Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset støtte for CSS. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi vise nettstedet uten stiler og JavaScript.
Genvektorer for behandling av cystisk fibrose i lungene bør målrette de ledende luftveiene fordi perifer lungetransduksjon ikke gir terapeutisk fordel. Viral transduksjonseffektivitet er direkte relatert til vektorens oppholdstid. Imidlertid diffunderer leveringsvæsker som genbærere naturlig inn i alveolene under inspirasjon, og terapeutiske partikler av enhver form fjernes raskt ved mukociliær transport. Å forlenge oppholdstiden til genbærere i luftveiene er viktig, men vanskelig å oppnå. Genbærerkonjugerte magnetiske partikler som kan rettes mot overflaten av luftveiene, kan forbedre regional målretting. På grunn av utfordringene med in vivo-visualisering er oppførselen til slike små magnetiske partikler på luftveisoverflaten i nærvær av et påført magnetfelt dårlig forstått. Målet med denne studien var å bruke synkrotronavbildning for å visualisere in vivo-bevegelsen til en serie magnetiske partikler i luftrøret til bedøvede rotter for å undersøke dynamikken og mønstrene til individuell og bulkopartikkeloppførsel in vivo. Vi vurderte deretter også om levering av lentivirale magnetiske partikler i nærvær av et magnetfelt ville øke transduksjonseffektiviteten hos rotten. luftrøret. Synkrotronrøntgenavbildning avslører oppførselen til magnetiske partikler i stasjonære og bevegelige magnetfelt in vitro og in vivo. Partikler kan ikke lett dras langs overflaten av den levende luftveien med magneter, men under transport konsentreres avleiringene i synsfeltet der magnetfeltet er sterkest. Transduksjonseffektiviteten ble også seksdoblet når lentivirale magnetiske partikler ble levert i nærvær av et magnetfelt. Samlet sett tyder disse resultatene på at lentivirale magnetiske partikler og magnetfelt kan være verdifulle tilnærminger for å forbedre genvektormålretting og øke transduksjonsnivåene i ledende luftveier in vivo.
Cystisk fibrose (CF) er forårsaket av variasjon i et enkelt gen kalt CF transmembrankonduktansregulator (CFTR). CFTR-proteinet er en ionekanal som er tilstede i mange epitelceller i hele kroppen, inkludert de ledende luftveiene, et viktig sted for CF-patogenese. CFTR-defekter fører til unormal vanntransport, dehydrering av luftveisoverflaten og reduksjon av dybden av luftveisoverflatevæskelaget (ASL). Dette svekker også evnen til det mukociliære transportsystemet (MCT) til å fjerne inhalerte partikler og patogener fra luftveiene. Målet vårt er å utvikle en lentiviral (LV) genterapi for å levere riktig kopi av CFTR-genet og forbedre ASL-, MCT- og lungehelsen, og å fortsette å utvikle nye teknologier som er i stand til å måle disse parametrene in vivo1.
LV-vektorer er en av de ledende kandidatene for genterapi for CF-luftveier, hovedsakelig fordi de permanent kan integrere det terapeutiske genet i luftveisbasalcellene (luftveisstamceller). Dette er viktig fordi de kan gjenopprette normal hydrering og slimfjerning ved å differensiere til funksjonelle genkorrigerte CF-assosierte luftveisoverflateceller, noe som resulterer i livslange fordeler. LV-vektorer bør rettes mot den ledende luftveien, da det er her CF-lungesykdom begynner. Levering av vektoren dypere inn i lungen kan føre til alveolær transduksjon, men dette har ingen terapeutisk fordel ved CF. Imidlertid migrerer væsker som genbærere naturlig til alveolene ved inspirasjon etter levering3,4 og terapeutiske partikler fjernes raskt inn i munnhulen ved MCT. LV-transduksjonseffektiviteten er direkte relatert til hvor lenge vektoren forblir ved siden av målcellene for å tillate cellulært opptak – "oppholdstiden"5 – som lett reduseres av typisk regional luftstrøm samt koordinert partikkelslimfangst og MCT. For CF er evnen til å forlenge oppholdstiden til LV i luftveien viktig for å oppnå høye nivåer av transduksjon i denne regionen, men har så langt vært utfordrende.
For å overvinne denne hindringen foreslår vi at LV-magnetiske partikler (MP-er) kan hjelpe på to komplementære måter. For det første kan de magnetisk styres til luftveisoverflaten for å forbedre målretting og hjelpe genbærerpartiklene med å befinne seg i det ønskede luftveisområdet; og ASL) for å bevege seg til cellelag 6. MP-er har blitt mye brukt som målrettede legemiddelleveringsvehikler når de binder seg til antistoffer, cellegift eller andre små molekyler som fester seg til cellemembraner eller binder seg til relevante celleoverflatereseptorer og akkumuleres på tumorsteder i nærvær av statisk elektrisitet. Magnetiske felt for kreftbehandling 7. Andre "hypertermiske" teknikker tar sikte på å varme opp MP-er når de utsettes for oscillerende magnetfelt, og dermed ødelegge tumorceller. Prinsippet for magnetisk transfeksjon, der et magnetfelt brukes som et transfeksjonsmiddel for å forbedre overføringen av DNA til celler, brukes ofte in vitro ved bruk av en rekke ikke-virale og virale genvektorer for vanskelig transduserende cellelinjer. Effektiviteten av LV-magnetotransfeksjon er fastslått, med in vitro-levering av LV-MP-er til en human bronkial epitelcellelinje i nærvær av et statisk magnetfelt, noe som øker transduksjonseffektiviteten med 186 ganger sammenlignet med LV-vektor alene. LV-MP har også blitt brukt på en in vitro CF-modell, der magnetisk transfeksjon økte LV-transduksjon i luft-væske-grensesnittkulturer med 20 ganger i nærvær av CF-sputum10. Imidlertid har in vivo magnetotransfeksjon av organer fått relativt lite oppmerksomhet og har bare blitt evaluert i noen få dyreforsøk. studier11,12,13,14,15, spesielt i lungene16,17. Likevel er mulighetene for magnetisk transfeksjon i CF-lungebehandling klare. Tan et al. (2020) uttalte at «en proof-of-concept-studie av effektiv pulmonal levering av magnetiske nanopartikler vil bane vei for fremtidige CFTR-inhalasjonsstrategier for å forbedre kliniske resultater hos CF-pasienter»6.
Oppførselen til små magnetiske partikler på luftveisoverflater i nærvær av et påført magnetfelt er vanskelig å visualisere og studere, og dermed dårlig forstått. I andre studier utviklet vi en synkrotronforplantningsbasert fasekontrastrøntgenavbildningsmetode (PB-PCXI) for ikke-invasivt å visualisere og kvantifisere små in vivo-endringer i ASL-dybde18 og MCT-oppførsel19,20 for direkte å måle gasskanaloverflatehydrering og brukt som en tidlig indikator på behandlingseffektivitet. I tillegg bruker vår MCT-evalueringsmetode partikler med en diameter på 10–35 µm bestående av alumina eller glass med høy brytningsindeks som MCT-markører synlige ved bruk av PB-PCXI21. Begge teknikkene er egnet for visualisering av en rekke partikkeltyper, inkludert MP.
På grunn av den høye romlige og tidsmessige oppløsningen er våre PB-PCXI-baserte ASL- og MCT-analyseteknikker godt egnet for å undersøke dynamikken og mønstrene til enkelt- og bulkopartikkelatferd in vivo for å hjelpe oss med å forstå og optimalisere MP-genleveringsteknikker. Tilnærmingen vi bruker her stammer fra våre studier med SPring-8 BL20B2-strålelinjen, der vi visualiserte væskebevegelse etter sham-vektordoselevering i nese- og pulmonale luftveier hos mus for å bidra til å forklare våre ikke-uniforme genuttrykksmønstre observert i våre dyrestudier med genbærerdose 3,4.
Målet med denne studien var å bruke synkrotronen PB-PCXI til å visualisere in vivo-bevegelsene til en serie MP-er i luftrøret til levende rotter. Disse PB-PCXI-avbildningsstudiene ble utformet for å teste en rekke MP-er, magnetfeltstyrker og plasseringer for å bestemme deres effekt på MP-bevegelse. Vi antok at et eksternt påført magnetfelt ville hjelpe den leverte MP-en med å holde seg eller bevege seg til målområdet. Disse studiene tillot oss også å identifisere magnetkonfigurasjoner som maksimerer antallet partikler som holdes tilbake i luftrøret etter avsetning. I en andre serie studier forsøkte vi å bruke denne optimale konfigurasjonen for å demonstrere transduksjonsmønsteret som følge av in vivo-levering av LV-MP-er til rotteluftveiene, basert på antagelsen om at levering av LV-MP-er i sammenheng med luftveismålretting ville resultere i forbedret LV-transduksjonseffektivitet.
Alle dyrestudier ble utført i henhold til protokoller godkjent av University of Adelaide (M-2019-060 og M-2020-022) og SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Eksperimentene ble utført i henhold til ARRIVE-retningslinjene.
All røntgenavbildning ble utført ved BL20XU-strålelinjen ved SPring-8-synkrotronen i Japan, med et oppsett som ligner på det som er beskrevet tidligere21,22. Kort fortalt var forsøksboksen plassert 245 m fra synkrotronlagringsringen. En avstand mellom prøve og detektor på 0,6 m brukes til partikkelavbildningsstudier og 0,3 m til in vivo-avbildningsstudier for å generere fasekontrasteffekter. En monokromatisk stråleenergi på 25 keV ble brukt. Bilder ble tatt med en høyoppløselig røntgenkonverterer (SPring-8 BM3) koblet til en sCMOS-detektor. Konverteren konverterer røntgenstråler til synlig lys ved hjelp av en 10 µm tykk scintillator (Gd3Al2Ga3O12), som deretter rettes til en sCMOS-sensor ved hjelp av et × 10 mikroskopobjektiv (NA 0.3). sCMOS-detektoren var Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) med en arraystørrelse på 2048 × 2048 piksler og en rå pikselstørrelse på 6,5 × 6,5 µm. Dette oppsettet gir en effektiv isotrop pikselstørrelse på 0,51 µm og et synsfelt på omtrent 1,1 mm × 1,1 mm. En eksponeringslengde på 100 ms ble valgt for å maksimere signal-til-støy-forholdet til magnetiske partikler i og utenfor luftveiene, samtidig som pusteinduserte bevegelsesartefakter ble minimert. For in vivo-studier ble en rask røntgenlukker plassert i røntgenbanen for å begrense strålingsdosen ved å blokkere røntgenstrålen mellom eksponeringene.
LV-bæreren ble ikke brukt i noen SPring-8 PB-PCXI-avbildningsstudier fordi BL20XU-avbildningskammeret ikke er sertifisert på biosikkerhetsnivå 2. I stedet valgte vi en rekke godt karakteriserte mikroskopiske plager fra to kommersielle leverandører – som dekker en rekke størrelser, materialer, jernkonsentrasjoner og bruksområder – først for å forstå hvordan magnetfelt påvirker mikroskopiske plagerbevegelser i glasskapillærer og deretter i levende luftveier. på overflaten. MP-er varierer i størrelse fra 0,25 til 18 μm og er laget av en rekke materialer (se tabell 1), men sammensetningen av hver prøve, inkludert størrelsen på de magnetiske partiklene i MP-en, er ukjent. Basert på våre omfattende MCT-studier 19, 20, 21, 23, 24, forventer vi at MP-er så små som 5 μm kan sees på luftrørets overflate, for eksempel ved å trekke fra påfølgende bilder for å se forbedret synlighet av MP-bevegelse. En enkelt MP på 0,25 μm er mindre enn oppløsningen til avbildningsenheten, men PB-PCXI forventes å oppdage volumkontrasten og bevegelsen til overflatevæsken de avsettes på etter avsetning.
Prøver for hver MP i tabell 1 ble fremstilt i 20 μl glasskapillærer (Drummond Microcaps, PA, USA) med en indre diameter på 0,63 mm. Korpuskulære partikler er tilgjengelige i vann, mens CombiMag-partikler er tilgjengelige i produsentens proprietære væske. Hvert rør er halvfylt med væske (omtrent 11 μl) og plassert på prøveholderen (se figur 1). Glasskapillærene ble plassert horisontalt på prøvetrinnet i avbildningsboksen, og plassert langs kantene av væsken. En nikkelskallmagnet av sjeldne jordarter, neodym, jernbor (NdFeB) (N35, kat.nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) med en restmagnetisering på 1,17 Tesla ble festet til et separat translasjonstrinn for å oppnå endring av posisjonen eksternt under avbildning. Røntgenbildeopptak begynner når magneten er plassert omtrent 30 mm over prøven, og bilder tas med en hastighet på 4 bilder per sekund. Under avbildning ble magneten brakt nær glasskapillarrøret (ca. 1 mm unna) og deretter forskjøvet langs røret for å vurdere effekten av feltstyrke og posisjon.
In vitro-avbildningsoppsett som inneholder MP-prøver i glasskapillærer på prøvens xy-translasjonstrinn. Røntgenstrålens bane er markert med en rød stiplet linje.
Når in vitro-synligheten til MP-ene var fastslått, ble en delmengde av dem testet in vivo i villtype hunnalbino Wistar-rotter (~12 uker gamle, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) og 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Rottene ble bedøvet med en blanding av Pharma (Pharma), Japan) ved intraperitoneal injeksjon. Etter anestesi ble de forberedt for avbildning ved å fjerne pelsen rundt luftrøret, sette inn et endotrakealt rør (ET; 16 Ga iv kanyle, Terumo BCT) og immobilisere dem liggende på en spesiallaget bildeplate som inneholdt en termisk pose for å opprettholde kroppstemperaturen 22. Bildeplaten ble deretter festet til prøvetranslasjonstrinnet i bildeboksen i en liten vinkel for å justere luftrøret horisontalt i røntgenbildet, som vist i figur 2a.
(a) In vivo-avbildningsoppsett i SPring-8-avbildningsboksen, røntgenstrålens bane er markert med en rød stiplet linje. (b, c) Magnetlokalisering på luftrøret ble utført eksternt ved hjelp av to ortogonalt monterte IP-kameraer. På venstre side av skjermbildet kan man se trådsløyfen som holder hodet, og leveringskanylen på plass i ET-røret.
Et fjernstyrt sprøytepumpesystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) med en 100 μl glasssprøyte ble koblet til PE10-slange (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) via en 30 Ga nål. Merk røret for å sikre at spissen er i riktig posisjon i luftrøret når ET-røret settes inn. Ved hjelp av mikropumpen ble sprøytestempelet trukket ut mens spissen av røret var nedsenket i MP-prøven som skulle leveres. Det lastede leveringsrøret ble deretter satt inn i endotrakealtuben, og spissen ble plassert innenfor den sterkeste delen av vårt forventede påførte magnetfelt. Bildeopptak ble kontrollert ved hjelp av en respirasjonsdetektor koblet til vår Arduino-baserte timingboks, og alle signaler (f.eks. temperatur, respirasjon, lukkeråpning/-lukking og bildeopptak) ble registrert ved hjelp av Powerlab og LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Ved avbildning Da kabinettet var utilgjengelig, ble to IP-kameraer (Panasonic BB-SC382) plassert omtrent 90° i forhold til hverandre og ble brukt til å overvåke posisjonen til magnet i forhold til luftrøret under avbildning (fig. 2b, c). For å minimere bevegelsesartefakter ble det tatt ett bilde per åndedrag under platået ved sluttidalstrømning.
En magnet er festet til et andre trinn som kan plasseres eksternt fra utsiden av avbildningshuset. Ulike magnetposisjoner og konfigurasjoner ble testet, inkludert: Montert i en vinkel på omtrent 30° over luftrøret (konfigurasjoner vist i figur 2a og 3a); én magnet over dyret og den andre nedenfor, med polene satt til å tiltrekke (figur 3b); én magnet over dyret og den andre nedenfor, med polene satt til å frastøte (figur 3c); og én magnet over og vinkelrett på luftrøret (figur 3d). Når dyret og magneten er konfigurert og MP-en som skal testes er lastet inn i sprøytepumpen, lever en dose på 50 μl med en hastighet på 4 μl/sek mens du tar bilder. Magneten beveges deretter frem og tilbake langs eller sideveis over luftrøret mens du fortsetter å ta bilder.
Magnetkonfigurasjon for in vivo-avbildning (a) en enkelt magnet over luftrøret i en vinkel på omtrent 30°, (b) to magneter satt til å tiltrekke, (c) to magneter satt til å frastøte, (d) en enkelt magnet over og vinkelrett i luftrøret. Observatøren så ned fra munnen til lungene gjennom luftrøret, og røntgenstrålen passerte gjennom rottens venstre side og forlot høyre side. Magneten beveges enten langs luftveiens lengde eller til venstre og høyre over luftrøret i retning av røntgenstrålen.
Vi forsøkte også å bestemme synligheten og oppførselen til partikler i luftveiene i fravær av forstyrrende pust og hjertebevegelser. Derfor ble dyrene humant avlivet på slutten av avbildningsperioden for overdose med pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Noen dyr ble liggende på avbildningsplattformen, og når pusten og hjerterytmen stoppet, ble avbildningsprosessen gjentatt, med en ekstra dose MP tilsatt hvis ingen MP var synlig på luftveisoverflaten.
De innhentede bildene ble korrigert for flatt felt og mørkt felt, og deretter satt sammen til en film (20 bilder per sekund; 15–25 × normal hastighet avhengig av respirasjonsfrekvens) ved hjelp av et tilpasset skript skrevet i MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle studier av LV-genvektorlevering ble utført ved Laboratory Animal Research Facility ved University of Adelaide, og målet var å bruke resultatene fra SPring-8-eksperimentet til å vurdere om LV-MP-levering i nærvær av et magnetfelt kunne forbedre genoverføring in vivo. For å vurdere effekten av MP og magnetfelt ble to grupper dyr behandlet: én gruppe fikk LV-MP med en magnet plassert, og den andre gruppen fikk en kontrollgruppe med LV-MP uten magnet.
LV-genvektorer ble generert ved hjelp av tidligere beskrevne metoder 25, 26. LacZ-vektoren uttrykker det nukleært lokaliserte beta-galaktosidasegenet drevet av den konstitutive MPSV-promotoren (LV-LacZ), som produserer et blått reaksjonsprodukt i transduserte celler, synlig i lungevevsfronter og vevssnitt. Titrering ble utført i cellekulturer ved å manuelt telle antall LacZ-positive celler med et hemocytometer for å beregne titeren i TU/ml. Bærerne kryopreserveres ved -80 °C, tines før bruk og bindes til CombiMag ved å blande i et 1:1-forhold og inkuberes på is i minst 30 minutter før levering.
Normale Sprague Dawley-rotter (n = 3/gruppe, ~2-3 ble bedøvet intraperitonealt med en blanding av 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Australia) og 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australia) (ip) injeksjon og ikke-kirurgisk oral kanylering med en 16 Ga iv kanyle. For å sikre at trakealluftveisvevet mottar LV-transduksjon, ble det kondisjonert ved hjelp av vår tidligere beskrevne mekaniske perturbasjonsprotokoll, der trakealluftveisoverflaten ble gnidd aksialt med en metallkurv (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Trakeal administrering av LV-MP ble deretter utført i et biologisk sikkerhetsskap omtrent 10 minutter etter perturbasjon.
Magnetfeltet som ble brukt i dette eksperimentet ble konfigurert på en lignende måte som in vivo røntgenavbildningsstudien, med de samme magnetene holdt over luftrøret ved hjelp av destillasjonsstentklemmer (figur 4). Et 50 μl volum (2 × 25 μl alikvoter) av LV-MP ble levert inn i luftrøret (n = 3 dyr) ved hjelp av en pipette som inneholdt en gelspiss som tidligere beskrevet. En kontrollgruppe (n = 3 dyr) mottok de samme LV-MP-ene uten bruk av en magnet. Etter at infusjonen er fullført, fjernes kanylen fra ET-røret og dyret ekstuberes. Magneten forblir på plass i 10 minutter, deretter fjernes den. Rottene fikk en subkutan dose meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) etterfulgt av reversering av anestesien ved ip-injeksjon av 1 mg/kg atipamazolhydroklorid (Antisedan, Zoetis, Australia). Rottene ble holdt varme og overvåket til de var fullstendig rekonvalesens fra anestesien.
LV-MP-leveringsenhet i et biologisk sikkerhetsskap. Den lysegrå Luer-muffen på ET-røret kan sees stikke ut fra munnen, og gelspissen på pipetten som vist på bildet føres inn gjennom ET-røret til ønsket dybde og inn i luftrøret.
En uke etter LV-MP-doseringsprosedyren ble dyrene humant avlivet ved 100 % CO2-inhalasjon, og LacZ-ekspresjon ble vurdert ved hjelp av vår standard X-gal-behandling. De tre kaudale, mest bruskholdige ringene ble fjernet for å sikre at mekanisk skade eller væskeretensjon fra plassering av endotrakealtuber ikke ble inkludert i analysen. Hver luftrør ble kuttet i lengderetningen for å lage to halvdeler for analyse, og de ble montert i en skål som inneholdt silikongummi (Sylgard, Dow Inc) ved hjelp av en Minutien-nål (Fine Science Tools) for å visualisere luminaloverflaten. Fordelingen og mønsteret av transduserte celler ble bekreftet ved frontal fotografering ved hjelp av et Nikon-mikroskop (SMZ1500) med et DigiLite-kamera og TCapture-programvare (Tucsen Photonics, Kina). Bildene ble tatt med 20x forstørrelse (inkludert den høyeste innstillingen for luftrørets fulle bredde), med hele luftrørets lengde avbildet trinn for trinn, noe som sikret tilstrekkelig overlapping mellom hvert bilde for å muliggjøre bilde-"sammenføyning". Bilder fra hver luftrør ble deretter satt sammen til et enkelt sammensatt bilde ved hjelp av Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) som bruker en plan bevegelsesalgoritme. LacZ-ekspresjonsområder i sammensatte bilder av luftrøret fra hvert dyr ble kvantifisert ved hjelp av et automatisert MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet, med innstillinger på 0,35 < fargetone < 0,58, metning > 0,15 og verdi < 0,7. Ved å tegne vevets konturer ble en maske generert manuelt i GIMP v2.10.24 for hvert sammensatte bilde for å identifisere vevsområdet og forhindre falske deteksjoner utenfra luftrørsvevet. De fargede områdene fra alle sammensatte bilder fra hvert dyr ble summert for å generere det totale fargede området for det dyret. Det fargede området ble deretter delt på det totale maskeområdet for å generere det normaliserte området.
Hver luftrør ble innstøpt i parafin, og 5 μm snitt ble kuttet. Snittene ble motfarget med nøytral hurtigrødt i 5 minutter, og bildene ble tatt med et Nikon Eclipse E400-mikroskop, DS-Fi3-kamera og NIS-elementopptaksprogramvare (versjon 5.20.00).
Alle statistiske analyser ble utført i GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistisk signifikans ble satt til p ≤ 0,05. Normaliteten ble verifisert ved hjelp av Shapiro-Wilk-testen, og forskjeller i LacZ-farging ble vurdert ved hjelp av den uparede t-testen.
De seks MP-ene beskrevet i tabell 1 ble undersøkt ved hjelp av PCXI, og synligheten er beskrevet i tabell 2. To polystyren-MP-er (MP1 og MP2; henholdsvis 18 μm og 0,25 μm) var ikke synlige under PCXI, men resten av prøvene var identifiserbare (eksempler er vist i figur 5). MP3 og MP4 (10–15 % Fe3O4; henholdsvis 0,25 μm og 0,9 μm) er svakt synlige. Selv om de inneholdt noen av de minste partiklene som ble testet, var MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 μm) den mest uttalte. CombiMag-produktet MP6 er vanskelig å få øye på. I alle tilfeller ble vår evne til å oppdage MP betydelig forbedret ved å forskyve magneten frem og tilbake parallelt med kapillærrøret. Da magnetene beveget seg bort fra kapillærrøret, utvidet partiklene seg i lange strenger, men etter hvert som magnetene kom nærmere og magnetfeltstyrken økte, ble partikkelstrengene forkortet etter hvert som partiklene migrerte mot kapillærrørets toppflate (se tilleggsvideo S1: MP4), noe som økte. partikkeltettheten på overflaten. Omvendt, når magneten fjernes fra kapillærrøret, reduseres feltstyrken, og MP-ene omorganiseres til lange strenger som strekker seg fra kapillærrørets øvre overflate (se tilleggsvideo S2: MP4). Etter at magneten slutter å bevege seg, fortsetter partiklene å bevege seg i en kort periode etter at de har nådd likevektsposisjonen. Når MP-en beveger seg mot og bort fra kapillærrørets øvre overflate, drar de magnetiske partiklene vanligvis avfallet gjennom væsken.
Synligheten av MP under PCXI varierer betydelig mellom prøvene. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6. Alle bildene som vises her ble tatt med en magnet plassert omtrent 10 mm rett over kapillærrøret. De synlige store sirklene er luftbobler fanget i kapillærene, noe som tydelig viser de svarte og hvite kanttrekkene ved fasekontrastavbildning. Den røde boksen inneholder den kontrastforsterkende forstørrelsen. Merk at diameteren til magnetskjemaene i alle figurene ikke er i målestokk og er omtrent 100 ganger større enn vist.
Når magneten forskyves til venstre og høyre langs toppen av kapillærrøret, endres vinkelen på MP-strengen for å justere den med magneten (se figur 6), og dermed avgrenses magnetfeltlinjene. For MP3-5, etter at korden når en terskelvinkel, blir partiklene dratt langs kapillærrørets øvre overflate. Dette resulterer ofte i at MP-er grupperer seg i større grupper nær der magnetfeltet er sterkest (se tilleggsvideo S3: MP5). Dette er også spesielt tydelig ved avbildning nær kapillærenden, noe som fører til at MP-er aggregerer og konsentrerer seg ved væske-luft-grensesnittet. Partikler i MP6, som var vanskeligere å skjelne enn MP3-5, ble ikke dratt mens magneten beveget seg langs kapillærrøret, men MP-strengene dissosierte, og etterlot partiklene i synsfeltet (se tilleggsvideo S4: MP6). I noen tilfeller, når det påførte magnetfeltet ble redusert ved å flytte magneten en stor avstand fra avbildningsstedet, sank eventuelle gjenværende MP-er sakte ned til bunnflaten av røret ved hjelp av tyngdekraften mens de forble i strengen (se tilleggsvideo S5: MP3).
Vinkelen på MP-strengen endres når magneten forskyves til høyre over kapillærrøret. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6. Den røde boksen inneholder den kontrastforsterkende forstørrelsen. Merk at de supplerende videoene er informative ettersom de avslører viktig partikkelstruktur og dynamisk informasjon som ikke kan visualiseres i disse statiske bildene.
Våre tester viste at det å bevege magneten sakte frem og tilbake langs luftrøret letter visualiseringen av MP i sammenheng med kompleks bevegelse in vivo. In vivo-testing ble ikke utført da polystyrenkuler (MP1 og MP2) ikke var synlige i kapillærrøret. Hver av de resterende fire MP-ene ble testet in vivo med magnetens lange akse konfigurert over luftrøret i en vinkel på omtrent 30° i forhold til vertikalen (se figur 2b og 3a), da dette resulterte i lengre MP-kjeder og var mer effektivt enn magnetkonfigurasjonen som var avsluttet. MP3, MP4 og MP6 ble ikke påvist i luftrøret til noen levende dyr. Da rotteluftveiene ble avbildet etter at dyrene var humant avlivet, forble partiklene usynlige selv når ytterligere volum ble tilsatt ved hjelp av en sprøytepumpe. MP5 hadde det høyeste jernoksidinnholdet og var den eneste synlige partikkelen, og ble derfor brukt til å vurdere og karakterisere MPs oppførsel in vivo.
Å plassere magneten over luftrøret under MP-levering resulterte i at mange, men ikke alle, MP-er ble konsentrert i synsfeltet. Partikler som kommer inn i luftrøret observeres best hos dyr som ble avlivet humant. Figur 7 og tilleggsvideo S6: MP5 viser rask magnetisk fangst og justering av partikler på overflaten av den ventrale luftrøret, noe som indikerer at MP-er kan rettes til ønskede områder av luftrøret. Ved søk mer distalt langs luftrøret etter MP-levering ble noen MP-er funnet nærmere carina, noe som tyder på at magnetfeltstyrken var utilstrekkelig til å samle og beholde alle MP-ene, ettersom de ble levert gjennom området med maksimal magnetfeltstyrke under væskeprosessen. Likevel var MP-konsentrasjonene etter fødselen høyere rundt det avbildede området, noe som tyder på at mange MP-er forble i luftveisområdene der den påførte magnetfeltstyrken var høyest.
Bilder fra (a) før og (b) etter levering av MP5 i luftrøret til en nylig avlivet rotte med magneten plassert rett over avbildningsområdet. Det avbildede området ligger mellom de to bruskringene. Før MP-levering er det noe væske i luftveiene. Den røde boksen inneholder den kontrastforsterkende forstørrelsen. Disse bildene er fra videoen vist i tilleggsvideo S6:MP5.
Å forskyve magneten langs luftrøret in vivo førte til at MP-kjeden endret vinkel i luftveisoverflaten på en måte som ligner på den man ser i kapillærer (se figur 8 og tilleggsvideo S7:MP5). I vår studie kunne imidlertid ikke MP-er dras langs overflaten av den levende luftveien slik de kunne med kapillærer. I noen tilfeller vil MP-kjeden bli lengre når magneten beveger seg til venstre og høyre. Interessant nok fant vi også at partikkelstrengen ser ut til å endre dybden på overflatevæskelaget når magneten beveges i lengderetningen langs luftrøret, og utvider seg når magneten beveges rett over hodet og partikkelstrengen roteres til en vertikal posisjon (se tilleggsvideo S7). : MP5 kl. 0:09, nederst til høyre). Det karakteristiske bevegelsesmønsteret endret seg da magneten ble forskjøvet lateralt over toppen av luftrøret (det vil si til venstre eller høyre for dyret i stedet for langs luftrørets lengde). Partiklene var fortsatt tydelig synlige mens de beveget seg, men da magneten ble fjernet fra luftrøret, ble spissene på partikkelstrengene synlige (se tilleggsvideo S8:MP5, som starter kl. 0:08). Dette stemmer overens med MP-oppførselen vi observerte under et påført magnetfelt i en glasskapillær.
Eksempelbilder som viser MP5 i luftrøret til en levende, bedøvet rotte. (a) Magneten brukes til å ta bilder over og til venstre for luftrøret, deretter (b) etter at magneten er flyttet til høyre. Den røde boksen inneholder den kontrastforsterkende forstørrelsen. Disse bildene er fra videoen vist i tilleggsvideo S7:MP5.
Når de to polene ble konfigurert i en nord-sør-orientering over og under luftrøret (dvs. tiltrekkende; fig. 3b), virket MP-kordene lengre og var plassert på sideveggen av luftrøret snarere enn på den dorsale luftrøroverflaten (se tilleggsvideo S9:MP5). Imidlertid ble høye konsentrasjoner av partikler på ett enkelt sted (dvs. den dorsale overflaten av luftrøret) ikke oppdaget etter væsketilførsel når en dobbelmagnetenhet ble brukt, noe som vanligvis skjer når en enkeltmagnetenhet brukes. Da én magnet ble konfigurert til å frastøte polene reversert (fig. 3c), så det ikke ut til at antallet partikler som var synlige i synsfeltet økte etter tilførsel. Oppsettet av begge dobbelmagnetkonfigurasjonene er utfordrende på grunn av de høye magnetfeltstyrkene som trekker eller skyver magnetene, henholdsvis. Oppsettet ble deretter endret til en enkelt magnet parallelt med luftveien, men som passerte gjennom luftveien i 90 grader slik at feltlinjene krysset luftrørveggen ortogonalt (fig. 3d), en orientering designet for å bestemme om partikkelaggregering på sideveggen kunne observeres. Imidlertid, i Denne konfigurasjonen viste ingen identifiserbar bevegelse av MP-akkumulering eller magnetbevegelse. Basert på alle disse resultatene ble en konfigurasjon med én magnet og 30 graders orientering (figur 3a) valgt for in vivo-genbærerstudier.
Da dyret ble gjentatte ganger avbildet rett etter human avliving, medførte fraværet av forstyrrende vevsbevegelse at finere og kortere partikkellinjer kunne sees i det klare interkondrale feltet, «ustø» i tråd med magnetens translasjonsbevegelse. Likevel kan man fortsatt ikke tydelig se tilstedeværelsen og bevegelsen av MP6-partikler.
LV-LacZ-titeren var 1,8 × 108 TU/ml, og etter 1:1-blanding med CombiMag MP (MP6) fikk dyrene en 50 μl trakealdose på 9 × 107 TU/ml LV-vehikkel (dvs. 4,5 × 106 TU/rotte). I disse studiene, i stedet for å translatere magneten under fødsel, fikset vi magneten i én posisjon for å avgjøre om LV-transduksjon (a) kunne forbedres sammenlignet med vektorlevering i fravær av et magnetfelt, og (b) kunne fokuseres. Luftveisceller transduseres til magnetiske målområder i de øvre luftveiene.
Tilstedeværelsen av magneter og bruken av CombiMag kombinert med LV-vektorer så ikke ut til å ha negative effekter på dyrehelsen, i likhet med vår standard LV-vektorleveringsprotokoll. Frontale bilder av trakealregionen utsatt for mekanisk forstyrrelse (tilleggsfigur 1) indikerte at det var betydelig høyere nivåer av transduksjon i gruppen av dyr behandlet med LV-MP når magneten var til stede (figur 9a). Bare en liten mengde blå LacZ-farging var tilstede i kontrollgruppen (figur 9b). Kvantifisering av normaliserte X-Gal-fargede områder viste at administrering av LV-MP i nærvær av et magnetfelt ga en omtrent 6-ganger forbedring (figur 9c).
Eksempel på sammensatte bilder som viser trakealtransduksjon ved hjelp av LV-MP (a) i nærvær av et magnetfelt og (b) i fravær av en magnet. (c) Statistisk signifikant forbedring i normalisert LacZ-transduksjonsareal i luftrøret ved bruk av magnet (*p = 0,029, t-test, n = 3 per gruppe, gjennomsnitt ± SEM).
Nøytrale, raske, rødfargede seksjoner (eksempel vist i tilleggsfigur 2) viste LacZ-fargede celler tilstede i et lignende mønster og plassering som tidligere rapportert.
En sentral utfordring for genterapi i luftveiene er fortsatt den nøyaktige lokaliseringen av bærerpartikler til interessante områder og oppnåelse av høy transduksjonseffektivitet i den bevegelige lungen i nærvær av luftstrøm og aktiv slimfjerning. For LV-bærere utviklet for å behandle CF-luftveissykdom har det hittil vært et unnvikende mål å øke oppholdstiden til bærerpartikler i de ledende luftveiene. Som påpekt av Castellani et al., har bruk av magnetfelt for å forbedre transduksjon fordeler sammenlignet med andre genleveringsmetoder som elektroporering, da det kan kombinere enkelhet, kostnadseffektivitet, leveringslokalisering, økt effektivitet og kortere inkubasjonstider, og muligens en mindre bærerdose10. Imidlertid har in vivo-avsetning og oppførsel av magnetiske partikler i luftveiene under påvirkning av eksterne magnetiske krefter aldri blitt beskrevet, og det har heller ikke blitt demonstrert at denne metoden er gjennomførbar in vivo for å forbedre genuttrykksnivåene i intakte levende luftveier.
Våre in vitro synkrotron PCXI-eksperimenter viste at alle partiklene vi testet, med unntak av polystyren MP, var synlige i bildeoppsettet vi brukte. I nærvær av et magnetfelt danner MP-er strenger hvis lengder er relatert til partikkeltype og magnetfeltstyrke (dvs. nærhet og bevegelse av magneten). Som vist i figur 10, dannes strengene vi observerer på grunn av at hver enkelt partikkel magnetiseres og induserer sitt eget lokale magnetfelt. Disse separate feltene får andre lignende partikler til å aggregere og koble seg sammen, med gruppestrenglignende bevegelser på grunn av lokale krefter fra de lokale tiltrekkende og frastøtende kreftene til andre partikler.
Skjematisk fremstilling av (a, b) partikkeltog generert inne i væskefylte kapillærer og (c, d) luftfylt luftrør. Merk at kapillærene og luftrøret ikke er tegnet i målestokk. Panel (a) inneholder også en beskrivelse av MP, som inneholder Fe3O4-partikler arrangert i strenger.
Da magneten ble flyttet over kapillærrøret, nådde vinkelen på partikkelstrengen en kritisk terskel for MP3-5 som inneholdt Fe3O4, hvoretter partikkelstrengen ikke lenger forble i den opprinnelige posisjonen, men beveget seg langs overflaten til en ny posisjon.magnet.Denne effekten oppstår sannsynligvis fordi glasskapillæroverflaten er glatt nok til å tillate denne bevegelsen.Interessant nok oppførte ikke MP6 (CombiMag) seg slik, muligens fordi partiklene var mindre, hadde forskjellige belegg eller overflateladninger, eller fordi en proprietær bærervæske påvirket deres evne til å bevege seg.Bildekontrasten til CombiMag-partikler er også svakere, noe som tyder på at væsken og partiklene kan ha lignende tettheter og derfor ikke lett beveger seg mot hverandre.Partikler kan også sette seg fast hvis magneten beveger seg for raskt, noe som indikerer at magnetfeltstyrken ikke alltid kan overvinne friksjonen mellom partikler i væsken, noe som tyder på at det kanskje ikke er overraskende at magnetfeltstyrken og avstanden mellom magneten og målområdet er svært viktig.Samlet sett tyder disse resultatene også på at selv om magneter kan fange opp mange MP-er som strømmer gjennom målområdet, er det usannsynlig at magneter kan stole på at de beveger seg. CombiMag-partikler langs overflaten av luftrøret. Derfor konkluderer vi med at in vivo LV-MP-studier bør bruke statiske magnetfelt for å fysisk målrette spesifikke områder av luftveistreet.
Når partikler leveres i kroppen, er de vanskelige å identifisere i sammenheng med komplekst bevegelig kroppsvev, men evnen til å oppdage dem ble forbedret ved å forskyve magneten horisontalt over luftrøret for å "vrikke" MP-strengene. Selv om live-avbildning er mulig, er det lettere å skjelne partikkelbevegelse når dyret er blitt humant avlivet. MP-konsentrasjonene var generelt høyest på dette stedet når magneten var plassert over avbildningsområdet, selv om noen partikler vanligvis ble funnet lenger langs luftrøret. I motsetning til in vitro-studier kan ikke partikler dras langs luftrøret ved å forskyve magneten. Dette funnet er i samsvar med hvordan slimet som belegger overflaten av luftrøret vanligvis behandler inhalerte partikler, fanger dem i slimet og deretter fjernes av den mukociliære klareringsmekanismen.
Vi antok at bruk av magneter for tiltrekning over og under luftrøret (fig. 3b) kan resultere i et mer ensartet magnetfelt, snarere enn et magnetfelt som er sterkt konsentrert på ett punkt, noe som potensielt kan føre til en mer ensartet fordeling av partikler. Vår foreløpige studie fant imidlertid ikke klare bevis som støtter denne hypotesen. På samme måte resulterte ikke konfigurering av et par magneter for å frastøte (fig. 3c) i mer partikkelavsetning i det avbildede området. Disse to funnene viser at dobbeltmagnetoppsettet ikke forbedrer lokal kontroll av MP-målretting betydelig, og at de resulterende sterke magnetiske kreftene er vanskelige å konfigurere, noe som gjør denne tilnærmingen mindre praktisk. På samme måte økte ikke orientering av magneten over og gjennom luftrøret (fig. 3d) antallet partikler som ble holdt tilbake i det avbildede området. Noen av disse alternative konfigurasjonene er kanskje ikke vellykkede fordi de resulterer i lavere magnetfeltstyrker innenfor avsetningsområdet. Derfor anses konfigurasjonen med en enkelt 30-graders vinkelmagnet (figur 3a) som den enkleste og mest effektive metoden for in vivo-testing.
LV-MP-studien viste at når LV-vektorer ble kombinert med CombiMag og levert etter fysisk forstyrrelse i nærvær av et magnetfelt, økte transduksjonsnivåene betydelig i luftrøret sammenlignet med kontrollgruppen. Basert på synkrotronavbildningsstudiene og LacZ-resultatene, var magnetfeltet tilsynelatende i stand til å bevare LV i luftrøret og redusere antallet vektorpartikler som umiddelbart penetrerte dypt inn i lungen. Slike forbedringer i målretting kan føre til høyere effekt samtidig som leverte titere, transduksjon utenfor målet, inflammatoriske og immune bivirkninger og genbærerkostnader reduseres. Viktigere er det at CombiMag ifølge produsenten kan brukes sammen med andre genoverføringsmetoder, inkludert med andre virale vektorer (som AAV) og nukleinsyrer.