Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman modeu kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal nampilkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Vektor gén pikeun pengobatan panyakit paru-paru fibrosis kistik kedah narékahan saluran pernapasan anu ngalir sabab transduksi paru-paru periferal henteu nyayogikeun mangpaat terapi. Efisiensi transduksi virus langsung aya hubunganana sareng waktos cicingna véktor. Nanging, cairan pangiriman sapertos pamawa gén sacara alami nyebar kana alveoli nalika inspirasi, sareng partikel terapi tina bentuk naon waé gancang dibersihkeun ku transportasi mukosiliar. Manjangkeun waktos cicingna pamawa gén dina saluran pernapasan penting tapi hésé kahontal. Partikel magnét konjugasi pamawa gén anu tiasa diarahkeun ka permukaan saluran pernapasan tiasa ningkatkeun targeting régional. Kusabab tantangan visualisasi in vivo, paripolah partikel magnét alit sapertos kitu dina permukaan saluran pernapasan dina ayana médan magnét anu diterapkeun kirang kahartos. Tujuan tina panilitian ieu nyaéta pikeun nganggo pencitraan sinkrotron pikeun ngabayangkeun gerakan in vivo tina séri partikel magnét dina trakea beurit anu dibius pikeun nalungtik dinamika sareng pola paripolah partikel individu sareng massal in vivo. Kami teras ogé meunteun naha pangiriman partikel magnét lentiviral dina ayana médan magnét bakal ningkatkeun efisiensi transduksi dina trakea beurit. Sinar-X Sinkron Pencitraan ngungkabkeun paripolah partikel magnét dina médan magnét anu cicing sareng obah in vitro sareng in vivo. Partikel teu tiasa gampang diseret sapanjang permukaan saluran napas hirup nganggo magnét, tapi salami diangkut, deposit dikonsentrasikeun dina widang pandang dimana médan magnét paling kuat. Efisiensi transduksi ogé ningkat genep kali lipat nalika partikel magnét lentiviral dikirimkeun dina ayana médan magnét. Babarengan, hasil ieu nunjukkeun yén partikel magnét lentiviral sareng médan magnét tiasa janten pendekatan anu berharga pikeun ningkatkeun targeting véktor gén sareng ningkatkeun tingkat transduksi dina ngalaksanakeun saluran napas in vivo.
Fibrosis kistik (CF) disababkeun ku variasi dina hiji gén anu disebut regulator konduktansi transmembran CF (CFTR). Protéin CFTR nyaéta saluran ion anu aya dina seueur sél épitél di sakumna awak, kalebet saluran pernapasan, situs utama patogenesis CF. Cacad CFTR nyababkeun transportasi cai anu teu normal, ngadehidrasi permukaan saluran pernapasan sareng ngirangan jerona lapisan cairan permukaan saluran pernapasan (ASL). Ieu ogé ngarusak kamampuan sistem transportasi mukosiliar (MCT) pikeun ngabersihan partikel sareng patogén anu dihirup tina saluran pernapasan. Tujuan kami nyaéta pikeun ngembangkeun terapi gén lentiviral (LV) pikeun nganteurkeun salinan gén CFTR anu leres sareng ningkatkeun ASL, MCT, sareng kaséhatan paru-paru, sareng pikeun teras ngembangkeun téknologi énggal anu sanggup ngukur parameter ieu in vivo1.
Vektor LV mangrupikeun salah sahiji calon utama pikeun terapi gén saluran napas CF, utamina kusabab aranjeunna tiasa ngahijikeun gén terapi sacara permanén kana sél basal saluran napas (sél stém saluran napas). Ieu penting sabab aranjeunna tiasa mulangkeun hidrasi normal sareng beberesih mukus ku cara ngabédakeun kana sél permukaan saluran napas anu dikoréksi gén fungsional anu aya hubunganana sareng CF, anu ngahasilkeun kauntungan salami hirup. Vektor LV kedah diarahkeun ngalawan saluran napas anu ngalir, sabab di dieu panyakit paru-paru CF dimimitian. Pangiriman véktor anu langkung jero kana paru-paru tiasa nyababkeun transduksi alveolar, tapi ieu teu gaduh kauntungan terapi dina CF. Nanging, cairan sapertos pamawa gén sacara alami migrasi ka alveoli nalika inspirasi saatos pangiriman3,4 sareng partikel terapi gancang dibersihkeun kana rongga lisan ku MCT. Efisiensi transduksi LV langsung aya hubunganana sareng lami waktos véktor tetep gigireun sél target pikeun ngamungkinkeun panyerepan sélular - "waktos cicing"5 - anu gampang dikirangan ku aliran hawa régional has ogé panangkepan mukus partikel anu terkoordinasi sareng MCT. Pikeun CF, kamampuan pikeun manjangkeun waktos cicing LV dina saluran napas penting pikeun ngahontal tingkat transduksi anu luhur di daérah ieu, tapi dugi ka ayeuna nangtang.
Pikeun ngungkulan halangan ieu, kami nyarankeun yén partikel magnét LV (MP) tiasa ngabantosan dina dua cara anu saling ngalengkepan. Mimiti, aranjeunna tiasa dipandu sacara magnét ka permukaan saluran napas pikeun ningkatkeun targeting sareng ngabantosan partikel pamawa gén cicing di daérah saluran napas anu dipikahoyong; sareng ASL) pikeun pindah ka lapisan sél 6. MP parantos seueur dianggo salaku wahana pangiriman ubar anu dituju nalika aranjeunna ngabeungkeut antibodi, ubar kémoterapi, atanapi molekul alit sanés anu napel kana mémbran sél atanapi ngabeungkeut kana reséptor permukaan sél anu relevan sareng akumulasi di situs tumor dina ayana listrik statis. Médan Magnét pikeun Pangobatan Kangker 7. Téhnik "hipertermal" anu sanés bertujuan pikeun manaskeun MP nalika kakeunaan médan magnét anu osilasi, sahingga ngancurkeun sél tumor. Prinsip transfeksi magnét, dimana médan magnét dianggo salaku agén transfeksi pikeun ningkatkeun transfer DNA ka sél, umumna dianggo sacara in vitro nganggo rupa-rupa véktor gén non-virus sareng virus pikeun garis sél anu hésé ditransduksi. Éféktivitas magnetotransfeksi LV parantos ditetepkeun, kalayan pangiriman in vitro LV-MP ka garis sél épitél bronkial manusa dina ayana médan magnét statis, ningkatkeun efisiensi transduksi ku 186 kali lipat dibandingkeun sareng véktor LV nyalira. LV-MP ogé parantos diterapkeun kana modél CF in vitro, dimana transfeksi magnét ningkatkeun transduksi LV dina kultur antarmuka hawa-cair ku 20 kali lipat dina ayana sputum CF10. Nanging, magnetotransfeksi organ in vivo nampi sakedik perhatian sareng ngan ukur dievaluasi dina sababaraha panilitian sato11,12,13,14,15, khususna dina paru-paru16,17. Sanajan kitu, kasempetan pikeun transfeksi magnét dina terapi paru-paru CF jelas. Tan et al. (2020) nyatakeun yén "studi bukti-konsép ngeunaan pangiriman pulmonal nanopartikel magnét anu efisien bakal muka jalan pikeun strategi inhalasi CFTR ka hareup pikeun ningkatkeun hasil klinis dina pasien CF"6.
Paripolah partikel magnét leutik dina permukaan saluran napas nalika aya médan magnét anu diterapkeun hésé divisualisasikeun sareng dikaji, sahingga kurang kahartos. Dina panilitian sanés, kami ngembangkeun metode pencitraan sinar-X fase kontras berbasis propagasi sinkrotron (PB-PCXI) pikeun sacara non-invasif ngavisualisasikeun sareng ngitung parobahan in vivo menit dina jerona ASL18 sareng paripolah MCT19,20 pikeun ngukur langsung hidrasi permukaan Saluran gas sareng dianggo salaku indikator awal khasiat pangobatan. Salaku tambahan, metode évaluasi MCT kami nganggo partikel diaméter 10–35 µm anu diwangun ku alumina atanapi kaca indéks bias tinggi salaku spidol MCT anu katingali nganggo PB-PCXI21. Kadua téknik ieu cocog pikeun visualisasi rupa-rupa jinis partikel, kalebet MP.
Kusabab résolusi spasial sareng temporalna anu luhur, téknik analisis ASL sareng MCT berbasis PB-PCXI kami cocog pisan pikeun nalungtik dinamika sareng pola paripolah partikel tunggal sareng massal in vivo pikeun ngabantosan kami ngartos sareng ngaoptimalkeun téknik pangiriman gén MP. Pendekatan anu kami anggo di dieu asalna tina panilitian kami nganggo beamline SPring-8 BL20B2, dimana kami ngavisualisasikeun gerakan cairan nuturkeun pangiriman dosis véktor palsu kana saluran napas nasal sareng pulmonal beurit pikeun ngabantosan ngajelaskeun pola éksprési gén Non-seragam anu dititénan dina panilitian sato dosis pamawa gén kami 3,4.
Tujuan tina panilitian ieu nyaéta pikeun ngagunakeun sinkrotron PB-PCXI pikeun ngabayangkeun gerakan in vivo tina sarangkaian MP dina trakea beurit hirup. Panilitian pencitraan PB-PCXI ieu dirancang pikeun nguji rupa-rupa MP, kakuatan médan magnét, sareng lokasi pikeun nangtukeun pangaruhna kana gerakan MP. Kami ngahipotesiskeun yén médan magnét anu diterapkeun sacara éksternal bakal ngabantosan MP anu dikirimkeun cicing atanapi pindah ka daérah target. Panilitian ieu ogé ngamungkinkeun kami pikeun ngaidentipikasi konfigurasi magnét anu ngamaksimalkeun jumlah partikel anu ditahan dina trakea saatos déposisi. Dina séri panilitian kadua, kami narékahan pikeun ngagunakeun konfigurasi optimal ieu pikeun nunjukkeun pola transduksi anu dihasilkeun tina pangiriman in vivo LV-MP ka saluran napas beurit, dumasar kana anggapan yén pangiriman LV-MP dina kontéks targeting saluran napas bakal ngahasilkeun efisiensi transduksi LV anu ningkat.
Sadaya panilitian sato dilaksanakeun numutkeun protokol anu disatujuan ku Universitas Adelaide (M-2019-060 sareng M-2020-022) sareng Komite Étika Sato Synchrotron SPring-8. Ékspérimén dilaksanakeun numutkeun pedoman ARRIVE.
Sadaya pencitraan sinar-X dilaksanakeun di beamline BL20XU di sinkrotron SPring-8 di Jepang, nganggo setelan anu sami sareng anu dijelaskeun sateuacanna21,22. Sacara singget, kotak ékspériméntal ayana 245 m ti cincin panyimpen sinkrotron. Jarak sampel-ka-detektor 0,6 m dianggo pikeun studi pencitraan partikel sareng 0,3 m pikeun studi pencitraan in vivo pikeun ngahasilkeun épék kontras fase. Énergi sinar monokromatik 25 keV dianggo. Gambar dicandak nganggo konverter sinar-X résolusi luhur (SPring-8 BM3) anu digandengkeun kana detektor sCMOS. Konverter ngarobih sinar-X janten cahaya anu katingali nganggo sintilator kandel 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), anu teras diarahkeun ka sensor sCMOS nganggo objektif mikroskop × 10 (NA 0,3). Detektor sCMOS nyaéta Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) kalayan ukuran array 2048 × 2048 piksel sareng ukuran piksel atah 6,5 × 6,5 µm. Setelan ieu ngahasilkeun ukuran piksel isotropik efektif 0,51 µm sareng widang pandang sakitar 1,1 mm × 1,1 mm. Panjang paparan 100 ms dipilih pikeun maksimalkeun babandingan signal-to-noise partikel magnét di jero sareng di luar saluran napas bari ngaminimalkeun artefak gerakan anu diinduksi ku engapan. Pikeun studi in vivo, rana sinar-X gancang disimpen dina jalur sinar-X pikeun ngawatesan dosis radiasi ku cara meungpeuk sinar-X di antara paparan.
Pamawa LV teu dianggo dina studi pencitraan SPring-8 PB-PCXI sabab kamar pencitraan BL20XU teu disertipikasi Biosafety Level 2. Gantina, kami milih sababaraha MP anu dicirikeun kalayan saé ti dua supplier komérsial—anu ngawengku rupa-rupa ukuran, bahan, konsentrasi beusi, sareng aplikasi—mimiti pikeun ngartos kumaha médan magnét mangaruhan gerakan MP dina kapiler kaca, teras dina saluran pernapasan hirup. dina beungeut cai. MP ukuranana ti 0,25 nepi ka 18 μm sarta dijieun tina rupa-rupa bahan (tingali Tabel 1), tapi komposisi unggal sampel, kaasup ukuran partikel magnét dina MP, teu dipikanyaho. Dumasar kana studi MCT kami anu éksténsif 19, 20, 21, 23, 24, kami ngarepkeun yén MP anu ukuranana leutik sapertos 5 μm tiasa katingali dina beungeut saluran napas trakea, contona ku cara ngirangan pigura anu padeukeut pikeun ningali pisibilitas gerakan MP anu ningkat. MP ukuran 0,25 μm tunggal langkung alit tibatan résolusi alat pencitraan, tapi PB-PCXI diperkirakeun bakal ngadeteksi kontras volume sareng gerakan cairan permukaan tempat aranjeunna disimpen saatos déposisi.
Sampel pikeun unggal MP dina Tabel 1 disiapkeun dina kapiler kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) kalayan diaméter jero 0,63 mm. Partikel korpuskular sayogi dina cai, sedengkeun partikel CombiMag sayogi dina cairan milik produsén. Unggal tabung satengah dieusi ku cairan (sakitar 11 μl) sareng disimpen dina wadah sampel (tingali Gambar 1). Kapiler kaca disimpen sacara horizontal dina tahap sampel dina kotak pencitraan, masing-masing, sareng ditempatkeun di sisi cairan. Magnet boron beusi neodymium (NdFeB) cangkang nikel bumi langka diaméter 19 mm (panjang 28 mm) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) kalayan magnetisasi sésa 1,17 Tesla dipasang kana tahap translasi anu misah pikeun ngahontal Robah posisina jarak jauh salami pencitraan. Akuisisi gambar sinar-X dimimitian nalika magnet diposisikan sakitar 30 mm di luhur sampel, sareng gambar diala dina laju 4 pigura per detik. Salila pencitraan, magnet dibawa caket kana tabung kapiler kaca. (sakitar 1 mm jauhna) teras ditarjamahkeun sapanjang tabung pikeun meunteun pangaruh kakuatan sareng posisi medan.
Setelan pencitraan in vitro anu ngandung sampel MP dina kapiler kaca dina tahapan translasi xy sampel. Jalur sinar-X ditandaan ku garis putus-putus beureum.
Sakali pisibilitas in vitro MP parantos ditetepkeun, sabagian tina éta diuji in vivo dina beurit Wistar albino bikang tipe liar (umur ~ 12 minggu, ~ 200 g). 0,24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Jepang), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepang) sareng 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika) Tikus dibius ku campuran Pharma), Jepang) ku suntikan intraperitoneal. Saatos anestesi, aranjeunna disiapkeun pikeun pencitraan ku cara miceun bulu di sakitar trakea, nyelapkeun tabung endotrakeal (ET; 16 Ga iv kanula, Terumo BCT) sareng ngimobilisasi aranjeunna dina pelat pencitraan khusus anu ngandung kantong termal pikeun ngajaga suhu awak 22. Pelat pencitraan teras dipasangkeun kana tahap tarjamahan sampel dina kotak pencitraan dina sudut anu sakedik pikeun ngajajarkeun trakea sacara horizontal dina gambar sinar-X, sapertos anu dipidangkeun dina Gambar 2a.
(a) Setelan pencitraan in vivo dina kotak pencitraan SPring-8, jalur sinar-X ditandaan ku garis putus-putus beureum. (b,c) Lokalisasi magnét dina trakea dilakukeun jarak jauh nganggo dua kaméra IP anu dipasang sacara ortogonal. Di sisi kénca gambar layar, loop kawat anu nahan sirah tiasa katingali, sareng kanula pangiriman aya dina tempatna dina tabung ET.
Sistem pompa syringe anu dikontrol jarak jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) nganggo syringe kaca 100 μl disambungkeun kana tabung PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) ngalangkungan jarum 30 Ga. Tandaan tabung pikeun mastikeun yén ujungna aya dina posisi anu leres dina trakea nalika nyelapkeun tabung ET. Nganggo pompa mikro, plunger syringe ditarik nalika ujung tabung dicelupkeun kana sampel MP anu bakal dikirimkeun. Tabung pangiriman anu dimuat teras diasupkeun kana tabung endotrakeal, nempatkeun ujungna dina bagian anu paling kuat tina médan magnét anu diarepkeun. Akuisisi gambar dikontrol nganggo detektor réspirasi anu disambungkeun kana kotak timing berbasis Arduino kami, sareng sadaya sinyal (contona suhu, réspirasi, muka/nutup rana sareng akuisisi gambar) dirékam nganggo Powerlab sareng LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Nalika pencitraan Nalika wadahna teu tiasa diaksés, dua kaméra IP (Panasonic BB-SC382) diposisikan sakitar 90° ka silih sareng dianggo pikeun ngawas posisi. tina magnét relatif ka trakea nalika pencitraan (Gambar 2b, c). Pikeun ngaminimalkeun artefak gerakan, hiji gambar dicandak per napas nalika dataran luhur aliran pasang surut.
Hiji magnét dipasangkeun kana tahap kadua anu tiasa ditempatkeun sacara jarak jauh ti luar wadah pencitraan. Rupa-rupa posisi sareng konfigurasi magnét diuji, kalebet: Dipasang dina sudut sakitar 30° di luhur trakea (konfigurasi anu dipidangkeun dina Gambar 2a sareng 3a); hiji magnét di luhur sato sareng anu sanésna di handap, kalayan kutub disetel pikeun narik (Gambar 3b); hiji magnét di luhur sato sareng anu sanésna di handap, kalayan kutub disetel pikeun nolak (Gambar 3c); sareng hiji magnét di luhur sareng tegak lurus kana trakea (Gambar 3d). Sakali sato sareng magnét dikonfigurasi sareng MP anu badé diuji dimuat kana pompa syringe, kirimkeun dosis 50 μl dina laju 4 μl/detik bari kéngingkeun gambar. Magnét teras dipindahkeun ka hareup sareng ka hareup sapanjang atanapi ka gigir di sakuliah trakea bari teras kéngingkeun gambar.
Konfigurasi magnét pikeun pencitraan in vivo (a) hiji magnét di luhur trakea dina sudut kira-kira 30°, (b) dua magnét anu disetel pikeun narik, (c) dua magnét anu disetel pikeun nolak, (d) hiji magnét di luhur sareng tegak lurus dina trakea. Panitén ningali ka handap ti sungut ka bayah ngaliwatan trakea, sareng sinar-X nembus sisi kénca beurit sareng kaluar ti sisi katuhu. Magnét éta boh dipindahkeun sapanjang jalan napas atanapi ka kénca sareng ka katuhu di luhur trakea dina arah sinar-X.
Kami ogé narékahan pikeun nangtukeun pisibilitas sareng paripolah partikel dina saluran pernapasan nalika teu aya gangguan pernapasan sareng gerakan jantung. Ku alatan éta, dina ahir période pencitraan, sato-sato dipaéhan sacara manusiawi kusabab overdosis pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, AS; ~65 mg/kg ip). Sababaraha sato ditinggalkeun dina platform pencitraan, sareng sakali pernapasan sareng denyut jantung eureun, prosés pencitraan diulang, nambihan dosis MP tambahan upami teu aya MP anu katingali dina permukaan saluran pernapasan.
Gambar anu diala dikoréksi widang datar sareng widang poék teras dirakit kana pilem (20 pigura per detik; 15-25 × kecepatan normal gumantung kana laju pernapasan) nganggo skrip khusus anu ditulis dina MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Sadaya studi pangiriman vektor gén LV dilaksanakeun di Fasilitas Panalungtikan Sato Laboratorium di Universitas Adelaide sareng bertujuan pikeun ngagunakeun hasil ékspérimén SPring-8 pikeun meunteun naha pangiriman LV-MP nalika aya médan magnét tiasa ningkatkeun transfer gén in vivo. Pikeun meunteun pangaruh MP sareng médan magnét, dua kelompok sato dirawat: hiji kelompok dipasihan LV-MP kalayan magnét anu dipasang, sareng kelompok anu sanésna nampi kelompok kontrol kalayan LV-MP tanpa magnét.
Vektor gén LV dihasilkeun nganggo metode 25, 26 anu parantos dijelaskeun sateuacanna. Vektor LacZ ngébréhkeun gén beta-galaktosidase anu dilokalisasi sacara nuklir anu didorong ku promotor MPSV konstitutif (LV-LacZ), anu ngahasilkeun produk réaksi biru dina sél anu ditransduksi, katingali dina bagian hareup jaringan paru-paru sareng bagian jaringan. Titrasi dilaksanakeun dina kultur sél ku cara ngitung sacara manual jumlah sél positip LacZ nganggo hemositometer pikeun ngitung titer dina TU/ml. Pembawa dikriopreservasi dina suhu -80 °C, dicairkeun sateuacan dianggo, sareng dihijikeun kana CombiMag ku cara dicampur dina babandingan 1:1 sareng diinkubasi dina és sahenteuna 30 menit sateuacan dikirimkeun.
Tikus Sprague Dawley normal (n = 3/grup, ~2-3 dibius sacara intraperitoneal nganggo campuran 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) sareng 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australia) (umur sabulan) injeksi ip) sareng kanulasi oral non-bedah nganggo kanula 16 Ga iv. Pikeun mastikeun yén jaringan saluran napas trakea nampi transduksi LV, éta dikondisikeun nganggo protokol perturbasi mékanis anu parantos dijelaskeun sateuacanna, dimana permukaan saluran napas trakea digosok sacara aksial nganggo karanjang kawat (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Administrasi trakea LV-MP teras dilakukeun dina kabinet kaamanan biologis sakitar 10 menit saatos perturbasi.
Médan magnét anu dianggo dina ékspérimén ieu dikonfigurasi ku cara anu sami sareng panilitian pencitraan sinar-X in vivo, kalayan magnét anu sami diayakeun di luhur trakea nganggo klip stent distilasi (Gambar 4). Volume 50 μl (2 × 25 μl aliquot) LV-MP dikirimkeun kana trakea (n = 3 sato) nganggo pipet anu ngandung ujung gél sapertos anu dijelaskeun sateuacanna. Grup kontrol (n = 3 sato) nampi LV-MP anu sami tanpa nganggo magnét. Saatos infus réngsé, kanula dicabut tina tabung ET sareng sato diékstubasi. Magnét tetep di tempatna salami 10 menit, teras dicabut. Tikus nampi dosis meloxicam subkutan (1 ml/kg) (Ilium, Australia) dituturkeun ku pambalikan anestesi ku suntikan ip 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia). Tikus dijaga haneut sareng diawasi dugi ka pulih pinuh tina anestesi.
Alat pangiriman LV-MP dina kabinet kaamanan biologis. Hub Luer kulawu ngora dina tabung ET katingali nonjol tina sungut sareng ujung gél pipet anu dipidangkeun dina gambar dilebetkeun ngaliwatan tabung ET dugi ka jerona anu dipikahoyong kana trakea.
Saminggu saatos prosedur dosis LV-MP, sato-sato sacara manusiawi dipaéhan ku cara inhalasi CO2 100% sareng éksprési LacZ dipeunteun nganggo perlakuan X-gal standar kami. Tilu cincin paling rawan kaudal dicabut pikeun mastikeun yén karusakan mékanis atanapi ingetan cairan tina panempatan tabung endotrakeal henteu kalebet dina analisis. Unggal trakea dipotong sacara longitudinal pikeun nyiptakeun dua bagian pikeun dianalisis, sareng dipasang dina piring anu ngandung karét silikon (Sylgard, Dow Inc) nganggo jarum Minutien (Fine Science Tools) pikeun ngabayangkeun permukaan luminal. Sebaran sareng pola sél anu ditransduksi dikonfirmasi ku fotografi frontal nganggo mikroskop Nikon (SMZ1500) nganggo kaméra DigiLite sareng parangkat lunak TCapture (Tucsen Photonics, Cina). Gambar diala dina pembesaran 20x (kalebet setélan pangluhurna pikeun lébar pinuh trakea), kalayan sakabéh panjang trakea dicitrakeun léngkah-léngkah, mastikeun tumpang tindih anu cekap antara unggal gambar pikeun ngamungkinkeun gambar "jahit". Gambar tina unggal trakea nyaéta Teras dirakit jadi hiji gambar komposit nganggo Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) nganggo algoritma gerakan planar. Area éksprési LacZ dina gambar komposit trakea ti unggal sato diukur nganggo skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) sapertos anu parantos dijelaskeun sateuacanna, nganggo setélan 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15, sareng Value < 0,7. Ku cara ngalacak kontur jaringan, topéng dihasilkeun sacara manual dina GIMP v2.10.24 pikeun unggal gambar komposit pikeun ngaidentipikasi area jaringan sareng nyegah deteksi palsu ti luar jaringan trakea. Area anu diwarnaan tina sadaya gambar komposit ti unggal sato dijumlahkeun pikeun ngahasilkeun total area anu diwarnaan pikeun sato éta. Area anu diwarnaan teras dibagi ku total area topéng pikeun ngahasilkeun area anu dinormalisasi.
Unggal trakea diasupkeun kana parafin sareng bagian 5 μm dipotong. Bagian-bagian éta diwarnaan deui ku warna beureum gancang nétral salami 5 menit sareng gambar dicandak nganggo mikroskop Nikon Eclipse E400, kaméra DS-Fi3 sareng parangkat lunak nangkep unsur NIS (versi 5.20.00).
Sadaya analisis statistik dilaksanakeun dina GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Signifikansi statistik ditetepkeun dina p ≤ 0,05. Normalitas diverifikasi nganggo uji Shapiro-Wilk, sareng bédana dina pewarnaan LacZ dipeunteun nganggo uji-t anu teu dipasangkeun.
Genep MP anu dijelaskeun dina Tabel 1 ditalungtik nganggo PCXI, sareng pisibilitasna dijelaskeun dina Tabel 2. Dua MP polistirena (MP1 sareng MP2; 18 μm sareng 0,25 μm, masing-masing) henteu katingali dina PCXI, tapi sésana sampel tiasa diidentipikasi (conto dipidangkeun dina Gambar 5). MP3 sareng MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm sareng 0,9 μm, masing-masing) samar-samar katingali. Sanaos ngandung sababaraha partikel pangleutikna anu diuji, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) mangrupikeun anu paling jelas. Produk CombiMag MP6 hésé ditingali. Dina sadaya kasus, kamampuan urang pikeun ngadeteksi MP ningkat sacara signifikan ku cara narjamahkeun magnet ka hareup sareng ka hareup sajajar sareng kapiler. Nalika magnet ngajauhan kapiler, partikel manjang dina senar anu panjang, tapi nalika magnet beuki caket sareng kakuatan medan magnét ningkat, senar partikel pondok nalika partikel hijrah ka arah permukaan luhur kapiler (tingali Pidéo Tambahan S1: MP4), ningkatkeun The kapadetan partikel permukaan. Sabalikna, nalika magnet dicabut tina kapiler, kakuatan medan nurun sareng MP nyusun ulang kana senar panjang anu manjang ti permukaan luhur kapiler (tingali Pidéo Tambahan S2: MP4). Saatos magnet eureun gerak, partikel teras gerak kanggo waktos anu singget saatos ngahontal posisi kasaimbangan. Nalika MP bergerak nuju sareng ngajauhan permukaan luhur kapiler, partikel magnét biasana nyered lebu ngaliwatan cairan.
Visibilitas MP dina PCXI bénten-bénten sacara signifikan antara sampel. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 sareng (d) MP6. Sadaya gambar anu dipidangkeun di dieu dicandak nganggo magnét anu aya sakitar 10 mm langsung di luhur kapiler. Bunderan ageung anu katingali nyaéta gelembung hawa anu kajebak dina kapiler, anu jelas nunjukkeun fitur ujung hideung bodas tina pencitraan kontras fase. Kotak beureum ngandung pembesaran anu ningkatkeun kontras. Catet yén diaméter skéma magnét dina sadaya gambar henteu diskalakeun sareng sakitar 100 kali langkung ageung tibatan anu dipidangkeun.
Nalika magnét ditranslasikeun ka kénca sareng ka katuhu sapanjang luhur kapiler, sudut senar MP robih pikeun saluyu sareng magnét (tingali Gambar 6), sahingga ngagambarkeun garis médan magnét. Pikeun MP3-5, saatos akord ngahontal sudut ambang, partikel-partikel éta diseret sapanjang permukaan luhur kapiler. Ieu sering nyababkeun MP ngagolong kana kelompok anu langkung ageung caket tempat médan magnét paling kuat (tingali Pidéo Tambahan S3:MP5). Ieu ogé khususna katingali nalika pencitraan caket tungtung kapiler, anu nyababkeun MP ngahiji sareng konsentrasi dina antarmuka cairan-hawa. Partikel dina MP6, anu langkung sesah dibédakeun tibatan MP3-5, henteu diseret nalika magnét ngalih sapanjang kapiler, tapi senar MP disosiasi, ninggalkeun partikel dina widang pandang (tingali Pidéo Tambahan S4:MP6). Dina sababaraha kasus, nalika médan magnét anu diterapkeun dikirangan ku cara mindahkeun magnét jarak anu jauh ti lokasi pencitraan, MP anu sésana laun-laun turun ka permukaan handap tabung ku gravitasi bari tetep aya dina senar (tingali Pidéo Tambahan S5:MP3).
Sudut senar MP robah nalika magnét ditarjamahkeun ka katuhu di luhur kapiler. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 sareng (d) MP6. Kotak beureum ngandung pembesaran anu ningkatkeun kontras. Catet yén pidéo tambahan informatif sabab ngungkabkeun struktur partikel anu penting sareng inpormasi dinamis anu teu tiasa divisualisasikeun dina gambar statis ieu.
Tés kami nunjukkeun yén mindahkeun magnét lalaunan ka hareup sareng ka tukang sapanjang trakea ngagampangkeun visualisasi MP dina kontéks gerakan kompléks in vivo. Tés in vivo henteu dilakukeun sabab manik-manik polistirena (MP1 sareng MP2) henteu katingali dina kapiler. Masing-masing tina opat MP sésana diuji in vivo kalayan sumbu panjang magnét anu dikonfigurasi di luhur trakea dina sudut sakitar 30° ka vertikal (tingali Gambar 2b sareng 3a), sabab ieu ngahasilkeun ranté MP anu langkung panjang sareng langkung efektif tibatan konfigurasi magnét anu dihentikeun. MP3, MP4 sareng MP6 henteu dideteksi dina trakea sato hirup. Nalika saluran pernapasan beurit dicitrakeun saatos sato ditelasan sacara manusiawi, partikel tetep teu katingali sanajan volume tambahan ditambahkeun nganggo pompa syringe. MP5 ngagaduhan eusi oksida beusi pangluhurna sareng mangrupikeun hiji-hijina partikel anu katingali, sareng ku kituna dianggo pikeun meunteun sareng ngacirikeun paripolah in vivo MP.
Nempatkeun magnét di luhur trakea nalika pangiriman MP nyababkeun seueur, tapi henteu sadayana, MP anu dikonsentrasikeun dina widang pandang. Partikel anu lebet kana trakea paling saé dititénan dina sato anu dikorbankeun sacara manusiawi. Gambar 7 sareng Pidéo Tambahan S6: MP5 nunjukkeun panangkepan magnét anu gancang sareng panyelarasan partikel dina permukaan trakea ventral, nunjukkeun yén MP tiasa diarahkeun ka daérah trakea anu dipikahoyong. Nalika milarian langkung distal sapanjang trakea saatos pangiriman MP, sababaraha MP kapanggih langkung caket kana carina, nunjukkeun yén kakuatan médan magnét henteu cekap pikeun ngumpulkeun sareng nahan sadaya MP, sabab dikirimkeun ngalangkungan daérah kakuatan médan magnét maksimum salami prosés cairan. Nanging, konsentrasi MP postpartum langkung luhur di sakitar daérah anu dicitrakeun, nunjukkeun yén seueur MP tetep aya di daérah saluran napas dimana kakuatan médan magnét anu diterapkeun pangluhurna.
Gambar ti (a) sateuacan sareng (b) saatos pangiriman MP5 kana trakea beurit anu nembé dieutanasia kalayan magnét diposisikan langsung di luhur daérah pencitraan. Daérah anu dicitrakeun ayana di antara dua cincin tulang rawan. Sateuacan pangiriman MP, aya sababaraha cairan dina saluran pernapasan. Kotak beureum ngandung pembesaran anu ningkatkeun kontras. Gambar-gambar ieu tina pidéo anu dipidangkeun dina Pidéo Tambahan S6:MP5.
Narjamahkeun magnét sapanjang trakea in vivo nyababkeun ranté MP ngarobih sudut dina permukaan saluran napas ku cara anu sami sareng anu katingali dina kapiler (tingali Gambar 8 sareng Pidéo Tambahan S7: MP5). Nanging, dina panilitian kami, MP henteu tiasa diseret sapanjang permukaan saluran napas hirup sapertos anu tiasa dilakukeun ku kapiler. Dina sababaraha kasus, ranté MP bakal langkung panjang nalika magnét ngalih ka kénca sareng ka katuhu. Anu pikaresepeun, kami ogé mendakan yén senar partikel sigana ngarobih jerona lapisan cairan permukaan nalika magnét dipindahkeun sacara longitudinal sapanjang trakea, sareng ngalegaan nalika magnét dipindahkeun langsung ka luhur sareng senar partikel diputer ka posisi nangtung (tingali Pidéo Tambahan S7). : MP5 jam 0:09, handap katuhu). Pola gerakan anu khas robih nalika magnét ditarjamahkeun ka luhur trakea sacara lateral (nyaéta, ka kénca atanapi ka katuhu sato tinimbang sapanjang trakea). Partikel-partikel éta masih katingali jelas nalika aranjeunna gerak, tapi nalika magnét dicabut tina trakea, tungtung senar partikel janten katingali (tingali Pidéo Tambahan S8:MP5, dimimitian ti 0:08). Ieu saluyu sareng paripolah MP anu kami niténan dina médan magnét anu diterapkeun dina kapiler kaca.
Conto gambar anu nunjukkeun MP5 dina trakea beurit hirup anu dibius. (a) Magnet dianggo pikeun kéngingkeun gambar di luhur sareng ka kénca trakea, teras (b) saatos magnet dipindahkeun ka katuhu. Kotak beureum ngandung pembesaran anu ningkatkeun kontras. Gambar-gambar ieu tina pidéo anu dipidangkeun dina Pidéo Tambahan S7:MP5.
Nalika dua kutub dikonfigurasi dina orientasi kalér-kidul di luhur sareng di handap trakea (contona narik; Gambar 3b), akord MP katingalina langkung panjang sareng ayana di sisi témbok trakea tinimbang dina permukaan trakea dorsal (tingali Pidéo Tambahan S9:MP5). Nanging, konsentrasi partikel anu luhur dina hiji lokasi (contona, permukaan dorsal trakea) henteu dideteksi saatos pangiriman cairan nalika alat dual-magnet dianggo, anu biasana kajantenan nalika alat single-magnet dianggo. Teras nalika hiji magnet dikonfigurasi pikeun ngusir kutub anu dibalikkeun (Gambar 3c), jumlah partikel anu katingali dina widang pandang henteu katingali ningkat saatos pangiriman. Setelan duanana konfigurasi dual-magnet nangtang kusabab kakuatan médan magnét anu luhur anu narik atanapi ngadorong magnét, masing-masing. Setelan teras dirobih janten magnet tunggal anu sajajar sareng saluran napas tapi ngalangkungan saluran napas dina 90 derajat supados garis médan meuntas témbok trakea sacara ortogonal (Gambar 3d), orientasi anu dirancang pikeun nangtukeun naha agregasi partikel dina témbok sisi tiasa dititénan. Nanging, dina Dina konfigurasi ieu, teu aya gerakan akumulasi MP atanapi gerakan magnét anu tiasa diidentipikasi. Dumasar kana sadaya hasil ieu, konfigurasi orientasi 30 derajat magnét tunggal (Gambar 3a) dipilih pikeun panilitian pamawa gén in vivo.
Nalika sato éta dicitrakeun sababaraha kali langsung saatos dibunuh sacara manusiawi, henteuna gerakan jaringan anu ngabingungkeun hartosna garis partikel anu langkung ipis sareng langkung pondok tiasa katingali dina widang interkondral anu jelas, "goyang" saluyu sareng gerakan translasi magnét. Sanaos kitu, tetep teu tiasa ningali kalayan jelas ayana sareng gerakan partikel MP6.
Titer LV-LacZ nyaéta 1,8 × 108 TU/ml, sareng saatos dicampur 1:1 sareng CombiMag MP (MP6), sasatoan nampi dosis trakea 50 μl 9 × 107 TU/ml kendaraan LV (nyaéta 4,5 × 106 TU/tikus). Dina panilitian ieu, tinimbang narjamahkeun magnet nalika ngalahirkeun, urang ngalereskeun magnet dina hiji posisi pikeun nangtukeun naha transduksi LV (a) tiasa ningkat dibandingkeun sareng pangiriman vektor tanpa ayana medan magnet, sareng (b) tiasa difokuskeun Sél saluran napas ditransduksi ka daérah target magnét dina saluran napas luhur.
Ayana magnét sareng panggunaan CombiMag digabungkeun sareng véktor LV sigana henteu gaduh pangaruh anu goréng kana kaséhatan sato, sapertos protokol pangiriman véktor LV standar kami. Gambar hareup daérah trakea anu kakeunaan gangguan mékanis (Gambar Tambahan 1) nunjukkeun yén aya tingkat transduksi anu langkung luhur sacara signifikan dina kelompok sato anu dirawat ku LV-MP nalika magnét aya (Gambar 9a). Ngan sakedik pewarnaan LacZ biru anu aya dina kelompok kontrol (Gambar 9b). Kuantifikasi daérah anu diwarnaan X-Gal anu dinormalisasi nunjukkeun yén administrasi LV-MP dina ayana médan magnét ngahasilkeun paningkatan sakitar 6 kali lipat (Gambar 9c).
Conto gambar komposit anu nunjukkeun transduksi trakea ku LV-MP (a) nalika aya medan magnét sareng (b) nalika teu aya magnét. (c) Peningkatan anu signifikan sacara statistik dina daérah transduksi LacZ anu dinormalisasi dina trakea nalika nganggo magnét (*p = 0,029, uji-t, n = 3 per grup, rata-rata ± SEM).
Bagian anu diwarnaan beureum gancang nétral (conto anu dipidangkeun dina Gambar Tambahan 2) nunjukkeun sél anu diwarnaan LacZ aya dina pola sareng lokasi anu sami sapertos anu dilaporkeun sateuacanna.
Tangtangan konci pikeun terapi gén saluran napas tetep lokalisasi partikel pamawa anu akurat ka daérah anu dipikaresep sareng ngahontal tingkat efisiensi transduksi anu luhur dina paru-paru anu bergerak kalayan ayana aliran hawa sareng pembersihan mukus aktif. Pikeun pamawa LV anu dirancang pikeun ngubaran panyakit saluran napas CF, ningkatkeun waktos tinggal partikel pamawa dina saluran napas anu ngalir parantos janten tujuan anu hésé dugi ka ayeuna. Sakumaha anu dituduhkeun ku Castellani et al., panggunaan médan magnét pikeun ningkatkeun transduksi ngagaduhan kaunggulan dibandingkeun sareng metode pangiriman gén sanés sapertos éléktroporasi, sabab tiasa ngagabungkeun kesederhanaan, efektivitas biaya, lokalisasi pangiriman, ningkat efisiensi, sareng waktos inkubasi anu langkung pondok, sareng kamungkinan dosis pamawa anu langkung alit10. Nanging, déposisi in vivo sareng paripolah partikel magnét dina saluran napas dina pangaruh gaya magnét éksternal henteu acan pernah dijelaskeun, atanapi sabenerna kalayakan metode ieu henteu acan dipidangkeun in vivo pikeun ningkatkeun tingkat éksprési gén dina saluran napas hirup anu utuh.
Ékspérimén PCXI sinkrotron in vitro kami nunjukkeun yén sadaya partikel anu kami uji, iwal ti polistirena MP, katingali dina setélan pencitraan anu kami anggo. Dina ayana médan magnét, MP ngabentuk senar anu panjangna aya hubunganana sareng jinis partikel sareng kakuatan médan magnét (contona jarak sareng gerakan magnét). Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 10, senar anu kami tingali kabentuk kusabab unggal partikel individu dimagnetisasi sareng nimbulkeun médan magnét lokalna nyalira. Médan anu misah ieu nyababkeun partikel anu sami ngahiji sareng nyambung, kalayan gerakan sapertos senar kelompok kusabab gaya lokal tina gaya lokal anu narik sareng tolak partikel sanés.
Skéma anu nunjukkeun (a,b) runtuyan partikel anu dihasilkeun di jero kapiler anu dieusi cairan sareng (c,d) trakea anu dieusi hawa. Catet yén kapiler sareng trakea henteu digambar dumasar skala. Panel (a) ogé ngandung pedaran MP, anu ngandung partikel Fe3O4 anu disusun dina senar.
Nalika magnét dipindahkeun di luhur kapiler, sudut senar partikel ngahontal ambang kritis pikeun MP3-5 anu ngandung Fe3O4, saatos éta senar partikel henteu deui cicing dina posisi aslina, tapi ngalih sapanjang permukaan ka posisi anyar. magnét. Éfék ieu kamungkinan bakal kajadian sabab permukaan kapiler kaca cukup lemes pikeun ngamungkinkeun gerakan ieu kajadian. Anu pikaresepeun, MP6 (CombiMag) henteu kalakuanana sapertos kieu, kamungkinan kusabab partikelna langkung alit, gaduh lapisan atanapi muatan permukaan anu béda, atanapi cairan pamawa anu dipatenkeun mangaruhan kamampuanana pikeun gerak. Kontras gambar partikel CombiMag ogé langkung lemah, nunjukkeun yén cairan sareng partikel tiasa gaduh kapadetan anu sami sareng ku kituna henteu gampang ngalih ka arah silih. Partikel ogé tiasa macét upami magnét gerak gancang teuing, nunjukkeun yén kakuatan médan magnét henteu salawasna tiasa ngatasi gesekan antara partikel dina cairan, nunjukkeun yén panginten henteu anéh yén kakuatan médan magnét sareng jarak antara magnét sareng daérah target Penting pisan. Dihijikeun, hasil ieu ogé nunjukkeun yén, sanaos magnét tiasa néwak seueur MP anu ngalir ngaliwatan daérah target, sigana magnét henteu tiasa diandelkeun. pikeun mindahkeun partikel CombiMag sapanjang permukaan trakea. Ku kituna, urang nyimpulkeun yén studi LV-MP in vivo kedah ngamangpaatkeun médan magnét statis pikeun sacara fisik narékahan daérah khusus tina tangkal saluran napas.
Nalika partikel dikirimkeun kana awak, éta hésé diidentipikasi dina kontéks jaringan awak anu obah sacara kompléks, tapi kamampuan pikeun ngadeteksi éta ditingkatkeun ku cara narjamahkeun magnét sacara horizontal di luhur trakea pikeun "ngagoyangkeun" senar MP. Sanaos pencitraan langsung dimungkinkeun, langkung gampang pikeun ngabédakeun gerakan partikel saatos sato parantos ditelasan sacara manusiawi. Konsentrasi MP umumna pangluhurna di lokasi ieu nalika magnét diposisikan di luhur daérah pencitraan, sanaos sababaraha partikel biasana kapendak langkung jauh di sapanjang trakea. Sabalikna tina panilitian in vitro, partikel henteu tiasa diseret sapanjang trakea ku cara narjamahkeun magnét. Panemuan ieu saluyu sareng kumaha lendir anu ngalapis permukaan trakea biasana ngolah partikel anu dihirup, ngajebakna dina lendir sareng salajengna dibersihkeun ku mékanisme beberesih mukosiliar.
Kami ngahipotesiskeun yén panggunaan magnet pikeun narik di luhur sareng di handap trakea (Gambar 3b) tiasa nyababkeun medan magnet anu langkung seragam, tinimbang medan magnet anu terkonsentrasi pisan dina hiji titik, anu berpotensi ngarah kana distribusi partikel anu langkung seragam. Nanging, panilitian awal kami henteu mendakan bukti anu jelas pikeun ngadukung hipotesis ieu. Kitu ogé, ngonpigurasikeun sapasang magnet pikeun nolak (Gambar 3c) henteu nyababkeun langkung seueur déposisi partikel di daérah anu dicitrakeun. Dua panemuan ieu nunjukkeun yén setelan dual-magnet henteu ningkatkeun kontrol lokal tina targeting MP sacara signifikan, sareng yén gaya magnét anu kuat anu dihasilkeun hésé dikonfigurasi, ngajantenkeun pendekatan ieu kirang praktis. Nya kitu, orientasi magnet di luhur sareng ngalangkungan trakea (Gambar 3d) ogé henteu ningkatkeun jumlah partikel anu ditahan di daérah anu dicitrakeun. Sababaraha konfigurasi alternatif ieu panginten henteu suksés sabab nyababkeun kakuatan medan magnet anu langkung handap dina daérah déposisi. Ku alatan éta, konfigurasi magnet sudut 30 derajat tunggal (Gambar 3a) dianggap metode anu paling gampang sareng paling efisien pikeun uji in vivo.
Panilitian LV-MP nunjukkeun yén nalika véktor LV digabungkeun sareng CombiMag sareng dikirimkeun saatos gangguan fisik dina ayana médan magnét, tingkat transduksi ningkat sacara signifikan dina trakea dibandingkeun sareng kontrol. Dumasar kana panilitian pencitraan sinkrotron sareng hasil LacZ, médan magnét sigana tiasa ngajaga LV dina trakea sareng ngirangan jumlah partikel véktor anu langsung nembus jero kana paru-paru. Peningkatan targeting sapertos kitu tiasa nyababkeun épéktipitas anu langkung luhur bari ngirangan titer anu dikirimkeun, transduksi di luar target, efek samping radang sareng imun, sareng biaya pamawa gén. Anu penting, numutkeun produsén, CombiMag tiasa dianggo sasarengan sareng metode transfer gén anu sanés, kalebet sareng véktor virus anu sanés (sapertos AAV) sareng asam nukléat.