Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Генные векторы для лечения легочного заболевания при муковисцидозе должны быть нацелены на проводящие дыхательные пути, поскольку периферическая трансдукция легких не обеспечивает терапевтического эффекта. Эффективность вирусной трансдукции напрямую связана со временем пребывания вектора. Однако транспортные жидкости, такие как носители генов, естественным образом диффундируют в альвеолы ​​во время вдоха, а терапевтические частицы любой формы быстро выводятся мукоцилиарным транспортом. Увеличение времени пребывания носителей генов в дыхательных путях важно, но труднодостижимо. Конъюгированные с носителями генов магнитные частицы, которые могут быть направлены к поверхности дыхательных путей, могут улучшить региональное таргетирование. Из-за трудностей визуализации in vivo поведение таких мелких магнитных частиц на поверхности дыхательных путей в присутствии приложенного магнитного поля изучено недостаточно. Целью данного исследования было использование синхротронной визуализации для наблюдения за движением in vivo ряда магнитных частиц в трахее анестезированных крыс с целью изучения динамики и закономерностей поведения отдельных частиц и их массы in vivo. Затем мы также оценили, влияет ли доставка Лентивирусные магнитные частицы в присутствии магнитного поля повышают эффективность трансдукции в трахее крысы. Синхротронная рентгеновская визуализация позволяет наблюдать поведение магнитных частиц в стационарных и движущихся магнитных полях in vitro и in vivo. Частицы нелегко перемещать по поверхности живых дыхательных путей с помощью магнитов, но во время транспортировки отложения концентрируются в поле зрения, где магнитное поле наиболее сильное. Эффективность трансдукции также увеличилась в шесть раз, когда лентивирусные магнитные частицы доставлялись в присутствии магнитного поля. В совокупности эти результаты показывают, что лентивирусные магнитные частицы и магнитные поля могут быть ценными подходами для улучшения направленного воздействия генных векторов и повышения уровня трансдукции в проводящих дыхательных путях in vivo.
Муковисцидоз (МВ) вызывается вариацией в одном гене, называемом регулятором трансмембранной проводимости CFTR. Белок CFTR представляет собой ионный канал, присутствующий во многих эпителиальных клетках по всему организму, включая проводящие дыхательные пути, являющиеся основным местом патогенеза МВ. Дефекты CFTR приводят к нарушению транспорта воды, обезвоживанию поверхности дыхательных путей и уменьшению глубины слоя поверхностной жидкости дыхательных путей (ASL). Это также ухудшает способность системы мукоцилиарного транспорта (MCT) удалять вдыхаемые частицы и патогены из дыхательных путей. Наша цель — разработать лентивирусную (LV) генную терапию для доставки правильной копии гена CFTR и улучшения ASL, MCT и здоровья легких, а также продолжить разработку новых технологий, способных измерять эти параметры in vivo1.
Векторы LV являются одними из ведущих кандидатов для генной терапии дыхательных путей при муковисцидозе, главным образом потому, что они могут навсегда интегрировать терапевтический ген в базальные клетки дыхательных путей (стволовые клетки дыхательных путей). Это важно, поскольку они могут восстановить нормальную гидратацию и отведение слизи, дифференцируясь в функциональные генно-скорректированные клетки поверхности дыхательных путей, связанные с муковисцидозом, что приводит к пожизненным преимуществам. Векторы LV следует направлять против проводящих дыхательных путей, поскольку именно здесь начинается легочное заболевание при муковисцидозе. Введение вектора глубже в легкие может привести к альвеолярной трансдукции, но это не имеет терапевтического эффекта при муковисцидозе. Однако жидкости, такие как носители генов, естественным образом мигрируют в альвеолы ​​при вдохе после введения3,4, а терапевтические частицы быстро выводятся в полость рта с помощью МСТ. Эффективность трансдукции LV напрямую связана с продолжительностью времени, в течение которого вектор остается рядом с целевыми клетками, чтобы обеспечить клеточное поглощение – «время пребывания»5, которое легко сокращается типичным региональным потоком воздуха, а также скоординированным захватом частиц слизи и МСТ. Для муковисцидоза способность Увеличение времени пребывания левого желудочка в дыхательных путях имеет важное значение для достижения высокого уровня трансдукции в этой области, но до сих пор это представляло собой сложную задачу.
Для преодоления этого препятствия мы предполагаем, что магнитные частицы LV могут помочь двумя взаимодополняющими способами. Во-первых, их можно магнитно направлять к поверхности дыхательных путей для улучшения адресной доставки и обеспечения локализации частиц-носителей генов в желаемой области дыхательных путей; и, во-вторых, их можно перемещать в клеточный слой 6 (ASL). Магнитные частицы широко используются в качестве средств адресной доставки лекарств, когда они связываются с антителами, химиотерапевтическими препаратами или другими малыми молекулами, которые прикрепляются к клеточным мембранам или связываются с соответствующими рецепторами клеточной поверхности и накапливаются в опухолевых очагах в присутствии статического электричества. Магнитные поля для лечения рака 7. Другие «гипертермические» методы направлены на нагрев микрочастиц при воздействии на них осциллирующих магнитных полей, что приводит к разрушению опухолевых клеток. Принцип магнитной трансфекции, при котором магнитное поле используется в качестве трансфекционного агента для усиления переноса ДНК в клетки, широко применяется in vitro с использованием ряда невирусных и вирусных генных векторов для труднотрансдуцируемых клеточных линий. Эффективность магнитотрансфекции с использованием леветирацетама (ЛВ) была установлена: in vitro доставка ЛВ-микрочастиц в линию клеток эпителия бронхов человека в присутствии статического магнитного поля увеличила эффективность трансдукции в 186 раз по сравнению с использованием только ЛВ-вектора. ЛВ-микрочастицы также применялись в модели муковисцидоза in vitro, где магнитная трансфекция увеличила трансдукцию ЛВ в культурах на границе раздела воздух-жидкость в 20 раз в присутствии мокроты пациентов с муковисцидозом10. Однако магнитотрансфекция органов in vivo получила относительно мало внимания и была оценена лишь на нескольких животных. исследования11,12,13,14,15, особенно в легких16,17. Тем не менее, возможности магнитной трансфекции в терапии легких при муковисцидозе очевидны. Тан и др. (2020) заявили, что «исследование, подтверждающее концепцию эффективной доставки магнитных наночастиц в легкие, проложит путь для будущих стратегий ингаляционного введения CFTR с целью улучшения клинических результатов у пациентов с муковисцидозом»6.
Поведение мелких магнитных частиц на поверхностях дыхательных путей в присутствии приложенного магнитного поля трудно визуализировать и изучать, и поэтому оно плохо изучено. В других исследованиях мы разработали метод фазово-контрастной рентгеновской визуализации на основе распространения синхротронного излучения (PB-PCXI) для неинвазивной визуализации и количественной оценки мельчайших изменений глубины ASL18 и поведения MCT19,20 in vivo, чтобы напрямую измерять гидратацию поверхности газового канала и использовать его в качестве раннего индикатора эффективности лечения. Кроме того, наш метод оценки MCT использует частицы диаметром 10–35 мкм, состоящие из оксида алюминия или стекла с высоким показателем преломления, в качестве маркеров MCT, видимых с помощью PB-PCXI21. Обе методики подходят для визуализации различных типов частиц, включая MP.
Благодаря высокому пространственному и временному разрешению, наши методы анализа ASL и MCT на основе PB-PCXI хорошо подходят для изучения динамики и закономерностей поведения отдельных частиц и целых частиц in vivo, что помогает нам понять и оптимизировать методы доставки генов с помощью микрочастиц. Используемый нами подход основан на наших исследованиях с использованием линии SPring-8 BL20B2, в которых мы визуализировали движение жидкости после введения контрольной дозы вектора в носовые и легочные дыхательные пути мышей, что помогает объяснить неравномерные закономерности экспрессии генов, наблюдаемые в наших исследованиях на животных с использованием дозы носителя гена 3,4.
Целью данного исследования было использование синхротрона PB-PCXI для визуализации движений ряда микрочастиц (МП) in vivo в трахее живых крыс. Эти исследования с использованием PB-PCXI были разработаны для тестирования различных типов МП, напряженности магнитного поля и их расположения с целью определения их влияния на движение МП. Мы предположили, что внешнее магнитное поле поможет доставленным МП оставаться или перемещаться в целевую область. Эти исследования также позволили нам определить конфигурации магнитов, которые максимизируют количество частиц, удерживаемых в трахее после осаждения. Во второй серии исследований мы стремились использовать эту оптимальную конфигурацию для демонстрации картины трансдукции, возникающей в результате доставки МП с низким содержанием липидов (LV-МП) в дыхательные пути крыс in vivo, исходя из предположения, что доставка LV-МП в контексте целенаправленного воздействия на дыхательные пути приведет к повышению эффективности трансдукции LV.
Все исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Университетом Аделаиды (M-2019-060 и M-2020-022) и Комитетом по этике экспериментов на животных синхротрона SPring-8. Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE.
Все рентгеновские изображения были получены на линии BL20XU синхротрона SPring-8 в Японии с использованием установки, аналогичной описанной ранее21,22. Вкратце, экспериментальный бокс располагался на расстоянии 245 м от накопительного кольца синхротрона. Расстояние от образца до детектора составляло 0,6 м для исследований с использованием изображений частиц и 0,3 м для исследований in vivo с целью создания эффектов фазового контраста. Использовалась монохроматическая энергия пучка 25 кэВ. Изображения регистрировались с помощью высокоразрешающего рентгеновского преобразователя (SPring-8 BM3), соединенного с sCMOS-детектором. Преобразователь преобразует рентгеновские лучи в видимый свет с помощью сцинтиллятора толщиной 10 мкм (Gd3Al2Ga3O12), который затем направляется на sCMOS-сенсор с помощью микроскопного объектива ×10 (NA 0,3). В качестве sCMOS-детектора использовался Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) с размером матрицы 2048 × 2048 пикселей и размером исходного пикселя 6,5 × 6,5 мкм. Эта установка обеспечивает эффективный изотропный размер пикселя 0,51 мкм и поле зрения приблизительно 1,1 мм × 1,1 мм. Была выбрана длительность экспозиции 100 мс для максимизации отношения сигнал/шум магнитных частиц внутри и вне дыхательных путей при минимизации артефактов движения, вызванных дыханием. Для исследований in vivo в тракт рентгеновского излучения был установлен быстродействующий рентгеновский затвор для ограничения дозы облучения путем блокировки рентгеновского луча между экспозициями.
В исследованиях SPring-8 PB-PCXI носитель LV не использовался, поскольку камера для визуализации BL20XU не сертифицирована по уровню биобезопасности 2. Вместо этого мы выбрали ряд хорошо охарактеризованных микрочастиц от двух коммерческих поставщиков, охватывающих широкий диапазон размеров, материалов, концентрации железа и областей применения, — сначала для того, чтобы понять, как магнитные поля влияют на движение микрочастиц внутри стеклянных капилляров, а затем в живых дыхательных путях. на поверхности. Микрочастицы имеют размер от 0,25 до 18 мкм и изготавливаются из различных материалов (см. Таблицу 1), но состав каждого образца, включая размер магнитных частиц внутри микрочастицы, неизвестен. На основе наших обширных исследований MCT 19, 20, 21, 23, 24 мы ожидаем, что микрочастицы размером до 5 мкм можно увидеть на поверхности дыхательных путей трахеи, например, путем вычитания последовательных кадров для улучшения видимости движения микрочастиц. Одна микрочастица размером 0,25 мкм меньше разрешения устройства визуализации, но ожидается, что PB-PCXI позволит обнаружить их объемный контраст и движение поверхностной жидкости, на которой они осаждаются, после осаждения.
Образцы для каждого микрочастицы, представленного в таблице 1, были подготовлены в стеклянных капиллярах объемом 20 мкл (Drummond Microcaps, Пенсильвания, США) с внутренним диаметром 0,63 мм. Корпускулярные частицы доступны в воде, а частицы CombiMag — в фирменной жидкости производителя. Каждая пробирка наполовину заполнялась жидкостью (приблизительно 11 мкл) и помещалась на держатель образца (см. рисунок 1). Стеклянные капилляры располагались горизонтально на предметном столике в боксе для визуализации и позиционировались по краям жидкости. К отдельному подвижному столику был прикреплен никелевый магнит диаметром 19 мм (длиной 28 мм) из редкоземельного неодима, железа и бора (NdFeB) (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) с остаточной намагниченностью 1,17 Тесла. Для дистанционного изменения положения во время визуализации. Получение рентгеновских изображений начинается, когда магнит расположен приблизительно на 30 мм выше образца, и изображения Полученные изображения регистрировались со скоростью 4 кадра в секунду. Во время съемки магнит подносили близко к стеклянной капиллярной трубке (примерно на расстоянии 1 мм), а затем перемещали вдоль трубки для оценки влияния напряженности поля и положения.
Установка для визуализации in vitro, содержащая образцы MP в стеклянных капиллярах на подвижной платформе образца по осям xy. Путь рентгеновского луча обозначен красной пунктирной линией.
После того, как была установлена ​​видимость микрочастиц in vitro, их подгруппа была протестирована in vivo на самках белых крыс Wistar дикого типа (~12 недель, ~200 г). 0,24 мг/кг медетомидина (Domitor®, Zenoaq, Япония), 3,2 мг/кг мидазолама (Dormicum®, Astellas Pharma, Япония) и 4 мг/кг буторфанола (Vetorphale®, Meiji Seika) крысы были анестезированы смесью (Pharma, Япония) путем внутрибрюшинной инъекции. После анестезии их подготовили к визуализации, удалив шерсть вокруг трахеи, введя эндотрахеальную трубку (ЭТ; внутривенная канюля 16 Ga, Terumo BCT) и зафиксировав их в положении лежа на спине на специально изготовленной пластине для визуализации, содержащей термопакет для поддержания температуры тела 22. Затем пластину для визуализации прикрепили к подвижной платформе образца в боксе для визуализации под небольшим углом. На рентгеновском снимке трахея должна быть расположена горизонтально, как показано на рисунке 2а.
(a) Схема установки для прижизненной визуализации в боксе SPring-8, траектория рентгеновского луча отмечена красной пунктирной линией. (b,c) Магнитная локализация на трахее проводилась дистанционно с помощью двух ортогонально установленных IP-камер. В левой части изображения на экране видна проволочная петля, удерживающая голову, и канюля для доставки, установленная внутри эндотрахеальной трубки.
Система дистанционно управляемого шприцевого насоса (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) с использованием стеклянного шприца объемом 100 мкл была соединена с трубкой PE10 (внешний диаметр 0,61 мм, внутренний диаметр 0,28 мм) через иглу 30 Ga. Пометьте трубку, чтобы убедиться, что ее кончик находится в правильном положении в трахее при введении эндотрахеальной трубки. С помощью микронасоса поршень шприца был извлечен, в то время как кончик трубки был погружен в образец MP, который необходимо было ввести. Затем загруженная трубка для введения была вставлена ​​в эндотрахеальную трубку, поместив ее кончик в самую сильную часть ожидаемого приложенного магнитного поля. Получение изображений контролировалось с помощью детектора дыхания, подключенного к нашему таймеру на базе Arduino, и все сигналы (например, температура, дыхание, открытие/закрытие затвора и получение изображений) записывались с помощью Powerlab и LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) 22. При визуализации, когда корпус был недоступен, использовались две IP-камеры (Panasonic). Магниты BB-SC382 были расположены под углом приблизительно 90° друг к другу и использовались для контроля положения магнита относительно трахеи во время визуализации (рис. 2b,c). Для минимизации артефактов движения за каждый вдох во время плато конечного выдоха получалось одно изображение.
К второй ступени прикреплен магнит, который может располагаться удаленно от корпуса системы визуализации. Были протестированы различные положения и конфигурации магнита, в том числе: установленный под углом приблизительно 30° над трахеей (конфигурации показаны на рисунках 2a и 3a); один магнит над животным, а другой под ним, с полюсами, установленными на притяжение (рисунок 3b); один магнит над животным, а другой под ним, с полюсами, установленными на отталкивание (рисунок 3c); и один магнит над трахеей и перпендикулярно ей (рисунок 3d). После того, как животное и магнит настроены, а исследуемый микрочастица загружена в шприцевой насос, подайте дозу 50 мкл со скоростью 4 мкл/сек, одновременно получая изображения. Затем магнит перемещается вперед и назад вдоль или вбок по трахее, продолжая получать изображения.
Конфигурация магнита для прижизненной визуализации: (a) один магнит над трахеей под углом приблизительно 30°, (b) два магнита, настроенные на притяжение, (c) два магнита, настроенные на отталкивание, (d) один магнит над трахеей и перпендикулярно ей. Наблюдатель смотрел вниз от рта к легким через трахею, а рентгеновский луч проходил через левую сторону крысы и выходил с правой стороны. Магнит перемещается либо вдоль дыхательных путей, либо влево и вправо над трахеей в направлении рентгеновского луча.
Мы также стремились определить видимость и поведение частиц в дыхательных путях в отсутствие мешающих факторов, таких как дыхание и сердечная деятельность. Поэтому по окончании периода визуализации животных гуманно умерщвляли от передозировки пентобарбитала (Сомнопентил, Питман-Мур, Вашингтон-Кроссинг, США; ~65 мг/кг внутрибрюшинно). Некоторых животных оставляли на платформе для визуализации, и после прекращения дыхания и сердцебиения процесс визуализации повторяли, добавляя дополнительную дозу МП, если МП не был виден на поверхности дыхательных путей.
Полученные изображения были скорректированы по плоскому и темному полю, а затем смонтированы в видеоролик (20 кадров в секунду; скорость в 15-25 раз выше обычной в зависимости от частоты дыхания) с помощью пользовательского скрипта, написанного на MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Все исследования по доставке генных векторов LV проводились в лаборатории по изучению лабораторных животных при Университете Аделаиды и были направлены на использование результатов эксперимента SPring-8 для оценки того, может ли доставка LV-MP в присутствии магнитного поля усилить перенос генов in vivo. Для оценки эффектов MP и магнитного поля были проведены эксперименты на двух группах животных: одной группе вводили LV-MP с установленным магнитом, а другой группе вводили LV-MP без магнита (контрольная группа).
Генные векторы LV были созданы с использованием ранее описанных методов 25, 26. Вектор LacZ экспрессирует локализованный в ядре ген бета-галактозидазы под управлением конститутивного промотора MPSV (LV-LacZ), который продуцирует синий продукт реакции в трансдуцированных клетках, видимый на фронтах легочной ткани и срезах ткани. Титрование проводилось в культурах клеток путем ручного подсчета количества LacZ-положительных клеток с помощью гемоцитометра для расчета титра в ТУ/мл. Носители криоконсервируются при -80 °C, размораживаются перед использованием и связываются с CombiMag путем смешивания в соотношении 1:1 и инкубации на льду в течение не менее 30 минут перед введением.
Нормальные крысы породы Спраг-Доули (n = 3/группа, ~2-3 месячных крыс были анестезированы внутрибрюшинно смесью 0,4 мг/кг медетомидина (Домитор, Илиум, Австралия) и 60 мг/кг кетамина (Илиум, Австралия) внутрибрюшинно) и подвергнуты нехирургической канюляции ротовой полости внутривенной канюлей 16 Ga. Для обеспечения трансдукции ЛВ в ткани дыхательных путей трахеи, она была подготовлена ​​с использованием ранее описанного нами протокола механического воздействия, при котором поверхность дыхательных путей трахеи растирали аксиально проволочной корзинкой (N-Circle, нитиноловый экстрактор камней без наконечника NTSE-022115 -UDH, Кук Медицинский, США) в течение 30 секунд 28 секунд. Затем, примерно через 10 минут после воздействия, в боксе биологической безопасности проводили внутритрахеальное введение ЛВ-МП.
Магнитное поле, использованное в этом эксперименте, было настроено аналогично исследованию рентгеновской визуализации in vivo, при этом те же магниты удерживались над трахеей с помощью дистилляционных зажимов для стентов (Рисунок 4). 50 мкл (2 × 25 мкл аликвоты) LV-MP вводили в трахею (n = 3 животных) с помощью пипетки с гелевым наконечником, как описано ранее. Контрольная группа (n = 3 животных) получала те же LV-MP без использования магнита. После завершения инфузии канюлю удаляли из эндотрахеальной трубки, и животное экстубировали. Магнит оставался на месте в течение 10 минут, затем его удаляли. Крысам вводили подкожно мелоксикам (1 мл/кг) (Ilium, Австралия), после чего анестезию прекращали внутрибрюшинной инъекцией 1 мг/кг гидрохлорида атипамазола (Antisedan, Zoetis, Австралия). Крыс содержали в тепле и Наблюдение продолжалось до полного восстановления после наркоза.
Устройство для введения LV-MP в боксе биологической безопасности. Видно, как из ротовой полости выступает светло-серый люэровский наконечник эндотрахеальной трубки, а показанный на рисунке наконечник пипетки с гелем вводится через эндотрахеальную трубку на необходимую глубину в трахею.
Через неделю после процедуры введения LV-MP животные были гуманно умерщвлены путем ингаляции 100% CO2, а экспрессия LacZ оценивалась с использованием нашей стандартной обработки X-gal. Три самых каудальных хрящевых кольца были удалены, чтобы исключить из анализа любые механические повреждения или задержку жидкости, возникшие в результате установки эндотрахеальной трубки. Каждая трахея была разрезана продольно, чтобы создать две половины для анализа, и они были помещены в чашку Петри, содержащую силиконовую резину (Sylgard, Dow Inc), с помощью иглы Minutien (Fine Science Tools) для визуализации просветной поверхности. Распределение и структура трансдуцированных клеток были подтверждены фронтальной фотографией с использованием микроскопа Nikon (SMZ1500) с камерой DigiLite и программным обеспечением TCapture (Tucsen Photonics, Китай). Изображения были получены при 20-кратном увеличении (включая максимальное значение для всей ширины трахеи), при этом вся длина трахеи была сфотографирована пошагово, обеспечивая достаточное перекрытие между каждым изображением для обеспечения Для «сшивания» изображений. Затем изображения каждой трахеи были объединены в одно составное изображение с помощью редактора составных изображений Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) с использованием алгоритма планарного движения. Площади экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного были количественно оценены с помощью автоматизированного скрипта MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 и Value < 0,7. Путем обводки контуров ткани вручную в GIMP v2.10.24 была создана маска для каждого составного изображения, чтобы идентифицировать область ткани и предотвратить ложные обнаружения за пределами ткани трахеи. Окрашенные области со всех составных изображений каждого животного были суммированы для получения общей окрашенной области для этого животного. Затем окрашенная область была разделена на общую площадь маски для получения нормализованной области.
Каждая трахея была залита парафином, и были получены срезы толщиной 5 мкм. Срезы были дополнительно окрашены нейтральным быстродействующим красным в течение 5 минут, и изображения были получены с помощью микроскопа Nikon Eclipse E400, камеры DS-Fi3 и программного обеспечения NIS element capture (версия 5.20.00).
Все статистические анализы проводились в программе GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Статистическая значимость устанавливалась на уровне p ≤ 0,05. Нормальность распределения проверялась с помощью теста Шапиро-Уилка, а различия в окрашивании LacZ оценивались с помощью непарного t-теста.
Шесть микрочастиц, описанных в Таблице 1, были исследованы с помощью PCXI, а их видимость описана в Таблице 2. Две микрочастицы полистирола (MP1 и MP2; 18 мкм и 0,25 мкм соответственно) не были видны под PCXI, но остальные образцы были идентифицированы (примеры показаны на Рисунке 5). MP3 и MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 мкм и 0,9 мкм соответственно) едва различимы. Хотя MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) содержал одни из самых мелких исследованных частиц, он был наиболее заметен. Продукт CombiMag MP6 трудно обнаружить. Во всех случаях наша способность обнаруживать микрочастицы значительно повышалась за счет перемещения магнита вперед и назад параллельно капилляру. Когда магниты удалялись от капилляра, частицы образовывали длинные цепочки, но по мере приближения магнитов и увеличения напряженности магнитного поля При увеличении магнитного поля цепочки частиц укорачиваются по мере их миграции к верхней поверхности капилляра (см. дополнительное видео S1: MP4), что приводит к увеличению плотности частиц на поверхности. Напротив, когда магнит удаляется из капилляра, напряженность поля уменьшается, и микрочастицы перестраиваются в длинные цепочки, простирающиеся от верхней поверхности капилляра (см. дополнительное видео S2: MP4). После остановки движения магнита частицы продолжают движение в течение короткого времени после достижения положения равновесия. По мере перемещения микрочастиц к верхней поверхности капилляра и от нее магнитные частицы обычно увлекают обломки за собой в жидкости.
Видимость MP под PCXI значительно различается между образцами. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 и (d) MP6. Все представленные здесь изображения были получены с помощью магнита, расположенного примерно в 10 мм непосредственно над капилляром. Большие круги, которые кажутся видимыми, — это пузырьки воздуха, захваченные в капиллярах, четко показывающие черно-белые краевые особенности фазово-контрастной визуализации. Красная рамка показывает увеличение для повышения контрастности. Обратите внимание, что диаметры схем магнитов на всех рисунках не соответствуют масштабу и примерно в 100 раз больше, чем показано.
При перемещении магнита влево и вправо вдоль верхней части капилляра угол нити микрочастиц изменяется, выравниваясь с магнитом (см. рис. 6), тем самым определяя линии магнитного поля. Для MP3-5 после того, как хорда достигает порогового угла, частицы увлекаются вдоль верхней поверхности капилляра. Это часто приводит к скоплению микрочастиц в более крупные группы вблизи места с самым сильным магнитным полем (см. дополнительное видео S3: MP5). Это также особенно заметно при визуализации вблизи конца капилляра, что приводит к агрегации и концентрации микрочастиц на границе раздела жидкость-воздух. Частицы в MP6, которые было труднее различить, чем в MP3-5, не увлекались при перемещении магнита вдоль капилляра, но нити микрочастиц распадались, оставляя частицы в поле зрения (см. дополнительное видео S4: MP6). В некоторых случаях, когда приложенное магнитное поле уменьшалось путем перемещения магнита на большое расстояние от места визуализации, любые оставшиеся микрочастицы медленно опускались на нижнюю поверхность трубки под действием силы тяжести, оставаясь при этом в строка (см. дополнительное видео S5: MP3).
Угол наклона нити MP изменяется по мере перемещения магнита вправо над капилляром. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 и (d) MP6. Красная рамка показывает увеличение для повышения контрастности. Обратите внимание, что дополнительные видеоролики информативны, поскольку они раскрывают важную информацию о структуре частиц и их динамике, которую невозможно визуализировать на этих статических изображениях.
Наши тесты показали, что медленное перемещение магнита вперед и назад вдоль трахеи облегчает визуализацию МП в контексте сложных движений in vivo. Тестирование in vivo не проводилось, поскольку полистироловые шарики (MP1 и MP2) не были видны в капилляре. Каждый из оставшихся четырех МП был протестирован in vivo с длинной осью магнита, расположенной над трахеей под углом примерно 30° к вертикали (см. рисунки 2b и 3a), поскольку это приводило к образованию более длинных цепочек МП и было более эффективным, чем конфигурация магнита с концевыми группами. MP3, MP4 и MP6 не были обнаружены в трахее ни одного живого животного. При визуализации дыхательных путей крыс после гуманного умерщвления животных частицы оставались невидимыми даже при добавлении дополнительного объема с помощью шприцевого насоса. MP5 имел самое высокое содержание оксида железа и был единственной видимой частицей, поэтому он был использован для оценки и характеристики поведения МП in vivo.
Размещение магнита над трахеей во время введения микрочастиц привело к концентрации многих, но не всех микрочастиц в поле зрения. Частицы, попадающие в трахею, лучше всего наблюдаются у гуманно умерщвленных животных. Рисунок 7 и дополнительное видео S6: MP5 демонстрирует быстрое магнитное захватывание и выравнивание частиц на поверхности вентральной части трахеи, указывая на то, что микрочастицы могут быть направлены в желаемые области трахеи. При поиске дистальнее вдоль трахеи после введения микрочастиц некоторые микрочастицы были обнаружены ближе к килю трахеи, что предполагает, что напряженность магнитного поля была недостаточной для сбора и удержания всех микрочастиц, поскольку они были доставлены через область максимальной напряженности магнитного поля во время процесса введения жидкости. Тем не менее, послеродовые концентрации микрочастиц были выше вокруг области изображения, что предполагает, что многие микрочастицы оставались в областях дыхательных путей, где приложенная напряженность магнитного поля была самой высокой.
Изображения (a) до и (b) после введения MP5 в трахею недавно эвтаназированной крысы, при этом магнит расположен непосредственно над областью визуализации. Область визуализации находится между двумя хрящевыми кольцами. До введения MP в дыхательных путях присутствует некоторое количество жидкости. Красная рамка обозначает увеличение для повышения контрастности. Эти изображения взяты из видео, показанного в дополнительном видео S6:MP5.
Перемещение магнита вдоль трахеи in vivo приводило к изменению угла цепочки микрочастиц на поверхности дыхательных путей аналогично тому, что наблюдается в капиллярах (см. рисунок 8 и дополнительное видео S7:MP5). Однако в нашем исследовании микрочастицы не могли перемещаться по поверхности живых дыхательных путей так же, как в капиллярах. В некоторых случаях цепочка микрочастиц удлинялась по мере перемещения магнита влево и вправо. Интересно, что мы также обнаружили, что цепочка частиц, по-видимому, изменяет глубину поверхностного слоя жидкости при продольном перемещении магнита вдоль трахеи и расширяется, когда магнит перемещается непосредственно над головой, а цепочка частиц поворачивается в вертикальное положение (см. дополнительное видео S7). (MP5 на 0:09, внизу справа). Характерная картина движения изменилась, когда магнит перемещался по верхней части трахеи вбок (то есть влево или вправо от животного, а не вдоль трахеи). Частицы по-прежнему были отчетливо видны во время движения, но когда магнит был удален из трахеи, кончики нитей частиц стали видны (см. дополнительное видео S8:MP5, начиная с 0:08). Это согласуется с поведением MP, которое мы наблюдали под воздействием приложенного магнитного поля в стеклянном капилляре.
Примеры изображений, демонстрирующих MP5 в трахее живой анестезированной крысы. (a) Магнит используется для получения изображений выше и слева от трахеи, затем (b) после перемещения магнита вправо. Красная рамка обозначает увеличение для повышения контрастности. Эти изображения взяты из видео, показанного в дополнительном видео S7:MP5.
Когда два полюса были расположены в направлении север-юг выше и ниже трахеи (т.е. притягиваясь; рис. 3b), хорды MP казались длиннее и располагались на боковой стенке трахеи, а не на дорсальной поверхности трахеи (см. дополнительное видео S9:MP5). Однако высокие концентрации частиц в одном месте (т.е. на дорсальной поверхности трахеи) не были обнаружены после введения жидкости при использовании устройства с двумя магнитами, что обычно происходит при использовании устройства с одним магнитом. Затем, когда один магнит был сконфигурирован так, чтобы отталкивать полюса, повернутые в обратную сторону (рис. 3c), количество частиц, видимых в поле зрения, не увеличивалось после введения. Настройка обеих конфигураций с двумя магнитами представляет собой сложную задачу из-за высокой напряженности магнитного поля, которое, соответственно, притягивает или отталкивает магниты. Затем конфигурация была изменена на один магнит, параллельный дыхательным путям, но проходящий через них под углом 90 градусов, так что линии поля пересекали стенку трахеи. Ортогональная ориентация (рис. 3d) была разработана для определения возможности наблюдения агрегации частиц на боковой стенке. Однако в этой конфигурации не наблюдалось заметного движения накопления МП или движения магнита. На основании всех этих результатов для исследований in vivo с использованием носителей генов была выбрана конфигурация с одним магнитом и ориентацией под углом 30 градусов (рис. 3a).
При многократном исследовании животного сразу после гуманного умерщвления, отсутствие мешающих движений тканей позволило различить более тонкие и короткие линии частиц в четком межхондральном поле, «колеблющиеся» в соответствии с поступательным движением магнита. Тем не менее, присутствие и движение частиц MP6 по-прежнему не видны.
Титр LV-LacZ составлял 1,8 × 10⁸ ТЕ/мл, и после смешивания в соотношении 1:1 с CombiMag MP (MP6) животным вводили 50 мкл трахеальной дозы 9 × 10⁷ ТЕ/мл носителя LV (т.е. 4,5 × 10⁶ ТЕ/крыса). В этих исследованиях вместо перемещения магнита во время родов мы фиксировали магнит в одном положении, чтобы определить, можно ли (а) улучшить трансдукцию LV по сравнению с векторной доставкой в ​​отсутствие магнитного поля и (б) сфокусировать ее. Клетки дыхательных путей трансдуцируются в магнитные целевые области верхних дыхательных путей.
Наличие магнитов и использование CombiMag в сочетании с LV-векторами, по-видимому, не оказывало неблагоприятного воздействия на здоровье животных, как и наш стандартный протокол доставки LV-векторов. Фронтальные изображения области трахеи, подвергнутой механическому воздействию (дополнительный рис. 1), показали, что в группе животных, получавших LV-MP, наблюдался значительно более высокий уровень трансдукции при наличии магнита (рис. 9a). В контрольной группе наблюдалось лишь небольшое количество синего окрашивания LacZ (рис. 9b). Количественная оценка нормализованных площадей, окрашенных X-Gal, показала, что введение LV-MP в присутствии магнитного поля привело к приблизительно 6-кратному улучшению (рис. 9c).
Примеры составных изображений, демонстрирующих трансдукцию трахеи с помощью LV-MP (a) в присутствии магнитного поля и (b) в отсутствие магнита. (c) Статистически значимое улучшение нормализованной площади трансдукции LacZ в трахее при использовании магнита (*p = 0,029, t-критерий, n = 3 в каждой группе, среднее ± стандартная ошибка среднего).
На срезах, окрашенных нейтральным быстродействующим красным (пример показан на дополнительном рисунке 2), клетки, окрашенные LacZ, присутствовали в аналогичном порядке и в аналогичном месте, как сообщалось ранее.
Ключевой проблемой генной терапии дыхательных путей остается точная локализация частиц-носителей в интересующих областях и достижение высокой эффективности трансдукции в движущихся легких при наличии воздушного потока и активного удаления слизи. Для носителей LV, предназначенных для лечения заболеваний дыхательных путей при муковисцидозе, увеличение времени пребывания частиц-носителей в проводящих дыхательных путях до сих пор оставалось труднодостижимой целью. Как отмечают Кастеллани и др., использование магнитных полей для улучшения трансдукции имеет преимущества по сравнению с другими методами доставки генов, такими как электропорация, поскольку оно может сочетать в себе простоту, экономичность, локализацию доставки, повышенную эффективность и более короткое время инкубации, а также, возможно, меньшую дозу носителя10. Однако осаждение и поведение магнитных частиц in vivo в дыхательных путях под воздействием внешних магнитных сил никогда не описывалось, и фактически не была продемонстрирована возможность применения этого метода in vivo для повышения уровня экспрессии генов в интактных живых дыхательных путях.
Наши эксперименты in vitro с использованием синхротронного PCXI показали, что все протестированные нами частицы, за исключением полистироловых микрочастиц, были видны в используемой нами установке для визуализации. В присутствии магнитного поля микрочастицы образуют цепочки, длина которых зависит от типа частицы и напряженности магнитного поля (т. е. близости и движения магнита). Как показано на рисунке 10, наблюдаемые нами цепочки образуются из-за намагничивания каждой отдельной частицы и создания ею собственного локального магнитного поля. Эти отдельные поля вызывают агрегацию и соединение других подобных частиц, приводя к групповым цепочечным движениям, обусловленным локальными силами притяжения и отталкивания других частиц.
Схема, показывающая (a,b) последовательности частиц, образующиеся внутри капилляров, заполненных жидкостью, и (c,d) трахею, заполненную воздухом. Обратите внимание, что капилляры и трахея изображены не в масштабе. На панели (a) также приведено описание МП, содержащего частицы Fe3O4, расположенные цепочками.
Когда магнит перемещался над капилляром, угол движения цепочки частиц достигал критического порога для MP3-5, содержащего Fe3O4, после чего цепочка частиц переставала оставаться в исходном положении и перемещалась вдоль поверхности в новое положение. Этот эффект, вероятно, возникает из-за того, что поверхность стеклянного капилляра достаточно гладкая, чтобы позволить этому движению происходить. Интересно, что MP6 (CombiMag) вел себя иначе, возможно, потому что частицы были меньше, имели различное покрытие или поверхностный заряд, или запатентованная несущая жидкость влияла на их способность к движению. Контраст изображения частиц CombiMag также слабее, что предполагает, что жидкость и частицы могут иметь схожую плотность и, следовательно, нелегко двигаться друг к другу. Частицы также могут застревать, если магнит движется слишком быстро, что указывает на то, что напряженность магнитного поля не всегда может преодолеть трение между частицами в жидкости, предполагая, что, возможно, неудивительно, что напряженность магнитного поля и расстояние между магнитом и целевой областью очень важны. В совокупности эти результаты также предполагают, что, хотя магниты могут захватывать множество микрочастиц, протекающих через целевую область В этой области маловероятно, что на магниты можно полагаться для перемещения частиц CombiMag вдоль поверхности трахеи. Поэтому мы приходим к выводу, что в исследованиях LV-MP in vivo следует использовать статические магнитные поля для физического воздействия на определенные участки дыхательных путей.
Когда частицы попадают в организм, их трудно идентифицировать в контексте сложных движущихся тканей тела, но возможность их обнаружения была улучшена за счет горизонтального перемещения магнита над трахеей для «покачивания» нитей микрочастиц. Хотя прижизненная визуализация возможна, движение частиц легче заметить после гуманного умерщвления животного. Концентрации микрочастиц, как правило, были самыми высокими в этом месте, когда магнит располагался над областью визуализации, хотя некоторые частицы обычно обнаруживались дальше по трахее. В отличие от исследований in vitro, частицы не могут перемещаться по трахее путем перемещения магнита. Этот вывод согласуется с тем, как слизь, покрывающая поверхность трахеи, обычно обрабатывает вдыхаемые частицы, задерживая их в слизи и впоследствии удаляя с помощью мукоцилиарного механизма.
Мы предположили, что использование магнитов для притяжения выше и ниже трахеи (рис. 3b) может привести к более однородному магнитному полю, а не к полю, сильно сконцентрированному в одной точке, что потенциально может привести к более равномерному распределению частиц. Однако наше предварительное исследование не выявило четких доказательств в поддержку этой гипотезы. Аналогично, конфигурация пары магнитов для отталкивания (рис. 3c) не привела к увеличению осаждения частиц в исследуемой области. Эти два результата показывают, что установка с двумя магнитами не значительно улучшает локальный контроль целевого воздействия на микрочастицы, и что возникающие сильные магнитные силы трудно настроить, что делает этот подход менее практичным. Аналогично, ориентация магнита выше и через трахею (рис. 3d) также не увеличила количество частиц, удерживаемых в исследуемой области. Некоторые из этих альтернативных конфигураций могут быть неэффективными, поскольку они приводят к более низким значениям напряженности магнитного поля в области осаждения. Поэтому конфигурация с одним магнитом под углом 30 градусов (рис. 3a) считается самым простым и эффективным методом. для тестирования in vivo.
Исследование LV-MP показало, что при сочетании векторов LV с CombiMag и их доставке после физического воздействия в присутствии магнитного поля уровни трансдукции в трахее значительно повышались по сравнению с контрольной группой. На основании исследований с использованием синхротронного излучения и результатов LacZ было установлено, что магнитное поле, по-видимому, способно удерживать вектор LV внутри трахеи и уменьшать количество частиц вектора, которые немедленно проникали глубоко в легкие. Такие улучшения в нацеливании могут привести к повышению эффективности при одновременном снижении титров доставляемого препарата, нецелевой трансдукции, воспалительных и иммунных побочных эффектов, а также стоимости носителя гена. Важно отметить, что, по данным производителя, CombiMag можно использовать в сочетании с другими методами переноса генов, включая другие вирусные векторы (такие как AAV) и нуклеиновые кислоты.