Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Vektor gen untuk pengobatan penyakit paru fibrosis kistik harus menargetkan saluran udara konduksi karena transduksi paru perifer tidak memberikan manfaat terapeutik. Efisiensi transduksi virus berhubungan langsung dengan waktu tinggal vektor. Namun, cairan pengiriman seperti pembawa gen secara alami berdifusi ke dalam alveoli selama inspirasi, dan partikel terapeutik dalam bentuk apa pun dengan cepat dibersihkan oleh transportasi mukosiliar. Memperpanjang waktu tinggal pembawa gen di saluran udara penting tetapi sulit dicapai. Partikel magnetik terkonjugasi pembawa gen yang dapat diarahkan ke permukaan saluran udara dapat meningkatkan penargetan regional. Karena tantangan visualisasi in vivo, perilaku partikel magnetik kecil tersebut pada permukaan saluran udara dengan adanya medan magnet yang diberikan kurang dipahami. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menggunakan pencitraan sinkrotron untuk memvisualisasikan gerakan in vivo dari serangkaian partikel magnetik di trakea tikus yang dibius untuk memeriksa dinamika dan pola perilaku partikel individu dan massal secara in vivo. Kami kemudian juga menilai apakah pengiriman partikel magnetik lentivirus dengan adanya medan magnet akan meningkatkan efisiensi transduksi dalam trakea tikus. Pencitraan sinar-X sinkrotron mengungkap perilaku partikel magnetik dalam medan magnet stasioner dan bergerak secara in vitro dan in vivo. Partikel tidak dapat dengan mudah diseret sepanjang permukaan saluran napas hidup dengan magnet, tetapi selama pengangkutan, endapan terkonsentrasi di bidang pandang tempat medan magnet paling kuat. Efisiensi transduksi juga meningkat enam kali lipat saat partikel magnetik lentivirus dikirimkan dengan adanya medan magnet. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa partikel magnetik lentivirus dan medan magnet dapat menjadi pendekatan yang berharga untuk meningkatkan penargetan vektor gen dan meningkatkan tingkat transduksi dalam saluran napas konduksi secara in vivo.
Fibrosis kistik (CF) disebabkan oleh variasi pada satu gen yang disebut pengatur konduktansi transmembran CF (CFTR). Protein CFTR adalah saluran ion yang terdapat pada banyak sel epitel di seluruh tubuh, termasuk saluran udara konduksi, lokasi utama patogenesis CF. Kelainan CFTR menyebabkan transportasi air abnormal, yang menyebabkan dehidrasi pada permukaan saluran udara, dan mengurangi kedalaman lapisan cairan permukaan saluran udara (ASL). Kondisi ini juga mengganggu kemampuan sistem transpor mukosiliar (MCT) untuk membersihkan partikel dan patogen yang terhirup dari saluran udara. Tujuan kami adalah mengembangkan terapi gen lentivirus (LV) untuk memberikan salinan gen CFTR yang tepat dan meningkatkan kesehatan ASL, MCT, dan paru-paru, serta terus mengembangkan teknologi baru yang mampu mengukur parameter ini secara in vivo1.
Vektor LV adalah salah satu kandidat utama untuk terapi gen saluran napas CF, terutama karena mereka dapat mengintegrasikan gen terapeutik secara permanen ke dalam sel basal saluran napas (sel induk saluran napas). Ini penting karena mereka dapat memulihkan hidrasi normal dan pembersihan lendir dengan berdiferensiasi menjadi sel permukaan saluran napas terkait CF yang dikoreksi gen fungsional, sehingga memberikan manfaat seumur hidup. Vektor LV harus diarahkan melawan saluran napas konduksi, karena di sinilah penyakit paru CF dimulai. Pengiriman vektor lebih dalam ke paru-paru dapat mengakibatkan transduksi alveolar, tetapi ini tidak memiliki manfaat terapeutik pada CF. Namun, cairan seperti pembawa gen secara alami bermigrasi ke alveoli saat inspirasi setelah pengiriman3,4 dan partikel terapeutik dengan cepat dibersihkan ke dalam rongga mulut oleh MCT. Efisiensi transduksi LV secara langsung terkait dengan lamanya waktu vektor tetap berada di samping sel target untuk memungkinkan penyerapan seluler – “waktu tinggal”5 – yang mudah dikurangi dengan aliran udara regional yang khas serta penangkapan lendir partikel terkoordinasi dan MCT. Untuk CF, kemampuan untuk memperpanjang waktu tinggal LV di dalam saluran napas penting untuk mencapai tingkat transduksi yang tinggi di wilayah ini, tetapi sejauh ini merupakan tantangan.
Untuk mengatasi kendala ini, kami menyarankan agar partikel magnetik LV (MP) membantu dalam dua cara yang saling melengkapi. Pertama, mereka dapat dipandu secara magnetik ke permukaan saluran napas untuk meningkatkan penargetan dan membantu partikel pembawa gen berada di wilayah saluran napas yang diinginkan; dan ASL) untuk bergerak ke lapisan sel 6. MP telah banyak digunakan sebagai wahana pengiriman obat yang ditargetkan saat mereka mengikat antibodi, obat kemoterapi, atau molekul kecil lainnya yang menempel pada membran sel atau mengikat reseptor permukaan sel yang relevan dan terakumulasi di lokasi tumor dengan adanya listrik statis. Medan Magnet untuk Pengobatan Kanker 7. Teknik "hipertermal" lainnya bertujuan untuk memanaskan MP saat terpapar medan magnet yang berosilasi, sehingga menghancurkan sel tumor. Prinsip transfeksi magnetik, di mana medan magnet digunakan sebagai agen transfeksi untuk meningkatkan transfer DNA ke sel, umumnya digunakan secara in vitro menggunakan berbagai vektor gen non-virus dan virus untuk garis sel yang sulit ditransduksi. Efektivitas magnetotransfeksi LV telah ditetapkan, dengan pengiriman LV-MP secara in vitro ke garis sel epitel bronkial manusia dengan adanya medan magnet statis, meningkatkan efisiensi transduksi hingga 186 kali lipat dibandingkan dengan vektor LV saja. LV-MP juga telah diterapkan pada model CF in vitro, di mana transfeksi magnetik meningkatkan transduksi LV dalam kultur antarmuka udara-cairan hingga 20 kali lipat dengan adanya sputum CF10. Namun, magnetotransfeksi organ secara in vivo kurang mendapat perhatian dan hanya dievaluasi pada beberapa hewan studi11,12,13,14,15, terutama di paru-paru16,17.Meskipun demikian, peluang untuk transfeksi magnetik dalam terapi paru-paru CF jelas.Tan et al.(2020) menyatakan bahwa “studi bukti konsep tentang pengiriman paru-paru nanopartikel magnetik yang efisien akan membuka jalan bagi strategi inhalasi CFTR di masa depan untuk meningkatkan hasil klinis pada pasien CF”6.
Perilaku partikel magnetik kecil pada permukaan saluran napas dengan adanya medan magnet yang diberikan sulit untuk divisualisasikan dan dipelajari, dan dengan demikian kurang dipahami. Dalam penelitian lain, kami mengembangkan metode pencitraan sinar-X kontras fase berbasis perambatan sinkrotron (PB-PCXI) untuk memvisualisasikan dan mengukur perubahan kecil in vivo pada kedalaman ASL18 dan perilaku MCT19,20 secara non-invasif untuk mengukur hidrasi permukaan saluran gas secara langsung dan digunakan sebagai indikator awal kemanjuran pengobatan. Selain itu, metode evaluasi MCT kami menggunakan partikel berdiameter 10–35 µm yang terdiri dari alumina atau kaca indeks bias tinggi sebagai penanda MCT yang terlihat menggunakan PB-PCXI21. Kedua teknik ini cocok untuk visualisasi berbagai jenis partikel, termasuk MP.
Berkat resolusi spasial dan temporalnya yang tinggi, teknik analisis ASL dan MCT berbasis PB-PCXI kami sangat cocok untuk memeriksa dinamika dan pola perilaku partikel tunggal dan massal secara in vivo guna membantu kami memahami dan mengoptimalkan teknik penyampaian gen MP. Pendekatan yang kami gunakan di sini berasal dari penelitian kami menggunakan garis sinar SPring-8 BL20B2, di mana kami memvisualisasikan pergerakan cairan mengikuti penyampaian dosis vektor semu ke dalam saluran napas nasal dan paru-paru tikus untuk membantu menjelaskan pola ekspresi gen yang tidak seragam yang kami amati dalam penelitian hewan dengan dosis pembawa gen kami 3,4 .
Tujuan dari penelitian ini adalah menggunakan sinkrotron PB-PCXI untuk memvisualisasikan pergerakan in vivo dari serangkaian MP di trakea tikus hidup. Studi pencitraan PB-PCXI ini dirancang untuk menguji berbagai MP, kekuatan medan magnet, dan lokasi untuk menentukan efeknya pada gerakan MP. Kami berhipotesis bahwa medan magnet yang diterapkan secara eksternal akan membantu MP yang dikirim tetap atau bergerak ke area target. Studi ini juga memungkinkan kami untuk mengidentifikasi konfigurasi magnet yang memaksimalkan jumlah partikel yang tertahan di trakea setelah pengendapan. Dalam rangkaian penelitian kedua, kami berusaha menggunakan konfigurasi optimal ini untuk menunjukkan pola transduksi yang dihasilkan dari pengiriman LV-MP in vivo ke saluran napas tikus, berdasarkan asumsi bahwa pengiriman LV-MP dalam konteks penargetan saluran napas akan menghasilkan peningkatan efisiensi transduksi LV.
Semua penelitian hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Universitas Adelaide (M-2019-060 dan M-2020-022) dan Komite Etika Hewan Sinkrotron SPring-8. Eksperimen dilakukan sesuai dengan pedoman ARRIVE.
Semua pencitraan sinar-X dilakukan pada garis sinar BL20XU di sinkrotron SPring-8 di Jepang, menggunakan pengaturan yang mirip dengan yang dijelaskan sebelumnya21,22. Secara singkat, kotak eksperimen terletak 245 m dari cincin penyimpanan sinkrotron. Jarak sampel ke detektor 0,6 m digunakan untuk studi pencitraan partikel dan 0,3 m untuk studi pencitraan in vivo untuk menghasilkan efek kontras fase. Energi sinar monokromatik 25 keV digunakan. Gambar diambil menggunakan konverter sinar-X resolusi tinggi (SPring-8 BM3) yang digabungkan ke detektor sCMOS. Konverter mengubah sinar-X menjadi cahaya tampak menggunakan pengkilap setebal 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), yang kemudian diarahkan ke sensor sCMOS menggunakan objektif mikroskop × 10 (NA 0,3). Detektor sCMOS adalah Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) dengan ukuran array 2048 × 2048 piksel dan ukuran piksel mentah 6,5 × 6,5 µm. Pengaturan ini menghasilkan ukuran piksel isotropik efektif 0,51 µm dan bidang pandang sekitar 1,1 mm × 1,1 mm. Panjang paparan 100 ms dipilih untuk memaksimalkan rasio sinyal terhadap derau partikel magnetik di dalam dan luar saluran napas sambil meminimalkan artefak gerakan yang disebabkan oleh pernapasan. Untuk studi in vivo, rana sinar-X cepat ditempatkan di jalur sinar-X untuk membatasi dosis radiasi dengan menghalangi berkas sinar-X di antara paparan.
Pembawa LV tidak digunakan dalam studi pencitraan SPring-8 PB-PCXI apa pun karena ruang pencitraan BL20XU tidak memiliki sertifikasi Biosafety Level 2. Sebaliknya, kami memilih serangkaian MP yang berkarakterisasi baik dari dua pemasok komersial—mencakup berbagai ukuran, bahan, konsentrasi zat besi, dan aplikasi—pertama untuk memahami bagaimana medan magnet memengaruhi gerakan MP dalam kapiler kaca, dan kemudian dalam saluran udara makhluk hidup. di permukaan. Ukuran MP berkisar antara 0,25 hingga 18 μm dan terbuat dari berbagai bahan (lihat Tabel 1), tetapi komposisi setiap sampel, termasuk ukuran partikel magnetik dalam MP, tidak diketahui. Berdasarkan studi MCT ekstensif kami 19, 20, 21, 23, 24, kami perkirakan MP sekecil 5 μm dapat dilihat di permukaan saluran napas trakea, misalnya dengan mengurangi bingkai berurutan untuk melihat peningkatan visibilitas gerakan MP. MP berukuran 0,25 μm tunggal lebih kecil daripada resolusi perangkat pencitraan, tetapi PB-PCXI diharapkan dapat mendeteksi kontras volume dan gerakan cairan permukaan tempat mereka diendapkan setelah pengendapan.
Sampel untuk setiap MP pada Tabel 1 disiapkan dalam kapiler kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, AS) dengan diameter dalam 0,63 mm. Partikel korpuskular tersedia dalam air, sedangkan partikel CombiMag tersedia dalam cairan milik pabrik. Setiap tabung setengah diisi dengan cairan (sekitar 11 μl) dan ditempatkan pada tempat sampel (lihat Gambar 1). Kapiler kaca ditempatkan secara horizontal pada tahap sampel di kotak pencitraan, masing-masing, dan memposisikan tepi cairan. Magnet boron besi neodymium tanah jarang cangkang nikel (NdFeB) berdiameter 19 mm (panjang 28 mm) (N35, nomor kat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) dengan magnetisasi sisa 1,17 Tesla dipasang pada tahap translasi terpisah untuk mencapai Perubahan posisinya dari jarak jauh selama pencitraan. Akuisisi gambar sinar-X dimulai saat magnet diposisikan sekitar 30 mm di atas sampel, dan gambar diperoleh pada kecepatan 4 bingkai per detik. Selama pencitraan, magnet didekatkan ke tabung kapiler kaca (sekitar 1 mm jauhnya) dan kemudian diterjemahkan sepanjang tabung untuk menilai efek kekuatan medan dan posisi.
Pengaturan pencitraan in vitro yang berisi sampel MP dalam kapiler kaca pada tahap translasi sampel xy. Lintasan berkas sinar X ditandai dengan garis putus-putus merah.
Bahasa Indonesia: Setelah visibilitas in vitro MP ditetapkan, sebagian dari mereka diuji secara in vivo pada tikus Wistar albino betina tipe liar (~12 minggu, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Jepang), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepang) dan 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika) Tikus dibius dengan campuran Pharma), Jepang) dengan injeksi intraperitoneal. Setelah anestesi, mereka dipersiapkan untuk pencitraan dengan membuang bulu di sekitar trakea, memasukkan tabung endotrakeal (ET; kanula iv 16 Ga, Terumo BCT) dan melumpuhkan mereka dalam posisi terlentang di atas pelat pencitraan yang dibuat khusus yang berisi kantong termal untuk menjaga suhu tubuh 22 . Pelat pencitraan kemudian dipasang ke tahap translasi sampel di kotak pencitraan dengan sedikit sudut untuk menyelaraskan trakea secara horizontal di gambar sinar-X, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a.
(a) Pengaturan pencitraan in vivo dalam kotak pencitraan SPring-8, lintasan berkas sinar X ditandai dengan garis putus-putus merah. (b,c) Lokalisasi magnet pada trakea dilakukan dari jarak jauh menggunakan dua kamera IP yang dipasang secara ortogonal. Di sisi kiri gambar layar, terlihat lilitan kawat yang menahan kepala, dan kanula penghantar pada tempatnya di dalam tabung ET.
Sistem pompa jarum suntik yang dikendalikan dari jarak jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) menggunakan jarum suntik kaca 100 μl dihubungkan ke tabung PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) melalui jarum 30 Ga. Tandai tabung untuk memastikan bahwa ujungnya berada pada posisi yang benar di trakea saat memasukkan tabung ET. Dengan menggunakan mikropompa, pendorong jarum suntik ditarik sementara ujung tabung terbenam dalam sampel MP yang akan dikirim. Tabung pengiriman yang dimuat kemudian dimasukkan ke dalam tabung endotrakeal, menempatkan ujungnya di bagian terkuat dari medan magnet yang kami harapkan. Akuisisi gambar dikontrol menggunakan detektor respirasi yang terhubung ke kotak pengaturan waktu berbasis Arduino kami, dan semua sinyal (misalnya suhu, respirasi, pembukaan/penutupan rana dan akuisisi gambar) direkam menggunakan Powerlab dan LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Saat pencitraan Ketika enklosur tidak dapat diakses, dua kamera IP (Panasonic BB-SC382) diposisikan pada sekitar 90° satu sama lain dan digunakan untuk memantau posisi magnet relatif terhadap trakea selama pencitraan (Gbr. 2b,c). Untuk meminimalkan artefak gerakan, satu gambar diperoleh per napas selama dataran tinggi aliran pasang surut akhir.
Magnet dipasangkan ke tahap kedua yang dapat ditempatkan dari luar rumah pencitraan. Berbagai posisi dan konfigurasi magnet diuji, termasuk: Dipasang pada sudut sekitar 30° di atas trakea (konfigurasi ditunjukkan pada Gambar 2a dan 3a); satu magnet di atas hewan dan yang lain di bawah, dengan kutub yang diatur untuk menarik (Gambar 3b); satu magnet di atas hewan dan yang lain di bawah, dengan kutub yang diatur untuk menolak (Gambar 3c); dan satu magnet di atas dan tegak lurus dengan trakea (Gambar 3d). Setelah hewan dan magnet dikonfigurasi dan MP yang akan diuji dimuat ke dalam pompa jarum suntik, berikan dosis 50 μl pada kecepatan 4 μl/detik sambil memperoleh gambar. Magnet kemudian digerakkan maju mundur sepanjang atau secara lateral melintasi trakea sambil terus memperoleh gambar.
Konfigurasi magnet untuk pencitraan in vivo (a) satu magnet di atas trakea pada sudut sekitar 30°, (b) dua magnet diatur untuk menarik, (c) dua magnet diatur untuk menolak, (d) satu magnet di atas dan tegak lurus di trakea. Pengamat melihat ke bawah dari mulut ke paru-paru melalui trakea, dan berkas sinar-X melewati sisi kiri tikus dan keluar dari sisi kanan. Magnet digerakkan sepanjang jalan napas atau ke kiri dan kanan di atas trakea sesuai arah berkas sinar-X.
Kami juga berupaya menentukan visibilitas dan perilaku partikel di saluran napas tanpa adanya gangguan pernapasan dan gerakan jantung. Oleh karena itu, di akhir periode pencitraan, hewan dibunuh secara manusiawi karena overdosis pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, AS; ~65 mg/kg ip). Beberapa hewan ditinggalkan di platform pencitraan, dan setelah pernapasan dan detak jantung berhenti, proses pencitraan diulang, dengan menambahkan dosis MP tambahan jika tidak ada MP yang terlihat di permukaan saluran napas.
Gambar yang diperoleh dikoreksi bidang datar dan bidang gelap, lalu dirangkai menjadi film (20 bingkai per detik; 15-25 × kecepatan normal tergantung pada laju pernapasan) menggunakan skrip khusus yang ditulis dalam MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Semua studi pengiriman vektor gen LV dilakukan di Fasilitas Penelitian Hewan Laboratorium di Universitas Adelaide dan ditujukan untuk menggunakan hasil percobaan SPring-8 untuk menilai apakah pengiriman LV-MP dengan adanya medan magnet dapat meningkatkan transfer gen in vivo. Untuk menilai efek MP dan medan magnet, dua kelompok hewan diperlakukan: satu kelompok diberi LV-MP dengan magnet yang dipasang, dan kelompok lainnya menerima kelompok kontrol dengan LV-MP tanpa magnet.
Vektor gen LV dihasilkan menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya 25, 26. Vektor LacZ mengekspresikan gen beta-galaktosidase yang terlokalisasi pada nukleus yang digerakkan oleh promotor konstitutif MPSV (LV-LacZ), yang menghasilkan produk reaksi biru pada sel yang ditransduksi, terlihat di bagian depan jaringan paru-paru dan potongan jaringan. Titrasi dilakukan dalam kultur sel dengan menghitung secara manual jumlah sel positif LacZ dengan hemocytometer untuk menghitung titer dalam TU/ml. Pembawa dikriopreservasi pada suhu -80 °C, dicairkan sebelum digunakan, dan diikat ke CombiMag dengan mencampur pada rasio 1:1 dan diinkubasi di atas es selama minimal 30 menit sebelum pengiriman.
Tikus Sprague Dawley normal (n = 3/kelompok, ~2-3 dibius secara intraperitoneal dengan campuran medetomidine 0,4 mg/kg (Domitor, Ilium, Australia) dan ketamin 60 mg/kg (Ilium, Australia) berumur satu bulan) ip) injeksi dan kanulasi oral non-bedah dengan kanula iv 16 Ga. Untuk memastikan bahwa jaringan jalan napas trakea menerima transduksi LV, jaringan tersebut dikondisikan menggunakan protokol gangguan mekanis yang telah kami jelaskan sebelumnya, di mana permukaan jalan napas trakea digosok secara aksial dengan keranjang kawat (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, AS) 30 detik28. Pemberian LV-MP trakea kemudian dilakukan dalam lemari pengaman biologis sekitar 10 menit setelah gangguan.
Medan magnet yang digunakan dalam percobaan ini dikonfigurasikan dengan cara yang sama dengan studi pencitraan sinar-X in vivo, dengan magnet yang sama dipegang di atas trakea menggunakan klip stent distilasi (Gambar 4). Volume 50 μl (aliquot 2 × 25 μl) LV-MP diberikan ke dalam trakea (n = 3 hewan) menggunakan pipet yang berisi ujung gel seperti yang dijelaskan sebelumnya. Kelompok kontrol (n = 3 hewan) menerima LV-MP yang sama tanpa menggunakan magnet. Setelah infus selesai, kanula dilepas dari tabung ET dan hewan diekstubasi. Magnet tetap di tempatnya selama 10 menit, kemudian dilepas. Tikus menerima dosis subkutan meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) diikuti dengan pembalikan anestesi dengan injeksi ip 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia). Tikus dijaga tetap hangat dan dipantau sampai pulih sepenuhnya dari anestesi.
Alat penghantar LV-MP dalam lemari pengaman biologis. Hub Luer berwarna abu-abu muda pada tabung ET dapat terlihat menonjol dari mulut dan ujung gel pipet yang ditunjukkan pada gambar dimasukkan melalui tabung ET hingga kedalaman yang diinginkan ke dalam trakea.
Seminggu setelah prosedur pemberian dosis LV-MP, hewan dibunuh secara manusiawi dengan inhalasi CO2 100% dan ekspresi LacZ dinilai menggunakan pengobatan X-gal standar kami. Tiga cincin tulang rawan paling kaudal dihilangkan untuk memastikan bahwa kerusakan mekanis atau retensi cairan dari penempatan tabung endotrakeal tidak termasuk dalam analisis. Setiap trakea dipotong memanjang untuk membuat dua bagian untuk analisis, dan dipasang di cawan berisi karet silikon (Sylgard, Dow Inc) menggunakan jarum Minutien (Fine Science Tools) untuk memvisualisasikan permukaan luminal. Distribusi dan pola sel yang ditransduksi dikonfirmasi oleh fotografi frontal menggunakan mikroskop Nikon (SMZ1500) dengan kamera DigiLite dan perangkat lunak TCapture (Tucsen Photonics, Tiongkok). Gambar diperoleh pada perbesaran 20x (termasuk pengaturan tertinggi untuk lebar penuh trakea), dengan seluruh panjang trakea dicitrakan langkah demi langkah, memastikan tumpang tindih yang cukup antara setiap gambar untuk memungkinkan "penjahitan" gambar. Gambar dari setiap trakea kemudian disusun menjadi gambar komposit tunggal menggunakan Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) yang memanfaatkan algoritma gerakan planar. Area ekspresi LacZ dalam gambar komposit trakea dari setiap hewan diukur menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya, menggunakan pengaturan 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15, dan Value < 0,7. Dengan menelusuri kontur jaringan, masker dibuat secara manual di GIMP v2.10.24 untuk setiap gambar komposit untuk mengidentifikasi area jaringan dan mencegah deteksi palsu dari luar jaringan trakea. Area yang diwarnai dari semua gambar komposit dari setiap hewan dijumlahkan untuk menghasilkan total area yang diwarnai untuk hewan tersebut. Area yang diwarnai kemudian dibagi dengan total area masker untuk menghasilkan area yang dinormalisasi.
Setiap trakea ditanamkan dalam parafin dan potongan setebal 5 μm dipotong. Potongan tersebut diwarnai dengan merah cepat netral selama 5 menit dan gambar diperoleh menggunakan mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 dan perangkat lunak penangkapan elemen NIS (versi 5.20.00).
Semua analisis statistik dilakukan dalam GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Signifikansi statistik ditetapkan pada p ≤ 0,05. Normalitas diverifikasi menggunakan uji Shapiro-Wilk, dan perbedaan dalam pewarnaan LacZ dinilai menggunakan uji-t tidak berpasangan.
Enam MP yang dijelaskan dalam Tabel 1 diperiksa menggunakan PCXI, dan visibilitasnya dijelaskan dalam Tabel 2. Dua MP polistirena (MP1 dan MP2; masing-masing 18 μm dan 0,25 μm) tidak terlihat di bawah PCXI, tetapi sampel lainnya dapat diidentifikasi (contoh ditunjukkan pada Gambar 5). MP3 dan MP4 (10-15% Fe3O4; masing-masing 0,25 μm dan 0,9 μm) terlihat samar-samar. Meskipun mengandung beberapa partikel terkecil yang diuji, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) adalah yang paling menonjol. Produk CombiMag MP6 sulit dikenali. Dalam semua kasus, kemampuan kami untuk mendeteksi MP ditingkatkan secara signifikan dengan menerjemahkan magnet bolak-balik sejajar dengan kapiler. Ketika magnet menjauh dari kapiler, partikel memanjang dalam untaian panjang, tetapi ketika magnet semakin dekat dan kekuatan medan magnet meningkat, untaian partikel memendek Partikel-partikel bermigrasi ke arah permukaan atas kapiler (lihat Video Tambahan S1: MP4), sehingga meningkatkan kerapatan partikel pada permukaan. Sebaliknya, saat magnet dilepaskan dari kapiler, kekuatan medan berkurang dan MP tersusun ulang menjadi untaian panjang yang memanjang dari permukaan atas kapiler (lihat Video Tambahan S2: MP4). Setelah magnet berhenti bergerak, partikel-partikel terus bergerak untuk waktu yang singkat setelah mencapai posisi kesetimbangan. Saat MP bergerak mendekati dan menjauhi permukaan atas kapiler, partikel-partikel magnetik biasanya menyeret serpihan melalui cairan.
Visibilitas MP pada PCXI bervariasi secara signifikan di antara sampel. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5, dan (d) MP6. Semua gambar yang ditampilkan di sini diambil dengan magnet yang terletak sekitar 10 mm tepat di atas kapiler. Lingkaran besar yang tampak adalah gelembung udara yang terperangkap dalam kapiler, yang dengan jelas menunjukkan fitur tepi hitam dan putih dari pencitraan kontras fase. Kotak merah berisi pembesaran peningkatan kontras. Perhatikan bahwa diameter skema magnet pada semua gambar tidak berskala dan sekitar 100 kali lebih besar daripada yang ditampilkan.
Saat magnet ditranslasikan ke kiri dan kanan sepanjang bagian atas kapiler, sudut untaian MP berubah agar sejajar dengan magnet (lihat Gambar 6), sehingga menggambarkan garis medan magnet. Untuk MP3-5, setelah tali mencapai sudut ambang, partikel diseret sepanjang permukaan atas kapiler. Hal ini sering kali mengakibatkan MP mengelompok menjadi kelompok yang lebih besar di dekat tempat medan magnet paling kuat (lihat Video Tambahan S3:MP5). Hal ini juga terbukti secara khusus saat pencitraan di dekat ujung kapiler, yang menyebabkan MP berkumpul dan terkonsentrasi di antarmuka udara-fluida. Partikel dalam MP6, yang lebih sulit untuk dilihat daripada MP3-5, tidak terseret saat magnet bergerak sepanjang kapiler, tetapi untaian MP terdisosiasi, meninggalkan partikel di bidang pandang (lihat Video Tambahan S4:MP6). Dalam beberapa kasus, saat medan magnet yang diberikan dikurangi dengan menggerakkan magnet pada jarak yang jauh dari lokasi pencitraan, MP yang tersisa perlahan turun ke permukaan bawah tabung oleh gravitasi sambil tetap berada di untaian (lihat Video Tambahan S5: (MP3).
Sudut untaian MP berubah saat magnet ditranslasikan ke kanan di atas kapiler. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5, dan (d) MP6. Kotak merah berisi perbesaran peningkatan kontras. Perhatikan bahwa video tambahan bersifat informatif karena mengungkap struktur partikel penting dan informasi dinamis yang tidak dapat divisualisasikan dalam gambar statis ini.
Pengujian kami menunjukkan bahwa menggerakkan magnet perlahan maju mundur sepanjang trakea memfasilitasi visualisasi MP dalam konteks gerakan kompleks in vivo. Pengujian in vivo tidak dilakukan karena manik-manik polistirena (MP1 dan MP2) tidak terlihat di kapiler. Masing-masing dari empat MP yang tersisa diuji in vivo dengan sumbu panjang magnet yang dikonfigurasi di atas trakea pada sudut sekitar 30° ke vertikal (lihat Gambar 2b dan 3a), karena ini menghasilkan rantai MP yang lebih panjang dan lebih efektif daripada konfigurasi magnet yang diakhiri. MP3, MP4 dan MP6 tidak terdeteksi di trakea hewan hidup mana pun. Ketika saluran napas tikus divisualisasikan setelah hewan-hewan itu dibunuh secara manusiawi, partikel-partikel itu tetap tidak terlihat bahkan ketika volume tambahan ditambahkan menggunakan pompa jarum suntik. MP5 memiliki kandungan oksida besi tertinggi dan merupakan satu-satunya partikel yang terlihat, dan oleh karena itu digunakan untuk menilai dan mengkarakterisasi perilaku in vivo MP.
Penempatan magnet di atas trakea selama pemberian MP menyebabkan banyak, tetapi tidak semua, MP terkonsentrasi di bidang pandang. Partikel yang memasuki trakea paling baik diamati pada hewan yang dikorbankan secara manusiawi. Gambar 7 dan Video Tambahan S6: MP5 menunjukkan penangkapan magnetik yang cepat dan penyelarasan partikel pada permukaan trakea ventral, yang menunjukkan bahwa MP dapat diarahkan ke daerah trakea yang diinginkan. Ketika mencari lebih jauh di sepanjang trakea setelah pemberian MP, beberapa MP ditemukan lebih dekat ke karina, yang menunjukkan bahwa kekuatan medan magnet tidak cukup untuk mengumpulkan dan menahan semua MP, karena mereka diberikan melalui daerah kekuatan medan magnet maksimum selama proses cairan. Meskipun demikian, konsentrasi MP pascapersalinan lebih tinggi di sekitar area yang di-scan, yang menunjukkan bahwa banyak MP tetap berada di daerah saluran napas tempat kekuatan medan magnet yang diberikan paling tinggi.
Gambar dari (a) sebelum dan (b) setelah pemberian MP5 ke dalam trakea tikus yang baru saja di-eutanasia dengan magnet yang diposisikan tepat di atas area pencitraan. Area yang di-imaging terletak di antara dua cincin tulang rawan. Sebelum pemberian MP, ada sedikit cairan di saluran napas. Kotak merah berisi pembesaran yang meningkatkan kontras. Gambar-gambar ini berasal dari video yang ditayangkan dalam Video Tambahan S6:MP5.
Penerjemahan magnet di sepanjang trakea in vivo menyebabkan rantai MP mengubah sudut dalam permukaan saluran napas dengan cara yang mirip dengan yang terlihat di kapiler (lihat Gambar 8 dan Video Tambahan S7:MP5). Namun, dalam penelitian kami, MP tidak dapat diseret di sepanjang permukaan saluran napas hidup seperti yang terjadi pada kapiler. Dalam beberapa kasus, rantai MP akan bertambah panjang saat magnet bergerak ke kiri dan kanan. Menariknya, kami juga menemukan bahwa untaian partikel tampaknya mengubah kedalaman lapisan cairan permukaan saat magnet digerakkan memanjang di sepanjang trakea, dan mengembang saat magnet digerakkan langsung ke atas kepala dan untaian partikel diputar ke posisi vertikal (lihat Video Tambahan S7). : MP5 pada 0:09, kanan bawah). Pola gerak yang khas berubah ketika magnet dipindahkan melintasi bagian atas trakea secara lateral (yaitu, ke kiri atau kanan hewan, bukan sepanjang trakea). Partikel-partikel tersebut masih terlihat jelas ketika bergerak, tetapi ketika magnet dikeluarkan dari trakea, ujung-ujung untaian partikel menjadi terlihat (lihat Video Tambahan S8:MP5, mulai dari 0:08). Hal ini konsisten dengan perilaku MP yang kami amati di bawah medan magnet yang diterapkan dalam kapiler kaca.
Contoh gambar yang menunjukkan MP5 dalam trakea tikus hidup yang dibius. (a) Magnet digunakan untuk memperoleh gambar di atas dan di sebelah kiri trakea, kemudian (b) setelah magnet digerakkan ke kanan. Kotak merah berisi perbesaran penambah kontras. Gambar-gambar ini berasal dari video yang ditayangkan dalam Video Tambahan S7:MP5.
Bahasa Indonesia:Ketika kedua kutub dikonfigurasikan dalam orientasi utara-selatan di atas dan di bawah trakea (yaitu menarik; Gambar 3b), korda MP tampak lebih panjang dan terletak di dinding samping trakea daripada di permukaan trakea dorsal (lihat Video Tambahan S9:MP5).Namun, konsentrasi partikel yang tinggi di satu lokasi (yaitu, permukaan dorsal trakea) tidak terdeteksi setelah pemberian cairan ketika perangkat magnet ganda digunakan, yang biasanya terjadi ketika perangkat magnet tunggal digunakan.Kemudian ketika satu magnet dikonfigurasikan untuk menolak kutub secara terbalik (Gambar 3c), jumlah partikel yang terlihat di bidang pandang tampaknya tidak meningkat setelah pemberian.Pengaturan kedua konfigurasi magnet ganda menantang karena kekuatan medan magnet yang tinggi yang menarik atau mendorong magnet, masing-masing.Pengaturan kemudian diubah menjadi magnet tunggal yang sejajar dengan jalan napas tetapi melewati jalan napas pada 90 derajat sehingga garis medan melintasi dinding trakea secara ortogonal (Gambar 3d), orientasi yang dirancang untuk menentukan apakah agregasi partikel pada dinding samping dapat diamati. Namun, dalam konfigurasi ini, tidak ada pergerakan akumulasi MP atau pergerakan magnet yang dapat diidentifikasi. Berdasarkan semua hasil ini, konfigurasi orientasi magnet tunggal 30 derajat (Gambar 3a) dipilih untuk studi pembawa gen in vivo.
Ketika hewan tersebut berulang kali dicitrakan segera setelah pembunuhan yang manusiawi, tidak adanya gerakan jaringan yang membingungkan berarti bahwa garis partikel yang lebih halus dan lebih pendek dapat dilihat di bidang interchondral yang jelas, "bergoyang" sesuai dengan gerakan translasi magnet. Meskipun demikian, masih belum dapat melihat dengan jelas keberadaan dan gerakan partikel MP6.
Titer LV-LacZ adalah 1,8 × 108 TU/ml, dan setelah pencampuran 1:1 dengan CombiMag MP (MP6), hewan menerima dosis trakea 50 μl 9 × 107 TU/ml kendaraan LV (yaitu 4,5 × 106 TU/tikus). ).Dalam penelitian ini, alih-alih menerjemahkan magnet selama persalinan, kami memperbaiki magnet dalam satu posisi untuk menentukan apakah transduksi LV (a) dapat ditingkatkan dibandingkan dengan pengiriman vektor tanpa adanya medan magnet, dan (b) dapat difokuskan Sel-sel saluran napas ditransduksi ke daerah target magnetik saluran napas bagian atas.
Kehadiran magnet dan penggunaan CombiMag yang dikombinasikan dengan vektor LV tampaknya tidak memiliki efek buruk pada kesehatan hewan, seperti halnya protokol pengiriman vektor LV standar kami. Gambar frontal dari daerah trakea yang mengalami gangguan mekanis (Gambar Tambahan 1) menunjukkan bahwa ada tingkat transduksi yang secara signifikan lebih tinggi pada kelompok hewan yang diobati dengan LV-MP saat magnet hadir (Gambar 9a). Hanya sedikit pewarnaan LacZ biru yang hadir dalam kelompok kontrol (Gambar 9b). Kuantifikasi area pewarnaan X-Gal yang dinormalisasi menunjukkan bahwa pemberian LV-MP dengan adanya medan magnet menghasilkan peningkatan sekitar 6 kali lipat (Gambar 9c).
Contoh gambar komposit yang menunjukkan transduksi trakea oleh LV-MP (a) dengan adanya medan magnet dan (b) tanpa adanya magnet. (c) Peningkatan yang signifikan secara statistik pada area transduksi LacZ yang dinormalisasi dalam trakea saat menggunakan magnet (*p = 0,029, uji-t, n = 3 per kelompok, rata-rata ± SEM).
Potongan yang diwarnai merah cepat netral (contoh ditunjukkan pada Gambar Tambahan 2) menunjukkan sel yang diwarnai LacZ hadir dalam pola dan lokasi yang sama seperti yang dilaporkan sebelumnya.
Tantangan utama untuk terapi gen saluran napas tetaplah lokalisasi akurat partikel pembawa ke daerah yang diinginkan dan mencapai tingkat efisiensi transduksi yang tinggi pada paru-paru yang bergerak dengan adanya aliran udara dan pembersihan mukus yang aktif. Bagi pembawa LV yang dirancang untuk mengobati penyakit saluran napas CF, meningkatkan waktu tinggal partikel pembawa dalam saluran napas konduksi merupakan tujuan yang sulit dipahami sebelumnya. Seperti yang ditunjukkan oleh Castellani dkk., penggunaan medan magnet untuk meningkatkan transduksi memiliki beberapa keuntungan dibandingkan dengan metode penghantaran gen lainnya seperti elektroporasi, karena dapat menggabungkan kesederhanaan, efektivitas biaya, lokalisasi penghantaran, peningkatan efisiensi, dan waktu inkubasi yang lebih pendek, dan mungkin dosis pembawa yang lebih kecil10. Namun, deposisi in vivo dan perilaku partikel magnetik di saluran napas di bawah pengaruh gaya magnet eksternal belum pernah dijelaskan, juga belum pernah dibuktikan kelayakan metode ini secara in vivo untuk meningkatkan tingkat ekspresi gen di saluran napas hidup yang utuh.
Percobaan sinkrotron PCXI in vitro kami memperlihatkan bahwa semua partikel yang kami uji, kecuali polistirena MP, terlihat dalam perangkat pencitraan yang kami gunakan. Di hadapan medan magnet, MP membentuk untaian yang panjangnya terkait dengan jenis partikel dan kekuatan medan magnet (yaitu kedekatan dan gerakan magnet). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10, untaian yang kami amati terbentuk karena setiap partikel individu dimagnetisasi dan menginduksi medan magnet lokalnya sendiri. Medan-medan terpisah ini menyebabkan partikel serupa lainnya untuk berkumpul dan terhubung, dengan gerakan seperti untaian kelompok karena gaya lokal dari gaya tarik dan tolak lokal partikel lain.
Skema yang menunjukkan (a,b) rangkaian partikel yang dihasilkan di dalam kapiler berisi cairan dan (c,d) trakea berisi udara. Perhatikan bahwa kapiler dan trakea tidak digambar sesuai skala. Panel (a) juga berisi deskripsi MP, yang berisi partikel Fe3O4 yang tersusun dalam untaian.
Bahasa Indonesia:Ketika magnet digerakkan di atas kapiler, sudut untaian partikel mencapai ambang kritis untuk MP3-5 yang mengandung Fe3O4, setelah itu untaian partikel tidak lagi tinggal di posisi semula, tetapi bergerak sepanjang permukaan ke posisi baru.magnet. Efek ini kemungkinan terjadi karena permukaan kapiler kaca cukup halus untuk memungkinkan gerakan ini terjadi. Menariknya, MP6 (CombiMag) tidak berperilaku seperti ini, mungkin karena partikelnya lebih kecil, memiliki lapisan atau muatan permukaan yang berbeda, atau cairan pembawa yang dipatenkan memengaruhi kemampuannya untuk bergerak. Kontras gambar partikel CombiMag juga lebih lemah, menunjukkan bahwa cairan dan partikel mungkin memiliki kepadatan yang sama dan karena itu tidak mudah bergerak ke arah satu sama lain. Partikel juga dapat tersangkut jika magnet bergerak terlalu cepat, yang menunjukkan bahwa kekuatan medan magnet tidak selalu dapat mengatasi gesekan antara partikel dalam cairan, yang menunjukkan bahwa mungkin tidak mengherankan bahwa kekuatan medan magnet dan jarak antara magnet dan area target Sangat penting. Secara keseluruhan, hasil ini juga menunjukkan bahwa, meskipun magnet dapat menangkap banyak MP yang mengalir melalui area target, tidak mungkin bahwa magnet dapat diandalkan untuk menggerakkan partikel CombiMag di sepanjang permukaan trakea. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa studi LV-MP in vivo harus memanfaatkan medan magnet statis untuk secara fisik menargetkan wilayah tertentu dari pohon saluran napas.
Ketika partikel dikirimkan dalam tubuh, mereka sulit diidentifikasi dalam konteks jaringan tubuh bergerak yang kompleks, tetapi kemampuan untuk mendeteksinya ditingkatkan dengan menerjemahkan magnet secara horizontal di atas trakea untuk "menggoyangkan" untaian MP. Meskipun pencitraan langsung dimungkinkan, lebih mudah untuk membedakan gerakan partikel setelah hewan tersebut dibunuh secara manusiawi. Konsentrasi MP umumnya tertinggi di lokasi ini ketika magnet diposisikan di atas area pencitraan, meskipun beberapa partikel biasanya ditemukan lebih jauh di sepanjang trakea. Berbeda dengan penelitian in vitro, partikel tidak dapat diseret sepanjang trakea dengan menerjemahkan magnet. Temuan ini konsisten dengan bagaimana lendir yang melapisi permukaan trakea biasanya memproses partikel yang terhirup, menjebaknya dalam lendir dan kemudian dibersihkan oleh mekanisme pembersihan mukosiliar.
Kami berhipotesis bahwa penggunaan magnet untuk menarik di atas dan di bawah trakea (Gbr. 3b) dapat menghasilkan medan magnet yang lebih seragam, daripada medan magnet yang sangat terkonsentrasi di satu titik, yang berpotensi menghasilkan distribusi partikel yang lebih seragam. Namun, studi pendahuluan kami tidak menemukan bukti yang jelas untuk mendukung hipotesis ini. Demikian pula, mengonfigurasi sepasang magnet untuk saling menolak (Gbr. 3c) tidak menghasilkan lebih banyak pengendapan partikel di area yang dicitrakan. Kedua temuan ini menunjukkan bahwa pengaturan magnet ganda tidak secara signifikan meningkatkan kontrol lokal penargetan MP, dan bahwa gaya magnet kuat yang dihasilkan sulit dikonfigurasi, sehingga pendekatan ini kurang praktis. Demikian pula, mengarahkan magnet di atas dan melalui trakea (Gbr. 3d) juga tidak meningkatkan jumlah partikel yang tertahan di area yang dicitrakan. Beberapa konfigurasi alternatif ini mungkin tidak berhasil karena menghasilkan kekuatan medan magnet yang lebih rendah di dalam area pengendapan. Oleh karena itu, konfigurasi magnet sudut 30 derajat tunggal (Gambar 3a) dianggap sebagai metode termudah dan paling efisien untuk in vivo pengujian.
Studi LV-MP memperlihatkan bahwa ketika vektor LV dikombinasikan dengan CombiMag dan dikirimkan setelah gangguan fisik dengan adanya medan magnet, kadar transduksi meningkat secara signifikan di trakea dibandingkan dengan kontrol. Berdasarkan studi pencitraan sinkrotron dan hasil LacZ, medan magnet tampaknya mampu mempertahankan LV di dalam trakea dan mengurangi jumlah partikel vektor yang langsung menembus jauh ke dalam paru-paru. Peningkatan penargetan tersebut dapat menghasilkan efikasi yang lebih tinggi sekaligus mengurangi titer yang dikirimkan, transduksi yang tidak sesuai target, efek samping inflamasi dan imun, serta biaya pembawa gen. Yang terpenting, menurut produsennya, CombiMag dapat digunakan bersama dengan metode transfer gen lainnya, termasuk dengan vektor virus lainnya (seperti AAV) dan asam nukleat.