תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
וקטורים גנים לטיפול במחלת ריאות סיסטיק פיברוזיס צריכים להתמקד בדרכי הנשימה המולכות מכיוון שהתמרה ריאתית היקפית אינה מספקת תועלת טיפולית. יעילות התמרה ויראלית קשורה ישירות לזמן שהייה של הווקטור. עם זאת, נוזלי העברה כמו נשאי גנים מתפזרים באופן טבעי לתוך הנאדיות במהלך שאיפה, וחלקיקים טיפוליים מכל צורה מפונים במהירות על ידי הובלה רירית. הארכת זמן השהייה של נשאי גנים בדרכי הנשימה חשובה אך קשה להשגה. חלקיקים מגנטיים מצומדים לנשא גנים שניתן לכוון אל פני השטח של דרכי הנשימה יכולים לשפר את המיקוד האזורי. עקב אתגרי ההדמיה in vivo, התנהגותם של חלקיקים מגנטיים קטנים כאלה על פני דרכי הנשימה בנוכחות שדה מגנטי מופעל אינה מובנת היטב. מטרת מחקר זה הייתה להשתמש בהדמיית סינכרוטרון כדי להמחיש את התנועה in vivo של סדרה של חלקיקים מגנטיים בקנה הנשימה של חולדות מורדמות כדי לבחון את הדינמיקה והדפוסים של התנהגות חלקיקים בודדים וגדולים in vivo. לאחר מכן הערכנו גם האם אספקת חלקיקים מגנטיים לנטי-ויראליים בנוכחות שדה מגנטי תגביר את יעילות ההתמרה בחולדה. קנה הנשימה. הדמיית רנטגן סינכרוטרון חושפת את התנהגותם של חלקיקים מגנטיים בשדות מגנטיים נייחים ונעים במבחנה ובחי. לא ניתן לגרור חלקיקים בקלות לאורך פני דרכי הנשימה החיות בעזרת מגנטים, אך במהלך ההובלה, המשקעים מרוכזים בשדה הראייה שבו השדה המגנטי הוא החזק ביותר. יעילות ההולכה גדלה גם היא פי שישה כאשר חלקיקים מגנטיים של לנטי-ויראלים נמסרו בנוכחות שדה מגנטי. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שחלקיקים מגנטיים של לנטי-ויראלים ושדות מגנטיים עשויים להיות גישות חשובות לשיפור מיקוד וקטור גנים ולהגברת רמות ההולכה בדרכי הנשימה המוליכות in vivo.
סיסטיק פיברוזיס (CF) נגרמת על ידי שונות בגן יחיד הנקרא מווסת מוליכות טרנסממברני של CF (CFTR). חלבון ה-CFTR הוא תעלת יונים הנמצאת בתאי אפיתל רבים בכל הגוף, כולל דרכי הנשימה המוליכות, אתר עיקרי בפתוגנזה של CF. פגמים ב-CFTR מובילים להובלת מים לא תקינה, התייבשות פני השטח של דרכי הנשימה והפחתת עומק שכבת הנוזל על פני דרכי הנשימה (ASL). זה גם פוגע ביכולתה של מערכת ההובלה הרירית (MCT) לפנות חלקיקים בשאיפה ופתוגנים מדרכי הנשימה. מטרתנו היא לפתח טיפול גנטי לנטי-ויראלי (LV) כדי לספק את העותק הנכון של גן CFTR ולשפר את בריאות ה-ASL, ה-MCT והריאות, ולהמשיך לפתח טכנולוגיות חדשות המסוגלות למדוד פרמטרים אלה in vivo1.
וקטורים של LV הם אחד המועמדים המובילים לטיפול גנטי בדרכי הנשימה של CF, בעיקר משום שהם יכולים לשלב לצמיתות את הגן הטיפולי בתאי הבסיס של דרכי הנשימה (תאי גזע של דרכי הנשימה). זה חשוב משום שהם יכולים לשחזר הידרציה תקינה וסילוק ריר על ידי התמיינות לתאי שטח פונקציונליים הקשורים ל-CF המתוקנים על ידי גנים, וכתוצאה מכך יתרונות לכל החיים. וקטורים של LV צריכים להיות מכוונים נגד דרכי הנשימה המוליכות, שכן כאן מתחילה מחלת ריאות CF. העברת הווקטור עמוק יותר לתוך הריאה עלולה לגרום להתמרה אלוואולרית, אך אין לכך תועלת טיפולית ב-CF. עם זאת, נוזלים כמו נשאי גנים נודדים באופן טבעי אל הנאדיות עם השאיפה לאחר הלידה3,4 וחלקיקים טיפוליים מפונים במהירות לחלל הפה על ידי MCT. יעילות התמרה של LV קשורה ישירות למשך הזמן שהווקטור נשאר ליד תאי המטרה כדי לאפשר ספיגה תאית - "זמן השהייה"5 - אשר מצטמצם בקלות על ידי זרימת אוויר אזורית אופיינית כמו גם לכידת ריר חלקיקים מתואמת ו-MCT. עבור CF, היכולת להאריך את זמן השהייה של LV בתוך דרכי הנשימה חשובה להשגת רמות גבוהות של התמרה באזור זה, אך עד כה הייתה מאתגרת.
כדי להתגבר על מכשול זה, אנו מציעים שחלקיקים מגנטיים של LV (MPs) עשויים לסייע בשתי דרכים משלימות. ראשית, ניתן להדריך אותם באופן מגנטי אל פני השטח של דרכי הנשימה כדי לשפר את המיקוד ולעזור לחלקיקי נושאי הגן להישאר באזור דרכי הנשימה הרצוי; ו-ASL) לנוע לשכבת התא 6. MPs נמצאים בשימוש נרחב ככלי העברת תרופות ממוקדים כאשר הם נקשרים לנוגדנים, תרופות כימותרפיות או מולקולות קטנות אחרות הנצמדות לקרומי התא או נקשרות לקולטנים רלוונטיים על פני התא ומצטברות באתרי גידול בנוכחות חשמל סטטי. שדות מגנטיים לטיפול בסרטן 7. טכניקות "היפרתרמיות" אחרות שואפות לחמם MPs כאשר הם נחשפים לשדות מגנטיים מתנדנדים, ובכך להרוס תאי גידול. עקרון הטרנספקציה המגנטית, שבו שדה מגנטי משמש כחומר טרנספקציה כדי לשפר את העברת ה-DNA לתאים, משמש בדרך כלל במבחנה באמצעות מגוון וקטורי גנים לא-ויראליים וויראליים עבור שורות תאים קשות להעברה. יעילותה של מגנטוטרנספקציה של LV נקבעה, כאשר העברת LV-MPs במבחנה לקו תאי אפיתל סימפונות אנושי בנוכחות שדה מגנטי סטטי, מגדילה את יעילות ההעברה פי 186 בהשוואה לווקטור LV בלבד. LV-MP יושם גם במודל CF במבחנה, שבו טרנספקציה מגנטית הגבירה את התמרת LV בתרביות ממשק אוויר-נוזל פי 20 בנוכחות כיח CF10. עם זאת, מגנטוטרנספקציה של איברים in vivo זכתה לתשומת לב מועטה יחסית והוערכה רק במספר מצומצם של ניסויים בבעלי חיים. מחקרים11,12,13,14,15, במיוחד בריאות16,17. אף על פי כן, ההזדמנויות לטרנספקציה מגנטית בטיפול ריאה באמצעות CF ברורות. טאן ואחרים (2020) קבעו כי "מחקר הוכחת היתכנות של מתן יעיל של ננו-חלקיקים מגנטיים לריאות יסלול את הדרך לאסטרטגיות שאיפת CFTR עתידיות לשיפור התוצאות הקליניות בחולי CF"6.
התנהגותם של חלקיקים מגנטיים קטנים על משטחי דרכי הנשימה בנוכחות שדה מגנטי מופעל קשה להמחשה ומחקר, ולכן אינה מובנת היטב. במחקרים אחרים, פיתחנו שיטת דימות רנטגן בניגוד פאזה מבוססת התפשטות סינכרוטרון (PB-PCXI) כדי להמחיש ולכמת באופן לא פולשני שינויים זעירים in vivo בעומק ASL18 ובהתנהגות MCT19,20 כדי למדוד ישירות את הידרציה של פני השטח של תעלת הגז ומשמשת כאינדיקטור מוקדם ליעילות הטיפול. בנוסף, שיטת הערכת ה-MCT שלנו משתמשת בחלקיקים בקוטר 10-35 מיקרומטר המורכבים מאלומינה או זכוכית בעלת מקדם שבירה גבוה כסמני MCT הנראים לעין באמצעות PB-PCXI21. שתי הטכניקות מתאימות להמחשה של מגוון סוגי חלקיקים, כולל MP.
בשל הרזולוציה המרחבית והזמנית הגבוהה שלה, טכניקות הניתוח ASL ו-MCT שלנו, המבוססות על PB-PCXI, מתאימות היטב לבחינת הדינמיקה והדפוסים של התנהגות חלקיקים בודדים וחלקיקים בכמות גדולה in vivo, כדי לעזור לנו להבין ולמטב את טכניקות העברת גנים של MP. הגישה בה אנו משתמשים כאן נובעת ממחקרים שלנו המשתמשים בקו הקרן SPring-8 BL20B2, שבו הצגנו ויזואליזציה של תנועת נוזלים לאחר העברת מנת וקטור דמה לדרכי הנשימה האף והריאתיות של עכברים, כדי לסייע בהסבר דפוסי ביטוי גנים לא אחידים שנצפו במחקרים בבעלי חיים על מינון נשאי גנים 3,4.
מטרת מחקר זה הייתה להשתמש בסינכרוטרון PB-PCXI כדי להמחיש את התנועות in vivo של סדרה של מגנטים מגנטיים (MPs) בקנה הנשימה של חולדות חיות. מחקרי הדמיה PB-PCXI אלה נועדו לבחון מגוון של מגנטים, עוצמות שדה מגנטי ומיקומים כדי לקבוע את השפעתם על תנועת המגנטים. שיערנו ששדה מגנטי המופעל חיצונית יסייע למגנט המסופק להישאר או לנוע באזור המטרה. מחקרים אלה גם אפשרו לנו לזהות תצורות מגנט שממקסמות את מספר החלקיקים הנותרים בקנה הנשימה לאחר ההפקדה. בסדרה שנייה של מחקרים, ביקשנו להשתמש בתצורה אופטימלית זו כדי להדגים את דפוס ההמרה הנובע ממתן in vivo של מגנטים משמאל לימין (LV-MPs) לדרכי הנשימה של החולדה, בהתבסס על ההנחה שמתן מגנטים משמאל לימין בהקשר של מיקוד דרכי הנשימה יביא לשיפור יעילות ההמרה של דרכי הנשימה.
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת אדלייד (M-2019-060 ו-M-2020-022) ועל ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של SPring-8 Synchrotron. הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE.
כל הדמיית קרני הרנטגן בוצעה בקו הקרן BL20XU בסינכרוטרון SPring-8 ביפן, תוך שימוש במערך דומה לזה שתואר קודם לכן21,22. בקצרה, תיבת הניסוי מוקמה 245 מטר מטבעת אחסון הסינכרוטרון. מרחק של 0.6 מטר בין הדגימה לגלאי משמש למחקרי הדמיית חלקיקים ו-0.3 מטר למחקרי הדמיה in vivo כדי לייצר אפקטים של ניגודיות פאזה. נעשה שימוש באנרגיית קרן מונוכרומטית של 25 keV. תמונות צולמו באמצעות ממיר קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה (SPring-8 BM3) המחובר לגלאי sCMOS. הממיר ממיר קרני רנטגן לאור נראה באמצעות סינטילטור בעובי 10 מיקרומטר (Gd3Al2Ga3O12), אשר לאחר מכן מכוון לחיישן sCMOS באמצעות מטרת מיקרוסקופ × 10 (NA 0.3). גלאי ה-sCMOS היה Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, יפן) עם גודל מערך של 2048 × 2048 פיקסלים וגודל פיקסל גולמי של 6.5 × 6.5 מיקרומטר. הגדרה זו מניבה גודל פיקסל איזוטרופי אפקטיבי של 0.51 מיקרומטר ושדה ראייה של כ-1.1 מ"מ × 1.1 מ"מ. אורך חשיפה של 100 מילישניות נבחר כדי למקסם את יחס אות לרעש של חלקיקים מגנטיים בתוך דרכי הנשימה ומחוצה לה, תוך מזעור תופעות תנועה הנגרמות על ידי נשימה. עבור מחקרי in vivo, תריס רנטגן מהיר הוצב בנתיב קרני הרנטגן כדי להגביל את מינון הקרינה על ידי חסימת קרן הרנטגן בין חשיפות.
נשא LV לא שימש באף מחקרי הדמיה SPring-8 PB-PCXI מכיוון שתא ההדמיה BL20XU אינו מאושר ברמה 2 לבטיחות ביולוגית. במקום זאת, בחרנו מגוון של MPs מאופיינים היטב משני ספקים מסחריים - המכסים מגוון גדלים, חומרים, ריכוזי ברזל ויישומים - תחילה כדי להבין כיצד שדות מגנטיים משפיעים על תנועת MP בתוך נימים מזכוכית, ולאחר מכן בדרכי אוויר חיות. על פני השטח. גודלם של חלקיקי MP נע בין 0.25 ל-18 מיקרומטר ועשויים ממגוון חומרים (ראה טבלה 1), אך הרכב כל דגימה, כולל גודל החלקיקים המגנטיים בתוך ה-MP, אינו ידוע. בהתבסס על מחקרי MCT נרחבים שלנו [19, 20, 21, 23, 24], אנו צופים שניתן יהיה לראות חלקיקי MP קטנים עד כדי 5 מיקרומטר על פני דרכי הנשימה של קנה הנשימה, למשל על ידי חיסור מסגרות עוקבות כדי לראות נראות משופרת של תנועת ה-MP. MP יחיד בגודל 0.25 מיקרומטר קטן יותר מהרזולוציה של מכשיר ההדמיה, אך צפוי ש-PB-PCXI יזהה את ניגודיות הנפח שלהם ואת תנועת נוזל פני השטח עליו הם מופקדים לאחר ההפקדה.
דגימות עבור כל MP בטבלה 1 הוכנו בנימי זכוכית של 20 מיקרוליטר (Drummond Microcaps, PA, USA) בקוטר פנימי של 0.63 מ"מ. חלקיקים קורפוסקולריים זמינים במים, בעוד שחלקיקי CombiMag זמינים בנוזל הקנייני של היצרן. כל צינור מלא למחצה בנוזל (כ-11 מיקרוליטר) ומונחים על מחזיק הדגימה (ראה איור 1). נימי הזכוכית הונחו אופקית על במת הדגימה בתיבת ההדמיה, בהתאמה, ומיקמו את קצוות הנוזל. מגנט בקוטר 19 מ"מ (28 מ"מ אורך) עשוי ניקל, אדמה נדירה ניאודימיום, ברזל בורון (NdFeB) (N35, מס' קטלוגי LM1652, Jaycar Electronics, אוסטרליה) עם מגנטיזציה שיורית של 1.17 טסלה חובר לשלב תרגום נפרד כדי להשיג שינוי מיקומו מרחוק במהלך ההדמיה. רכישת תמונות רנטגן מתחילה כאשר המגנט ממוקם כ-30 מ"מ מעל הדגימה, ותמונות נרכשות בקצב של 4 פריימים לשנייה. במהלך ההדמיה, המגנט היה... הובאו קרוב לצינור הקפילרי מזכוכית (במרחק של כ-1 מ"מ) ולאחר מכן הוזזו לאורך הצינור כדי להעריך את השפעות עוצמת השדה והמיקום.
מערך הדמיה חוץ גופית המכיל דגימות MP בנימי זכוכית על במת תרגום xy של הדגימה. מסלול קרן הרנטגן מסומן בקו מקווקו אדום.
לאחר שנקבעה הנראות של MPs in vitro, תת-קבוצה מהן נבדקה in vivo בחולדות Wistar לבקניות בר (בנות כ-12 שבועות, כ-200 גרם). 0.24 מ"ג/ק"ג מדטומידין (Domitor®, Zenoaq, יפן), 3.2 מ"ג/ק"ג מידזולם (Dormicum®, Astellas Pharma, יפן) ו-4 מ"ג/ק"ג בוטורפנול (Vetorphale®, Meiji Seika). החולדות הורדמו בתערובת של Pharma (יפן) באמצעות הזרקה תוך-צפקית. לאחר ההרדמה, הן הוכנו להדמיה על ידי הסרת הפרווה סביב קנה הנשימה, החדרת צינור אנדוטרכאלי (ET; קנולה תוך-ורידית 16 Ga, Terumo BCT) וקיבוען על גבו על לוחית הדמיה בהתאמה אישית המכילה שקית תרמית לשמירה על טמפרטורת הגוף 22. לאחר מכן חוברה לוחית ההדמיה לשלב העברת הדגימה בתיבת ההדמיה בזווית קלה כדי ליישר את קנה הנשימה אופקית בתמונת הרנטגן, כפי שמוצג באיור. 2א.
(א) הגדרת הדמיה in vivo בתיבת ההדמיה SPring-8, מסלול קרן הרנטגן מסומן בקו מקווקו אדום. (ב,ג) לוקליזציה של מגנט על קנה הנשימה בוצעה מרחוק באמצעות שתי מצלמות IP המותקנות אורתוגונלית. בצד שמאל של תמונת המסך, ניתן לראות את לולאת החוט המחזיקה את הראש, ואת קנולת ההזרקה במקומה בתוך צינור ה-ET.
מערכת משאבת מזרק הנשלטת מרחוק (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) באמצעות מזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר חוברה לצינור PE10 (קוטר חיצוני 0.61 מ"מ, קוטר פנימי 0.28 מ"מ) באמצעות מחט 30 Ga. סמנו את הצינור כדי לוודא שהקצה נמצא במיקום הנכון בקנה הנשימה בעת החדרת צינור ה-ET. באמצעות המיקרו-משאבה, בוכנת המזרק נמשכה בעוד קצה הצינור היה שקוע בדגימת ה-MP שיש להעביר. צינור ההעברה הטעון הוכנס לאחר מכן לצינור האנדוטרכאלי, כשהקצה ממוקם בחלק החזק ביותר של השדה המגנטי הצפוי שלנו. רכישת התמונה נשלטה באמצעות גלאי נשימה המחובר לקופסת התזמון מבוססת Arduino שלנו, וכל האותות (למשל טמפרטורה, נשימה, פתיחת/סגירת תריס ורכישת תמונה) תועדו באמצעות Powerlab ו-LabChart (AD Instruments, סידני, אוסטרליה) 22. בעת צילום התמונה. כאשר המתחם לא היה נגיש, שתי מצלמות IP (Panasonic BB-SC382) הוצבו בזווית של כ-90 מעלות זו לזו ושימשו לניטור מיקום... מגנט יחסית לקנה הנשימה במהלך ההדמיה (איור 2ב', ג'). כדי למזער תופעות תנועה, תמונה אחת נרכשה לכל נשימה במהלך מישור הזרימה הסופי-טידלי.
מגנט מחובר לשלב שני שניתן למקם מרחוק מחוץ למארז ההדמיה. נבדקו מגוון מיקומים ותצורות של מגנטים, כולל: הרכבה בזווית של כ-30° מעל קנה הנשימה (תצורות מוצגות באיורים 2a ו-3a); מגנט אחד מעל בעל החיים והשני מתחת, כאשר הקטבים מוגדרים למשיכה (איור 3b); מגנט אחד מעל בעל החיים והשני מתחת, כאשר הקטבים מוגדרים לדחייה (איור 3c); ומגנט אחד מעל ומאונך לקנה הנשימה (איור 3d). לאחר שתצורת בעל החיים והמגנט מוגדרים וה-MP לבדיקה נטען למשאבת המזרק, יש לספק מנה של 50 מיקרוליטר בקצב של 4 מיקרוליטר/שנייה תוך כדי צילום תמונות. לאחר מכן המגנט מועבר קדימה ואחורה לאורך או לרוחב קנה הנשימה תוך כדי המשך צילום תמונות.
תצורת מגנט להדמיה in vivo (א) מגנט יחיד מעל קנה הנשימה בזווית של כ-30°, (ב) שני מגנטים המוצבים למשיכה, (ג) שני מגנטים המוצבים לדחייה, (ד) מגנט יחיד מעל ומאונך בקנה הנשימה. הצופה הביט למטה מהפה אל הריאות דרך קנה הנשימה, וקרן הרנטגן עברה דרך צד שמאל של החולדה ויצאה מצד ימין. המגנט מועבר לאורך דרכי הנשימה או שמאלה וימינה מעל קנה הנשימה בכיוון קרן הרנטגן.
ביקשנו גם לקבוע את הנראות וההתנהגות של חלקיקים בדרכי הנשימה בהיעדר נשימה מבלבלת ותנועת לב. לכן, בסוף תקופת ההדמיה, בעלי החיים הומתו בצורה הומנית עקב מנת יתר של פנטוברביטל (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 מ"ג/ק"ג ip). חלק מהחיות נותרו על משטח ההדמיה, וכאשר הנשימה והדופק פסקו, תהליך ההדמיה חזר על עצמו, תוך הוספת מינון נוסף של MP אם לא נראה MP על פני דרכי הנשימה.
התמונות שנרכשו עברו תיקון שדה שטוח ושדה אפל ולאחר מכן הורכבו לסרט (20 פריימים לשנייה; מהירות רגילה ×15-25 בהתאם לקצב הנשימה) באמצעות סקריפט מותאם אישית שנכתב ב-MATLAB ‏(R2020a, The Mathworks).
כל מחקרי העברת וקטור גן LV נערכו במתקן המחקר בבעלי חיים במעבדה באוניברסיטת אדלייד ומטרתם הייתה להשתמש בתוצאות ניסוי SPring-8 כדי להעריך האם העברת LV-MP בנוכחות שדה מגנטי יכולה לשפר את העברת הגנים in vivo. כדי להעריך את השפעות ה-MP והשדה המגנטי, טופלו שתי קבוצות של בעלי חיים: קבוצה אחת קיבלה LV-MP עם מגנט, והקבוצה השנייה קיבלה קבוצת ביקורת עם LV-MP ללא מגנט.
וקטורי גן LV נוצרו באמצעות שיטות שתוארו קודם לכן 25, 26. וקטור LacZ מבטא את הגן בטא-גלקטוזידאז מקומי-גרעיני המונע על ידי פרומוטר MPSV קונסטיטוטיבי (LV-LacZ), אשר מייצר תוצר תגובה כחול בתאים שעברו טרנסדוקציה, הנראה בחזיתות רקמת הריאה ובחתכי רקמה. טיטרציה בוצעה בתרביות תאים על ידי ספירה ידנית של מספר התאים החיוביים ל-LacZ באמצעות הומוציטוטומטר כדי לחשב את הטיטר ב-TU/ml. נשאים נשאים נשמרים בהקפאה ב-80°C-, מופשרים לפני השימוש, ונקשרים ל-CombiMag על ידי ערבוב ביחס של 1:1 ודגירה על קרח במשך 30 דקות לפחות לפני המסירה.
חולדות ספראג דאולי תקינות (n = 3/קבוצה, ~2-3 עברו הרדמה תוך-צפקית עם תערובת של 0.4 מ"ג/ק"ג מדטומידין (Domitor, Ilium, אוסטרליה) ו-60 מ"ג/ק"ג קטמין (Ilium, אוסטרליה) בנות חודש) בזריקה תוך-צפקית ותעלות פומית לא ניתוחית באמצעות קנולה תוך-ורידית של 16 Ga. כדי להבטיח שרקמת דרכי הנשימה של קנה הנשימה מקבלת התמרת שמאל (LV), היא הותנתה באמצעות פרוטוקול ההפרעה המכנית שתואר קודם לכן, שבו משטח דרכי הנשימה של קנה הנשימה שופשף בצורה צירית בעזרת סל תיל (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ארה"ב) 30 שניות 28. לאחר מכן בוצעה מתן LV-MP לקנה הנשימה בארון בטיחות ביולוגי כ-10 דקות לאחר ההפרעה.
השדה המגנטי בו נעשה שימוש בניסוי זה תוכנן באופן דומה למחקר הדמיית רנטגן in vivo, כאשר אותם מגנטים הוחזקו מעל קנה הנשימה באמצעות קליפסים לתומכן זיקוק (איור 4). נפח של 50 מיקרוליטר (2 מנות × 25 מיקרוליטר) של LV-MP הוחדר לקנה הנשימה (n = 3 בעלי חיים) באמצעות פיפטה המכילה קצה ג'ל כפי שתואר קודם לכן. קבוצת ביקורת (n = 3 בעלי חיים) קיבלה את אותם LV-MPs ללא שימוש במגנט. לאחר השלמת העירוי, הקנולה מוסרת מצינור ה-ET והחיה מוציאה מהאטובציה. המגנט נשאר במקומו למשך 10 דקות, ולאחר מכן הוא מוסר. חולדות קיבלו מינון תת עורי של מלוקסיקם (1 מ"ל/ק"ג) (Ilium, אוסטרליה) ולאחר מכן היפוך ההרדמה על ידי הזרקה תוך-ורידית של 1 מ"ג/ק"ג אטיפאזול הידרוכלוריד (Antisedan, Zoetis, אוסטרליה). החולדות נשמרו חמות ונבדקו עד להחלמה מלאה מההרדמה.
התקן הזרקה LV-MP בארון בטיחות ביולוגי. ניתן לראות את צינור ה-Luer האפור בהיר של צינור ה-ET בולט מהפה וקצה הג'ל של הפיפטה המוצגת בתמונה מוחדר דרך צינור ה-ET לעומק הרצוי לתוך קנה הנשימה.
שבוע לאחר הליך המינון של LV-MP, בעלי החיים הומתו בצורה הומנית על ידי שאיפת 100% CO2 וביטוי LacZ הוערך באמצעות טיפול X-gal הסטנדרטי שלנו. שלוש הטבעות הסחוסיות ביותר הזנביות הוסרו כדי להבטיח שכל נזק מכני או אצירת נוזלים כתוצאה מהנחת צינור אנדוטרכאלי לא ייכללו בניתוח. כל קנה נשימה נחתך לאורכו כדי ליצור שני חצאים לניתוח, והם הורכבו בצלחת המכילה גומי סיליקון (Sylgard, Dow Inc) באמצעות מחט Minutien (Fine Science Tools) כדי להמחיש את פני השטח הלומינליים. ההתפלגות והדפוס של התאים שעברו מעבר אושרו על ידי צילום חזיתי באמצעות מיקרוסקופ Nikon (SMZ1500) עם מצלמת DigiLite ותוכנת TCapture (Tucsen Photonics, סין). תמונות נרכשו בהגדלה של פי 20 (כולל ההגדרה הגבוהה ביותר עבור רוחב מלא של קנה הנשימה), כאשר כל אורך קנה הנשימה צולם שלב אחר שלב, תוך הבטחת חפיפה מספקת בין כל תמונה כדי לאפשר "תפירת תמונות". תמונות מכל קנה נשלף לאחר מכן הורכבו ל... תמונה מורכבת אחת באמצעות עורך Image Composite v2.0.3 (Microsoft Research) המשתמש באלגוריתם תנועה מישורית. אזורי ביטוי LacZ בתמונות מורכבות של קנה הנשימה מכל בעל חיים כומתו באמצעות סקריפט MATLAB אוטומטי (R2020a, MathWorks) כפי שתואר קודם לכן, תוך שימוש בהגדרות של 0.35 < גוון < 0.58, רוויה > 0.15 וערך < 0.7. על ידי מעקב אחר קווי המתאר של הרקמה, נוצרה מסכה ידנית ב-GIMP גרסה 2.10.24 עבור כל תמונה מורכבת על מנת לזהות את אזור הרקמה ולמנוע זיהוי שווא מחוץ לרקמת קנה הנשימה. האזורים הצבועים מכל התמונות המורכבות מכל בעל חיים סוכמו כדי ליצור את השטח הצבוע הכולל עבור אותו בעל חיים. לאחר מכן חולק השטח הצבוע בשטח המסכה הכולל כדי ליצור את השטח המנורמל.
כל קנה נשימה הוטמע בפרפין וחתכו חתכים של 5 מיקרומטר. החתכים נצבעו בצבע אדום ניטרלי מהיר למשך 5 דקות והתמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ Nikon Eclipse E400, מצלמת DS-Fi3 ותוכנת לכידת אלמנטים NIS (גרסה 5.20.00).
כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו בתוכנת GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). המובהקות הסטטיסטית נקבעה ל-p ≤ 0.05. הנורמליות אומתה באמצעות מבחן שפירו-וילק, וההבדלים בצביעת LacZ הוערכו באמצעות מבחן t לא מזווג.
ששת חלקיקי המגנט המתוארים בטבלה 1 נבדקו באמצעות PCXI, והנראות שלהם מתוארת בטבלה 2. שני חלקיקי מגנט מפוליסטירן (MP1 ו-MP2; 18 מיקרומטר ו-0.25 מיקרומטר, בהתאמה) לא היו גלויים תחת PCXI, אך שאר הדגימות ניתנו לזיהוי (דוגמאות מוצגות באיור 5). MP3 ו-MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 מיקרומטר ו-0.9 מיקרומטר, בהתאמה) נראים קלושות. למרות שהכילו כמה מהחלקיקים הקטנים ביותר שנבדקו, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 מיקרומטר) היה הבולט ביותר. קשה לזהות את מוצר CombiMag MP6. בכל המקרים, היכולת שלנו לזהות MP שופרה משמעותית על ידי תזוזת המגנט קדימה ואחורה במקביל לקפילר. כאשר המגנטים התרחקו מהקפילר, החלקיקים התארכו במחרוזות ארוכות, אך ככל שהמגנטים התקרבו ועוצמת השדה המגנטי גברה, מחרוזות החלקיקים התקצרו ככל שהחלקיקים נדדו לעבר המשטח העליון של הקפילר (ראה סרטון משלים S1: MP4), מה שהגדיל את ה... צפיפות החלקיקים של פני השטח. לעומת זאת, כאשר המגנט מוסר מהנימי, עוצמת השדה פוחתת והחלקיקים המגנטיים מסתדרים מחדש למחרוזות ארוכות המשתרעות מהמשטח העליון של הנמי (ראה סרטון משלים S2: MP4). לאחר שהמגנט מפסיק לנוע, החלקיקים ממשיכים לנוע לזמן קצר לאחר שהגיעו למצב שיווי המשקל. כאשר החלקיקים המגנטיים נעים לעבר המשטח העליון של הנמי וממנו, החלקיקים המגנטיים בדרך כלל גוררים את הפסולת דרך הנוזל.
הנראות של MP תחת PCXI משתנה באופן משמעותי בין דגימות. (א) MP3, (ב) MP4, (ג) MP5 ו-(ד) MP6. כל התמונות המוצגות כאן צולמו באמצעות מגנט הממוקם כ-10 מ"מ ישירות מעל הנימים. העיגולים הגדולים הנראים לעין הם בועות אוויר הלכודות בנימים, ומראות בבירור את מאפייני הקצה השחור-לבן של דימות ניגודיות פאזה. התיבה האדומה מכילה את ההגדלה המגנטית. שימו לב שקטרי הסכמות של המגנט בכל האיורים אינם בקנה מידה וגדולים פי 100 בקירוב מהמוצג.
כאשר המגנט מועבר ימינה ושמאלה לאורך החלק העליון של הקפילרי, זווית מיתר ה-MP משתנה כדי להתיישר עם המגנט (ראה איור 6), ובכך מתארת ​​את קווי השדה המגנטי. עבור MP3-5, לאחר שהמיתר מגיע לזווית סף, החלקיקים נגררים לאורך המשטח העליון של הקפילרי. זה גורם לעתים קרובות להתקבצות חלקיקים לקבוצות גדולות יותר קרוב למקום שבו השדה המגנטי הוא החזק ביותר (ראה סרטון משלים S3:MP5). זה ניכר במיוחד גם בעת הדמיה קרוב לקצה הקפילרי, מה שגורם לחלקיקים להצטבר ולהתרכז בממשק נוזל-אוויר. חלקיקים ב-MP6, שהיו קשים יותר להבחנה מאשר ב-MP3-5, לא נגררו כאשר המגנט נע לאורך הקפילרי, אך מיתרי ה-MP התנתקו, והותירו את החלקיקים בשדה הראייה (ראה סרטון משלים S4:MP6). במקרים מסוימים, כאשר השדה המגנטי שהופעל הופחת על ידי הזזת המגנט למרחק רב ממיקום ההדמיה, כל חלקיקי ה-MP שנותרו ירדו באיטיות למשטח התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה תוך שהם נותרים במיתר (ראה סרטון משלים S5: MP3).
זווית מיתר ה-MP משתנה כאשר המגנט מועבר ימינה מעל הקפילר. (א) MP3, (ב) MP4, (ג) MP5 ו-(ד) MP6. התיבה האדומה מכילה את ההגדלה לשיפור הניגודיות. שימו לב שהסרטונים המשלימים אינפורמטיביים מכיוון שהם חושפים מידע חשוב על מבנה החלקיקים ומידע דינמי שלא ניתן להמחיש בתמונות סטטיות אלה.
הבדיקות שלנו הראו כי הזזת המגנט קדימה ואחורה באיטיות לאורך קנה הנשימה מקלה על הדמיית MP בהקשר של תנועה מורכבת in vivo. לא בוצעה בדיקה in vivo מכיוון שחרוזי פוליסטירן (MP1 ו-MP2) לא היו גלויים בנימי. כל אחד מארבעת חלקיקי ה-MP הנותרים נבדק in vivo כאשר ציר המגנט הארוך מוגדר מעל קנה הנשימה בזווית של כ-30° לאנכי (ראה איורים 2b ו-3a), מכיוון שהדבר הביא לשרשראות MP ארוכות יותר והיה יעיל יותר מתצורת המגנט שהופסקה. MP3, MP4 ו-MP6 לא זוהו בקנה הנשימה של אף בעל חיים חי. כאשר צולמו דרכי הנשימה של החולדות לאחר שהחיות הומתו באופן הומאני, החלקיקים נותרו בלתי נראים גם כאשר נוסף נפח נוסף באמצעות משאבת מזרק. ל-MP5 היה תכולת תחמוצת הברזל הגבוהה ביותר והוא היה החלקיק הנראה היחיד, ולכן שימש להערכת ואפיון התנהגות MP in vivo.
הנחת המגנט מעל קנה הנשימה במהלך מתן MP הביאה לריכוז של MP רבים, אך לא כולם, בשדה הראייה. חלקיקים הנכנסים לקנה הנשימה נצפים בצורה הטובה ביותר בבעלי חיים שהוקרבו באופן הומני. איור 7 וסרטון משלים S6: MP5 מציג לכידה מגנטית מהירה ויישור של חלקיקים על פני קנה הנשימה הגחוני, דבר המצביע על כך שניתן לכוון MP לאזורים הרצויים של קנה הנשימה. בחיפוש דיסטלי יותר לאורך קנה הנשימה לאחר מתן MP, נמצאו MP מסוימים קרוב יותר לקרינה, דבר המצביע על כך שעוצמת השדה המגנטי לא הספיקה לאיסוף ולשמירה על כל MP, מכיוון שהם נמסרו דרך האזור בעל עוצמת השדה המגנטי המרבית במהלך תהליך הנוזל. עם זאת, ריכוזי MP לאחר הלידה היו גבוהים יותר סביב האזור המצולם, דבר המצביע על כך ש-MP רבים נותרו באזורי דרכי הנשימה שבהם עוצמת השדה המגנטי שהופעלה הייתה הגבוהה ביותר.
תמונות מ-(א) לפני ו-(ב) לאחר מתן MP5 לקנה הנשימה של חולדה שהורדמה לאחרונה, כאשר המגנט ממוקם ישירות מעל אזור ההדמיה. האזור המצולם ממוקם בין שתי טבעות הסחוס. לפני מתן MP, יש מעט נוזל בדרכי הנשימה. הקופסה האדומה מכילה את ההגדלה המגבירה את חומר הניגוד. תמונות אלו הן מהסרטון המוצג בסרטון המשלים S6:MP5.
תזוזת המגנט לאורך קנה הנשימה in vivo גרמה לשרשרת MP לשנות את הזווית בתוך פני דרכי הנשימה באופן דומה לזה שנראה בנימים (ראה איור 8 וסרטון משלים S7:MP5). עם זאת, במחקר שלנו, לא יכלו להיגרר MP לאורך פני דרכי הנשימה החיות כפי שניתן היה עם נימים. במקרים מסוימים, שרשרת MP מתארכת ככל שהמגנט נע שמאלה וימינה. מעניין לציין, שמצאנו גם שמחרוזת החלקיקים משנה את עומק שכבת הנוזל על פני השטח כאשר המגנט מועבר לאורכו לאורך קנה הנשימה, ומתרחבת כאשר המגנט מועבר ישירות מעל ומחרוזת החלקיקים מסובבת למצב אנכי (ראה סרטון משלים S7). : MP5 בשעה 0:09, למטה מימין). דפוס התנועה האופייני השתנה כאשר המגנט הוזז לרוחב ראש קנה הנשימה (כלומר, לשמאל או לימין של בעל החיים ולא לאורך קנה הנשימה). החלקיקים עדיין היו גלויים בבירור כשהם נעו, אך כאשר המגנט הוסר מקנה הנשימה, קצות מיתרי החלקיקים הפכו גלויים (ראה סרטון משלים S8:MP5, החל מ-0:08). זה עולה בקנה אחד עם התנהגות MP שראינו תחת שדה מגנטי מופעל בנימי זכוכית.
תמונות לדוגמה המציגות את MP5 בקנה הנשימה של חולדה מורדמת חיה. (א) המגנט משמש לרכישת תמונות מעל ומשמאל לקנה הנשימה, ולאחר מכן (ב) לאחר הזזת המגנט ימינה. התיבה האדומה מכילה את ההגדלה המגבירה את הניגודיות. תמונות אלו הן מהסרטון המוצג בסרטון המשלים S7:MP5.
כאשר שני הקטבים עוצבו בכיוון צפון-דרום מעל ומתחת לקנה הנשימה (כלומר, מושכים; איור 3b), מיתרי ה-MP נראו ארוכים יותר והיו ממוקמים על דופן הנשימה ולא על פני השטח הגביים של קנה הנשימה (ראה סרטון משלים S9:MP5). עם זאת, ריכוזים גבוהים של חלקיקים במיקום יחיד (כלומר, המשטח הגבי של קנה הנשימה) לא זוהו לאחר אספקת נוזלים כאשר נעשה שימוש במכשיר בעל מגנט כפול, דבר המתרחש בדרך כלל כאשר נעשה שימוש במכשיר בעל מגנט יחיד. לאחר מכן, כאשר מגנט אחד הוגדר לדחות את הקטבים בצורה הפוכה (איור 3c), מספר החלקיקים הנראים בשדה הראייה לא נראה כגדל לאחר אספקת הנוזל. הגדרת שתי תצורות המגנט הכפול מאתגרת עקב עוצמות השדה המגנטי הגבוהות שמושכות או דוחפות את המגנטים, בהתאמה. לאחר מכן שונתה ההגדרה למגנט יחיד במקביל לדרכי הנשימה אך עובר דרך דרכי הנשימה בזווית של 90 מעלות כך שקווי השדה חוצים את דופן קנה הנשימה בצורה אורתוגונלית (איור 3d), כיוון שנועד לקבוע אם ניתן לצפות בהצטברות חלקיקים על דופן הצד. עם זאת, ב... בתצורה זו, לא הייתה תנועה ניתנת לזיהוי של הצטברות MP או תנועת מגנט. בהתבסס על כל התוצאות הללו, נבחרה תצורה של מגנט יחיד, בזווית של 30 מעלות (איור 3א) למחקרי נשאים של גנים in vivo.
כאשר בעל החיים צולם שוב ושוב מיד לאחר ההמתה ההומניסטית, היעדר תנועת רקמה מבלבלת גרמה לכך שניתן היה להבחין בקווי חלקיקים דקים וקצרים יותר בשדה הבין-כונדרלי הברור, "מתנדנדים" בהתאם לתנועת הטרנסלציה של המגנט. אף על פי כן, עדיין לא ניתן לראות בבירור את נוכחותם ותנועתם של חלקיקי MP6.
טיטר LV-LacZ היה 1.8 × 108 TU/ml, ולאחר ערבוב ביחס של 1:1 עם CombiMag MP (MP6), בעלי החיים קיבלו מינון של 50 מיקרוליטר לקנה הנשימה של 9 × 107 TU/ml של נשא LV (כלומר 4.5 × 106 TU/חולדה). במחקרים אלה, במקום להעביר את המגנט במהלך הלידה, קיבענו את המגנט במיקום אחד כדי לקבוע האם ניתן לשפר את התמרת ה-LV (א) בהשוואה למסירה וקטורית בהיעדר שדה מגנטי, ו-(ב) ניתן למקד אותו. תאי דרכי הנשימה עוברים התמרה לאזורי מטרה מגנטיים של דרכי הנשימה העליונות.
נוכחות מגנטים והשימוש ב-CombiMag בשילוב עם וקטורים של LV לא נראה כבעלי השפעות שליליות על בריאות בעלי החיים, כפי שעשה פרוטוקול מתן וקטור LV הסטנדרטי שלנו. תמונות חזיתיות של אזור קנה הנשימה שעבר הפרעה מכנית (איור משלים 1) הצביעו על רמות גבוהות משמעותית של התמרה בקבוצת בעלי החיים שטופלו ב-LV-MP כאשר המגנט היה נוכח (איור 9א). רק כמות קטנה של צביעת LacZ כחולה הייתה קיימת בקבוצת הביקורת (איור 9ב). כימות של אזורים מנורמלים ב-X-Gal הראה כי מתן LV-MP בנוכחות שדה מגנטי הניב שיפור של פי 6 בערך (איור 9ג).
תמונות מורכבות לדוגמה המציגות התמרה של קנה הנשימה על ידי LV-MP (א) בנוכחות שדה מגנטי ו-(ב) בהיעדר מגנט. (ג) שיפור מובהק סטטיסטית באזור התמרה מנורמל של LacZ בתוך קנה הנשימה בעת שימוש במגנט (*p = 0.029, מבחן t, n = 3 לכל קבוצה, ממוצע ± SEM).
חתכים צבועים באדום מהיר ניטרלי (דוגמה המוצגת באיור המשלים 2) הראו תאים צבועים ב-LacZ הנמצאים בדפוס ובמיקום דומים כפי שדווח בעבר.
אתגר מרכזי עבור טיפול גנטי בדרכי הנשימה נותר המיקום המדויק של חלקיקי נשא לאזורים מעניינים והשגת רמות גבוהות של יעילות התמרה בריאה הנעה בנוכחות זרימת אוויר וסילוק ריר פעיל. עבור נשאים של LV שנועדו לטפל במחלת דרכי הנשימה של CF, הגדלת זמן השהייה של חלקיקי נשא בדרכי הנשימה המוליכות הייתה מטרה חמקמקה עד כה. כפי שציינו קסטלני ועמיתיו, לשימוש בשדות מגנטיים לשיפור התמרה יש יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות של העברת גנים כגון אלקטרופורציה, מכיוון שהוא יכול לשלב פשטות, עלות-תועלת, מיקום אספקה, יעילות מוגברת וזמני דגירה קצרים יותר, ואולי גם מינון נשא קטן יותר. עם זאת, השקיעה וההתנהגות in vivo של חלקיקים מגנטיים בדרכי הנשימה תחת השפעת כוחות מגנטיים חיצוניים מעולם לא תוארו, וגם לא הודגמה היתכנותה של שיטה זו in vivo לשיפור רמות ביטוי גנים בדרכי נשימה חיות שלמות.
ניסויי הסינכרוטרון PCXI שלנו במבחנה הראו שכל החלקיקים שבדקנו, למעט פוליסטירן MP, היו גלויים במערך ההדמיה בו השתמשנו. בנוכחות שדה מגנטי, חלקיקים MP יוצרים מיתרים שאורכם קשור לסוג החלקיק ולעוצמת השדה המגנטי (כלומר, קרבה ותנועה של המגנט). כפי שמוצג באיור 10, המיתרים שאנו צופים נוצרים עקב מגנטיות של כל חלקיק בודד ויצירת שדה מגנטי מקומי משלו. שדות נפרדים אלה גורמים לחלקיקים דומים אחרים להתאגד ולהתחבר, עם תנועות דמויות מיתרים קבוצתיות עקב כוחות מקומיים מכוחות המשיכה והדחייה המקומיים של חלקיקים אחרים.
סכמטיקה המציגה (א,ב) סדרות חלקיקים שנוצרו בתוך נימים מלאי נוזל ו-(ג,ד) קנה נשימה מלא באוויר. שימו לב שהנימים וקנה הנשימה אינם מצוירים בקנה מידה. פאנל (א) מכיל גם תיאור של ה-MP, המכיל חלקיקי Fe3O4 המסודרים במחרוזות.
כאשר המגנט הוזז מעל הקפילר, זווית מחרוזת החלקיקים הגיעה לסף קריטי עבור MP3-5 המכיל Fe3O4, ולאחר מכן מחרוזת החלקיקים לא נשארה עוד במיקום המקורי, אלא נעה לאורך פני השטח למיקום חדש. מגנט. סביר להניח שאפקט זה מתרחש מכיוון שפני השטח של קפילר הזכוכית חלקים מספיק כדי לאפשר תנועה זו להתרחש. מעניין לציין ש-MP6 (CombiMag) לא התנהג כך, אולי משום שהחלקיקים היו קטנים יותר, היו להם ציפויים או מטענים שונים, או שנוזל נשא קנייני השפיע על יכולתם לנוע. ניגודיות התמונה של חלקיקי CombiMag חלשה יותר, דבר המצביע על כך שהנוזל והחלקיקים עשויים להיות בעלי צפיפויות דומות ולכן אינם נעים בקלות זה לעבר זה. חלקיקים יכולים גם להיתקע אם המגנט נע מהר מדי, דבר המצביע על כך שעוצמת השדה המגנטי לא תמיד יכולה להתגבר על החיכוך בין החלקיקים בנוזל, דבר המצביע על כך שאולי אין זה מפתיע שעוצמת השדה המגנטי והמרחק בין המגנט לאזור המטרה חשובים מאוד. יחד, תוצאות אלו מצביעות גם על כך שבעוד שמגנטים יכולים ללכוד MPs רבים הזורמים דרך אזור המטרה, לא סביר שניתן לסמוך על מגנטים כדי לנוע. חלקיקי CombiMag לאורך פני קנה הנשימה. לכן, אנו מסיקים שמחקרי LV-MP in vivo צריכים להשתמש בשדות מגנטיים סטטיים כדי לכוון פיזית לאזורים ספציפיים בעץ דרכי הנשימה.
כאשר חלקיקים מועברים לגוף, קשה לזהות אותם בהקשר של רקמת גוף מורכבת ונעה, אך היכולת לזהות אותם שופרה על ידי הזזת המגנט אופקית מעל קנה הנשימה כדי "לנענע" את מיתרי ה-MP. למרות שהדמיה חיה אפשרית, קל יותר להבחין בתנועת חלקיקים לאחר שהחיה הומתה בצורה הומנית. ריכוזי ה-MP היו בדרך כלל הגבוהים ביותר במיקום זה כאשר המגנט הוצב מעל אזור ההדמיה, אם כי חלק מהחלקיקים נמצאו בדרך כלל לאורך קנה הנשימה. בניגוד למחקרים חוץ גופיים, לא ניתן לגרור חלקיקים לאורך קנה הנשימה על ידי הזזת המגנט. ממצא זה עולה בקנה אחד עם האופן שבו הריר המצפה את פני קנה הנשימה מעבד בדרך כלל חלקיקים בשאיפה, לוכד אותם בריר ולאחר מכן מפונה על ידי מנגנון ניקוי הרירי.
שיערנו כי השימוש במגנטים למשיכה מעל ומתחת לקנה הנשימה (איור 3ב) עשוי לגרום לשדה מגנטי אחיד יותר, ולא לשדה מגנטי מרוכז מאוד בנקודה אחת, מה שעשוי להוביל לפיזור אחיד יותר של חלקיקים. עם זאת, המחקר המקדים שלנו לא מצא ראיות ברורות התומכות בהשערה זו. באופן דומה, הגדרת זוג מגנטים לדחייה (איור 3ג) לא הביאה לשקיעת חלקיקים רבה יותר באזור המצולם. שני ממצאים אלה מראים כי הגדרת המגנט הכפול אינה משפרת באופן משמעותי את השליטה המקומית במיקוד MP, וכי קשה להגדיר את הכוחות המגנטיים החזקים הנובעים מכך, מה שהופך גישה זו לפחות מעשית. באופן דומה, כיוון המגנט מעל ודרך קנה הנשימה (איור 3ד) גם לא הגדיל את מספר החלקיקים הנותרים באזור המצולם. חלק מהתצורות החלופיות הללו עשויות שלא להיות מוצלחות מכיוון שהן גורמות לעוצמות שדה מגנטי נמוכות יותר באזור השקיעה. לכן, תצורת מגנט יחיד בזווית של 30 מעלות (איור 3א) נחשבת לשיטה הקלה והיעילה ביותר לבדיקות in vivo.
מחקר LV-MP הראה שכאשר וקטורים של LV שולבו עם CombiMag וסופקו לאחר הפרעה פיזית בנוכחות שדה מגנטי, רמות התמרה גנטית עלו משמעותית בקנה הנשימה בהשוואה לקבוצת הביקורת. בהתבסס על מחקרי הדמיית הסינכרוטרון ותוצאות LacZ, השדה המגנטי הצליח ככל הנראה לשמר את LV בתוך קנה הנשימה ולהפחית את מספר חלקיקי הווקטור שחדרו מיד לעומק הריאה. שיפורים כאלה במיקוד עשויים להוביל ליעילות גבוהה יותר תוך הפחתת טיטרים מועברים, התמרה מחוץ למטרה, תופעות לוואי דלקתיות וחיסוניות ועלויות נשאי גנים. חשוב לציין, שלפי היצרן, ניתן להשתמש ב-CombiMag בשילוב עם שיטות העברת גנים אחרות, כולל עם וקטורים ויראליים אחרים (כגון AAV) וחומצות גרעין.