Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Vektor gen untuk pengobatan penyakit paru fibrosis kistik harus menargetkan saluran pernapasan karena transduksi paru perifer tidak memberikan manfaat terapeutik. Efisiensi transduksi virus berhubungan langsung dengan waktu tinggal vektor. Namun, cairan pengantar seperti pembawa gen secara alami berdifusi ke dalam alveoli selama inspirasi, dan partikel terapeutik dalam bentuk apa pun dengan cepat dibersihkan oleh transportasi mukosiliar. Memperpanjang waktu tinggal pembawa gen di saluran pernapasan penting tetapi sulit dicapai. Partikel magnetik yang dikonjugasikan dengan pembawa gen yang dapat diarahkan ke permukaan saluran pernapasan dapat meningkatkan penargetan regional. Karena tantangan visualisasi in vivo, perilaku partikel magnetik kecil tersebut pada permukaan saluran pernapasan dengan adanya medan magnet yang diterapkan kurang dipahami. Tujuan penelitian ini adalah untuk menggunakan pencitraan sinkrotron untuk memvisualisasikan gerakan in vivo dari serangkaian partikel magnetik di trakea tikus yang dibius untuk memeriksa dinamika dan pola perilaku partikel individu dan massal secara in vivo. Kami kemudian juga menilai apakah pengiriman partikel magnetik lentivirus dengan adanya medan magnet akan meningkatkan efisiensi transduksi di trakea tikus. Pencitraan sinar-X sinkrotron mengungkapkan perilaku partikel magnetik dalam medan magnet stasioner dan bergerak secara in vitro dan in vivo. Partikel tidak dapat dengan mudah ditarik di sepanjang permukaan saluran udara hidup dengan magnet, tetapi selama transportasi, endapan terkonsentrasi di bidang pandang di mana medan magnet paling kuat. Efisiensi transduksi juga meningkat enam kali lipat ketika partikel magnetik lentivirus diberikan dengan adanya medan magnet. Secara bersamaan, hasil ini menunjukkan bahwa partikel magnetik lentivirus dan medan magnet mungkin merupakan pendekatan yang berharga untuk meningkatkan penargetan vektor gen dan meningkatkan tingkat transduksi di saluran udara konduksi secara in vivo.
Fibrosis kistik (CF) disebabkan oleh variasi pada satu gen tunggal yang disebut regulator konduktansi transmembran CF (CFTR). Protein CFTR adalah saluran ion yang terdapat di banyak sel epitel di seluruh tubuh, termasuk saluran pernapasan, yang merupakan lokasi utama patogenesis CF. Cacat CFTR menyebabkan transportasi air yang abnormal, menyebabkan dehidrasi permukaan saluran pernapasan dan mengurangi kedalaman lapisan cairan permukaan saluran pernapasan (ASL). Hal ini juga mengganggu kemampuan sistem transportasi mukosiliar (MCT) untuk membersihkan partikel dan patogen yang terhirup dari saluran pernapasan. Tujuan kami adalah untuk mengembangkan terapi gen lentivirus (LV) untuk memberikan salinan gen CFTR yang benar dan meningkatkan ASL, MCT, dan kesehatan paru-paru, serta untuk terus mengembangkan teknologi baru yang mampu mengukur parameter ini secara in vivo1.
Vektor LV merupakan salah satu kandidat utama untuk terapi gen saluran napas CF, terutama karena vektor ini dapat secara permanen mengintegrasikan gen terapeutik ke dalam sel basal saluran napas (sel punca saluran napas). Hal ini penting karena vektor LV dapat mengembalikan hidrasi normal dan pembersihan lendir dengan berdiferensiasi menjadi sel permukaan saluran napas fungsional yang terkait dengan CF dan telah dikoreksi gennya, sehingga memberikan manfaat seumur hidup. Vektor LV harus diarahkan ke saluran napas konduksi, karena di sinilah penyakit paru-paru CF dimulai. Pengiriman vektor lebih dalam ke paru-paru dapat menghasilkan transduksi alveolar, tetapi ini tidak memiliki manfaat terapeutik pada CF. Namun, cairan seperti pembawa gen secara alami bermigrasi ke alveoli saat inspirasi setelah pengiriman3,4 dan partikel terapeutik dengan cepat dibersihkan ke dalam rongga mulut oleh MCT. Efisiensi transduksi LV berhubungan langsung dengan lamanya waktu vektor tetap berada di dekat sel target untuk memungkinkan penyerapan seluler – "waktu tinggal"5 – yang mudah dikurangi oleh aliran udara regional yang khas serta penangkapan lendir partikel yang terkoordinasi dan MCT. Untuk CF, kemampuan untuk memperpanjang waktu tinggal LV di dalam saluran napas penting untuk mencapai tingkat yang tinggi. transduksi di wilayah ini, tetapi sejauh ini masih menantang.
Untuk mengatasi kendala ini, kami menyarankan agar partikel magnetik LV (MP) dapat membantu dalam dua cara yang saling melengkapi. Pertama, partikel tersebut dapat dipandu secara magnetis ke permukaan saluran napas untuk meningkatkan penargetan dan membantu partikel pembawa gen berada di wilayah saluran napas yang diinginkan; dan ASL) untuk bergerak ke lapisan sel 6. MP telah banyak digunakan sebagai kendaraan pengiriman obat yang ditargetkan ketika mengikat antibodi, obat kemoterapi, atau molekul kecil lainnya yang menempel pada membran sel atau mengikat reseptor permukaan sel yang relevan dan terakumulasi di lokasi tumor dengan adanya listrik statis. Medan Magnet untuk Pengobatan Kanker 7. Teknik “hipertermal” lainnya bertujuan untuk memanaskan MP ketika terpapar medan magnet berosilasi, sehingga menghancurkan sel tumor. Prinsip transfeksi magnetik, di mana medan magnet digunakan sebagai agen transfeksi untuk meningkatkan transfer DNA ke sel, umumnya digunakan secara in vitro menggunakan berbagai vektor gen non-virus dan virus untuk lini sel yang sulit ditransduksi. Efektivitas magnetotransfeksi LV telah ditetapkan, dengan pemberian LV-MP secara in vitro ke lini sel epitel bronkial manusia dengan adanya medan magnet statis, meningkatkan efisiensi transduksi hingga 186 kali lipat dibandingkan dengan vektor LV saja. LV-MP juga telah diterapkan pada model CF in vitro, di mana transfeksi magnetik meningkatkan transduksi LV dalam kultur antarmuka udara-cair hingga 20 kali lipat dengan adanya dahak CF10. Namun, magnetotransfeksi organ secara in vivo relatif kurang mendapat perhatian dan hanya dievaluasi pada beberapa hewan. penelitian11,12,13,14,15, terutama di paru-paru16,17.Meskipun demikian, peluang untuk transfeksi magnetik dalam terapi paru-paru CF jelas terlihat.Tan et al.(2020) menyatakan bahwa “studi pembuktian konsep pengiriman nanopartikel magnetik yang efisien ke paru-paru akan membuka jalan bagi strategi inhalasi CFTR di masa depan untuk meningkatkan hasil klinis pada pasien CF”6.
Perilaku partikel magnetik kecil pada permukaan saluran napas dengan adanya medan magnet yang diterapkan sulit divisualisasikan dan dipelajari, sehingga kurang dipahami. Dalam penelitian lain, kami mengembangkan metode pencitraan sinar-X kontras fase berbasis propagasi sinkrotron (PB-PCXI) untuk memvisualisasikan dan mengukur secara non-invasif perubahan kecil in vivo pada kedalaman ASL18 dan perilaku MCT19,20 untuk mengukur langsung hidrasi permukaan saluran gas dan digunakan sebagai indikator awal efektivitas pengobatan. Selain itu, metode evaluasi MCT kami menggunakan partikel berdiameter 10–35 µm yang terbuat dari alumina atau kaca indeks bias tinggi sebagai penanda MCT yang terlihat menggunakan PB-PCXI21. Kedua teknik ini cocok untuk visualisasi berbagai jenis partikel, termasuk MP.
Karena resolusi spasial dan temporalnya yang tinggi, teknik analisis ASL dan MCT berbasis PB-PCXI kami sangat cocok untuk memeriksa dinamika dan pola perilaku partikel tunggal dan massal secara in vivo untuk membantu kami memahami dan mengoptimalkan teknik pengiriman gen MP. Pendekatan yang kami gunakan di sini berasal dari studi kami menggunakan beamline SPring-8 BL20B2, di mana kami memvisualisasikan pergerakan cairan setelah pemberian dosis vektor palsu ke saluran pernapasan hidung dan paru-paru tikus untuk membantu menjelaskan pola ekspresi gen yang tidak seragam yang diamati dalam studi hewan dosis pembawa gen kami 3,4.
Tujuan penelitian ini adalah untuk menggunakan sinkrotron PB-PCXI untuk memvisualisasikan pergerakan in vivo dari serangkaian MP di trakea tikus hidup. Studi pencitraan PB-PCXI ini dirancang untuk menguji berbagai MP, kekuatan medan magnet, dan lokasi untuk menentukan pengaruhnya terhadap pergerakan MP. Kami berhipotesis bahwa medan magnet yang diterapkan secara eksternal akan membantu MP yang diberikan tetap berada di tempatnya atau bergerak ke area target. Studi ini juga memungkinkan kami untuk mengidentifikasi konfigurasi magnet yang memaksimalkan jumlah partikel yang tertahan di trakea setelah pengendapan. Dalam serangkaian studi kedua, kami berupaya menggunakan konfigurasi optimal ini untuk mendemonstrasikan pola transduksi yang dihasilkan dari pemberian LV-MP secara in vivo ke saluran napas tikus, berdasarkan asumsi bahwa pemberian LV-MP dalam konteks penargetan saluran napas akan menghasilkan peningkatan efisiensi transduksi LV.
Semua penelitian pada hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Universitas Adelaide (M-2019-060 dan M-2020-022) dan Komite Etika Hewan Sinkrotron SPring-8. Eksperimen dilakukan sesuai dengan pedoman ARRIVE.
Semua pencitraan sinar-X dilakukan di jalur berkas BL20XU di sinkrotron SPring-8 di Jepang, menggunakan pengaturan yang mirip dengan yang dijelaskan sebelumnya21,22. Singkatnya, kotak eksperimental terletak 245 m dari cincin penyimpanan sinkrotron. Jarak sampel ke detektor 0,6 m digunakan untuk studi pencitraan partikel dan 0,3 m untuk studi pencitraan in vivo untuk menghasilkan efek kontras fase. Energi berkas monokromatik 25 keV digunakan. Gambar diambil menggunakan konverter sinar-X resolusi tinggi (SPring-8 BM3) yang dihubungkan ke detektor sCMOS. Konverter mengubah sinar-X menjadi cahaya tampak menggunakan scintillator setebal 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), yang kemudian diarahkan ke sensor sCMOS menggunakan lensa objektif mikroskop × 10 (NA 0,3). Detektor sCMOS adalah Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) dengan array Ukuran piksel 2048 × 2048 dan ukuran piksel mentah 6,5 × 6,5 µm. Pengaturan ini menghasilkan ukuran piksel isotropik efektif 0,51 µm dan bidang pandang sekitar 1,1 mm × 1,1 mm. Panjang paparan 100 ms dipilih untuk memaksimalkan rasio sinyal-ke-derau partikel magnetik di dalam dan di luar saluran napas sambil meminimalkan artefak gerakan yang disebabkan oleh pernapasan. Untuk studi in vivo, rana sinar-X cepat ditempatkan di jalur sinar-X untuk membatasi dosis radiasi dengan memblokir berkas sinar-X di antara paparan.
Pembawa LV tidak digunakan dalam studi pencitraan SPring-8 PB-PCXI apa pun karena ruang pencitraan BL20XU tidak bersertifikasi Tingkat Keamanan Hayati 2. Sebagai gantinya, kami memilih berbagai MP yang telah dikarakterisasi dengan baik dari dua pemasok komersial—yang mencakup berbagai ukuran, bahan, konsentrasi besi, dan aplikasi—pertama untuk memahami bagaimana medan magnet memengaruhi pergerakan MP di dalam kapiler kaca, dan kemudian di saluran udara hidup. Pada permukaan, MP memiliki ukuran mulai dari 0,25 hingga 18 μm dan terbuat dari berbagai material (lihat Tabel 1), tetapi komposisi setiap sampel, termasuk ukuran partikel magnetik di dalam MP, tidak diketahui. Berdasarkan studi MCT ekstensif kami 19, 20, 21, 23, 24, kami memperkirakan bahwa MP sekecil 5 μm dapat terlihat pada permukaan saluran trakea, misalnya dengan mengurangi frame berurutan untuk melihat peningkatan visibilitas gerakan MP. Sebuah MP berukuran 0,25 μm lebih kecil daripada resolusi perangkat pencitraan, tetapi PB-PCXI diharapkan dapat mendeteksi kontras volumenya dan gerakan cairan permukaan tempat MP tersebut diendapkan setelah pengendapan.
Sampel untuk setiap MP dalam Tabel 1 disiapkan dalam kapiler kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) dengan diameter dalam 0,63 mm. Partikel korpuskular tersedia dalam air, sedangkan partikel CombiMag tersedia dalam cairan milik produsen. Setiap tabung diisi setengahnya dengan cairan (sekitar 11 μl) dan ditempatkan pada dudukan sampel (lihat Gambar 1). Kapiler kaca ditempatkan secara horizontal pada panggung sampel di dalam kotak pencitraan, dan tepi cairan diposisikan. Magnet neodymium besi boron (NdFeB) cangkang nikel berdiameter 19 mm (panjang 28 mm) (N35, no. katalog LM1652, Jaycar Electronics, Australia) dengan magnetisasi sisa 1,17 Tesla dipasang pada panggung translasi terpisah untuk mengubah posisinya dari jarak jauh selama pencitraan. Akuisisi gambar sinar-X dimulai ketika magnet diposisikan sekitar 30 mm di atas sampel, dan gambar diperoleh dengan kecepatan tertentu. 4 frame per detik. Selama pengambilan gambar, magnet didekatkan ke tabung kapiler kaca (sekitar 1 mm) dan kemudian digeser sepanjang tabung untuk menilai efek kekuatan medan dan posisi.
Pengaturan pencitraan in vitro yang berisi sampel MP dalam kapiler kaca pada tahap translasi xy sampel. Jalur berkas sinar-X ditandai dengan garis putus-putus merah.
Setelah visibilitas MP secara in vitro ditetapkan, sebagian darinya diuji secara in vivo pada tikus albino Wistar betina tipe liar (~12 minggu, ~200 g). Tikus dibius dengan campuran medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Jepang), midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepang), dan butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma) dengan injeksi intraperitoneal. Setelah dibius, tikus dipersiapkan untuk pencitraan dengan menghilangkan bulu di sekitar trakea, memasukkan tabung endotrakeal (ET; kanula iv 16 Ga, Terumo BCT), dan mengimobilisasi tikus dalam posisi telentang pada pelat pencitraan khusus yang berisi kantung termal untuk menjaga suhu tubuh. Pelat pencitraan kemudian dipasang pada tahap translasi sampel di dalam kotak pencitraan dengan sedikit sudut untuk menyelaraskan trakea secara horizontal. Gambar sinar-X, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a.
(a) Pengaturan pencitraan in vivo di dalam kotak pencitraan SPring-8, jalur sinar X ditandai dengan garis putus-putus merah. (b,c) Lokalisasi magnet pada trakea dilakukan dari jarak jauh menggunakan dua kamera IP yang dipasang secara ortogonal. Di sisi kiri gambar layar, terlihat kawat penahan kepala, dan kanula pengiriman terpasang di dalam tabung ET.
Sistem pompa jarum suntik yang dikendalikan dari jarak jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) menggunakan jarum suntik kaca 100 μl dihubungkan ke selang PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) melalui jarum 30 Ga. Tandai selang untuk memastikan ujungnya berada pada posisi yang benar di trakea saat memasukkan selang ET. Dengan menggunakan mikropompa, pendorong jarum suntik ditarik sementara ujung selang direndam dalam sampel MP yang akan diberikan. Selang pengiriman yang telah diisi kemudian dimasukkan ke dalam selang endotrakeal, menempatkan ujungnya di bagian terkuat dari medan magnet yang diharapkan. Akuisisi gambar dikontrol menggunakan detektor pernapasan yang terhubung ke kotak pengatur waktu berbasis Arduino kami, dan semua sinyal (misalnya suhu, pernapasan, pembukaan/penutupan rana, dan akuisisi gambar) direkam menggunakan Powerlab dan LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Saat pengambilan gambar, ketika ruang tertutup tidak dapat diakses, dua kamera IP (Panasonic BB-SC382) diposisikan kira-kira pada Kedua magnet tersebut membentuk sudut 90° satu sama lain dan digunakan untuk memantau posisi magnet relatif terhadap trakea selama pengambilan gambar (Gambar 2b,c). Untuk meminimalkan artefak gerakan, satu gambar diambil per tarikan napas selama plateau aliran akhir ekspirasi.
Sebuah magnet dipasang pada tahap kedua yang dapat ditempatkan dari jarak jauh di luar wadah pencitraan. Berbagai posisi dan konfigurasi magnet diuji, termasuk: Dipasang pada sudut sekitar 30° di atas trakea (konfigurasi ditunjukkan pada Gambar 2a dan 3a); satu magnet di atas hewan dan yang lainnya di bawah, dengan kutub diatur untuk saling menarik (Gambar 3b); satu magnet di atas hewan dan yang lainnya di bawah, dengan kutub diatur untuk saling menolak (Gambar 3c); dan satu magnet di atas dan tegak lurus terhadap trakea (Gambar 3d). Setelah hewan dan magnet dikonfigurasi dan MP yang akan diuji dimasukkan ke dalam pompa jarum suntik, berikan dosis 50 μl dengan kecepatan 4 μl/detik sambil mengambil gambar. Magnet kemudian digerakkan maju mundur di sepanjang atau secara lateral melintasi trakea sambil terus mengambil gambar.
Konfigurasi magnet untuk pencitraan in vivo (a) satu magnet di atas trakea dengan sudut sekitar 30°, (b) dua magnet diatur untuk saling menarik, (c) dua magnet diatur untuk saling menolak, (d) satu magnet di atas dan tegak lurus di trakea. Pengamat melihat dari mulut ke paru-paru melalui trakea, dan sinar X melewati sisi kiri tikus dan keluar di sisi kanan. Magnet digerakkan sepanjang saluran udara atau ke kiri dan kanan di atas trakea searah dengan sinar X.
Kami juga berupaya menentukan visibilitas dan perilaku partikel di saluran pernapasan tanpa adanya gangguan pernapasan dan gerakan jantung. Oleh karena itu, pada akhir periode pencitraan, hewan-hewan tersebut dibunuh secara manusiawi dengan overdosis pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Beberapa hewan dibiarkan di platform pencitraan, dan setelah pernapasan dan detak jantung berhenti, proses pencitraan diulangi, dengan menambahkan dosis MP tambahan jika tidak ada MP yang terlihat di permukaan saluran pernapasan.
Gambar yang diperoleh dikoreksi flat-field dan dark-field, kemudian dirakit menjadi sebuah film (20 frame per detik; 15-25 × kecepatan normal tergantung pada laju pernapasan) menggunakan skrip khusus yang ditulis dalam MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Semua studi pengiriman vektor gen LV dilakukan di Fasilitas Penelitian Hewan Laboratorium di Universitas Adelaide dan bertujuan untuk menggunakan hasil percobaan SPring-8 untuk menilai apakah pengiriman LV-MP dengan adanya medan magnet dapat meningkatkan transfer gen in vivo. Untuk menilai efek MP dan medan magnet, dua kelompok hewan diberi perlakuan: satu kelompok diberi LV-MP dengan magnet yang ditempatkan, dan kelompok lainnya menerima kelompok kontrol dengan LV-MP tanpa magnet.
Vektor gen LV dihasilkan menggunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya 25, 26. Vektor LacZ mengekspresikan gen beta-galaktosidase yang terlokalisasi di nukleus yang digerakkan oleh promotor MPSV konstitutif (LV-LacZ), yang menghasilkan produk reaksi biru pada sel yang ditransduksi, terlihat pada bagian depan jaringan paru-paru dan potongan jaringan. Titrasi dilakukan dalam kultur sel dengan menghitung secara manual jumlah sel positif LacZ dengan hemositometer untuk menghitung titer dalam TU/ml. Pembawa dibekukan pada suhu -80 °C, dicairkan sebelum digunakan, dan diikat ke CombiMag dengan mencampur pada rasio 1:1 dan diinkubasi di atas es setidaknya selama 30 menit sebelum pengiriman.
Tikus Sprague Dawley normal (n = 3/kelompok, ~2-3 bulan) dibius secara intraperitoneal dengan campuran 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Australia) dan 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australia) dan kanulasi oral non-bedah dengan kanula 16 Ga iv. Untuk memastikan bahwa jaringan saluran napas trakea menerima transduksi LV, jaringan tersebut dikondisikan menggunakan protokol perturbasi mekanis yang telah kami jelaskan sebelumnya, di mana permukaan saluran napas trakea digosok secara aksial dengan keranjang kawat (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115 -UDH, Cook Medical, USA) selama 30 detik. Pemberian LV-MP melalui trakea kemudian dilakukan di dalam lemari pengaman biologis sekitar 10 menit setelah perturbasi.
Medan magnet yang digunakan dalam percobaan ini dikonfigurasi dengan cara yang serupa dengan studi pencitraan sinar-X in vivo, dengan magnet yang sama dipegang di atas trakea menggunakan klip stent distilasi (Gambar 4). Volume 50 μl (2 × 25 μl alikuot) LV-MP dimasukkan ke dalam trakea (n = 3 hewan) menggunakan pipet yang berisi ujung gel seperti yang dijelaskan sebelumnya. Kelompok kontrol (n = 3 hewan) menerima LV-MP yang sama tanpa menggunakan magnet. Setelah infus selesai, kanula dilepas dari tabung ET dan hewan diekstubasi. Magnet tetap di tempatnya selama 10 menit, kemudian dilepas. Tikus menerima dosis meloxicam subkutan (1 ml/kg) (Ilium, Australia) diikuti dengan pembalikan anestesi dengan injeksi ip 1 mg/kg atipamazol hidroklorida (Antisedan, Zoetis, Australia). Tikus dijaga tetap hangat dan dipantau sampai pulih sepenuhnya. dari anestesi.
Perangkat pemberian LV-MP di dalam kabinet pengaman biologis. Hub Luer berwarna abu-abu muda dari tabung ET terlihat menonjol dari mulut dan ujung gel pipet yang ditunjukkan pada gambar dimasukkan melalui tabung ET hingga kedalaman yang diinginkan ke dalam trakea.
Satu minggu setelah prosedur pemberian dosis LV-MP, hewan-hewan tersebut dibunuh secara manusiawi dengan inhalasi CO2 100% dan ekspresi LacZ dinilai menggunakan perlakuan X-gal standar kami. Tiga cincin tulang rawan kaudal paling ujung dihilangkan untuk memastikan bahwa kerusakan mekanis atau retensi cairan dari pemasangan tabung endotrakeal tidak termasuk dalam analisis. Setiap trakea dipotong memanjang untuk membuat dua bagian untuk analisis, dan dipasang dalam cawan berisi karet silikon (Sylgard, Dow Inc) menggunakan jarum Minutien (Fine Science Tools) untuk memvisualisasikan permukaan luminal. Distribusi dan pola sel yang ditransduksi dikonfirmasi dengan fotografi frontal menggunakan mikroskop Nikon (SMZ1500) dengan kamera DigiLite dan perangkat lunak TCapture (Tucsen Photonics, China). Gambar diperoleh pada perbesaran 20x (termasuk pengaturan tertinggi untuk lebar penuh trakea), dengan seluruh panjang trakea dipotret langkah demi langkah, memastikan tumpang tindih yang cukup antara setiap gambar untuk memungkinkan "penyambungan" gambar. Gambar dari masing-masing Trakea kemudian digabungkan menjadi satu gambar komposit menggunakan Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) dengan memanfaatkan algoritma gerakan planar. Area ekspresi LacZ dalam gambar komposit trakea dari setiap hewan dikuantifikasi menggunakan skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) seperti yang dijelaskan sebelumnya, menggunakan pengaturan 0,35 < Hue < 0,58, Saturasi > 0,15, dan Nilai < 0,7. Dengan menelusuri kontur jaringan, masker dibuat secara manual di GIMP v2.10.24 untuk setiap gambar komposit guna mengidentifikasi area jaringan dan mencegah deteksi palsu dari luar jaringan trakea. Area yang diwarnai dari semua gambar komposit dari setiap hewan dijumlahkan untuk menghasilkan total area yang diwarnai untuk hewan tersebut. Area yang diwarnai kemudian dibagi dengan total area masker untuk menghasilkan area yang dinormalisasi.
Setiap trakea dibenamkan dalam parafin dan dipotong menjadi bagian setebal 5 μm. Bagian-bagian tersebut diwarnai ulang dengan pewarna netral fast red selama 5 menit dan gambar diambil menggunakan mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3, dan perangkat lunak pengambilan gambar NIS element (versi 5.20.00).
Semua analisis statistik dilakukan di GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Signifikansi statistik ditetapkan pada p ≤ 0,05. Normalitas diverifikasi menggunakan uji Shapiro-Wilk, dan perbedaan pewarnaan LacZ dinilai menggunakan uji t tidak berpasangan.
Enam MP yang dijelaskan dalam Tabel 1 diperiksa menggunakan PCXI, dan visibilitasnya dijelaskan dalam Tabel 2. Dua MP polistirena (MP1 dan MP2; masing-masing 18 μm dan 0,25 μm) tidak terlihat di bawah PCXI, tetapi sampel lainnya dapat diidentifikasi (contohnya ditunjukkan pada Gambar 5). MP3 dan MP4 (10-15% Fe3O4; masing-masing 0,25 μm dan 0,9 μm) terlihat samar-samar. Meskipun mengandung beberapa partikel terkecil yang diuji, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) adalah yang paling menonjol. Produk CombiMag MP6 sulit ditemukan. Dalam semua kasus, kemampuan kami untuk mendeteksi MP secara signifikan ditingkatkan dengan menggerakkan magnet bolak-balik sejajar dengan kapiler. Ketika magnet menjauh dari kapiler, partikel memanjang dalam untaian panjang, tetapi ketika magnet semakin dekat dan kekuatan medan magnet meningkat, untaian partikel memendek seiring dengan partikel-partikel tersebut. Partikel-partikel tersebut bermigrasi menuju permukaan atas kapiler (lihat Video Tambahan S1: MP4), meningkatkan kepadatan partikel di permukaan. Sebaliknya, ketika magnet dikeluarkan dari kapiler, kekuatan medan berkurang dan MP tersusun kembali menjadi untaian panjang yang memanjang dari permukaan atas kapiler (lihat Video Tambahan S2: MP4). Setelah magnet berhenti bergerak, partikel-partikel tersebut terus bergerak untuk waktu singkat setelah mencapai posisi keseimbangan. Saat MP bergerak menuju dan menjauh dari permukaan atas kapiler, partikel magnetik biasanya menyeret puing-puing melalui cairan.
Visibilitas MP di bawah PCXI bervariasi secara signifikan antar sampel. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6. Semua gambar yang ditampilkan di sini diambil dengan magnet yang terletak sekitar 10 mm tepat di atas kapiler. Lingkaran besar yang tampak adalah gelembung udara yang terperangkap di dalam kapiler, yang dengan jelas menunjukkan fitur tepi hitam dan putih dari pencitraan kontras fase. Kotak merah berisi pembesaran yang meningkatkan kontras. Perhatikan bahwa diameter skema magnet di semua gambar tidak sesuai skala dan kira-kira 100 kali lebih besar dari yang ditunjukkan.
Saat magnet digeser ke kiri dan ke kanan di sepanjang bagian atas kapiler, sudut untaian MP berubah untuk sejajar dengan magnet (lihat Gambar 6), sehingga membatasi garis medan magnet. Untuk MP3-5, setelah untaian mencapai sudut ambang batas, partikel-partikel tersebut terseret di sepanjang permukaan atas kapiler. Hal ini seringkali mengakibatkan MP berkumpul menjadi kelompok yang lebih besar di dekat tempat medan magnet paling kuat (lihat Video Tambahan S3:MP5). Hal ini juga sangat jelas terlihat saat pencitraan di dekat ujung kapiler, yang menyebabkan MP menggumpal dan terkonsentrasi di antarmuka fluida-udara. Partikel dalam MP6, yang lebih sulit dibedakan daripada MP3-5, tidak terseret saat magnet bergerak di sepanjang kapiler, tetapi untaian MP terurai, meninggalkan partikel-partikel tersebut dalam bidang pandang (lihat Video Tambahan S4:MP6). Dalam beberapa kasus, ketika medan magnet yang diterapkan dikurangi dengan memindahkan magnet dalam jarak yang jauh dari lokasi pencitraan, MP yang tersisa perlahan-lahan turun ke permukaan bawah tabung karena gravitasi sambil tetap berada dalam untaian (lihat Video Tambahan S5: MP3).
Sudut tali MP berubah saat magnet digeser ke kanan di atas kapiler. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6. Kotak merah berisi perbesaran untuk meningkatkan kontras. Perhatikan bahwa video tambahan informatif karena mengungkapkan struktur partikel penting dan informasi dinamis yang tidak dapat divisualisasikan dalam gambar statis ini.
Pengujian kami menunjukkan bahwa menggerakkan magnet secara perlahan maju mundur di sepanjang trakea memfasilitasi visualisasi MP dalam konteks pergerakan kompleks in vivo. Pengujian in vivo tidak dilakukan karena manik-manik polistirena (MP1 dan MP2) tidak terlihat di kapiler. Masing-masing dari empat MP yang tersisa diuji in vivo dengan sumbu panjang magnet dikonfigurasi di atas trakea pada sudut sekitar 30° terhadap vertikal (lihat Gambar 2b dan 3a), karena ini menghasilkan rantai MP yang lebih panjang dan lebih efektif daripada konfigurasi magnet yang diakhiri. MP3, MP4, dan MP6 tidak terdeteksi di trakea hewan hidup mana pun. Ketika saluran udara tikus diimajinasikan setelah hewan tersebut dibunuh secara manusiawi, partikel tetap tidak terlihat bahkan ketika volume tambahan ditambahkan menggunakan pompa jarum suntik. MP5 memiliki kandungan oksida besi tertinggi dan merupakan satu-satunya partikel yang terlihat, dan oleh karena itu digunakan untuk menilai dan mengkarakterisasi perilaku MP in vivo.
Penempatan magnet di atas trakea selama pemberian MP menghasilkan banyak, tetapi tidak semua, MP terkonsentrasi di bidang pandang. Partikel yang memasuki trakea paling baik diamati pada hewan yang dikorbankan secara manusiawi. Gambar 7 dan Video Tambahan S6: MP5 menunjukkan penangkapan magnetik yang cepat dan penyelarasan partikel pada permukaan trakea ventral, menunjukkan bahwa MP dapat diarahkan ke wilayah trakea yang diinginkan. Saat mencari lebih jauh di sepanjang trakea setelah pemberian MP, beberapa MP ditemukan lebih dekat ke karina, menunjukkan bahwa kekuatan medan magnet tidak cukup untuk mengumpulkan dan menahan semua MP, karena MP diberikan melalui wilayah dengan kekuatan medan magnet maksimum selama proses cairan. Meskipun demikian, konsentrasi MP pascapartum lebih tinggi di sekitar area yang diimajinasikan, menunjukkan bahwa banyak MP tetap berada di wilayah saluran napas di mana kekuatan medan magnet yang diterapkan paling tinggi.
Gambar dari (a) sebelum dan (b) setelah pemberian MP5 ke trakea tikus yang baru saja di-eutanasia dengan magnet yang diposisikan tepat di atas area pencitraan. Area yang diimajinasikan terletak di antara dua cincin tulang rawan. Sebelum pemberian MP, terdapat sedikit cairan di saluran napas. Kotak merah berisi pembesaran untuk meningkatkan kontras. Gambar-gambar ini berasal dari video yang ditampilkan dalam Video Tambahan S6:MP5.
Pergerakan magnet di sepanjang trakea secara in vivo menyebabkan rantai MP mengubah sudut di dalam permukaan saluran napas dengan cara yang mirip dengan yang terlihat pada kapiler (lihat Gambar 8 dan Video Tambahan S7:MP5). Namun, dalam penelitian kami, MP tidak dapat ditarik di sepanjang permukaan saluran napas hidup seperti yang terjadi pada kapiler. Dalam beberapa kasus, rantai MP akan menjadi lebih panjang saat magnet bergerak ke kiri dan ke kanan. Menariknya, kami juga menemukan bahwa untaian partikel tampaknya mengubah kedalaman lapisan cairan permukaan ketika magnet digerakkan memanjang di sepanjang trakea, dan mengembang ketika magnet digerakkan langsung di atas kepala dan untaian partikel diputar ke posisi vertikal (lihat Video Tambahan S7). (MP5 pada 0:09, kanan bawah). Pola gerak karakteristik berubah ketika magnet digeser melintasi bagian atas trakea secara lateral (yaitu, ke kiri atau kanan hewan, bukan sepanjang trakea). Partikel-partikel tersebut masih terlihat jelas saat bergerak, tetapi ketika magnet dilepas dari trakea, ujung-ujung untaian partikel menjadi terlihat (lihat Video Tambahan S8:MP5, mulai dari 0:08). Hal ini konsisten dengan perilaku MP yang kami amati di bawah medan magnet yang diterapkan dalam kapiler kaca.
Contoh gambar yang menunjukkan MP5 di trakea tikus hidup yang dibius. (a) Magnet digunakan untuk mengambil gambar di atas dan di sebelah kiri trakea, kemudian (b) setelah magnet digerakkan ke kanan. Kotak merah berisi pembesaran untuk meningkatkan kontras. Gambar-gambar ini berasal dari video yang ditampilkan dalam Video Tambahan S7:MP5.
Ketika kedua kutub dikonfigurasi dalam orientasi utara-selatan di atas dan di bawah trakea (yaitu saling menarik; Gambar 3b), tali MP tampak lebih panjang dan terletak di dinding samping trakea daripada di permukaan dorsal trakea (lihat Video Tambahan S9:MP5). Namun, konsentrasi partikel yang tinggi di satu lokasi (yaitu, permukaan dorsal trakea) tidak terdeteksi setelah pemberian cairan ketika perangkat magnet ganda digunakan, yang biasanya terjadi ketika perangkat magnet tunggal digunakan. Kemudian ketika satu magnet dikonfigurasi untuk menolak kutub yang dibalik (Gambar 3c), jumlah partikel yang terlihat di bidang pandang tampaknya tidak meningkat setelah pemberian. Pengaturan kedua konfigurasi magnet ganda ini menantang karena kekuatan medan magnet yang tinggi yang menarik atau mendorong magnet, masing-masing. Pengaturan kemudian diubah menjadi magnet tunggal yang sejajar dengan saluran udara tetapi melewati saluran udara pada sudut 90 derajat sehingga garis medan melintasi dinding trakea secara ortogonal (Gambar 3d), orientasi yang dirancang untuk menentukan apakah Agregasi partikel pada dinding samping dapat diamati. Namun, dalam konfigurasi ini, tidak ada pergerakan akumulasi MP atau pergerakan magnet yang dapat diidentifikasi. Berdasarkan semua hasil ini, konfigurasi orientasi magnet tunggal 30 derajat (Gambar 3a) dipilih untuk studi pembawa gen in vivo.
Ketika hewan tersebut berulang kali diimajinasikan segera setelah dibunuh secara manusiawi, tidak adanya gerakan jaringan yang membingungkan berarti bahwa garis partikel yang lebih halus dan lebih pendek dapat dibedakan dalam medan interkondral yang jernih, "bergoyang" sejalan dengan gerakan translasi magnet. Meskipun demikian, keberadaan dan gerakan partikel MP6 masih belum dapat terlihat dengan jelas.
Titer LV-LacZ adalah 1,8 × 10⁸ TU/ml, dan setelah pencampuran 1:1 dengan CombiMag MP (MP6), hewan menerima dosis trakea 50 μl dari 9 × 10⁷ TU/ml kendaraan LV (yaitu 4,5 × 10⁶ TU/tikus). Dalam penelitian ini, alih-alih menggerakkan magnet selama persalinan, kami memposisikan magnet tetap pada satu posisi untuk menentukan apakah transduksi LV (a) dapat ditingkatkan dibandingkan dengan pemberian vektor tanpa adanya medan magnet, dan (b) dapat difokuskan. Sel-sel saluran napas ditransduksi ke daerah target magnetik saluran napas bagian atas.
Kehadiran magnet dan penggunaan CombiMag yang dikombinasikan dengan vektor LV tampaknya tidak memiliki efek buruk pada kesehatan hewan, seperti halnya protokol pemberian vektor LV standar kami. Gambar frontal dari daerah trakea yang mengalami gangguan mekanis (Gambar Tambahan 1) menunjukkan bahwa terdapat tingkat transduksi yang secara signifikan lebih tinggi pada kelompok hewan yang diobati dengan LV-MP ketika magnet hadir (Gambar 9a). Hanya sedikit pewarnaan LacZ biru yang ada pada kelompok kontrol (Gambar 9b). Kuantifikasi area yang diwarnai X-Gal yang dinormalisasi menunjukkan bahwa pemberian LV-MP dengan adanya medan magnet menghasilkan peningkatan sekitar 6 kali lipat (Gambar 9c).
Contoh gambar komposit yang menunjukkan transduksi trakea oleh LV-MP (a) dengan adanya medan magnet dan (b) tanpa adanya magnet. (c) Peningkatan yang signifikan secara statistik pada area transduksi LacZ yang dinormalisasi di dalam trakea saat menggunakan magnet (*p = 0,029, uji-t, n = 3 per kelompok, rata-rata ± SEM).
Bagian yang diwarnai dengan pewarna Neutral Fast Red (contoh ditunjukkan pada Gambar Tambahan 2) menunjukkan sel-sel yang diwarnai LacZ hadir dalam pola dan lokasi yang serupa seperti yang dilaporkan sebelumnya.
Tantangan utama untuk terapi gen saluran napas tetaplah lokalisasi partikel pembawa yang akurat ke daerah yang diinginkan dan pencapaian tingkat efisiensi transduksi yang tinggi di paru-paru yang bergerak dengan adanya aliran udara dan pembersihan lendir aktif. Untuk pembawa LV yang dirancang untuk mengobati penyakit saluran napas CF, meningkatkan waktu tinggal partikel pembawa di dalam saluran napas konduksi telah menjadi tujuan yang sulit dicapai hingga saat ini. Seperti yang ditunjukkan oleh Castellani dkk., penggunaan medan magnet untuk meningkatkan transduksi memiliki keunggulan dibandingkan dengan metode pengiriman gen lainnya seperti elektroporasi, karena dapat menggabungkan kesederhanaan, efektivitas biaya, lokalisasi pengiriman, peningkatan efisiensi, dan waktu inkubasi yang lebih pendek, dan mungkin dosis pembawa yang lebih kecil10. Namun, pengendapan dan perilaku partikel magnetik secara in vivo di saluran napas di bawah pengaruh gaya magnet eksternal belum pernah dijelaskan, dan juga belum pernah dibuktikan kelayakan metode ini secara in vivo untuk meningkatkan tingkat ekspresi gen di saluran napas hidup yang utuh.
Eksperimen sinkrotron PCXI in vitro kami menunjukkan bahwa semua partikel yang kami uji, kecuali polistirena MP, terlihat dalam pengaturan pencitraan yang kami gunakan. Dengan adanya medan magnet, MP membentuk untaian yang panjangnya terkait dengan jenis partikel dan kekuatan medan magnet (yaitu kedekatan dan gerakan magnet). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10, untaian yang kami amati terbentuk karena setiap partikel individu termagnetisasi dan menginduksi medan magnet lokalnya sendiri. Medan-medan terpisah ini menyebabkan partikel serupa lainnya berkumpul dan terhubung, dengan gerakan seperti untaian kelompok karena gaya lokal dari gaya tarik dan tolak lokal partikel lain.
Skema yang menunjukkan (a,b) rangkaian partikel yang dihasilkan di dalam kapiler berisi cairan dan (c,d) trakea berisi udara. Perhatikan bahwa kapiler dan trakea tidak digambar sesuai skala. Panel (a) juga berisi deskripsi MP, yang berisi partikel Fe3O4 yang tersusun dalam untaian.
Ketika magnet digerakkan di atas kapiler, sudut untaian partikel mencapai ambang kritis untuk MP3-5 yang mengandung Fe3O4, setelah itu untaian partikel tidak lagi tetap pada posisi semula, tetapi bergerak di sepanjang permukaan ke posisi baru. Efek ini kemungkinan terjadi karena permukaan kapiler kaca cukup halus untuk memungkinkan pergerakan ini terjadi. Menariknya, MP6 (CombiMag) tidak berperilaku seperti ini, mungkin karena partikelnya lebih kecil, memiliki lapisan atau muatan permukaan yang berbeda, atau cairan pembawa khusus memengaruhi kemampuan mereka untuk bergerak. Kontras gambar partikel CombiMag juga lebih lemah, menunjukkan bahwa cairan dan partikel mungkin memiliki kepadatan yang serupa dan oleh karena itu tidak mudah bergerak saling mendekat. Partikel juga dapat tersangkut jika magnet bergerak terlalu cepat, menunjukkan bahwa kekuatan medan magnet tidak selalu dapat mengatasi gesekan antara partikel dalam cairan, menunjukkan bahwa mungkin tidak mengherankan bahwa kekuatan medan magnet dan jarak antara magnet dan area target sangat penting. Secara keseluruhan, hasil ini juga menunjukkan bahwa, meskipun magnet dapat menangkap banyak MP yang mengalir melalui area target, kemungkinan besar magnet tidak dapat menangkap semua MP secara efektif. dapat diandalkan untuk menggerakkan partikel CombiMag di sepanjang permukaan trakea. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa studi LV-MP in vivo harus menggunakan medan magnet statis untuk secara fisik menargetkan wilayah spesifik dari pohon saluran napas.
Ketika partikel masuk ke dalam tubuh, partikel tersebut sulit diidentifikasi dalam konteks jaringan tubuh yang bergerak kompleks, tetapi kemampuan untuk mendeteksinya ditingkatkan dengan menggerakkan magnet secara horizontal di atas trakea untuk "menggoyangkan" untaian MP. Meskipun pencitraan langsung dimungkinkan, lebih mudah untuk membedakan gerakan partikel setelah hewan tersebut dibunuh secara manusiawi. Konsentrasi MP umumnya tertinggi di lokasi ini ketika magnet diposisikan di atas area pencitraan, meskipun beberapa partikel biasanya ditemukan lebih jauh di sepanjang trakea. Berbeda dengan studi in vitro, partikel tidak dapat ditarik di sepanjang trakea dengan menggerakkan magnet. Temuan ini konsisten dengan bagaimana lendir yang melapisi permukaan trakea biasanya memproses partikel yang dihirup, menjebaknya dalam lendir dan kemudian dibersihkan oleh mekanisme pembersihan mukosiliar.
Kami berhipotesis bahwa penggunaan magnet untuk daya tarik di atas dan di bawah trakea (Gambar 3b) mungkin menghasilkan medan magnet yang lebih seragam, daripada medan magnet yang sangat terkonsentrasi pada satu titik, yang berpotensi menyebabkan distribusi partikel yang lebih seragam. Namun, studi pendahuluan kami tidak menemukan bukti yang jelas untuk mendukung hipotesis ini. Demikian pula, konfigurasi sepasang magnet untuk saling tolak (Gambar 3c) tidak menghasilkan lebih banyak pengendapan partikel di area yang diimajinasikan. Kedua temuan ini menunjukkan bahwa pengaturan magnet ganda tidak secara signifikan meningkatkan kontrol lokal penargetan MP, dan bahwa gaya magnet yang kuat yang dihasilkan sulit dikonfigurasi, sehingga pendekatan ini kurang praktis. Demikian pula, mengarahkan magnet di atas dan melalui trakea (Gambar 3d) juga tidak meningkatkan jumlah partikel yang tertahan di area yang diimajinasikan. Beberapa konfigurasi alternatif ini mungkin tidak berhasil karena menghasilkan kekuatan medan magnet yang lebih rendah di dalam area pengendapan. Oleh karena itu, konfigurasi magnet sudut 30 derajat tunggal (Gambar 3a) dianggap sebagai metode termudah dan paling efisien untuk pengujian in vivo.
Studi LV-MP menunjukkan bahwa ketika vektor LV dikombinasikan dengan CombiMag dan diberikan setelah gangguan fisik dengan adanya medan magnet, tingkat transduksi meningkat secara signifikan di trakea dibandingkan dengan kontrol. Berdasarkan studi pencitraan sinkrotron dan hasil LacZ, medan magnet tampaknya mampu mempertahankan LV di dalam trakea dan mengurangi jumlah partikel vektor yang langsung menembus jauh ke dalam paru-paru. Peningkatan penargetan tersebut dapat menyebabkan efikasi yang lebih tinggi sekaligus mengurangi titer yang diberikan, transduksi di luar target, efek samping inflamasi dan imun, serta biaya pembawa gen. Yang penting, menurut produsen, CombiMag dapat digunakan bersamaan dengan metode transfer gen lainnya, termasuk dengan vektor virus lain (seperti AAV) dan asam nukleat.