Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Genski vektori za liječenje cistične fibroze pluća trebali bi ciljati provodne disajne puteve jer periferna plućna transdukcija ne pruža terapijsku korist. Efikasnost virusne transdukcije direktno je povezana s vremenom zadržavanja vektora. Međutim, tekućine za isporuku, poput nosača gena, prirodno difundiraju u alveole tokom udisaja, a terapijske čestice bilo kojeg oblika brzo se uklanjaju mukocilijarnim transportom. Produženje vremena zadržavanja nosača gena u disajnim putevima je važno, ali teško postići. Magnetne čestice konjugirane s nosačem gena koje se mogu usmjeriti na površinu disajnih puteva mogu poboljšati regionalno ciljanje. Zbog izazova vizualizacije in vivo, ponašanje takvih malih magnetnih čestica na površini disajnih puteva u prisustvu primijenjenog magnetnog polja slabo je shvaćeno. Cilj ove studije bio je koristiti sinhrotronsko snimanje za vizualizaciju kretanja niza magnetnih čestica in vivo u traheji anesteziranih pacova kako bi se ispitala dinamika i obrasci ponašanja pojedinačnih i skupnih čestica in vivo. Zatim smo također procijenili da li bi isporuka lentivirusnih magnetnih čestica u prisustvu magnetnog polja povećala efikasnost transdukcije u traheji pacova. Sinhrotronsko rendgensko snimanje otkriva... Ponašanje magnetskih čestica u stacionarnim i pokretnim magnetskim poljima in vitro i in vivo. Čestice se ne mogu lako vući po površini živih disajnih puteva magnetima, ali tokom transporta, naslage se koncentrišu u vidnom polju gdje je magnetsko polje najjače. Efikasnost transdukcije je također povećana šest puta kada su lentivirusne magnetske čestice isporučene u prisustvu magnetskog polja. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da lentivirusne magnetske čestice i magnetska polja mogu biti vrijedni pristupi za poboljšanje ciljanja genskih vektora i povećanje nivoa transdukcije u provodnim disajnim putevima in vivo.
Cistična fibroza (CF) je uzrokovana varijacijom u jednom genu koji se naziva CF transmembranski regulator provodljivosti (CFTR). CFTR protein je jonski kanal koji je prisutan u mnogim epitelnim ćelijama u tijelu, uključujući i provodne disajne puteve, glavno mjesto patogeneze cistične fibroze. CFTR defekti dovode do abnormalnog transporta vode, dehidracije površine disajnih puteva i smanjenja dubine sloja tečnosti na površini disajnih puteva (ASL). Ovo također narušava sposobnost mukocilijarnog transportnog sistema (MCT) da ukloni udahnute čestice i patogene iz disajnih puteva. Naš cilj je razviti lentivirusnu (LV) gensku terapiju kako bismo isporučili ispravnu kopiju CFTR gena i poboljšali zdravlje ASL, MCT i pluća, te nastaviti s razvojem novih tehnologija sposobnih za mjerenje ovih parametara in vivo1.
LV vektori su jedan od vodećih kandidata za gensku terapiju disajnih puteva kod CF, uglavnom zato što mogu trajno integrirati terapijski gen u bazalne ćelije disajnih puteva (matične ćelije disajnih puteva). Ovo je važno jer mogu obnoviti normalnu hidrataciju i čišćenje sluzi diferencijacijom u funkcionalne genski korigovane površinske ćelije disajnih puteva povezane sa CF, što rezultira doživotnim koristima. LV vektori trebaju biti usmjereni protiv provodnih disajnih puteva, jer tu počinje CF bolest pluća. Isporuka vektora dublje u pluća može rezultirati alveolarnom transdukcijom, ali to nema terapijsku korist kod CF. Međutim, tečnosti poput nosača gena prirodno migriraju u alveole nakon udisaja3,4 i terapijske čestice se brzo uklanjaju u usnu šupljinu pomoću MCT-a. Efikasnost LV transdukcije direktno je povezana s dužinom vremena koje vektor ostaje pored ciljnih ćelija kako bi se omogućilo ćelijsko preuzimanje – "vrijeme boravka"5 – koje se lako smanjuje tipičnim regionalnim protokom zraka, kao i koordiniranim hvatanjem čestica sluzi i MCT-om. Za CF, sposobnost produženja vremena zadržavanja LV unutar disajnih puteva važna je za postizanje visokih nivoa transdukcije u ovoj regiji, ali je do sada bila izazovna.
Da bi se prevazišla ova prepreka, pretpostavljamo da LV magnetske čestice (MP) mogu pomoći na dva komplementarna načina. Prvo, mogu se magnetski voditi do površine disajnih puteva kako bi se poboljšalo ciljanje i pomoglo česticama nosačima gena da se zadrže u željenom području disajnih puteva; i (ASL) da se premjeste u ćelijski sloj 6. MP se široko koriste kao ciljana sredstva za dostavu lijekova kada se vežu za antitijela, hemoterapeutske lijekove ili druge male molekule koje se vežu za ćelijske membrane ili se vežu za relevantne receptore na površini ćelija i akumuliraju na mjestima tumora u prisustvu statičkog elektriciteta. Magnetna polja za liječenje raka 7. Druge „hipertermalne“ tehnike imaju za cilj zagrijavanje MP-ova kada su izloženi oscilirajućim magnetnim poljima, čime se uništavaju tumorske ćelije. Princip magnetne transfekcije, u kojem se magnetno polje koristi kao transfekcijsko sredstvo za poboljšanje prijenosa DNK u ćelije, obično se koristi in vitro korištenjem niza nevirusnih i virusnih genskih vektora za teško transducirane ćelijske linije. Utvrđena je učinkovitost LV magnetotransfekcije, s in vitro isporukom LV-MP-ova u ćelijsku liniju ljudskog bronhijalnog epitela u prisustvu statičkog magnetnog polja, povećavajući učinkovitost transdukcije za 186 puta u usporedbi sa samim LV vektorom. LV-MP je također primijenjen na in vitro CF model, gdje je magnetna transfekcija povećala LV transdukciju u kulturama na granici zrak-tekućina za 20 puta u prisutnosti CF sputuma10. Međutim, in vivo magnetotransfekcija organa dobila je relativno malo pažnje i procijenjena je samo u nekoliko studija na životinjama11,12,13,14,15, posebno u pluća16,17. Ipak, mogućnosti magnetske transfekcije u terapiji pluća za cističnu fibrozu (CF) su jasne. Tan i saradnici (2020) su izjavili da će „studija dokaza koncepta efikasne plućne isporuke magnetskih nanočestica utrti put budućim strategijama inhalacije CFTR-a za poboljšanje kliničkih ishoda kod pacijenata sa CF“6.
Ponašanje malih magnetskih čestica na površinama disajnih puteva u prisustvu primijenjenog magnetskog polja teško je vizualizirati i proučavati, te je stoga slabo shvaćeno. U drugim studijama razvili smo metodu fazno-kontrastnog rendgenskog snimanja zasnovanu na sinhrotronskom širenju (PB-PCXI) za neinvazivnu vizualizaciju i kvantifikaciju malih in vivo promjena u dubini ASL-a18 i ponašanju MCT-a19,20 kako bismo direktno izmjerili hidrataciju površine plinskog kanala i koristili je kao rani pokazatelj efikasnosti liječenja. Osim toga, naša metoda evaluacije MCT-a koristi čestice promjera 10–35 µm sastavljene od aluminijevog oksida ili stakla visokog indeksa prelamanja kao MCT markere vidljive pomoću PB-PCXI21. Obje tehnike su pogodne za vizualizaciju niza tipova čestica, uključujući MP.
Zbog visoke prostorne i vremenske rezolucije, naše tehnike analize ASL i MCT zasnovane na PB-PCXI su veoma pogodne za ispitivanje dinamike i obrazaca ponašanja pojedinačnih i rasutih čestica in vivo, kako bi nam pomogle da razumijemo i optimizujemo tehnike isporuke MP gena. Pristup koji ovdje koristimo potiče iz naših studija korištenjem SPring-8 BL20B2 linije snopa, u kojoj smo vizualizirali kretanje fluida nakon isporuke lažne vektorske doze u nosne i plućne disajne puteve miševa kako bismo objasnili naše neujednačene obrasce ekspresije gena uočene u našim studijama na životinjama s dozama nosača gena 3,4.
Cilj ove studije bio je korištenje sinhrotronskog PB-PCXI uređaja za vizualizaciju in vivo kretanja serije MP u traheji živih pacova. Ove PB-PCXI studije snimanja su osmišljene da testiraju niz MP, jačine magnetnog polja i lokacija kako bi se utvrdio njihov uticaj na kretanje MP. Pretpostavili smo da bi eksterno primijenjeno magnetno polje pomoglo isporučenom MP da ostane ili se pomjeri ka ciljnom području. Ove studije su nam također omogućile da identifikujemo konfiguracije magneta koje maksimiziraju broj čestica zadržanih u traheji nakon taloženja. U drugoj seriji studija, nastojali smo koristiti ovu optimalnu konfiguraciju kako bismo demonstrirali obrazac transdukcije koji proizlazi iz in vivo isporuke LV-MP u disajne puteve pacova, na osnovu pretpostavke da bi isporuka LV-MP u kontekstu ciljanja disajnih puteva rezultirala poboljšanom efikasnošću LV transdukcije.
Sve studije na životinjama provedene su u skladu s protokolima koje je odobrio Univerzitet u Adelaideu (M-2019-060 i M-2020-022) i Odbor za etiku sinhrotronskih životinja SPring-8. Eksperimenti su provedeni u skladu s ARRIVE smjernicama.
Sva rendgenska snimanja su izvršena na liniji snopa BL20XU na sinhrotronu SPring-8 u Japanu, koristeći postavku sličnu onoj opisanoj prethodno21,22. Ukratko, eksperimentalna kutija je bila smještena 245 m od prstena za pohranu sinhrotrona. Udaljenost od uzorka do detektora od 0,6 m koristi se za studije snimanja čestica, a 0,3 m za in vivo studije snimanja kako bi se generirali efekti faznog kontrasta. Korištena je energija monohromatskog snopa od 25 keV. Slike su snimljene pomoću rendgenskog pretvarača visoke rezolucije (SPring-8 BM3) spojenog na sCMOS detektor. Pretvarač pretvara rendgenske zrake u vidljivu svjetlost pomoću scintilatora (Gd3Al2Ga3O12) debljine 10 µm, koji se zatim usmjerava na sCMOS senzor pomoću mikroskopskog objektiva × 10 (NA 0,3). sCMOS detektor je bio Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) sa veličinom niza od 2048 × 2048 piksela i sirova veličina piksela od 6,5 × 6,5 µm. Ova postavka daje efektivnu izotropnu veličinu piksela od 0,51 µm i vidno polje od približno 1,1 mm × 1,1 mm. Dužina ekspozicije od 100 ms odabrana je kako bi se maksimizirao odnos signala i šuma magnetskih čestica unutar i izvan disajnih puteva, a istovremeno minimizirali artefakti kretanja izazvani disanjem. Za in vivo studije, brzi rendgenski zatvarač postavljen je u putanju rendgenskih zraka kako bi se ograničila doza zračenja blokiranjem rendgenskog snopa između ekspozicija.
LV nosač nije korišten ni u jednoj SPring-8 PB-PCXI studiji snimanja jer komora za snimanje BL20XU nije certificirana za biološku sigurnost nivoa 2. Umjesto toga, odabrali smo niz dobro okarakteriziranih mikroplastika od dva komercijalna dobavljača - koji pokrivaju niz veličina, materijala, koncentracija željeza i primjena - prvo kako bismo razumjeli kako magnetska polja utječu na kretanje mikroplastike unutar staklenih kapilara, a zatim i u živim disajnim putevima. na površini. MP-ovi se kreću u veličini od 0,25 do 18 μm i napravljeni su od različitih materijala (vidi Tabelu 1), ali sastav svakog uzorka, uključujući veličinu magnetskih čestica unutar MP-a, nije poznat. Na osnovu naših opsežnih MCT studija 19, 20, 21, 23, 24, očekujemo da se MP-ovi veličine i do 5 μm mogu vidjeti na površini trahealnih disajnih puteva, na primjer oduzimanjem uzastopnih kadrova kako bi se vidjela poboljšana vidljivost kretanja MP-a. Pojedinačni MP veličine 0,25 μm je manji od rezolucije uređaja za snimanje, ali se očekuje da će PB-PCXI detektovati njihov volumenski kontrast i kretanje površinske tečnosti na koju su deponovani nakon deponovanja.
Uzorci za svaki MP u Tabeli 1 pripremljeni su u staklenim kapilarama od 20 μl (Drummond Microcaps, PA, SAD) sa unutrašnjim prečnikom od 0,63 mm. Korpuskularne čestice dostupne su u vodi, dok su CombiMag čestice dostupne u proizvođačevoj vlasničkoj tečnosti. Svaka epruveta je do pola napunjena tečnošću (približno 11 μl) i postavljena na držač uzorka (vidi Sliku 1). Staklene kapilare su postavljene horizontalno na postolje za uzorak u kutiji za snimanje, respektivno, i pozicionirane su na rubove tečnosti. Magnet NdFeB (N35, kat. br. LM1652, Jaycar Electronics, Australija) prečnika 19 mm (dužine 28 mm) od nikl omotača, rijetkozemnih neodimijumskih željeza i bora (NdFeB) sa rezidualnom magnetizacijom od 1,17 Tesla pričvršćen je na zasebno postolje za translaciju kako bi se postigla daljinska promjena njegovog položaja tokom snimanja. Snimanje rendgenskih slika počinje kada se magnet postavi približno 30 mm iznad uzorka, a slike se snimaju brzinom od 4 sličice u sekundi. Tokom snimanja, magnet je približen... staklenu kapilarnu cijev (udaljenu oko 1 mm), a zatim pomicanu duž cijevi kako bi se procijenili učinci jačine polja i položaja.
In vitro postavka za snimanje koja sadrži MP uzorke u staklenim kapilarama na postolju za xy translaciju uzorka. Putanja rendgenskog snopa označena je crvenom isprekidanom linijom.
Nakon što je utvrđena in vitro vidljivost mikroplastike (MP), podskupina njih je testirana in vivo na ženkama albino Wistar pacova divljeg tipa (starosti ~12 sedmica, ~200 g). Pacovi su anestezirani mješavinom 0,24 mg/kg medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg midazolama (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) i 4 mg/kg butorfanola (Vetorphale®, Meiji Seika) intraperitonealnom injekcijom. Nakon anestezije, pripremljeni su za snimanje uklanjanjem krzna oko traheje, umetanjem endotrahealne cijevi (ET; 16 Ga iv kanila, Terumo BCT) i imobilizacijom u ležećem položaju na prilagođenoj ploči za snimanje koja sadrži termalnu vrećicu za održavanje tjelesne temperature 22. Ploča za snimanje je zatim pričvršćena na postolje za translaciju uzorka u kutiji za snimanje pod blagim uglom kako bi se traheja horizontalno poravnala na rendgenskoj slici, kao što je prikazano na slici. 2a.
(a) Postavka za in vivo snimanje u SPring-8 kutiji za snimanje, putanja rendgenskog snopa je označena crvenom isprekidanom linijom. (b,c) Lokalizacija magneta na traheji izvršena je daljinski pomoću dvije ortogonalno postavljene IP kamere. Na lijevoj strani slike na ekranu vidi se žičana petlja koja drži glavu i kanila za dostavljanje na mjestu unutar ET cijevi.
Sistem pumpe za šprice sa daljinskim upravljanjem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) koji koristi staklenu špricu od 100 μl povezan je sa PE10 cijevi (spoljni promjer 0,61 mm, unutrašnji promjer 0,28 mm) putem igle od 30 Ga. Označite cijev kako biste osigurali da je vrh u ispravnom položaju u traheji prilikom umetanja ET cijevi. Pomoću mikropumpe, klip šprice je izvučen dok je vrh cijevi bio uronjen u MP uzorak koji treba da se da. Napunjena cijev za davanje je zatim umetnuta u endotrahealnu cijev, postavljajući vrh unutar najjačeg dijela našeg očekivanog primijenjenog magnetskog polja. Akvizicija slike je kontrolisana pomoću detektora disanja povezanog na našu kutiju za mjerenje vremena baziranu na Arduinu, a svi signali (npr. temperatura, disanje, otvaranje/zatvaranje zatvarača i akvizicija slike) su snimljeni pomoću Powerlaba i LabChart-a (AD Instruments, Sydney, Australija) 22. Prilikom snimanja Kada kućište nije bilo dostupno, dvije IP kamere (Panasonic BB-SC382) su postavljene pod uglom od približno 90° jedna u odnosu na drugu i korištene su za praćenje položaja magneta u odnosu na... do traheje tokom snimanja (Sl. 2b,c). Da bi se smanjili artefakti kretanja, snimljena je jedna slika po udahu tokom platoa protoka na kraju respiratornog trakta.
Magnet je pričvršćen za drugu fazu koja se može postaviti udaljeno izvan kućišta za snimanje. Testirani su različiti položaji i konfiguracije magneta, uključujući: Montiran pod uglom od približno 30° iznad traheje (konfiguracije prikazane na slikama 2a i 3a); jedan magnet iznad životinje, a drugi ispod, s polovima postavljenim na privlačenje (slika 3b); jedan magnet iznad životinje, a drugi ispod, s polovima postavljenim na odbijanje (slika 3c); i jedan magnet iznad i okomito na traheju (slika 3d). Nakon što su životinja i magnet konfigurirani i MP koji se testira ubačen u pumpu za špricu, isporučuje se doza od 50 μl brzinom od 4 μl/s dok se snimaju slike. Magnet se zatim pomiče naprijed-nazad duž ili bočno preko traheje dok se nastavlja snimati slike.
Konfiguracija magneta za in vivo snimanje (a) jedan magnet iznad traheje pod uglom od približno 30°, (b) dva magneta postavljena na privlačenje, (c) dva magneta postavljena na odbijanje, (d) jedan magnet iznad i okomito u traheji. Posmatrač je gledao dolje od usta do pluća kroz traheju, a rendgenski snop je prolazio kroz lijevu stranu pacova i izlazio na desnoj strani. Magnet se ili pomiče duž disajnih puteva ili lijevo i desno iznad traheje u smjeru rendgenskog snopa.
Također smo nastojali utvrditi vidljivost i ponašanje čestica u disajnim putevima u odsustvu ometajućeg disanja i srčanog rada. Stoga su na kraju perioda snimanja životinje humano ubijene zbog predoziranja pentobarbitalom (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, SAD; ~65 mg/kg ip). Neke životinje su ostavljene na platformi za snimanje, a nakon prestanka disanja i rada srca, proces snimanja je ponovljen, dodajući dodatnu dozu MP ako MP nije bio vidljiv na površini disajnih puteva.
Dobijene slike su korigirane u ravnom i tamnom polju, a zatim su sastavljene u film (20 kadrova u sekundi; 15-25 × normalna brzina ovisno o frekvenciji disanja) korištenjem prilagođenog skripta napisanog u MATLAB-u (R2020a, The Mathworks).
Sve studije o isporuci LV gena vektorom provedene su u Istraživačkom centru za laboratorijske životinje Univerziteta u Adelaideu s ciljem korištenja rezultata SPring-8 eksperimenta za procjenu da li isporuka LV-MP u prisustvu magnetskog polja može poboljšati transfer gena in vivo. Da bi se procijenili efekti MP i magnetskog polja, tretirane su dvije grupe životinja: jednoj grupi je dat LV-MP sa postavljenim magnetom, a drugoj grupi je dat kontrolni LV-MP bez magneta.
LV genski vektori su generirani korištenjem prethodno opisanih metoda 25, 26. LacZ vektor eksprimira nuklearno lokalizirani beta-galaktozidazni gen vođen konstitutivnim MPSV promotorom (LV-LacZ), koji proizvodi plavi reakcijski produkt u transduciranim ćelijama, vidljiv na frontovima plućnog tkiva i presjecima tkiva. Titracija je provedena u ćelijskim kulturama ručnim brojanjem broja LacZ pozitivnih ćelija hemocitometrom kako bi se izračunao titar u TU/ml. Nosači su krioprezervirani na -80 °C, odmrznuti prije upotrebe i vezani za CombiMag miješanjem u omjeru 1:1 i inkubacijom na ledu najmanje 30 minuta prije isporuke.
Normalni Sprague Dawley pacovi (n = 3/grupi, ~2-3) su anestezirani intraperitonealno mješavinom od 0,4 mg/kg medetomidina (Domitor, Ilium, Australija) i 60 mg/kg ketamina (Ilium, Australija) (stari mjesec dana) ip injekcijom i nehirurškom oralnom kanilacijom s 16 Ga iv kanilom. Kako bi se osiguralo da tkivo trahealnih disajnih puteva primi LV transdukciju, kondicionirano je korištenjem našeg prethodno opisanog protokola mehaničke perturbacije, u kojem je površina trahealnih disajnih puteva aksijalno trljana žičanom korpom (N-Circle, Nitinol bezglavi ekstraktor kamenca NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, SAD) 30 s28. Trahealna primjena LV-MP je zatim izvršena u biološki sigurnosnom kabinetu otprilike 10 minuta nakon perturbacije.
Magnetno polje korišteno u ovom eksperimentu konfigurirano je na sličan način kao i u studiji rendgenskog snimanja in vivo, s istim magnetima koji su držani iznad traheje pomoću destilacijskih stent kopči (Slika 4). Volumen od 50 μl (2 × 25 μl alikvota) LV-MP-a ubrizgan je u traheju (n = 3 životinje) pomoću pipete koja sadrži gel vrh, kao što je prethodno opisano. Kontrolna grupa (n = 3 životinje) primila je iste LV-MP-ove bez upotrebe magneta. Nakon što je infuzija završena, kanila se uklanja iz ET cijevi i životinja se ekstubira. Magnet ostaje na mjestu 10 minuta, a zatim se uklanja. Pacovi su primili subkutanu dozu meloksikama (1 ml/kg) (Ilium, Australija), nakon čega je uslijedila reverzibilna anestezija ip injekcijom 1 mg/kg atipamazol hidrohlorida (Antisedan, Zoetis, Australija). Pacovi su držani na toplom i praćeni do potpunog oporavka od anestezije.
Uređaj za isporuku LV-MP u biološki sigurnosnom ormariću. Svijetlosivi Luer nastavak ET cijevi može se vidjeti kako viri iz usta, a gel vrh pipete prikazane na slici umetnut je kroz ET cijev do željene dubine u traheju.
Sedmicu dana nakon postupka doziranja LV-MP, životinje su humano ubijene inhalacijom 100% CO2, a ekspresija LacZ je procijenjena korištenjem našeg standardnog X-gal tretmana. Tri kaudalna najhrskavičnija prstena su uklonjena kako bi se osiguralo da bilo kakvo mehaničko oštećenje ili zadržavanje tečnosti od postavljanja endotrahealne cijevi nije uključeno u analizu. Svaka traheja je uzdužno prerezana kako bi se stvorile dvije polovine za analizu, a zatim su postavljene u posudu koja sadrži silikonsku gumu (Sylgard, Dow Inc) korištenjem Minutien igle (Fine Science Tools) za vizualizaciju luminalne površine. Distribucija i obrazac transduciranih ćelija potvrđeni su frontalnom fotografijom korištenjem Nikon mikroskopa (SMZ1500) sa DigiLite kamerom i TCapture softverom (Tucsen Photonics, Kina). Slike su snimljene pri 20x uvećanju (uključujući najveće podešavanje za punu širinu traheje), pri čemu je cijela dužina traheje snimljena korak po korak, osiguravajući dovoljno preklapanje između svake slike kako bi se omogućilo "spajanje" slika. Slike iz svake traheje su zatim sastavljene u jednu. kompozitna slika korištenjem Image Composite Editora v2.0.3 (Microsoft Research) uz primjenu algoritma planarnog kretanja. Područja ekspresije LacZ u kompozitnim slikama traheje svake životinje kvantificirana su korištenjem automatiziranog MATLAB skripta (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano, koristeći postavke od 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 i Value < 0,7. Praćenjem kontura tkiva, maska ​​je ručno generirana u GIMP v2.10.24 za svaku kompozitnu sliku kako bi se identificiralo područje tkiva i spriječile bilo kakve lažne detekcije izvan tkiva traheje. Obojena područja sa svih kompozitnih slika svake životinje su zbrojena kako bi se generirala ukupna obojena površina za tu životinju. Obojena površina je zatim podijeljena s ukupnom površinom maske kako bi se generirala normalizirana površina.
Svaka traheja je ugrađena u parafin i izrezani su rezovi od 5 μm. Rezovi su kontrastno obojeni neutralno brzom crvenom bojom tokom 5 minuta, a slike su dobijene korištenjem Nikon Eclipse E400 mikroskopa, DS-Fi3 kamere i NIS softvera za snimanje elemenata (verzija 5.20.00).
Sve statističke analize su provedene u GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistička značajnost je postavljena na p ≤ 0,05. Normalnost je provjerena Shapiro-Wilk testom, a razlike u LacZ bojenju su procijenjene korištenjem neparnog t-testa.
Šest MP opisanih u Tabeli 1 ispitano je pomoću PCXI, a vidljivost je opisana u Tabeli 2. Dva polistirenska MP (MP1 i MP2; 18 μm i 0,25 μm, respektivno) nisu bila vidljiva pod PCXI, ali su ostali uzorci bili prepoznatljivi (primjeri su prikazani na Slici 5). MP3 i MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm i 0,9 μm, respektivno) su slabo vidljivi. Iako sadrži neke od najmanjih testiranih čestica, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) je bio najizraženiji. CombiMag proizvod MP6 je teško uočiti. U svim slučajevima, naša sposobnost detekcije MP-a značajno je poboljšana pomicanjem magneta naprijed-nazad paralelno s kapilarom. Kada su se magneti udaljavali od kapilare, čestice su se protezale u dugim nizovima, ali kako su se magneti približavali i jačina magnetskog polja povećavala, nizovi čestica su se skraćivali kako su čestice migrirale prema gornjoj površini kapilare (vidi Dodatni video S1: MP4), povećavajući... Gustoća čestica površine. Suprotno tome, kada se magnet ukloni iz kapilare, jačina polja se smanjuje i mikročestice se preuređuju u duge niti koje se protežu od gornje površine kapilare (pogledajte Dodatni video S2:MP4). Nakon što se magnet prestane kretati, čestice se nastavljaju kretati kratko vrijeme nakon što dostignu ravnotežni položaj. Kako se mikročestica kreće prema gornjoj površini kapilare i od nje, magnetske čestice obično vuku ostatke kroz tekućinu.
Vidljivost MP pod PCXI značajno varira između uzoraka. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6. Sve ovdje prikazane slike snimljene su magnetom koji se nalazi otprilike 10 mm direktno iznad kapilare. Prividni veliki krugovi su mjehurići zraka zarobljeni u kapilarama, jasno pokazujući crno-bijele rubne karakteristike faznokontrastnog snimanja. Crveni okvir sadrži uvećanje koje pojačava kontrast. Imajte na umu da promjeri magnetskih shema na svim slikama nisu u mjerilu i da su otprilike 100 puta veći od prikazanog.
Kako se magnet pomiče lijevo i desno duž vrha kapilare, ugao MP strune se mijenja kako bi se poravnao s magnetom (vidi Sliku 6), čime se ocrtavaju linije magnetskog polja. Kod MP3-5, nakon što tetiva dostigne granični ugao, čestice se povlače duž gornje površine kapilare. To često rezultira grupiranjem MP-ova u veće grupe blizu mjesta gdje je magnetsko polje najjače (vidi Dodatni video S3:MP5). Ovo je posebno očigledno prilikom snimanja blizu kraja kapilare, što uzrokuje agregaciju i koncentraciju MP-ova na granici tekućina-zrak. Čestice u MP6, koje je bilo teže razaznati nego u MP3-5, nisu bile povučene dok se magnet kretao duž kapilare, ali su se MP strune disocirale, ostavljajući čestice u vidnom polju (vidi Dodatni video S4:MP6). U nekim slučajevima, kada je primijenjeno magnetsko polje smanjeno pomicanjem magneta na veliku udaljenost od mjesta snimanja, svi preostali MP-ovi su se polako spuštali na donju površinu cijevi gravitacijom, dok su ostali u struni (vidi Dodatni video S5: MP3).
Ugao MP niti se mijenja kako se magnet pomiče udesno iznad kapilare. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6. Crveni okvir sadrži uvećanje koje pojačava kontrast. Imajte na umu da su dodatni videozapisi informativni jer otkrivaju važne informacije o strukturi čestica i dinamici koje se ne mogu vizualizirati na ovim statičkim slikama.
Naši testovi su pokazali da sporo pomicanje magneta naprijed-nazad duž traheje olakšava vizualizaciju MP u kontekstu složenog kretanja in vivo. In vivo testiranje nije provedeno jer polistirenske kuglice (MP1 i MP2) nisu bile vidljive u kapilari. Svaki od preostala četiri MP testiran je in vivo s dugom osom magneta konfigurisanom iznad traheje pod uglom od oko 30° u odnosu na vertikalu (vidi slike 2b i 3a), jer je to rezultiralo dužim MP lancima i bilo je efikasnije od konfiguracije završene magnetom. MP3, MP4 i MP6 nisu detektovani u traheji nijedne žive životinje. Kada su disajni putevi pacova snimljeni nakon što su životinje humano ubijene, čestice su ostale nevidljive čak i kada je dodatna zapremina dodana pomoću šprice pumpe. MP5 je imao najveći sadržaj željeznog oksida i bio je jedina vidljiva čestica, te je stoga korišten za procjenu i karakterizaciju in vivo ponašanja MP.
Postavljanje magneta preko traheje tokom isporuke MP-a rezultiralo je koncentracijom mnogih, ali ne svih, MP-ova u vidnom polju. Čestice koje ulaze u traheju najbolje se uočavaju kod humano žrtvovanih životinja. Slika 7 i dodatni video S6: MP5 pokazuje brzo magnetsko hvatanje i poravnanje čestica na površini ventralne traheje, što ukazuje na to da se MP-ovi mogu usmjeriti u željene regije traheje. Prilikom pretrage distalnije duž traheje nakon isporuke MP-a, neki MP-ovi su pronađeni bliže karini, što sugerira da jačina magnetskog polja nije bila dovoljna da sakupi i zadrži sve MP-ove, jer su isporučeni kroz područje maksimalne jačine magnetskog polja tokom procesa fluida. Ipak, postpartalne koncentracije MP-a bile su veće oko snimljenog područja, što sugerira da su mnogi MP-ovi ostali u regijama disajnih puteva gdje je primijenjena jačina magnetskog polja bila najveća.
Slike iz (a) prije i (b) nakon uvođenja MP5 u traheju nedavno eutanaziranog pacova s ​​magnetom postavljenim direktno iznad područja snimanja. Snimljeno područje se nalazi između dva hrskavična prstena. Prije uvođenja MP, u disajnim putevima se nalazi određena količina tečnosti. Crveni okvir sadrži uvećanje za pojačavanje kontrasta. Ove slike su iz videa prikazanog u Dodatnom videu S6:MP5.
Pomjeranje magneta duž traheje in vivo uzrokovalo je promjenu ugla MP lanca unutar površine disajnih puteva na način sličan onome koji se vidi u kapilarima (vidi Sliku 8 i Dodatni video S7:MP5). Međutim, u našoj studiji, MP-ovi se nisu mogli povući duž površine živih disajnih puteva kao što su to mogli s kapilarama. U nekim slučajevima, MP lanac će se produžiti kako se magnet pomiče lijevo i desno. Zanimljivo je da smo također otkrili da niz čestica mijenja dubinu površinskog sloja tekućine kada se magnet pomiče uzdužno duž traheje, a širi se kada se magnet pomiče direktno iznad glave, a niz čestica se rotira u vertikalni položaj (vidi Dodatni video S7). : MP5 u 0:09, dolje desno). Karakteristični obrazac kretanja se promijenio kada je magnet translatiran preko vrha traheje lateralno (tj. lijevo ili desno od životinje, a ne duž cijele dužine traheje). Čestice su i dalje bile jasno vidljive dok su se kretale, ali kada je magnet uklonjen iz traheje, vrhovi nizova čestica postali su vidljivi (pogledajte Dodatni video S8:MP5, počevši od 0:08). Ovo je u skladu s ponašanjem MP-a koje smo primijetili pod djelovanjem magnetskog polja u staklenoj kapilari.
Primjeri slika koje prikazuju MP5 u traheji živog anesteziranog pacova. (a) Magnet se koristi za dobijanje slika iznad i lijevo od traheje, zatim (b) nakon što se magnet pomakne udesno. Crveni okvir sadrži uvećanje za pojačavanje kontrasta. Ove slike su iz videa prikazanog u Dodatnom videu S7:MP5.
Kada su dva pola bila konfigurisana u orijentaciji sjever-jug iznad i ispod traheje (tj. privlačeći se; slika 3b), MP akordi su izgledali duže i nalazili su se na bočnom zidu traheje, a ne na dorzalnoj površini traheje (vidi Dodatni video S9:MP5). Međutim, visoke koncentracije čestica na jednoj lokaciji (tj. dorzalnoj površini traheje) nisu detektovane nakon isporuke tečnosti kada je korišten uređaj sa dva magneta, što se obično dešava kada se koristi uređaj sa jednim magnetom. Zatim, kada je jedan magnet konfigurisan da odbija obrnuto okrenute polove (slika 3c), broj čestica vidljivih u vidnom polju nije se činio povećanim nakon isporuke. Postavljanje obje konfiguracije sa dva magneta je izazovno zbog visokih jačina magnetskog polja koje vuku ili guraju magnete. Postavljanje je zatim promijenjeno na jedan magnet paralelan disajnim putevima, ali koji prolazi kroz disajne puteve pod uglom od 90 stepeni tako da linije polja prelaze zid traheje ortogonalno (slika 3d), orijentacija dizajnirana da utvrdi da li se može uočiti agregacija čestica na bočnom zidu. Međutim, u ovoj konfiguraciji, Nije bilo uočljivog kretanja akumulacije MP ili kretanja magneta. Na osnovu svih ovih rezultata, za in vivo studije genskih nosača odabrana je konfiguracija s jednim magnetom i orijentacijom od 30 stepeni (Slika 3a).
Kada je životinja više puta snimana odmah nakon humanog usmrćivanja, odsustvo ometajućeg kretanja tkiva značilo je da su se u jasnom interhondralnom polju mogle razaznati finije i kraće linije čestica, „klimave“ u skladu s translacijskim kretanjem magneta. Ipak, još uvijek se ne može jasno vidjeti prisustvo i kretanje MP6 čestica.
Titar LV-LacZ bio je 1,8 × 10⁻ TU/ml, a nakon miješanja 1:1 sa CombiMag MP (MP6), životinje su primile 50 μl trahealne doze od 9 × 10⁻ TU/ml LV nosača (tj. 4,5 × 10⁻ TU/pacov). U ovim studijama, umjesto pomjeranja magneta tokom porođaja, fiksirali smo magnet u jednom položaju kako bismo utvrdili da li se LV transdukcija (a) može poboljšati u poređenju sa vektorskom dostavom u odsustvu magnetnog polja i (b) da li se može fokusirati. Ćelije disajnih puteva se transduciraju u magnetne ciljne regije gornjih disajnih puteva.
Prisustvo magneta i upotreba CombiMag-a u kombinaciji sa LV vektorima nisu imali negativne efekte na zdravlje životinja, kao ni naš standardni protokol isporuke LV vektora. Frontalne slike trahealne regije izložene mehaničkim perturbacijama (Dopunska slika 1) pokazale su da su postojali značajno viši nivoi transdukcije u grupi životinja tretiranih LV-MP kada je magnet bio prisutan (Slika 9a). Samo mala količina plavog LacZ bojenja bila je prisutna u kontrolnoj grupi (Slika 9b). Kvantifikacija normalizovanih X-Gal obojenih područja pokazala je da je davanje LV-MP u prisustvu magnetnog polja proizvelo približno 6 puta veće poboljšanje (Slika 9c).
Primjer kompozitnih slika koje prikazuju trahealnu transdukciju pomoću LV-MP (a) u prisustvu magnetskog polja i (b) u odsustvu magneta. (c) Statistički značajno poboljšanje normaliziranog područja LacZ transdukcije unutar traheje pri korištenju magneta (*p = 0,029, t-test, n = 3 po grupi, srednja vrijednost ± SEM).
Neutralno brzo crveno obojeni presjeci (primjer prikazan na Dodatnoj slici 2) pokazali su prisustvo LacZ-obojenih ćelija u sličnom obrascu i na sličnoj lokaciji kao što je prethodno objavljeno.
Ključni izazov za gensku terapiju disajnih puteva ostaje tačna lokalizacija čestica nosača u regije od interesa i postizanje visokog nivoa efikasnosti transdukcije u pokretnom pluću u prisustvu protoka vazduha i aktivnog uklanjanja sluzi. Za LV nosače dizajnirane za liječenje cistične fibroze disajnih puteva, povećanje vremena zadržavanja čestica nosača unutar provodnih disajnih puteva do sada je bio nedostižan cilj. Kao što su istakli Castellani i saradnici, upotreba magnetnih polja za poboljšanje transdukcije ima prednosti u poređenju s drugim metodama isporuke gena kao što je elektroporacija, jer može kombinovati jednostavnost, isplativost, lokalizaciju isporuke, povećanu efikasnost i kraće vrijeme inkubacije, a moguće i manju dozu nosača10. Međutim, in vivo taloženje i ponašanje magnetnih čestica u disajnim putevima pod uticajem spoljnih magnetnih sila nikada nije opisano, niti je zapravo izvodljivost ove metode in vivo dokazana za povećanje nivoa ekspresije gena u intaktnim živim disajnim putevima.
Naši in vitro sinhrotronski PCXI eksperimenti pokazali su da su sve čestice koje smo testirali, s izuzetkom polistirenskog MP, bile vidljive u postavci za snimanje koju smo koristili. U prisustvu magnetskog polja, MP formiraju strune čije su dužine povezane s vrstom čestice i jačinom magnetskog polja (tj. blizinom i kretanjem magneta). Kao što je prikazano na slici 10, strune koje posmatramo formiraju se zbog toga što je svaka pojedinačna čestica magnetizirana i inducira vlastito lokalno magnetsko polje. Ova odvojena polja uzrokuju agregaciju i povezivanje drugih sličnih čestica, s grupnim pokretima sličnim strunama zbog lokalnih sila od lokalnih privlačnih i odbojnih sila drugih čestica.
Shematski prikaz (a, b) nizova čestica generiranih unutar kapilara ispunjenih tekućinom i (c, d) traheje ispunjene zrakom. Treba napomenuti da kapilari i traheja nisu nacrtani u mjerilu. Ploča (a) također sadrži opis MP-a, koji sadrži čestice Fe3O4 raspoređene u nizove.
Kada je magnet pomjeren iznad kapilare, ugao niza čestica dostigao je kritični prag za MP3-5 koji sadrži Fe3O4, nakon čega niz čestica više nije ostajao u prvobitnom položaju, već se pomicao duž površine do novog položaja. magnet. Ovaj efekat se vjerovatno javlja jer je površina staklene kapilare dovoljno glatka da omogući ovo kretanje. Zanimljivo je da se MP6 (CombiMag) nije ponašao na ovaj način, moguće zato što su čestice bile manje, imale različite premaze ili površinske naboje, ili je vlasnička tekućina nosač utjecala na njihovu sposobnost kretanja. Kontrast slike CombiMag čestica je također slabiji, što sugerira da tekućina i čestice mogu imati slične gustoće i stoga se ne kreću lako jedna prema drugoj. Čestice se također mogu zaglaviti ako se magnet kreće prebrzo, što ukazuje na to da jačina magnetskog polja ne može uvijek savladati trenje između čestica u tekućini, što sugerira da možda nije iznenađujuće da su jačina magnetskog polja i udaljenost između magneta i ciljanog područja vrlo važne. Uzeti zajedno, ovi rezultati također sugeriraju da, iako magneti mogu uhvatiti mnoge MP-ove koji teku kroz ciljano područje, malo je vjerojatno da se na magnete može osloniti da ih pomiču. CombiMag čestice duž površine traheje. Stoga zaključujemo da bi in vivo LV-MP studije trebale koristiti statička magnetska polja za fizičko ciljanje specifičnih regija disajnih puteva.
Kada se čestice unesu u tijelo, teško ih je identificirati u kontekstu složenog tjelesnog tkiva u pokretu, ali sposobnost njihovog otkrivanja poboljšana je horizontalnim pomicanjem magneta iznad traheje kako bi se "pomicali" niti mikroplastike (MP). Iako je snimanje uživo moguće, lakše je uočiti kretanje čestica nakon što je životinja humano ubijena. Koncentracije MP-a uglavnom su bile najviše na ovom mjestu kada je magnet postavljen iznad područja snimanja, iako su se neke čestice obično nalazile dalje duž traheje. Za razliku od in vitro studija, čestice se ne mogu povući duž traheje pomicanjem magneta. Ovaj nalaz je u skladu s načinom na koji sluz koja prekriva površinu traheje obično obrađuje udahnute čestice, hvatajući ih u sluzi i potom uklanjajući ih mehanizmom mukocilijarnog čišćenja.
Pretpostavili smo da bi upotreba magneta za privlačenje iznad i ispod traheje (slika 3b) mogla rezultirati ujednačenijim magnetskim poljem, umjesto magnetskog polja koje je visoko koncentrirano u jednoj tački, što potencijalno dovodi do ujednačenije distribucije čestica. Međutim, naša preliminarna studija nije pronašla jasne dokaze koji bi podržali ovu hipotezu. Slično tome, konfigurisanje para magneta za odbijanje (slika 3c) nije rezultiralo većim taloženjem čestica u snimljenom području. Ova dva nalaza pokazuju da postavka s dva magneta ne poboljšava značajno lokalnu kontrolu ciljanja MP-a i da je rezultirajuće jake magnetske sile teško konfigurirati, što ovaj pristup čini manje praktičnim. Slično tome, orijentisanje magneta iznad i kroz traheju (slika 3d) također nije povećalo broj čestica zadržanih u snimljenom području. Neke od ovih alternativnih konfiguracija možda neće biti uspješne jer rezultiraju nižim jačinama magnetskog polja unutar područja taloženja. Stoga se konfiguracija s jednim magnetom od 30 stepeni (slika 3a) smatra najlakšom i najefikasnijom metodom za in vivo testiranje.
Studija LV-MP pokazala je da kada su LV vektori kombinovani sa CombiMagom i isporučeni nakon fizičke perturbacije u prisustvu magnetnog polja, nivoi transdukcije su značajno povećani u traheji u poređenju sa kontrolnom grupom. Na osnovu studija sinhrotronskog snimanja i rezultata LacZ-a, magnetno polje je očigledno bilo u stanju da sačuva LV unutar traheje i smanji broj vektorskih čestica koje su odmah prodrle duboko u pluća. Takva poboljšanja ciljanja mogu dovesti do veće efikasnosti uz smanjenje isporučenih titara, transdukcije van cilja, upalnih i imunoloških nuspojava i troškova nosača gena. Važno je napomenuti da se, prema proizvođaču, CombiMag može koristiti u kombinaciji s drugim metodama transfera gena, uključujući i druge virusne vektore (kao što je AAV) i nukleinske kiseline.