Благодарим вас за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшей работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Генные векторы для лечения муковисцидоза легких должны быть нацелены на проводящие дыхательные пути, поскольку периферическая легочная трансдукция не обеспечивает терапевтического эффекта. Эффективность вирусной трансдукции напрямую связана со временем пребывания вектора. Однако жидкости для доставки, такие как носители генов, естественным образом диффундируют в альвеолы ​​во время вдоха, а терапевтические частицы любой формы быстро выводятся мукоцилиарным транспортом. Продление времени пребывания носителей генов в дыхательных путях важно, но труднодостижимо. Конъюгированные с носителями генов магнитные частицы, которые можно направлять на поверхность дыхательных путей, могут улучшить региональное нацеливание. Из-за проблем визуализации in vivo поведение таких небольших магнитных частиц на поверхности дыхательных путей в присутствии приложенного магнитного поля плохо изучено. Целью данного исследования было использование синхротронной визуализации для визуализации in vivo движения серии магнитных частиц в трахее анестезированных крыс для изучения динамики и закономерностей поведения отдельных и объемных частиц in vivo. Затем мы также оценили, обеспечивает ли доставка Лентивирусные магнитные частицы в присутствии магнитного поля повышают эффективность трансдукции в трахее крысы. Синхротронная рентгеновская визуализация выявляет поведение магнитных частиц в стационарных и движущихся магнитных полях in vitro и in vivo. Частицы не могут легко перемещаться по поверхности живых дыхательных путей с помощью магнитов, но во время транспортировки отложения концентрируются в поле зрения, где магнитное поле наиболее сильное. Эффективность трансдукции также увеличивалась в шесть раз, когда лентивирусные магнитные частицы доставлялись в присутствии магнитного поля. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что лентивирусные магнитные частицы и магнитные поля могут быть ценными подходами для улучшения нацеливания генного вектора и повышения уровней трансдукции в проводящих дыхательных путях in vivo.
Муковисцидоз (МВ) вызывается изменением в одном гене, называемом регулятором трансмембранной проводимости МВ (CFTR). Белок МВТР представляет собой ионный канал, который присутствует во многих эпителиальных клетках по всему телу, включая проводящие дыхательные пути, основной участок патогенеза МВ. Дефекты МВТР приводят к аномальному транспорту воды, обезвоживанию поверхности дыхательных путей и уменьшению глубины слоя жидкости на поверхности дыхательных путей (ASL). Это также ухудшает способность системы мукоцилиарного транспорта (МСТ) очищать дыхательные пути от вдыхаемых частиц и патогенов. Наша цель — разработать лентивирусную (ЛВ) генную терапию для доставки правильной копии гена МВТР и улучшения ASL, MCT и здоровья легких, а также продолжить разработку новых технологий, способных измерять эти параметры in vivo1.
Векторы LV являются одними из ведущих кандидатов для генной терапии дыхательных путей при муковисцидозе, главным образом потому, что они могут постоянно интегрировать терапевтический ген в базальные клетки дыхательных путей (стволовые клетки дыхательных путей). Это важно, поскольку они могут восстанавливать нормальную гидратацию и очищение от слизи, дифференцируясь в функциональные генно-скорректированные клетки поверхности дыхательных путей, связанные с муковисцидозом, что приводит к пожизненным преимуществам. Векторы LV должны быть направлены против проводящих дыхательных путей, поскольку именно там начинается заболевание легких при муковисцидозе. Доставка вектора глубже в легкие может привести к альвеолярной трансдукции, но это не имеет терапевтического преимущества при муковисцидозе. Однако жидкости, такие как носители генов, естественным образом мигрируют в альвеолы ​​при вдохе после доставки3,4, а терапевтические частицы быстро выводятся в полость рта с помощью МСТ. Эффективность трансдукции LV напрямую связана с продолжительностью времени, в течение которого вектор остается рядом с целевыми клетками, обеспечивая клеточный захват — «время пребывания»5 — которое легко сокращается типичным региональным потоком воздуха, а также координированным захватом частиц слизи и МСТ. Для муковисцидоза Возможность продлить время пребывания ЛЖ в дыхательных путях важна для достижения высоких уровней трансдукции в этой области, но до сих пор это было непросто.
Чтобы преодолеть это препятствие, мы предполагаем, что магнитные частицы (МП) ЛЖ могут помочь двумя взаимодополняющими способами. Во-первых, их можно направлять с помощью магнита к поверхности дыхательных путей, чтобы улучшить нацеливание и помочь частицам-носителям генов закрепиться в нужной области дыхательных путей; и (АСЛ) переместиться в клеточный слой 6. МП широко используются в качестве средств целевой доставки лекарств, когда они связываются с антителами, химиотерапевтическими препаратами или другими малыми молекулами, которые прикрепляются к клеточным мембранам или связываются с соответствующими рецепторами на поверхности клеток и накапливаются в местах опухоли в присутствии статического электричества. Магнитные поля для лечения рака 7. Другие «гипертермические» методы направлены на нагревание MP, когда они подвергаются воздействию осциллирующих магнитных полей, тем самым разрушая опухолевые клетки. Принцип магнитной трансфекции, в котором магнитное поле используется в качестве трансфекционного агента для улучшения переноса ДНК в клетки, обычно используется in vitro с использованием ряда невирусных и вирусных генных векторов для труднотрансдуцируемых клеточных линий. Эффективность LV-магнитотрансфекции была установлена ​​с помощью in vitro доставки LV-MP в линию эпителиальных клеток бронхов человека в присутствии статического магнитного поля, что увеличило эффективность трансдукции в 186 раз по сравнению с одним только вектором LV. LV-MP также применялся к модели CF in vitro, где магнитная трансфекция увеличила трансдукцию LV в культурах интерфейса воздух-жидкость в 20 раз в присутствии мокроты CF10. Однако in vivo магнитотрансфекция органов получила относительно мало внимания и была оценена только на нескольких животных исследования11,12,13,14,15, особенно в легких16,17. Тем не менее, возможности магнитной трансфекции в терапии легких при МВ очевидны. Тан и др. (2020) заявили, что «концептуальное исследование эффективной доставки магнитных наночастиц в легкие проложит путь для будущих стратегий ингаляции МВТР для улучшения клинических результатов у пациентов с МВ»6.
Поведение мелких магнитных частиц на поверхности дыхательных путей в присутствии приложенного магнитного поля трудно визуализировать и изучать, и поэтому оно плохо изучено. В других исследованиях мы разработали метод фазово-контрастной рентгеновской визуализации на основе синхротронного распространения (PB-PCXI) для неинвазивной визуализации и количественной оценки мельчайших изменений in vivo глубины ASL18 и поведения MCT19,20 для непосредственного измерения гидратации поверхности газового канала и использования в качестве раннего индикатора эффективности лечения. Кроме того, наш метод оценки MCT использует частицы диаметром 10–35 мкм, состоящие из оксида алюминия или стекла с высоким показателем преломления, в качестве маркеров MCT, видимых с помощью PB-PCXI21. Оба метода подходят для визуализации ряда типов частиц, включая MP.
Благодаря высокому пространственному и временному разрешению наши методы анализа ASL и MCT на основе PB-PCXI хорошо подходят для изучения динамики и закономерностей поведения отдельных и объемных частиц in vivo, что помогает нам понимать и оптимизировать методы доставки генов MP. Подход, который мы здесь используем, основан на наших исследованиях с использованием канала пучка SPring-8 BL20B2, в котором мы визуализировали движение жидкости после доставки ложной дозы вектора в носовые и легочные дыхательные пути мышей, чтобы помочь объяснить наши неоднородные паттерны экспрессии генов, наблюдаемые в наших исследованиях животных с дозой гена-носителя3,4.
Целью данного исследования было использование синхротрона PB-PCXI для визуализации in vivo движений серии МП в трахее живых крыс. Эти исследования визуализации PB-PCXI были разработаны для тестирования ряда МП, напряженностей магнитного поля и местоположений для определения их влияния на движение МП. Мы предположили, что внешнее приложенное магнитное поле поможет доставленным МП оставаться или перемещаться в целевую область. Эти исследования также позволили нам определить конфигурации магнитов, которые максимизируют количество частиц, удерживаемых в трахее после осаждения. Во второй серии исследований мы стремились использовать эту оптимальную конфигурацию для демонстрации паттерна трансдукции, возникающего в результате доставки in vivo LV-MP в дыхательные пути крысы, основываясь на предположении, что доставка LV-MP в контексте нацеливания на дыхательные пути приведет к повышению эффективности трансдукции LV.
Все исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, одобренными Университетом Аделаиды (M-2019-060 и M-2020-022) и Комитетом по этике работы с животными на синхротроне SPring-8. Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE.
Все рентгеновские изображения были получены на линии пучка BL20XU на синхротроне SPring-8 в Японии с использованием установки, аналогичной описанной ранее21,22. Вкратце, экспериментальный бокс был расположен в 245 м от накопительного кольца синхротрона. Расстояние от образца до детектора 0,6 м используется для исследований изображений частиц и 0,3 м для исследований изображений in vivo для создания эффектов фазового контраста. Использовалась энергия монохроматического пучка 25 кэВ. Изображения были получены с помощью рентгеновского преобразователя высокого разрешения (SPring-8 BM3), соединенного с детектором sCMOS. Преобразователь преобразует рентгеновские лучи в видимый свет с помощью сцинтиллятора толщиной 10 мкм (Gd3Al2Ga3O12), который затем направляется на датчик sCMOS с помощью объектива микроскопа × 10 (NA 0,3). Детектором sCMOS был Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) с размером матрицы 2048 × 2048 пикселей и размером необработанного пикселя 6,5 × 6,5 мкм. Такая установка обеспечивает эффективный изотропный размер пикселя 0,51 мкм и поле зрения приблизительно 1,1 мм × 1,1 мм. Длительность экспозиции 100 мс была выбрана для максимального увеличения отношения сигнал/шум магнитных частиц внутри и снаружи дыхательных путей при минимизации артефактов движения, вызванных дыханием. Для исследований in vivo на пути рентгеновских лучей был установлен быстрый рентгеновский затвор, чтобы ограничить дозу облучения путем блокирования рентгеновского луча между экспозициями.
Носитель LV не использовался ни в одном исследовании визуализации SPring-8 PB-PCXI, поскольку камера визуализации BL20XU не имеет сертификата биологической безопасности уровня 2. Вместо этого мы выбрали ряд хорошо охарактеризованных МП от двух коммерческих поставщиков, охватывающих диапазон размеров, материалов, концентраций железа и областей применения, — сначала для того, чтобы понять, как магнитные поля влияют на движение МП в стеклянных капиллярах, а затем в дыхательных путях живых людей. на поверхности. MP имеют размер от 0,25 до 18 мкм и изготавливаются из различных материалов (см. Таблицу 1), но состав каждого образца, включая размер магнитных частиц внутри MP, неизвестен. Основываясь на наших обширных исследованиях MCT19, 20, 21, 23, 24, мы ожидаем, что MP размером до 5 мкм можно будет увидеть на поверхности трахеальных дыхательных путей, например, путем вычитания последовательных кадров, чтобы увидеть улучшенную видимость движения MP. Отдельный MP размером 0,25 мкм меньше разрешения устройства визуализации, но ожидается, что PB-PCXI обнаружит их объемный контраст и движение поверхностной жидкости, на которой они откладываются после отложения.
Образцы для каждого МП в Таблице 1 были подготовлены в стеклянных капиллярах объемом 20 мкл (Drummond Microcaps, PA, США) с внутренним диаметром 0,63 мм. Корпускулярные частицы доступны в воде, в то время как частицы CombiMag доступны в фирменной жидкости производителя. Каждая пробирка наполовину заполнена жидкостью (приблизительно 11 мкл) и помещена в держатель образца (см. Рисунок 1). Стеклянные капилляры были размещены горизонтально на предметном столике образца в боксе для визуализации, соответственно, и позиционировали края жидкости. Магнит из редкоземельного неодима, железа и бора (NdFeB) диаметром 19 мм (длиной 28 мм) с никелевой оболочкой (N35, номер по каталогу LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) с остаточной намагниченностью 1,17 Тесла был прикреплен к отдельному трансляционному столику для достижения дистанционного изменения его положения во время визуализации. Получение рентгеновского изображения начинается, когда магнит располагается примерно в 30 мм над образцом, и изображения получаются со скоростью 4 кадра в секунду. Во время получения изображения магнит подносился близко к стеклянной капиллярной трубке (на расстоянии около 1 мм), а затем перемещался вдоль трубки для оценки влияния напряженности поля и положения.
Установка для получения изображений in vitro, содержащая образцы MP в стеклянных капиллярах на столике перемещения образца по осям xy. Путь рентгеновского луча отмечен красной пунктирной линией.
После того, как была установлена ​​видимость MP in vitro, подгруппа из них была протестирована in vivo на самках белых крыс Wistar дикого типа (возраст ~12 недель, ~200 г). 0,24 мг/кг медетомидина (Domitor®, Zenoaq, Япония), 3,2 мг/кг мидазолама (Dormicum®, Astellas Pharma, Япония) и 4 мг/кг буторфанола (Vetorphale®, Meiji Seika). Крысы были анестезированы смесью Pharma), Япония) путем внутрибрюшинной инъекции. После анестезии их подготовили для визуализации, удалив шерсть вокруг трахеи, вставив эндотрахеальную трубку (ET; 16 Ga iv канюля, Terumo BCT) и иммобилизовав их на спине на специально изготовленной пластине для визуализации, содержащей термосумку для поддержания температуры тела 22 . Затем пластину для визуализации прикрепили к столику для перемещения образца в боксе для визуализации с небольшим угол, чтобы выровнять трахею горизонтально на рентгеновском снимке, как показано на рисунке 2а.
(a) Настройка визуализации in vivo в блоке визуализации SPring-8, путь рентгеновского луча отмечен красной пунктирной линией. (b,c) Магнитная локализация трахеи выполнялась дистанционно с использованием двух ортогонально установленных IP-камер. В левой части изображения на экране можно увидеть проволочную петлю, удерживающую голову, и канюлю доставки, установленную внутри эндотрахеальной трубки.
Система шприцевого насоса с дистанционным управлением (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) с использованием стеклянного шприца объемом 100 мкл была подключена к трубке PE10 (внешний диаметр 0,61 мм, внутренний диаметр 0,28 мм) через иглу 30 Ga. Пометьте трубку, чтобы убедиться, что наконечник находится в правильном положении в трахее при вставке трубки ЭТ. С помощью микронасоса поршень шприца был извлечен, в то время как наконечник трубки был погружен в образец MP, который должен быть доставлен. Затем загруженная трубка доставки была вставлена ​​в эндотрахеальную трубку, помещая наконечник в самую сильную часть нашего ожидаемого приложенного магнитного поля. Получение изображения контролировалось с помощью детектора дыхания, подключенного к нашему блоку синхронизации на базе Arduino, и все сигналы (например, температура, дыхание, открытие/закрытие затвора и получение изображения) регистрировались с помощью Powerlab и LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) 22. При получении изображения Когда корпус был недоступен, две IP-камеры (Panasonic BB-SC382) были расположены примерно под углом 90° друг к другу и использовались для контроля положения магнита относительно трахеи во время визуализации (рис. 2b,c). Чтобы свести к минимуму артефакты движения, на каждом вдохе во время плато конечного выдоха получалось одно изображение.
Магнит прикреплен ко второй ступени, которая может быть расположена удаленно снаружи корпуса визуализации. Были протестированы различные положения и конфигурации магнита, в том числе: установленный под углом приблизительно 30° над трахеей (конфигурации показаны на рисунках 2a и 3a); один магнит над животным, а другой под ним, с полюсами, установленными на притяжение (рисунок 3b); один магнит над животным, а другой под ним, с полюсами, установленными на отталкивание (рисунок 3c); и один магнит над трахеей и перпендикулярно ей (рисунок 3d). После того, как животное и магнит настроены, а тестируемый МП загружен в шприцевой насос, введите дозу 50 мкл со скоростью 4 мкл/сек, одновременно получая изображения. Затем магнит перемещают вперед и назад вдоль или вбок поперек трахеи, продолжая получать изображения.
Конфигурация магнита для визуализации in vivo (a) один магнит над трахеей под углом приблизительно 30°, (b) два магнита, настроенные на притяжение, (c) два магнита, настроенные на отталкивание, (d) один магнит над трахеей и перпендикулярно ей. Наблюдатель смотрел вниз ото рта к легким через трахею, а рентгеновский луч проходил через левую сторону крысы и выходил с правой стороны. Магнит перемещался либо вдоль дыхательных путей, либо влево и вправо над трахеей в направлении рентгеновского луча.
Мы также стремились определить видимость и поведение частиц в дыхательных путях при отсутствии мешающего дыхания и сердечного ритма. Поэтому в конце периода визуализации животных гуманно умерщвляли из-за передозировки пентобарбитала (Сомнопентил, Pitman-Moore, Вашингтон-Кроссинг, США; ~65 мг/кг внутрибрюшинно). Некоторых животных оставляли на платформе визуализации, и после остановки дыхания и сердцебиения процесс визуализации повторяли, добавляя дополнительную дозу МП, если МП не было видно на поверхности дыхательных путей.
Полученные изображения были скорректированы по методу плоского и темного поля, а затем собраны в фильм (20 кадров в секунду; скорость 15–25 × нормальная в зависимости от частоты дыхания) с использованием специального скрипта, написанного в среде MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Все исследования по доставке генного вектора LV проводились в Центре исследований лабораторных животных в Университете Аделаиды и были направлены на использование результатов эксперимента SPring-8 для оценки того, может ли доставка LV-MP в присутствии магнитного поля улучшить перенос генов in vivo. Для оценки эффектов МП и магнитного поля были обработаны две группы животных: одной группе вводили LV-MP с размещенным магнитом, а другой группе вводили контрольную группу с LV-MP без магнита.
Векторы гена LV были получены с использованием ранее описанных методов25, 26. Вектор LacZ экспрессирует локализованный в ядре ген бета-галактозидазы, управляемый конститутивным промотором MPSV (LV-LacZ), который производит синий продукт реакции в трансдуцированных клетках, видимый на фронтах легочной ткани и срезах тканей. Титрование проводили в клеточных культурах путем ручного подсчета количества LacZ-положительных клеток с помощью гемоцитометра для расчета титра в ТЕ/мл. Носители криоконсервируют при -80 °C, размораживают перед использованием и связывают с CombiMag путем смешивания в соотношении 1:1 и инкубации на льду в течение не менее 30 минут перед доставкой.
Нормальные крысы Sprague Dawley (n = 3/группа, ~2-3 были анестезированы внутрибрюшинно смесью 0,4 мг/кг медетомидина (Domitor, Ilium, Австралия) и 60 мг/кг кетамина (Ilium, Австралия) в возрасте месячной инъекции внутрибрюшинно и нехирургической оральной канюлей с внутривенной канюлей 16 Ga. Чтобы гарантировать, что ткань дыхательных путей трахеи получает трансдукцию LV, ее кондиционировали с помощью нашего ранее описанного протокола механической пертурбации, в котором поверхность дыхательных путей трахеи растирали в осевом направлении проволочной корзиной (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, США) в течение 30 с28. Затем в боксе биологической безопасности примерно через 10 минут после пертурбации проводили введение LV-MP в трахею.
Магнитное поле, используемое в этом эксперименте, было сконфигурировано аналогично исследованию рентгеновской визуализации in vivo, с теми же магнитами, удерживаемыми над трахеей с помощью дистилляционных стентовых зажимов (рисунок 4). Объем 50 мкл (2 × 25 мкл аликвоты) LV-MP был доставлен в трахею (n = 3 животных) с помощью пипетки с гелевым наконечником, как описано ранее. Контрольная группа (n = 3 животных) получила те же LV-MP без использования магнита. После завершения инфузии канюля удаляется из ЭТ-трубки, и животное экстубируется. Магнит остается на месте в течение 10 минут, затем его удаляют. Крысам вводили подкожную дозу мелоксикама (1 мл/кг) (Ilium, Австралия), после чего анестезию отменяли путем внутрибрюшинной инъекции 1 мг/кг гидрохлорида атипамазола (Antisedan, Zoetis, Австралия). Крысы содержались согреться и находиться под наблюдением до полного выхода из наркоза.
Устройство доставки LV-MP в боксе биологической безопасности. Светло-серый наконечник Люэра трубки ЭТ выступает изо рта, а гелевый наконечник пипетки, показанный на рисунке, вводится через трубку ЭТ на нужную глубину в трахею.
Через неделю после процедуры дозирования LV-MP животные были гуманно умерщвлены путем 100% ингаляции CO2, и экспрессия LacZ была оценена с использованием нашей стандартной обработки X-gal. Три самых каудальных хрящевых кольца были удалены, чтобы гарантировать, что любые механические повреждения или задержка жидкости из-за размещения эндотрахеальной трубки не были включены в анализ. Каждая трахея была разрезана продольно, чтобы создать две половины для анализа, и они были помещены в чашку, содержащую силиконовый каучук (Sylgard, Dow Inc) с помощью иглы Minutien (Fine Science Tools) для визуализации поверхности просвета. Распределение и рисунок трансдуцированных клеток были подтверждены фронтальной фотографией с использованием микроскопа Nikon (SMZ1500) с камерой DigiLite и программным обеспечением TCapture (Tucsen Photonics, Китай). Изображения были получены при 20-кратном увеличении (включая максимальную настройку для полной ширины трахеи), при этом вся длина трахеи была визуализирована шаг за шагом, обеспечивая достаточное перекрытие между каждым изображение для «сшивания» изображений. Затем изображения каждой трахеи были собраны в одно составное изображение с помощью редактора составных изображений Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) с использованием алгоритма плоскостного движения. Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного были количественно оценены с помощью автоматизированного скрипта MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 < Оттенок < 0,58, Насыщенность > 0,15 и Значение < 0,7. Путем отслеживания контуров ткани в GIMP v2.10.24 вручную была сгенерирована маска для каждого составного изображения, чтобы идентифицировать область ткани и предотвратить любые ложные обнаружения из-за пределов ткани трахеи. Окрашенные области со всех составных изображений каждого животного были суммированы для создания общей окрашенной области для этого животного. Затем окрашенная область была разделена на общую площадь маски для создания нормализованной области.
Каждую трахею заливали парафином и делали срезы толщиной 5 мкм. Срезы контрастно окрашивали нейтральным быстрым красным в течение 5 минут, а изображения получали с помощью микроскопа Nikon Eclipse E400, камеры DS-Fi3 и программного обеспечения для захвата элементов NIS (версия 5.20.00).
Все статистические анализы проводились в GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Статистическая значимость была установлена ​​на уровне p ≤ 0,05. Нормальность проверялась с помощью критерия Шапиро-Уилка, а различия в окрашивании LacZ оценивались с помощью непарного t-критерия Стьюдента.
Шесть MP, описанных в Таблице 1, были исследованы с помощью PCXI, а видимость описана в Таблице 2. Два MP из полистирола (MP1 и MP2; 18 мкм и 0,25 мкм соответственно) не были видны под PCXI, но остальные образцы были идентифицированы (примеры показаны на Рисунке 5). MP3 и MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 мкм и 0,9 мкм соответственно) слабо видны. Хотя MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) содержал некоторые из самых мелких протестированных частиц, он был наиболее выраженным. Продукт CombiMag MP6 трудно обнаружить. Во всех случаях наша способность обнаруживать MP была значительно улучшена путем перемещения магнита вперед и назад параллельно капилляру. Когда магниты удалялись от капилляра, частицы вытягивались в длинные нити, но по мере приближения магнитов и увеличения магнитного напряженность поля увеличивалась, нити частиц укорачивались по мере того, как частицы мигрировали к верхней поверхности капилляра (см. Дополнительное видео S1: MP4), увеличивая плотность частиц на поверхности. И наоборот, когда магнит удаляется из капилляра, напряженность поля уменьшается, и МП перестраиваются в длинные нити, простирающиеся от верхней поверхности капилляра (см. Дополнительное видео S2: MP4). После того, как магнит прекращает движение, частицы продолжают двигаться в течение короткого времени после достижения положения равновесия. По мере того, как МП движется к верхней поверхности капилляра и от нее, магнитные частицы обычно увлекают за собой мусор через жидкость.
Видимость MP под PCXI значительно различается между образцами. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 и (d) MP6. Все представленные здесь изображения были получены с помощью магнита, расположенного примерно в 10 мм непосредственно над капилляром. Видимые большие круги представляют собой пузырьки воздуха, захваченные в капиллярах, четко демонстрирующие черно-белые краевые особенности фазово-контрастного изображения. Красный прямоугольник содержит контрастно-усиленное увеличение. Обратите внимание, что диаметры схем магнитов на всех рисунках не соответствуют масштабу и примерно в 100 раз больше показанных.
По мере того как магнит перемещается влево и вправо вдоль верхней части капилляра, угол струны МП изменяется, чтобы совпасть с магнитом (см. Рисунок 6), таким образом очерчивая линии магнитного поля. Для МП3-5, после того как хорда достигает порогового угла, частицы перетаскиваются вдоль верхней поверхности капилляра. Это часто приводит к тому, что МП объединяются в более крупные группы вблизи того места, где магнитное поле наиболее сильное (см. Дополнительное видео S3:MP5). Это также особенно заметно при визуализации вблизи конца капилляра, что заставляет МП объединяться и концентрироваться на границе раздела жидкость-воздух. Частицы в МП6, которые было труднее различить, чем МП3-5, не перетаскивались при перемещении магнита вдоль капилляра, но струны МП диссоциировали, оставляя частицы в поле зрения (см. Дополнительное видео S4:MP6). В некоторых случаях, когда приложенное магнитное поле уменьшалось путем перемещения магнита на большое расстояние от места визуализации, любые оставшиеся МП медленно опускались на нижнюю поверхность трубки под действием силы тяжести. оставаясь при этом в строю (см. дополнительное видео S5: MP3).
Угол наклона струны МП изменяется по мере перемещения магнита вправо над капилляром. (a) МП3, (b) МП4, (c) МП5 и (d) МП6. Красный прямоугольник содержит контрастное увеличение. Обратите внимание, что дополнительные видео являются информативными, поскольку они раскрывают важную структуру частиц и динамическую информацию, которую невозможно визуализировать на этих статических изображениях.
Наши испытания показали, что медленное перемещение магнита вперед и назад вдоль трахеи облегчает визуализацию МП в контексте сложного движения in vivo. Испытания in vivo не проводились, поскольку полистирольные шарики (MP1 и MP2) не были видны в капилляре. Каждый из оставшихся четырех МП был испытан in vivo с длинной осью магнита, сконфигурированной над трахеей под углом около 30° к вертикали (см. рисунки 2b и 3a), поскольку это приводило к более длинным цепям МП и было более эффективным, чем конфигурация с терминированным магнитом. MP3, MP4 и MP6 не были обнаружены в трахее ни одного живого животного. При визуализации дыхательных путей крыс после гуманного умерщвления животных частицы оставались невидимыми даже при добавлении дополнительного объема с помощью шприцевого насоса. MP5 имел самое высокое содержание оксида железа и был единственной видимой частицей, и поэтому использовался для оценки и характеристики поведения МП in vivo.
Размещение магнита над трахеей во время доставки МП привело к тому, что многие, но не все МП были сконцентрированы в поле зрения. Частицы, попадающие в трахею, лучше всего наблюдаются у гуманно умерщвленных животных. Рисунок 7 и дополнительное видео S6: МП5 показывают быстрый магнитный захват и выравнивание частиц на поверхности вентральной части трахеи, что указывает на то, что МП могут быть направлены в желаемые области трахеи. При поиске более дистально вдоль трахеи после доставки МП некоторые МП были обнаружены ближе к карине, что свидетельствует о том, что напряженность магнитного поля была недостаточной для сбора и удержания всех МП, поскольку они были доставлены через область максимальной напряженности магнитного поля во время процесса подачи жидкости. Тем не менее, послеродовые концентрации МП были выше вокруг области визуализации, что свидетельствует о том, что многие МП оставались в областях дыхательных путей, где напряженность приложенного магнитного поля была самой высокой.
Изображения (a) до и (b) после доставки MP5 в трахею недавно умерщвленной крысы с магнитом, расположенным непосредственно над областью визуализации. Область визуализации расположена между двумя хрящевыми кольцами. Перед доставкой MP в дыхательных путях присутствует некоторое количество жидкости. Красный прямоугольник содержит контрастное увеличение. Эти изображения взяты из видео, показанного в дополнительном видео S6:MP5.
Перемещение магнита вдоль трахеи in vivo приводило к изменению угла цепи МП в пределах поверхности дыхательных путей способом, аналогичным тому, который наблюдается в капиллярах (см. Рисунок 8 и Дополнительное видео S7:MP5). Однако в нашем исследовании МП не могли перемещаться по поверхности живых дыхательных путей, как это было возможно в капиллярах. В некоторых случаях цепь МП удлинялась по мере перемещения магнита влево и вправо. Интересно, что мы также обнаружили, что цепочка частиц, по-видимому, изменяет глубину поверхностного слоя жидкости, когда магнит перемещается продольно вдоль трахеи, и расширяется, когда магнит перемещается прямо над головой, а цепочка частиц поворачивается в вертикальное положение (см. Дополнительное видео S7). : MP5 на 0:09, внизу справа). Характерная картина движения изменилась, когда магнит был перемещен по верхней части трахеи латерально (то есть слева или справа от животного, а не вдоль длины трахеи). Частицы по-прежнему были четко видны по мере их движения, но когда магнит был удален от трахеи, кончики струн частиц стали видны (см. дополнительное видео S8:MP5, начиная с 0:08). Это согласуется с поведением МП, которое мы наблюдали под действием приложенного магнитного поля в стеклянном капилляре.
Примеры изображений, демонстрирующих MP5 в трахее живой анестезированной крысы. (a) Магнит используется для получения изображений выше и слева от трахеи, затем (b) после перемещения магнита вправо. Красный прямоугольник содержит контрастное увеличение. Эти изображения взяты из видео, показанного в дополнительном видео S7:MP5.
Когда два полюса были сконфигурированы в ориентации север-юг над и под трахеей (т. е. притягивались; рис. 3b), хорды MP казались длиннее и располагались на боковой стенке трахеи, а не на дорсальной поверхности трахеи (см. дополнительное видео S9:MP5). Однако высокие концентрации частиц в одном месте (т. е. на дорсальной поверхности трахеи) не были обнаружены после подачи жидкости при использовании устройства с двумя магнитами, что обычно происходит при использовании устройства с одним магнитом. Затем, когда один магнит был сконфигурирован для отталкивания полюсов, поменянных местами (рис. 3c), количество частиц, видимых в поле зрения, по-видимому, не увеличилось после подачи. Настройка обеих конфигураций с двумя магнитами является сложной из-за высокой напряженности магнитного поля, которое тянет или толкает магниты соответственно. Затем настройка была изменена на один магнит, параллельный дыхательным путям, но проходящий через дыхательные пути под углом 90 градусов, так что линии поля пересекали трахею стенке ортогонально (рис. 3d), ориентация, предназначенная для определения того, можно ли наблюдать агрегацию частиц на боковой стенке. Однако в этой конфигурации не было идентифицируемого движения накопления МП или движения магнита. На основании всех этих результатов была выбрана конфигурация с одним магнитом и 30-градусной ориентацией (рис. 3a) для исследований переносчиков генов in vivo.
Когда животное было повторно визуализировано сразу после гуманного умерщвления, отсутствие мешающего движения тканей означало, что более тонкие и короткие линии частиц можно было различить в чистом межхрящевом поле, «шатающиеся» в соответствии с поступательным движением магнита. Тем не менее, все еще не удается четко увидеть присутствие и движение частиц MP6.
Титр LV-LacZ составил 1,8 × 108 ТЕ/мл, и после смешивания 1:1 с CombiMag MP (MP6) животные получили 50 мкл трахеальной дозы 9 × 107 ТЕ/мл носителя LV (т.е. 4,5 × 106 ТЕ/крысу). В этих исследованиях вместо перемещения магнита во время родов мы зафиксировали магнит в одном положении, чтобы определить, можно ли улучшить трансдукцию LV (a) по сравнению с доставкой вектора в отсутствие магнитного поля, и (b) можно ли сфокусировать Клетки дыхательных путей трансдуцируются в целевые магнитные области верхних дыхательных путей.
Присутствие магнитов и использование CombiMag в сочетании с векторами LV, по-видимому, не оказывали неблагоприятного воздействия на здоровье животных, как это было при нашем стандартном протоколе доставки вектора LV. Фронтальные изображения области трахеи, подвергнутой механическому возмущению (дополнительный рис. 1), показали, что в группе животных, получавших лечение LV-MP, при наличии магнита наблюдались значительно более высокие уровни трансдукции (рис. 9a). В контрольной группе наблюдалось лишь небольшое количество синего окрашивания LacZ (рис. 9b). Количественная оценка нормализованных областей, окрашенных X-Gal, показала, что введение LV-MP в присутствии магнитного поля приводило к приблизительно 6-кратному улучшению (рис. 9c).
Пример составных изображений, демонстрирующих трансдукцию трахеи с помощью LV-MP (a) в присутствии магнитного поля и (b) в отсутствие магнита. (c) Статистически значимое улучшение нормализованной площади трансдукции LacZ в трахее при использовании магнита (*p = 0,029, t-критерий Стьюдента, n = 3 на группу, среднее значение ± SEM).
Срезы, окрашенные нейтральным быстрым красным (пример показан на дополнительном рис. 2), показали, что окрашенные LacZ клетки присутствуют в той же схеме и в том же месте, что и сообщалось ранее.
Ключевой проблемой генной терапии дыхательных путей остается точная локализация частиц-носителей в интересующих областях и достижение высоких уровней эффективности трансдукции в движущемся легком при наличии воздушного потока и активного очищения от слизи. Для носителей LV, разработанных для лечения заболеваний дыхательных путей при муковисцидозе, увеличение времени пребывания частиц-носителей в проводящих дыхательных путях до сих пор было труднодостижимой целью. Как отмечают Кастеллани и др., использование магнитных полей для улучшения трансдукции имеет преимущества по сравнению с другими методами доставки генов, такими как электропорация, поскольку оно может сочетать простоту, экономическую эффективность, локализацию доставки, повышенную эффективность и более короткое время инкубации, а также, возможно, меньшую дозу носителя10. Однако осаждение и поведение магнитных частиц в дыхательных путях in vivo под воздействием внешних магнитных сил никогда не были описаны, и на самом деле не была продемонстрирована возможность применения этого метода in vivo для повышения уровней экспрессии генов в неповрежденных живых дыхательных путях.
Наши эксперименты in vitro на синхротроне PCXI показали, что все протестированные нами частицы, за исключением полистирольных MP, были видны в используемой нами установке для визуализации. В присутствии магнитного поля MP образуют струны, длина которых зависит от типа частицы и напряженности магнитного поля (т. е. близости и движения магнита). Как показано на рисунке 10, наблюдаемые нами струны образуются из-за того, что каждая отдельная частица намагничивается и создает свое собственное локальное магнитное поле. Эти отдельные поля заставляют другие подобные частицы объединяться и соединяться с групповыми струноподобными движениями из-за локальных сил от локальных сил притяжения и отталкивания других частиц.
Схематическое изображение (a, b) цепочек частиц, образующихся внутри заполненных жидкостью капилляров и (c, d) заполненных воздухом трахей. Обратите внимание, что капилляры и трахеи нарисованы не в масштабе. Панель (a) также содержит описание МП, которая содержит частицы Fe3O4, организованные в цепочки.
Когда магнит перемещался над капилляром, угол струны частиц достигал критического порога для MP3-5, содержащего Fe3O4, после чего струна частиц больше не оставалась в исходном положении, а перемещалась по поверхности в новое положение.магнит.Этот эффект, вероятно, возникал из-за того, что поверхность стеклянного капилляра была достаточно гладкой, чтобы позволить этому движению произойти.Интересно, что MP6 (CombiMag) не вел себя таким образом, возможно, потому, что частицы были меньше, имели разные покрытия или поверхностные заряды, или запатентованная жидкость-носитель влияла на их способность двигаться.Контраст изображения частиц CombiMag также слабее, что говорит о том, что жидкость и частицы могут иметь схожую плотность и, следовательно, нелегко двигаться навстречу друг другу.Частицы также могут застревать, если магнит движется слишком быстро, что указывает на то, что сила магнитного поля не всегда может преодолеть трение между частицами в жидкости, что, возможно, неудивительно, что сила магнитного поля и расстояние между магнитом и целевой областью очень важны.В совокупности эти результаты также предполагают, что, хотя магниты могут захватывать много MP, которые протекают через целевую область, маловероятно, что магниты могут перемещать частицы CombiMag вдоль поверхности трахеи. Поэтому мы приходим к выводу, что в исследованиях LV-MP in vivo следует использовать статические магнитные поля для физического воздействия на определенные области дыхательных путей.
Когда частицы попадают в организм, их трудно идентифицировать в контексте сложной движущейся ткани тела, но способность их обнаружения была улучшена путем перемещения магнита горизонтально над трахеей для «покачивания» нитей МП. Хотя визуализация в реальном времени возможна, легче различить движение частиц после того, как животное было гуманно убито. Концентрации МП, как правило, были самыми высокими в этом месте, когда магнит располагался над областью визуализации, хотя некоторые частицы обычно обнаруживались дальше по трахее. В отличие от исследований in vitro, частицы нельзя перетаскивать вдоль трахеи путем перемещения магнита. Это открытие согласуется с тем, как слизь, покрывающая поверхность трахеи, обычно обрабатывает вдыхаемые частицы, захватывая их в слизи и впоследствии выводя с помощью механизма мукоцилиарного клиренса.
Мы предположили, что использование магнитов для притяжения над и под трахеей (рис. 3b) может привести к более однородному магнитному полю, а не к магнитному полю, которое высоко сконцентрировано в одной точке, что потенциально приводит к более равномерному распределению частиц. Однако наше предварительное исследование не нашло четких доказательств в поддержку этой гипотезы. Аналогичным образом, настройка пары магнитов для отталкивания (рис. 3c) не привела к большему осаждению частиц в области изображения. Эти два вывода показывают, что установка с двумя магнитами не значительно улучшает локальный контроль нацеливания МП, и что полученные сильные магнитные силы трудно настроить, что делает этот подход менее практичным. Аналогичным образом, ориентация магнита над и через трахею (рис. 3d) также не увеличила количество частиц, удерживаемых в области изображения. Некоторые из этих альтернативных конфигураций могут оказаться неуспешными, поскольку они приводят к более низкой напряженности магнитного поля в области осаждения. Поэтому конфигурация с одним магнитом под углом 30 градусов (рис. 3a) считается самой простой и наиболее эффективный метод тестирования in vivo.
Исследование LV-MP показало, что при объединении векторов LV с CombiMag и доставке после физического воздействия в присутствии магнитного поля уровни трансдукции в трахее были значительно повышены по сравнению с контрольной группой. На основании исследований синхротронной визуализации и результатов LacZ, магнитное поле, по-видимому, способно сохранять LV в трахее и уменьшать количество векторных частиц, которые немедленно проникают глубоко в легкие. Такие улучшения нацеливания могут привести к более высокой эффективности при одновременном снижении доставляемых титров, нецелевой трансдукции, воспалительных и иммунных побочных эффектов и затрат на перенос генов. Важно отметить, что, по словам производителя, CombiMag можно использовать в сочетании с другими методами переноса генов, в том числе с другими вирусными векторами (такими как AAV) и нуклеиновыми кислотами.