Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). In de tussentijd geven we de site weer zonder stijlen en JavaScript, om ondersteuning te blijven bieden.
Genvectoren voor de behandeling van cystische fibrose (CFS) longziekte zouden zich moeten richten op de geleidende luchtwegen, omdat perifere longtransductie geen therapeutisch voordeel oplevert. De efficiëntie van virale transductie is direct gerelateerd aan de verblijftijd van de vector. Afgiftevloeistoffen zoals gendragers diffunderen echter van nature in de alveoli tijdens inademing, en therapeutische deeltjes van welke vorm dan ook worden snel verwijderd door mucociliair transport. Het verlengen van de verblijftijd van gendragers in de luchtwegen is belangrijk, maar moeilijk te bereiken. Met gendragers geconjugeerde magnetische deeltjes die naar het oppervlak van de luchtwegen kunnen worden gericht, kunnen de regionale targeting verbeteren. Vanwege de uitdagingen van in-vivo visualisatie wordt het gedrag van dergelijke kleine magnetische deeltjes op het oppervlak van de luchtwegen in aanwezigheid van een aangelegd magnetisch veld slecht begrepen. Het doel van deze studie was om met behulp van synchrotronbeeldvorming de in-vivo beweging van een reeks magnetische deeltjes in de luchtpijp van verdoofde ratten te visualiseren om de dynamiek en patronen van het gedrag van individuele en bulkdeeltjes in vivo te onderzoeken. Vervolgens hebben we ook beoordeeld of de afgifte van lentivirale magnetische deeltjes in aanwezigheid van een magnetisch veld Verhoog de transductie-efficiëntie in de rattenluchtpijp. Synchrotron-röntgenbeeldvorming laat het gedrag zien van magnetische deeltjes in stationaire en bewegende magnetische velden in vitro en in vivo. Deeltjes kunnen niet eenvoudig met magneten over het oppervlak van de levende luchtwegen worden gesleept, maar tijdens het transport concentreren de afzettingen zich in het gezichtsveld waar het magnetische veld het sterkst is. De transductie-efficiëntie werd ook zesvoudig verhoogd wanneer lentivirale magnetische deeltjes werden afgeleverd in de aanwezigheid van een magnetisch veld. Deze resultaten samen suggereren dat lentivirale magnetische deeltjes en magnetische velden waardevolle benaderingen kunnen zijn om de targeting van genvectoren te verbeteren en de transductieniveaus in geleidende luchtwegen in vivo te verhogen.
Cystic fibrosis (CF) wordt veroorzaakt door variatie in één enkel gen, de CF transmembrane conductance regulator (CFTR). Het CFTR-eiwit is een ionenkanaal dat aanwezig is in veel epitheelcellen in het hele lichaam, waaronder de geleidende luchtwegen, een belangrijke plaats van de pathogenese van CF. CFTR-defecten leiden tot abnormaal watertransport, waardoor het oppervlak van de luchtwegen uitdroogt en de diepte van de vloeistoflaag op het oppervlak van de luchtwegen (ASL) afneemt. Dit belemmert ook het vermogen van het mucociliaire transportsysteem (MCT) om ingeademde deeltjes en pathogenen uit de luchtwegen te verwijderen. Ons doel is om een ​​lentivirale (LV) gentherapie te ontwikkelen om de juiste kopie van het CFTR-gen af ​​te leveren en de ASL, MCT en longgezondheid te verbeteren, en om door te gaan met de ontwikkeling van nieuwe technologieën om deze parameters in vivo te meten1.
LV-vectoren zijn een van de belangrijkste kandidaten voor CF-luchtweggentherapie, voornamelijk omdat ze het therapeutische gen permanent kunnen integreren in de basale cellen van de luchtwegen (stamcellen van de luchtwegen). Dit is belangrijk omdat ze de normale hydratatie en slijmopruiming kunnen herstellen door te differentiëren in functionele gen-gecorrigeerde CF-geassocieerde oppervlaktecellen van de luchtwegen, wat resulteert in levenslange voordelen. LV-vectoren moeten gericht zijn tegen de geleidende luchtweg, aangezien dit is waar CF-longziekte begint. Toediening van de vector dieper in de long kan resulteren in alveolaire transductie, maar dit heeft geen therapeutisch voordeel bij CF. Vloeistoffen zoals gendragers migreren echter van nature naar de alveoli bij inademing na toediening3,4 en therapeutische deeltjes worden snel in de mondholte verwijderd door MCT. De efficiëntie van LV-transductie is direct gerelateerd aan de tijd dat de vector naast doelcellen blijft om cellulaire opname mogelijk te maken - de "residentietijd"5 - die gemakkelijk kan worden verkort door typische regionale luchtstroom en gecoördineerde deeltjes-slijmopvang en MCT. Voor CF is het vermogen om de residentietijd van de LV in de Het is belangrijk om in dit gebied een hoge transductie te bereiken, maar tot nu toe is dit een uitdaging gebleken.
Om dit obstakel te overwinnen, suggereren we dat LV-magnetische deeltjes (MP's) op twee complementaire manieren kunnen helpen. Ten eerste kunnen ze magnetisch naar het oppervlak van de luchtwegen worden geleid om de doelgerichtheid te verbeteren en de gendragerdeeltjes te helpen zich in de gewenste luchtwegregio te bevinden; en ASL) om naar cellaag 6 te bewegen. MP's worden op grote schaal gebruikt als gerichte medicijnafgiftemiddelen wanneer ze zich binden aan antilichamen, chemotherapeutische medicijnen of andere kleine moleculen die zich hechten aan celmembranen of aan relevante receptoren op het celoppervlak en zich ophopen op tumorlocaties in de aanwezigheid van statische elektriciteit. Magnetische velden voor kankerbehandeling 7. Andere "hyperthermale" technieken zijn gericht op het opwarmen van MP's wanneer ze worden blootgesteld aan oscillerende magnetische velden, waardoor tumorcellen worden vernietigd. Het principe van magnetische transfectie, waarbij een magnetisch veld wordt gebruikt als transfectiemiddel om de overdracht van DNA naar cellen te verbeteren, wordt vaak in vitro gebruikt met behulp van een reeks niet-virale en virale genvectoren voor moeilijk te transduceren cellijnen. De effectiviteit van LV-magnetotransfectie is vastgesteld, met in vitro-afgifte van LV-MP's aan een humane bronchiale epitheelcellijn in aanwezigheid van een statisch magnetisch veld, waardoor de transductie-efficiëntie met een factor 186 wordt verhoogd in vergelijking met alleen een LV-vector. LV-MP is ook toegepast op een in vitro CF-model, waarbij magnetische transfectie de LV-transductie in culturen van de lucht-vloeistofinterface met een factor 20 verhoogde in aanwezigheid van CF-sputum10. In vivo-magnetotransfectie van organen heeft echter relatief weinig aandacht gekregen en is slechts bij een paar dieren geëvalueerd studies11,12,13,14,15, vooral in de longen16,17. Niettemin zijn de mogelijkheden voor magnetische transfectie bij CF-longtherapie duidelijk. Tan et al. (2020) stelden dat "een proof-of-concept-studie van efficiënte toediening van magnetische nanodeeltjes in de longen de weg zal vrijmaken voor toekomstige CFTR-inhalatiestrategieën om de klinische resultaten bij CF-patiënten te verbeteren"6.
Het gedrag van kleine magnetische deeltjes op het oppervlak van de luchtwegen in aanwezigheid van een aangelegd magnetisch veld is moeilijk te visualiseren en te bestuderen, en wordt daarom slecht begrepen. In andere onderzoeken hebben we een op synchrotronvoortplanting gebaseerde fasecontraströntgenbeeldvormingsmethode (PB-PCXI) ontwikkeld om op niet-invasieve wijze kleine in-vivoveranderingen in ASL-diepte18 en MCT-gedrag19,20 te visualiseren en te kwantificeren om de hydratatie van het gaskanaaloppervlak direct te meten en te gebruiken als een vroege indicator van de werkzaamheid van de behandeling. Bovendien gebruikt onze MCT-evaluatiemethode deeltjes met een diameter van 10–35 µm die bestaan ​​uit aluminiumoxide of glas met een hoge brekingsindex als MCT-markers die zichtbaar zijn met PB-PCXI21. Beide technieken zijn geschikt voor visualisatie van een reeks deeltjestypen, waaronder MP.
Dankzij de hoge ruimtelijke en temporele resolutie zijn onze op PB-PCXI gebaseerde ASL- en MCT-analysetechnieken uitstekend geschikt voor het onderzoeken van de dynamiek en patronen van het gedrag van afzonderlijke en bulkdeeltjes in vivo, zodat we MP-genafgiftetechnieken beter kunnen begrijpen en optimaliseren. De aanpak die we hier gebruiken, is afgeleid van onze onderzoeken met de SPring-8 BL20B2-bundellijn, waarin we vloeistofbeweging visualiseerden na een schijnbare toediening van een vectordosis in de neus- en longwegen van muizen, om zo onze niet-uniforme genexpressiepatronen te helpen verklaren die werden waargenomen in onze dieronderzoeken met gendragerdoses 3,4 .
Het doel van deze studie was om met behulp van de synchrotron PB-PCXI de in-vivobewegingen van een reeks MP's in de luchtpijp van levende ratten te visualiseren. Deze PB-PCXI-beeldvormingsstudies waren bedoeld om een ​​reeks MP's, magnetische veldsterktes en locaties te testen om hun effect op de MP-beweging te bepalen. We veronderstelden dat een extern aangelegd magnetisch veld de toegediende MP zou helpen om op het doelgebied te blijven of ernaartoe te bewegen. Met deze studies konden we ook magneetconfiguraties identificeren die het aantal deeltjes dat na afzetting in de luchtpijp wordt vastgehouden, maximaliseren. In een tweede reeks studies wilden we deze optimale configuratie gebruiken om het transductiepatroon aan te tonen dat voortvloeit uit in-vivo-toediening van LV-MP's aan de luchtwegen van ratten, op basis van de aanname dat de toediening van LV-MP's in de context van luchtwegtargeting zou resulteren in een verbeterde LV-transductie-efficiëntie.
Alle dierstudies werden uitgevoerd volgens de protocollen die zijn goedgekeurd door de Universiteit van Adelaide (M-2019-060 en M-2020-022) en de SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Experimenten werden uitgevoerd volgens de ARRIVE-richtlijnen.
Alle röntgenbeeldvorming werd uitgevoerd op de BL20XU-bundellijn bij de SPring-8-synchrotron in Japan, met behulp van een opstelling die vergelijkbaar was met die eerder beschreven21,22.Kortom, de experimentele box bevond zich op 245 m van de synchrotron-opslagring.Een afstand van monster tot detector van 0,6 m wordt gebruikt voor deeltjesbeeldvormingsstudies en 0,3 m voor in vivo-beeldvormingsstudies om fasecontrasteffecten te genereren.Een monochromatische bundelenergie van 25 keV werd gebruikt.Beelden werden vastgelegd met behulp van een röntgenconverter met hoge resolutie (SPring-8 BM3) gekoppeld aan een sCMOS-detector.De converter zet röntgenstralen om in zichtbaar licht met behulp van een 10 µm dikke scintillator (Gd3Al2Ga3O12), dat vervolgens naar een sCMOS-sensor wordt gericht met behulp van een × 10 microscoopobjectief (NA 0,3).De sCMOS-detector was Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) met een arraygrootte van 2048 × 2048 pixels en een ruwe pixelgrootte van 6,5 × 6,5 µm. Deze opstelling levert een effectieve isotrope pixelgrootte van 0,51 µm en een gezichtsveld van ongeveer 1,1 mm × 1,1 mm. Een belichtingsduur van 100 ms werd gekozen om de signaal-ruisverhouding van magnetische deeltjes binnen en buiten de luchtwegen te maximaliseren en door ademhaling veroorzaakte bewegingsartefacten te minimaliseren. Voor in-vivo-onderzoeken werd een snelle röntgensluiter in het röntgenpad geplaatst om de stralingsdosis te beperken door de röntgenbundel tussen belichtingen te blokkeren.
De LV-drager werd niet gebruikt in SPring-8 PB-PCXI-beeldvormingsstudies omdat de BL20XU-beeldvormingskamer niet gecertificeerd is op biosafety level 2. In plaats daarvan selecteerden we een reeks goed gekarakteriseerde MP's van twee commerciële leveranciers, die een breed scala aan afmetingen, materialen, ijzerconcentraties en toepassingen bestrijken. Eerst wilden we begrijpen hoe magnetische velden de MP-beweging in glazen capillairen en vervolgens in levende luchtwegen beïnvloeden. op het oppervlak. MP's variëren in grootte van 0,25 tot 18 μm en zijn gemaakt van verschillende materialen (zie tabel 1), maar de samenstelling van elk monster, inclusief de grootte van de magnetische deeltjes in de MP, is onbekend. Op basis van onze uitgebreide MCT-onderzoeken 19, 20, 21, 23, 24 verwachten we dat MP's van slechts 5 μm kunnen worden gezien op het oppervlak van de luchtwegen in de luchtpijp, bijvoorbeeld door opeenvolgende frames af te trekken om de zichtbaarheid van MP-beweging te verbeteren. Een enkele MP van 0,25 μm is kleiner dan de resolutie van het beeldvormende apparaat, maar PB-PCXI zal naar verwachting hun volumecontrast en de beweging van de oppervlaktevloeistof waarop ze na afzetting worden afgezet, detecteren.
Monsters voor elke MP in Tabel 1 werden bereid in glazen capillairen van 20 μl (Drummond Microcaps, PA, VS) met een binnendiameter van 0,63 mm. Corpusculaire deeltjes zijn beschikbaar in water, terwijl CombiMag-deeltjes beschikbaar zijn in de gepatenteerde vloeistof van de fabrikant. Elk buisje is half gevuld met vloeistof (ongeveer 11 μl) en op de monsterhouder geplaatst (zie Afbeelding 1). De glazen capillairen werden horizontaal op het monsterpodium in de beeldvormingsbox geplaatst en de randen van de vloeistof gepositioneerd. Een zeldzame aarde neodymium ijzer boor (NdFeB) magneet met een diameter van 19 mm (28 mm lang) nikkelen mantel (N35, cat. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australië) met een restmagnetisatie van 1,17 Tesla werd bevestigd aan een afzonderlijk translatiepodium om de positie ervan op afstand te kunnen veranderen tijdens het beeldvormingsproces. De röntgenbeeldverwerving begint wanneer de magneet ongeveer 30 mm boven het monster is gepositioneerd en de beelden worden verkregen met een snelheid van 4 beelden per seconde. Tijdens het maken van de foto werd de magneet dicht bij de glazen capillaire buis gebracht (op ongeveer 1 mm afstand) en vervolgens langs de buis bewogen om de effecten van veldsterkte en positie te beoordelen.
In vitro-beeldvormingsopstelling met MP-monsters in glazen capillairen op het xy-translatiestadium van het monster. Het pad van de röntgenbundel is gemarkeerd met een rode stippellijn.
Zodra de in vitro zichtbaarheid van MP's was vastgesteld, werd een subset ervan in vivo getest bij wilde-type vrouwelijke albino Wistar-ratten (~12 weken oud, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) en 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Ratten werden verdoofd met een mengsel van Pharma), Japan) door intraperitoneale injectie. Na anesthesie werden ze voorbereid op beeldvorming door de vacht rond de luchtpijp te verwijderen, een endotracheale tube (ET; 16 Ga iv-canule, Terumo BCT) in te brengen en ze in rugligging te immobiliseren op een op maat gemaakte beeldplaat met een thermische zak om de lichaamstemperatuur te handhaven 22. De beeldplaat werd vervolgens in een kleine hoek aan het monstertranslatiestadium in de beelddoos bevestigd om de luchtpijp horizontaal uit te lijnen in de Röntgenfoto, zoals weergegeven in Figuur 2a.
(a) In vivo-beeldvormingsopstelling in de SPring-8-beeldvormingsbox, het pad van de röntgenbundel is gemarkeerd met een rode stippellijn. (b,c) Magneetlokalisatie op de luchtpijp werd op afstand uitgevoerd met behulp van twee orthogonaal gemonteerde IP-camera's. Aan de linkerkant van het scherm is de draadlus te zien die het hoofd vasthoudt, en de toedieningscanule op zijn plaats in de ET-buis.
Een op afstand bestuurbaar spuitpompsysteem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) met een glazen spuit van 100 μl werd via een naald van 30 Ga aangesloten op een PE10-slang (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm). Markeer de buis om er zeker van te zijn dat de punt zich in de juiste positie in de luchtpijp bevindt bij het inbrengen van de ET-buis. Met behulp van de micropomp werd de zuiger van de spuit teruggetrokken terwijl de punt van de buis was ondergedompeld in het MP-monster dat moest worden toegediend. De geladen toedieningsbuis werd vervolgens in de endotracheale buis geplaatst, waarbij de punt zich in het sterkste deel van ons verwachte toegepaste magnetische veld bevond. De beeldacquisitie werd bestuurd met behulp van een ademhalingsdetector die was aangesloten op onze Arduino-gebaseerde timingbox, en alle signalen (bijv. temperatuur, ademhaling, openen/sluiten van de sluiter en beeldacquisitie) werden vastgelegd met behulp van Powerlab en LabChart (AD Instruments, Sydney, Australië) 22. Bij het maken van foto's Toen de behuizing niet toegankelijk was, werden twee IP-camera's (Panasonic BB-SC382) geplaatst op ongeveer 90° ten opzichte van elkaar en werden gebruikt om de positie van de magneet ten opzichte van de luchtpijp te bewaken tijdens het maken van beelden (Fig. 2b,c). Om bewegingsartefacten te minimaliseren, werd er één beeld per ademhaling gemaakt tijdens het eind-getijdenstroomplateau.
Een magneet is bevestigd aan een tweede podium dat op afstand van de buitenkant van de beeldvormingsbehuizing kan worden geplaatst. Verschillende magneetposities en -configuraties werden getest, waaronder: gemonteerd onder een hoek van ongeveer 30° boven de luchtpijp (configuraties weergegeven in figuur 2a en 3a); één magneet boven het dier en de andere eronder, met polen ingesteld om aan te trekken (figuur 3b); één magneet boven het dier en de andere eronder, met polen ingesteld om af te stoten (figuur 3c); en één magneet boven en loodrecht op de luchtpijp (figuur 3d). Zodra het dier en de magneet zijn geconfigureerd en de te testen MP in de spuitpomp is geladen, dient u een dosis van 50 μl toe met een snelheid van 4 μl/sec terwijl u beelden vastlegt. De magneet wordt vervolgens heen en weer bewogen langs of lateraal over de luchtpijp terwijl u doorgaat met het vastleggen van beelden.
Magneetconfiguratie voor in vivo-beeldvorming: (a) een enkele magneet boven de luchtpijp onder een hoek van ongeveer 30°, (b) twee magneten ingesteld om aan te trekken, (c) twee magneten ingesteld om af te stoten, (d) een enkele magneet boven en loodrecht op de luchtpijp. De waarnemer keek van de mond door de luchtpijp naar de longen, en de röntgenstraal ging door de linkerkant van de rat en verliet hem aan de rechterkant. De magneet wordt óf over de lengte van de luchtwegen bewogen, óf naar links en rechts boven de luchtpijp in de richting van de röntgenstraal.
We wilden ook de zichtbaarheid en het gedrag van deeltjes in de luchtwegen bepalen bij afwezigheid van verstorende ademhaling en hartbewegingen. Daarom werden dieren aan het einde van de beeldvormingsperiode op humane wijze gedood vanwege een overdosis pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, VS; ~65 mg/kg ip). Sommige dieren werden op het beeldvormingsplatform achtergelaten en zodra de ademhaling en hartslag stopten, werd het beeldvormingsproces herhaald, waarbij een extra dosis MP werd toegevoegd als er geen MP zichtbaar was op het oppervlak van de luchtwegen.
De verkregen beelden werden gecorrigeerd voor flat-field en dark-field beelden en vervolgens samengevoegd tot een film (20 frames per seconde; 15-25 × de normale snelheid, afhankelijk van de ademhalingsfrequentie) met behulp van een speciaal script geschreven in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle onderzoeken naar de toediening van LV-genvectoren werden uitgevoerd in het Laboratory Animal Research Facility van de Universiteit van Adelaide en hadden als doel de resultaten van het SPring-8-experiment te gebruiken om te beoordelen of toediening van LV-MP in aanwezigheid van een magnetisch veld de genoverdracht in vivo kon verbeteren. Om de effecten van MP en een magnetisch veld te beoordelen, werden twee groepen dieren behandeld: de ene groep kreeg LV-MP met een geplaatste magneet en de andere groep kreeg een controlegroep met LV-MP zonder magneet.
LV-genvectoren werden gegenereerd met behulp van eerder beschreven methoden 25, 26. De LacZ-vector brengt het in de kern gelokaliseerde bèta-galactosidase-gen tot expressie, aangestuurd door de constitutieve MPSV-promotor (LV-LacZ), dat een blauw reactieproduct produceert in getransduceerde cellen, zichtbaar in longweefselfronten en weefselsecties. Titratie werd uitgevoerd in celculturen door handmatig het aantal LacZ-positieve cellen te tellen met een hemocytometer om de titer te berekenen in TU/ml. Dragers worden cryoconserveerd bij -80 °C, ontdooid vóór gebruik en gebonden aan CombiMag door te mengen in een verhouding van 1:1 en te incuberen op ijs gedurende ten minste 30 minuten vóór toediening.
Normale Sprague Dawley-ratten (n = 3/groep, ~2-3 werden intraperitoneaal verdoofd met een mengsel van 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australië) en 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australië) (een maand oud) ip) injectie en niet-chirurgische orale canulatie met een 16 Ga iv-canule. Om ervoor te zorgen dat het tracheale luchtwegweefsel LV-transductie ontvangt, werd het geconditioneerd met behulp van ons eerder beschreven mechanische perturbatieprotocol, waarbij het oppervlak van de tracheale luchtweg axiaal werd gewreven met een draadmand (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, VS) 30 s28. Tracheale toediening van LV-MP werd vervolgens uitgevoerd in een biologische veiligheidskast ongeveer 10 minuten na perturbatie.
Het magnetische veld dat in dit experiment werd gebruikt, werd op een soortgelijke manier geconfigureerd als het in vivo röntgenbeeldonderzoek, met dezelfde magneten die boven de luchtpijp werden gehouden met behulp van destillatiestentklemmen (Figuur 4). Een volume van 50 μl (2 × 25 μl aliquots) LV-MP werd in de luchtpijp gebracht (n = 3 dieren) met behulp van een pipet met een gelpunt zoals eerder beschreven. Een controlegroep (n = 3 dieren) kreeg dezelfde LV-MP's zonder het gebruik van een magneet. Nadat de infusie is voltooid, wordt de canule uit de ET-tube verwijderd en wordt het dier geëxtubeerd. De magneet blijft 10 minuten op zijn plaats en wordt vervolgens verwijderd. Ratten kregen een subcutane dosis meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australië) gevolgd door opheffing van de anesthesie door middel van een ip-injectie van 1 mg/kg atipamazolhydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australië). Ratten werden warm gehouden en gemonitord tot ze volledig waren hersteld van de anesthesie.
LV-MP-toedieningsapparaat in een biologische veiligheidskast. De lichtgrijze Luer-aansluiting van de ET-tube steekt uit de mond en de gelpunt van de pipet die op de afbeelding wordt weergegeven, wordt via de ET-tube tot de gewenste diepte in de luchtpijp ingebracht.
Eén week na de LV-MP-doseringsprocedure werden de dieren op humane wijze gedood door 100% CO2-inhalatie en werd de LacZ-expressie beoordeeld met behulp van onze standaard X-gal-behandeling. De drie caudale, meest kraakbeenachtige ringen werden verwijderd om ervoor te zorgen dat mechanische schade of vochtretentie door plaatsing van de endotracheale tube niet in de analyse werd opgenomen. Elke luchtpijp werd in de lengte doorgesneden om twee helften te creëren voor analyse, en ze werden in een schaal met siliconenrubber (Sylgard, Dow Inc) geplaatst met behulp van een Minutien-naald (Fine Science Tools) om het luminale oppervlak te visualiseren. De verdeling en het patroon van de getransduceerde cellen werden bevestigd door frontale fotografie met behulp van een Nikon-microscoop (SMZ1500) met een DigiLite-camera en TCapture-software (Tucsen Photonics, China). Beelden werden verkregen met een vergroting van 20x (inclusief de hoogste instelling voor de volledige breedte van de luchtpijp), waarbij de volledige lengte van de luchtpijp stapsgewijs in beeld werd gebracht, waarbij voldoende overlapping tussen elk beeld werd gegarandeerd om de beeldkwaliteit te verbeteren. "stitching". Beelden van elke luchtpijp werden vervolgens samengevoegd tot één samengesteld beeld met behulp van de Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) met behulp van een algoritme voor planaire beweging. LacZ-expressiegebieden in samengestelde beelden van de luchtpijp van elk dier werden gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks) zoals eerder beschreven, met behulp van instellingen van 0,35 < Tint < 0,58, Verzadiging > 0,15 en Waarde < 0,7. Door de contouren van het weefsel te traceren, werd handmatig een masker gegenereerd in GIMP v2.10.24 voor elk samengesteld beeld om het weefselgebied te identificeren en eventuele onjuiste detecties van buiten het luchtpijpweefsel te voorkomen. De gekleurde gebieden van alle samengestelde beelden van elk dier werden opgeteld om het totale gekleurde gebied voor dat dier te genereren. Het gekleurde gebied werd vervolgens gedeeld door het totale maskergebied om het genormaliseerde gebied te genereren.
Elke luchtpijp werd in paraffine ingebed en er werden coupes van 5 μm uitgesneden. De coupes werden gedurende 5 minuten tegengekleurd met neutraal snelrood en de beelden werden verkregen met behulp van een Nikon Eclipse E400-microscoop, DS-Fi3-camera en NIS-elementcapturesoftware (versie 5.20.00).
Alle statistische analyses werden uitgevoerd in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistische significantie werd vastgesteld op p ≤ 0,05. Normaliteit werd geverifieerd met behulp van de Shapiro-Wilk-test en verschillen in LacZ-kleuring werden beoordeeld met behulp van de ongepaarde t-test.
De zes MP's die in Tabel 1 worden beschreven, werden onderzocht met PCXI en de zichtbaarheid wordt beschreven in Tabel 2. Twee polystyreen MP's (MP1 en MP2; respectievelijk 18 μm en 0,25 μm) waren niet zichtbaar onder PCXI, maar de rest van de monsters was identificeerbaar (voorbeelden worden weergegeven in Afbeelding 5). MP3 en MP4 (respectievelijk 10-15% Fe3O4; 0,25 μm en 0,9 μm) zijn vaag zichtbaar. Hoewel ze enkele van de kleinste geteste deeltjes bevatten, was MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) het meest uitgesproken. Het CombiMag-product MP6 is moeilijk te herkennen. In alle gevallen werd ons vermogen om MP te detecteren aanzienlijk verbeterd door de magneet parallel aan de capillair heen en weer te bewegen. Toen de magneten zich van de capillair verwijderden, strekten de deeltjes zich uit in lange strengen, maar naarmate de magneten dichterbij kwamen en de magnetische veldsterkte toenam, korter naarmate de deeltjes naar het bovenoppervlak van de capillair migreerden (zie aanvullende video S1: MP4), waardoor de deeltjesdichtheid van het oppervlak toenam. Omgekeerd, wanneer de magneet uit de capillair wordt verwijderd, neemt de veldsterkte af en herschikken de MP's zich in lange strengen die zich uitstrekken vanaf het bovenoppervlak van de capillair (zie aanvullende video S2: MP4). Nadat de magneet stopt met bewegen, blijven de deeltjes nog een korte tijd bewegen nadat ze de evenwichtspositie hebben bereikt. Terwijl de MP naar het bovenoppervlak van de capillair toe en ervan af beweegt, slepen de magnetische deeltjes het vuil doorgaans door de vloeistof.
De zichtbaarheid van MP onder PCXI varieert aanzienlijk tussen monsters (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6. Alle hier getoonde afbeeldingen zijn gemaakt met een magneet die zich ongeveer 10 mm direct boven de capillair bevindt. De ogenschijnlijk grote cirkels zijn luchtbellen die in de capillairen gevangen zitten en die duidelijk de zwart-witte randkenmerken van fasecontrastbeeldvorming laten zien. Het rode kader bevat de contrastverhogende vergroting. Merk op dat de diameters van de magneetschema's in alle afbeeldingen niet op schaal zijn en ongeveer 100 keer groter zijn dan weergegeven.
Naarmate de magneet naar links en rechts over de bovenkant van de capillair wordt verplaatst, verandert de hoek van de MP-snaar om deze uit te lijnen met de magneet (zie Afbeelding 6), waardoor de magnetische veldlijnen worden afgebakend. Voor MP3-5 worden de deeltjes, nadat de koorde een drempelhoek heeft bereikt, langs het bovenoppervlak van de capillair gesleept. Dit resulteert er vaak in dat MP's zich clusteren in grotere groepen dicht bij waar het magnetische veld het sterkst is (zie Aanvullende video S3:MP5). Dit is ook bijzonder duidelijk bij het maken van opnamen dicht bij het uiteinde van de capillair, waardoor MP's zich samenvoegen en concentreren aan de grensvlak tussen vloeistof en lucht. Deeltjes in MP6, die moeilijker te onderscheiden waren dan MP3-5, werden niet gesleept toen de magneet langs de capillair bewoog, maar de MP-snaren dissocieerden, waardoor de deeltjes in het gezichtsveld achterbleven (zie Aanvullende video S4:MP6). In sommige gevallen, toen het aangelegde magnetische veld werd verminderd door de magneet over een grote afstand van de opnamelocatie te verplaatsen, daalden alle resterende MP's langzaam door de zwaartekracht naar het onderste oppervlak van de buis terwijl ze in de snaar bleven (zie Aanvullende video S5: MP3).
De hoek van de MP-snaar verandert naarmate de magneet boven de capillair naar rechts wordt verplaatst (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6. Het rode vakje bevat de contrastverhogende vergroting. Houd er rekening mee dat de aanvullende video's informatief zijn, omdat ze belangrijke informatie over de deeltjesstructuur en de dynamiek onthullen die niet in deze statische beelden kan worden gevisualiseerd.
Uit onze testen bleek dat het langzaam heen en weer bewegen van de magneet langs de luchtpijp de visualisatie van MP in de context van complexe bewegingen in vivo vergemakkelijkt. Er werden geen in-vivo-tests uitgevoerd omdat polystyreenkorrels (MP1 en MP2) niet zichtbaar waren in de capillair. Elk van de overige vier MP's werd in vivo getest met de lange as van de magneet geconfigureerd boven de luchtpijp in een hoek van ongeveer 30° ten opzichte van de verticale as (zie figuur 2b en 3a), omdat dit resulteerde in langere MP-ketens en effectiever was dan de beëindigde magneetconfiguratie. MP3, MP4 en MP6 werden niet gedetecteerd in de luchtpijp van levende dieren. Bij het in beeld brengen van de luchtwegen van ratten nadat de dieren op humane wijze waren gedood, bleven de deeltjes onzichtbaar, zelfs toen er extra volume werd toegevoegd met behulp van een spuitpomp. MP5 had het hoogste ijzeroxidegehalte en was het enige zichtbare deeltje en werd daarom gebruikt om het in-vivo-gedrag van MP te beoordelen en te karakteriseren.
Door de magneet boven de luchtpijp te plaatsen tijdens de MP-afgifte, werden veel, maar niet alle, MP's geconcentreerd in het gezichtsveld. Deeltjes die de luchtpijp binnendringen, kunnen het beste worden waargenomen bij op humane wijze opgeofferde dieren. Figuur 7 en aanvullende video S6: MP5 tonen snelle magnetische vangst en uitlijning van deeltjes op het oppervlak van de ventrale luchtpijp, wat aangeeft dat MP's naar gewenste delen van de luchtpijp kunnen worden geleid. Bij het zoeken verder distaal langs de luchtpijp na MP-afgifte, werden enkele MP's dichter bij de carina gevonden, wat suggereert dat de magnetische veldsterkte onvoldoende was om alle MP's te verzamelen en vast te houden, omdat ze werden afgegeven via het gebied met de maximale magnetische veldsterkte tijdens het vloeistofproces. Niettemin waren de MP-concentraties na de bevalling hoger rond het afgebeelde gebied, wat suggereert dat veel MP's achterbleven in de luchtweggebieden waar de toegepaste magnetische veldsterkte het hoogst was.
Afbeeldingen van (a) vóór en (b) ná toediening van MP5 in de luchtpijp van een onlangs geëuthanaseerde rat, waarbij de magneet direct boven het beeldvormingsgebied is geplaatst. Het afgebeelde gebied bevindt zich tussen de twee kraakbeenringen. Vóór toediening van MP5 bevindt zich wat vloeistof in de luchtwegen. Het rode vakje bevat de contrastversterkende vergroting. Deze afbeeldingen zijn afkomstig uit de video die wordt getoond in Aanvullende video S6:MP5.
Door de magneet in vivo langs de luchtpijp te verplaatsen, veranderde de hoek van de MP-keten binnen het oppervlak van de luchtwegen op een manier die vergelijkbaar is met die in haarvaten (zie Afbeelding 8 en Aanvullende video S7:MP5). In ons onderzoek konden MP's echter niet over het oppervlak van de levende luchtwegen worden gesleept zoals dat met haarvaten wel kon. In sommige gevallen wordt de MP-keten langer naarmate de magneet naar links en rechts beweegt. Interessant genoeg ontdekten we ook dat de deeltjesreeks de diepte van de oppervlaktevloeistoflaag lijkt te veranderen wanneer de magneet in de lengterichting langs de luchtpijp wordt bewogen, en uitzet wanneer de magneet recht boven het hoofd wordt bewogen en de deeltjesreeks naar een verticale positie wordt gedraaid (zie Aanvullende video S7). : MP5 op 0:09, rechtsonder). Het karakteristieke bewegingspatroon veranderde wanneer de magneet lateraal over de bovenkant van de luchtpijp werd bewogen (dat wil zeggen, naar links of rechts van het dier in plaats van over de lengte van de luchtpijp). De deeltjes waren nog steeds duidelijk zichtbaar terwijl ze bewogen, maar toen de magneet uit de luchtpijp werd verwijderd, werden de uiteinden van de deeltjesreeksen zichtbaar (zie aanvullende video S8:MP5, vanaf 0:08). Dit komt overeen met het MP-gedrag dat we observeerden onder een aangelegd magnetisch veld in een glazen capillair.
Voorbeeldafbeeldingen van MP5 in de luchtpijp van een levende, verdoofde rat. (a) De magneet wordt gebruikt om afbeeldingen te maken van boven en links van de luchtpijp, en vervolgens (b) nadat de magneet naar rechts is verplaatst. Het rode vakje bevat de contrastversterkende vergroting. Deze afbeeldingen zijn afkomstig uit de video die wordt getoond in Aanvullende video S7:MP5.
Toen de twee polen in een noord-zuid-oriëntatie boven en onder de trachea werden geconfigureerd (d.w.z. aantrekkend; Afb. 3b), leken de MP-koorden langer en bevonden ze zich op de zijwand van de trachea in plaats van op het dorsale oppervlak van de trachea (zie Aanvullende video S9:MP5). Echter, hoge concentraties van deeltjes op één locatie (d.w.z. het dorsale oppervlak van de trachea) werden niet gedetecteerd na toediening van vloeistof wanneer een apparaat met twee magneten werd gebruikt, wat doorgaans gebeurt wanneer een apparaat met één magneet wordt gebruikt. Toen vervolgens één magneet werd geconfigureerd om de omgekeerde polen af ​​te stoten (Afb. 3c), leek het aantal zichtbare deeltjes in het gezichtsveld niet toe te nemen na toediening. De opstelling van beide configuraties met twee magneten is een uitdaging vanwege de hoge magnetische veldsterktes die de magneten respectievelijk trekken of duwen. De opstelling werd vervolgens veranderd naar een enkele magneet parallel aan de luchtweg, maar onder een hoek van 90 graden door de luchtweg, zodat de veldlijnen de tracheawand orthogonaal kruisten (Afb. 3d), een oriëntatie ontworpen om te bepalen of deeltjesaggregatie aan de zijwand kon worden waargenomen. In deze configuratie was er echter geen identificeerbare beweging van MP-accumulatie of magneetbeweging. Op basis van al deze resultaten werd een configuratie met één magneet en een oriëntatie van 30 graden (Figuur 3a) gekozen voor in vivo-gendragerstudies.
Toen het dier direct na de humane doding herhaaldelijk werd afgebeeld, betekende de afwezigheid van verstorende weefselbeweging dat er fijnere en kortere deeltjeslijnen te onderscheiden waren in het heldere interchondrale veld, "wiebelig" in lijn met de translationele beweging van de magneet. Desondanks kunnen de aanwezigheid en beweging van MP6-deeltjes nog steeds niet duidelijk worden waargenomen.
De LV-LacZ-titer bedroeg 1,8 × 108 TU/ml en na 1:1-menging met CombiMag MP (MP6) ontvingen de dieren een tracheale dosis van 50 μl van 9 × 107 TU/ml LV-vehikel (d.w.z. 4,5 × 106 TU/rat). In deze onderzoeken hebben we, in plaats van de magneet tijdens de bevalling te transleren, de magneet op één positie vastgezet om te bepalen of de LV-transductie (a) verbeterd kon worden in vergelijking met vectortoediening bij afwezigheid van een magnetisch veld, en (b) gericht kon worden. Luchtwegcellen worden getransduceerd naar magnetische doelgebieden van de bovenste luchtwegen.
De aanwezigheid van magneten en het gebruik van CombiMag in combinatie met LV-vectoren leken geen nadelige effecten te hebben op de gezondheid van dieren, in tegenstelling tot ons standaardprotocol voor toediening van LV-vectoren. Frontale beelden van de tracheale regio die werd blootgesteld aan mechanische verstoring (aanvullende figuur 1) gaven aan dat er significant hogere niveaus van transductie waren in de groep dieren die werden behandeld met LV-MP wanneer de magneet aanwezig was (figuur 9a). Er was slechts een kleine hoeveelheid blauwe LacZ-kleuring aanwezig in de controlegroep (figuur 9b). Kwantificering van genormaliseerde X-Gal-gekleurde gebieden toonde aan dat toediening van LV-MP in aanwezigheid van een magnetisch veld een ongeveer 6-voudige verbetering opleverde (figuur 9c).
Voorbeelden van samengestelde afbeeldingen van tracheale transductie door LV-MP (a) in aanwezigheid van een magnetisch veld en (b) bij afwezigheid van een magneet. (c) Statistisch significante verbetering van het genormaliseerde LacZ-transductiegebied in de trachea bij gebruik van de magneet (*p = 0,029, t-test, n = 3 per groep, gemiddelde ± SEM).
In neutrale snelrood gekleurde secties (voorbeeld weergegeven in aanvullende figuur 2) werden LacZ-gekleurde cellen aangetroffen in een vergelijkbaar patroon en op dezelfde locatie als eerder gerapporteerd.
Een belangrijke uitdaging voor gentherapie van de luchtwegen is de nauwkeurige lokalisatie van dragerdeeltjes in de interessegebieden en het bereiken van een hoge transductie-efficiëntie in de bewegende long in aanwezigheid van luchtstroom en actieve slijmopruiming. Voor LV-dragers die zijn ontworpen voor de behandeling van CF-luchtwegaandoeningen, was het verlengen van de verblijftijd van dragerdeeltjes in de geleidende luchtwegen een tot nu toe onbereikbaar doel. Zoals aangegeven door Castellani et al., heeft het gebruik van magnetische velden om de transductie te verbeteren voordelen ten opzichte van andere genafgiftemethoden zoals elektroporatie, omdat het eenvoud, kosteneffectiviteit, lokalisatie van de afgifte, verhoogde efficiëntie en kortere incubatietijden kan combineren, en mogelijk een kleinere dragerdosis10. De in vivo-afzetting en het gedrag van magnetische deeltjes in de luchtwegen onder invloed van externe magnetische krachten zijn echter nog nooit beschreven, en de haalbaarheid van deze methode om in vivo de genexpressieniveaus in intacte levende luchtwegen te verbeteren, is ook nog nooit daadwerkelijk aangetoond.
Uit onze in vitro synchrotron PCXI-experimenten bleek dat alle geteste deeltjes, met uitzondering van polystyreen MP, zichtbaar waren in de beeldopstelling die we gebruikten. In aanwezigheid van een magnetisch veld vormen MP's snaren waarvan de lengte verband houdt met het type deeltje en de sterkte van het magnetische veld (d.w.z. de nabijheid en beweging van de magneet). Zoals weergegeven in Afbeelding 10, worden de snaren die we waarnemen gevormd doordat elk individueel deeltje wordt gemagnetiseerd en zijn eigen lokale magnetische veld induceert. Deze afzonderlijke velden zorgen ervoor dat andere, vergelijkbare deeltjes samenklonteren en zich verbinden, met groepachtige snaarachtige bewegingen als gevolg van de lokale aantrekkingskrachten en afstotende krachten van andere deeltjes.
Schematische weergave van (a,b) deeltjestreinen die ontstaan ​​in met vloeistof gevulde haarvaten en (c,d) met lucht gevulde luchtpijp. Let op: de haarvaten en de luchtpijp zijn niet op schaal getekend. Paneel (a) bevat ook een beschrijving van het MP, dat Fe3O4-deeltjes bevat die in strengen zijn gerangschikt.
Toen de magneet boven de capillair werd bewogen, bereikte de hoek van de deeltjesreeks een kritische drempelwaarde voor MP3-5 met Fe3O4, waarna de deeltjesreeks niet langer in de oorspronkelijke positie bleef, maar langs het oppervlak naar een nieuwe positie bewoog.magneet.Dit effect treedt waarschijnlijk op omdat het oppervlak van de glazen capillair glad genoeg is om deze beweging mogelijk te maken.Interessant genoeg gedroeg MP6 (CombiMag) zich niet op deze manier, mogelijk omdat de deeltjes kleiner waren, verschillende coatings of oppervlakteladingen hadden, of omdat een gepatenteerde dragervloeistof hun bewegingsvermogen beïnvloedde.Het beeldcontrast van CombiMag-deeltjes is ook zwakker, wat suggereert dat de vloeistof en de deeltjes vergelijkbare dichtheden kunnen hebben en daarom niet gemakkelijk naar elkaar toe bewegen.Deeltjes kunnen ook vastlopen als de magneet te snel beweegt, wat aangeeft dat de magnetische veldsterkte niet altijd de wrijving tussen deeltjes in de vloeistof kan overwinnen, wat suggereert dat het misschien niet verrassend is dat de magnetische veldsterkte en de afstand tussen de magneet en het doelgebied Zeer belangrijk.Samengevat suggereren deze resultaten ook dat, hoewel magneten veel MP's kunnen vangen die door het doelgebied stromen, het onwaarschijnlijk is dat er op magneten vertrouwd kan worden om CombiMag-deeltjes over het oppervlak van de luchtpijp te verplaatsen. Daarom concluderen we dat in vivo LV-MP-onderzoeken gebruik moeten maken van statische magnetische velden om specifieke gebieden van de luchtwegen fysiek te targeten.
Wanneer deeltjes in het lichaam worden afgeleverd, zijn ze moeilijk te identificeren in de context van complex bewegend lichaamsweefsel, maar het vermogen om ze te detecteren werd verbeterd door de magneet horizontaal boven de luchtpijp te verplaatsen om de MP-snaren te "wiebelen". Hoewel live-imaging mogelijk is, is het gemakkelijker om de beweging van deeltjes te onderscheiden nadat het dier op humane wijze is gedood. De MP-concentraties waren over het algemeen het hoogst op deze locatie wanneer de magneet boven het beeldgebied was geplaatst, hoewel sommige deeltjes meestal verderop in de luchtpijp werden gevonden. In tegenstelling tot in-vitrostudies kunnen deeltjes niet door de luchtpijp worden gesleept door de magneet te verplaatsen. Deze bevinding komt overeen met hoe het slijm dat het oppervlak van de luchtpijp bedekt, doorgaans ingeademde deeltjes verwerkt, ze in het slijm opsluit en vervolgens door het mucociliaire verwijderingsmechanisme wordt verwijderd.
We veronderstelden dat het gebruik van magneten voor aantrekking boven en onder de luchtpijp (Fig. 3b) zou kunnen resulteren in een uniformer magnetisch veld, in plaats van een magnetisch veld dat sterk geconcentreerd is op één punt, wat mogelijk leidt tot een uniformere verdeling van deeltjes. Ons voorlopige onderzoek vond echter geen duidelijk bewijs om deze hypothese te ondersteunen. Evenzo resulteerde het configureren van een paar magneten om af te stoten (Fig. 3c) niet in meer deeltjesafzetting in het afgebeelde gebied. Deze twee bevindingen tonen aan dat de opstelling met twee magneten de lokale controle van MP-targeting niet significant verbetert en dat de resulterende sterke magnetische krachten moeilijk te configureren zijn, wat deze aanpak minder praktisch maakt. Evenzo verhoogde het oriënteren van de magneet boven en door de luchtpijp (Fig. 3d) ook niet het aantal deeltjes dat in het afgebeelde gebied werd vastgehouden. Sommige van deze alternatieve configuraties zijn mogelijk niet succesvol omdat ze resulteren in lagere magnetische veldsterktes in het afzettingsgebied. Daarom wordt de configuratie met één magneet met een hoek van 30 graden (Fig. 3a) beschouwd als de gemakkelijkste en meest efficiënte methode voor in vivo testen.
Uit het LV-MP-onderzoek bleek dat wanneer LV-vectoren werden gecombineerd met CombiMag en toegediend na een fysieke verstoring in de aanwezigheid van een magnetisch veld, de transductieniveaus in de luchtpijp aanzienlijk toenamen in vergelijking met de controlegroep. Op basis van de synchrotronbeeldvormingsstudies en de LacZ-resultaten was het magnetische veld blijkbaar in staat om de LV in de luchtpijp te behouden en het aantal vectordeeltjes dat direct diep in de longen doordrong te verminderen. Dergelijke doelgerichte verbeteringen kunnen leiden tot een hogere werkzaamheid en tegelijkertijd de toegediende titers, off-target transductie, ontstekings- en immuunbijwerkingen en gendragerkosten verminderen. Belangrijk is dat CombiMag volgens de fabrikant kan worden gebruikt in combinatie met andere genoverdrachtmethoden, waaronder andere virale vectoren (zoals AAV) en nucleïnezuren.