Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо аз браузери навшуда истифода баред (ё режими мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript намоиш медиҳем.
Векторҳои ген барои табобати бемории шуши фибрози кистикӣ бояд роҳҳои нафасии гузаронандаро ҳадаф қарор диҳанд, зеро трансдуксияи периферии шуш фоидаи терапевтӣ намедиҳад. Самаранокии трансдуксияи вирусӣ мустақиман ба вақти будубоши вектор алоқаманд аст. Аммо, моеъҳои интиқолдиҳанда, ба монанди интиқолдиҳандагони ген, ҳангоми нафаскашӣ ба таври табиӣ ба алвеолаҳо паҳн мешаванд ва зарраҳои терапевтии ҳама гуна шакл бо интиқоли мукосилиарӣ зуд тоза карда мешаванд. Дароз кардани вақти будубоши интиқолдиҳандагони ген дар роҳҳои нафас муҳим аст, аммо ба даст овардан душвор аст. Зарраҳои магнитии конъюгатсияшудаи интиқолдиҳандаи ген, ки метавонанд ба сатҳи роҳҳои нафас равона карда шаванд, метавонанд ҳадафгирии минтақавиро беҳтар кунанд. Аз сабаби мушкилоти визуализатсияи in vivo, рафтори чунин зарраҳои хурди магнитӣ дар сатҳи роҳи нафас дар ҳузури майдони магнитии татбиқшуда ба таври кофӣ фаҳмида нашудааст. Ҳадафи ин таҳқиқот истифодаи тасвири синхротронӣ барои визуализатсияи ҳаракати in vivo як қатор зарраҳои магнитӣ дар трахеяи каламушҳои наркозшуда барои омӯхтани динамика ва намунаҳои рафтори зарраҳои инфиродӣ ва ҳаҷмии in vivo буд. Сипас мо инчунин арзёбӣ кардем, ки оё расонидани зарраҳои магнитии лентивирусӣ дар ҳузури майдони магнитӣ самаранокии трансдуксияро дар каламуш афзоиш медиҳад. трахея. Тасвири рентгении синхротронӣ рафтори зарраҳои магнитиро дар майдонҳои магнитии статсионарӣ ва ҳаракаткунанда дар in vitro ва in vivo нишон медиҳад. Зарраҳоро бо магнитҳо ба осонӣ дар сатҳи роҳи нафаси зинда кашола кардан мумкин нест, аммо ҳангоми интиқол, пасмондаҳо дар майдони дид, ки дар он майдони магнитӣ қавитар аст, ҷамъ мешаванд. Самаранокии интиқол инчунин шаш маротиба афзоиш ёфт, вақте ки зарраҳои магнитии лентивирусӣ дар ҳузури майдони магнитӣ интиқол дода шуданд. Ин натиҷаҳо якҷоя нишон медиҳанд, ки зарраҳои магнитии лентивирусӣ ва майдонҳои магнитӣ метавонанд равишҳои арзишманд барои беҳтар кардани ҳадафгирии векторҳои ген ва баланд бардоштани сатҳи интиқол дар роҳҳои нафасии гузаронанда дар in vivo бошанд.
Фибрози кистикӣ (CF) аз сабаби тағирёбии як ген бо номи танзимгари гузаронандагии трансмембрании CF (CFTR) ба вуҷуд меояд. Сафедаи CFTR як канали ион аст, ки дар бисёр ҳуҷайраҳои эпителиалӣ дар тамоми бадан, аз ҷумла роҳҳои нафасии гузаронанда, ки макони асосии патогенези CF мебошад, мавҷуд аст. Нуқсонҳои CFTR боиси интиқоли ғайримуқаррарии об, хушкшавии сатҳи роҳи нафас ва коҳиш додани умқи қабати моеъи сатҳи роҳи нафас (ASL) мегардад. Ин инчунин қобилияти системаи интиқоли луобпарда (MCT)-ро барои тоза кардани зарраҳо ва патогенҳои нафаскашӣ аз роҳҳои нафас коҳиш медиҳад. Ҳадафи мо таҳияи терапияи гении лентивирусӣ (LV) барои расонидани нусхаи дурусти гени CFTR ва беҳтар кардани саломатии ASL, MCT ва шуш ва идома додани таҳияи технологияҳои навест, ки қодиранд ин параметрҳоро дар vivo1 чен кунанд.
Векторҳои LV яке аз номзадҳои пешбари терапияи гении роҳи нафаси CF мебошанд, асосан аз он сабаб, ки онҳо метавонанд гени терапевтиро ба ҳуҷайраҳои базалии роҳи нафас (ҳуҷайраҳои бунёдии роҳи нафас) пайваста ворид кунанд. Ин муҳим аст, зеро онҳо метавонанд намнокии муқаррарӣ ва тозакунии луобро тавассути дифференсиатсия ба ҳуҷайраҳои сатҳи роҳи нафаси функсионалии CF, ки бо генҳои функсионалӣ алоқаманданд, барқарор кунанд, ки дар натиҷа фоидаи якумрӣ ба даст меояд. Векторҳои LV бояд ба муқобили роҳи нафаси гузаронанда равона карда шаванд, зеро дар ин ҷо бемории шуши CF оғоз мешавад. Интиқоли вектор ба шуш амиқтар метавонад боиси трансдуксияи алвеолярӣ гардад, аммо ин дар CF ягон фоидаи терапевтӣ надорад. Бо вуҷуди ин, моеъҳо ба монанди интиқолдиҳандагони ген пас аз нафаскашӣ пас аз таваллуд ба таври табиӣ ба алвеолаҳо муҳоҷират мекунанд3,4 ва зарраҳои терапевтӣ тавассути MCT зуд ба ковокии даҳон тоза карда мешаванд. Самаранокии трансдуксияи LV мустақиман ба дарозии вақте, ки вектор дар паҳлӯи ҳуҷайраҳои мақсаднок мемонад, барои имкон додани ҷабби ҳуҷайраҳо - "вақти истиқомат"5 - алоқаманд аст, ки ба осонӣ бо ҷараёни ҳавои маъмулии минтақавӣ, инчунин забти луобпардаи ҳамоҳангшуда ва MCT кам карда мешавад. Барои CF, қобилияти дароз кардани вақти истиқомати LV дар роҳи нафас барои ноил шудан ба сатҳи баланди трансдуксия дар ин минтақа муҳим аст, аммо чунин дорад. хеле душвор буд.
Барои бартараф кардани ин монеа, мо пешниҳод мекунем, ки зарраҳои магнитии LV (MP) метавонанд бо ду роҳи мукаммал кӯмак расонанд. Аввалан, онҳоро метавон ба таври магнитӣ ба сатҳи роҳи нафас роҳнамоӣ кард, то ҳадафгириро беҳтар кунад ва ба зарраҳои интиқолдиҳандаи ген дар минтақаи дилхоҳи роҳи нафас кӯмак кунад; ва ASL) барои гузаштан ба қабати ҳуҷайра 6. MP-ҳо ба таври васеъ ҳамчун воситаҳои интиқоли доруҳои мақсаднок истифода мешаванд, вақте ки онҳо ба антителоҳо, доруҳои химиотерапевтӣ ё дигар молекулаҳои хурде, ки ба мембранаҳои ҳуҷайра пайваст мешаванд ё ба ретсепторҳои сатҳи ҳуҷайраҳои дахлдор пайваст мешаванд ва дар ҷойҳои варам дар ҳузури барқи статикӣ ҷамъ мешаванд. Майдонҳои магнитӣ барои табобати саратон 7. Усулҳои дигари "гипертермикӣ" барои гарм кардани MP-ҳо ҳангоми дучор шудан ба майдонҳои магнитии ларзишнок ва бо ин васила нобуд кардани ҳуҷайраҳои варам равона шудаанд. Принсипи трансфексияи магнитӣ, ки дар он майдони магнитӣ ҳамчун агенти трансфексия барои беҳтар кардани интиқоли ДНК ба ҳуҷайраҳо истифода мешавад, одатан дар in vitro бо истифода аз як қатор векторҳои генҳои ғайривирусӣ ва вирусӣ барои хатҳои ҳуҷайраҳои душворгузар истифода мешавад. Самаранокии магнитотрансфексияи LV бо интиқоли in vitro-и LV-MP ба хати ҳуҷайраҳои эпителиалии бронхиалии инсон дар ҳузури майдони магнитии статикӣ муқаррар карда шудааст, ки самаранокии трансдуксияро дар муқоиса бо вектори LV танҳо 186 маротиба зиёд мекунад. LV-MP инчунин ба модели CF in vitro татбиқ шудааст, ки дар он трансфексияи магнитӣ трансдуксияи LV-ро дар фарҳангҳои интерфейси ҳаво-моеъ дар ҳузури балғами CF 20 маротиба зиёд кардааст10. Аммо, магнитотрансфексияи in vivo-и узвҳо нисбатан кам таваҷҷӯҳ зоҳир кардааст ва танҳо дар чанд ҳайвон арзёбӣ шудааст. таҳқиқот11,12,13,14,15, махсусан дар шуш16,17. Бо вуҷуди ин, имкониятҳои трансфексияи магнитӣ дар терапияи шуши CF равшананд. Тан ва ҳамкорон (2020) изҳор доштанд, ки "таҳқиқоти исботи консепсияи интиқоли самараноки нанозарраҳои магнитӣ ба шуш роҳро барои стратегияҳои ояндаи нафаскашии CFTR барои беҳтар кардани натиҷаҳои клиникӣ дар беморони CF ҳамвор мекунад"6.
Рафтори зарраҳои хурди магнитӣ дар сатҳҳои роҳи нафас ҳангоми мавҷудияти майдони магнитии татбиқшаванда тасаввур ва омӯхтан душвор аст ва аз ин рӯ, он ба таври кофӣ фаҳмида нашудааст. Дар дигар таҳқиқот, мо усули тасвири рентгении фазавии контрасти синхротронӣ (PB-PCXI)-ро таҳия кардем, ки ба таври ғайриинвазивӣ тағйироти ночизи in vivo дар умқи ASL18 ва рафтори MCT19,20-ро барои чен кардани мустақими гидрататсияи сатҳи канали газ ва ҳамчун нишондиҳандаи аввали самаранокии табобат истифода мебарад. Илова бар ин, усули арзёбии MCT-и мо зарраҳои диаметри 10-35 мкм-ро истифода мебарад, ки аз алюминий ё шишаи индекси баланди шикаст иборатанд, ҳамчун маркерҳои MCT, ки бо истифода аз PB-PCXI21 намоёнанд. Ҳарду усул барои тасаввур кардани як қатор намудҳои зарраҳо, аз ҷумла MP мувофиқанд.
Аз сабаби қарори баланди фазоӣ ва замонӣ, усулҳои таҳлили ASL ва MCT-и мо, ки дар асоси PB-PCXI мавҷуданд, барои омӯзиши динамика ва намунаҳои рафтори зарраҳои якка ва калон дар in vivo хеле мувофиқанд, то ба мо дар фаҳмидан ва беҳтар кардани усулҳои интиқоли гени MP кумак кунанд. Усуле, ки мо дар ин ҷо истифода мебарем, аз таҳқиқоти мо бо истифода аз хатти нури SPring-8 BL20B2 бармеояд, ки дар он мо ҳаракати моеъро пас аз интиқоли вояи вектори қалбакӣ ба роҳҳои нафасии бинӣ ва шуши мушҳо тасаввур кардем, то ба шарҳи намунаҳои ифодаи ғайримуқаррарии ген, ки дар таҳқиқоти ҳайвоноти мо бо вояи интиқоли ген мушоҳида шудаанд, кумак кунем 3,4.
Ҳадафи ин таҳқиқот истифодаи синхротрони PB-PCXI барои тасаввур кардани ҳаракатҳои in vivo-и як қатор MP-ҳо дар трахеяи каламушҳои зинда буд. Ин таҳқиқоти тасвирии PB-PCXI барои санҷидани як қатор MP-ҳо, қувваҳои майдони магнитӣ ва маконҳо барои муайян кардани таъсири онҳо ба ҳаракати MP тарҳрезӣ шуда буданд. Мо фарзия кардем, ки майдони магнитии берунӣ ба MP-и расонидашуда кӯмак мекунад, ки дар минтақаи ҳадаф бимонад ё ҳаракат кунад. Ин таҳқиқот инчунин ба мо имкон доданд, ки конфигуратсияҳои магнитиро муайян кунем, ки шумораи зарраҳои нигоҳдошташударо дар трахея пас аз таҳшиншавӣ ба ҳадди аксар мерасонанд. Дар силсилаи дуюми таҳқиқот, мо кӯшиш кардем, ки ин конфигуратсияи оптималиро барои нишон додани намунаи трансдуксия, ки дар натиҷаи интиқоли in vivo-и LV-MP-ҳо ба роҳи нафаси каламуш ба вуҷуд меояд, истифода барем, бар асоси фарзияе, ки интиқоли LV-MP-ҳо дар заминаи ҳадафгирии роҳи ҳавоӣ боиси беҳтар шудани самаранокии трансдуксияи LV мегардад.
Ҳамаи таҳқиқоти ҳайвонот мувофиқи протоколҳои тасдиқкардаи Донишгоҳи Аделаида (M-2019-060 ва M-2020-022) ва Кумитаи ахлоқи ҳайвоноти синхротрони SPring-8 гузаронида шуданд. Таҷрибаҳо мувофиқи дастурҳои ARRIVE гузаронида шуданд.
Ҳама аксбардории рентгенӣ дар хатти шуои BL20XU дар синхротрони SPring-8 дар Ҷопон бо истифода аз насби монанд ба насби қаблан тавсифшуда анҷом дода шуд21,22. Хулоса, қуттии таҷрибавӣ дар масофаи 245 м аз ҳалқаи нигоҳдории синхротрон ҷойгир буд. Барои таҳқиқоти аксбардории зарраҳо масофаи намуна то детектор 0,6 м ва барои таҳқиқоти аксбардории in vivo 0,3 м истифода мешавад, то эффектҳои контрасти фазаро ба вуҷуд орад. Энергияи шуои монохроматии 25 кэВ истифода шуд. Тасвирҳо бо истифода аз табдилдиҳандаи рентгении баландсифат (SPring-8 BM3), ки ба детектори sCMOS пайваст карда шудааст, гирифта шуданд. Табдилдиҳанда нурҳои рентгениро ба нури намоён бо истифода аз сцинтиллятори ғафсии 10 мкм (Gd3Al2Ga3O12) табдил медиҳад, ки сипас ба сенсори sCMOS бо истифода аз объективи микроскопи × 10 (NA 0.3) равона карда мешавад. Детектори sCMOS Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Ҷопон) бо андозаи массив буд. 2048 × 2048 пиксел ва андозаи пиксели хом 6.5 × 6.5 µm. Ин танзим андозаи муассири пиксели изотропии 0.51 µm ва майдони биниши тақрибан 1.1 мм × 1.1 мм медиҳад. Барои ба ҳадди аксар расонидани таносуби сигнал ба садои зарраҳои магнитӣ дар дохил ва беруни роҳи нафас ва дар айни замон кам кардани артефактҳои ҳаракати нафаскашӣ, дарозии экспозицияи 100 мс интихоб карда шуд. Барои таҳқиқоти in vivo, дар роҳи рентгенӣ пардаи зуди рентгенӣ ҷойгир карда шуд, то миқдори радиатсияро бо роҳи бастани шуои рентгенӣ байни экспозицияҳо маҳдуд кунад.
Интиқолдиҳандаи LV дар ягон таҳқиқоти тасвирии SPring-8 PB-PCXI истифода нашуд, зеро камераи тасвирии BL20XU сертификати Биобехатарии Сатҳи 2 надорад. Ба ҷои ин, мо як қатор MP-ҳои хуб тавсифшударо аз ду таъминкунандаи тиҷоратӣ интихоб кардем, ки доираи васеи андозаҳо, маводҳо, консентратсияи оҳан ва барномаҳоро дар бар мегиранд - аввал барои фаҳмидани он ки чӣ гуна майдонҳои магнитӣ ба ҳаракати MP дар дохили капиллярҳои шишагӣ ва сипас дар роҳҳои нафасии зинда таъсир мерасонанд. дар сатҳ. MP-ҳо андозаи аз 0,25 то 18 мкм доранд ва аз маводҳои гуногун сохта шудаанд (нигаред ба Ҷадвали 1), аммо таркиби ҳар як намуна, аз ҷумла андозаи зарраҳои магнитӣ дар дохили MP, номаълум аст. Бар асоси таҳқиқоти васеи MCT-и мо 19, 20, 21, 23, 24, мо интизорем, ки MP-ҳои то 5 мкм-ро дар сатҳи роҳи нафаси трахея дидан мумкин аст, масалан, бо роҳи кам кардани чаҳорчӯбаҳои пайдарпай барои дидани намоёнии беҳтари ҳаракати MP. Як MP-и андозаи 0,25 мкм аз қарори дастгоҳи тасвирӣ хурдтар аст, аммо интизор меравад, ки PB-PCXI контрасти ҳаҷмии онҳоро ва ҳаракати моеъи сатҳӣ, ки онҳо пас аз таҳшиншавӣ дар он ҷойгир шудаанд, муайян кунад.
Намунаҳо барои ҳар як MP дар Ҷадвали 1 дар капиллярҳои шишагии 20 мкл (Drummond Microcaps, PA, ИМА) бо диаметри дарунии 0,63 мм омода карда шуданд. Зарраҳои корпускулярӣ дар об мавҷуданд, дар ҳоле ки зарраҳои CombiMag дар моеъи хусусии истеҳсолкунанда дастрасанд. Ҳар як найча нисфаш бо моеъ пур карда шудааст (тақрибан 11 мкл) ва дар нигоҳдорандаи намуна ҷойгир карда шудааст (нигаред ба расми 1). Капиллярҳои шишагӣ мутаносибан дар марҳилаи намуна дар қуттии тасвир ба таври уфуқӣ ҷойгир карда шуданд ва канорҳои моеъро ҷойгир карданд. Магнити неодимии оҳани бор (NdFeB) бо диаметри 19 мм (дарозӣ 28 мм) аз қабати никелӣ (N35, рақами кат. LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) бо магнитизатсияи боқимондаи 1,17 Тесла ба марҳилаи тарҷумаи алоҳида пайваст карда шуд, то мавқеи онро аз фосилаи дур ҳангоми тасвир тағйир диҳад. Гирифтани тасвири рентгенӣ вақте оғоз мешавад, ки магнит тақрибан 30 мм болотар аз намуна ҷойгир карда шудааст ва тасвирҳо бо суръати 4 кадр дар як сония ба даст оварда мешаванд. Ҳангоми тасвир, магнит ба ... наздик карда шуд. найчаи капиллярии шишагин (тақрибан 1 мм дуртар) ва сипас дар баробари найча барои арзёбии таъсири шиддати майдон ва мавқеъ интиқол дода мешавад.
Таҷҳизоти аксбардории in vitro, ки намунаҳои MP-ро дар капиллярҳои шишагӣ дар марҳилаи тарҷумаи намунаи xy дар бар мегирад. Масири шуои рентгенӣ бо хати сурхи пунктир қайд карда шудааст.
Пас аз муқаррар шудани намоёнии MP-ҳо дар in vitro, як қисми онҳо дар каламушҳои модаи албинои Вистар (~12 ҳафтаина, ~200 г) in vivo санҷида шуданд. 0.24 мг/кг медетомидин (Domitor®, Zenoaq, Ҷопон), 3.2 мг/кг мидазолам (Dormicum®, Astellas Pharma, Ҷопон) ва 4 мг/кг буторфанол (Vetorphale®, Meiji Seika) бо омехтаи Pharma (Japan) тавассути тазриқи дохили шикам наркоз карда шуданд. Пас аз наркоз, онҳо барои тасвирбардорӣ бо тоза кардани пашми атрофи трахея, ворид кардани найчаи эндотрахея (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) ва имҳаракат кардани онҳо ба паҳлӯ дар лавҳаи тасвирии фармоишӣ, ки дорои халтаи гармӣ барои нигоҳ доштани ҳарорати бадан буд, омода карда шуданд. Сипас лавҳаи тасвирӣ ба марҳилаи тарҷумаи намуна дар қуттии тасвирӣ бо кунҷи ночиз пайваст карда шуд, то трахеяро ​​ба таври уфуқӣ дар тасвири рентгенӣ ҳамоҳанг созад. чунон ки дар расми 2a нишон дода шудааст.
(а) Танзимоти аксбардории in vivo дар қуттии аксбардории SPring-8, роҳи нури рентгенӣ бо хати сурхи нуқтадор нишон дода шудааст.(б,в) Ҷойгиркунии магнит дар трахея аз фосилаи дур бо истифода аз ду камераи IP, ки ба таври ортогоналӣ насб карда шудаанд, анҷом дода шуд. Дар тарафи чапи тасвири экран, ҳалқаи симӣ, ки сарро нигоҳ медорад ва канюлаи интиқол дар дохили найчаи ET дида мешавад.
Системаи насоси сӯзандоруи дурдаст (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) бо истифода аз сӯзандоруи шишагии 100 мкл ба найчаи PE10 (OD 0.61 мм, ID 0.28 мм) тавассути сӯзани 30 Ga пайваст карда шуд. Ҳангоми ворид кардани найчаи ET, найчаро қайд кунед, то боварӣ ҳосил кунед, ки нӯги он дар мавқеи дуруст дар трахея қарор дорад. Бо истифода аз микронасос, поршени сӯзандору берун карда шуд, дар ҳоле ки нӯги найча дар намунаи MP барои интиқол ғӯтонида шуд. Сипас найчаи интиқоли пурбор ба найчаи эндотрахеалӣ ворид карда шуд ва нӯги он дар қисми қавитарини майдони магнитии татбиқшудаи пешбинишудаи мо ҷойгир карда шуд. Гирифтани тасвир бо истифода аз детектори нафаскашӣ, ки ба қуттии вақтсанҷии мо дар асоси Arduino пайваст карда шудааст, назорат карда шуд ва ҳама сигналҳо (масалан, ҳарорат, нафаскашӣ, кушодан/пӯшидани парда ва гирифтани тасвир) бо истифода аз Powerlab ва LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) сабт карда шуданд 22. Ҳангоми тасвиргирӣ Вақте ки қуттӣ дастнорас буд, ду камераи IP (Panasonic BB-SC382) тақрибан 90° нисбат ба якдигар ҷойгир карда шуданд ва истифода шуданд. барои назорат кардани мавқеи магнит нисбат ба трахея ҳангоми аксбардорӣ (Расми 2b,c). Барои кам кардани артефактҳои ҳаракат, як тасвир барои ҳар нафас ҳангоми платои ҷараёни мадди охир гирифта шуд.
Ба марҳилаи дуюм магнит пайваст карда шудааст, ки онро аз беруни корпуси аксбардорӣ дур ҷойгир кардан мумкин аст. Мавқеъҳо ва конфигуратсияҳои гуногуни магнит санҷида шуданд, аз ҷумла: Дар кунҷи тақрибан 30° аз болои трахея насб карда шудааст (конфигуратсияҳо дар расмҳои 2a ва 3a нишон дода шудаанд); як магнит дар болои ҳайвон ва дигаре дар поён, бо қутбҳо барои ҷалб кардан муқаррар карда шудааст (Расми 3b); як магнит дар болои ҳайвон ва дигаре дар поён, бо қутбҳо барои тела додан муқаррар карда шудааст (Расми 3c); ва як магнит дар боло ва ба трахея амудӣ (Расми 3d). Пас аз он ки ҳайвон ва магнит танзим карда шуданд ва MP-и санҷидашаванда ба насоси сӯзандору бор карда шуд, ҳангоми гирифтани тасвирҳо 50 мкл вояро бо суръати 4 мкл/сония ворид кунед. Сипас магнит дар баробари гирифтани тасвирҳо дар трахея ба пеш ва пас ҳаракат мекунад.
Конфигуратсияи магнит барои аксбардории in vivo (а) як магнит дар болои трахея бо кунҷи тақрибан 30°, (б) ду магнит барои ҷалб кардан, (в) ду магнит барои тела додан, (г) як магнит дар боло ва амудӣ дар трахея. Нозир аз даҳон ба шуш тавассути трахея нигоҳ кард ва нури рентгенӣ аз тарафи чапи каламуш гузашта, аз тарафи рост берун омад. Магнит ё дар тӯли роҳи нафас ё ба чап ва рост аз болои трахея дар самти нури рентгенӣ ҳаракат мекунад.
Мо инчунин кӯшиш кардем, ки намоёнӣ ва рафтори зарраҳоро дар роҳҳои нафас ҳангоми набудани нафаскашӣ ва ҳаракати дил муайян кунем. Аз ин рӯ, дар охири давраи аксбардорӣ, ҳайвонот барои аз меъёр зиёд истеъмол кардани пентобарбитал (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ИМА; ~65 мг/кг ip) ба таври инсонӣ кушта шуданд. Баъзе ҳайвонҳо дар платформаи аксбардорӣ гузошта шуданд ва пас аз қатъ шудани нафаскашӣ ва тапиши дил, раванди аксбардорӣ такрор карда шуд ва агар дар сатҳи роҳи нафас ягон MP намоён набошад, миқдори иловагии MP илова карда шуд.
Тасвирҳои бадастомада бо майдони ҳамвор ва майдони торик ислоҳ карда шуданд ва сипас бо истифода аз скрипти фармоишӣ, ки бо забони MATLAB (R2020a, The Mathworks) навишта шудааст, ба филм (20 кадр дар як сония; 15-25 × суръати муқаррарӣ вобаста ба суръати нафаскашӣ) ҷамъ карда шуданд.
Ҳама таҳқиқоти интиқоли генҳои вектори LV дар Муассисаи тадқиқоти ҳайвоноти лабораторӣ дар Донишгоҳи Аделаида гузаронида шуданд ва ҳадафи онҳо истифодаи натиҷаҳои таҷрибаи SPring-8 барои арзёбии он буд, ки оё интиқоли LV-MP дар ҳузури майдони магнитӣ метавонад интиқоли генро дар in vivo беҳтар кунад. Барои арзёбии таъсири MP ва майдони магнитӣ, ду гурӯҳи ҳайвонот табобат карда шуданд: ба як гурӯҳ LV-MP бо магнит дода шуд ва ба гурӯҳи дигар гурӯҳи назоратӣ бо LV-MP бе магнит дода шуд.
Векторҳои гени LV бо истифода аз усулҳои қаблан тавсифшуда 25, 26 тавлид карда шуданд. Вектори LacZ гени бета-галактозидазаи дар ядро ​​ҷойгиршударо ифода мекунад, ки аз ҷониби промоутери конститутсионии MPSV (LV-LacZ) идора мешавад, ки дар ҳуҷайраҳои трансдуксияшуда маҳсулоти реаксияи кабудро ба вуҷуд меорад, ки дар фронтҳои бофтаи шуш ва қисмҳои бофта намоён аст. Титркунӣ дар фарҳангҳои ҳуҷайра бо роҳи ҳисоб кардани дастии шумораи ҳуҷайраҳои мусбати LacZ бо гемоцитометр барои ҳисоб кардани титр дар TU/мл анҷом дода шуд. Интиқолдиҳандагон дар -80 °C криоконсерв карда мешаванд, пеш аз истифода об карда мешаванд ва бо омехта кардан бо таносуби 1:1 ва инкубатсия дар ях ҳадди аққал 30 дақиқа пеш аз интиқол ба CombiMag пайваст карда мешаванд.
Каламушҳои муқаррарии Спрэг Доули (n = 3/гурӯҳ, ~2-3) бо омехтаи 0,4 мг/кг медетомидин (Domitor, Ilium, Австралия) ва 60 мг/кг кетамин (Ilium, Австралия) якмоҳа) ба таври дохили шикамӣ наркоз карда шуданд ва каннулясияи даҳонии ғайриҷарроҳӣ бо каннуляи 16 Ga iv гузаронида шуд. Барои он ки бофтаи роҳи нафаси трахея трансдуксияи LV-ро қабул кунад, он бо истифода аз протоколи илтиҳоби механикии қаблан тавсифшудаи мо кондитсия карда шуд, ки дар он сатҳи роҳи нафаси трахея бо сабади симӣ (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ИМА) ба таври меҳварӣ молида шуд. Сипас, ворид намудани LV-MP ба трахея тақрибан 10 дақиқа пас аз илтиҳоб дар як кабинети бехатарии биологӣ анҷом дода шуд.
Майдони магнитии истифодашуда дар ин таҷриба ба тарзи монанд ба таҳқиқоти аксбардории рентгении in vivo танзим карда шуд, ки дар он ҳамон магнитҳо дар болои трахея бо истифода аз клипҳои стенти дистилятсия нигоҳ дошта мешуданд (Расми 4). Ҳаҷми 50 мкл (2 × 25 мкл аликвот)-и LV-MP ба трахея (n = 3 ҳайвон) бо истифода аз пипеткае, ки нӯги гел дошт, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, ворид карда шуд. Гурӯҳи назоратӣ (n = 3 ҳайвон) ҳамон LV-MP-ҳоро бе истифодаи магнит гирифтанд. Пас аз анҷоми инфузия, канюля аз найчаи ET хориҷ карда мешавад ва ҳайвон экстубатсия карда мешавад. Магнит 10 дақиқа дар ҷои худ мемонад, сипас он хориҷ карда мешавад. Каламушҳо вояи зеризаминии мелоксикам (1 мл/кг) (Илиум, Австралия) гирифтанд ва пас аз он анестезия бо тазриқи 1 мг/кг гидрохлориди атипамазол (Antisedan, Zoetis, Австралия) баръакс карда шуд. Каламушҳо то пурра шифо ёфтан аз анестезия гарм нигоҳ дошта ва назорат карда шуданд.
Дастгоҳи интиқоли LV-MP дар қуттии бехатарии биологӣ. Маркази Luer хокистарранги равшани найчаи ET аз даҳон берун мебарояд ва нӯги гелии пипеткаи дар расм нишондодашуда тавассути найчаи ET то чуқурии дилхоҳ ба трахея ворид карда мешавад.
Як ҳафта пас аз тартиби миқдори LV-MP, ҳайвонҳо бо роҳи нафаскашии 100% CO2 ба таври инсонӣ кушта шуданд ва ифодаи LacZ бо истифода аз табобати стандартии X-gal-и мо арзёбӣ карда шуд. Се ҳалқаи каудӣ аз ҳама пайвандҳои устухонӣ хориҷ карда шуданд, то боварӣ ҳосил шавад, ки ҳама гуна осеби механикӣ ё нигоҳдории моеъ аз ҷойгиркунии найчаи эндотрахеалӣ ба таҳлил дохил карда нашудааст. Ҳар як трахея ба таври тӯлонӣ бурида шуд, то ду ним барои таҳлил эҷод карда шавад ва онҳо дар зарфе, ки дорои резинаи силикон (Sylgard, Dow Inc) бо истифода аз сӯзани Minutien (Fine Science Tools) барои дидани сатҳи люминалӣ насб карда шуданд. Тақсимот ва намунаи ҳуҷайраҳои трансдуксияшуда бо истифода аз микроскопи Nikon (SMZ1500) бо камераи DigiLite ва нармафзори TCapture (Tucsen Photonics, Чин) тасдиқ карда шуданд. Тасвирҳо бо бузургкунии 20x (аз ҷумла баландтарин танзимот барои паҳнои пурраи трахея) ба даст оварда шуданд, ки тамоми дарозии трахея қадам ба қадам тасвир карда шуд ва ҳампӯшии кофӣ байни ҳар як тасвир барои "дӯхтани" тасвир таъмин карда шуд. Тасвирҳо аз Сипас ҳар як трахея бо истифода аз Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) бо истифода аз алгоритми ҳаракати ҳамвор ба як тасвири ягонаи таркибӣ ҷамъ карда шуд. Минтақаҳои ифодаи LacZ дар тасвирҳои таркибии трахея аз ҳар як ҳайвон бо истифода аз скрипти автоматии MATLAB (R2020a, MathWorks), тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, бо истифода аз танзимоти 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 ва Value < 0.7, миқдорӣ муайян карда шуданд. Бо пайгирии контурҳои бофта, дар GIMP v2.10.24 барои ҳар як тасвири таркибӣ ниқоб ба таври дастӣ тавлид карда шуд, то минтақаи бофтаро муайян кунад ва аз ҳама гуна ошкоркуниҳои бардурӯғ аз берун аз бофтаи трахея пешгирӣ кунад. Минтақаҳои рангкардашуда аз ҳама тасвирҳои таркибӣ аз ҳар як ҳайвон ҷамъ карда шуданд, то майдони умумии рангкардашударо барои он ҳайвон тавлид кунанд. Сипас майдони рангкардашуда ба майдони умумии ниқоб тақсим карда шуд, то майдони муқарраршуда тавлид шавад.
Ҳар як трахея дар парафин ҷойгир карда шуда, қисматҳои 5 мкм бурида шуданд. Қисмҳо бо ранги сурхи нейтралӣ барои 5 дақиқа ранг карда шуданд ва тасвирҳо бо истифода аз микроскопи Nikon Eclipse E400, камераи DS-Fi3 ва нармафзори сабти унсурҳои NIS (версияи 5.20.00) гирифта шуданд.
Ҳамаи таҳлилҳои оморӣ дар GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) гузаронида шуданд. Аҳамияти оморӣ дар p ≤ 0.05 муқаррар карда шуд. Муқаррарӣ бо истифода аз санҷиши Шапиро-Вилк тасдиқ карда шуд ва фарқиятҳо дар рангкунии LacZ бо истифода аз санҷиши t-ҷуфтнашуда арзёбӣ карда шуданд.
Шаш MP, ки дар Ҷадвали 1 тавсиф шудаанд, бо истифода аз PCXI тафтиш карда шуданд ва намоёнӣ дар Ҷадвали 2 тавсиф шудааст. Ду MP-и полистиролӣ (MP1 ва MP2; мутаносибан 18 мкм ва 0.25 мкм) дар зери PCXI намоён набуданд, аммо боқимондаи намунаҳо муайян карда мешуданд (мисолҳо дар Расми 5 нишон дода шудаанд). MP3 ва MP4 (мутаносибан 10-15% Fe3O4; 0.25 мкм ва 0.9 мкм) нозук намоёнанд. Гарчанде ки баъзе аз хурдтарин зарраҳои санҷидашударо дар бар мегирифтанд, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 мкм) бештар намоён буд. Маҳсулоти CombiMag MP6-ро пайгирӣ кардан душвор аст. Дар ҳама ҳолатҳо, қобилияти мо барои муайян кардани MP бо роҳи ба пеш ва ба пеш интиқол додани магнит ба таври мувозӣ ба капилляр ба таври назаррас беҳтар шуд. Вақте ки магнитҳо аз капилляр дур шуданд, зарраҳо дар риштаҳои дароз дароз шуданд, аммо бо наздик шудани магнитҳо ва афзоиши қувваи майдони магнитӣ, риштаҳои зарраҳо ҳангоми ҳаракати зарраҳо ба сӯи сатҳи болоии капилляр кӯтоҳ шуданд (нигаред ба Видеои иловагии S1: MP4), зичии зарраҳои сатҳро зиёд мекунад. Баръакс, вақте ки магнит аз капилляр хориҷ карда мешавад, қувваи майдон кам мешавад ва MP-ҳо ба риштаҳои дароз табдил меёбанд, ки аз сатҳи болоии капилляр тӯл мекашанд (нигаред ба Видеои иловагӣ S2:MP4). Пас аз он ки магнит ҳаракатро қатъ мекунад, зарраҳо пас аз расидан ба мавқеи мувозинат барои муддати кӯтоҳ ҳаракатро идома медиҳанд. Ҳангоме ки MP ба сӯи сатҳи болоии капилляр ва аз он дур мешавад, зарраҳои магнитӣ одатан партовҳоро тавассути моеъ кашола мекунанд.
Намоёнии MP дар зери PCXI байни намунаҳо ба таври назаррас фарқ мекунад.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ва (d) MP6. Ҳамаи тасвирҳои дар ин ҷо нишондодашуда бо магните гирифта шудаанд, ки тақрибан 10 мм мустақиман аз болои капилляр ҷойгир аст. Доираҳои калони намоён ҳубобчаҳои ҳавоӣ мебошанд, ки дар капиллярҳо ҷамъ шудаанд ва хусусиятҳои канори сиёҳ ва сафеди тасвири контрасти фазаро ба таври возеҳ нишон медиҳанд. Қуттии сурх дорои бузургкунии контраст мебошад. Дар хотир доред, ки диаметри схемаҳои магнитӣ дар ҳама расмҳо барои миқёс пешбинӣ нашудаанд ва тақрибан 100 маротиба аз он чизе ки нишон дода шудааст, калонтаранд.
Вақте ки магнит дар болои капилляр ба чап ва рост ҳаракат мекунад, кунҷи ресмони MP барои мувофиқат бо магнит тағйир меёбад (нигаред ба расми 6), ки бо ин васила хатҳои майдони магнитиро муайян мекунад. Барои MP3-5, пас аз он ки хорда ба кунҷи остона мерасад, зарраҳо дар сатҳи болоии капилляр кашола карда мешаванд. Ин аксар вақт боиси ҷамъшавии MP-ҳо ба гурӯҳҳои калонтар дар наздикии ҷое, ки майдони магнитӣ қавитар аст, мегардад (нигаред ба видеои иловагӣ S3:MP5). Ин инчунин ҳангоми тасвир дар наздикии нӯги капиллярӣ ба таври хос намоён аст, ки боиси ҷамъшавии MP-ҳо дар интерфейси моеъ-ҳаво мегардад. Зарраҳо дар MP6, ки нисбат ба MP3-5 фарқ карданашон душвортар буд, ҳангоми ҳаракати магнит дар капилляр кашола карда нашуданд, аммо ресмонҳои MP пароканда шуданд ва зарраҳоро дар майдони дид гузоштанд (нигаред ба видеои иловагӣ S4:MP6). Дар баъзе ҳолатҳо, вақте ки майдони магнитии татбиқшуда бо ҳаракат додани магнит ба масофаи дур аз макони тасвир кам карда шуд, ҳама гуна MP-ҳои боқимонда бо қувваи ҷозиба оҳиста ба сатҳи поёнии найча фуруд омаданд ва дар ресмон боқӣ монданд (нигаред ба видеои иловагӣ S5: MP3).
Кунҷи ресмони MP ҳангоми ҳаракат додани магнит ба тарафи рост аз болои капилляр тағйир меёбад.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ва (d) MP6. Қуттии сурх дорои калонкунии контраст мебошад. Дар хотир доред, ки видеоҳои иловагӣ иттилоотӣ мебошанд, зеро онҳо сохтори муҳими зарраҳо ва маълумоти динамикиро, ки дар ин тасвирҳои статикӣ тасаввур кардан мумкин нест, ошкор мекунанд.
Санҷишҳои мо нишон доданд, ки ҳаракат додани магнит оҳиста-оҳиста дар трахея ба пешу пас визуализатсияи MP-ро дар заминаи ҳаракати мураккаб дар in vivo осон мекунад. Санҷиши in vivo гузаронида нашуд, зеро донаҳои полистирол (MP1 ва MP2) дар капилляр намоён набуданд. Ҳар яке аз чор MP-и боқимонда in vivo бо меҳвари дарози магнит дар болои трахея дар кунҷи тақрибан 30° нисбат ба амудӣ санҷида шуданд (нигаред ба расмҳои 2b ва 3a), зеро ин боиси занҷирҳои дарозтари MP гардид ва нисбат ба қатъ шудани конфигуратсияи магнит самараноктар буд. MP3, MP4 ва MP6 дар трахеяи ягон ҳайвони зинда муайян карда нашуданд. Вақте ки роҳҳои нафасии каламуш пас аз куштани ҳайвонот ба таври инсонӣ тасвир карда шуданд, зарраҳо ҳатто ҳангоми илова кардани ҳаҷми иловагӣ бо истифода аз насоси сӯзандору ноаён монданд. MP5 дорои баландтарин миқдори оксиди оҳан буд ва ягона зарраи намоён буд ва аз ин рӯ, барои арзёбӣ ва тавсифи рафтори in vivo MP истифода мешуд.
Ҷойгир кардани магнит ҳангоми интиқоли MP боиси он гардид, ки бисёре аз MP-ҳо, вале на ҳама, дар майдони биниш ҷамъ шаванд. Зарраҳое, ки ба трахея ворид мешаванд, беҳтар аст дар ҳайвоноти қурбонии инсонӣ мушоҳида карда шаванд. Расми 7 ва видеои иловагӣ S6: MP5 сабти босуръати магнитӣ ва ҳамоҳангсозии зарраҳоро дар сатҳи трахеяи вентралӣ нишон медиҳад, ки нишон медиҳад, ки MP-ҳо метавонанд ба минтақаҳои дилхоҳи трахея равона карда шаванд. Ҳангоми ҷустуҷӯи дуртар дар тӯли трахея пас аз интиқоли MP, баъзе MP-ҳо ба карина наздиктар ёфт шуданд, ки ин нишон медиҳад, ки қувваи майдони магнитӣ барои ҷамъоварӣ ва нигоҳ доштани ҳамаи MP-ҳо нокифоя буд, зеро онҳо тавассути минтақаи қувваи максималии майдони магнитӣ ҳангоми раванди моеъ интиқол дода мешуданд. Бо вуҷуди ин, консентратсияи MP пас аз таваллуд дар атрофи минтақаи тасвиршуда баландтар буд, ки нишон медиҳад, ки бисёре аз MP-ҳо дар минтақаҳои роҳи нафас боқӣ монданд, ки қувваи майдони магнитии истифодашуда баландтарин буд.
Тасвирҳо аз (а) пеш ва (б) пас аз интиқоли MP5 ба трахеяи каламуши нав эвтаназияшуда бо магнити мустақиман дар болои минтақаи тасвиргирӣ ҷойгиршуда. Минтақаи тасвиршуда байни ду ҳалқаи пайвандак ҷойгир аст. Пеш аз интиқоли MP, дар роҳи нафас каме моеъ мавҷуд аст. Қуттии сурх дорои бузургкунии контраст мебошад. Ин тасвирҳо аз видеое гирифта шудаанд, ки дар Видеои иловагӣ S6:MP5 нишон дода шудаанд.
Интиқоли магнит дар баробари трахея дар шароити in vivo боис шуд, ки занҷири MP кунҷи сатҳи роҳи нафасро ба тарзе, ки дар капиллярҳо дида мешавад, тағйир диҳад (нигаред ба расми 8 ва видеои иловагӣ S7:MP5). Аммо, дар таҳқиқоти мо, MP-ҳоро мисли капиллярҳо дар сатҳи роҳи нафаси зинда кашола кардан мумкин набуд. Дар баъзе ҳолатҳо, занҷири MP бо ҳаракати магнит ба чап ва рост дарозтар мешавад. Ҷолиб он аст, ки мо инчунин муайян кардем, ки ҳангоми ҳаракат додани магнит ба таври тӯлонӣ дар баробари трахея, занҷири зарраҳо умқи қабати моеъи рӯизаминиро тағйир медиҳад ва ҳангоми ҳаракат додани магнит мустақиман аз боло ва гардиши занҷири зарраҳо ба мавқеи амудӣ васеъ мешавад (нигаред ба видеои иловагӣ S7). : MP5 дар 0:09, рости поён). Тарзи хоси ҳаракат ҳангоми интиқоли магнит дар болои трахея ба паҳлӯ (яъне ба тарафи чап ё рости ҳайвон, на дар тӯли трахея) тағйир ёфт. Зарраҳо ҳангоми ҳаракат кардан ҳанӯз ҳам ба таври возеҳ намоён буданд, аммо вақте ки магнит аз трахея хориҷ карда шуд, нӯги риштаҳои зарраҳо намоён шуданд (нигаред ба Видеои иловагии S8:MP5, аз 0:08 сар мешавад). Ин бо рафтори MP, ки мо дар зери майдони магнитии татбиқшуда дар капилляри шишагӣ мушоҳида кардем, мувофиқ аст.
Намунаҳои тасвирҳое, ки MP5-ро дар трахеяи каламуши зиндаи наркозшуда нишон медиҳанд.(а) Магнит барои гирифтани тасвирҳо дар боло ва чапи трахея, сипас (б) пас аз ҳаракат додани магнит ба тарафи рост, истифода мешавад. Қуттии сурх дорои бузургкунии контраст мебошад. Ин тасвирҳо аз видеое гирифта шудаанд, ки дар Видеои иловагӣ S7:MP5 нишон дода шудаанд.
Вақте ки ду қутб дар самти шимол-ҷануб дар боло ва поёни трахея (яъне ҷалб; Расми 3b) танзим карда шуданд, хордаҳои MP дарозтар ба назар мерасиданд ва дар девори паҳлӯии трахея ҷойгир буданд, на дар сатҳи дорсалии трахея (нигаред ба Видеои иловагӣ S9:MP5). Аммо, консентратсияи баланди зарраҳо дар як макон (яъне сатҳи дорсалии трахея) пас аз интиқоли моеъ ҳангоми истифодаи дастгоҳи думагнитӣ, ки одатан ҳангоми истифодаи дастгоҳи якмагнитӣ рух медиҳад, муайян карда нашуд. Сипас, вақте ки як магнит барои дафъ кардани қутбҳои баръакс танзим карда шуд (Расми 3c), шумораи зарраҳои намоён дар майдони дид пас аз интиқол зиёд нашуданд. Танзими ҳарду конфигуратсияи думагнитӣ аз сабаби қувваи баланди майдони магнитӣ, ки мутаносибан магнитҳоро мекашанд ё тела медиҳанд, душвор аст. Сипас танзим ба як магнити мувозӣ ба роҳи ҳавоӣ иваз карда шуд, аммо аз роҳи ҳавоӣ дар кунҷи 90 дараҷа мегузашт, то хатҳои майдон девори трахеяро ​​ортогоналӣ убур кунанд (Расми 3d), самте, ки барои муайян кардани он тарҳрезӣ шудааст, ки оё ҷамъшавии зарраҳо дар девори паҳлӯ мушоҳида карда мешавад. Аммо, дар ин конфигуратсия ҳаракати муайяншавандаи ҷамъшавии MP ё ҳаракати магнит вуҷуд надошт. Бар асоси ҳамаи ин натиҷаҳо, барои таҳқиқоти интиқолдиҳандаи генҳои in vivo конфигуратсияи самти якмагнитӣ бо кунҷи 30 дараҷа (Расми 3a) интихоб карда шуд.
Вақте ки ҳайвон фавран пас аз куштори инсонӣ борҳо аксбардорӣ карда шуд, набудани ҳаракати бофтаҳои омехта маънои онро дошт, ки дар майдони равшани байнихондрӣ хатҳои зарраҳои хурдтар ва кӯтоҳтарро дидан мумкин буд, ки бо ҳаракати тарҷумавии магнит "ларзиш" мекарданд. Бо вуҷуди ин, онҳо то ҳол мавҷудият ва ҳаракати зарраҳои MP6-ро ба таври возеҳ дида наметавонанд.
Титри LV-LacZ 1.8 × 108 TU/мл буд ва пас аз омехтаи 1:1 бо CombiMag MP (MP6), ҳайвонҳо вояи 50 мкл трахеяи 9 × 107 TU/мл воситаи LV (яъне 4.5 × 106 TU/калам) гирифтанд. ). Дар ин таҳқиқот, ба ҷои интиқоли магнит ҳангоми таваллуд, мо магнитро дар як мавқеъ мустаҳкам кардем, то муайян кунем, ки оё трансдуксияи LV (а) метавонад дар муқоиса бо интиқоли вектор дар сурати набудани майдони магнитӣ беҳтар карда шавад ва (б) метавонад фокус карда шавад. Ҳуҷайраҳои роҳи нафас ба минтақаҳои ҳадафи магнитии роҳи болоии нафас трансдуксия карда мешаванд.
Мавҷудияти магнитҳо ва истифодаи CombiMag дар якҷоягӣ бо векторҳои LV ба саломатии ҳайвонот таъсири манфӣ нарасонид, мисли протоколи стандартии интиқоли вектори LV. Тасвирҳои фронталии минтақаи трахея, ки ба осеби механикӣ дучор шудаанд (Расми иловагии 1) нишон доданд, ки дар гурӯҳи ҳайвоноте, ки бо LV-MP табобат карда шудаанд, вақте ки магнит мавҷуд буд, сатҳи хеле баланди трансдуксия мавҷуд буд (Расми 9a). Дар гурӯҳи назоратӣ танҳо миқдори ками ранги кабуди LacZ мавҷуд буд (Расми 9b). Миқдори минтақаҳои рангкардашудаи X-Gal-и муқарраршуда нишон дод, ки ворид кардани LV-MP дар ҳузури майдони магнитӣ тақрибан 6 маротиба беҳбудӣ ба бор овард (Расми 9c).
Намунаҳои тасвирҳои мураккаб, ки трансдуксияи трахеяро ​​тавассути LV-MP (а) дар ҳузури майдони магнитӣ ва (б) дар набудани магнит нишон медиҳанд.(в) Беҳбудии аз ҷиҳати оморӣ назаррас дар минтақаи трансдуксияи LacZ-и муқарраршуда дар дохили трахея ҳангоми истифодаи магнит (*p = 0.029, озмоиши t, n = 3 дар як гурӯҳ, миёна ± SEM).
Қисмҳои сурхи зудранги нейтралӣ (мисол дар расми 2-и иловагӣ нишон дода шудааст) ҳуҷайраҳои бо LacZ рангшуда дар намуна ва макони монанд, ки қаблан гузориш шуда буд, мавҷуданд.
Мушкилоти калидӣ барои терапияи генҳои роҳҳои нафасӣ ҷойгиркунии дақиқи зарраҳои интиқолдиҳанда ба минтақаҳои мавриди таваҷҷӯҳ ва ба даст овардани сатҳи баланди самаранокии трансдуксия дар шуши ҳаракаткунанда дар ҳузури ҷараёни ҳаво ва тозакунии фаъоли луоб боқӣ мемонад. Барои интиқолдиҳандагони LV, ки барои табобати бемории роҳҳои нафасии CF тарҳрезӣ шудаанд, зиёд кардани вақти будубоши зарраҳои интиқолдиҳанда дар роҳҳои нафасии гузаронанда то ҳол ҳадафи норавшан буд. Тавре ки Кастеллани ва дигарон қайд карданд, истифодаи майдонҳои магнитӣ барои беҳтар кардани трансдуксия нисбат ба дигар усулҳои интиқоли генҳо, ба монанди электропоратсия, бартариҳо дорад, зеро он метавонад соддагӣ, самаранокии хароҷот, маҳаллисозии интиқол, баланд бардоштани самаранокӣ ва вақти кӯтоҳтари инкубатсия ва эҳтимолан вояи камтари интиқолдиҳандаро муттаҳид кунад10. Бо вуҷуди ин, ҷойгиршавӣ ва рафтори зарраҳои магнитӣ дар роҳҳои нафасии in vivo таҳти таъсири қувваҳои магнитии беруна ҳеҷ гоҳ тавсиф нашудааст ва инчунин имконияти ин усул дар vivo барои баланд бардоштани сатҳи ифодаи генҳо дар роҳҳои нафасии зиндаи солим нишон дода нашудааст.
Таҷрибаҳои мо дар синхротрони PCXI дар in vitro нишон доданд, ки ҳамаи зарраҳое, ки мо санҷидаем, ба истиснои полистирол MP, дар танзимоти тасвирии истифодашуда намоён буданд. Дар ҳузури майдони магнитӣ, MP-ҳо сатрҳоеро ташкил медиҳанд, ки дарозии онҳо ба намуди зарраҳо ва қувваи майдони магнитӣ (яъне наздикӣ ва ҳаракати магнит) алоқаманд аст. Тавре ки дар расми 10 нишон дода шудааст, сатрҳое, ки мо мушоҳида мекунем, аз сабаби магнитизатсияи ҳар як зарраи алоҳида ва ба вуҷуд овардани майдони магнитии маҳаллии худ ташаккул меёбанд. Ин майдонҳои алоҳида боиси муттаҳидшавӣ ва пайвастшавии дигар зарраҳои монанд мешаванд, ки ҳаракатҳои сатри гурӯҳӣ аз сабаби қувваҳои маҳаллӣ аз қувваҳои ҷозиба ва теладиҳандаи маҳаллии дигар зарраҳо ба вуҷуд меоянд.
Нақша нишон медиҳад, ки (а, б) қаторҳои зарраҳо, ки дар дохили капиллярҳои пур аз моеъ ва (в, г) трахеяи пур аз ҳаво ба вуҷуд меоянд. Дар хотир доред, ки капиллярҳо ва трахея ба миқёс кашида нашудаанд. Панели (а) инчунин тавсифи MP-ро дар бар мегирад, ки зарраҳои Fe3O4-ро дар шакли сатрҳо ҷойгиршуда дар бар мегирад.
Вақте ки магнит аз болои капилляр ҳаракат мекард, кунҷи риштаи зарраҳо барои MP3-5, ки дорои Fe3O4 буд, ба ҳадди муҳим расид, ки пас аз он риштаи зарраҳо дигар дар мавқеи аввала намондааст, балки дар сатҳ ба мавқеи нав ҳаракат кардааст. магнит. Ин таъсир эҳтимол дорад, ки аз он сабаб ба амал ояд, ки сатҳи капиллярии шишагӣ ба қадри кофӣ ҳамвор аст, ки ин ҳаракатро имконпазир созад. Ҷолиб он аст, ки MP6 (CombiMag) ин тавр рафтор накард, эҳтимол аз он сабаб, ки зарраҳо хурдтар буданд, пӯшишҳо ё зарядҳои сатҳӣ доштанд ё моеъи интиқолдиҳандаи хусусӣ ба қобилияти ҳаракати онҳо таъсир расонд. Контрасти тасвири зарраҳои CombiMag низ заифтар аст, ки нишон медиҳад, ки моеъ ва зарраҳо метавонанд зичии якхела дошта бошанд ва аз ин рӯ ба осонӣ ба сӯи якдигар ҳаракат накунанд. Зарраҳо инчунин метавонанд часпанд, агар магнит хеле зуд ҳаракат кунад, ки ин нишон медиҳад, ки қувваи майдони магнитӣ ҳамеша наметавонад соишро байни зарраҳо дар моеъ бартараф кунад, ки ин нишон медиҳад, ки шояд тааҷҷубовар нест, ки қувваи майдони магнитӣ ва масофа байни магнит ва минтақаи ҳадаф Хеле муҳим аст. Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо инчунин нишон медиҳанд, ки дар ҳоле ки магнитҳо метавонанд бисёр MP-ҳоеро, ки аз минтақаи ҳадаф ҷорӣ мешаванд, дастгир кунанд, эҳтимол надорад, ки ба магнитҳо такя кард. зарраҳои CombiMag-ро дар сатҳи трахея ҳаракат диҳед. Аз ин рӯ, мо ба хулосае омадем, ки таҳқиқоти in vivo LV-MP бояд аз майдонҳои магнитии статикӣ барои ҳадаф қарор додани минтақаҳои мушаххаси дарахти роҳи нафас истифода баранд.
Вақте ки зарраҳо дар бадан интиқол дода мешаванд, муайян кардани онҳо дар заминаи бофтаи мураккаби ҳаракаткунандаи бадан душвор аст, аммо қобилияти муайян кардани онҳо бо роҳи интиқоли магнит ба таври уфуқӣ дар болои трахея барои "ҷунбондан"-и риштаҳои MP беҳтар карда шуд. Гарчанде ки аксбардории зинда имконпазир аст, пас аз куштани ҳайвон ба таври инсонӣ муайян кардани ҳаракати зарраҳо осонтар аст. Консентратсияи MP одатан дар ин макон вақте ки магнит дар болои минтақаи аксбардорӣ ҷойгир карда шуда буд, баландтарин буд, гарчанде ки баъзе зарраҳо одатан дар канори трахея пайдо мешуданд. Бар хилофи таҳқиқоти in vitro, зарраҳоро бо интиқоли магнит дар трахея кашидан мумкин нест. Ин бозёфт бо он мувофиқат мекунад, ки чӣ гуна луобе, ки сатҳи трахеяро ​​мепӯшонад, одатан зарраҳои нафасгирифтаро коркард мекунад, онҳоро дар луоб нигоҳ медорад ва баъдан тавассути механизми тозакунии мукосилиарӣ тоза мекунад.
Мо фарзия кардем, ки истифодаи магнитҳо барои ҷалб дар боло ва поёни трахея (Расми 3b) метавонад ба майдони магнитии якхелатар оварда расонад, на майдони магнитие, ки дар як нуқта хеле мутамарказ аст ва эҳтимолан ба тақсимоти якхелаи зарраҳо оварда мерасонад. Аммо, таҳқиқоти пешакии мо далелҳои равшанеро барои дастгирии ин фарзия пайдо накард. Ба ҳамин монанд, танзим кардани як ҷуфт магнит барои дафъ кардан (Расми 3c) боиси ҷойгиршавии бештари зарраҳо дар минтақаи тасвиршуда нашуд. Ин ду бозёфт нишон медиҳанд, ки танзимоти дугонаи магнитӣ назорати маҳаллии ҳадафгирии MP-ро ба таври назаррас беҳтар намекунад ва танзим кардани қувваҳои қавии магнитии бадастомада душвор аст, ки ин равишро камтар амалӣ мегардонад. Ба ҳамин монанд, самт додани магнит дар боло ва тавассути трахея (Расми 3d) инчунин шумораи зарраҳои нигоҳдошташударо дар минтақаи тасвиршуда зиёд накард. Баъзе аз ин конфигуратсияҳои алтернативӣ метавонанд муваффақ набошанд, зеро онҳо боиси паст шудани қувваи майдони магнитӣ дар минтақаи ҷойгиршавӣ мешаванд. Аз ин рӯ, конфигуратсияи ягонаи магнити кунҷи 30-дараҷа (Расми 3a) усули осонтарин ва самараноктарин барои санҷиши in vivo ҳисобида мешавад.
Таҳқиқоти LV-MP нишон дод, ки вақте ки векторҳои LV бо CombiMag якҷоя карда шуданд ва пас аз халалдоршавии ҷисмонӣ дар ҳузури майдони магнитӣ интиқол дода шуданд, сатҳи трансдуксия дар трахея дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ ба таври назаррас афзоиш ёфт. Бар асоси таҳқиқоти аксбардории синхротронӣ ва натиҷаҳои LacZ, майдони магнитӣ зоҳиран қодир буд, ки LV-ро дар дохили трахея нигоҳ дорад ва шумораи зарраҳои векториро, ки фавран ба шуш амиқ ворид мешуданд, кам кунад. Чунин беҳбудиҳои ҳадафгирӣ метавонанд ба самаранокии баландтар оварда расонанд ва дар айни замон титрҳои интиқолшуда, трансдуксияи берун аз ҳадаф, таъсири паҳлӯии илтиҳобӣ ва иммунӣ ва хароҷоти интиқолдиҳандаи генро коҳиш диҳанд. Муҳим он аст, ки ба гуфтаи истеҳсолкунанда, CombiMag метавонад дар якҷоягӣ бо дигар усулҳои интиқоли ген, аз ҷумла бо дигар векторҳои вирусӣ (масалан, AAV) ва кислотаҳои нуклеинӣ истифода шавад.