Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Vektorët e gjeneve për trajtimin e sëmundjes së mushkërive me fibrozë cistike duhet të synojnë rrugët e frymëmarrjes përçuese sepse transduksioni periferik i mushkërive nuk ofron përfitim terapeutik. Efikasiteti i transduksionit viral lidhet drejtpërdrejt me kohën e qëndrimit të vektorit. Megjithatë, lëngjet e shpërndarjes, të tilla si bartësit e gjeneve, shpërndahen natyrshëm në alveola gjatë frymëzimit, dhe grimcat terapeutike të çdo forme pastrohen shpejt nga transporti mukoziliar. Zgjatja e kohës së qëndrimit të bartësve të gjeneve në rrugët e frymëmarrjes është e rëndësishme, por e vështirë për t'u arritur. Grimcat magnetike të konjuguara me bartës të gjeneve që mund të drejtohen në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes mund të përmirësojnë shënjestrimin rajonal. Për shkak të sfidave të vizualizimit in vivo, sjellja e grimcave të tilla të vogla magnetike në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes në prani të një fushe magnetike të aplikuar është kuptuar dobët. Qëllimi i këtij studimi ishte të përdorej imazheria sinkrotron për të vizualizuar lëvizjen in vivo të një serie grimcash magnetike në trakenë e minjve të anestezuar për të shqyrtuar dinamikën dhe modelet e sjelljes së grimcave individuale dhe masive in vivo. Pastaj vlerësuam gjithashtu nëse shpërndarja e grimcave magnetike lentivirale në prani të një fushe magnetike do të rriste efikasitetin e transduksionit në trakenë e miut. Imazheria me rreze X sinkrotron zbulon sjelljen e magnetike. grimcat në fusha magnetike stacionare dhe lëvizëse in vitro dhe in vivo. Grimcat nuk mund të zvarriten lehtësisht përgjatë sipërfaqes së rrugëve të gjalla të frymëmarrjes me magnet, por gjatë transportit, depozitat përqendrohen në fushën e shikimit ku fusha magnetike është më e fortë. Efikasiteti i transduksionit u rrit gjithashtu gjashtëfish kur grimcat magnetike lentivirale u dorëzuan në prani të një fushe magnetike. Së bashku, këto rezultate sugjerojnë që grimcat magnetike lentivirale dhe fushat magnetike mund të jenë qasje të vlefshme për të përmirësuar synimin e vektorit të gjeneve dhe për të rritur nivelet e transduksionit në rrugët e frymëmarrjes përçuese in vivo.
Fibroza cistike (FIB) shkaktohet nga variacioni në një gjen të vetëm të quajtur rregullatori i përçueshmërisë transmembranore të FIB-së (CFTR). Proteina CFTR është një kanal jonik që është i pranishëm në shumë qeliza epiteliale në të gjithë trupin, duke përfshirë rrugët e frymëmarrjes përçuese, një vend kryesor i patogjenezës së FIB-së. Defektet e CFTR çojnë në transport jonormal të ujit, duke dehidratuar sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes dhe duke zvogëluar thellësinë e shtresës së lëngshme sipërfaqësore të rrugëve të frymëmarrjes (ASL). Kjo gjithashtu dëmton aftësinë e sistemit të transportit mukociliar (MCT) për të pastruar grimcat e thithura dhe patogjenët nga rrugët e frymëmarrjes. Qëllimi ynë është të zhvillojmë një terapi gjenike lentivirale (LV) për të ofruar kopjen e saktë të gjenit CFTR dhe për të përmirësuar shëndetin e ASL, MCT dhe mushkërive, si dhe të vazhdojmë të zhvillojmë teknologji të reja të afta për të matur këto parametra in vivo1.
Vektorët e LV janë një nga kandidatët kryesorë për terapinë gjenike të rrugëve të frymëmarrjes me fibrozë cistike (CF), kryesisht sepse ato mund ta integrojnë përgjithmonë gjenin terapeutik në qelizat bazale të rrugëve të frymëmarrjes (qelizat staminale të rrugëve të frymëmarrjes). Kjo është e rëndësishme sepse ato mund të rivendosin hidratimin normal dhe pastrimin e mukusit duke u diferencuar në qeliza sipërfaqësore të rrugëve të frymëmarrjes të shoqëruara me CF të korrigjuara nga gjeni, duke rezultuar në përfitime gjatë gjithë jetës. Vektorët e LV duhet të drejtohen kundër rrugëve të frymëmarrjes përçuese, pasi këtu fillon sëmundja e mushkërive me CF. Dorëzimi i vektorit më thellë në mushkëri mund të rezultojë në transduksion alveolar, por kjo nuk ka përfitim terapeutik në CF. Megjithatë, lëngjet si bartësit e gjeneve migrojnë natyrshëm në alveole pas frymëzimit pas lindjes3,4 dhe grimcat terapeutike pastrohen shpejt në zgavrën orale nga MCT. Efikasiteti i transduksionit të LV lidhet drejtpërdrejt me kohëzgjatjen që vektori mbetet pranë qelizave të synuara për të lejuar thithjen qelizore - "koha e qëndrimit"5 - e cila reduktohet lehtësisht nga rrjedha tipike rajonale e ajrit, si dhe kapja e koordinuar e mukusit të grimcave dhe MCT. Për CF, aftësia për të zgjatur kohën e qëndrimit të LV brenda rrugëve të frymëmarrjes është e rëndësishme për të arritur nivele të larta të transduksionit në këtë rajon, por deri më tani ka qenë sfiduese.
Për të kapërcyer këtë pengesë, ne sugjerojmë që grimcat magnetike të LV (MP) mund të ndihmojnë në dy mënyra plotësuese. Së pari, ato mund të drejtohen magnetikisht në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes për të përmirësuar shënjestrimin dhe për të ndihmuar grimcat bartëse të gjeneve të qëndrojnë në rajonin e dëshiruar të rrugëve të frymëmarrjes; dhe ASL) për të lëvizur në shtresën qelizore 6. MP janë përdorur gjerësisht si mjete të synuara për administrimin e barnave kur ato lidhen me antitrupa, ilaçe kimioterapeutike ose molekula të tjera të vogla që ngjiten në membranat qelizore ose lidhen me receptorët përkatës të sipërfaqes qelizore dhe grumbullohen në vendet e tumorit në prani të elektricitetit statik. Fushat Magnetike për Trajtimin e Kancerit 7. Teknika të tjera "hipertermale" synojnë të ngrohin MP-të kur ato ekspozohen ndaj fushave magnetike osciluese, duke shkatërruar kështu qelizat tumorale. Parimi i transfektimit magnetik, në të cilin një fushë magnetike përdoret si një agjent transfektimi për të rritur transferimin e ADN-së në qeliza, përdoret zakonisht in vitro duke përdorur një gamë vektorësh gjenesh jo-viralë dhe viralë për linjat qelizore të vështira për t'u transduktuar. Efektiviteti i magnetotransfektimit të LV është vendosur, me shpërndarjen in vitro të LV-MP-ve në një linjë qelizore epiteliale bronkiale njerëzore në prani të një fushe magnetike statike, duke rritur efikasitetin e transduksionit me 186 herë krahasuar me vetëm vektorin e LV-së. LV-MP është aplikuar gjithashtu në një model CF in vitro, ku transfektimi magnetik rriti transduksionin e LV në kulturat e ndërfaqes ajër-lëng me 20 herë në prani të sputumit CF10. Megjithatë, magnetotransfektimi in vivo i organeve ka marrë relativisht pak vëmendje dhe është vlerësuar vetëm në disa studime në kafshë11,12,13,14,15, veçanërisht në mushkëritë16,17. Megjithatë, mundësitë për transfektim magnetik në terapinë e mushkërive me fibrozë cistike janë të qarta. Tan et al. (2020) deklaruan se "një studim i provës së konceptit të administrimit efikas pulmonar me nanopjesëza magnetike do të hapë rrugën për strategjitë e ardhshme të inhalimit të CFTR për të përmirësuar rezultatet klinike tek pacientët me fibrozë cistike"6.
Sjellja e grimcave të vogla magnetike në sipërfaqet e rrugëve të frymëmarrjes në prani të një fushe magnetike të aplikuar është e vështirë për t'u vizualizuar dhe studiuar, dhe për këtë arsye nuk kuptohet mirë. Në studime të tjera, ne zhvilluam një metodë të imazherisë me rreze X me kontrast faze të bazuar në përhapjen e sinkrotronit (PB-PCXI) për të vizualizuar dhe përcaktuar në mënyrë jo invazive ndryshimet e vogla in vivo në thellësinë ASL18 dhe sjelljen e MCT19,20 për të matur drejtpërdrejt hidratimin sipërfaqësor të kanalit të gazit dhe për ta përdorur si një tregues të hershëm të efikasitetit të trajtimit. Përveç kësaj, metoda jonë e vlerësimit MCT përdor grimca me diametër 10-35 µm të përbëra nga alumina ose qelqi me indeks të lartë refraktiv si shënjues MCT të dukshëm duke përdorur PB-PCXI21. Të dyja teknikat janë të përshtatshme për vizualizimin e një game të llojeve të grimcave, duke përfshirë MP.
Për shkak të rezolucionit të lartë hapësinor dhe kohor, teknikat tona të analizës ASL dhe MCT të bazuara në PB-PCXI janë të përshtatshme për të shqyrtuar dinamikën dhe modelet e sjelljes së grimcave të vetme dhe të mëdha in vivo për të na ndihmuar të kuptojmë dhe optimizojmë teknikat e administrimit të gjenit MP. Qasja që përdorim këtu rrjedh nga studimet tona duke përdorur vijën e rrezes SPring-8 BL20B2, në të cilën vizualizuam lëvizjen e lëngjeve pas administrimit të dozës së vektorit të rremë në rrugët e frymëmarrjes nazale dhe pulmonare të minjve për të ndihmuar në shpjegimin e modeleve tona jo-uniforme të shprehjes së gjeneve të vëzhguara në studimet tona të kafshëve me dozë bartëse të gjeneve 3,4.
Qëllimi i këtij studimi ishte përdorimi i sinkrotronit PB-PCXI për të vizualizuar lëvizjet in vivo të një serie MP-sh në trakenë e minjve të gjallë. Këto studime imazherike PB-PCXI u hartuan për të testuar një gamë të MP-sh, forcave të fushës magnetike dhe vendndodhjeve për të përcaktuar efektin e tyre në lëvizjen e MP-së. Ne hipotetizuam se një fushë magnetike e aplikuar nga jashtë do të ndihmonte MP-në e dhënë të qëndronte ose të lëvizte në zonën e synuar. Këto studime na lejuan gjithashtu të identifikonim konfigurimet e magneteve që maksimizojnë numrin e grimcave të mbajtura në trake pas depozitimit. Në një seri të dytë studimesh, ne kërkuam të përdornim këtë konfigurim optimal për të demonstruar modelin e transduksionit që rezulton nga administrimi in vivo i LV-MP në rrugët e frymëmarrjes së miut, bazuar në supozimin se administrimi i LV-MP në kontekstin e synimit të rrugëve të frymëmarrjes do të rezultonte në efikasitet të përmirësuar të transduksionit të LV-së.
Të gjitha studimet në kafshë u kryen sipas protokolleve të miratuara nga Universiteti i Adelaide-s (M-2019-060 dhe M-2020-022) dhe Komiteti i Etikës së Kafshëve SPring-8 Synchrotron. Eksperimentet u kryen sipas udhëzimeve ARRIVE.
Të gjitha imazhet me rreze X u kryen në vijën e rrezeve BL20XU në sinkrotronin SPring-8 në Japoni, duke përdorur një konfigurim të ngjashëm me atë të përshkruar më parë21,22. Shkurtimisht, kutia eksperimentale ndodhej 245 m nga unaza e ruajtjes së sinkrotronit. Një distancë mostër-detektor prej 0.6 m përdoret për studimet e imazhit të grimcave dhe 0.3 m për studimet e imazhit in vivo për të gjeneruar efekte të kontrastit të fazës. U përdor një energji rrezesh monokromatike prej 25 keV. Imazhet u kapën duke përdorur një konvertues rrezesh X me rezolucion të lartë (SPring-8 BM3) të lidhur me një detektor sCMOS. Konvertuesi konverton rrezet X në dritë të dukshme duke përdorur një scintilator me trashësi 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), i cili më pas drejtohet në një sensor sCMOS duke përdorur një objektiv mikroskopi × 10 (NA 0.3). Detektori sCMOS ishte Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japoni) me një madhësi matrice prej 2048 × 2048 piksel dhe një madhësi të papërpunuar të pikselit prej 6.5 × 6.5 µm. Ky konfigurim jep një madhësi efektive izotropike të pikselit prej 0.51 µm dhe një fushëpamje prej afërsisht 1.1 mm × 1.1 mm. Një gjatësi ekspozimi prej 100 ms u zgjodh për të maksimizuar raportin sinjal-zhurmë të grimcave magnetike brenda dhe jashtë rrugëve të frymëmarrjes, duke minimizuar artefaktet e lëvizjes së shkaktuara nga frymëmarrja. Për studimet in vivo, një qepen i shpejtë me rreze X u vendos në shtegun e rrezeve X për të kufizuar dozën e rrezatimit duke bllokuar rrezen X midis ekspozimeve.
Bartësi i LV nuk u përdor në asnjë studim imazherie SPring-8 PB-PCXI sepse dhoma e imazherisë BL20XU nuk është e certifikuar për Nivelin 2 të Biosigurisë. Në vend të kësaj, ne zgjodhëm një gamë të mirë-karakterizuar MP nga dy furnizues komercialë - që mbulojnë një gamë madhësish, materialesh, përqendrimesh hekuri dhe aplikimesh - së pari për të kuptuar se si fushat magnetike ndikojnë në lëvizjen e MP brenda kapilarëve të qelqit dhe më pas në rrugët e frymëmarrjes së gjalla. në sipërfaqe. MP-të variojnë në madhësi nga 0.25 deri në 18 μm dhe janë bërë nga një shumëllojshmëri materialesh (shih Tabelën 1), por përbërja e secilës mostër, duke përfshirë madhësinë e grimcave magnetike brenda MP-së, është e panjohur. Bazuar në studimet tona të gjera MCT 19, 20, 21, 23, 24, ne presim që MP-të e vogla deri në 5 μm mund të shihen në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes trakeale, për shembull duke zbritur korniza të njëpasnjëshme për të parë dukshmëri të shtuar të lëvizjes së MP-së. Një MP e vetme me madhësi 0.25 μm është më e vogël se rezolucioni i pajisjes së imazherisë, por PB-PCXI pritet të zbulojë kontrastin e tyre të vëllimit dhe lëvizjen e lëngut sipërfaqësor mbi të cilin ato depozitohen pas depozitimit.
Mostrat për secilën MP në Tabelën 1 u përgatitën në kapilarë qelqi 20 μl (Drummond Microcaps, PA, SHBA) me një diametër të brendshëm prej 0.63 mm. Grimcat korpuskulare janë të disponueshme në ujë, ndërsa grimcat CombiMag janë të disponueshme në lëngun e patentuar të prodhuesit. Çdo tub është gjysmë i mbushur me lëng (afërsisht 11 μl) dhe i vendosur në mbajtësen e mostrës (shih Figurën 1). Kapilarët e qelqit u vendosën horizontalisht në skenën e mostrës në kutinë e imazhit, përkatësisht, dhe u pozicionuan skajet e lëngut. Një magnet me shtresë nikeli prej 19 mm diametër (28 mm i gjatë) (N35, nr. kat. LM1652, Jaycar Electronics, Australi) me një magnetizim të mbetur prej 1.17 Tesla u lidh në një fazë të veçantë përkthimi për të arritur ndryshimin e pozicionit të tij nga distanca gjatë imazhit. Marrja e imazhit me rreze X fillon kur magneti pozicionohet afërsisht 30 mm mbi mostrën, dhe imazhet merren me një shpejtësi prej 4 kuadrosh për sekondë. Gjatë imazhit, magneti u afrua me tub kapilar qelqi (rreth 1 mm larg) dhe më pas u zhvendos përgjatë tubit për të vlerësuar efektet e forcës dhe pozicionit të fushës.
Konfigurim imazherie in vitro që përmban mostra MP në kapilarë qelqi në fazën e përkthimit xy të mostrës. Shtegu i rrezes së rrezeve X është shënuar me një vijë të kuqe të ndërprerë.
Pasi u përcaktua dukshmëria in vitro e MP-ve, një nëngrup i tyre u testua in vivo në minjtë femra albino Wistar të tipit të egër (~12 javë të vjetra, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidinë (Domitor®, Zenoaq, Japoni), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japoni) dhe 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Minjtë u anestezuan me një përzierje të Pharma (Japoni) me anë të injeksionit intraperitoneal. Pas anestezisë, ata u përgatitën për imazhe duke hequr qimet rreth trakesë, duke futur një tub endotraheal (ET; kanulë 16 Ga iv, Terumo BCT) dhe duke i imobilizuar në shpinë në një pllakë imazherie të bërë me porosi që përmbante një qese termike për të ruajtur temperaturën e trupit 22. Pllaka e imazherisë u ngjit më pas në fazën e përkthimit të mostrës në kutinë e imazherisë në një kënd të vogël për të rreshtuar trakenë horizontalisht në imazhin me rreze X, siç tregohet në Figurën 2a.
(a) Konfigurimi i imazherisë in vivo në kutinë e imazherisë SPring-8, rruga e rrezes X është shënuar me një vijë të kuqe të ndërprerë. (b,c) Lokalizimi i magnetit në trake u krye nga distanca duke përdorur dy kamera IP të montuara ortogonalisht. Në anën e majtë të imazhit të ekranit, mund të shihet laku i telit që mban kokën dhe kanula e administrimit në vend brenda tubit ET.
Një sistem pompe shiringe me telekomandë (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) duke përdorur një shiringë qelqi 100 μl u lidh me tubin PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) nëpërmjet një gjilpëre 30 Ga. Shënoni tubin për t'u siguruar që maja është në pozicionin e saktë në trake kur futet tubi ET. Duke përdorur mikropompën, pistoni i shiringës u tërhoq ndërsa maja e tubit ishte zhytur në mostrën MP që do të administrohej. Tubi i administrimit i ngarkuar u fut më pas në tubin endotraheal, duke e vendosur majën brenda pjesës më të fortë të fushës sonë magnetike të aplikuar që pritet. Marrja e imazhit u kontrollua duke përdorur një detektor frymëmarrjeje të lidhur me kutinë tonë të kohës të bazuar në Arduino, dhe të gjitha sinjalet (p.sh. temperatura, frymëmarrja, hapja/mbyllja e qepenit dhe marrja e imazhit) u regjistruan duke përdorur Powerlab dhe LabChart (AD Instruments, Sydney, Australi) 22. Kur mbyllja ishte e paarritshme, dy kamera IP (Panasonic BB-SC382) u pozicionuan në afërsisht 90° me njëra-tjetrën dhe u përdorën. për të monitoruar pozicionin e magnetit në lidhje me trakenë gjatë imazherisë (Fig. 2b, c). Për të minimizuar artefaktet e lëvizjes, u mor një imazh për frymëmarrje gjatë platosë së rrjedhës fundore të baticës.
Një magnet është i bashkangjitur në një fazë të dytë që mund të vendoset në distancë nga jashtë strehës së imazhit. U testuan pozicione dhe konfigurime të ndryshme të magnetit, duke përfshirë: Të montuar në një kënd prej afërsisht 30° mbi trake (konfigurimet e treguara në Figurat 2a dhe 3a); një magnet mbi kafshën dhe tjetri poshtë, me pole të vendosura për të tërhequr (Figura 3b); një magnet mbi kafshën dhe tjetri poshtë, me pole të vendosura për të shtyrë (Figura 3c); dhe një magnet sipër dhe pingul me trakenë (Figura 3d). Pasi kafsha dhe magneti të jenë konfiguruar dhe MP që do të testohet të jetë ngarkuar në pompën e shiringës, jepet një dozë prej 50 μl me një shpejtësi prej 4 μl/sek gjatë marrjes së imazheve. Magneti më pas lëviz para dhe mbrapa përgjatë ose anash nëpër trake ndërsa vazhdon të marrë imazhe.
Konfigurimi i magnetit për imazhe in vivo (a) një magnet i vetëm mbi trake në një kënd prej afërsisht 30°, (b) dy magnete të vendosur për të tërhequr, (c) dy magnete të vendosur për të shtyrë, (d) një magnet i vetëm sipër dhe pingul në trake. Vëzhguesi shikoi poshtë nga goja në mushkëri përmes trakesë, dhe rrezja e rrezeve X kaloi nëpër anën e majtë të miut dhe doli nga ana e djathtë. Magneti lëviz ose përgjatë gjatësisë së rrugës së frymëmarrjes ose majtas dhe djathtas mbi trake në drejtim të rrezes së rrezeve X.
Ne gjithashtu kërkuam të përcaktonim dukshmërinë dhe sjelljen e grimcave në rrugët e frymëmarrjes në mungesë të frymëmarrjes konfuze dhe lëvizjes kardiake. Prandaj, në fund të periudhës së imazherisë, kafshët u vranë në mënyrë humane për mbidozë pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, SHBA; ~65 mg/kg ip). Disa kafshë u lanë në platformën e imazherisë dhe, sapo frymëmarrja dhe rrahjet e zemrës ndaluan, procesi i imazherisë u përsërit, duke shtuar një dozë shtesë të MP nëse asnjë MP nuk ishte e dukshme në sipërfaqen e rrugëve të frymëmarrjes.
Imazhet e përftuara u korrigjuan në fushën e sheshtë dhe në fushën e errët dhe më pas u mblodhën në një film (20 kuadro për sekondë; 15-25 × shpejtësi normale në varësi të ritmit të frymëmarrjes) duke përdorur një skript të personalizuar të shkruar në MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Të gjitha studimet mbi administrimin e vektorit të gjenit LV u kryen në Qendrën e Kërkimit të Kafshëve Laboratorike në Universitetin e Adelaides dhe synonin të përdornin rezultatet e eksperimentit SPring-8 për të vlerësuar nëse administrimi i LV-MP në prani të një fushe magnetike mund të rriste transferimin e gjenit in vivo. Për të vlerësuar efektet e MP dhe fushës magnetike, u trajtuan dy grupe kafshësh: një grup iu dha LV-MP me një magnet të vendosur, dhe grupi tjetër mori një grup kontrolli me LV-MP pa magnet.
Vektorët e gjenit LV u gjeneruan duke përdorur metodat e përshkruara më parë 25, 26. Vektori LacZ shpreh gjenin beta-galaktozidazë të lokalizuar në bërthamë, të drejtuar nga promotori konstitutiv i MPSV (LV-LacZ), i cili prodhon një produkt reagimi blu në qelizat e transduktuara, të dukshëm në frontet e indeve të mushkërive dhe seksionet e indeve. Titrimi u krye në kulturat qelizore duke numëruar manualisht numrin e qelizave pozitive LacZ me një hemocitometër për të llogaritur titrin në TU/ml. Bartësit kriokonservohen në -80 °C, shkrihen para përdorimit dhe lidhen me CombiMag duke u përzier në një raport 1:1 dhe duke u inkubuar në akull për të paktën 30 minuta para dorëzimit.
Minjtë normalë Sprague Dawley (n = 3/grup, ~2-3 u anestezuan intraperitonealisht me një përzierje prej 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australi) dhe 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australi) muajsh) injeksion ip) dhe kanulim oral jo-kirurgjikal me një kanulë iv 16 Ga. Për të siguruar që indi i rrugëve të frymëmarrjes trakeale merr transduksionin e LV, ai u kushtëzua duke përdorur protokollin tonë të perturbimit mekanik të përshkruar më parë, në të cilin sipërfaqja e rrugëve të frymëmarrjes trakeale u fërkua në mënyrë aksiale me një shportë teli (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, SHBA) 30 s28. Administrimi trakeal i LV-MP u krye më pas në një kabinet sigurie biologjike afërsisht 10 minuta pas perturbimit.
Fusha magnetike e përdorur në këtë eksperiment u konfigurua në një mënyrë të ngjashme me studimin e imazherisë me rreze X in vivo, me të njëjtat magnete të mbajtura mbi trake duke përdorur kapëse stenti distilimi (Figura 4). Një vëllim prej 50 μl (2 × 25 μl alikuota) të LV-MP u fut në trake (n = 3 kafshë) duke përdorur një pipetë që përmbante një majë xheli siç është përshkruar më parë. Një grup kontrolli (n = 3 kafshë) mori të njëjtat LV-MP pa përdorimin e një magneti. Pasi infuzioni të ketë mbaruar, kanula hiqet nga tubi ET dhe kafsha ekstubohet. Magneti mbetet në vend për 10 minuta, pastaj hiqet. Minjtë morën një dozë nënlëkurore të meloksikamit (1 ml/kg) (Ilium, Australi) të ndjekur nga përmbysja e anestezisë me injeksion ip prej 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australi). Minjtë u mbajtën ngrohtë dhe u monitoruan deri në rikuperimin e plotë nga anestezia.
Pajisja e administrimit LV-MP në një kabinet sigurie biologjike. Boshti Luer gri i çelët i tubit ET mund të shihet duke dalë nga goja dhe maja e xhelit të pipetës së treguar në figurë futet përmes tubit ET deri në thellësinë e dëshiruar në trake.
Një javë pas procedurës së dozimit LV-MP, kafshët u vranë në mënyrë humane me anë të thithjes 100% CO2 dhe shprehja e LacZ u vlerësua duke përdorur trajtimin tonë standard X-gal. Tre unazat kaudale më kërcore u hoqën për t'u siguruar që çdo dëmtim mekanik ose mbajtje lëngjesh nga vendosja e tubit endotrakeal nuk u përfshi në analizë. Çdo trakea u pre gjatësisht për të krijuar dy gjysma për analizë, dhe ato u montuan në një enë që përmbante gome silikoni (Sylgard, Dow Inc) duke përdorur një gjilpërë Minutien (Fine Science Tools) për të vizualizuar sipërfaqen luminale. Shpërndarja dhe modeli i qelizave të transdukuara u konfirmuan me anë të fotografisë frontale duke përdorur një mikroskop Nikon (SMZ1500) me një kamerë DigiLite dhe softuer TCapture (Tucsen Photonics, Kinë). Imazhet u morën me zmadhim 20x (duke përfshirë cilësimin më të lartë për gjerësinë e plotë të trakesë), me të gjithë gjatësinë e trakesë të fotografuar hap pas hapi, duke siguruar mbivendosje të mjaftueshme midis secilës imazh për të lejuar "qepjen" e imazhit. Imazhet nga secila trakea u mblodhën më pas në një imazh të vetëm të përbërë duke përdorur Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) duke përdorur një algoritëm lëvizjeje planare. Zonat e shprehjes LacZ në imazhet kompozite të trakesë nga secila kafshë u përcaktuan duke përdorur një skript të automatizuar MATLAB (R2020a, MathWorks) siç është përshkruar më parë, duke përdorur cilësimet 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 dhe Value < 0.7. Duke gjurmuar konturet e indit, një maskë u gjenerua manualisht në GIMP v2.10.24 për secilën imazh të përbërë në mënyrë që të identifikohej zona e indeve dhe të parandalohej çdo zbulim i rremë nga jashtë indit trakeal. Zonat e ngjyrosura nga të gjitha imazhet e përbërë nga secila kafshë u mblodhën për të gjeneruar zonën totale të ngjyrosur për atë kafshë. Zona e ngjyrosur u nda më pas me zonën totale të maskës për të gjeneruar zonën e normalizuar.
Çdo trake u ngulit në parafinë dhe u prenë seksione prej 5 μm. Seksionet u ngjyrosën me të kuqe neutrale të shpejtë për 5 minuta dhe imazhet u morën duke përdorur një mikroskop Nikon Eclipse E400, kamerën DS-Fi3 dhe programin e kapjes së elementëve NIS (versioni 5.20.00).
Të gjitha analizat statistikore u kryen në GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Rëndësia statistikore u vendos në p ≤ 0.05. Normaliteti u verifikua duke përdorur testin Shapiro-Wilk, dhe ndryshimet në ngjyrosjen LacZ u vlerësuan duke përdorur testin t të paçiftuar.
Gjashtë MP-të e përshkruara në Tabelën 1 u ekzaminuan duke përdorur PCXI, dhe dukshmëria përshkruhet në Tabelën 2. Dy MP-të e polistirenit (MP1 dhe MP2; përkatësisht 18 μm dhe 0.25 μm) nuk ishin të dukshme nën PCXI, por pjesa tjetër e mostrave ishte e identifikueshme (shembuj tregohen në Figurën 5). MP3 dhe MP4 (10-15% Fe3O4; përkatësisht 0.25 μm dhe 0.9 μm) janë pak të dukshme. Megjithëse përmbanin disa nga grimcat më të vogla të testuara, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) ishte më e theksuara. Produkti CombiMag MP6 është i vështirë për t'u dalluar. Në të gjitha rastet, aftësia jonë për të zbuluar MP u rrit ndjeshëm duke e zhvendosur magnetin para dhe mbrapa paralelisht me kapilarin. Kur magnetët u larguan nga kapilari, grimcat u zgjatën në vargje të gjata, por ndërsa magnetët u afruan dhe forca e fushës magnetike u rrit, vargjet e grimcave u shkurtuan ndërsa grimcat migruan drejt sipërfaqes së sipërme të kapilarit (shih Videon Plotësuese S1: MP4), duke rritur Dendësia e grimcave të sipërfaqes. Anasjelltas, kur magneti hiqet nga kapilari, intensiteti i fushës zvogëlohet dhe MP-të riorganizohen në vargje të gjata që shtrihen nga sipërfaqja e sipërme e kapilarit (shih Videon Plotësuese S2:MP4). Pasi magneti ndalon së lëvizuri, grimcat vazhdojnë të lëvizin për një kohë të shkurtër pasi të arrijnë pozicionin e ekuilibrit. Ndërsa MP lëviz drejt dhe larg sipërfaqes së sipërme të kapilarit, grimcat magnetike zakonisht i tërheqin mbeturinat përmes lëngut.
Dukshmëria e MP nën PCXI ndryshon ndjeshëm midis mostrave. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dhe (d) MP6. Të gjitha imazhet e paraqitura këtu janë marrë me një magnet të vendosur afërsisht 10 mm direkt mbi kapilar. Rrathët e mëdhenj të dukshëm janë flluska ajri të bllokuara në kapilarë, duke treguar qartë tiparet e skajit të zi dhe të bardhë të imazhit me kontrast fazor. Kutia e kuqe përmban zmadhimin që rrit kontrastin. Vini re se diametrat e skemave të magnetit në të gjitha figurat nuk janë në shkallë dhe janë afërsisht 100 herë më të mëdhenj se sa tregohen.
Ndërsa magneti zhvendoset majtas dhe djathtas përgjatë pjesës së sipërme të kapilarit, këndi i vargut MP ndryshon për t'u rreshtuar me magnetin (shih Figurën 6), duke përcaktuar kështu linjat e fushës magnetike. Për MP3-5, pasi korda arrin një kënd pragu, grimcat zvarriten përgjatë sipërfaqes së sipërme të kapilarit. Kjo shpesh rezulton në grumbullimin e MP-ve në grupe më të mëdha afër vendit ku fusha magnetike është më e fortë (shih Videon Plotësuese S3:MP5). Kjo është gjithashtu veçanërisht e dukshme kur imazhi është afër fundit të kapilarit, gjë që bën që MP-të të grumbullohen dhe të përqendrohen në ndërfaqen lëng-ajër. Grimcat në MP6, të cilat ishin më të vështira për t'u dalluar se MP3-5, nuk u zvarritën ndërsa magneti lëvizte përgjatë kapilarit, por vargjet MP u shkëputën, duke i lënë grimcat në fushën e shikimit (shih Videon Plotësuese S4:MP6). Në disa raste, kur fusha magnetike e aplikuar u zvogëlua duke lëvizur magnetin në një distancë të madhe nga vendi i imazhit, çdo MP i mbetur zbriti ngadalë në sipërfaqen e poshtme të tubit nga graviteti ndërsa mbeti në varg (shih Videon Plotësuese S5: MP3).
Këndi i vargut MP ndryshon ndërsa magneti zhvendoset në të djathtë mbi kapilar. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dhe (d) MP6. Kutia e kuqe përmban zmadhimin që rrit kontrastin. Vini re se videot plotësuese janë informuese pasi ato zbulojnë strukturën e rëndësishme të grimcave dhe informacionin dinamik që nuk mund të vizualizohet në këto imazhe statike.
Testet tona treguan se lëvizja e ngadaltë e magnetit para dhe mbrapa përgjatë trakesë lehtëson vizualizimin e MP në kontekstin e lëvizjes komplekse in vivo. Testimi in vivo nuk u krye pasi sferat e polistirenit (MP1 dhe MP2) nuk ishin të dukshme në kapilar. Secili prej katër MP-ve të mbetura u testua in vivo me boshtin e gjatë të magnetit të konfiguruar mbi trake në një kënd prej rreth 30° në krahasim me vertikalen (shih Figurat 2b dhe 3a), pasi kjo rezultoi në zinxhirë më të gjatë të MP dhe ishte më efektive sesa konfigurimi i magnetit i ndërprerë. MP3, MP4 dhe MP6 nuk u zbuluan në trakenë e asnjë kafshe të gjallë. Kur rrugët e frymëmarrjes së miut u imazhuan pasi kafshët u vranë në mënyrë humane, grimcat mbetën të padukshme edhe kur u shtua vëllim shtesë duke përdorur një pompë shiringe. MP5 kishte përmbajtjen më të lartë të oksidit të hekurit dhe ishte e vetmja grimcë e dukshme, dhe për këtë arsye u përdor për të vlerësuar dhe karakterizuar sjelljen in vivo të MP.
Vendosja e magnetit mbi trake gjatë administrimit të MP rezultoi në përqendrimin e shumë MP-ve, por jo të gjithave, në fushën e shikimit. Grimcat që hyjnë në trake vërehen më së miri te kafshët e sakrifikuara në mënyrë humane. Figura 7 dhe Videoja Plotësuese S6: MP5 tregojnë kapjen e shpejtë magnetike dhe shtrirjen e grimcave në sipërfaqen e trakesë ventrale, duke treguar se MP-të mund të drejtohen në rajonet e dëshiruara të trakesë. Kur u kërkua më distale përgjatë trakesë pas administrimit të MP-ve, disa MP u gjetën më afër karinës, duke sugjeruar që forca e fushës magnetike ishte e pamjaftueshme për të mbledhur dhe mbajtur të gjitha MP-të, pasi ato u administruan përmes rajonit me forcë maksimale të fushës magnetike gjatë procesit të lëngjeve. Megjithatë, përqendrimet e MP-ve pas lindjes ishin më të larta rreth zonës së imazhit, duke sugjeruar që shumë MP mbetën në rajonet e rrugëve të frymëmarrjes ku forca e fushës magnetike e aplikuar ishte më e larta.
Imazhe nga (a) para dhe (b) pas administrimit të MP5 në trakenë e një miu të eutanizuar së fundmi me magnetin e pozicionuar direkt mbi zonën e imazhit. Zona e imazhit ndodhet midis dy unazave të kërcit. Para administrimit të MP, ka pak lëng në rrugët e frymëmarrjes. Kutia e kuqe përmban zmadhimin që rrit kontrastin. Këto imazhe janë nga videoja e treguar në Videon Plotësuese S6:MP5.
Zhvendosja e magnetit përgjatë trakesë in vivo bëri që zinxhiri MP të ndryshonte këndin brenda sipërfaqes së rrugës ajrore në një mënyrë të ngjashme me atë të parë në kapilarë (shih Figurën 8 dhe Videon Plotësuese S7:MP5). Megjithatë, në studimin tonë, MP nuk mund të zvarriteshin përgjatë sipërfaqes së rrugës ajrore të gjallë siç mund të ndodhte me kapilarët. Në disa raste, zinxhiri MP do të zgjatet ndërsa magneti lëviz majtas dhe djathtas. Është interesante se zbuluam gjithashtu se vargu i grimcave duket se ndryshon thellësinë e shtresës sipërfaqësore të lëngut kur magneti lëviz gjatësisht përgjatë trakesë dhe zgjerohet kur magneti lëviz direkt sipër dhe vargu i grimcave rrotullohet në një pozicion vertikal (shih Videon Plotësuese S7). : MP5 në 0:09, poshtë djathtas). Modeli karakteristik i lëvizjes ndryshoi kur magneti u zhvendos përgjatë pjesës së sipërme të trakesë anash (domethënë, në të majtë ose të djathtë të kafshës në vend që të kalonte përgjatë gjatësisë së trakesë). Grimcat ishin ende qartë të dukshme ndërsa lëviznin, por kur magneti u hoq nga trakeja, majat e vargjeve të grimcave u bënë të dukshme (shih Videon Plotësuese S8:MP5, duke filluar nga 0:08). Kjo është në përputhje me sjelljen e MP që vëzhguam nën një fushë magnetike të aplikuar në një kapilar qelqi.
Shembuj imazhesh që tregojnë MP5 në trakenë e një miu të gjallë të anestezuar. (a) Magneti përdoret për të marrë imazhe sipër dhe në të majtë të trakesë, pastaj (b) pasi magneti të zhvendoset në të djathtë. Kutia e kuqe përmban zmadhimin që rrit kontrastin. Këto imazhe janë nga videoja e treguar në Videon Plotësuese S7:MP5.
Kur dy polet u konfiguruan në një orientim veri-jug sipër dhe poshtë trakesë (domethënë duke tërhequr; Fig. 3b), kordat MP dukeshin më të gjata dhe ishin të vendosura në murin anësor të trakesë në vend të sipërfaqes dorsale trakeale (shih Videon Plotësuese S9:MP5). Megjithatë, përqendrime të larta të grimcave në një vendndodhje të vetme (domethënë, sipërfaqja dorsale e trakesë) nuk u zbuluan pas administrimit të lëngjeve kur u përdor një pajisje me dy magnete, gjë që zakonisht ndodh kur përdoret një pajisje me një magnet të vetëm. Pastaj, kur një magnet u konfigurua për të sprapsur polet të përmbysura (Fig. 3c), numri i grimcave të dukshme në fushën e shikimit nuk dukej se rritej pas administrimit. Konfigurimi i të dy konfigurimeve me dy magnete është sfidues për shkak të forcave të larta të fushës magnetike që tërheqin ose shtyjnë magnetet, përkatësisht. Konfigurimi u ndryshua më pas në një magnet të vetëm paralel me rrugën e frymëmarrjes, por që kalonte nëpër rrugën e frymëmarrjes në 90 gradë në mënyrë që linjat e fushës të kalonin murin trakeal në mënyrë ortogonale (Fig. 3d), një orientim i projektuar për të përcaktuar nëse mund të vërehej grumbullimi i grimcave në murin anësor. Megjithatë, në këtë konfigurim, kishte asnjë lëvizje e identifikueshme e akumulimit të MP ose lëvizjes së magnetit. Bazuar në të gjitha këto rezultate, u zgjodh një konfigurim me një magnet të vetëm, me orientim 30 gradë (Figura 3a) për studimet in vivo të bartësve të gjeneve.
Kur kafsha u fotografua në mënyrë të përsëritur menjëherë pas vrasjes humane, mungesa e lëvizjes ngatërruese të indeve nënkuptonte që vija grimcash më të holla dhe më të shkurtra mund të dalloheshin në fushën e qartë interkondrale, "të lëkundshme" në përputhje me lëvizjen përkthimore të magnetit. Megjithatë, ende nuk mund të shihet qartë prania dhe lëvizja e grimcave MP6.
Titri LV-LacZ ishte 1.8 × 108 TU/ml, dhe pas përzierjes 1:1 me CombiMag MP (MP6), kafshët morën një dozë trakeale prej 50 μl prej 9 × 107 TU/ml mjeti LV (domethënë 4.5 × 106 TU/miu). Në këto studime, në vend që ta zhvendosnim magnetin gjatë lindjes, ne e fiksuam magnetin në një pozicion për të përcaktuar nëse transduksioni i LV (a) mund të përmirësohej krahasuar me administrimin vektorial në mungesë të një fushe magnetike, dhe (b) mund të përqendrohej. Qelizat e rrugëve të frymëmarrjes transduktohen në rajone magnetike të synuara të rrugëve të sipërme të frymëmarrjes.
Prania e magneteve dhe përdorimi i CombiMag i kombinuar me vektorët LV nuk duket se kanë pasur efekte negative në shëndetin e kafshëve, ashtu si protokolli ynë standard i administrimit të vektorëve LV. Imazhet ballore të rajonit trakeal të nënshtruar perturbimit mekanik (Fig. 1 plotësuese) treguan se kishte nivele dukshëm më të larta të transduksionit në grupin e kafshëve të trajtuara me LV-MP kur magneti ishte i pranishëm (Fig. 9a). Vetëm një sasi e vogël e ngjyrosjes blu LacZ ishte e pranishme në grupin e kontrollit (Fig. 9b). Kuantifikimi i zonave të normalizuara të ngjyrosura me X-Gal tregoi se administrimi i LV-MP në prani të një fushe magnetike prodhoi një përmirësim afërsisht 6-fish (Fig. 9c).
Shembuj imazhesh të përbëra që tregojnë transduksionin trakeal nga LV-MP (a) në prani të një fushe magnetike dhe (b) në mungesë të një magneti. (c) Përmirësim statistikisht i rëndësishëm në zonën e normalizuar të transduksionit LacZ brenda trakesë kur përdoret magneti (*p = 0.029, t-test, n = 3 për grup, mesatarja ± SEM).
Seksionet neutrale të ngjyrosura shpejt me të kuqe (shembulli i treguar në Fig. 2 plotësuese) treguan qeliza të ngjyrosura me LacZ të pranishme në një model dhe vendndodhje të ngjashme siç është raportuar më parë.
Një sfidë kryesore për terapinë gjenike të rrugëve të frymëmarrjes mbetet lokalizimi i saktë i grimcave bartëse në rajonet me interes dhe arritja e niveleve të larta të efikasitetit të transduksionit në mushkëritë lëvizëse në prani të rrjedhës së ajrit dhe pastrimit aktiv të mukusit. Për bartësit e LV të projektuar për të trajtuar sëmundjen e rrugëve të frymëmarrjes me fibrozë cistike, rritja e kohës së qëndrimit të grimcave bartëse brenda rrugëve të frymëmarrjes përçuese ka qenë një qëllim deri më tani i pakapshëm. Siç është theksuar nga Castellani et al., përdorimi i fushave magnetike për të përmirësuar transduksionin ka përparësi krahasuar me metodat e tjera të administrimit të gjeneve, siç është elektroporimi, pasi mund të kombinojë thjeshtësinë, efektivitetin e kostos, lokalizimin e administrimit, efikasitetin e rritur dhe kohët më të shkurtra të inkubacionit, dhe ndoshta një dozë më të vogël të bartësit10. Megjithatë, depozitimi in vivo dhe sjellja e grimcave magnetike në rrugët e frymëmarrjes nën ndikimin e forcave të jashtme magnetike nuk është përshkruar kurrë, dhe as nuk është demonstruar në të vërtetë fizibiliteti i kësaj metode in vivo për të rritur nivelet e shprehjes së gjeneve në rrugët e frymëmarrjes të gjalla të paprekura.
Eksperimentet tona in vitro me sinkrotron PCXI treguan se të gjitha grimcat që testuam, me përjashtim të polistirenit MP, ishin të dukshme në konfigurimin e imazhit që përdorëm. Në prani të një fushe magnetike, MP formojnë vargje gjatësitë e të cilave lidhen me llojin e grimcave dhe forcën e fushës magnetike (domethënë afërsinë dhe lëvizjen e magnetit). Siç tregohet në Figurën 10, vargjet që vëzhgojmë formohen për shkak të magnetizimit të secilës grimcë individuale dhe induktimit të fushës së saj lokale magnetike. Këto fusha të ndara bëjnë që grimca të tjera të ngjashme të grumbullohen dhe të lidhen, me lëvizje të ngjashme me vargun në grup për shkak të forcave lokale nga forcat lokale tërheqëse dhe shtytëse të grimcave të tjera.
Skema që tregon (a, b) vargje grimcash të gjeneruara brenda kapilarëve të mbushur me lëng dhe (c, d) trakenë e mbushur me ajër. Vini re se kapilarët dhe trakeja nuk janë vizatuar në shkallë. Paneli (a) përmban gjithashtu një përshkrim të MP, i cili përmban grimca Fe3O4 të rregulluara në vargje.
Kur magneti u zhvendos mbi kapilar, këndi i vargut të grimcave arriti një prag kritik për MP3-5 që përmban Fe3O4, pas së cilës vargu i grimcave nuk qëndroi më në pozicionin origjinal, por u zhvendos përgjatë sipërfaqes në një pozicion të ri. Ky efekt ka të ngjarë të ndodhë sepse sipërfaqja kapilare e qelqit është mjaft e lëmuar për të lejuar që kjo lëvizje të ndodhë. Interesante është se MP6 (CombiMag) nuk u soll në këtë mënyrë, ndoshta sepse grimcat ishin më të vogla, kishin veshje ose ngarkesa sipërfaqësore të ndryshme, ose një lëng bartës i patentuar ndikoi në aftësinë e tyre për të lëvizur. Kontrasti i imazhit të grimcave CombiMag është gjithashtu më i dobët, duke sugjeruar që lëngu dhe grimcat mund të kenë dendësi të ngjashme dhe për këtë arsye nuk lëvizin lehtësisht drejt njëra-tjetrës. Grimcat gjithashtu mund të ngecin nëse magneti lëviz shumë shpejt, duke treguar se forca e fushës magnetike nuk mund ta kapërcejë gjithmonë fërkimin midis grimcave në lëng, duke sugjeruar se ndoshta nuk është për t'u habitur që forca e fushës magnetike dhe distanca midis magnetit dhe zonës së synuar janë shumë të rëndësishme. Të marra së bashku, këto rezultate sugjerojnë gjithashtu se, ndërsa magnetët mund të kapin shumë MP që rrjedhin nëpër zonën e synuar, është e pamundur që magnetet të mund të mbështeten për të... lëvizin grimcat CombiMag përgjatë sipërfaqes së trakesë. Prandaj, ne konkludojmë se studimet in vivo LV-MP duhet të përdorin fusha magnetike statike për të synuar fizikisht rajone specifike të pemës së rrugëve të frymëmarrjes.
Kur grimcat futen në trup, ato janë të vështira për t'u identifikuar në kontekstin e indeve komplekse të trupit në lëvizje, por aftësia për t'i zbuluar ato u përmirësua duke e zhvendosur magnetin horizontalisht mbi trake për të "lëvizur" fijet e MP. Megjithëse imazhet e drejtpërdrejta janë të mundura, është më e lehtë të dallohet lëvizja e grimcave pasi kafsha të jetë vrarë në mënyrë humane. Përqendrimet e MP ishin përgjithësisht më të larta në këtë vend kur magneti ishte pozicionuar mbi zonën e imazhit, megjithëse disa grimca zakonisht gjendeshin më tej përgjatë trakesë. Në ndryshim nga studimet in vitro, grimcat nuk mund të zvarriten përgjatë trakesë duke zhvendosur magnetin. Ky zbulim është në përputhje me mënyrën se si mukusi që vesh sipërfaqen e trakesë zakonisht përpunon grimcat e thithura, duke i bllokuar ato në mukus dhe më pas duke i pastruar nga mekanizmi i pastrimit mukociliar.
Ne hipotetizuam se përdorimi i magneteve për tërheqje sipër dhe poshtë trakesë (Fig. 3b) mund të rezultojë në një fushë magnetike më uniforme, në vend të një fushe magnetike që është shumë e përqendruar në një pikë, duke çuar potencialisht në një shpërndarje më uniforme të grimcave. Megjithatë, studimi ynë paraprak nuk gjeti prova të qarta për të mbështetur këtë hipotezë. Po kështu, konfigurimi i një palë magnetesh për të sprapsur (Fig. 3c) nuk rezultoi në më shumë depozitim grimcash në zonën e imazhit. Këto dy gjetje tregojnë se konfigurimi me dy magnete nuk përmirëson ndjeshëm kontrollin lokal të synimit të MP, dhe se forcat e forta magnetike që rezultojnë janë të vështira për t'u konfiguruar, duke e bërë këtë qasje më pak praktike. Në mënyrë të ngjashme, orientimi i magnetit sipër dhe përmes trakesë (Fig. 3d) gjithashtu nuk rriti numrin e grimcave të mbajtura në zonën e imazhit. Disa nga këto konfigurime alternative mund të mos jenë të suksesshme sepse ato rezultojnë në forca më të ulëta të fushës magnetike brenda zonës së depozitimit. Prandaj, konfigurimi i një magneti me kënd të vetëm 30 gradë (Figura 3a) konsiderohet metoda më e lehtë dhe më efikase për testimin in vivo.
Studimi LV-MP tregoi se kur vektorët e LV u kombinuan me CombiMag dhe u dorëzuan pas perturbimit fizik në prani të një fushe magnetike, nivelet e transduksionit u rritën ndjeshëm në trake krahasuar me kontrollet. Bazuar në studimet e imazherisë sinkrotron dhe rezultatet e LacZ, fusha magnetike me sa duket ishte në gjendje të ruante LV brenda trakesë dhe të zvogëlonte numrin e grimcave vektoriale që depërtonin menjëherë thellë në mushkëri. Përmirësime të tilla në synim mund të çojnë në efikasitet më të lartë, duke zvogëluar titrat e dorëzuar, transduksionin jashtë objektivit, efektet anësore inflamatore dhe imune, dhe kostot e bartësit të gjeneve. Është e rëndësishme të theksohet se, sipas prodhuesit, CombiMag mund të përdoret në lidhje me metoda të tjera të transferimit të gjeneve, duke përfshirë vektorë të tjerë viralë (si AAV) dhe acide nukleike.