Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Генныя вектары для лячэння мукавісцыдозу лёгкіх павінны быць накіраваны на праводзячыя дыхальныя шляхі, паколькі перыферычная трансдукцыя лёгкіх не дае тэрапеўтычнай карысці. Эфектыўнасць віруснай трансдукцыі непасрэдна звязана з часам знаходжання вектара. Аднак вадкасці для дастаўкі, такія як носьбіты генаў, натуральна дыфузуюць у альвеолы ​​падчас удыху, і тэрапеўтычныя часціцы любой формы хутка выводзяцца з дапамогай мукацыліярнага транспарту. Падаўжэнне часу знаходжання носьбітаў генаў у дыхальных шляхах важна, але цяжка дасягнуць. Магнітныя часціцы, кан'югаваныя з носьбітамі генаў, якія можна накіраваць на паверхню дыхальных шляхоў, могуць палепшыць рэгіянальнае нацэльванне. З-за праблем візуалізацыі in vivo паводзіны такіх малых магнітных часціц на паверхні дыхальных шляхоў у прысутнасці прыкладзенага магнітнага поля дрэнна вывучаны. Мэтай гэтага даследавання было выкарыстанне сінхратроннай візуалізацыі для візуалізацыі руху in vivo серыі магнітных часціц у трахеі анестэзаваных пацукоў, каб вывучыць дынаміку і заканамернасці паводзін асобных і аб'ёмных часціц in vivo. Затым мы таксама ацанілі, ці павялічыць дастаўка лентывірусных магнітных часціц у прысутнасці магнітнага поля эфектыўнасць трансдукцыі ў трахеі пацукоў. Сінхратронная рэнтгенаўская візуалізацыя паказвае... Паводзіны магнітных часціц у стацыянарных і рухомых магнітных палях in vitro і in vivo. Часціцы нельга лёгка перацягваць па паверхні жывых дыхальных шляхоў магнітамі, але падчас транспарціроўкі адклады канцэнтруюцца ў полі зроку, дзе магнітнае поле найбольш моцнае. Эфектыўнасць трансдукцыі таксама павялічылася ў шэсць разоў, калі магнітныя часціцы лентывіруса дастаўляліся ў прысутнасці магнітнага поля. Разам гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што магнітныя часціцы лентывіруса і магнітныя палі могуць быць каштоўнымі падыходамі для паляпшэння таргетынгу генных вектараў і павышэння ўзроўню трансдукцыі ў праводзячых дыхальных шляхах in vivo.
Мукавісцыдоз (МВ) выкліканы зменай у адным гене, які называецца рэгулятарам трансмембраннай праводнасці МВ (CFTR). Бялок CFTR — гэта іённы канал, які прысутнічае ў многіх эпітэліяльных клетках па ўсім целе, у тым ліку ў праводзячых дыхальных шляхах, якія з'яўляюцца асноўным месцам патагенезу МВ. Дэфекты CFTR прыводзяць да парушэння транспарту вады, абязводжвання паверхні дыхальных шляхоў і памяншэння глыбіні пласта паверхневай вадкасці (ASL). Гэта таксама пагаршае здольнасць сістэмы мукацыліярнага транспарту (MCT) выдаляць удыханыя часціцы і патагены з дыхальных шляхоў. Наша мэта — распрацаваць генную тэрапію лентывірусам (LV) для дастаўкі правільнай копіі гена CFTR і паляпшэння здароўя ASL, MCT і лёгкіх, а таксама працягваць распрацоўку новых тэхналогій, здольных вымяраць гэтыя параметры in vivo1.
Вектары левага страўнічка (ЛШ) з'яўляюцца адным з вядучых кандыдатаў для геннай тэрапіі дыхальных шляхоў пры мукавісцыдозе, галоўным чынам таму, што яны могуць пастаянна інтэграваць тэрапеўтычны ген у базальныя клеткі дыхальных шляхоў (ствалавыя клеткі дыхальных шляхоў). Гэта важна, таму што яны могуць аднаўляць нармальную гідратацыю і клірэнс слізі шляхам дыферэнцыяцыі ў функцыянальныя генна-скарэкціраваныя паверхневыя клеткі дыхальных шляхоў, звязаныя з МВ, што прыводзіць да пажыццёвых пераваг. Вектары ЛШ павінны быць накіраваны супраць праводзячых дыхальных шляхоў, бо менавіта тут пачынаецца захворванне лёгкіх пры МВ. Дастаўка вектара глыбей у лёгкія можа прывесці да альвеалярнай трансдукцыі, але гэта не мае тэрапеўтычнай карысці пры МВ. Аднак вадкасці, такія як носьбіты генаў, натуральным чынам мігруюць у альвеолы ​​пры ўдыху пасля дастаўкі3,4, і тэрапеўтычныя часціцы хутка выводзяцца ў ротавую поласць з дапамогай MCT. Эфектыўнасць трансдукцыі ЛШ непасрэдна звязана з працягласцю часу, на працягу якога вектар застаецца побач з мэтавымі клеткамі, каб дазволіць паглынанне клеткамі - "час знаходжання"5 - які лёгка памяншаецца тыповым рэгіянальным патокам паветра, а таксама каардынаваным захопам часціц слізі і MCT. Пры МВ здольнасць падаўжаць час знаходжання ЛШ у дыхальных шляхах важная для дасягнення высокага ўзроўню трансдукцыі ў гэтай вобласці, але да гэтага часу гэта было складанай задачай.
Каб пераадолець гэтую перашкоду, мы мяркуем, што магнітныя часціцы (МЧ) ЛШ могуць дапамагчы двума дапаўняльнымі спосабамі. Па-першае, іх можна магнітна накіроўваць на паверхню дыхальных шляхоў для паляпшэння таргетынгу і дапамогі часціцам-носьбітам генаў знаходзіцца ў патрэбнай вобласці дыхальных шляхоў; і (АСЛ) для перамяшчэння да 6-га клеткавага пласта. МЧ шырока выкарыстоўваюцца ў якасці мэтанакіраваных сродкаў дастаўкі лекаў, калі яны звязваюцца з антыцеламі, хіміятэрапеўтычнымі прэпаратамі або іншымі малымі малекуламі, якія прымацоўваюцца да клеткавых мембран або звязваюцца з адпаведнымі рэцэптарамі на паверхні клетак і назапашваюцца ў месцах пухліны ў прысутнасці статычнай электрычнасці. Магнітныя палі для лячэння раку 7. Іншыя «гіпертэрмічныя» метады накіраваны на награванне мікрапластыкавых пухлін (МП) пры ўздзеянні вагальных магнітных палёў, тым самым знішчаючы пухлінныя клеткі. Прынцып магнітнай трансфекцыі, у якім магнітнае поле выкарыстоўваецца ў якасці трансфекцыйнага агента для паляпшэння пераносу ДНК у клеткі, звычайна выкарыстоўваецца in vitro з выкарыстаннем шэрагу невірусных і вірусных генных вектараў для цяжкатрансдуцыруемых клеткавых ліній. Эфектыўнасць магнітатрансфекцыі левага страўнічка (ЛШ) была ўстаноўлена пры дастаўцы МП ЛШ in vitro ў лінію клетак бронхальнага эпітэлія чалавека ў прысутнасці статычнага магнітнага поля, што павялічвае эфектыўнасць трансдукцыі ў 186 разоў у параўнанні з адным толькі вектарам ЛШ. МП ЛШ таксама быў ужыты да мадэлі МФ in vitro, дзе магнітная трансфекцыя павялічыла трансдукцыю ЛШ у культурах на мяжы паветра-вадкасць у 20 разоў у прысутнасці мокроты хворага на МФ10. Аднак магнітатрансфекцыя органаў in vivo атрымала адносна мала ўвагі і была ацэненая толькі ў некалькіх даследаваннях на жывёлах11,12,13,14,15, асабліва ў лёгкія16,17. Тым не менш, магчымасці магнітнай трансфекцыі ў тэрапіі лёгкіх пры мукавісцыдозе відавочныя. Тан і інш. (2020) заявілі, што «даследаванне эфектыўнай дастаўкі магнітных наначасціц у лёгкія адкрые шлях для будучых стратэгій інгаляцыі CFTR для паляпшэння клінічных вынікаў у пацыентаў з мукавісцыдозам»6.
Паводзіны малых магнітных часціц на паверхнях дыхальных шляхоў у прысутнасці прыкладзенага магнітнага поля цяжка візуалізаваць і вывучаць, таму яны дрэнна вывучаны. У іншых даследаваннях мы распрацавалі метад фазава-кантрастнай рэнтгенаўскай візуалізацыі на аснове распаўсюджвання сінхратроннага выпраменьвання (PB-PCXI) для неінвазіўнай візуалізацыі і колькаснай ацэнкі нязначных змяненняў in vivo глыбіні ASL18 і паводзін MCT19,20 для непасрэднага вымярэння гідратацыі паверхні газавага канала і выкарыстання ў якасці ранняга індыкатара эфектыўнасці лячэння. Акрамя таго, наш метад ацэнкі MCT выкарыстоўвае часціцы дыяметрам 10-35 мкм, якія складаюцца з аксіду алюмінію або шкла з высокім паказчыкам праламлення, у якасці маркераў MCT, бачных з дапамогай PB-PCXI21. Абодва метады падыходзяць для візуалізацыі шэрагу тыпаў часціц, у тым ліку MP.
Дзякуючы высокаму прастораваму і часаваму разрозненню, нашы метады аналізу ASL і MCT на аснове PB-PCXI добра падыходзяць для вывучэння дынамікі і заканамернасцей паводзін адзінкавых і аб'ёмных часціц in vivo, каб дапамагчы нам зразумець і аптымізаваць метады дастаўкі генаў MP. Падыход, які мы выкарыстоўваем тут, заснаваны на нашых даследаваннях з выкарыстаннем прамянёвай лініі SPring-8 BL20B2, у якіх мы візуалізавалі рух вадкасці пасля дастаўкі дозы вектара ў насавыя і лёгачныя дыхальныя шляхі мышэй, каб дапамагчы растлумачыць неаднародныя заканамернасці экспрэсіі генаў, якія назіраліся ў нашых даследаваннях на жывёлах з дозамі носьбітаў генаў 3,4.
Мэтай гэтага даследавання было выкарыстанне сінхратроннага PB-PCXI для візуалізацыі рухаў серыі мікрачасціц (МЧ) у трахеі жывых пацукоў in vivo. Гэтыя даследаванні візуалізацыі з выкарыстаннем PB-PCXI былі распрацаваны для праверкі шэрагу МЧ, напружанасці магнітнага поля і месцазнаходжання, каб вызначыць іх уплыў на рух МЧ. Мы выказалі гіпотэзу, што прыкладзенае знешняе магнітнае поле дапаможа дастаўленаму МЧ заставацца або рухацца ў мэтавую вобласць. Гэтыя даследаванні таксама дазволілі нам вызначыць канфігурацыі магнітаў, якія максімізуюць колькасць часціц, якія затрымліваюцца ў трахеі пасля адкладання. У другой серыі даследаванняў мы імкнуліся выкарыстаць гэтую аптымальную канфігурацыю для дэманстрацыі карціны трансдукцыі, якая ўзнікае ў выніку дастаўкі МЧ ЛШ in vivo ў дыхальныя шляхі пацукоў, зыходзячы з здагадкі, што дастаўка МЧ ЛШ у кантэксце накіравання ў дыхальныя шляхі прывядзе да павышэння эфектыўнасці трансдукцыі ЛШ.
Усе даследаванні на жывёлах праводзіліся ў адпаведнасці з пратаколамі, зацверджанымі Адэлаідскім універсітэтам (M-2019-060 і M-2020-022) і Камітэтам па этыцы сінхротроннага даследавання жывёл SPring-8. Эксперыменты праводзіліся ў адпаведнасці з рэкамендацыямі ARRIVE.
Усе рэнтгенаўскія здымкі праводзіліся на лініі выпраменьвання BL20XU сінхратрона SPring-8 у Японіі з выкарыстаннем устаноўкі, падобнай да апісанай раней21,22. Карацей кажучы, эксперыментальная скрынка знаходзілася ў 245 м ад кольца сінхратроннага захоўвання. Адлегласць паміж узорам і дэтэктарам складала 0,6 м для даследаванняў візуалізацыі часціц, а для даследаванняў візуалізацыі in vivo — 0,3 м для стварэння эфектаў фазавага кантрасту. Выкарыстоўвалася энергія манахраматычнага выпраменьвання 25 кэВ. Здымкі атрымліваліся з дапамогай рэнтгенаўскага пераўтваральніка высокага разрознення (SPring-8 BM3), падлучанага да sCMOS-дэтэктара. Пераўтваральнік пераўтварае рэнтгенаўскія прамяні ў бачнае святло з дапамогай сцынтылятара (Gd3Al2Ga3O12) таўшчынёй 10 мкм, які затым накіроўваецца на sCMOS-датчык з выкарыстаннем мікраскопа × 10 (NA 0,3). Дэтэктар sCMOS быў Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Японія) з памерам масіва 2048 × 2048 пікселяў і памер пікселя ў неапрацаваным выглядзе 6,5 × 6,5 мкм. Такая ўстаноўка забяспечвае эфектыўны ізатропны памер пікселя 0,51 мкм і поле зроку прыблізна 1,1 мм × 1,1 мм. Працягласць экспазіцыі 100 мс была абрана для максімізацыі суадносін сігнал/шум магнітных часціц унутры і звонку дыхальных шляхоў, мінімізуючы пры гэтым артэфакты руху, выкліканыя дыханнем. Для даследаванняў in vivo на шляху рэнтгенаўскага выпраменьвання быў размешчаны хуткі рэнтгенаўскі затвор, каб абмежаваць дозу выпраменьвання шляхам блакавання рэнтгенаўскага прамяня паміж экспазіцыямі.
Носьбіт LV не выкарыстоўваўся ні ў якіх даследаваннях візуалізацыі SPring-8 PB-PCXI, паколькі камера візуалізацыі BL20XU не сертыфікавана па ўзроўні біялагічнай бяспекі 2. Замест гэтага мы адабралі шэраг добра характарызаваных мікраплазматаў ад двух камерцыйных пастаўшчыкоў — якія ахопліваюць шырокі спектр памераў, матэрыялаў, канцэнтрацый жалеза і прымянення — спачатку каб зразумець, як магнітныя палі ўплываюць на рух мікраплазматаў у шкляных капілярах, а затым у жывых дыхальных шляхах. на паверхні. Памеры мікрачасціц вар'іруюцца ад 0,25 да 18 мкм і вырабляюцца з розных матэрыялаў (гл. Табліцу 1), але склад кожнага ўзору, у тым ліку памер магнітных часціц унутры мікрачасціц, невядомы. Зыходзячы з нашых шырокіх даследаванняў MCT 19, 20, 21, 23, 24, мы чакаем, што мікрачасціцы памерам да 5 мкм можна будзе ўбачыць на паверхні трахеі дыхальных шляхоў, напрыклад, шляхам аднімання паслядоўных кадраў, каб убачыць палепшаную бачнасць руху мікрачасціц. Адзін мікрачасціц памерам 0,25 мкм меншы за раздзяляльную здольнасць прылады візуалізацыі, але чакаецца, што PB-PCXI выявіць іх аб'ёмны кантраст і рух паверхневай вадкасці, на якой яны адкладаюцца пасля адкладання.
Узоры для кожнага MP у Табліцы 1 былі падрыхтаваны ў шкляных капілярах аб'ёмам 20 мкл (Drummond Microcaps, PA, ЗША) з унутраным дыяметрам 0,63 мм. Карпускулярныя часціцы даступныя ў вадзе, а часціцы CombiMag даступныя ў запатэнтаванай вадкасці вытворцы. Кожная трубка напалову запоўнена вадкасцю (прыблізна 11 мкл) і размешчана на трымальніку для ўзораў (гл. Малюнак 1). Шкляныя капіляры былі размешчаны гарызантальна на стале ўзору ў скрынцы для візуалізацыі адпаведна і размешчаны па краях вадкасці. Нікелевы магніт дыяметрам 19 мм (даўжынёй 28 мм) з рэдказямельных неадымавых жалеза-боравых элементаў (NdFeB) (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Аўстралія) з рэшткавай намагнічанасцю 1,17 Тэсла быў прымацаваны да асобнага стала перамяшчэння для дыстанцыйнай змены яго становішча падчас візуалізацыі. Атрыманне рэнтгенаўскага малюнка пачынаецца, калі магніт размешчаны прыблізна на 30 мм вышэй за ўзор, і выявы атрымліваюцца з частатой 4 кадры ў секунду. Падчас візуалізацыі магніт быў падведзены блізка да ўзору. шкляную капілярную трубку (прыкладна на адлегласці 1 мм), а затым перамяшчалі ўздоўж трубкі для ацэнкі ўплыву напружанасці поля і становішча.
Усталёўка для візуалізацыі in vitro, якая змяшчае ўзоры мікраскапіі ў шкляных капілярах на этапе перамяшчэння ўзору па восях xy. Шлях рэнтгенаўскага прамяня пазначаны чырвонай пункцірнай лініяй.
Пасля таго, як была ўстаноўлена бачнасць мікрапластыкавых бляшак in vitro, падгрупа з іх была пратэставана in vivo на самках альбіносных пацукоў Вістар дзікага тыпу (узрост ~12 тыдняў, ~200 г). 0,24 мг/кг медэтамідыну (Domitor®, Zenoaq, Японія), 3,2 мг/кг мідазоламу (Dormicum®, Astellas Pharma, Японія) і 4 мг/кг бутарфанолу (Vetorphale®, Meiji Seika). Пацукоў анестэзавалі сумессю (Pharma) (Японія) шляхам унутрыбрушыннай ін'екцыі. Пасля анестэзіі іх падрыхтавалі да візуалізацыі, выдаліўшы поўсць вакол трахеі, уставіўшы эндотрахеальную трубку (ET; 16 Ga нутравенна канюля, Terumo BCT) і імабілізуючы іх у становішчы лежачы на ​​спіне на спецыяльна вырабленай візуалізацыйнай пласціне, якая змяшчае тэрмічны мяшок для падтрымання тэмпературы цела 22. Затым візуалізацыйная пласціна была прымацавана да стала для перамяшчэння ўзору ў скрынцы для візуалізацыі пад невялікім вуглом, каб выраўнаваць трахею гарызантальна на рэнтгенаўскім здымку, як паказана на малюнку. 2а.
(a) Устаноўка для візуалізацыі in vivo ў візуалізацыйным блоку SPring-8, шлях рэнтгенаўскага прамяня пазначаны чырвонай пункцірнай лініяй. (b,c) Лакалізацыя магніта на трахеі праводзілася дыстанцыйна з дапамогай дзвюх артаганальна ўсталяваных IP-камер. У левай частцы экрана бачная дроцяная пятля, якая ўтрымлівае галоўку, і дастаўная канюля, размешчаная ўнутры эндатраэстральнай трубкі.
Дыстанцыйна кіраваная сістэма шпрыцавага помпы (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Фларыда) з выкарыстаннем шклянога шпрыца аб'ёмам 100 мкл была падключана да трубкі PE10 (знешні дыяметр 0,61 мм, унутраны дыяметр 0,28 мм) праз іголку 30 Ga. Пазначце трубку, каб пераканацца, што наканечнік знаходзіцца ў правільным становішчы ў трахеі пры ўстаўцы эндотрахеальнай трубкі. З дапамогай мікрапомпы поршань шпрыца выцягвалі, а наканечнік трубкі апускалі ў пробу MP, якую трэба было ўвесці. Затым загружаную трубку для ўвядзення ў эндотрахеальную трубку ўстаўлялі, размяшчаючы наканечнік у межах найбольш моцнай часткі чаканага прыкладзенага магнітнага поля. Атрыманне выявы кантралявалася з дапамогай датчыка дыхання, падлучанага да нашага таймеру на базе Arduino, і ўсе сігналы (напрыклад, тэмпература, дыханне, адкрыццё/закрыццё засаўкі і атрыманне выявы) запісваліся з дапамогай Powerlab і LabChart (AD Instruments, Сіднэй, Аўстралія)22. Пры візуалізацыі, калі корпус быў недаступны, дзве IP-камеры (Panasonic BB-SC382) былі размешчаны прыблізна пад вуглом 90° адна да адной і выкарыстоўваліся для кантролю становішча магніта адносна... да трахеі падчас візуалізацыі (мал. 2b,c). Каб мінімізаваць артэфакты руху, падчас плато патоку ў канцы прыліву атрымлівалася адно выява на кожны ўдых.
Магніт прымацаваны да другой каскады, якую можна размясціць дыстанцыйна звонку корпуса візуалізацыі. Былі пратэставаны розныя становішча і канфігурацыі магніта, у тым ліку: усталяваны пад вуглом прыблізна 30° над трахеяй (канфігурацыі паказаны на малюнках 2a і 3a); адзін магніт над жывёлай, а другі пад ёй, з полюсамі, устаноўленымі для прыцягнення (малюнак 3b); адзін магніт над жывёлай, а другі пад ёй, з полюсамі, устаноўленымі для адштурхвання (малюнак 3c); і адзін магніт над трахеяй і перпендыкулярны ёй (малюнак 3d). Пасля таго, як жывёла і магніт настроены, і мікрачып, які падлягае тэставанню, загружаны ў шпрыцавы помпа, уводзяць дозу 50 мкл са хуткасцю 4 мкл/с падчас атрымання выявы. Затым магніт перамяшчаюць наперад і назад уздоўж або папярок трахеі, працягваючы атрымліваць выявы.
Канфігурацыя магніта для візуалізацыі in vivo: (а) адзін магніт над трахеяй пад вуглом прыблізна 30°, (б) два магніты, настроеныя на прыцягненне, (в) два магніты, настроеныя на адштурхванне, (г) адзін магніт над трахеяй і перпендыкулярна ёй. Назіральнік глядзеў уніз ад рота да лёгкіх праз трахею, і рэнтгенаўскі прамень праходзіў праз левы бок пацука і выходзіў з правага боку. Магніт перамяшчаўся альбо ўздоўж дыхальных шляхоў, альбо злева і справа над трахеяй у кірунку рэнтгенаўскага прамяня.
Мы таксама імкнуліся вызначыць бачнасць і паводзіны часціц у дыхальных шляхах пры адсутнасці парушаючых дыханне і сардэчны рух. Таму ў канцы перыяду візуалізацыі жывёл гуманна забівалі з-за перадазіроўкі пентабарбіталу (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ЗША; ~65 мг/кг в/б). Некаторых жывёл пакідалі на платформе візуалізацыі, і пасля спынення дыхання і сардэчнага рытму працэс візуалізацыі паўтаралі, дадаючы дадатковую дозу MP, калі MP на паверхні дыхальных шляхоў не было відаць.
Атрыманыя выявы былі карэкціраваны ў плоскім і цёмным полі, а затым сабраны ў фільм (20 кадраў у секунду; 15-25 × нармальная хуткасць у залежнасці ад частаты дыхання) з выкарыстаннем спецыяльнага сцэнарыя, напісанага ў MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Усе даследаванні па дастаўцы вектара гена LV былі праведзены ў Цэнтры даследаванняў лабараторных жывёл пры Універсітэце Адэлаіды і мелі на мэце выкарыстаць вынікі эксперыменту SPring-8 для ацэнкі таго, ці можа дастаўка LV-MP у прысутнасці магнітнага поля палепшыць перанос генаў in vivo. Для ацэнкі ўздзеяння MP і магнітнага поля былі апрацаваны дзве групы жывёл: адна група атрымлівала LV-MP з магнітам, а другая група атрымлівала кантрольную групу з LV-MP без магніта.
Вектары генаў LV былі атрыманы з выкарыстаннем раней апісаных метадаў 25, 26. Вектар LacZ экспрэсуе ядзерна-лакалізаваны ген бэта-галактазідазы, які кіруецца канстытутыўным прамотарам MPSV (LV-LacZ), які ўтварае сіні прадукт рэакцыі ў трансдуцыраваных клетках, бачны на франтах тканін лёгкіх і зрэзах тканін. Тытраванне праводзілася ў клеткавых культурах шляхам ручнога падліку колькасці LacZ-пазітыўных клетак з дапамогай гемацытометра для разліку тытра ў TU/мл. Носьбіты крыякансервуюцца пры тэмпературы -80 °C, размарожваюцца перад выкарыстаннем і звязваюцца з CombiMag шляхам змешвання ў суадносінах 1:1 і інкубацыі на лёдзе не менш за 30 хвілін перад дастаўкай.
Нармальным пацукам лініі Sprague Dawley (n = 3/група, ~2-3 асобіны ва ўзросце 1 месяца) уводзілі ўнутрыбрушынна сумесь медэтамідыну 0,4 мг/кг (Domitor, Ilium, Аўстралія) і кетаміна 60 мг/кг (Ilium, Аўстралія) шляхам в/б ін'екцыі і нехірургічнай аральнай канюляцыі з дапамогай 16 Ga в/в канюлі. Каб гарантаваць, што тканіна трахеальных дыхальных шляхоў атрымае трансдукцыю левага страўнічка, яе кандыцыянавалі з выкарыстаннем нашага раней апісанага пратаколу механічнага ўзрушэння, у якім паверхня трахеальных дыхальных шляхоў расціралася па восі дроцяным кошыкам (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ЗША) 30 s28. Затым праз 10 хвілін пасля ўзрушэння трахеальнае ўвядзенне LV-MP праводзілася ў кабінеце біялагічнай бяспекі.
Магнітнае поле, якое выкарыстоўвалася ў гэтым эксперыменце, было настроена аналагічна даследаванню рэнтгенаўскай візуалізацыі in vivo, з тымі ж магнітамі, якія ўтрымліваліся над трахеяй з дапамогай дыстыляцыйных стэнтавых кліпс (малюнак 4). Аб'ём 50 мкл (2 × 25 мкл аліквоты) LV-MP быў дастаўлены ў трахею (n = 3 жывёлы) з дапамогай піпеткі з гелевым наканечнікам, як апісана раней. Кантрольная група (n = 3 жывёлы) атрымлівала тыя ж LV-MP без выкарыстання магніта. Пасля завяршэння інфузіі канюлю вымаюць з ET-трубы, і жывёлу экстубуюць. Магніт застаецца на месцы на працягу 10 хвілін, затым яго выдаляюць. Пацукі атрымлівалі падскурную дозу мелоксікаму (1 мл/кг) (Ilium, Аўстралія), а затым адмянялі анестэзію шляхам в/б ін'екцыі 1 мг/кг гідрахларыду атыпамазолу (Antisedan, Zoetis, Аўстралія). Пацукоў трымалі ў цяпле і назіралі за імі да поўнага аднаўлення ад анестэзіі.
Прылада дастаўкі LV-MP у шафе біялагічнай бяспекі. Светла-шэры люэраўскі канюль эндатэрапеўтычнай трубкі выступае з рота, а гелевы наканечнік піпеткі, паказаны на малюнку, уводзіцца праз эндатэрапеўтычную трубку на патрэбную глыбіню ў трахею.
Праз тыдзень пасля працэдуры дазавання LV-MP жывёл гуманна забілі шляхам інгаляцыі 100% CO2, і экспрэсію LacZ ацэньвалі з выкарыстаннем нашага стандартнага лячэння X-gal. Тры найбольш храстковыя кольцы ў хвасце былі выдалены, каб пераканацца, што любыя механічныя пашкоджанні або затрымка вадкасці з-за размяшчэння эндотрахеальнай трубкі не былі ўключаны ў аналіз. Кожная трахея была разрэзана падоўжна, каб стварыць дзве паловы для аналізу, і яны былі ўсталяваны ў чашку, якая змяшчае сіліконавы каўчук (Sylgard, Dow Inc) з выкарыстаннем іголкі Minutien (Fine Science Tools) для візуалізацыі паверхні прасвету. Размеркаванне і структура трансдуцыраваных клетак былі пацверджаны франтальнай фатаграфіяй з выкарыстаннем мікраскопа Nikon (SMZ1500) з камерай DigiLite і праграмным забеспячэннем TCapture (Tucsen Photonics, Кітай). Здымкі былі атрыманы пры 20-кратным павелічэнні (уключаючы найвышэйшую наладу для поўнай шырыні трахеі), прычым уся даўжыня трахеі візуалізавалася паэтапна, забяспечваючы дастатковае перакрыццё паміж кожным малюнкам, каб дазволіць «зшыванне» малюнкаў. Затым выявы з кожнай трахеі былі сабраны ў адзін. кампазітны малюнак з выкарыстаннем рэдактара Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) з выкарыстаннем алгарытму планарнага руху. Зоны экспрэсіі LacZ у кампазітных малюнках трахеі кожнай жывёлы былі колькасна вызначаны з дапамогай аўтаматызаванага скрыпта MATLAB (R2020a, MathWorks), як апісана раней, з выкарыстаннем налад 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 і Value < 0,7. Шляхам абводкі контураў тканіны для кожнага кампазітнага малюнка ўручную была створана маска ў GIMP v2.10.24, каб ідэнтыфікаваць вобласць тканіны і прадухіліць любыя ілжывыя выяўленні звонку тканіны трахеі. Афарбаваныя вобласці з усіх кампазітных малюнкаў кожнай жывёлы былі падсумаваны для атрымання агульнай афарбаванай плошчы для гэтай жывёлы. Затым афарбаваная плошча была падзелена на агульную плошчу маскі для атрымання нармалізаванай плошчы.
Кожную трахею залілі парафінам, і выразалі зрэзы таўшчынёй 5 мкм. Зрэзы кантраставалі нейтральным чырвоным колерам на працягу 5 хвілін, а выявы атрымлівалі з дапамогай мікраскопа Nikon Eclipse E400, камеры DS-Fi3 і праграмнага забеспячэння для захопу элементаў NIS (версія 5.20.00).
Усе статыстычныя аналізы былі выкананы ў GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Статыстычная значнасць была ўстаноўлена пры p ≤ 0,05. Нармальнасць была праверана з дапамогай тэсту Шапіра-Уілка, а адрозненні ў афарбоўванні LacZ былі ацэнены з дапамогай няпарнага t-крытэрыя.
Шэсць МП, апісаных у Табліцы 1, былі даследаваны з дапамогай PCXI, а іх бачнасць апісана ў Табліцы 2. Два МП з полістыролу (MP1 і MP2; 18 мкм і 0,25 мкм адпаведна) не былі бачныя пад PCXI, але астатнія ўзоры можна было ідэнтыфікаваць (прыклады паказаны на Малюнку 5). MP3 і MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 мкм і 0,9 мкм адпаведна) слаба бачныя. Нягледзячы на ​​тое, што MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) утрымлівае адны з самых дробных правераных часціц, ён быў найбольш выяўлены. Прадукт CombiMag MP6 цяжка заўважыць. Ва ўсіх выпадках наша здольнасць выяўляць МП значна палепшылася шляхам перамяшчэння магніта туды-сюды паралельна капіляру. Калі магніты аддаляліся ад капіляра, часціцы выцягваліся ў доўгія ніткі, але па меры набліжэння магнітаў і павелічэння напружанасці магнітнага поля ніткі часціц скарачаліся, калі часціцы мігравалі да верхняй паверхні капіляра (гл. дадатковае відэа S1: MP4), павялічваючы... Шчыльнасць часціц паверхні. І наадварот, калі магніт выдаляецца з капіляра, напружанасць поля памяншаецца, і мікрапластык перабудоўваецца ў доўгія ніткі, якія цягнуцца ад верхняй паверхні капіляра (гл. дадатковае відэа S2:MP4). Пасля таго, як магніт спыняе рух, часціцы працягваюць рухацца на працягу кароткага часу пасля дасягнення раўнаважнага становішча. Па меры таго, як мікрапластык рухаецца да верхняй паверхні капіляра і ад яе, магнітныя часціцы звычайна цягнуць смецце праз вадкасць.
Бачнасць MP пад PCXI значна адрозніваецца паміж узорамі. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 і (d) MP6. Усе паказаныя тут выявы былі зроблены з дапамогай магніта, размешчанага прыблізна ў 10 мм непасрэдна над капілярам. Бачныя вялікія кругі - гэта паветраныя бурбалкі, якія трапілі ў капіляры, выразна дэманструючы чорна-белыя краявыя асаблівасці фазава-кантрастнай візуалізацыі. Чырвоная рамка змяшчае павелічэнне, якое ўзмацняе кантраснасць. Звярніце ўвагу, што дыяметры схем магніта на ўсіх малюнках не ў маштабе і прыблізна ў 100 разоў большыя за паказаныя.
Па меры перамяшчэння магніта ўлева і ўправа ўздоўж верхняй часткі капіляра, вугал струны МП змяняецца, каб сумясціць з магнітам (гл. Малюнак 6), тым самым акрэсліваючы лініі магнітнага поля. У MP3-5, пасля таго, як хорда дасягае парогавага вугла, часціцы цягнуцца ўздоўж верхняй паверхні капіляра. Гэта часта прыводзіць да таго, што МП збіраюцца ў большыя групы паблізу месца, дзе магнітнае поле найбольш моцнае (гл. Дадатковае відэа S3:MP5). Гэта таксама асабліва відавочна пры візуалізацыі блізка да канца капіляра, што прымушае МП агрэгавацца і канцэнтравацца на мяжы паміж вадкасцю і паветрам. Часціцы ў MP6, якія было цяжэй распазнаць, чым у MP3-5, не цягнуліся пры руху магніта ўздоўж капіляра, але струны МП дысацыяваліся, пакідаючы часціцы ў полі зроку (гл. Дадатковае відэа S4:MP6). У некаторых выпадках, калі прыкладзенае магнітнае поле памяншалася шляхам перамяшчэння магніта на вялікую адлегласць ад месца візуалізацыі, любыя пакінутыя МП павольна апускаліся на ніжнюю паверхню трубкі пад дзеяннем сілы цяжару, застаючыся ў струне (гл. Дадатковае відэа S5: MP3).
Кут нахілу струны MP змяняецца па меры зрушэння магніта ўправа над капілярам. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 і (d) MP6. Чырвоная рамка змяшчае павелічэнне, якое ўзмацняе кантраснасць. Звярніце ўвагу, што дадатковыя відэа інфарматыўныя, бо яны паказваюць важную інфармацыю пра структуру часціц і дынаміку, якую немагчыма візуалізаваць на гэтых статычных выявах.
Нашы тэсты паказалі, што павольнае перамяшчэнне магніта туды-сюды ўздоўж трахеі палягчае візуалізацыю мікрапластыку ў кантэксце складанага руху in vivo. Тэставанне in vivo не праводзілася, паколькі шарыкі з полістыролу (MP1 і MP2) не былі бачныя ў капіляры. Кожны з астатніх чатырох мікрапластыкаў быў пратэставаны in vivo з доўгай воссю магніта, размешчанай над трахеяй пад вуглом каля 30° да вертыкалі (гл. малюнкі 2b і 3a), бо гэта прывяло да больш доўгіх ланцугоў мікрапластыку і было больш эфектыўным, чым канфігурацыя з абрывам магніта. MP3, MP4 і MP6 не былі выяўлены ў трахеі ніводнай жывой жывёлы. Пры візуалізацыі дыхальных шляхоў пацукоў пасля гуманнага забойства жывёл часціцы заставаліся нябачнымі, нават калі дадатковы аб'ём дадаваўся з дапамогай шпрыцавага помпы. MP5 меў найвышэйшае ўтрыманне аксіду жалеза і быў адзінай бачнай часціцай, таму выкарыстоўваўся для ацэнкі і характарыстыкі паводзін мікрапластыку in vivo.
Размяшчэнне магніта над трахеяй падчас падачы мікраскапічнага рэчыва прывяло да таго, што многія, але не ўсе, мікраскапічныя рэчывы канцэнтраваліся ў полі зроку. Часціцы, якія трапляюць у трахею, лепш за ўсё назіраюцца ў жывёл, якія былі прынесены ў ахвяру. Малюнак 7 і дадатковае відэа S6: MP5 паказвае хуткі магнітны захоп і выраўноўванне часціц на паверхні вентральнай трахеі, што сведчыць аб тым, што мікраскапічныя рэчывы можна накіроўваць у патрэбныя вобласці трахеі. Пры пошуку больш дыстальна ўздоўж трахеі пасля падачы мікраскапічнага рэчыва некаторыя мікраскапічныя рэчывы былі знойдзены бліжэй да карыны, што сведчыць аб тым, што напружанасць магнітнага поля была недастатковай для збору і ўтрымання ўсіх мікраскапічных рэчываў, паколькі яны былі дастаўлены праз вобласць максімальнай напружанасці магнітнага поля падчас працэсу ўцечкі вадкасці. Тым не менш, канцэнтрацыі мікраскапічнага рэчыва пасля родаў былі вышэйшымі вакол візуалізаванай вобласці, што сведчыць аб тым, што многія мікраскапічныя рэчывы заставаліся ў абласцях дыхальных шляхоў, дзе прыкладзеная напружанасць магнітнага поля была найвышэйшай.
Выявы (а) да і (б) пасля ўвядзення MP5 у трахею нядаўна эўтаназіраванага пацука з магнітам, размешчаным непасрэдна над зонай візуалізацыі. Здыманая зона размешчана паміж двума храстковымі кольцамі. Перад увядзеннем MP у дыхальных шляхах ёсць некаторая колькасць вадкасці. Чырвоная рамка змяшчае павелічэнне, якое ўзмацняе кантраст. Гэтыя выявы ўзятыя з відэа, паказанага ў дадатковым відэа S6:MP5.
Перамяшчэнне магніта ўздоўж трахеі in vivo прывяло да змены вугла ланцуга МП у паверхні дыхальных шляхоў падобным чынам да таго, што назіраецца ў капілярах (гл. малюнак 8 і дадатковае відэа S7:MP5). Аднак у нашым даследаванні МП не маглі перацягвацца ўздоўж паверхні жывых дыхальных шляхоў, як гэта магло быць з капілярамі. У некаторых выпадках ланцуг МП павялічваўся даўжэй, калі магніт рухаўся налева і направа. Цікава, што мы таксама выявілі, што ланцуг часціц, здаецца, змяняе глыбіню павярхоўнага пласта вадкасці, калі магніт рухаецца падоўжна ўздоўж трахеі, і пашыраецца, калі магніт рухаецца непасрэдна над галавой, а ланцуг часціц паварочваецца ў вертыкальнае становішча (гл. дадатковае відэа S7). : MP5 у 0:09, унізе справа). Характэрная карціна руху змянілася, калі магніт перамяшчаўся папярок верхняй часткі трахеі ў бакавы бок (гэта значыць, злева або справа ад жывёлы, а не ўздоўж трахеі). Часціцы ўсё яшчэ былі выразна бачныя падчас руху, але калі магніт быў выдалены з трахеі, кончыкі струноў часціц сталі бачнымі (гл. дадатковае відэа S8:MP5, пачынаючы з 0:08). Гэта адпавядае паводзінам MP, якія мы назіралі пад уздзеяннем прыкладзенага магнітнага поля ў шкляным капіляры.
Прыклады малюнкаў, якія паказваюць MP5 у трахеі жывога анестэзаванага пацука. (a) Магніт выкарыстоўваецца для атрымання малюнкаў вышэй і злева ад трахеі, затым (b) пасля таго, як магніт перамяшчаецца направа. Чырвоная рамка змяшчае павелічэнне, якое ўзмацняе кантраснасць. Гэтыя выявы ўзятыя з відэа, паказанага ў дадатковым відэа S7:MP5.
Калі два полюсы былі сканфігураваны ў арыентацыі поўнач-поўдзень над і пад трахеяй (г.зн. прыцягваліся; мал. 3b), хорды MP выглядалі даўжэйшымі і размяшчаліся на бакавой сценцы трахеі, а не на дорсальнай паверхні трахеі (гл. дадатковае відэа S9:MP5). Аднак высокая канцэнтрацыя часціц у адным месцы (г.зн. на дорсальнай паверхні трахеі) не выяўлялася пасля падачы вадкасці пры выкарыстанні прылады з падвойным магнітам, што звычайна адбываецца пры выкарыстанні прылады з адным магнітам. Затым, калі адзін магніт быў настроены на адштурхоўванне полюсаў у адваротным кірунку (мал. 3c), колькасць часціц, бачных у полі зроку, не павялічвалася пасля падачы. Налада абедзвюх канфігурацый з падвойным магнітам з'яўляецца складанай з-за высокай напружанасці магнітнага поля, якое прыцягвае або штурхае магніты адпаведна. Затым налада была зменена на адзін магніт, паралельны дыхальным шляхам, але які праходзіць праз дыхальныя шляхі пад вуглом 90 градусаў, так што сілавыя лініі перасякалі сценку трахеі артаганальна (мал. 3d), арыентацыя прызначана для вызначэння таго, ці можна назіраць агрэгацыю часціц на бакавой сценцы. Аднак у гэтай канфігурацыі, не было выяўлена ніякага выяўленага руху назапашвання MP або руху магніта. Зыходзячы з усіх гэтых вынікаў, для даследаванняў носьбітаў генаў in vivo была абраная канфігурацыя з адным магнітам і 30-градуснай арыентацыяй (малюнак 3a).
Калі жывёлу неаднаразова фатаграфавалі адразу пасля гуманнага забойства, адсутнасць сутыкальнага руху тканін азначала, што ў выразным міжхрысцістым полі можна было адрозніць больш тонкія і кароткія лініі часціц, якія «вагаліся» ў адпаведнасці з паступальным рухам магніта. Тым не менш, прысутнасць і рух часціц MP6 усё яшчэ не ўдаецца выразна ўбачыць.
Тытр LV-LacZ склаў 1,8 × 10⁻ ТУ/мл, і пасля змешвання 1:1 з CombiMag MP (MP6) жывёлы атрымлівалі 50 мкл трахеальнай дозы 9 × 10⁻ ТУ/мл LV-напаўняльніка (г.зн. 4,5 × 10⁻ ТУ/пацук). У гэтых даследаваннях замест перамяшчэння магніта падчас родаў мы фіксавалі магніт у адным становішчы, каб вызначыць, ці можна палепшыць трансдукцыю LV (а) у параўнанні з вектарнай дастаўкай у адсутнасць магнітнага поля, і (б) ці можна сфакусаваць клеткі дыхальных шляхоў.
Прысутнасць магнітаў і выкарыстанне CombiMag у спалучэнні з вектарамі LV, відаць, не аказвалі негатыўнага ўплыву на здароўе жывёл, як і наш стандартны пратакол дастаўкі вектараў LV. Франтальныя выявы трахеальнай вобласці, якая падвяргалася механічнаму ўздзеянню (Дадатковы мал. 1), паказалі, што ў групе жывёл, якія атрымлівалі LV-MP, пры наяўнасці магніта назіраліся значна больш высокія ўзроўні трансдукцыі (мал. 9a). У кантрольнай групе прысутнічала толькі невялікая колькасць сіняга афарбоўвання LacZ (мал. 9b). Колькасная ацэнка нармалізаваных участкаў, афарбаваных X-Gal, паказала, што ўвядзенне LV-MP у прысутнасці магнітнага поля прывяло да прыблізна 6-кратнага паляпшэння (мал. 9c).
Прыклады кампазітных малюнкаў, якія паказваюць трахеальную трансдукцыю з дапамогай LV-MP (а) у прысутнасці магнітнага поля і (б) у адсутнасць магніта. (в) Статыстычна значнае паляпшэнне нармалізаванай плошчы трансдукцыі LacZ у трахеі пры выкарыстанні магніта (*p = 0,029, t-крытэрый, n = 3 на групу, сярэдняе ± SEM).
Зрэзы, афарбаваныя нейтральным хуткім чырвоным колерам (прыклад паказаны на дадатковым мал. 2), паказалі клеткі, афарбаваныя LacZ, у падобнай схеме і месцазнаходжанні, як паведамлялася раней.
Ключавой праблемай геннай тэрапіі дыхальных шляхоў застаецца дакладная лакалізацыя часціц-носьбітаў у цікавых абласцях і дасягненне высокага ўзроўню эфектыўнасці трансдукцыі ў рухомым лёгкім пры наяўнасці паветранага патоку і актыўнага ачышчэння слізі. Для носьбітаў левабрыяльнай легені (ЛШ), прызначаных для лячэння захворванняў дыхальных шляхоў, выкліканых мукавісцыдозам, павелічэнне часу знаходжання часціц-носьбітаў у праводзячых дыхальных шляхах дагэтуль было няўлоўнай мэтай. Як адзначаюць Кастэлані і інш., выкарыстанне магнітных палёў для паляпшэння трансдукцыі мае перавагі ў параўнанні з іншымі метадамі дастаўкі генаў, такімі як электрапарацыя, паколькі яно можа спалучаць прастату, эканамічную эфектыўнасць, лакалізацыю дастаўкі, павышаную эфектыўнасць і больш кароткі час інкубацыі, а таксама, магчыма, меншую дозу носьбіта10. Аднак адкладванне і паводзіны магнітных часціц у дыхальных шляхах in vivo пад уздзеяннем знешніх магнітных сіл ніколі не апісваліся, а таксама не была прадэманстравана магчымасць выкарыстання гэтага метаду in vivo для павышэння ўзроўню экспрэсіі генаў у цэлых жывых дыхальных шляхах.
Нашы сінхратронныя эксперыменты PCXI in vitro паказалі, што ўсе правераныя намі часціцы, за выключэннем полістыролу MP, былі бачныя ў выкарыстоўванай намі ўсталёўцы візуалізацыі. Пры наяўнасці магнітнага поля MP утвараюць струны, даўжыня якіх залежыць ад тыпу часціц і напружанасці магнітнага поля (г.зн. блізкасці і руху магніта). Як паказана на малюнку 10, струны, якія мы назіраем, утвараюцца з-за таго, што кожная асобная часціца намагнічваецца і індукуе ўласнае лакальнае магнітнае поле. Гэтыя асобныя палі прымушаюць іншыя падобныя часціцы агрэгавацца і злучацца з групавымі струнападобнымі рухамі з-за лакальных сіл ад лакальных сіл прыцягнення і адштурхвання іншых часціц.
Схематычнае адлюстраванне (a, b) патокаў часціц, якія ўтвараюцца ўнутры капіляраў, запоўненых вадкасцю, і (c, d) трахеі, запоўненай паветрам. Звярніце ўвагу, што капіляры і трахея намаляваны не ў маштабе. Панэль (a) таксама змяшчае апісанне мікрапласцінкі (MP), якая змяшчае часціцы Fe3O4, размешчаныя ў струны.
Калі магніт перамяшчаўся над капілярам, ​​кут нахілу струны часціц дасягнуў крытычнага парога для MP3-5, які змяшчае Fe3O4, пасля чаго струна часціц больш не заставалася ў зыходным становішчы, а рухалася ўздоўж паверхні ў новае становішча. магніт. Гэты эфект, верагодна, узнікае таму, што паверхня шклянога капіляра дастаткова гладкая, каб дазволіць гэтаму руху адбывацца. Цікава, што MP6 (CombiMag) не паводзіў сябе такім чынам, магчыма, таму, што часціцы былі меншымі, мелі розныя пакрыцці або паверхневыя зарады, або запатэнтаваная вадкасць-носьбіт паўплывала на іх здольнасць рухацца. Кантраст выявы часціц CombiMag таксама слабейшы, што сведчыць аб тым, што вадкасць і часціцы могуць мець падобную шчыльнасць і таму не лёгка рухацца адна да адной. Часціцы таксама могуць затрымацца, калі магніт рухаецца занадта хутка, што сведчыць аб тым, што сіла магнітнага поля не заўсёды можа пераадолець трэнне паміж часціцамі ў вадкасці, што сведчыць аб тым, што, магчыма, не дзіўна, што сіла магнітнага поля і адлегласць паміж магнітам і мэтавай вобласцю вельмі важныя. У сукупнасці гэтыя вынікі таксама сведчаць аб тым, што, хоць магніты могуць захопліваць многія MP, якія праходзяць праз мэтавую вобласць, малаверагодна, што можна спадзявацца на магніты для перамяшчэння. Часціцы CombiMag уздоўж паверхні трахеі. Такім чынам, мы робім выснову, што ў даследаваннях LV-MP in vivo варта выкарыстоўваць статычныя магнітныя палі для фізічнага ўздзеяння на пэўныя вобласці дыхальных шляхоў.
Калі часціцы трапляюць у арганізм, іх цяжка ідэнтыфікаваць у кантэксце складаных рухомых тканін цела, але здольнасць іх выяўляць была палепшана шляхам гарызантальнага перамяшчэння магніта над трахеяй, каб «варушыць» струны мікрапластыка. Нягледзячы на ​​тое, што візуалізацыя ў рэжыме рэальнага часу магчымая, рух часціц лягчэй адрозніць пасля таго, як жывёла была гуманна забіта. Канцэнтрацыі мікрапластыка звычайна былі найвышэйшымі ў гэтым месцы, калі магніт быў размешчаны над зонай візуалізацыі, хоць некаторыя часціцы звычайна знаходзіліся далей уздоўж трахеі. У адрозненне ад даследаванняў in vitro, часціцы нельга перацягваць уздоўж трахеі шляхам перамяшчэння магніта. Гэта адпавядае таму, як слізь, якая пакрывае паверхню трахеі, звычайна апрацоўвае ўдыханыя часціцы, затрымліваючы іх у слізі і пасля выдаляючы з дапамогай механізму мукацыліярнай клірансу.
Мы выказалі гіпотэзу, што выкарыстанне магнітаў для прыцягнення вышэй і ніжэй трахеі (мал. 3b) можа прывесці да больш аднастайнага магнітнага поля, а не да магнітнага поля, якое высока сканцэнтравана ў адной кропцы, што патэнцыйна можа прывесці да больш раўнамернага размеркавання часціц. Аднак наша папярэдняе даследаванне не знайшло відавочных доказаў у падтрымку гэтай гіпотэзы. Аналагічна, канфігурацыя пары магнітаў для адштурхвання (мал. 3c) не прывяла да большага адкладання часціц у вобласці выявы. Гэтыя дзве вынікі паказваюць, што ўстаноўка з падвойным магнітам не паляпшае істотна лакальны кантроль мэтавага ўздзеяння мікраскапічнага рэчыва, і што атрыманыя моцныя магнітныя сілы цяжка наладзіць, што робіць гэты падыход менш практычным. Аналагічна, арыентацыя магніта вышэй і праз трахею (мал. 3d) таксама не павялічыла колькасць часціц, якія затрымліваюцца ў вобласці выявы. Некаторыя з гэтых альтэрнатыўных канфігурацый могуць быць непаспяховымі, таму што яны прыводзяць да зніжэння напружанасці магнітнага поля ў зоне адкладання. Такім чынам, канфігурацыя з адным магнітам пад вуглом 30 градусаў (мал. 3a) лічыцца самым простым і эфектыўным метадам для тэставання in vivo.
Даследаванне LV-MP паказала, што пры спалучэнні вектараў LV з CombiMag і дастаўцы пасля фізічнага ўздзеяння ў прысутнасці магнітнага поля ўзровень трансдукцыі ў трахеі значна павялічваўся ў параўнанні з кантрольнай групай. Зыходзячы з даследаванняў сінхратроннай візуалізацыі і вынікаў LacZ, магнітнае поле, відавочна, змагло захаваць LV у трахеі і паменшыць колькасць вектарных часціц, якія адразу пранікалі глыбока ў лёгкія. Такія паляпшэнні таргетынгу могуць прывесці да больш высокай эфектыўнасці, адначасова зніжаючы тытры дастаўленых вірусаў, трансдукцыю па-за мэтай, запаленчыя і імунныя пабочныя эфекты, а таксама выдаткі на носьбіты генаў. Важна адзначыць, што, паводле слоў вытворцы, CombiMag можна выкарыстоўваць разам з іншымі метадамі пераносу генаў, у тым ліку з іншымі віруснымі вектарамі (напрыклад, AAV) і нуклеінавымі кіслотамі.