Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակը սահմանափակ աջակցություն ունի CSS-ի համար: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Կիստոզ ֆիբրոզով թոքային հիվանդության բուժման համար գենային վեկտորները պետք է թիրախավորեն հաղորդիչ շնչուղիները, քանի որ ծայրամասային թոքային տրանսդուկցիան թերապևտիկ օգուտ չի տալիս: Վիրուսային տրանսդուկցիայի արդյունավետությունը ուղղակիորեն կապված է վեկտորի բնակության ժամանակի հետ: Այնուամենայնիվ, գեների կրիչների նման առաքման հեղուկները բնականաբար դիֆուզվում են ալվեոլների մեջ ներշնչման ժամանակ, և ցանկացած ձևի թերապևտիկ մասնիկները արագորեն մաքրվում են լորձաթաղանթային փոխադրման միջոցով: Գեների կրիչների շնչուղիներում բնակության ժամանակի երկարացումը կարևոր է, բայց դժվար է իրականացնել: Գեների կրիչների հետ կոնյուգացված մագնիսական մասնիկները, որոնք կարող են ուղղորդվել շնչուղիների մակերեսին, կարող են բարելավել տարածաշրջանային թիրախավորումը: In vivo վիզուալիզացիայի մարտահրավերների պատճառով, կիրառվող մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում շնչուղիների մակերեսին նման փոքր մագնիսական մասնիկների վարքագիծը վատ է հասկացված: Այս ուսումնասիրության նպատակն էր օգտագործել սինխրոտրոնային պատկերացում՝ անզգայացված առնետների շնչափողում մագնիսական մասնիկների շարքի in vivo շարժումը պատկերացնելու համար՝ in vivo անհատական ​​և զանգվածային մասնիկների վարքագծի դինամիկան և օրինաչափությունները ուսումնասիրելու համար: Այնուհետև մենք նաև գնահատեցինք, թե արդյոք լենտիվիրուսային մագնիսական մասնիկների առաքումը մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում կբարձրացնի տրանսդուկցիայի արդյունավետությունը առնետի շնչափողում: Սինխրոտրոնային ռենտգենյան պատկերացումը բացահայտում է մագնիսական մասնիկների վարքագիծը: մասնիկներ անշարժ և շարժվող մագնիսական դաշտերում in vitro և in vivo պայմաններում: Մասնիկները հեշտությամբ չեն կարող քարշ գալ կենդանի շնչուղիների մակերեսով մագնիսներով, բայց տեղափոխման ընթացքում նստվածքները կենտրոնանում են տեսադաշտում, որտեղ մագնիսական դաշտն ամենաուժեղն է: Փոխանցման արդյունավետությունը նույնպես վեց անգամ ավելացել է, երբ լենտիվիրուսային մագնիսական մասնիկները մատակարարվել են մագնիսական դաշտի առկայությամբ: Այս արդյունքները միասին ենթադրում են, որ լենտիվիրուսային մագնիսական մասնիկները և մագնիսական դաշտերը կարող են արժեքավոր մոտեցումներ լինել գեների վեկտորի թիրախավորումը բարելավելու և հաղորդիչ շնչուղիներում փոխանցման մակարդակը բարձրացնելու համար in vivo պայմաններում:
Կիստոզ ֆիբրոզը (ԿՖ) առաջանում է մեկ գենի տատանումների պատճառով, որը կոչվում է ԿՖ թաղանթային հաղորդունակության կարգավորիչ (ԿՖԹՌ): ԿՖԹՌ սպիտակուցը իոնային ալիք է, որը առկա է մարմնի բազմաթիվ էպիթելային բջիջներում, այդ թվում՝ հաղորդիչ շնչուղիներում, որոնք ԿՖ-ի ախտածագման հիմնական կենտրոններից են: ԿՖԹՌ արատները հանգեցնում են ջրի աննորմալ փոխադրման, շնչուղիների մակերեսի ջրազրկման և շնչուղիների մակերեսային հեղուկի (ՀՀՀ) շերտի խորության նվազեցման: Սա նաև խաթարում է լորձաթաղանթային փոխադրման (ՄԹՏ) համակարգի ունակությունը՝ շնչուղիներից ներշնչված մասնիկները և հարուցիչները մաքրելու: Մեր նպատակն է մշակել լենտիվիրուսային (ԼՏ) գենային թերապիա՝ ԿՖԹՌ գենի ճիշտ պատճենը մատակարարելու և ԱՖԹՌ, ՄԹՏ և թոքերի առողջությունը բարելավելու համար, ինչպես նաև շարունակել մշակել նոր տեխնոլոգիաներ, որոնք կարող են չափել այս պարամետրերը in vivo1:
Ձախ փորոքի վեկտորները ՔՖ-ի շնչուղիների գենային թերապիայի առաջատար թեկնածուներից են, հիմնականում այն ​​պատճառով, որ դրանք կարող են մշտապես ինտեգրել թերապևտիկ գենը շնչուղիների բազալ բջիջների (շնչուղիների ցողունային բջիջների) մեջ: Սա կարևոր է, քանի որ դրանք կարող են վերականգնել նորմալ հիդրատացիան և լորձի մաքրումը՝ դիֆերենցվելով ֆունկցիոնալ գեներով շտկված ՔՖ-ի հետ կապված շնչուղիների մակերեսային բջիջների, ինչը հանգեցնում է ողջ կյանքի ընթացքում օգուտների: Ձախ փորոքի վեկտորները պետք է ուղղված լինեն հաղորդիչ շնչուղիների դեմ, քանի որ այստեղ է սկսվում ՔՖ-ի թոքային հիվանդությունը: Վեկտորի ավելի խորը ներթափանցումը թոքերի մեջ կարող է հանգեցնել ալվեոլային տրանսդուկցիայի, բայց դա ՔՖ-ի դեպքում թերապևտիկ օգուտ չունի: Այնուամենայնիվ, գեների կրողներ նման հեղուկները բնականաբար տեղափոխվում են ալվեոլներ ներշնչման ժամանակ՝ ծննդաբերությունից հետո3,4, և թերապևտիկ մասնիկները արագորեն մաքրվում են բերանի խոռոչ MCT-ի միջոցով: Ձախ փորոքի տրանսդուկցիայի արդյունավետությունը ուղղակիորեն կապված է այն ժամանակի հետ, երբ վեկտորը մնում է թիրախային բջիջների կողքին՝ բջջային կլանումը թույլ տալու համար՝ «բնակության ժամանակը»5, որը հեշտությամբ կրճատվում է բնորոշ տարածաշրջանային օդային հոսքի, ինչպես նաև համակարգված մասնիկային լորձի կլանման և MCT-ի միջոցով: ՔՖ-ի դեպքում շնչուղիներում Ձախ փորոքի բնակության ժամանակը երկարացնելու ունակությունը կարևոր է այս շրջանում տրանսդուկցիայի բարձր մակարդակի հասնելու համար, բայց մինչ այժմ դա եղել է: մարտահրավեր նետող։
Այս խոչընդոտը հաղթահարելու համար մենք առաջարկում ենք, որ ձախ փորոքի մագնիսական մասնիկները (ՁՓՄ) կարող են օգնել երկու լրացուցիչ ձևերով։ Նախ, դրանք կարող են մագնիսականորեն ուղղորդվել դեպի շնչուղիների մակերես՝ բարելավելու թիրախավորումը և օգնելու գեների կրող մասնիկներին գտնվել ցանկալի շնչուղիների շրջանում, և ԱՓՄ)՝ տեղափոխվելու բջջային շերտ 6-ը։ ՁՓՄ-ները լայնորեն օգտագործվել են որպես թիրախային դեղերի առաքման միջոցներ, երբ դրանք կապվում են հակամարմինների, քիմիաթերապևտիկ դեղամիջոցների կամ այլ փոքր մոլեկուլների հետ, որոնք կպչում են բջջային թաղանթներին կամ կապվում են բջջային մակերեսի համապատասխան ընկալիչների հետ և կուտակվում ուռուցքի տեղամասերում ստատիկ էլեկտրականության առկայության դեպքում։ Մագնիսական դաշտեր քաղցկեղի բուժման համար 7. Այլ «հիպերթերմալ» մեթոդները նպատակ ունեն տաքացնել միկրոմասնիկները, երբ դրանք ենթարկվում են տատանվող մագնիսական դաշտերի ազդեցությանը՝ այդպիսով ոչնչացնելով ուռուցքային բջիջները: Մագնիսական տրանսֆեկցիայի սկզբունքը, որի դեպքում մագնիսական դաշտն օգտագործվում է որպես տրանսֆեկցիոն նյութ՝ ԴՆԹ-ի բջիջներ փոխանցումը բարելավելու համար, սովորաբար օգտագործվում է in vitro պայմաններում՝ օգտագործելով ոչ վիրուսային և վիրուսային գեների վեկտորների մի շարք դժվար տրանսդուկցվող բջջային գծերի համար: Ձախ փորոքի մագնիսա-տրանսֆեկցիայի արդյունավետությունը հաստատվել է, որտեղ մարդու բրոնխիալ էպիթելային բջջային գծին Ձախ փորոքի-ՄՊ-ների in vitro մատակարարումը ստատիկ մագնիսական դաշտի առկայությամբ մեծացնում է տրանսդուկցիայի արդյունավետությունը 186 անգամ՝ համեմատած միայն Ձախ փորոքի վեկտորի հետ: Ձախ փորոքի-ՄՊ-ն կիրառվել է նաև in vitro CF մոդելում, որտեղ մագնիսական տրանսֆեկցիան 20 անգամ մեծացրել է Ձախ փորոքի տրանսդուկցիան օդ-հեղուկ միջերեսային մշակույթներում՝ CF խորխի առկայությամբ10: Այնուամենայնիվ, օրգանների in vivo մագնիսա-տրանսֆեկցիան համեմատաբար քիչ ուշադրության է արժանացել և գնահատվել է միայն մի քանի կենդանիների վրա կատարված ուսումնասիրություններում11,12,13,14,15, հատկապես թոքեր16,17: Այնուամենայնիվ, մագնիսական տրանսֆեկցիայի հնարավորությունները ֆիբրոզով հիվանդների թոքերի թերապիայի մեջ հստակ են: Թանը և այլք (2020) նշել են, որ «մագնիսական նանոմասնիկների արդյունավետ թոքային մատակարարման հայեցակարգի ապացույցի ուսումնասիրությունը կհարթի ճանապարհը CFTR-ի ապագա ինհալացիոն ռազմավարությունների համար՝ ֆիբրոզով հիվանդների կլինիկական արդյունքները բարելավելու համար»6:
Շնչուղիների մակերեսների վրա փոքր մագնիսական մասնիկների վարքագիծը կիրառվող մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում դժվար է պատկերացնել և ուսումնասիրել, ուստի վատ է հասկացվում։ Այլ ուսումնասիրություններում մենք մշակել ենք սինխրոտրոնային տարածման վրա հիմնված փուլային կոնտրաստային ռենտգենյան պատկերման (PB-PCXI) մեթոդ՝ ASL խորության18 և MCT վարքագծի19,20 ոչ ինվազիվ կերպով պատկերացնելու և քանակապես որոշելու համար in vivo ASL խորության18 և MCT վարքագծի19,20 մանր փոփոխությունները, որոնք ուղղակիորեն չափում են գազային ջրանցքի մակերեսային հիդրատացիան և օգտագործվում են որպես բուժման արդյունավետության վաղ ցուցիչ։ Բացի այդ, մեր MCT գնահատման մեթոդը օգտագործում է 10-35 մկմ տրամագծով մասնիկներ, որոնք կազմված են ալյումինից կամ բարձր ռեֆրակցիայի ցուցիչով ապակուց, որպես MCT մարկերներ, որոնք տեսանելի են PB-PCXI21 միջոցով։ Երկու տեխնիկաներն էլ հարմար են մասնիկների մի շարք տեսակների, այդ թվում՝ MP-ի պատկերացման համար։
Բարձր տարածական և ժամանակային լուծաչափի շնորհիվ, մեր PB-PCXI-ի վրա հիմնված ASL և MCT վերլուծության տեխնիկաները հիանալի են in vivo մեկ և մեծ մասնիկների վարքագծի դինամիկան և օրինաչափությունները ուսումնասիրելու համար՝ մեզ օգնելու հասկանալ և օպտիմալացնել MP գեների մատակարարման տեխնիկան: Այստեղ կիրառվող մոտեցումը բխում է SPring-8 BL20B2 ճառագայթային գծի վրա հիմնված մեր ուսումնասիրություններից, որոնցում մենք պատկերացրել ենք հեղուկի շարժումը մկների քթի և թոքային շնչուղիներ կեղծ վեկտորային դոզայի մատակարարումից հետո՝ բացատրելու համար մեր գեների կրողների դոզայի կենդանիների վրա կատարված ուսումնասիրություններում դիտարկված ոչ միատարր գեների արտահայտման օրինաչափությունները 3,4:
Այս ուսումնասիրության նպատակն էր օգտագործել PB-PCXI սինխրոտրոնը՝ կենդանի առնետների շնչափողում մի շարք միկրոմասնիկների (ՄՊ) in vivo շարժումները պատկերացնելու համար: Այս PB-PCXI պատկերագրական ուսումնասիրությունները նախատեսված էին ՄՊ-ների, մագնիսական դաշտի ուժգնության և տեղակայման մի շարք փորձարկելու համար՝ ՄՊ շարժման վրա դրանց ազդեցությունը որոշելու համար: Մենք ենթադրեցինք, որ արտաքին կիրառվող մագնիսական դաշտը կօգնի մատակարարվող ՄՊ-ին մնալ կամ տեղափոխվել թիրախային տարածք: Այս ուսումնասիրությունները նաև թույլ տվեցին մեզ նույնականացնել մագնիսների կոնֆիգուրացիաներ, որոնք մեծացնում են շնչափողում կուտակումից հետո պահպանված մասնիկների քանակը: Ուսումնասիրությունների երկրորդ շարքում մենք ձգտեցինք օգտագործել այս օպտիմալ կոնֆիգուրացիան՝ ցույց տալու համար ձախ փորոքի միկրոմասնիկների (ՁՊ) in vivo մատակարարումից առնետի շնչուղիներ առաջացող տրանսդուկցիայի օրինաչափությունը՝ հիմնվելով այն ենթադրության վրա, որ ՁՊ-ՄՊ-ների մատակարարումը շնչուղիների թիրախավորման համատեքստում կհանգեցնի ՁՊ տրանսդուկցիայի արդյունավետության բարելավմանը:
Բոլոր կենդանիների վրա կատարված ուսումնասիրությունները կատարվել են Ադելաիդայի համալսարանի (M-2019-060 և M-2020-022) և SPring-8 Սինխրոտրոնային կենդանիների էթիկայի կոմիտեի կողմից հաստատված արձանագրությունների համաձայն։ Փորձերը կատարվել են ARRIVE ուղեցույցների համաձայն։
Բոլոր ռենտգենյան պատկերները կատարվել են Ճապոնիայի SPring-8 սինխրոտրոնի BL20XU ճառագայթային գծի վրա՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրվածին նման կառուցվածք21,22: Հակիրճ ասած, փորձարարական տուփը գտնվում էր սինխրոտրոնի պահեստավորման օղակից 245 մ հեռավորության վրա: Մասնիկների պատկերման ուսումնասիրությունների համար օգտագործվում է նմուշ-դետեկտոր 0.6 մ հեռավորություն, իսկ in vivo պատկերման ուսումնասիրությունների համար՝ 0.3 մ հեռավորություն: Օգտագործվել է 25 կէՎ մոնոքրոմատիկ փնջի էներգիա: Պատկերները ստացվել են բարձր թույլտվությամբ ռենտգենյան փոխարկիչի (SPring-8 BM3) միջոցով, որը միացված է sCMOS դետեկտորին: Փոխարկիչը ռենտգենյան ճառագայթները վերածում է տեսանելի լույսի՝ օգտագործելով 10 մկմ հաստությամբ սցինտիլյատոր (Gd3Al2Ga3O12), որն այնուհետև ուղղորդվում է sCMOS սենսոր՝ օգտագործելով × 10 մանրադիտակի օբյեկտիվ (NA 0.3): sCMOS դետեկտորը Orca-Flash4.0-ն էր (Hamamatsu Photonics, Ճապոնիա)՝ զանգվածի չափսերով: 2048 × 2048 պիքսել և 6.5 × 6.5 մկմ հում պիքսելի չափս։ Այս կարգավորումը տալիս է 0.51 մկմ արդյունավետ իզոտրոպ պիքսելի չափ և մոտավորապես 1.1 մմ × 1.1 մմ տեսադաշտ։ Ընտրվել է 100 մվրկ էքսպոզիցիայի երկարություն՝ շնչուղիների ներսում և դրսում մագնիսական մասնիկների ազդանշան-աղմուկ հարաբերակցությունը մեծացնելու և շնչառության հետևանքով առաջացած շարժման արտեֆակտները նվազագույնի հասցնելու համար։ In vivo ուսումնասիրությունների համար ռենտգենյան ուղու վրա տեղադրվել է արագ ռենտգենյան փակաղակ՝ ճառագայթման դոզան սահմանափակելու համար՝ էքսպոզիցիաների միջև ռենտգենյան ճառագայթը արգելափակելով։
Ձախ փորոքի կրիչը չի օգտագործվել SPring-8 PB-PCXI որևէ պատկերագրական ուսումնասիրություններում, քանի որ BL20XU պատկերագրական խցիկը չունի կենսաանվտանգության 2-րդ մակարդակի հավաստագիր: Դրա փոխարեն մենք ընտրել ենք լավ բնութագրված միկրոմասնիկների մի շարք երկու առևտրային մատակարարներից՝ ընդգրկելով չափերի, նյութերի, երկաթի կոնցենտրացիաների և կիրառությունների լայն տեսականի՝ նախ հասկանալու համար, թե ինչպես են մագնիսական դաշտերը ազդում միկրոմասնիկների շարժման վրա ապակե մազանոթներում, ապա՝ կենդանի շնչուղիներում: մակերեսին։ ՄՊ-ները տատանվում են 0.25-ից մինչև 18 մկմ չափերի և պատրաստված են տարբեր նյութերից (տե՛ս աղյուսակ 1), սակայն յուրաքանչյուր նմուշի կազմը, ներառյալ ՄՊ-ի ներսում գտնվող մագնիսական մասնիկների չափը, անհայտ է։ Հիմնվելով մեր լայնածավալ ՄԿՏ ուսումնասիրությունների 19, 20, 21, 23, 24 վրա, մենք ենթադրում ենք, որ 5 մկմ-ի չափի ՄՊ-ները կարելի է տեսնել շնչափողի շնչուղիների մակերեսին, օրինակ՝ հանելով հաջորդական կադրերը՝ ՄՊ շարժման բարելավված տեսանելիությունը տեսնելու համար։ Մեկ 0.25 մկմ չափի ՄՊ-ն փոքր է պատկերող սարքի լուծաչափից, սակայն PB-PCXI-ն, ենթադրաբար, կհայտնաբերի դրանց ծավալային հակադրությունը և այն մակերեսային հեղուկի շարժումը, որի վրա դրանք նստեցվել են նստեցումից հետո։
Աղյուսակ 1-ում ներկայացված յուրաքանչյուր MP-ի նմուշները պատրաստվել են 20 մկլ ապակե մազանոթներում (Drummond Microcaps, PA, ԱՄՆ)՝ 0.63 մմ ներքին տրամագծով: Կորպուսկուլյար մասնիկները հասանելի են ջրի մեջ, մինչդեռ CombiMag մասնիկները հասանելի են արտադրողի սեփական հեղուկում: Յուրաքանչյուր խողովակ կիսով չափ լցված է հեղուկով (մոտավորապես 11 մկլ) և տեղադրված է նմուշի պահիչի վրա (տե՛ս նկար 1): Ապակե մազանոթները հորիզոնական տեղադրվել են համապատասխանաբար պատկերման տուփի նմուշի հարթակի վրա և դիրքավորվել են հեղուկի եզրերը: 19 մմ տրամագծով (28 մմ երկարությամբ) նիկելային թաղանթով հազվագյուտ հողային նեոդիմիումային երկաթի բորի (NdFeB) մագնիս (N35, կատալոգային համար LM1652, Jaycar Electronics, Ավստրալիա)՝ 1.17 Տեսլա մնացորդային մագնիսացմամբ, միացվել է առանձին տեղափոխման հարթակին՝ պատկերման ընթացքում դրա դիրքը հեռակա փոխելը ապահովելու համար: Ռենտգենյան պատկերի ստացումը սկսվում է, երբ մագնիսը տեղադրվում է նմուշից մոտավորապես 30 մմ վերև, և պատկերները ստացվում են վայրկյանում 4 կադր արագությամբ: Պատկերման ընթացքում մագնիսը մոտեցվել է... ապակե մազանոթային խողովակ (մոտ 1 մմ հեռավորության վրա) և այնուհետև տեղափոխվել խողովակի երկայնքով՝ դաշտի ուժի և դիրքի ազդեցությունը գնահատելու համար։
Ին վիտրո պատկերման համակարգ, որը պարունակում է միկրոմասնիկների նմուշներ ապակե մազանոթներում՝ նմուշի xy թարգմանության փուլում: Ռենտգենյան փնջի ուղին նշված է կարմիր կետագծով:
Երբ հաստատվեց միկրոպլասենտների in vitro տեսանելիությունը, դրանց մի մասը in vivo փորձարկվեց վայրի տիպի էգ ալբինոս Wistar առնետների վրա (մոտ 12 շաբաթական, մոտ 200 գ): 0.24 մգ/կգ մեդետոմիդին (Domitor®, Zenoaq, Ճապոնիա), 3.2 մգ/կգ միդազոլամ (Dormicum®, Astellas Pharma, Ճապոնիա) և 4 մգ/կգ բուտորֆանոլ (Vetorphale®, Meiji Seika): Առնետները անզգայացվեցին Pharma (Ճապոնիա) խառնուրդով՝ ներորովայնային ներարկման միջոցով: Անզգայացումից հետո նրանք պատրաստվեցին պատկերման համար՝ հեռացնելով շնչափողի շուրջը գտնվող մորթին, տեղադրելով էնդոտրախեալ խողովակ (ET; 16 Ga iv կանուլա, Terumo BCT) և անշարժացնելով նրանց պառկած վիճակում՝ մարմնի ջերմաստիճանը պահպանելու համար նախատեսված ջերմային պարկ պարունակող պատկերման ափսեի վրա 22: Այնուհետև պատկերման ափսեն միացվեց պատկերման տուփի նմուշի տեղափոխման փուլին՝ փոքր անկյան տակ, որպեսզի շնչափողը հորիզոնականորեն դասավորվի ռենտգենյան պատկերում, ինչպես ցույց է տրված նկար 2ա-ում:
(ա) SPring-8 պատկերման տուփում in vivo պատկերման կարգավորում, ռենտգենյան փնջի ուղին նշված է կարմիր ընդհատ գծով: (բ,գ) Շնչափողի վրա մագնիսի տեղայնացումը կատարվել է հեռակա կարգով՝ օգտագործելով երկու ուղղանկյուն կերպով տեղադրված IP տեսախցիկներ: Էկրանի պատկերի ձախ կողմում կարելի է տեսնել գլուխը պահող մետաղալարե օղակը և ներարկման կանուլան՝ տեղադրված է էթերոէնտերոլային խողովակի ներսում:
Հեռակառավարվող ներարկիչ-պոմպային համակարգ (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), որն օգտագործում էր 100 մկլ ապակե ներարկիչ, միացվել էր PE10 խողովակին (OD 0.61 մմ, ID 0.28 մմ) 30 Ga ասեղի միջոցով: Նշեք խողովակը՝ համոզվելու համար, որ ծայրը ճիշտ դիրքում է շնչափողում՝ ET խողովակը տեղադրելիս: Միկրոպոմպի միջոցով ներարկիչի մխոցը հանվել է, մինչդեռ խողովակի ծայրը ընկղմվել է ներարկվող MP նմուշի մեջ: Այնուհետև լիցքավորված ներարկիչ խողովակը տեղադրվել է էնդոտրախեալ խողովակի մեջ՝ ծայրը տեղադրելով մեր սպասվող կիրառվող մագնիսական դաշտի ամենաուժեղ մասում: Պատկերի ստացումը կառավարվել է մեր Arduino-ի վրա հիմնված ժամանակային տուփին միացված շնչառության դետեկտորի միջոցով, և բոլոր ազդանշանները (օրինակ՝ ջերմաստիճան, շնչառություն, փակիչի բացում/փակում և պատկերի ստացում) գրանցվել են Powerlab-ի և LabChart-ի (AD Instruments, Սիդնեյ, Ավստրալիա) 22 միջոցով: Պատկերման ժամանակ, երբ պատյանը անհասանելի էր, երկու IP տեսախցիկներ (Panasonic BB-SC382) տեղադրվել են միմյանց նկատմամբ մոտավորապես 90° անկյան տակ և օգտագործվել են: պատկերման ընթացքում մագնիսի դիրքը շնչափողի նկատմամբ վերահսկելու համար (Նկ. 2բ, գ): Շարժման արտեֆակտները նվազագույնի հասցնելու համար, վերջնամակարդային հոսքի պլատոյի ընթացքում յուրաքանչյուր շնչառության համար ստացվել է մեկ պատկեր:
Երկրորդ փուլին, որը կարող է տեղադրվել պատկերման պատյանի դրսից հեռու, ամրացված է մագնիս։ Փորձարկվել են մագնիսների տարբեր դիրքեր և կոնֆիգուրացիաներ, այդ թվում՝ տեղադրված շնչափողից մոտավորապես 30° անկյան տակ (կոնֆիգուրացիաները ցույց են տրված նկար 2ա և 3ա-ում), մեկ մագնիս կենդանու վերևում, իսկ մյուսը՝ ներքևում, ձգողականության համար նախատեսված բևեռներով (Նկար 3բ), մեկ մագնիս կենդանու վերևում, իսկ մյուսը՝ ներքևում, ձգողականության համար նախատեսված բևեռներով (Նկար 3գ), և մեկ մագնիս շնչափողից վերև և ուղղահայաց (Նկար 3դ)։ Երբ կենդանին և մագնիսը կարգավորված են, և փորձարկվող միկրոմասնիկը լցվում է ներարկիչ պոմպի մեջ, պատկերներ ստանալիս ներարկվում է 50 մկլ դեղաչափ 4 մկլ/վրկ արագությամբ։ Այնուհետև մագնիսը շարժվում է ետ և առաջ շնչափողի երկայնքով կամ կողքից՝ շարունակելով պատկերներ ստանալը։
In vivo պատկերման համար մագնիսական կոնֆիգուրացիա (ա) մեկ մագնիս՝ շնչափողի վերևում՝ մոտավորապես 30° անկյան տակ, (բ) երկու մագնիս՝ ձգելու համար, (գ) երկու մագնիս՝ վանելու համար, (դ) մեկ մագնիս՝ շնչափողի վերևում և ուղղահայաց։ Դիտորդը բերանից ներքև նայում էր թոքերին շնչափողի միջով, և ռենտգենյան ճառագայթը անցնում էր առնետի ձախ կողմից և դուրս գալիս աջ կողմից։ Մագնիսը կամ շարժվում էր շնչուղիների երկայնքով, կամ ձախ և աջ՝ շնչափողի վերևում՝ ռենտգենյան ճառագայթի ուղղությամբ։
Մենք նաև ձգտեցինք որոշել մասնիկների տեսանելիությունն ու վարքագիծը շնչուղիներում՝ շնչառության և սրտի շարժման խառնաշփոթի բացակայության դեպքում։ Հետևաբար, պատկերման ժամանակահատվածի ավարտին կենդանիները մարդասիրաբար սպանվեցին պենտոբարբիտալի չափից մեծ դոզայի համար (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 մգ/կգ ներերակային)։ Որոշ կենդանիներ մնացին պատկերման հարթակի վրա, և շնչառության և սրտի բաբախյունի դադարեցումից հետո պատկերման գործընթացը կրկնվեց՝ ավելացնելով միկրոմասնիկների լրացուցիչ դոզա, եթե շնչուղիների մակերեսին միկրոմասնիկներ տեսանելի չէին։
Ստացված պատկերները շտկվել են հարթ և մութ դաշտերում, այնուհետև հավաքվել են ֆիլմի մեջ (վայրկյանում 20 կադր; 15-25 × նորմալ արագություն՝ կախված շնչառության հաճախականությունից)՝ օգտագործելով MATLAB-ում գրված հատուկ սկրիպտ (R2020a, The Mathworks):
Ձախ ձախ փորոքի գեների վեկտորի ներարկման բոլոր ուսումնասիրությունները անցկացվել են Ադելաիդայի համալսարանի լաբորատոր կենդանիների հետազոտությունների կենտրոնում և նպատակ ունեին օգտագործել SPring-8 փորձի արդյունքները՝ գնահատելու համար, թե արդյոք մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում Ձախ փորոքի-մետրոպոլիսախարիդային ներարկումը կարող է բարելավել գեների փոխանցումը in vivo: Մետրոպոլիսախարիդային ներարկման և մագնիսական դաշտի ազդեցությունը գնահատելու համար բուժվել են կենդանիների երկու խմբեր. մեկ խմբին տրվել է Ձախ փորոքի-մետրոպոլիսախարիդային ներարկում՝ տեղադրված մագնիսով, իսկ մյուս խմբին տրվել է վերահսկիչ խումբ՝ Ձախ փորոքի-մետրոպոլիսախարիդային ներարկումով՝ առանց մագնիսների:
LV գենային վեկտորները ստեղծվել են նախկինում նկարագրված մեթոդներով25, 26: LacZ վեկտորը արտահայտում է միջուկային տեղայնացված բետա-գալակտոզիդազի գենը, որը շարժվում է MPSV պրոմոտորի (LV-LacZ) կողմից, որը տրանսդուկցված բջիջներում առաջացնում է կապույտ ռեակցիայի արգասիք, որը տեսանելի է թոքային հյուսվածքի ճակատային մասերում և հյուսվածքային հատվածներում: Տիտրացիան իրականացվել է բջջային կուլտուրաներում՝ LacZ դրական բջիջների քանակը ձեռքով հաշվելով հեմոցիտոմետրով՝ տիտրը TU/ml-ով հաշվարկելու համար: Կրողները կրիոսինտեսվում են -80°C ջերմաստիճանում, հալեցվում են օգտագործելուց առաջ և կապվում CombiMag-ի հետ՝ խառնելով 1:1 հարաբերակցությամբ և ինկուբացվելով սառույցի վրա առնվազն 30 րոպե՝ մինչև առաքումը:
Սփրեյգ Դոուլիի նորմալ առնետները (n = 3/խմբում, ~2-3) անզգայացվել են ներորովայնային եղանակով՝ 0.4 մգ/կգ մեդետոմիդինի (Domitor, Ilium, Ավստրալիա) և 60 մգ/կգ կետամինի (Ilium, Ավստրալիա) (ամսական) ներմկանային ներարկման միջոցով և ոչ վիրաբուժական բերանային կանուլայով՝ 16 Ga ներերակային կանուլայով։ Որպեսզի ապահովվի, որ շնչափողի շնչուղիների հյուսվածքը ստանում է ձախ փորոքի տրանսդուկցիա, այն պայմանավորվել է մեր նախկինում նկարագրված մեխանիկական պերտուրբացիայի արձանագրությամբ, որի դեպքում շնչափողի շնչուղիների մակերեսը առանցքային ուղղությամբ քսվել է մետաղալարե զամբյուղով (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ԱՄՆ) 30 վայրկյան 28։ Այնուհետև LV-MP-ի շնչափողային ներարկումը կատարվել է կենսաբանական անվտանգության պահարանում՝ պերտուրբացիայից մոտավորապես 10 րոպե անց։
Այս փորձի մեջ օգտագործված մագնիսական դաշտը կարգավորվել է in vivo ռենտգենյան պատկերման ուսումնասիրության նման՝ նույն մագնիսները պահվել են շնչափողի վերևում՝ օգտագործելով թորման ստենտային սեղմակներ (Նկար 4): Ձախ փորոքի արգանդ-մետաղապլաստիկ 50 մկլ ծավալով (2 × 25 մկլ ալիքվոտ) ներարկվել է շնչափող (n = 3 կենդանի)՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրված գելային ծայրով պիպետ: Վերահսկիչ խումբը (n = 3 կենդանի) ստացել է նույն Ձախ փորոքի արգանդ-մետաղապլաստիկ արգանդները՝ առանց մագնիս օգտագործելու: Ինֆուզիայի ավարտից հետո կանուլան հանվում է էքստրակտորային խողովակից, և կենդանին էքստուբացվում: Մագնիսը մնում է տեղում 10 րոպե, այնուհետև հանվում է: Առնետներին ենթամաշկային ներարկվել է մելոքսիկամի (1 մլ/կգ) (Ilium, Ավստրալիա) դեղաչափ, որին հաջորդել է անզգայացման վերացումը 1 մգ/կգ ատիպամազոլի հիդրոքլորիդի (Antisedan, Zoetis, Ավստրալիա) ներմկանային ներարկմամբ: Առնետներին տաք են պահել և հսկել մինչև անզգայացումից լիակատար ապաքինումը:
LV-MP ներարկման սարքը կենսաբանական անվտանգության պահարանում: ԷԹ խողովակի բաց մոխրագույն Լյուերի ցողունը կարելի է տեսնել բերանից դուրս ցցված, իսկ նկարում պատկերված պիպետի գելային ծայրը մտցվում է ԷԹ խողովակի միջով մինչև շնչափողի մեջ ցանկալի խորությունը:
LV-MP դեղաչափման ընթացակարգից մեկ շաբաթ անց կենդանիները մարդասիրաբար սպանվեցին 100% CO2 ինհալացիայով, և LacZ-ի արտահայտությունը գնահատվեց մեր ստանդարտ X-gal բուժման միջոցով: Երեք պոչային ամենաաճռռացող օղակները հեռացվեցին՝ ապահովելու համար, որ էնդոտրախեալ խողովակի տեղադրումից առաջացած որևէ մեխանիկական վնասվածք կամ հեղուկի կուտակում չներառվի վերլուծության մեջ: Յուրաքանչյուր շնչափող կտրվեց երկայնականորեն՝ վերլուծության համար երկու կես ստեղծելու համար, և դրանք տեղադրվեցին սիլիկոնե ռետին պարունակող ամանի մեջ (Sylgard, Dow Inc)՝ օգտագործելով Minutien ասեղ (Fine Science Tools)՝ լուսանցքի մակերեսը պատկերելու համար: Տրանսդուկցված բջիջների բաշխումը և պատկերը հաստատվեցին ճակատային լուսանկարչության միջոցով՝ օգտագործելով Nikon մանրադիտակ (SMZ1500)՝ DigiLite տեսախցիկով և TCapture ծրագրակազմով (Tucsen Photonics, Չինաստան): Պատկերները ստացվեցին 20x մեծացմամբ (ներառյալ շնչափողի լրիվ լայնության համար ամենաբարձր կարգավորումը), որտեղ շնչափողի ամբողջ երկարությունը պատկերվեց քայլ առ քայլ՝ ապահովելով յուրաքանչյուր պատկերի միջև բավարար համընկնումը՝ պատկերի «կարման» համար: Այնուհետև յուրաքանչյուր շնչափողից ստացված պատկերները միավորվեցին մեկ կոմպոզիտային պատկերի մեջ՝ օգտագործելով Պատկերի կոմպոզիտային խմբագրիչ v2.0.3 (Microsoft Research)՝ օգտագործելով հարթ շարժման ալգորիթմ: Յուրաքանչյուր կենդանու շնչափողի կոմպոզիտային պատկերներում LacZ արտահայտման տարածքները քանակականացվել են ավտոմատացված MATLAB սկրիպտի միջոցով (R2020a, MathWorks), ինչպես նկարագրվել է նախկինում, օգտագործելով 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 և Value < 0.7 կարգավորումները: Հյուսվածքի ուրվագծերը գծելով՝ GIMP v2.10.24-ում ձեռքով ստեղծվել է դիմակ յուրաքանչյուր կոմպոզիտային պատկերի համար՝ հյուսվածքային տարածքը նույնականացնելու և շնչափողի հյուսվածքից դուրս ցանկացած կեղծ հայտնաբերում կանխելու համար: Յուրաքանչյուր կենդանու բոլոր կոմպոզիտային պատկերներից ներկված տարածքները գումարվել են՝ այդ կենդանու համար ընդհանուր ներկված տարածքը ստանալու համար: Այնուհետև ներկված տարածքը բաժանվել է ընդհանուր դիմակի մակերեսին՝ նորմալացված տարածքը ստանալու համար:
Յուրաքանչյուր շնչափող ներդրվեց պարաֆինի մեջ, և կտրվեցին 5 մկմ հատվածներ։ Կտրվածքները 5 րոպե ներկվեցին չեզոք արագ կարմիր գույնով, և պատկերները ստացվեցին Nikon Eclipse E400 մանրադիտակի, DS-Fi3 տեսախցիկի և NIS տարրերի գրանցման ծրագրի (տարբերակ 5.20.00) միջոցով։
Բոլոր վիճակագրական վերլուծությունները կատարվել են GraphPad Prism v9-ում (GraphPad Software, Inc.): Վիճակագրական նշանակալիությունը սահմանվել է p ≤ 0.05: Նորմալությունը ստուգվել է Շապիրո-Վիլկի թեստի միջոցով, իսկ LacZ գունավորման տարբերությունները գնահատվել են չզույգված t-թեստի միջոցով:
Աղյուսակ 1-ում նկարագրված վեց միկրոպոլիստիրոլային միկրոպոլիստիրոլները (MP1 և MP2, համապատասխանաբար 18 մկմ և 0.25 մկմ) PCXI-ի տակ տեսանելի չէին, բայց մնացած նմուշները նույնականացվող էին (օրինակները ներկայացված են նկար 5-ում): MP3-ը և MP4-ը (համապատասխանաբար 10-15% Fe3O4; 0.25 մկմ և 0.9 մկմ) թույլ տեսանելի են: Չնայած պարունակում էին փորձարկված ամենափոքր մասնիկներից մի քանիսը, MP5-ը (98% Fe3O4; 0.25 մկմ) ամենաակնառու էր: CombiMag MP6 արտադրանքը դժվար է նկատել: Բոլոր դեպքերում, միկրոպոլիստիրոլը հայտնաբերելու մեր ունակությունը զգալիորեն բարելավվել է մագնիսը մազանոթին զուգահեռ առաջ և ետ տեղափոխելով: Երբ մագնիսները հեռանում էին մազանոթից, մասնիկները ձգվում էին երկար շղթաներով, բայց երբ մագնիսները մոտենում էին և մագնիսական դաշտի ուժգնությունը մեծանում էր, մասնիկների շղթաները կարճանում էին, քանի որ մասնիկները տեղափոխվում էին մազանոթի վերին մակերես (տե՛ս լրացուցիչ տեսանյութ S1: MP4), մեծացնելով The Մակերեսի մասնիկների խտությունը։ Հակառակը, երբ մագնիսը հանվում է մազանոթից, դաշտի ուժգնությունը նվազում է, և միկրոմասնիկները վերադասավորվում են մազանոթի վերին մակերևույթից ձգվող երկար շղթաների (տե՛ս լրացուցիչ տեսանյութ S2:MP4): Մագնիսի շարժումը դադարեցնելուց հետո մասնիկները շարունակում են շարժվել կարճ ժամանակ՝ հավասարակշռության դիրքին հասնելուց հետո։ Երբ միկրոմասնիկը շարժվում է մազանոթի վերին մակերևույթի ուղղությամբ և դրանից հեռանալով, մագնիսական մասնիկները սովորաբար քարշ են տալիս բեկորները հեղուկի միջով։
PCXI-ի տակ MP-ի տեսանելիությունը զգալիորեն տարբերվում է նմուշների միջև։(ա) MP3, (բ) MP4, (գ) MP5 և (դ) MP6: Այստեղ ներկայացված բոլոր պատկերները նկարահանվել են մազանոթից մոտավորապես 10 մմ անմիջապես վերևում գտնվող մագնիսով: Ակնհայտ մեծ շրջանակները մազանոթներում խցանված օդային պղպջակներ են, որոնք հստակ ցույց են տալիս փուլային կոնտրաստային պատկերման սև և սպիտակ եզրային առանձնահատկությունները: Կարմիր վանդակը պարունակում է կոնտրաստը ուժեղացնող խոշորացումը: Նկատի ունեցեք, որ բոլոր նկարներում մագնիսների սխեմատիկ տրամագծերը մասշտաբային չեն և մոտավորապես 100 անգամ մեծ են, քան ցույց է տրված:
Երբ մագնիսը տեղափոխվում է մազանոթի վերևի երկայնքով ձախ և աջ, MP լարի անկյունը փոխվում է՝ համընկնելու մագնիսի հետ (տե՛ս նկար 6), այդպիսով ուրվագծելով մագնիսական դաշտի գծերը: MP3-5-ի դեպքում, երբ լարը հասնում է շեմային անկյան, մասնիկները քաշվում են մազանոթի վերին մակերեսի երկայնքով: Սա հաճախ հանգեցնում է MP-ների կույտավորմանը՝ կազմելով ավելի մեծ խմբեր՝ մոտ մագնիսական դաշտի ամենաուժեղ հատվածին (տե՛ս լրացուցիչ տեսանյութ S3:MP5): Սա հատկապես ակնհայտ է նաև մազանոթի ծայրին մոտ պատկերելիս, ինչը հանգեցնում է MP-ների կուտակմանը և կենտրոնացմանը հեղուկ-օդ միջերեսում: MP6-ի մասնիկները, որոնք ավելի դժվար էր տարբերակել, քան MP3-5-ը, չեն քաշվել, երբ մագնիսը շարժվել է մազանոթի երկայնքով, բայց MP լարերը դիսոցացվել են՝ թողնելով մասնիկները տեսադաշտում (տե՛ս լրացուցիչ տեսանյութ S4:MP6): Որոշ դեպքերում, երբ կիրառվող մագնիսական դաշտը նվազեցվել է՝ մագնիսը պատկերման տեղից մեծ հեռավորության վրա տեղափոխելով, մնացած MP-ները դանդաղորեն իջել են խողովակի ներքևի մակերես՝ ձգողականության ուժով՝ մնալով լարի մեջ (տե՛ս լրացուցիչ տեսանյութ S5: MP3):
MP լարի անկյունը փոխվում է, երբ մագնիսը տեղափոխվում է մազանոթից աջ։(ա) MP3, (բ) MP4, (գ) MP5 և (դ) MP6: Կարմիր վանդակը պարունակում է հակադրությունը ուժեղացնող խոշորացումը: Նշենք, որ լրացուցիչ տեսանյութերը տեղեկատվական են, քանի որ դրանք բացահայտում են մասնիկների կարևոր կառուցվածքի և դինամիկ տեղեկատվության մասին, որոնք հնարավոր չէ պատկերացնել այս ստատիկ պատկերներում:
Մեր փորձարկումները ցույց տվեցին, որ մագնիսի դանդաղ առաջ-ետ շարժումը շնչափողի երկայնքով հեշտացնում է միկրոպոլիստիրոլի (ՄՊ) տեսողականացումը in vivo բարդ շարժման համատեքստում: In vivo փորձարկումներ չեն իրականացվել, քանի որ պոլիստիրոլի գնդիկները (MP1 և MP2) տեսանելի չեն եղել մազանոթում: Մնացած չորս ՄՊ-ներից յուրաքանչյուրը փորձարկվել է in vivo՝ մագնիսի երկար առանցքը դասավորված շնչափողի վերևում՝ ուղղահայացի նկատմամբ մոտ 30° անկյան տակ (տե՛ս նկար 2բ և 3ա), քանի որ դա հանգեցրել է ավելի երկար ՄՊ շղթաների և ավելի արդյունավետ է եղել, քան ավարտված մագնիսի կոնֆիգուրացիան: MP3, MP4 և MP6 չեն հայտնաբերվել որևէ կենդանի կենդանու շնչափողում: Երբ առնետի շնչուղիները պատկերվել են կենդանիների մարդասիրական սպանությունից հետո, մասնիկները մնացել են անտեսանելի նույնիսկ այն դեպքում, երբ լրացուցիչ ծավալ է ավելացվել ներարկիչ պոմպի միջոցով: MP5-ն ուներ երկաթի օքսիդի ամենաբարձր պարունակությունը և միակ տեսանելի մասնիկն էր, ուստի օգտագործվել է ՄՊ-ի in vivo վարքագիծը գնահատելու և բնութագրելու համար:
ՄՊ-ի ներարկման ժամանակ մագնիսը շնչափողի վրա տեղադրելը հանգեցրեց նրան, որ շատ, բայց ոչ բոլորը, ՄՊ-ներ կենտրոնացան տեսադաշտում: Շնչափող մտնող մասնիկները լավագույնս դիտվում են մարդասիրական ճանապարհով զոհաբերված կենդանիների մոտ: Նկար 7-ը և լրացուցիչ տեսանյութ S6: MP5-ը ցույց են տալիս մասնիկների արագ մագնիսական կլանումը և դասավորությունը որովայնի շնչափողի մակերեսին, ինչը ցույց է տալիս, որ ՄՊ-ները կարող են ուղղվել շնչափողի ցանկալի շրջաններ: ՄՊ-ի ներարկումից հետո շնչափողի երկայնքով ավելի դիստալ որոնում կատարելիս որոշ ՄՊ-ներ հայտնաբերվել են թիակին ավելի մոտ, ինչը ենթադրում է, որ մագնիսական դաշտի ուժգնությունը բավարար չէր բոլոր ՄՊ-ները հավաքելու և պահպանելու համար, քանի որ դրանք հեղուկի գործընթացի ընթացքում ներմուծվել են առավելագույն մագնիսական դաշտի ուժգնության շրջանով: Այնուամենայնիվ, հետծննդյան ՄՊ-ների կոնցենտրացիաները ավելի բարձր էին պատկերված տարածքի շուրջ, ինչը ենթադրում է, որ շատ ՄՊ-ներ մնացել են շնչուղիների այն շրջաններում, որտեղ կիրառվող մագնիսական դաշտի ուժգնությունն ամենաբարձրն էր:
Պատկերներ (ա) վերջերս էվթանազիայի ենթարկված առնետի շնչափող MP5-ի ներարկումից առաջ և (բ) հետո՝ մագնիսը տեղադրված պատկերման տարածքի անմիջապես վերևում: Պատկերված տարածքը գտնվում է երկու աճառային օղակների միջև: MP5-ի ներարկումից առաջ շնչուղիներում կա որոշակի քանակությամբ հեղուկ: Կարմիր վանդակը պարունակում է կոնտրաստը ուժեղացնող խոշորացույցը: Այս պատկերները վերցված են լրացուցիչ տեսանյութ S6:MP5-ում ցուցադրված տեսանյութից:
Մագնիսի in vivo տեղաշարժը շնչափողի երկայնքով հանգեցրեց միկրոմասնիկների շղթայի անկյունի փոփոխության շնչուղիների մակերեսի ներսում՝ նման մազանոթներում դիտվողին (տե՛ս նկար 8-ը և լրացուցիչ տեսանյութ S7:MP5): Այնուամենայնիվ, մեր ուսումնասիրության մեջ միկրոմասնիկները չէին կարող քարշ տալ կենդանի շնչուղիների մակերեսով, ինչպես դա կարող էին անել մազանոթների դեպքում: Որոշ դեպքերում միկրոմասնիկների շղթան կարող է երկարել, երբ մագնիսը շարժվում է ձախ և աջ: Հետաքրքիր է, որ մենք նաև պարզեցինք, որ մասնիկների շարը, կարծես, փոխում է մակերեսային հեղուկի շերտի խորությունը, երբ մագնիսը շարժվում է շնչափողի երկայնքով երկայնական ուղղությամբ, և լայնանում է, երբ մագնիսը տեղափոխվում է ուղիղ գլխավերևում, և մասնիկների շարը պտտվում է ուղղահայաց դիրքի (տե՛ս լրացուցիչ տեսանյութ S7): : MP5-ը 0:09-ին, ներքևի աջ անկյունում): Շարժման բնորոշ օրինաչափությունը փոխվում էր, երբ մագնիսը տեղափոխվում էր շնչափողի վերին մասի երկայնքով՝ կողային ուղղությամբ (այսինքն՝ կենդանու ձախ կամ աջ, այլ ոչ թե շնչափողի երկայնքով): Մասնիկները դեռևս հստակ տեսանելի էին շարժվելիս, բայց երբ մագնիսը հեռացվում էր շնչափողից, մասնիկների թելերի ծայրերը դառնում էին տեսանելի (տե՛ս լրացուցիչ տեսանյութ S8:MP5, սկսած 0:08-ից): Սա համապատասխանում է ապակե մազանոթում կիրառվող մագնիսական դաշտի տակ մեր դիտարկած MP վարքագծին:
Օրինակ պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս MP5-ը կենդանի անզգայացված առնետի շնչափողում։ (ա) Մագնիսն օգտագործվում է շնչափողի վերևում և ձախ կողմում պատկերներ ստանալու համար, ապա (բ) մագնիսը աջ տեղափոխելուց հետո։ Կարմիր վանդակը պարունակում է կոնտրաստը ուժեղացնող խոշորացումը։ Այս պատկերները վերցված են լրացուցիչ տեսանյութ S7:MP5-ում ցուցադրված տեսանյութից։
Երբ երկու բևեռները դասավորված էին հյուսիս-հարավ կողմնորոշմամբ՝ շնչափողից վերև և ներքև (այսինքն՝ ձգողական, Նկ. 3բ), MP լարերը թվում էին ավելի երկար և տեղակայված էին շնչափողի կողային պատին, այլ ոչ թե մեջքային շնչափողի մակերեսին (տե՛ս լրացուցիչ տեսանյութ S9:MP5): Այնուամենայնիվ, հեղուկի ներարկումից հետո մեկ տեղում (այսինքն՝ շնչափողի մեջքային մակերեսին) մասնիկների բարձր կոնցենտրացիաներ չեն հայտնաբերվել, երբ օգտագործվել է կրկնակի մագնիսով սարք, ինչը սովորաբար տեղի է ունենում, երբ օգտագործվում է մեկ մագնիսով սարք: Այնուհետև, երբ մեկ մագնիս է կարգավորվել բևեռները հակադարձելու համար (Նկ. 3գ), տեսադաշտում տեսանելի մասնիկների քանակը, կարծես, չի աճել ներարկումից հետո: Երկու կրկնակի մագնիսով կոնֆիգուրացիաների տեղադրումը դժվար է՝ պայմանավորված մագնիսները համապատասխանաբար քաշող կամ մղող բարձր մագնիսական դաշտի ուժգնությամբ: Այնուհետև կարգավորումը փոխվել է մեկ մագնիսով՝ զուգահեռ շնչուղիներին, բայց անցնելով շնչուղիներով 90 աստիճանով, որպեսզի դաշտի գծերը հատեն շնչափողի պատը ուղղաձիգ (Նկ. 3դ), կողմնորոշում, որը նախատեսված է որոշելու համար, թե արդյոք մասնիկների ագրեգացիան կարող է դիտվել կողային պատին: Այնուամենայնիվ, այս կոնֆիգուրացիայում կար ՄՊ կուտակման կամ մագնիսի որևէ ճանաչելի շարժում չի հայտնաբերվել: Այս բոլոր արդյունքների հիման վրա in vivo գեների կրիչների ուսումնասիրությունների համար ընտրվել է մեկ մագնիսով, 30 աստիճանի կողմնորոշմամբ կոնֆիգուրացիա (Նկար 3ա):
Երբ կենդանին բազմիցս պատկերվել է մարդասիրական սպանությունից անմիջապես հետո, շփոթեցնող հյուսվածքային շարժման բացակայությունը նշանակում է, որ հստակ միջխոնդրալ դաշտում կարելի է տարբերակել ավելի նուրբ և կարճ մասնիկների գծեր, որոնք «տատանվում» են մագնիսի տեղափոխական շարժմանը համապատասխան։ Այնուամենայնիվ, դեռևս հստակ չի կարելի տեսնել MP6 մասնիկների առկայությունը և շարժումը։
LV-LacZ տիտրը կազմել է 1.8 × 108 TU/մլ, և CombiMag MP (MP6)-ի հետ 1:1 խառնելուց հետո կենդանիները ստացել են 50 մկլ շնչափողային դոզան՝ 9 × 107 TU/մլ LV կրող (այսինքն՝ 4.5 × 106 TU/առնետ): Այս ուսումնասիրություններում, ծննդաբերության ընթացքում մագնիսը տեղափոխելու փոխարեն, մենք ֆիքսել ենք մագնիսը մեկ դիրքում՝ որոշելու համար, թե արդյոք LV տրանսդուկցիան (ա) կարող է բարելավվել վեկտորային մատակարարման համեմատ մագնիսական դաշտի բացակայության դեպքում, և (բ) կարող է կենտրոնացվել: Շնչուղիների բջիջները տրանսդուկցվում են վերին շնչուղիների մագնիսական թիրախային շրջաններ:
Մագնիսների առկայությունը և CombiMag-ի օգտագործումը ձախ փորոքի վեկտորների հետ համատեղ, կարծես թե, բացասական ազդեցություն չեն ունեցել կենդանիների առողջության վրա, ինչպես նաև մեր ստանդարտ ձախ փորոքի վեկտորի մատակարարման արձանագրությունը: Մեխանիկական խոտորման ենթարկված շնչափողի շրջանի ճակատային պատկերները (Լրացուցիչ նկար 1) ցույց են տվել, որ LV-MP-ով բուժված կենդանիների խմբում, երբ մագնիսը առկա էր, տրանսդուկցիայի մակարդակը զգալիորեն բարձր էր (Նկար 9ա): Վերահսկիչ խմբում առկա էր միայն կապույտ LacZ ներկման փոքր քանակություն (Նկար 9բ): Նորմալացված X-Gal ներկված տարածքների քանակական որոշումը ցույց տվեց, որ LV-MP-ի կիրառումը մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում առաջացրել է մոտավորապես 6 անգամ բարելավում (Նկար 9գ):
Օրինակելի համակցված պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս LV-MP-ի կողմից շնչափողի տրանսդուկցիան (ա) մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում և (բ) մագնիսի բացակայության դեպքում։ (գ) Մագնիսի օգտագործման դեպքում շնչափողի ներսում նորմալացված LacZ տրանսդուկցիայի տարածքի վիճակագրորեն նշանակալի բարելավում (*p = 0.029, t-փորձարկում, n = 3 մեկ խմբի համար, միջին ± SEM):
Չեզոք արագ կարմիր ներկված հատվածները (օրինակը ներկայացված է լրացուցիչ նկար 2-ում) ցույց տվեցին LacZ-ով ներկված բջիջներ, որոնք առկա էին նախկինում հաղորդվածի նման նախշով և տեղակայմամբ։
Շնչուղիների գենային թերապիայի հիմնական մարտահրավերը մնում է կրող մասնիկների ճշգրիտ տեղայնացումը հետաքրքրության շրջաններում և շարժվող թոքերում տրանսդուկցիայի բարձր մակարդակի արդյունավետության հասնելը՝ օդային հոսքի և ակտիվ լորձի մաքրման առկայության դեպքում: Ձախ փորոքի կրողների համար, որոնք նախատեսված են ֆիբրոզային ֆիբրոզով (CF) շնչուղիների հիվանդությունը բուժելու համար, կրող մասնիկների հաղորդիչ շնչուղիներում մնալու ժամանակի ավելացումը մինչ այժմ անհասանելի նպատակ է եղել: Ինչպես նշել են Կաստելանին և այլք, տրանսդուկցիան բարելավելու համար մագնիսական դաշտերի օգտագործումը առավելություններ ունի գեների մատակարարման այլ մեթոդների, ինչպիսիք են էլեկտրոպորացիան, համեմատած, քանի որ այն կարող է համատեղել պարզությունը, ծախսարդյունավետությունը, մատակարարման տեղայնացումը, բարձրացված արդյունավետությունը և ավելի կարճ ինկուբացիոն ժամանակը, և հնարավոր է՝ կրողի ավելի փոքր դոզան10: Այնուամենայնիվ, արտաքին մագնիսական ուժերի ազդեցության տակ շնչուղիներում մագնիսական մասնիկների in vivo նստեցումը և վարքագիծը երբեք չի նկարագրվել, և ոչ էլ իրականում ցույց է տրվել այս մեթոդի in vivo կիրառման հնարավորությունը գենային արտահայտման մակարդակը բարձրացնելու համար անվնաս կենդանի շնչուղիներում:
Մեր in vitro սինխրոտրոնային PCXI փորձերը ցույց տվեցին, որ մեր կողմից փորձարկված բոլոր մասնիկները, բացառությամբ պոլիստիրոլային MP-ի, տեսանելի էին մեր օգտագործած պատկերման համակարգում: Մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում MP-ները ձևավորում են թելեր, որոնց երկարությունը կապված է մասնիկի տեսակի և մագնիսական դաշտի ուժի հետ (այսինքն՝ մագնիսի մոտիկության և շարժման հետ): Ինչպես ցույց է տրված նկար 10-ում, մեր կողմից դիտարկվող թելերն առաջանում են յուրաքանչյուր առանձին մասնիկի մագնիսացման և իր սեփական տեղական մագնիսական դաշտի ինդուկցիայի պատճառով: Այս առանձին դաշտերը ստիպում են այլ նմանատիպ մասնիկների ագրեգացմանը և միացմանը՝ խմբային թելերանման շարժումներով, որոնք պայմանավորված են այլ մասնիկների տեղական ձգողական և վանողական ուժերի տեղական ուժերով:
Սխեմատիկ պատկեր, որը ցույց է տալիս (ա, բ) հեղուկով լցված մազանոթների և (գ, դ) օդով լցված շնչափողի ներսում առաջացող մասնիկների շարքերը: Նկատի ունեցեք, որ մազանոթները և շնչափողը մասշտաբով չեն նկարված: (ա) վահանակը նաև պարունակում է MP-ի նկարագրությունը, որը պարունակում է Fe3O4 մասնիկներ՝ դասավորված շղթաներով:
Երբ մագնիսը տեղափոխվեց մազանոթից վերև, մասնիկների լարի անկյունը հասավ Fe3O4 պարունակող MP3-5-ի համար կրիտիկական շեմի, որից հետո մասնիկների լարը այլևս չմնաց սկզբնական դիրքում, այլ շարժվեց մակերեսի երկայնքով դեպի նոր դիրք։ Այս էֆեկտը, հավանաբար, տեղի կունենա, քանի որ ապակե մազանոթի մակերեսը բավականաչափ հարթ է այս շարժումը թույլ տալու համար։ Հետաքրքիր է, որ MP6-ը (CombiMag) այսպես չի վարվել, հնարավոր է՝ մասնիկները ավելի փոքր էին, ունեին տարբեր ծածկույթներ կամ մակերեսային լիցքեր, կամ սեփական կրող հեղուկը ազդում էր դրանց շարժվելու ունակության վրա։ CombiMag մասնիկների պատկերի հակադրությունը նույնպես ավելի թույլ է, ինչը ենթադրում է, որ հեղուկը և մասնիկները կարող են ունենալ նմանատիպ խտություններ և, հետևաբար, հեշտությամբ չշարժվել միմյանց ուղղությամբ։ Մասնիկները կարող են նաև խրվել, եթե մագնիսը չափազանց արագ է շարժվում, ինչը ցույց է տալիս, որ մագնիսական դաշտի ուժը միշտ չէ, որ կարող է հաղթահարել հեղուկի մեջ մասնիկների միջև շփումը, ինչը ենթադրում է, որ գուցե զարմանալի չէ, որ մագնիսական դաշտի ուժը և մագնիսի ու թիրախային տարածքի միջև հեռավորությունը շատ կարևոր են։ Միասին վերցրած, այս արդյունքները նաև ենթադրում են, որ չնայած մագնիսները կարող են որսալ թիրախային տարածքով հոսող բազմաթիվ MP-ներ, քիչ հավանական է, որ մագնիսներին կարելի է վստահել։ տեղափոխել CombiMag մասնիկները շնչափողի մակերեսով։ Հետևաբար, մենք եզրակացնում ենք, որ in vivo LV-MP ուսումնասիրությունները պետք է օգտագործեն ստատիկ մագնիսական դաշտեր՝ շնչուղիների ծառի որոշակի շրջաններ ֆիզիկապես թիրախավորելու համար։
Երբ մասնիկները մտնում են մարմին, դրանք դժվար է նույնականացնել բարդ շարժվող մարմնի հյուսվածքների համատեքստում, սակայն դրանք հայտնաբերելու ունակությունը բարելավվել է՝ մագնիսը հորիզոնական կերպով տեղափոխելով շնչափողի վերև՝ միկրոմասնիկների լարերը «շարժելու» համար: Չնայած կենդանի պատկերումը հնարավոր է, մասնիկների շարժումը ավելի հեշտ է տարբերակել, երբ կենդանին մարդասիրաբար սպանվել է: Մագնիսի կոնցենտրացիաները, որպես կանոն, ամենաբարձրն էին այս վայրում, երբ մագնիսը տեղադրված էր պատկերման տարածքից վերև, չնայած որոշ մասնիկներ սովորաբար հայտնաբերվում էին շնչափողի երկայնքով: Ի տարբերություն in vitro ուսումնասիրությունների, մասնիկները չեն կարող քարշ գալ շնչափողի երկայնքով՝ մագնիսը տեղափոխելով: Այս հայտնագործությունը համապատասխանում է նրան, թե ինչպես է շնչափողի մակերեսը պատող լորձը սովորաբար մշակում ներշնչված մասնիկները՝ դրանք որսալով լորձի մեջ և հետագայում մաքրվելով լորձաթաղանթային մաքրման մեխանիզմով:
Մենք ենթադրեցինք, որ մագնիսների օգտագործումը շնչափողի վերևում և ներքևում ձգողականության համար (Նկար 3բ) կարող է հանգեցնել ավելի միատարր մագնիսական դաշտի, այլ ոչ թե մագնիսական դաշտի, որը բարձր կենտրոնացված է մեկ կետում, ինչը հնարավոր է հանգեցնի մասնիկների ավելի միատարր բաշխման: Այնուամենայնիվ, մեր նախնական ուսումնասիրությունը չի գտել հստակ ապացույցներ այս վարկածը հաստատող: Նմանապես, մագնիսների զույգը վանելու համար կարգավորելը (Նկար 3գ) չի հանգեցրել պատկերված տարածքում մասնիկների ավելի շատ նստեցման: Այս երկու արդյունքները ցույց են տալիս, որ կրկնակի մագնիսով կարգավորումը էապես չի բարելավում միկրոֆլորայի թիրախավորման տեղային վերահսկողությունը, և որ արդյունքում առաջացող ուժեղ մագնիսական ուժերը դժվար է կարգավորել, ինչը այս մոտեցումը դարձնում է պակաս գործնական: Նմանապես, մագնիսը շնչափողի վերևում և միջով կողմնորոշելը (Նկար 3դ) նույնպես չի ավելացրել պատկերված տարածքում պահվող մասնիկների քանակը: Այս այլընտրանքային կոնֆիգուրացիաներից մի քանիսը կարող են հաջողակ չլինել, քանի որ դրանք հանգեցնում են մագնիսական դաշտի ավելի ցածր ուժգնության նստեցման տարածքում: Հետևաբար, մեկ 30 աստիճանի անկյան տակ գտնվող մագնիսով կոնֆիգուրացիան (Նկար 3ա) համարվում է in vivo թեստավորման ամենահեշտ և ամենաարդյունավետ մեթոդը:
Ձախ փորոքի վեկտորների (ՁՓ) հետ համատեղման և մագնիսական դաշտի առկայության դեպքում ֆիզիկական խանգարումներից հետո շնչափողում տրանսդուկցիայի մակարդակները զգալիորեն բարձրացել են, համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ։ Սինխրոտրոնային պատկերման հետազոտությունների և LacZ արդյունքների հիման վրա, մագնիսական դաշտը, ըստ երևույթին, կարողացել է պահպանել ՁՓ-ն շնչափողի ներսում և նվազեցնել վեկտորային մասնիկների քանակը, որոնք անմիջապես խորը թափանցում էին թոքերի մեջ։ Նման թիրախավորման բարելավումները կարող են հանգեցնել ավելի բարձր արդյունավետության՝ միաժամանակ նվազեցնելով մատակարարվող տիտրերը, թիրախից դուրս տրանսդուկցիան, բորբոքային և իմունային կողմնակի ազդեցությունները, ինչպես նաև գեների կրիչների ծախսերը։ Կարևոր է նշել, որ արտադրողի խոսքով, CombiMag-ը կարող է օգտագործվել գեների փոխանցման այլ մեթոդների հետ համատեղ, այդ թվում՝ այլ վիրուսային վեկտորների (օրինակ՝ AAV) և նուկլեինաթթուների հետ։