vizualiza și cuantifica neinvaziv modificări in vivo minuscule ale adâncimii ASL18 și comportamentului MCT19,20 pentru a măsura direct hidratarea suprafeței canalului de gaz și a fost utilizată ca indicator timpuriu al eficacității tratamentului. În plus, metoda noastră de evaluare MCT utilizează particule cu diametrul de 10-35 µm, compuse din alumină sau sticlă cu indice de refracție ridicat, ca markeri MCT vizibili folosind PB-PCXI21. Ambele tehnici sunt potrivite pentru vizualizarea unei game de tipuri de particule, inclusiv MP.
Datorită rezoluției sale spațiale și temporale ridicate, tehnicile noastre de analiză ASL și MCT bazate pe PB-PCXI sunt potrivite pentru examinarea dinamicii și tiparelor de comportament in vivo al particulelor individuale și în vrac, pentru a ne ajuta să înțelegem și să optimizăm tehnicile de administrare a genelor MP. Abordarea pe care o folosim aici derivă din studiile noastre care au utilizat linia de fascicul SPring-8 BL20B2, în care am vizualizat mișcarea fluidului în urma administrării unei doze vectoriale simulate în căile respiratorii nazale și pulmonare ale șoarecilor, pentru a explica tiparele noastre neuniforme de expresie genică observate în studiile noastre pe animale cu doze purtătoare de gene 3,4.
Scopul acestui studiu a fost utilizarea sincrotronului PB-PCXI pentru a vizualiza mișcările in vivo ale unei serii de microparticule magnetice (MP) în traheea șobolanilor vii. Aceste studii imagistice PB-PCXI au fost concepute pentru a testa o gamă de MP, intensități ale câmpului magnetic și locații pentru a determina efectul acestora asupra mișcării MP. Am emis ipoteza că un câmp magnetic aplicat extern ar ajuta MP-ul administrat să rămână sau să se deplaseze în zona țintă. Aceste studii ne-au permis, de asemenea, să identificăm configurații magnetice care maximizează numărul de particule reținute în trahee după depunere. Într-o a doua serie de studii, am căutat să folosim această configurație optimă pentru a demonstra modelul de transducție rezultat din administrarea in vivo a MP-urilor LV în căile respiratorii ale șobolanului, bazându-ne pe presupunerea că administrarea MP-urilor LV în contextul direcționării căilor respiratorii ar duce la o eficiență îmbunătățită a transducției LV.
Toate studiile pe animale au fost efectuate conform protocoalelor aprobate de Universitatea din Adelaide (M-2019-060 și M-2020-022) și de Comitetul de Etică a Animalelor pentru Sincrotron SPring-8. Experimentele au fost efectuate conform ghidurilor ARRIVE.
Toate imagistica cu raze X au fost efectuate la linia de fascicul BL20XU de la sincrotronul SPring-8 din Japonia, utilizând o configurație similară cu cea descrisă anterior21,22. Pe scurt, cutia experimentală a fost amplasată la 245 m de inelul de stocare al sincrotronului. O distanță probă-detector de 0,6 m este utilizată pentru studiile de imagistică a particulelor și de 0,3 m pentru studiile de imagistică in vivo pentru a genera efecte de contrast de fază. S-a utilizat o energie a fasciculului monocromatic de 25 keV. Imaginile au fost capturate folosind un convertor de raze X de înaltă rezoluție (SPring-8 BM3) cuplat la un detector sCMOS. Convertorul convertește razele X în lumină vizibilă folosind un scintilator cu grosimea de 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), care este apoi direcționat către un senzor sCMOS folosind un obiectiv de microscop × 10 (NA 0.3). Detectorul sCMOS a fost Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonia) cu o dimensiune a matricei de 2048 × 2048 pixeli și o dimensiune brută a pixelului de 6,5 × 6,5 µm. Această configurație produce o dimensiune izotropă efectivă a pixelului de 0,51 µm și un câmp vizual de aproximativ 1,1 mm × 1,1 mm. A fost aleasă o lungime de expunere de 100 ms pentru a maximiza raportul semnal-zgomot al particulelor magnetice din interiorul și din exteriorul căilor respiratorii, minimizând în același timp artefactele de mișcare induse de respirație. Pentru studiile in vivo, un obturator rapid de raze X a fost plasat în calea razelor X pentru a limita doza de radiații prin blocarea fasciculului de raze X între expuneri.
Purtătorul de ventricul stâng (VS) nu a fost utilizat în niciun studiu de imagistică SPring-8 PB-PCXI, deoarece camera de imagistică BL20XU nu este certificată pentru nivelul 2 de biosecuritate. În schimb, am selectat o gamă de microplastice (MP) bine caracterizate de la doi furnizori comerciali - care acoperă o gamă largă de dimensiuni, materiale, concentrații de fier și aplicații - mai întâi pentru a înțelege cum afectează câmpurile magnetice mișcarea MP în capilarele de sticlă și apoi în căile respiratorii vii. la suprafață. MP-urile au dimensiuni cuprinse între 0,25 și 18 μm și sunt fabricate dintr-o varietate de materiale (vezi Tabelul 1), dar compoziția fiecărei probe, inclusiv dimensiunea particulelor magnetice din MP, este necunoscută. Pe baza studiilor noastre extinse MCT 19, 20, 21, 23, 24, ne așteptăm ca MP-uri de până la 5 μm să poată fi observate pe suprafața căilor respiratorii traheale, de exemplu prin scăderea cadrelor consecutive pentru a vedea o vizibilitate îmbunătățită a mișcării MP-ului. Un singur MP de 0,25 μm este mai mic decât rezoluția dispozitivului de imagistică, dar se așteaptă ca PB-PCXI să detecteze contrastul lor volumic și mișcarea fluidului de suprafață pe care sunt depuse după depunere.
Probele pentru fiecare MP din Tabelul 1 au fost preparate în capilare de sticlă de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, SUA) cu un diametru interior de 0,63 mm. Particulele corpusculare sunt disponibile în apă, în timp ce particulele CombiMag sunt disponibile în fluidul proprietar al producătorului. Fiecare tub este umplut pe jumătate cu lichid (aproximativ 11 μl) și plasat pe suportul de probă (vezi Figura 1). Capilarele de sticlă au fost plasate orizontal pe platforma probei în cutia de imagistică și poziționate la marginile fluidului. Un magnet cu înveliș de nichel, pământuri rare, neodim, fier-bor (NdFeB) cu diametrul de 19 mm (28 mm lungime) și o magnetizare reziduală de 1,17 Tesla a fost atașat la o platformă de translație separată pentru a realiza schimbarea poziției sale de la distanță în timpul imagisticii. Achiziția imaginilor cu raze X începe atunci când magnetul este poziționat la aproximativ 30 mm deasupra probei, iar imaginile sunt achiziționate cu o rată de 4 cadre pe secundă. În timpul imagisticii, magnetul a fost adus aproape de tubul capilar de sticlă (la aproximativ 1 mm distanță) și apoi deplasată de-a lungul tubului pentru a evalua efectele intensității câmpului și ale poziției.
Configurație de imagistică in vitro care conține probe MP în capilare de sticlă pe platforma de translație xy a probei. Traiectoria fasciculului de raze X este marcată cu o linie roșie punctată.
Odată ce vizibilitatea in vitro a microplasticelor (MP) a fost stabilită, un subset al acestora a fost testat in vivo la șobolani Wistar albinoși femele de tip sălbatic (cu vârsta de ~12 săptămâni, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidină (Domitor®, Zenoaq, Japonia), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonia) și 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Șobolanii au fost anesteziați cu un amestec de (Pharma), Japonia) prin injecție intraperitoneală. După anestezie, au fost pregătiți pentru imagistică prin îndepărtarea blănii din jurul traheei, introducerea unui tub endotraheal (ET; canulă iv de 16 Ga, Terumo BCT) și imobilizarea lor în decubit dorsal pe o placă de imagistică personalizată, care conținea o pungă termică pentru a menține temperatura corpului [22]. Placa de imagistică a fost apoi atașată la platforma de translație a probei din cutia de imagistică la un unghi ușor pentru a alinia traheea orizontal în imaginea cu raze X, așa cum se arată în Figura 1. 2a.
(a) Configurarea imagisticii in vivo în cutia de imagistică SPring-8, traiectoria fasciculului de raze X este marcată cu o linie roșie punctată. (b,c) Localizarea magnetului pe trahee a fost efectuată de la distanță folosind două camere IP montate ortogonal. În partea stângă a imaginii ecranului, se poate vedea bucla de sârmă care susține capul și canula de administrare în poziție în tubul ET.
Un sistem de pompă de seringă cu comandă de la distanță (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) care utilizează o seringă de sticlă de 100 μl a fost conectat la un tub din PE10 (diametru exterior 0,61 mm, diametru interior 0,28 mm) prin intermediul unui ac de calibru 30 Ga. Marcați tubul pentru a vă asigura că vârful este în poziția corectă în trahee la introducerea tubului endotraheal. Folosind micropompa, pistonul seringii a fost retras în timp ce vârful tubului era scufundat în proba MP care urma să fie administrată. Tubul de administrare încărcat a fost apoi introdus în tubul endotraheal, plasând vârful în partea cea mai puternică a câmpului magnetic aplicat așteptat. Achiziția imaginii a fost controlată folosind un detector de respirație conectat la cutia noastră de temporizare bazată pe Arduino, iar toate semnalele (de exemplu, temperatura, respirația, deschiderea/închiderea obturatorului și achiziția imaginii) au fost înregistrate folosind Powerlab și LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. La realizarea imagisticii, când incinta era inaccesibilă, două camere IP (Panasonic BB-SC382) au fost poziționate la aproximativ 90° una față de cealaltă și au fost utilizate pentru a monitoriza poziția magnetului relativ la... către trahee în timpul imagisticii (Fig. 2b,c). Pentru a minimiza artefactele de mișcare, a fost achiziționată o imagine per respirație în timpul platoului fluxului de sfârșit de respirație.
Un magnet este atașat la o a doua etapă care poate fi amplasată de la distanță, din exteriorul carcasei de imagistică. Au fost testate diverse poziții și configurații ale magneților, inclusiv: montat la un unghi de aproximativ 30° deasupra traheei (configurațiile sunt prezentate în Figurile 2a și 3a); un magnet deasupra animalului și celălalt dedesubt, cu polii setați să atragă (Figura 3b); un magnet deasupra animalului și celălalt dedesubt, cu polii setați să respingă (Figura 3c); și un magnet deasupra și perpendicular pe trahee (Figura 3d). Odată ce animalul și magnetul sunt configurate și MP-ul care urmează să fie testat este încărcat în pompa de seringă, se administrează o doză de 50 μl la o rată de 4 μl/sec în timp ce se achiziționează imagini. Magnetul este apoi deplasat înainte și înapoi de-a lungul sau lateral peste trahee, continuând în același timp achiziționarea de imagini.
Configurația magnetului pentru imagistica in vivo (a) un singur magnet deasupra traheei la un unghi de aproximativ 30°, (b) doi magneți setați să atragă, (c) doi magneți setați să respingă, (d) un singur magnet deasupra și perpendicular în trahee. Observatorul privea în jos de la gură la plămâni prin trahee, iar fasciculul de raze X trecea prin partea stângă a șobolanului și ieșea pe partea dreaptă. Magnetul este fie deplasat de-a lungul căilor respiratorii, fie la stânga și la dreapta deasupra traheei în direcția fasciculului de raze X.
De asemenea, am căutat să determinăm vizibilitatea și comportamentul particulelor din căile respiratorii în absența unor factori de confuzie respiratorie și cardiacă. Prin urmare, la sfârșitul perioadei de imagistică, animalele au fost sacrificate în mod uman pentru supradozajul de pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, SUA; ~65 mg/kg ip). Unele animale au fost lăsate pe platforma de imagistică, iar odată ce respirația și bătăile inimii s-au oprit, procesul de imagistică a fost repetat, adăugând o doză suplimentară de MP dacă nu era vizibil MP pe suprafața căilor respiratorii.
Imaginile achiziționate au fost corectate în câmp plat și în câmp întunecat, apoi asamblate într-un film (20 de cadre pe secundă; 15-25 × viteza normală, în funcție de frecvența respiratorie) folosind un script personalizat scris în MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Toate studiile privind administrarea vectorului genei LV au fost efectuate la Centrul de Cercetare a Animalelor de Laborator al Universității din Adelaide și au avut ca scop utilizarea rezultatelor experimentului SPring-8 pentru a evalua dacă administrarea de LV-MP în prezența unui câmp magnetic ar putea îmbunătăți transferul de gene in vivo. Pentru a evalua efectele MP și ale câmpului magnetic, au fost tratate două grupuri de animale: unui grup i s-a administrat LV-MP cu un magnet plasat, iar celuilalt grup i s-a administrat un grup de control cu ​​LV-MP fără magnet.
Vectorii genei LV au fost generați folosind metode descrise anterior 25, 26. Vectorul LacZ exprimă gena beta-galactozidazei localizată la nivel nuclear, condusă de promotorul constitutiv MPSV (LV-LacZ), care produce un produs de reacție albastru în celulele transduse, vizibil în fronturile țesutului pulmonar și în secțiunile de țesut. Titrarea a fost efectuată în culturi celulare prin numărarea manuală a numărului de celule LacZ pozitive cu un hemocitometru pentru a calcula titrul în TU/ml. Purtătorii sunt crioconservați la -80 °C, decongelați înainte de utilizare și legați de CombiMag prin amestecare într-un raport de 1:1 și incubare pe gheață timp de cel puțin 30 de minute înainte de livrare.
Șobolani Sprague Dawley normali (n = 3/grup, ~2-3 au fost anesteziați intraperitoneal cu un amestec de 0,4 mg/kg medetomidină (Domitor, Ilium, Australia) și 60 mg/kg ketamină (Ilium, Australia) (cu vârsta de o lună) ip) și canulare orală non-chirurgicală cu o canulă iv de 16 Ga. Pentru a se asigura că țesutul căilor respiratorii traheale primește transducția ventriculului stâng (VS), acesta a fost condiționat folosind protocolul nostru de perturbare mecanică descris anterior, în care suprafața căilor respiratorii traheale a fost frecată axial cu un coș de sârmă (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, SUA) timp de 30 de secunde28. Administrarea traheală de VS-MP a fost apoi efectuată într-o hotă de siguranță biologică la aproximativ 10 minute după perturbare.
Câmpul magnetic utilizat în acest experiment a fost configurat într-un mod similar cu cel din studiul de imagistică cu raze X in vivo, cu aceiași magneți ținuți deasupra traheei folosind cleme de stent de distilare (Figura 4). Un volum de 50 μl (2 × 25 μl alicote) de LV-MP a fost administrat în trahee (n = 3 animale) folosind o pipetă care conținea un vârf de gel, așa cum s-a descris anterior. Un grup de control (n = 3 animale) a primit aceleași LV-MP fără utilizarea unui magnet. După finalizarea perfuziei, canula este scoasă din tubul ET și animalul este extubat. Magnetul rămâne pe loc timp de 10 minute, apoi este îndepărtat. Șobolanii au primit o doză subcutanată de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia), urmată de inversarea anesteziei prin injectare intraperitoneală de 1 mg/kg clorhidrat de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Australia). Șobolanii au fost ținuți la cald și monitorizați până la recuperarea completă din anestezie.
Dispozitiv de administrare LV-MP într-o hotă de siguranță biologică. Mufa Luer gri deschis a sondei ET poate fi văzută ieșind din gură, iar vârful de gel al pipetei prezentate în imagine este introdus prin sonda ET până la adâncimea dorită în trahee.
La o săptămână după procedura de dozare LV-MP, animalele au fost sacrificate uman prin inhalare 100% CO2, iar expresia LacZ a fost evaluată utilizând tratamentul nostru standard X-gal. Cele trei inele caudale cele mai cartilaginoase au fost îndepărtate pentru a se asigura că orice deteriorare mecanică sau retenție de lichide din plasarea tubului endotraheal nu a fost inclusă în analiză. Fiecare trahee a fost tăiată longitudinal pentru a crea două jumătăți pentru analiză și au fost montate într-un vas care conținea cauciuc siliconic (Sylgard, Dow Inc) folosind un ac Minutien (Fine Science Tools) pentru a vizualiza suprafața luminală. Distribuția și modelul celulelor transduse au fost confirmate prin fotografie frontală utilizând un microscop Nikon (SMZ1500) cu o cameră DigiLite și software TCapture (Tucsen Photonics, China). Imaginile au fost achiziționate la o mărire de 20x (inclusiv cea mai mare setare pentru lățimea completă a traheei), cu întreaga lungime a traheei fotografiată pas cu pas, asigurând o suprapunere suficientă între fiecare imagine pentru a permite „cusatura” imaginii. Imaginile din fiecare trahee au fost apoi asamblate. într-o singură imagine compozită utilizând Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) care utilizează un algoritm de mișcare planară. Zonele de expresie LacZ din imaginile compozite ale traheei de la fiecare animal au fost cuantificate utilizând un script MATLAB automat (R2020a, MathWorks) așa cum s-a descris anterior, utilizând setări de 0,35 < Nuanță < 0,58, Saturație > 0,15 și Valoare < 0,7. Prin trasarea contururilor țesutului, o mască a fost generată manual în GIMP v2.10.24 pentru fiecare imagine compozită, pentru a identifica zona țesutului și a preveni orice detectare falsă din afara țesutului traheal. Zonele colorate din toate imaginile compozite de la fiecare animal au fost însumate pentru a genera zona totală colorată pentru animalul respectiv. Zona colorată a fost apoi împărțită la zona totală a măștii pentru a genera zona normalizată.
Fiecare trahee a fost încorporată în parafină și au fost tăiate secțiuni de 5 μm. Secțiunile au fost contracolorate cu roșu neutru rapid timp de 5 minute, iar imaginile au fost obținute folosind un microscop Nikon Eclipse E400, o cameră DS-Fi3 și software-ul de captură a elementelor NIS (versiunea 5.20.00).
Toate analizele statistice au fost efectuate în GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Semnificația statistică a fost stabilită la p ≤ 0,05. Normalitatea a fost verificată folosind testul Shapiro-Wilk, iar diferențele în colorarea LacZ au fost evaluate folosind testul t nepereche.
Cele șase microparticule descrise în Tabelul 1 au fost examinate folosind PCXI, iar vizibilitatea este descrisă în Tabelul 2. Două microparticule din polistiren (MP1 și MP2; 18 μm și respectiv 0,25 μm) nu au fost vizibile sub PCXI, dar restul probelor au fost identificabile (exemple sunt prezentate în Figura 5). MP3 și MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm și respectiv 0,9 μm) sunt slab vizibile. Deși conține unele dintre cele mai mici particule testate, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) a fost cea mai pronunțată. Produsul CombiMag MP6 este greu de observat. În toate cazurile, capacitatea noastră de a detecta microparticulele a fost semnificativ îmbunătățită prin deplasarea magnetului înainte și înapoi paralel cu capilarul. Când magneții s-au îndepărtat de capilar, particulele s-au extins în șiruri lungi, dar pe măsură ce magneții s-au apropiat și intensitatea câmpului magnetic a crescut, șirurile de particule s-au scurtat pe măsură ce particulele au migrat spre suprafața superioară a capilarului (vezi videoclipul suplimentar). S1: MP4), crescând densitatea particulelor de la suprafață. În schimb, când magnetul este scos din capilar, intensitatea câmpului scade, iar microparticulele magnetice se rearanjează în șiruri lungi care se extind de la suprafața superioară a capilarului (vezi videoclipul suplimentar S2:MP4). După ce magnetul se oprește din mișcare, particulele continuă să se miște pentru o scurtă perioadă de timp după atingerea poziției de echilibru. Pe măsură ce microparticula se deplasează spre și departe de suprafața superioară a capilarului, particulele magnetice trage de obicei resturile prin fluid.
Vizibilitatea MP sub PCXI variază semnificativ între probe. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 și (d) MP6. Toate imaginile prezentate aici au fost realizate cu un magnet situat la aproximativ 10 mm direct deasupra capilarului. Cercurile mari aparente sunt bule de aer prinse în capilare, arătând clar caracteristicile marginii alb-negru ale imaginii cu contrast de fază. Caseta roșie conține mărirea pentru îmbunătățirea contrastului. Rețineți că diametrele schemelor magnetului din toate figurile nu sunt la scară și sunt de aproximativ 100 de ori mai mari decât cele prezentate.
Pe măsură ce magnetul este deplasat la stânga și la dreapta de-a lungul părții superioare a capilarului, unghiul șirului de microparticule (MP) se schimbă pentru a se alinia cu magnetul (vezi Figura 6), delimitând astfel liniile câmpului magnetic. Pentru MP3-5, după ce coarda atinge un unghi prag, particulele sunt trase de-a lungul suprafeței superioare a capilarului. Acest lucru duce adesea la gruparea MP-urilor în grupuri mai mari aproape de locul unde câmpul magnetic este cel mai puternic (vezi Video suplimentar S3:MP5). Acest lucru este evident și în special atunci când se imagistică aproape de capătul capilarului, ceea ce face ca MP-urile să se agrege și să se concentreze la interfața fluid-aer. Particulele din MP6, care au fost mai dificil de discernut decât în ​​MP3-5, nu au fost trase pe măsură ce magnetul se deplasa de-a lungul capilarului, dar șirurile de MP s-au disociat, lăsând particulele în câmpul vizual (vezi Video suplimentar S4:MP6). În unele cazuri, când câmpul magnetic aplicat a fost redus prin deplasarea magnetului la o distanță mare de locația de imagistică, orice MP-uri rămase au coborât încet pe suprafața inferioară a tubului prin gravitație, rămânând în șir (vezi Video suplimentar S5: MP3).
Unghiul șirului MP se modifică pe măsură ce magnetul este deplasat spre dreapta deasupra capilarului. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 și (d) MP6. Caseta roșie conține mărirea pentru îmbunătățirea contrastului. Rețineți că videoclipurile suplimentare sunt informative, deoarece dezvăluie informații importante despre structura particulelor și informații dinamice care nu pot fi vizualizate în aceste imagini statice.
Testele noastre au arătat că mișcarea lentă a magnetului înainte și înapoi de-a lungul traheei facilitează vizualizarea MP în contextul mișcării complexe in vivo. Testarea in vivo nu a fost efectuată deoarece perlele de polistiren (MP1 și MP2) nu erau vizibile în capilar. Fiecare dintre cele patru MP rămase a fost testat in vivo cu axa lungă a magnetului configurată deasupra traheei la un unghi de aproximativ 30° față de verticală (vezi Figurile 2b și 3a), deoarece acest lucru a dus la lanțuri MP mai lungi și a fost mai eficient decât configurația magnetului terminată. MP3, MP4 și MP6 nu au fost detectate în traheea niciunui animal viu. Când căile respiratorii ale șobolanilor au fost fotografiate după ce animalele au fost ucise uman, particulele au rămas invizibile chiar și atunci când s-a adăugat volum suplimentar folosind o pompă de seringă. MP5 a avut cel mai mare conținut de oxid de fier și a fost singura particulă vizibilă și, prin urmare, a fost utilizată pentru a evalua și caracteriza comportamentul in vivo al MP.
Plasarea magnetului peste trahee în timpul administrării MP a dus la concentrarea multor MP, dar nu a tuturor. Particulele care intră în trahee se observă cel mai bine la animalele sacrificate uman. Figura 7 și videoclipul suplimentar S6: MP5 prezintă captarea magnetică rapidă și alinierea particulelor pe suprafața traheei ventrale, indicând faptul că MP-urile pot fi direcționate către regiunile dorite ale traheei. Când s-a căutat mai distal de-a lungul traheei după administrarea MP-urilor, unele MP-uri au fost găsite mai aproape de carină, sugerând că intensitatea câmpului magnetic a fost insuficientă pentru a colecta și reține toate MP-urile, deoarece acestea au fost administrate prin regiunea cu intensitate maximă a câmpului magnetic în timpul procesului fluid. Cu toate acestea, concentrațiile de MP postpartum au fost mai mari în jurul zonei imagistice, sugerând că multe MP-uri au rămas în regiunile căilor respiratorii unde intensitatea câmpului magnetic aplicat a fost cea mai mare.
Imagini de la (a) înainte și (b) după administrarea MP5 în traheea unui șobolan recent eutanasiat, cu magnetul poziționat direct deasupra zonei de imagistică. Zona imagistică este situată între cele două inele cartilaginoase. Înainte de administrarea MP, există lichid în căile respiratorii. Caseta roșie conține mărirea pentru îmbunătățirea contrastului. Aceste imagini provin din videoclipul prezentat în videoclipul suplimentar S6:MP5.
Translația magnetului de-a lungul traheei in vivo a determinat schimbarea unghiului lanțului de particule microscopice (MP) în cadrul suprafeței căilor respiratorii într-un mod similar cu cel observat în capilare (vezi Figura 8 și Video suplimentar S7:MP5). Cu toate acestea, în studiul nostru, MP-urile nu au putut fi trase de-a lungul suprafeței căilor respiratorii vii așa cum ar fi putut în cazul capilarelor. În unele cazuri, lanțul MP ​​va deveni mai lung pe măsură ce magnetul se mișcă la stânga și la dreapta. Interesant este că am constatat, de asemenea, că șirul de particule pare să modifice adâncimea stratului de fluid de la suprafață atunci când magnetul este deplasat longitudinal de-a lungul traheei și se extinde atunci când magnetul este deplasat direct deasupra capului, iar șirul de particule este rotit într-o poziție verticală (vezi Video suplimentar S7). MP5 la 0:09, dreapta jos). Modelul caracteristic de mișcare s-a schimbat atunci când magnetul a fost deplasat lateral peste partea superioară a traheei (adică, la stânga sau la dreapta animalului, mai degrabă decât de-a lungul traheei). Particulele erau încă clar vizibile pe măsură ce se mișcau, dar când magnetul a fost îndepărtat din trahee, vârfurile șirurilor de particule au devenit vizibile (vezi videoclipul suplimentar S8:MP5, începând cu 0:08). Acest lucru este în concordanță cu comportamentul MP ​​pe care l-am observat sub un câmp magnetic aplicat într-un capilar de sticlă.
Exemple de imagini care prezintă MP5 în traheea unui șobolan anesteziat viu. (a) Magnetul este utilizat pentru a obține imagini deasupra și la stânga traheei, apoi (b) după ce magnetul este mutat spre dreapta. Caseta roșie conține mărirea pentru îmbunătățirea contrastului. Aceste imagini sunt din videoclipul prezentat în videoclipul suplimentar S7:MP5.
Când cei doi poli au fost configurați într-o orientare nord-sud deasupra și dedesubtul traheei (adică atrăgând; Fig. 3b), acordurile MP au părut mai lungi și au fost localizate pe peretele lateral al traheei, mai degrabă decât pe suprafața dorsală a traheei (vezi videoclipul suplimentar S9:MP5). Cu toate acestea, concentrații mari de particule într-o singură locație (adică suprafața dorsală a traheei) nu au fost detectate după administrarea fluidului atunci când s-a utilizat un dispozitiv cu magnet dublu, ceea ce apare de obicei atunci când se utilizează un dispozitiv cu un singur magnet. Apoi, când un magnet a fost configurat să respingă polii invers (Fig. 3c), numărul de particule vizibile în câmpul vizual nu a părut să crească după administrare. Configurarea ambelor configurații cu magnet dublu este dificilă din cauza intensităților mari ale câmpului magnetic care trag sau împing magneții, respectiv. Configurarea a fost apoi schimbată la un singur magnet paralel cu căile respiratorii, dar care trece prin căile respiratorii la 90 de grade, astfel încât liniile de câmp să traverseze peretele traheal ortogonal (Fig. 3d), o orientare concepută pentru a determina dacă se poate observa agregarea particulelor pe peretele lateral. Cu toate acestea, în acest... În configurație, nu a existat nicio mișcare identificabilă de acumulare de MP sau de mișcare a magnetului. Pe baza tuturor acestor rezultate, a fost aleasă o configurație cu un singur magnet, cu orientare de 30 de grade (Figura 3a), pentru studiile in vivo asupra purtătorilor de gene.
Când animalul a fost fotografiat în mod repetat imediat după uciderea umană, absența mișcării confundente a țesuturilor a însemnat că se puteau observa linii de particule mai fine și mai scurte în câmpul intercondral clar, „oscilante” în linie cu mișcarea de translație a magnetului. Cu toate acestea, încă nu se poate observa clar prezența și mișcarea particulelor MP6.
Titrul LV-LacZ a fost de 1,8 × 108 TU/ml, iar după amestecarea 1:1 cu CombiMag MP (MP6), animalele au primit o doză traheală de 50 μl de 9 × 107 TU/ml vehicul LV (adică 4,5 × 106 TU/șobolan). În aceste studii, în loc să translatăm magnetul în timpul travaliului, am fixat magnetul într-o singură poziție pentru a determina dacă transducția LV (a) ar putea fi îmbunătățită în comparație cu administrarea vectorială în absența unui câmp magnetic și (b) ar putea fi focalizată. Celulele căilor respiratorii sunt transduse către regiunile țintă magnetice ale căilor respiratorii superioare.
Prezența magneților și utilizarea CombiMag combinată cu vectori LV nu au părut să aibă efecte adverse asupra sănătății animalelor, la fel ca și protocolul nostru standard de administrare a vectorului LV. Imaginile frontale ale regiunii traheale supuse unei perturbații mecanice (Fig. 1 suplimentar) au indicat că au existat niveluri semnificativ mai mari de transducție în grupul de animale tratate cu LV-MP atunci când magnetul era prezent (Fig. 9a). Doar o cantitate mică de colorare albastră LacZ a fost prezentă în grupul de control (Fig. 9b). Cuantificarea zonelor normalizate colorate cu X-Gal a arătat că administrarea LV-MP în prezența unui câmp magnetic a produs o îmbunătățire de aproximativ 6 ori (Fig. 9c).
Exemple de imagini compozite care prezintă transducția traheală prin LV-MP (a) în prezența unui câmp magnetic și (b) în absența unui magnet. (c) Îmbunătățire statistic semnificativă a ariei normalizate de transducție LacZ în trahee atunci când se utilizează magnetul (*p = 0,029, test t, n = 3 per grup, medie ± SEM).
Secțiunile neutre colorate cu roșu rapid (exemplu prezentat în Fig. 2 suplimentar) au arătat celule colorate cu LacZ prezente într-un model și o locație similare cu cele raportate anterior.
O provocare cheie pentru terapia genică a căilor respiratorii rămâne localizarea precisă a particulelor purtătoare în regiunile de interes și atingerea unor niveluri ridicate de eficiență a transducției în plămânul în mișcare, în prezența fluxului de aer și a eliminării active a mucusului. Pentru purtătorii de ventricul stâng (VS) concepuți pentru a trata boala respiratorie fibroza chistică (FC), creșterea timpului de rezidență a particulelor purtătoare în căile respiratorii conductoare a fost până acum un obiectiv evaziv. După cum au subliniat Castellani și colab., utilizarea câmpurilor magnetice pentru îmbunătățirea transducției are avantaje în comparație cu alte metode de administrare a genelor, cum ar fi electroporarea, deoarece poate combina simplitatea, rentabilitatea, localizarea administrării, eficiența crescută și timpii de incubație mai scurți și, eventual, o doză mai mică de purtător10. Cu toate acestea, depunerea și comportamentul in vivo al particulelor magnetice în căile respiratorii sub influența forțelor magnetice externe nu au fost niciodată descrise și nici nu a fost demonstrată fezabilitatea acestei metode in vivo pentru a îmbunătăți nivelurile de expresie genică în căile respiratorii vii intacte.
Experimentele noastre in vitro cu sincrotron PCXI au arătat că toate particulele testate, cu excepția MP-ului de polistiren, au fost vizibile în configurația de imagistică utilizată. În prezența unui câmp magnetic, MP-urile formează șiruri ale căror lungimi sunt legate de tipul particulei și de intensitatea câmpului magnetic (adică proximitatea și mișcarea magnetului). După cum se arată în Figura 10, șirurile pe care le observăm se formează datorită magnetizării fiecărei particule individuale și inducerii propriului câmp magnetic local. Aceste câmpuri separate determină agregarea și conectarea altor particule similare, cu mișcări asemănătoare unor șiruri de grup datorate forțelor locale provenite de la forțele locale de atracție și respingere ale altor particule.
Schemă care prezintă (a,b) trenuri de particule generate în interiorul capilarelor umplute cu fluid și (c,d) trahee umplută cu aer. Rețineți că capilarele și traheea nu sunt desenate la scară. Panoul (a) conține, de asemenea, o descriere a microscopului multifuncțional (MP), care conține particule de Fe3O4 aranjate în șiruri.
Când magnetul a fost deplasat deasupra capilarului, unghiul șirului de particule a atins un prag critic pentru MP3-5 care conține Fe3O4, după care șirul de particule nu a mai rămas în poziția inițială, ci s-a deplasat de-a lungul suprafeței magnetului către o nouă poziție. Acest efect este probabil să apară deoarece suprafața capilarului de sticlă este suficient de netedă pentru a permite această mișcare. Interesant este că MP6 (CombiMag) nu s-a comportat în acest fel, posibil pentru că particulele erau mai mici, aveau acoperiri sau sarcini de suprafață diferite sau un fluid purtător brevetat le-a afectat capacitatea de mișcare. Contrastul imaginii particulelor CombiMag este, de asemenea, mai slab, sugerând că fluidul și particulele pot avea densități similare și, prin urmare, nu se pot mișca ușor unul spre celălalt. Particulele se pot bloca, de asemenea, dacă magnetul se mișcă prea repede, indicând faptul că intensitatea câmpului magnetic nu poate depăși întotdeauna frecarea dintre particulele din fluid, sugerând că poate nu este surprinzător faptul că intensitatea câmpului magnetic și distanța dintre magnet și zona țintă sunt foarte importante. Luate împreună, aceste rezultate sugerează, de asemenea, că, deși magneții pot capta multe MP-uri care curg prin zona țintă, este puțin probabil să se poată baza pe magneți pentru a se deplasa. Particulele CombiMag de-a lungul suprafeței traheei. Prin urmare, concluzionăm că studiile in vivo LV-MP ar trebui să utilizeze câmpuri magnetice statice pentru a viza fizic regiuni specifice ale arborelui căilor respiratorii.
Când particulele sunt introduse în organism, acestea sunt dificil de identificat în contextul țesutului corporal în mișcare complexă, dar capacitatea de a le detecta a fost îmbunătățită prin deplasarea magnetului pe orizontală deasupra traheei pentru a „mișca” corzile MP. Deși imagistica live este posibilă, este mai ușor de discernut mișcarea particulelor odată ce animalul a fost ucis în mod uman. Concentrațiile de MP au fost în general cele mai mari în această locație atunci când magnetul a fost poziționat deasupra zonei de imagistică, deși unele particule au fost de obicei găsite mai departe de-a lungul traheei. Spre deosebire de studiile in vitro, particulele nu pot fi trase de-a lungul traheei prin deplasarea magnetului. Această constatare este în concordanță cu modul în care mucusul care acoperă suprafața traheei procesează de obicei particulele inhalate, captându-le în mucus și ulterior eliminându-le prin mecanismul de clearance mucociliar.
Am emis ipoteza că utilizarea magneților pentru atracție deasupra și dedesubtul traheei (Fig. 3b) ar putea duce la un câmp magnetic mai uniform, mai degrabă decât la un câmp magnetic foarte concentrat într-un punct, ceea ce ar putea duce la o distribuție mai uniformă a particulelor. Cu toate acestea, studiul nostru preliminar nu a găsit dovezi clare care să susțină această ipoteză. De asemenea, configurarea unei perechi de magneți pentru a se respinge (Fig. 3c) nu a dus la o depunere mai mare de particule în zona imagistică. Aceste două descoperiri demonstrează că configurația cu magneți dubli nu îmbunătățește semnificativ controlul local al direcționării MP și că forțele magnetice puternice rezultate sunt dificil de configurat, ceea ce face ca această abordare să fie mai puțin practică. În mod similar, orientarea magnetului deasupra și prin trahee (Fig. 3d) nu a crescut nici numărul de particule reținute în zona imagistică. Unele dintre aceste configurații alternative pot să nu aibă succes, deoarece duc la intensități mai mici ale câmpului magnetic în zona de depunere. Prin urmare, configurația cu un singur magnet cu un unghi de 30 de grade (Figura 3a) este considerată cea mai ușoară și mai eficientă metodă pentru testarea in vivo.
Studiul LV-MP a arătat că, atunci când vectorii VS au fost combinați cu CombiMag și administrați după perturbare fizică în prezența unui câmp magnetic, nivelurile de transducție au fost semnificativ crescute în trahee, comparativ cu grupul de control. Pe baza studiilor de imagistică sincrotron și a rezultatelor LacZ, câmpul magnetic a fost aparent capabil să păstreze VS în trahee și să reducă numărul de particule vectoriale care au pătruns imediat adânc în plămân. Astfel de îmbunătățiri ale direcționării pot duce la o eficacitate mai mare, reducând în același timp titrurile administrate, transducția în afara țintei, efectele secundare inflamatorii și imune și costurile purtătorilor de gene. Este important de menționat că, potrivit producătorului, CombiMag poate fi utilizat împreună cu alte metode de transfer de gene, inclusiv cu alți vectori virali (cum ar fi AAV) și acizi nucleici.