Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript.
Genvectoren voor de behandeling van longziekte bij cystische fibrose moeten zich richten op de geleidende luchtwegen, omdat transductie in de perifere longen geen therapeutisch voordeel oplevert. De efficiëntie van virale transductie is direct gerelateerd aan de verblijftijd van de vector. Toedieningsvloeistoffen zoals gendragers diffunderen echter van nature in de alveoli tijdens de inspiratie, en therapeutische deeltjes van welke vorm dan ook worden snel verwijderd door mucociliair transport. Het verlengen van de verblijftijd van gendragers in de luchtwegen is belangrijk, maar moeilijk te bereiken. Met gendragers geconjugeerde magnetische deeltjes die naar het oppervlak van de luchtwegen kunnen worden geleid, kunnen de regionale targeting verbeteren. Vanwege de uitdagingen van in vivo visualisatie is het gedrag van dergelijke kleine magnetische deeltjes op het luchtwegoppervlak in aanwezigheid van een aangelegd magnetisch veld slecht begrepen. Het doel van deze studie was om synchrotronbeeldvorming te gebruiken om de in vivo beweging van een reeks magnetische deeltjes in de trachea van verdoofde ratten te visualiseren en zo de dynamiek en patronen van individueel en bulkgedrag van deeltjes in vivo te onderzoeken. Vervolgens hebben we ook onderzocht of de toediening van lentivirale magnetische deeltjes in aanwezigheid van een magnetisch veld de transductie zou verhogen. De efficiëntie in de trachea van ratten. Synchrotron-röntgenbeeldvorming onthult het gedrag van magnetische deeltjes in stationaire en bewegende magnetische velden in vitro en in vivo. Deeltjes kunnen niet gemakkelijk met magneten over het oppervlak van de levende luchtwegen worden getrokken, maar tijdens het transport concentreren de afzettingen zich in het gezichtsveld waar het magnetische veld het sterkst is. De transductie-efficiëntie werd ook zesvoudig verhoogd wanneer lentivirale magnetische deeltjes werden toegediend in aanwezigheid van een magnetisch veld. Samen suggereren deze resultaten dat lentivirale magnetische deeltjes en magnetische velden waardevolle benaderingen kunnen zijn om de gerichte toediening van genvectoren te verbeteren en de transductieniveaus in geleidende luchtwegen in vivo te verhogen.
Cystische fibrose (CF) wordt veroorzaakt door een variatie in één enkel gen, de CF-transmembraan-geleidingsregulator (CFTR). Het CFTR-eiwit is een ionenkanaal dat aanwezig is in veel epitheelcellen in het hele lichaam, waaronder de luchtwegen, een belangrijke plaats in de pathogenese van CF. CFTR-defecten leiden tot abnormaal watertransport, waardoor het luchtwegoppervlak uitdroogt en de dikte van de luchtwegoppervlaktevloeistoflaag (ASL) afneemt. Dit belemmert ook het vermogen van het mucociliaire transportsysteem (MCT) om ingeademde deeltjes en ziekteverwekkers uit de luchtwegen te verwijderen. Ons doel is om een ​​lentivirale (LV) gentherapie te ontwikkelen die de juiste kopie van het CFTR-gen levert en de ASL, MCT en longgezondheid verbetert, en om nieuwe technologieën te blijven ontwikkelen die deze parameters in vivo kunnen meten.
LV-vectoren behoren tot de meest veelbelovende kandidaten voor gentherapie in de luchtwegen bij CF, met name omdat ze het therapeutische gen permanent kunnen integreren in de basale cellen van de luchtwegen (luchtwegstamcellen). Dit is belangrijk omdat ze de normale hydratatie en slijmklaring kunnen herstellen door te differentiëren tot functionele, gen-gecorrigeerde, CF-geassocieerde oppervlaktecellen van de luchtwegen, wat levenslange voordelen oplevert. LV-vectoren moeten gericht zijn op de geleidende luchtwegen, aangezien de longziekte bij CF daar begint. Toediening van de vector dieper in de longen kan leiden tot alveolaire transductie, maar dit heeft geen therapeutisch voordeel bij CF. Vloeistoffen zoals gendragers migreren echter van nature naar de alveoli bij inspiratie na toediening3,4 en therapeutische deeltjes worden snel via MCT naar de mondholte afgevoerd. De transductie-efficiëntie van LV is direct gerelateerd aan de tijdsduur dat de vector zich naast de doelcellen bevindt om cellulaire opname mogelijk te maken – de "verblijftijd"5 – die gemakkelijk wordt verkort door de typische regionale luchtstroom, evenals door gecoördineerde opname van de deeltjes door slijm en MCT. Voor CF is het vermogen om de verblijftijd van de LV in de luchtwegen te verlengen van groot belang. Het bereiken van hoge transductieniveaus in dit gebied is tot nu toe een uitdaging gebleken.
Om dit obstakel te overwinnen, suggereren we dat LV magnetische deeltjes (MP's) op twee complementaire manieren kunnen helpen. Ten eerste kunnen ze magnetisch naar het luchtwegoppervlak worden geleid om de targeting te verbeteren en ervoor te zorgen dat de gendragende deeltjes zich in het gewenste luchtweggebied bevinden; en ten tweede kunnen ze magnetisch naar cellaag 6 worden geleid. MP's worden al veelvuldig gebruikt als gerichte medicijntoedieningssystemen wanneer ze zich binden aan antilichamen, chemotherapeutische geneesmiddelen of andere kleine moleculen die zich hechten aan celmembranen of aan relevante celoppervlakreceptoren en zich ophopen op tumorlocaties in aanwezigheid van statische elektriciteit. Magnetische velden voor kankerbehandeling 7. Andere "hyperthermische" technieken zijn erop gericht om MP's te verhitten wanneer ze worden blootgesteld aan oscillerende magnetische velden, waardoor tumorcellen worden vernietigd. Het principe van magnetische transfectie, waarbij een magnetisch veld wordt gebruikt als transfectiemiddel om de overdracht van DNA naar cellen te verbeteren, wordt in vitro vaak gebruikt met een reeks niet-virale en virale genvectoren voor moeilijk te transduceren cellijnen. De effectiviteit van LV-magnetotransfectie is aangetoond, waarbij in vitro toediening van LV-MP's aan een humane bronchiale epitheelcellijn in aanwezigheid van een statisch magnetisch veld de transductie-efficiëntie met een factor 186 verhoogde in vergelijking met alleen de LV-vector. LV-MP is ook toegepast op een in vitro CF-model, waarbij magnetische transfectie de LV-transductie in lucht-vloeistof-grensvlakculturen met een factor 20 verhoogde in aanwezigheid van CF-sputum10. In vivo magnetotransfectie van organen heeft echter relatief weinig aandacht gekregen en is slechts bij een paar dieren geëvalueerd. studies11,12,13,14,15, vooral in de longen16,17. Niettemin zijn de mogelijkheden voor magnetische transfectie in CF-longtherapie duidelijk. Tan et al. (2020) stelden dat "een proof-of-conceptstudie van efficiënte pulmonale toediening van magnetische nanodeeltjes de weg zal banen voor toekomstige CFTR-inhalatiestrategieën om de klinische resultaten bij CF-patiënten te verbeteren"6.
Het gedrag van kleine magnetische deeltjes op luchtwegoppervlakken in aanwezigheid van een aangelegd magnetisch veld is moeilijk te visualiseren en te bestuderen, en daardoor slecht begrepen. In andere studies hebben we een op synchrotronstraling gebaseerde fasecontrast-röntgenbeeldvormingsmethode (PB-PCXI) ontwikkeld om niet-invasief minuscule in vivo veranderingen in de ASL-diepte18 en MCT-gedrag19,20 te visualiseren en te kwantificeren, om zo direct de hydratatie van het gaskanaaloppervlak te meten en te gebruiken als vroege indicator voor de effectiviteit van de behandeling. Daarnaast maakt onze MCT-evaluatiemethode gebruik van deeltjes met een diameter van 10-35 µm, bestaande uit aluminiumoxide of glas met een hoge brekingsindex, als MCT-markers die zichtbaar zijn met behulp van PB-PCXI21. Beide technieken zijn geschikt voor de visualisatie van een reeks deeltjestypen, waaronder MP.
Door de hoge ruimtelijke en temporele resolutie zijn onze op PB-PCXI gebaseerde ASL- en MCT-analysetechnieken zeer geschikt voor het onderzoeken van de dynamiek en patronen van het gedrag van individuele en bulkdeeltjes in vivo, zodat we MP-genafgiftetechnieken beter kunnen begrijpen en optimaliseren. De aanpak die we hier gebruiken, is afgeleid van onze studies met de SPring-8 BL20B2-bundellijn, waarbij we vloeistofbewegingen visualiseerden na toediening van een schijnvectordosis in de neus- en longluchtwegen van muizen. Dit hielp ons de niet-uniforme genexpressiepatronen te verklaren die we waarnamen in onze dierstudies met genendragerdoses 3,4.
Het doel van deze studie was om met behulp van de synchrotron PB-PCXI de in vivo bewegingen van een reeks microdeeltjes (MP's) in de trachea van levende ratten te visualiseren. Deze PB-PCXI-beeldvormingsstudies waren ontworpen om een ​​reeks MP's, magnetische veldsterktes en locaties te testen om hun effect op de MP-beweging te bepalen. We veronderstelden dat een extern aangelegd magnetisch veld de toegediende MP zou helpen om in het doelgebied te blijven of ernaartoe te bewegen. Deze studies stelden ons ook in staat om magneetconfiguraties te identificeren die het aantal deeltjes dat na depositie in de trachea achterblijft maximaliseren. In een tweede reeks studies probeerden we deze optimale configuratie te gebruiken om het transductiepatroon aan te tonen dat resulteert uit in vivo toediening van LV-MP's aan de luchtwegen van ratten, gebaseerd op de veronderstelling dat de toediening van LV-MP's in de context van gerichte toediening aan de luchtwegen zou resulteren in een verbeterde LV-transductie-efficiëntie.
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door de Universiteit van Adelaide (M-2019-060 en M-2020-022) en de SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. De experimenten werden uitgevoerd volgens de ARRIVE-richtlijnen.
Alle röntgenbeelden werden gemaakt op de BL20XU-bundellijn van het SPring-8-synchrotron in Japan, met behulp van een opstelling vergelijkbaar met die eerder beschreven21,22. Kort gezegd bevond de experimentele box zich op 245 m afstand van de synchrotron-opslagring. Een afstand van 0,6 m tussen monster en detector werd gebruikt voor deeltjesbeeldvormingsstudies en 0,3 m voor in vivo-beeldvormingsstudies om fasecontrasteffecten te genereren. Er werd een monochromatische bundelenergie van 25 keV gebruikt. Beelden werden vastgelegd met behulp van een röntgenconverter met hoge resolutie (SPring-8 BM3) gekoppeld aan een sCMOS-detector. De converter zet röntgenstralen om in zichtbaar licht met behulp van een 10 µm dikke scintillator (Gd3Al2Ga3O12), dat vervolgens naar een sCMOS-sensor wordt geleid met behulp van een ×10 microscoopobjectief (NA 0,3). De sCMOS-detector was een Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) met een De arraygrootte bedraagt ​​2048 × 2048 pixels en de ruwe pixelgrootte is 6,5 × 6,5 µm. Deze opstelling levert een effectieve isotrope pixelgrootte van 0,51 µm en een gezichtsveld van ongeveer 1,1 mm × 1,1 mm op. Een belichtingstijd van 100 ms werd gekozen om de signaal-ruisverhouding van magnetische deeltjes binnen en buiten de luchtwegen te maximaliseren en tegelijkertijd bewegingsartefacten als gevolg van de ademhaling te minimaliseren. Voor in vivo-onderzoeken werd een snelle röntgensluiter in het röntgenpad geplaatst om de stralingsdosis te beperken door de röntgenbundel tussen de opnames te blokkeren.
De LV-drager werd niet gebruikt in SPring-8 PB-PCXI-beeldvormingsstudies, omdat de BL20XU-beeldvormingskamer niet gecertificeerd is volgens bioveiligheidsniveau 2. In plaats daarvan selecteerden we een reeks goed gekarakteriseerde microdeeltjes (MP's) van twee commerciële leveranciers – met verschillende afmetingen, materialen, ijzerconcentraties en toepassingen – om eerst te begrijpen hoe magnetische velden de beweging van MP's in glazen capillairen beïnvloeden, en vervolgens in levende luchtwegen. Op het oppervlak variëren de groottes van de MP's van 0,25 tot 18 μm en zijn ze gemaakt van verschillende materialen (zie Tabel 1), maar de samenstelling van elk monster, inclusief de grootte van de magnetische deeltjes in de MP, is onbekend. Op basis van onze uitgebreide MCT-studies 19, 20, 21, 23, 24 verwachten we dat MP's zo klein als 5 μm zichtbaar kunnen zijn op het oppervlak van de tracheale luchtweg, bijvoorbeeld door opeenvolgende frames van elkaar af te trekken om de beweging van de MP's beter zichtbaar te maken. Een enkele MP van 0,25 μm is kleiner dan de resolutie van het beeldvormingsapparaat, maar PB-PCXI zal naar verwachting het volumecontrast en de beweging van de oppervlaktevloeistof waarop ze na afzetting zijn afgezet, detecteren.
Voor elk MP in Tabel 1 werden monsters bereid in glazen capillairen van 20 μl (Drummond Microcaps, PA, VS) met een binnendiameter van 0,63 mm. Corpusculaire deeltjes zijn verkrijgbaar in water, terwijl CombiMag-deeltjes verkrijgbaar zijn in de gepatenteerde vloeistof van de fabrikant. Elk buisje werd half gevuld met vloeistof (ongeveer 11 μl) en op de monsterhouder geplaatst (zie Figuur 1). De glazen capillairen werden horizontaal op de monsterhouder in de beeldvormingsbox geplaatst en aan de randen van de vloeistof gepositioneerd. Een nikkelen neodymium-ijzer-boor (NdFeB) magneet met een diameter van 19 mm (28 mm lang) en een restmagnetisatie van 1,17 Tesla werd bevestigd aan een aparte translatie-eenheid om de positie ervan op afstand te kunnen wijzigen tijdens de beeldvorming. De röntgenbeeldacquisitie begint wanneer de magneet zich op ongeveer 30 mm boven het monster bevindt en er worden beelden vastgelegd met een snelheid van 4 frames per seconde. Ten tweede werd tijdens de beeldvorming de magneet dicht bij het glazen capillairbuisje gebracht (op ongeveer 1 mm afstand) en vervolgens langs het buisje bewogen om de effecten van veldsterkte en positie te beoordelen.
In vitro beeldvormingsopstelling met MP-monsters in glazen capillairen op een xy-translatieplatform voor monsters. Het pad van de röntgenstraal is aangegeven met een rode stippellijn.
Nadat de zichtbaarheid van MP's in vitro was vastgesteld, werd een subset ervan in vivo getest bij vrouwelijke albino Wistar-ratten van het wildtype (~12 weken oud, ~200 g). Ratten werden verdoofd met een mengsel van 0,24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) en 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma), Japan) via intraperitoneale injectie. Na de verdoving werden ze voorbereid op beeldvorming door de vacht rond de trachea te verwijderen, een endotracheale tube (ET; 16 Ga iv canule, Terumo BCT) in te brengen en ze in rugligging te immobiliseren op een speciaal vervaardigde beeldplaat met een thermische zak om de lichaamstemperatuur te handhaven.22 De beeldplaat werd vervolgens onder een lichte hoek aan het translatieplatform van het monster in de beeldvormingsbox bevestigd om de trachea horizontaal in de röntgenfoto uit te lijnen. afbeelding, zoals weergegeven in Figuur 2a.
(a) In vivo beeldvormingsopstelling in de SPring-8 beeldvormingsbox; het pad van de röntgenstraal is gemarkeerd met een rode stippellijn. (b,c) De magneetlokalisatie op de trachea werd op afstand uitgevoerd met behulp van twee orthogonaal gemonteerde IP-camera's. Aan de linkerkant van het scherm is de draadlus te zien die het hoofd vasthoudt, en de toedieningscanule op zijn plaats in de endotracheale tube.
Een op afstand bediende spuitpomp (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) met een glazen spuit van 100 μl werd via een naald van 30 Ga verbonden met PE10-slang (buitendiameter 0,61 mm, binnendiameter 0,28 mm). Markeer de slang om ervoor te zorgen dat de punt zich in de juiste positie in de trachea bevindt bij het inbrengen van de endotracheale tube. Met behulp van de micropomp werd de zuiger van de spuit teruggetrokken terwijl de punt van de slang in het toe te dienen MP-monster werd ondergedompeld. De gevulde toedieningsslang werd vervolgens in de endotracheale tube ingebracht, waarbij de punt zich in het sterkste deel van ons verwachte aangelegde magnetische veld bevond. Beeldacquisitie werd gecontroleerd met behulp van een ademhalingsdetector die was aangesloten op onze op Arduino gebaseerde timingbox, en alle signalen (bijv. temperatuur, ademhaling, openen/sluiten van de sluiter en beeldacquisitie) werden geregistreerd met Powerlab en LabChart (AD Instruments, Sydney, Australië) 22. Tijdens het maken van beelden, wanneer de behuizing ontoegankelijk was, werden twee IP-camera's (Panasonic BB-SC382) op ongeveer De magneten stonden 90° ten opzichte van elkaar en werden gebruikt om de positie van de magneet ten opzichte van de trachea tijdens de beeldvorming te controleren (Fig. 2b,c). Om bewegingsartefacten te minimaliseren, werd één beeld per ademhaling verkregen tijdens het plateau van de eind-expiratoire stroom.
Een magneet is bevestigd aan een tweede trap die op afstand van de beeldvormingsbehuizing kan worden geplaatst. Verschillende magneetposities en -configuraties werden getest, waaronder: gemonteerd onder een hoek van ongeveer 30° boven de trachea (configuraties weergegeven in figuren 2a en 3a); één magneet boven het dier en de andere eronder, met de polen zo ingesteld dat ze elkaar aantrekken (figuur 3b); één magneet boven het dier en de andere eronder, met de polen zo ingesteld dat ze elkaar afstoten (figuur 3c); en één magneet boven en loodrecht op de trachea (figuur 3d). Zodra het dier en de magneet zijn geconfigureerd en de te testen MP in de spuitpomp is geladen, wordt een dosis van 50 μl toegediend met een snelheid van 4 μl/sec terwijl beelden worden gemaakt. De magneet wordt vervolgens heen en weer bewogen langs of zijdelings over de trachea, terwijl de beeldvorming wordt voortgezet.
Magneetconfiguratie voor in vivo beeldvorming: (a) één magneet boven de trachea onder een hoek van ongeveer 30°, (b) twee magneten die elkaar aantrekken, (c) twee magneten die elkaar afstoten, (d) één magneet boven en loodrecht in de trachea. De waarnemer keek van de mond naar de longen door de trachea, en de röntgenstraal ging door de linkerkant van de rat en verliet het lichaam aan de rechterkant. De magneet werd ofwel langs de lengte van de luchtweg bewogen, ofwel links en rechts boven de trachea in de richting van de röntgenstraal.
We wilden ook de zichtbaarheid en het gedrag van deeltjes in de luchtwegen bepalen in afwezigheid van verstorende ademhaling en hartbeweging. Daarom werden de dieren aan het einde van de beeldvormingsperiode op humane wijze gedood door een overdosis pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, VS; ~65 mg/kg ip). Sommige dieren bleven op het beeldvormingsplatform liggen en zodra de ademhaling en hartslag stopten, werd het beeldvormingsproces herhaald, waarbij een extra dosis MP werd toegevoegd als er geen MP zichtbaar was op het oppervlak van de luchtwegen.
De verkregen beelden werden vlakveld- en donkerveldgecorrigeerd en vervolgens samengevoegd tot een film (20 beelden per seconde; 15-25 × normale snelheid, afhankelijk van de ademhalingsfrequentie) met behulp van een aangepast script geschreven in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle studies naar de toediening van LV-genvectoren werden uitgevoerd in de proefdierfaciliteit van de Universiteit van Adelaide. Het doel was om de resultaten van het SPring-8-experiment te gebruiken om te beoordelen of de toediening van LV-MP in aanwezigheid van een magnetisch veld de genoverdracht in vivo kon verbeteren. Om de effecten van MP en een magnetisch veld te beoordelen, werden twee groepen dieren behandeld: de ene groep kreeg LV-MP toegediend met een magneet, en de andere groep ontving een controlegroep met LV-MP zonder magneet.
LV-genvectoren werden gegenereerd met behulp van eerder beschreven methoden 25, 26. De LacZ-vector brengt het nucleair gelokaliseerde bèta-galactosidase-gen tot expressie, aangedreven door de constitutieve MPSV-promotor (LV-LacZ), wat een blauw reactieproduct oplevert in getransduceerde cellen, zichtbaar in longweefselfronten en weefselcoupes. Titratie werd uitgevoerd in celculturen door handmatig het aantal LacZ-positieve cellen te tellen met een hemocytometer om de titer in TU/ml te berekenen. Dragers worden cryogepreserveerd bij -80 °C, ontdooid voor gebruik en gebonden aan CombiMag door te mengen in een verhouding van 1:1 en ten minste 30 minuten op ijs te incuberen vóór toediening.
Normale Sprague Dawley-ratten (n = 3/groep, ~2-3 werden intraperitoneaal verdoofd met een mengsel van 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australië) en 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australië) via een intraperitoneale injectie en niet-chirurgische orale canulatie met een 16 Ga iv-canule. Om ervoor te zorgen dat het tracheale luchtwegweefsel LV-transductie ontvangt, werd het geconditioneerd met behulp van ons eerder beschreven protocol voor mechanische verstoring, waarbij het tracheale luchtwegoppervlak axiaal werd gewreven met een draadmandje (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115 -UDH, Cook Medical, VS) gedurende 30 seconden. Tracheale toediening van LV-MP werd vervolgens uitgevoerd in een biologische veiligheidskast, ongeveer 10 minuten na de verstoring.
Het magnetische veld dat in dit experiment werd gebruikt, was op een vergelijkbare manier geconfigureerd als bij het in vivo röntgenbeeldvormingsonderzoek, waarbij dezelfde magneten boven de trachea werden gehouden met behulp van destillatie-stentclips (Figuur 4). Een volume van 50 μl (2 × 25 μl aliquots) LV-MP werd in de trachea toegediend (n = 3 dieren) met behulp van een pipet met een geltip, zoals eerder beschreven. Een controlegroep (n = 3 dieren) ontving dezelfde LV-MP's zonder gebruik van een magneet. Nadat de infusie was voltooid, werd de canule van de endotracheale tube verwijderd en werd het dier geëxtubeerd. De magneet bleef 10 minuten op zijn plaats en werd vervolgens verwijderd. Ratten kregen een subcutane dosis meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australië), gevolgd door het opheffen van de anesthesie door middel van een intraperitoneale injectie van 1 mg/kg atipamazolhydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australië). De ratten werden warm gehouden en gecontroleerd tot volledig herstel. anesthesie.
LV-MP-toedieningsapparaat in een biologische veiligheidskast. De lichtgrijze Luer-aansluiting van de endotracheale tube steekt uit de mond en de geltip van de pipet, zoals op de afbeelding te zien, wordt via de endotracheale tube tot de gewenste diepte in de trachea ingebracht.
Een week na de LV-MP-dosering werden de dieren op humane wijze gedood door inhalatie van 100% CO2 en werd de LacZ-expressie beoordeeld met behulp van onze standaard X-gal-behandeling. De drie meest caudale kraakbeenringen werden verwijderd om ervoor te zorgen dat eventuele mechanische schade of vochtophoping als gevolg van de plaatsing van de endotracheale tube niet in de analyse werd meegenomen. Elke trachea werd in de lengte doorgesneden om twee helften te creëren voor analyse, en deze werden in een schaal met siliconenrubber (Sylgard, Dow Inc) geplaatst met behulp van een Minutien-naald (Fine Science Tools) om het luminale oppervlak te visualiseren. De distributie en het patroon van getransduceerde cellen werden bevestigd door frontale fotografie met behulp van een Nikon-microscoop (SMZ1500) met een DigiLite-camera en TCapture-software (Tucsen Photonics, China). Beelden werden verkregen met een vergroting van 20x (inclusief de hoogste instelling voor de volledige breedte van de trachea), waarbij de gehele lengte van de trachea stap voor stap werd gefotografeerd, met voldoende overlap tussen de beelden om beeldvorming mogelijk te maken. “Stitching”.Afbeeldingen van elke trachea werden vervolgens samengevoegd tot één composietafbeelding met behulp van Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) en een planaire bewegingsalgoritme. LacZ-expressiegebieden in de composietafbeeldingen van de trachea van elk dier werden gekwantificeerd met behulp van een geautomatiseerd MATLAB-script (R2020a, MathWorks), zoals eerder beschreven, met instellingen van 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 en Value < 0,7. Door de contouren van het weefsel te traceren, werd handmatig een masker gegenereerd in GIMP v2.10.24 voor elke composietafbeelding om het weefselgebied te identificeren en valse detecties van buiten het tracheaweefsel te voorkomen. De gekleurde gebieden van alle composietafbeeldingen van elk dier werden opgeteld om het totale gekleurde gebied voor dat dier te genereren. Het gekleurde gebied werd vervolgens gedeeld door het totale maskergebied om het genormaliseerde gebied te genereren.
Elke trachea werd ingebed in paraffine en er werden coupes van 5 μm dik gesneden. De coupes werden gedurende 5 minuten nagekleurd met neutraal snelrood en de beelden werden vastgelegd met behulp van een Nikon Eclipse E400 microscoop, een DS-Fi3 camera en NIS element capture software (versie 5.20.00).
Alle statistische analyses werden uitgevoerd in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistische significantie werd vastgesteld op p ≤ 0,05. Normaliteit werd geverifieerd met behulp van de Shapiro-Wilk-test en verschillen in LacZ-kleuring werden beoordeeld met behulp van de ongepaarde t-test.
De zes MP's beschreven in Tabel 1 werden onderzocht met behulp van PCXI, en de zichtbaarheid wordt beschreven in Tabel 2. Twee polystyreen MP's (MP1 en MP2; respectievelijk 18 μm en 0,25 μm) waren niet zichtbaar onder PCXI, maar de rest van de monsters was wel identificeerbaar (voorbeelden zijn te zien in Figuur 5). MP3 en MP4 (10-15% Fe3O4; respectievelijk 0,25 μm en 0,9 μm) zijn vaag zichtbaar. Hoewel MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) enkele van de kleinste geteste deeltjes bevatte, was deze het meest prominent. Het CombiMag-product MP6 is moeilijk te detecteren. In alle gevallen werd ons vermogen om MP's te detecteren aanzienlijk verbeterd door de magneet heen en weer te bewegen parallel aan de capillaire buis. Wanneer de magneten zich van de capillaire buis verwijderden, strekten de deeltjes zich uit in lange strengen, maar naarmate de magneten dichterbij kwamen en de magnetische veldsterkte toenam, werden de deeltjesstrengen korter. De deeltjes migreerden naar het bovenoppervlak van de capillair (zie aanvullende video S1: MP4), waardoor de deeltjesdichtheid van het oppervlak toenam. Omgekeerd, wanneer de magneet uit de capillair wordt verwijderd, neemt de veldsterkte af en herschikken de MP's zich tot lange slierten die zich uitstrekken vanaf het bovenoppervlak van de capillair (zie aanvullende video S2: MP4). Nadat de magneet stopt met bewegen, blijven de deeltjes nog even bewegen nadat ze de evenwichtspositie hebben bereikt. Terwijl de MP's naar en van het bovenoppervlak van de capillair bewegen, slepen de magnetische deeltjes het vuil doorgaans door de vloeistof.
De zichtbaarheid van MP onder PCXI varieert aanzienlijk tussen de monsters. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6. Alle hier getoonde afbeeldingen zijn gemaakt met een magneet die zich ongeveer 10 mm recht boven de capillair bevond. De ogenschijnlijk grote cirkels zijn luchtbellen die in de capillairen zijn opgesloten en die duidelijk de zwart-witte randkenmerken van fasecontrastbeeldvorming laten zien. Het rode kader bevat de contrastverhogende vergroting. Merk op dat de diameters van de magneetschema's in alle figuren niet op schaal zijn en ongeveer 100 keer groter zijn dan weergegeven.
Terwijl de magneet langs de bovenkant van de capillaire buis naar links en rechts wordt bewogen, verandert de hoek van de MP-streng om zich uit te lijnen met de magneet (zie Figuur 6), waardoor de magnetische veldlijnen worden afgebakend. Voor MP3-5 worden de deeltjes, nadat de streng een drempelhoek heeft bereikt, meegesleept over het bovenoppervlak van de capillaire buis. Dit resulteert vaak in het clusteren van MP's in grotere groepen dicht bij de plek waar het magnetische veld het sterkst is (zie Aanvullende Video S3:MP5). Dit is ook met name duidelijk bij het afbeelden dicht bij het uiteinde van de capillaire buis, waardoor MP's aggregeren en zich concentreren aan het vloeistof-luchtgrensvlak. Deeltjes in MP6, die moeilijker te onderscheiden waren dan MP3-5, werden niet meegesleept toen de magneet langs de capillaire buis bewoog, maar de MP-strengen braken af, waardoor de deeltjes in het beeldveld achterbleven (zie Aanvullende Video S4:MP6). In sommige gevallen, wanneer het aangelegde magnetische veld werd verminderd door de magneet over een grote afstand van de beeldlocatie te verplaatsen, daalden de resterende MP's langzaam door de zwaartekracht naar het bodemoppervlak van de buis, terwijl ze in de streng bleven (zie Aanvullende Video). S5: MP3).
De hoek van de MP-string verandert wanneer de magneet naar rechts boven de capillaire buis wordt verschoven. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6. Het rode kader bevat de contrastverhogende vergroting. Merk op dat de aanvullende video's informatief zijn, omdat ze belangrijke informatie over de deeltjesstructuur en -dynamiek onthullen die niet zichtbaar is in deze statische afbeeldingen.
Uit onze tests bleek dat het langzaam heen en weer bewegen van de magneet langs de trachea de visualisatie van MP in de context van complexe bewegingen in vivo vergemakkelijkt. In vivo testen werden niet uitgevoerd omdat polystyreenbolletjes (MP1 en MP2) niet zichtbaar waren in de capillairen. Elk van de overige vier MP's werd in vivo getest met de lange as van de magneet boven de trachea onder een hoek van ongeveer 30° ten opzichte van de verticaal (zie figuren 2b en 3a), aangezien dit resulteerde in langere MP-ketens en effectiever was dan de magneetconfiguratie zonder de lange as. MP3, MP4 en MP6 werden niet gedetecteerd in de trachea van levende dieren. Toen de luchtwegen van ratten werden afgebeeld nadat de dieren op humane wijze waren gedood, bleven de deeltjes onzichtbaar, zelfs wanneer extra volume werd toegevoegd met behulp van een spuitpomp. MP5 had het hoogste ijzeroxidegehalte en was het enige zichtbare deeltje; het werd daarom gebruikt om het in vivo gedrag van MP te beoordelen en te karakteriseren.
Het plaatsen van de magneet boven de trachea tijdens de toediening van MP resulteerde in de concentratie van veel, maar niet alle, MP's in het gezichtsveld. Deeltjes die de trachea binnenkomen, kunnen het best worden waargenomen bij dieren die op humane wijze zijn geëuthanaseerd. Figuur 7 en aanvullende video S6: MP5 toont snelle magnetische aantrekking en uitlijning van deeltjes op het oppervlak van de ventrale trachea, wat aangeeft dat MP's naar gewenste delen van de trachea kunnen worden geleid. Bij verder distaal zoeken langs de trachea na de toediening van MP's werden sommige MP's dichter bij de carina gevonden, wat suggereert dat de magnetische veldsterkte onvoldoende was om alle MP's te verzamelen en vast te houden, aangezien ze tijdens het vloeistofproces door het gebied met de maximale magnetische veldsterkte werden toegediend. Desondanks waren de postpartum MP-concentraties hoger rond het afgebeelde gebied, wat suggereert dat veel MP's achterbleven in de luchtweggebieden waar de toegepaste magnetische veldsterkte het hoogst was.
Afbeeldingen van (a) vóór en (b) na toediening van MP5 in de trachea van een recent geëuthanaseerde rat, waarbij de magneet direct boven het beeldvormingsgebied is geplaatst. Het afgebeelde gebied bevindt zich tussen de twee kraakbeenringen. Vóór de toediening van MP5 is er wat vocht in de luchtwegen aanwezig. Het rode kader bevat de contrastverhogende vergroting. Deze afbeeldingen zijn afkomstig uit de video in Aanvullende Video S6:MP5.
Door de magneet in vivo langs de trachea te bewegen, veranderde de MP-keten van hoek binnen het luchtwegoppervlak op een manier die vergelijkbaar is met wat in capillairen wordt waargenomen (zie Figuur 8 en Aanvullende Video S7:MP5). In ons onderzoek konden de MP's echter niet over het oppervlak van de levende luchtweg worden gesleept zoals dat wel mogelijk was met capillairen. In sommige gevallen werd de MP-keten langer naarmate de magneet naar links en rechts bewoog. Interessant genoeg ontdekten we ook dat de deeltjesketen de diepte van de oppervlaktevloeistoflaag lijkt te veranderen wanneer de magneet in de lengterichting langs de trachea wordt bewogen, en uitzet wanneer de magneet recht boven de trachea wordt bewogen en de deeltjesketen verticaal wordt gedraaid (zie Aanvullende Video S7). (MP5 op 0:09, rechtsonder). Het karakteristieke bewegingspatroon veranderde toen de magneet zijdelings over de bovenkant van de trachea werd bewogen (dat wil zeggen, naar links of rechts van het dier in plaats van in de lengte van de trachea). De deeltjes waren nog steeds duidelijk zichtbaar tijdens hun beweging, maar toen de magneet van de trachea werd verwijderd, werden de uiteinden van de deeltjesstrengen zichtbaar (zie aanvullende video S8:MP5, vanaf 0:08). Dit komt overeen met het MP-gedrag dat we observeerden onder een aangelegd magnetisch veld in een glazen capillair.
Voorbeeldafbeeldingen van MP5 in de trachea van een levende, verdoofde rat. (a) De magneet wordt gebruikt om afbeeldingen boven en links van de trachea te maken, vervolgens (b) nadat de magneet naar rechts is bewogen. Het rode kader bevat de contrastverhogende vergroting. Deze afbeeldingen zijn afkomstig uit de video in Aanvullende Video S7:MP5.
Toen de twee polen in een noord-zuidrichting boven en onder de trachea waren geplaatst (d.w.z. elkaar aantrekkend; Fig. 3b), leken de MP-koorden langer en bevonden ze zich aan de zijwand van de trachea in plaats van aan het dorsale trachea-oppervlak (zie Aanvullende Video S9:MP5). Er werden echter geen hoge concentraties deeltjes op één locatie (d.w.z. het dorsale oppervlak van de trachea) gedetecteerd na toediening van vloeistof bij gebruik van een apparaat met twee magneten, wat doorgaans wel gebeurt bij gebruik van een apparaat met één magneet. Toen vervolgens één magneet zo werd geconfigureerd dat deze de polen afstootte (Fig. 3c), leek het aantal deeltjes dat zichtbaar was in het gezichtsveld na toediening niet toe te nemen. De configuratie van beide apparaten met twee magneten is lastig vanwege de hoge magnetische veldsterkten die de magneten respectievelijk aantrekken of afstoten. De configuratie werd vervolgens gewijzigd naar een enkele magneet parallel aan de luchtweg, maar die loodrecht door de luchtweg liep, zodat de veldlijnen de tracheawand loodrecht kruisten (Fig. 3d), een oriëntatie die is ontworpen om te bepalen als er deeltjesaggregatie op de zijwand kon worden waargenomen. In deze configuratie was er echter geen waarneembare beweging van MP-accumulatie of magneetbeweging. Op basis van al deze resultaten werd een configuratie met één magneet en een oriëntatie van 30 graden (Figuur 3a) gekozen voor in vivo genendragerstudies.
Toen het dier direct na de humane euthanasie herhaaldelijk werd afgebeeld, betekende de afwezigheid van storende weefselbewegingen dat fijnere en kortere deeltjeslijnen konden worden waargenomen in het heldere interchondrale veld, "wiebelend" in lijn met de translatiebeweging van de magneet. Desondanks is de aanwezigheid en beweging van MP6-deeltjes nog steeds niet duidelijk zichtbaar.
De LV-LacZ-titer was 1,8 × 10⁸ TU/ml, en na 1:1 menging met CombiMag MP (MP6) kregen de dieren een tracheale dosis van 50 μl van 9 × 10⁷ TU/ml LV-vehikel (d.w.z. 4,5 × 10⁶ TU/rat). In deze studies hebben we de magneet niet tijdens de bevalling verplaatst, maar in één positie gefixeerd om te bepalen of LV-transductie (a) verbeterd kon worden in vergelijking met vectortoediening zonder magnetisch veld, en (b) gericht kon worden. Luchtwegcellen worden getransduceerd naar magnetische doelgebieden van de bovenste luchtwegen.
De aanwezigheid van magneten en het gebruik van CombiMag in combinatie met LV-vectoren bleken geen nadelige effecten te hebben op de gezondheid van de dieren, net als ons standaardprotocol voor de toediening van LV-vectoren. Frontale beelden van het tracheale gebied dat aan mechanische verstoring werd blootgesteld (aanvullende figuur 1) toonden aan dat er significant hogere transductieniveaus waren in de groep dieren die met LV-MP werden behandeld wanneer de magneet aanwezig was (figuur 9a). Slechts een kleine hoeveelheid blauwe LacZ-kleuring was aanwezig in de controlegroep (figuur 9b). Kwantificering van de genormaliseerde X-Gal-gekleurde gebieden toonde aan dat toediening van LV-MP in aanwezigheid van een magnetisch veld een verbetering van ongeveer zesvoudig opleverde (figuur 9c).
Voorbeeld van samengestelde afbeeldingen die tracheale transductie door LV-MP laten zien (a) in aanwezigheid van een magnetisch veld en (b) in afwezigheid van een magneet. (c) Statistisch significante verbetering in het genormaliseerde LacZ-transductiegebied in de trachea bij gebruik van de magneet (*p = 0,029, t-test, n = 3 per groep, gemiddelde ± SEM).
Neutraal fast red-gekleurde coupes (voorbeeld weergegeven in Aanvullende Figuur 2) lieten LacZ-gekleurde cellen zien in een vergelijkbaar patroon en op een vergelijkbare locatie als eerder gerapporteerd.
Een belangrijke uitdaging voor gentherapie in de luchtwegen blijft de nauwkeurige lokalisatie van dragerdeeltjes in de gewenste gebieden en het bereiken van een hoge transductie-efficiëntie in de bewegende long, in aanwezigheid van luchtstroom en actieve slijmklaring. Voor LV-dragers die zijn ontworpen voor de behandeling van CF-gerelateerde luchtwegaandoeningen, is het verlengen van de verblijftijd van de dragerdeeltjes in de geleidende luchtwegen tot nu toe een ongrijpbaar doel gebleven. Zoals Castellani et al. hebben aangegeven, heeft het gebruik van magnetische velden om de transductie te verbeteren voordelen ten opzichte van andere methoden voor genafgifte, zoals elektroporatie, omdat het eenvoud, kosteneffectiviteit, lokalisatie van de afgifte, verhoogde efficiëntie, kortere incubatietijden en mogelijk een lagere dragerdosis kan combineren.¹⁰ De in vivo depositie en het gedrag van magnetische deeltjes in de luchtwegen onder invloed van externe magnetische krachten zijn echter nog nooit beschreven, noch is de haalbaarheid van deze methode in vivo aangetoond om de genexpressie in intacte, levende luchtwegen te verhogen.
Onze in vitro synchrotron PCXI-experimenten toonden aan dat alle deeltjes die we testten, met uitzondering van polystyreen-MP, zichtbaar waren in de gebruikte beeldvormingsopstelling. In aanwezigheid van een magnetisch veld vormen MP's strengen waarvan de lengte afhankelijk is van het deeltjestype en de sterkte van het magnetische veld (d.w.z. de nabijheid en beweging van de magneet). Zoals weergegeven in figuur 10, worden de waargenomen strengen gevormd doordat elk afzonderlijk deeltje gemagnetiseerd is en zijn eigen lokale magnetische veld induceert. Deze afzonderlijke velden zorgen ervoor dat andere soortgelijke deeltjes samenklonteren en verbinding maken, met groepsachtige, snaarachtige bewegingen als gevolg van lokale krachten van de lokale aantrekkingskrachten en afstotende krachten van andere deeltjes.
Schematische weergave van (a,b) deeltjesstromen gegenereerd in met vloeistof gevulde capillairen en (c,d) met lucht gevulde trachea. Merk op dat de capillairen en trachea niet op schaal zijn getekend. Paneel (a) bevat ook een beschrijving van de MP, die Fe3O4-deeltjes bevat die in strengen zijn gerangschikt.
Toen de magneet boven de capillaire buis werd bewogen, bereikte de hoek van de deeltjesstreng een kritische drempelwaarde voor MP3-5 met Fe3O4, waarna de deeltjesstreng niet langer op de oorspronkelijke positie bleef, maar zich langs het oppervlak naar een nieuwe positie verplaatste. Dit effect treedt waarschijnlijk op omdat het glazen capillaire oppervlak glad genoeg is om deze beweging mogelijk te maken. Interessant genoeg gedroeg MP6 (CombiMag) zich niet op deze manier, mogelijk omdat de deeltjes kleiner waren, andere coatings of oppervlakteladingen hadden, of omdat een gepatenteerde dragervloeistof hun bewegingsvermogen beïnvloedde. Het beeldcontrast van CombiMag-deeltjes is ook zwakker, wat suggereert dat de vloeistof en de deeltjes mogelijk een vergelijkbare dichtheid hebben en daardoor niet gemakkelijk naar elkaar toe bewegen. Deeltjes kunnen ook vast komen te zitten als de magneet te snel beweegt, wat aangeeft dat de magnetische veldsterkte niet altijd de wrijving tussen de deeltjes in de vloeistof kan overwinnen. Dit suggereert dat het wellicht niet verrassend is dat de magnetische veldsterkte en de afstand tussen de magneet en het doelgebied zeer belangrijk zijn. Samengevat suggereren deze resultaten ook dat, hoewel magneten veel MP's kunnen vangen die door het doelgebied stromen, het onwaarschijnlijk is dat magneten kan erop vertrouwd worden dat CombiMag-deeltjes zich langs het oppervlak van de trachea verplaatsen. Daarom concluderen we dat in vivo LV-MP-onderzoeken gebruik moeten maken van statische magnetische velden om specifieke gebieden van de luchtwegen fysiek te targeten.
Wanneer deeltjes in het lichaam terechtkomen, zijn ze moeilijk te identificeren in de context van complex bewegend lichaamsweefsel. De mogelijkheid om ze te detecteren werd echter verbeterd door de magneet horizontaal boven de trachea te bewegen om de MP-strengen te laten "wiebelen". Hoewel live beeldvorming mogelijk is, is het gemakkelijker om de beweging van deeltjes te onderscheiden nadat het dier op humane wijze is gedood. De MP-concentraties waren over het algemeen het hoogst op deze locatie wanneer de magneet boven het beeldvormingsgebied was geplaatst, hoewel er meestal ook deeltjes verderop in de trachea werden gevonden. In tegenstelling tot in vitro-onderzoeken kunnen deeltjes niet langs de trachea worden meegesleept door de magneet te bewegen. Deze bevinding is consistent met de manier waarop het slijm dat het oppervlak van de trachea bedekt, ingeademde deeltjes verwerkt, ze in het slijm vasthoudt en vervolgens verwijdert via het mucociliaire klaringmechanisme.
We veronderstelden dat het gebruik van magneten voor aantrekking boven en onder de trachea (Fig. 3b) zou kunnen resulteren in een gelijkmatiger magnetisch veld, in plaats van een sterk geconcentreerd magnetisch veld op één punt, wat mogelijk zou leiden tot een gelijkmatigere verdeling van de deeltjes. Ons vooronderzoek leverde echter geen duidelijk bewijs op ter ondersteuning van deze hypothese. Evenmin resulteerde het configureren van een paar magneten die elkaar afstoten (Fig. 3c) in een grotere deeltjesafzetting in het afgebeelde gebied. Deze twee bevindingen tonen aan dat de opstelling met twee magneten de lokale controle van de MP-targeting niet significant verbetert en dat de resulterende sterke magnetische krachten moeilijk te configureren zijn, waardoor deze aanpak minder praktisch is. Ook het oriënteren van de magneet boven en door de trachea (Fig. 3d) leidde niet tot een toename van het aantal deeltjes dat in het afgebeelde gebied werd vastgehouden. Sommige van deze alternatieve configuraties zijn mogelijk niet succesvol omdat ze resulteren in lagere magnetische veldsterkten binnen het afzettingsgebied. Daarom wordt de configuratie met één magneet onder een hoek van 30 graden (Fig. 3a) beschouwd als de eenvoudigste en meest efficiënte methode voor in vivo testen.
Uit het LV-MP-onderzoek bleek dat wanneer LV-vectoren werden gecombineerd met CombiMag en toegediend na fysieke verstoring in aanwezigheid van een magnetisch veld, de transductieniveaus in de trachea significant hoger waren dan bij de controlegroep. Op basis van de synchrotron-beeldvormingsstudies en LacZ-resultaten bleek het magnetische veld de LV in de trachea te behouden en het aantal vectordeeltjes te verminderen dat direct diep in de longen doordrong. Dergelijke verbeteringen in de targeting kunnen leiden tot een hogere werkzaamheid, terwijl de toegediende titers, off-target transductie, inflammatoire en immuungerelateerde bijwerkingen en de kosten van de genendrager worden verlaagd. Belangrijk is dat CombiMag volgens de fabrikant kan worden gebruikt in combinatie met andere gentransfermethoden, waaronder met andere virale vectoren (zoals AAV) en nucleïnezuren.