Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Vérsi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan terbatas pikeun CSS. Kanggo pangalaman pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi mareuman modeu kasaluyuan dina Internet Explorer).
Véktor gén pikeun pengobatan panyakit paru cystic fibrosis kedah nargétkeun saluran hawa anu ngalaksanakeun sabab transduksi paru periferal henteu masihan kauntungan terapeutik.Efisiensi transduksi virus langsung aya hubunganana sareng waktos tinggal vektor.Najan kitu, cairan pangiriman sapertos pembawa gen sacara alami kasebar kana alveoli nalika inspirasi, sareng partikel terapeutik tina bentuk naon waé anu gancang dibersihkeun ku mucociliary time transporter. penting tapi hésé pikeun ngahontal.Gene carrier-conjugated partikel magnét anu bisa diarahkeun kana beungeut saluran rél bisa ngaronjatkeun targeting régional.Kusabab tantangan visualisasi in vivo, paripolah partikel magnét leutik misalna dina beungeut airway ku ayana hiji médan magnét dilarapkeun kirang dipikaharti. Beurit anu dibius pikeun nguji dinamika sareng pola paripolah partikel individu sareng bulk dina vivo.Kami teras ogé ditaksir naha pangiriman partikel magnét lentiviral dina ayana médan magnét bakal ningkatkeun efisiensi transduksi dina trakea beurit. magnét, tapi salila angkutan, deposit anu ngumpul dina widang view mana médan magnét kuat. Efisiensi Transduksi ogé ngaronjat sixfold nalika partikel magnét lentiviral anu dikirimkeun ku ayana hiji field.Together magnét, hasil ieu nunjukkeun yén partikel magnét lentiviral jeung médan magnét bisa jadi pendekatan berharga pikeun ngaronjatkeun véktor gén targeting sarta ngaronjatkeun tingkat transduksi dina ngalakonan airways di vivo.
Fibrosis kistik (CF) disababkeun ku variasi dina gén tunggal anu disebut CF transmembrane conductance regulator (CFTR). Protéin CFTR mangrupikeun saluran ion anu aya dina seueur sél épitél sapanjang awak, kalebet saluran rél, tempat utama CF pathogenesis. impairs kamampuh sistem mucociliary transport (MCT) mupus partikel kaseuseup jeung patogén ti airways.Tujuan kami pikeun ngamekarkeun terapi gén lentiviral (LV) pikeun nganteurkeun salinan bener tina gén CFTR sarta ngaronjatkeun ASL, MCT, sarta kaséhatan paru-paru, sarta neruskeun ngamekarkeun téknologi anyar sanggup ngukur parameter ieu dina vivo1.
Vektor LV mangrupakeun salah sahiji calon ngarah pikeun terapi gén saluran napas CF, utamana sabab bisa ngahijikeun permanén gén terapi kana sél basal airway (stém stém airway).Hal ieu penting sabab bisa mulangkeun hidrasi normal jeung clearance mukus ku diferensiasi kana fungsi gén-dilereskeun CF-pakait sél permukaan airway, hasilna CF-pakait kana sél permukaan airway, hasilna panyakit ieu kudu hirup langsung kauntungan. Pangiriman véktor langkung jero kana paru-paru tiasa nyababkeun transduksi alveolar, tapi ieu henteu ngagaduhan kauntungan terapi dina CF. Tapi, cairan sapertos pembawa gen sacara alami migrasi ka alveoli nalika inspirasi saatos pangiriman3,4 sareng partikel terapeutik gancang dibersihkeun kana rongga lisan ku transduksi MCT.LV - efisiensi sélular langsung aya hubunganana sareng véktor pikeun nargétkeun waktos salajengna sareng efisiensi sélular. waktos "5 - nu gampang diréduksi ku aliran hawa régional has ogé ngagabung partikel mukus newak na MCT.For CF, kamampuhan pikeun manjangkeun waktu tinggal LV dina airway penting pikeun ngahontal tingkat luhur transduction di wewengkon ieu, tapi geus jadi jauh geus nangtang.
Pikeun nungkulan halangan ieu, kami nyarankeun yén partikel magnét LV (MPs) bisa mantuan dina dua ways.First lawanna, aranjeunna bisa magnetically dipandu ka beungeut airway pikeun ngaronjatkeun targeting tur mantuan partikel carrier gén reside di wewengkon airway nu dipikahoyong; sarta ASL) pikeun pindah ka lapisan sél 6.MPs geus loba dipaké salaku kandaraan pangiriman ubar sasaran nalika aranjeunna meungkeut antibodi, ubar chemotherapeutic, atawa molekul leutik lianna nu ngagantelkeun kana mémbran sél atawa ngabeungkeut reséptor permukaan sél relevan sarta ngumpulkeun dina situs tumor ku ayana listrik statik. Médan Magnét pikeun Pengobatan Kanker 7. Téhnik "hipertermal" séjén tujuanana pikeun memanaskeun anggota parlemén nalika aranjeunna kakeunaan médan magnét anu berosilasi, ku kituna ngancurkeun sél tumor. Prinsip transfeksi magnét, dimana médan magnét dianggo salaku agén transfeksi pikeun ningkatkeun transfer DNA kana sél, umumna dianggo dina vitro nganggo sauntuyan jalur non-viral sareng viral gén-transduksi épéktip pikeun sél LV. magnetotransfection geus diadegkeun, kalawan pangiriman in vitro of LV-MPs ka garis sél épitél bronchial manusa ku ayana médan magnét statik, ngaronjatkeun efisiensi transduksi ku 186-melu dibandingkeun LV vector alone.LV-MP ogé geus dilarapkeun ka model CF in vitro, dimana transfection magnét ngaronjat transduksi LV dina hawa-cairan-folding budaya ku ayana sptum10. vivo magnetotransfection organ geus narima rélatif saeutik perhatian sarta geus ngan geus dievaluasi dina sababaraha studi sato11,12,13,14,15, utamana dina lungs16,17. Sanajan kitu, kasempetan pikeun transfection magnét dina terapi paru CF jelas. Tan et al. strategi inhalation CFTR pikeun ngaronjatkeun hasil klinis di penderita CF "6.
Paripolah partikel magnét leutik dina surfaces airway ku ayana hiji médan magnét dilarapkeun hese visualize jeung ulikan, sahingga kirang dipikaharti.Dina studi séjén, urang ngembangkeun hiji fase-kontras dumasar-synchrotron-propagasi X-ray Imaging (PB-PCXI) metoda non-invasively visualize jeung ngitung menit dina parobahan vivo di vivo langsung dina ASL depthration19, sarta MCT 2. sarta dipaké salaku hiji indikator awal efficacy perlakuan. Sajaba ti éta, métode evaluasi MCT kami ngagunakeun 10-35 µm partikel diaméterna diwangun ku alumina atawa kaca indéks réfraktif tinggi salaku spidol MCT ditingali maké PB-PCXI21.Both téhnik anu cocog pikeun visualisasi tina sauntuyan jenis partikel, kaasup MP.
Kusabab résolusi spasial sareng temporal anu luhur, téknik analisis ASL sareng MCT basis PB-PCXI kami cocog pisan pikeun nguji dinamika sareng pola paripolah partikel tunggal sareng bulk dina vivo pikeun ngabantosan urang ngartos sareng ngaoptimalkeun téknik pangiriman gén MP. Airways pulmonal beurit pikeun mantuan ngajelaskeun pola ekspresi gén Non-seragam urang observasi dina studi sato dosis carrier gén urang 3,4.
Tujuan tina ulikan ieu ngagunakeun synchrotron PB-PCXI pikeun visualize gerakan in vivo runtuyan MPs dina trakea beurit hirup. Studi pencitraan PB-PCXI ieu dirancang pikeun nguji sauntuyan MPs, kakuatan médan magnét, jeung lokasi pikeun nangtukeun pangaruh maranéhanana dina gerak MP. kami pikeun ngaidentipikasi konfigurasi magnet nu maksimalkeun pungsi jumlah partikel dipikagaduh dina trachea sanggeus déposisi.Dina séri kadua studi, urang ditéang ngagunakeun konfigurasi optimal ieu pikeun demonstrate pola transduksi hasilna tina pangiriman in vivo of LV-MPs kana airway beurit, dumasar kana asumsi yén pangiriman LV-MPs dina konteks targeting airway bakal ngakibatkeun efisiensi transduksi LV.
Sadaya studi sato anu dipigawé nurutkeun protokol disatujuan ku Universitas Adelaide (M-2019-060 jeung M-2020-022) jeung SPring-8 Synchrotron Komite Etika Sato. Ékspérimén dipigawé nurutkeun tungtunan ARRIVE.
Sadaya pencitraan sinar-X dilakukeun dina beamline BL20XU di synchrotron SPring-8 di Jepang, ngagunakeun setelan anu sami sareng anu dijelaskeun sateuacana21,22. Sakeudeung, kotak ékspérimén lokasina 245 m ti cingcin panyimpen synchrotron. Jarak sampel-to-detektor 0,6 m dipaké pikeun studi fase kontras pikeun vivo imaging m pikeun studi fase vivo 0.3 m. Éfék. Énergi sinar monochromatic 25 keV dipaké. Gambar ditéwak maké konverter sinar-X resolusi luhur (SPring-8 BM3) gandeng jeung detektor sCMOS. Konverter ngarobah sinar-X kana cahaya katempo maké scintillator kandel 10 µm (Gd3Al2Ga3O12 langsung maké skop obyektif × MOSC) (NA 0.3).Detektor sCMOS nyaéta Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) kalayan ukuran Asép Sunandar Sunarya 2048 × 2048 piksel sareng ukuran piksel atah 6,5 × 6,5 µm. Setelan ieu ngahasilkeun ukuran piksel isotropik anu efektif 0.51 µm × 1 paparan panjangna kira-kira 1 mm × 1. 100 ms dipilih pikeun maksimalkeun rasio sinyal-ka-noise partikel magnét di jero sareng di luar saluran napas bari ngaminimalkeun artifak gerak anu disababkeun ku engapan. Pikeun studi vivo, jepret sinar-X gancang ditempatkeun dina jalur sinar-X pikeun ngawatesan dosis radiasi ku cara ngahalangan sinar-X antara paparan.
Pamawa LV henteu dianggo dina studi pencitraan SPring-8 PB-PCXI sabab kamar pencitraan BL20XU henteu disertipikasi Biosafety Level 2. Gantina, urang milih sauntuyan MPs anu dicirian saé tina dua supplier komérsial-ngawengku sauntuyan ukuran, bahan, konsentrasi beusi, sareng aplikasina-mimiti ngartos kumaha gerak MP sareng médan magnét dina kaca. dina surface.MPs rupa-rupa ukuranana ti 0,25 nepi ka 18 μm sarta dijieun tina rupa-rupa bahan (tingali Table 1), tapi komposisi unggal sampel, kaasup ukuran partikel magnét dina MP, kanyahoan. subtracting pigura padeukeut pikeun nempo ningkat pisibilitas MP motion.A single 0,25 μm-ukuran MP leuwih leutik batan resolusi alat Imaging, tapi PB-PCXI diperkirakeun ngadeteksi kontras volume maranéhanana jeung gerak cairan permukaan nu maranéhanana disimpen sanggeus déposisi.
Sampel pikeun tiap MP di Table 1 disiapkeun dina 20 μl kapilér kaca (Drummond Microcaps, Pa, AS) kalayan diaméter jero 0,63 mm.Partikel corpuscular sadia dina cai, bari partikel CombiMag sadia dina proprietary fluid.Each tube produsén urang satengah ngeusi cairan (kira-kira 11 μl wadahna). ditempatkeun horisontal dina tahap sampel dina kotak Imaging, masing-masing, sarta diposisikan edges of fluid.A 19 mm diaméterna (28 mm panjang) cangkang nikel langka bumi neodymium beusi boron (NdFeB) magnet (N35, ucing. No. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) kalawan magnetization residual tina 1.17 tarjamahan jarak jauh napel na Tesla posisi napel jauh Tesla 1.17. akuisisi gambar imaging.X-ray dimimitian nalika magnet diposisikan kurang leuwih 30 mm luhureun sampel, sarta gambar anu kaala dina laju 4 pigura per second.During Imaging, magnet nu dibawa deukeut ka tube capillary kaca (kira-kira 1 mm jauh) lajeng ditarjamahkeun sapanjang tube ka assess efek kakuatan widang jeung posisi.
Setélan pencitraan in vitro ngandung sampel MP dina kapilér kaca dina tahap panarjamahan sampel xy. Jalur sinar-X ditandaan ku garis putus-putus beureum.
Sakali visibilitas in vitro MPs diadegkeun, sawaréh di antarana diuji in vivo dina beurit Wistar albino bikang liar (~ 12 minggu heubeul, ~ 200 g). Seika) Beurit dibius sareng campuran Pharma), Jepang) ku suntikan intraperitoneal.Saatos anesthesia, aranjeunna disiapkeun pikeun pencitraan ku ngaleungitkeun bulu sakitar trakea, nyelapkeun tabung endotracheal (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) sareng immobilizing aranjeunna supine dina piring pencitraan suhu2 anu didamel khusus pikeun ngajaga pelat imaging termal. napel tahap tarjamah sampel dina kotak imaging dina sudut slight mun align trachea horizontal dina gambar X-ray, ditémbongkeun saperti dina Gambar 2a.
(a) In vivo Imaging setup in the SPring-8 imaging box, path of the X-ray beam is marked with a red dashed line.(b,c) Magnet localization on the trachea was conducted remotely using two orthogonally mounted IP cameras.On the left side of the screen picture, the wire loop hold the head can be seen, and the delivering the cannula in the place.
Hiji sistem pompa jarum suntik jarak jauh-dikawasa (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) ngagunakeun 100 μl kaca jarum suntik ieu disambungkeun ka PE10 tubing (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) via jarum 30 Ga.Mark tabung pikeun mastikeun yén tip aya dina posisi nu bener dina trachea nu plunger, nalika inserting nu syringe tube. ditarik bari ujung tabung ieu immersed dina sampel MP bisa delivered.The tube pangiriman dimuat ieu lajeng diselapkeun kana tube endotracheal, nempatkeun tip dina bagian neneng tina ekspektasi kami dilarapkeun magnet field.Image akuisisi ieu dikawasa ngagunakeun detektor réspirasi disambungkeun ka kotak timing dumasar Arduino kami, sarta sakabeh sinyal (misalna hawa, réspirasi, réspirasi, labél bukaan a). (Instrumén AD, Sydney, Australia) 22. Nalika imaging Nalika dipager éta inaccessible, dua kaméra IP (Panasonic BB-SC382) anu diposisikan dina kira 90 ° ka silih tur dipaké pikeun ngawas posisi magnet relatif ka trachea salila Imaging (Gbr. 2b, c) .Pikeun ngaleutikan gerak gambar tina artefak plat-au tidal ieu acquired unggal tungtung engapan.
Magnet dipasang dina tahap kadua anu tiasa lokasina jarak jauh ti luar perumahan pencitraan. Rupa-rupa posisi magnet sareng konfigurasi diuji, kalebet: Dipasang dina sudut kira-kira 30 ° di luhur trachea (konfigurasi anu dipidangkeun dina Gambar 2a sareng 3a); hiji magnet luhureun sato jeung lianna di handap, kalawan kutub diatur pikeun narik (Gambar 3b); hiji magnet luhureun sato jeung lianna di handap, jeung kutub disetel ka ngusir (Gambar 3c); sarta hiji magnet di luhur sarta jejeg trachea nu (Gambar 3d). Sakali sato jeung magnét anu ngonpigurasi sarta MP pikeun diuji dimuat kana pompa jarum suntik, nganteurkeun dosis 50 μl dina laju 4 μl / detik bari acquiring images.The magnet lajeng dipindahkeun deui mudik sapanjang atawa laterally sakuliah trakea bari nuluykeun gambar.
Konfigurasi magnét pikeun in vivo Imaging (a) magnet tunggal luhureun trachea dina sudut kira-kira 30 °, (b) dua magnet diatur pikeun narik, (c) dua magnet disetel ka ngusir, (d) magnet tunggal luhur sarta jejeg dina trachea. The panitén nempo handap ti sungut ka bayah ngaliwatan trachea, sarta sisi katuhu X-ray ngaliwatan beam sisi X-ray. magnet ieu boh dipindahkeun sapanjang panjang jalan napas atawa kénca jeung katuhu luhureun trakea arah sinar X-ray.
Urang ogé narékahan pikeun nangtukeun pisibilitas jeung paripolah partikel dina rél dina henteuna engapan confounding jeung motion cardiac.Ku kituna, dina ahir periode Imaging, sato anu humanely ditelasan pikeun overdose pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Pameuntasan, AS; ~ 65 mg / kg ip ip). Prosésna diulang deui, nambahan dosis MP tambahan upami henteu aya MP anu katingali dina permukaan jalan napas.
Gambar anu dicandak éta datar-sawah sareng poék-sawah dilereskeun teras dirakit janten pilem (20 pigura per detik; 15-25 × laju normal gumantung kana laju engapan) nganggo naskah khusus anu ditulis dina MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Sadaya studi pangiriman vektor gén LV dilaksanakeun di Fasilitas Panalungtikan Sato Laboratorium di Universitas Adelaide jeung aimed ngagunakeun hasil percobaan SPring-8 ka assess naha pangiriman LV-MP dina ayana médan magnét bisa ningkatkeun mindahkeun gén dina vivo.
Véktor gén LV dihasilkeun ngagunakeun métode anu dijelaskeun saméméhna 25, 26 .Véktor LacZ nganyatakeun gén béta-galaktosidase anu dilokalkeun nuklir anu didorong ku promotor MPSV konstitutif (LV-LacZ), anu ngahasilkeun produk réaksi biru dina sél transduksi, katingali dina jaringan paru-paru sareng bagian jaringan. titer dina TU / ml. Carriers anu cryopreserved di -80 °C, thawed saméméh pamakéan, sarta kabeungkeut CombiMag ku Pergaulan dina nisbah 1: 1 sarta incubating on és salila sahenteuna 30 menit saméméh pangiriman.
Beurit Sprague Dawley normal (n = 3 / grup, ~ 2-3 dibius sacara intraperitoneal sareng campuran 0.4 mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) sareng 60 mg / kg ketamine (Ilium, Australia) bulan) ip) suntik sareng kanulasi lisan non-bedah sareng 16 Ga iv pikeun mastikeun yén transduksi 16 Ga iv tiasa ngajamin yén transnulasi oral non-bedah. eta ieu conditioned ngagunakeun protokol perturbation mékanis kami dijelaskeun saméméhna, nu beungeut airway tracheal ieu digosok axially ku karinjang kawat (N-Circle, Nitinol Tipless Batu Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Médis, AS) 30 s28.Tracheal administrasi LV-MP ieu lajeng dipigawé dina menit kaamanan perturbological 10 menit sanggeus kurang leuwih menit perturbation.
Médan magnét dipaké dina percobaan ieu ngonpigurasi dina ragam nu sarupa jeung in vivo X-ray ulikan Imaging, jeung magnet sarua dilaksanakeun di luhur trachea maké klip stent distilasi (Gambar 4) .A 50 μl volume (2 × 25 μl aliquots) LV-MP ieu dikirimkeun kana trachea (n = 3 sato kontrol saméméhna dijelaskeun) a. 3 sato) nampi LV-MP anu sami tanpa ngagunakeun magnet. Saatos infus parantos réngsé, kanula dikaluarkeun tina tabung ET sareng sato diekstubasi. Magnet tetep di tempatna salami 10 menit, teras dipiceun. (Antisedan, Zoetis, Australia).Beurit dijaga haneut sareng diawaskeun dugi ka pulih tina anesthesia.
Alat pangiriman LV-MP dina kabinét kaamanan biologis.Hub Luer abu-abu lampu tina tabung ET tiasa katingali protruding tina sungut sareng ujung gél pipette anu dipidangkeun dina gambar diselapkeun ngaliwatan tabung ET ka jero anu dipikahoyong kana trakea.
Hiji minggu sanggeus prosedur dosing LV-MP, sato anu humanely ditelasan ku 100% CO2 inhalation sarta éksprési LacZ ieu ditaksir ngagunakeun treatment X-gal baku kami. Tilu cingcin paling cartilaginous caudal anu dipiceun pikeun mastikeun yén sagala karuksakan mékanis atawa ingetan cairan tina panempatan tube endotracheal teu kaasup kana analisis.Each trachea ieu motong longitudinal pikeun analisa, sarta dua silikon anu dicutat longitudinal pikeun analisis. (Sylgard, Dow Inc) ngagunakeun jarum Minutien (Fine Science Tools) pikeun ngabayangkeun permukaan luminal. Distribusi sareng pola sél anu ditransduksi dikonfirmasi ku fotografi frontal nganggo mikroskop Nikon (SMZ1500) kalayan kaméra DigiLite sareng parangkat lunak TCapture (Tucsen Photonics, China) . panjang trakea imaged hambalan-demi-hambalan, mastikeun tumpang tindihna cukup antara tiap gambar pikeun ngidinan pikeun "stitching" gambar. Gambar ti unggal trachea lajeng dirakit kana hiji gambar komposit tunggal ngagunakeun Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ngamangpaatkeun hiji algoritma gerak planar. Daérah éksprési LacZ dina gambar komposit tina hiji skrip MAT sato anu ditracheakeun otomatis tina unggal skrip MAT sato. (R2020a, MathWorks) sakumaha ditétélakeun saméméhna, ngagunakeun setélan 0.35 0.15, sarta Nilai <0.7.By tracing kontur jaringan, masker dihasilkeun sacara manual dina GIMP v2.10.24 pikeun tiap gambar komposit dina urutan pikeun ngaidentipikasi wewengkon jaringan palsu tina sagala deteksi di luar sarta wewengkon jaringan. gambar komposit ti unggal sato anu dijumlahkeun pikeun ngahasilkeun total aréa patri pikeun sato éta. Wewengkon patri ieu lajeng dibagi ku total aréa topeng pikeun ngahasilkeun wewengkon dinormalisasi.
Unggal trachea ieu study di parafin jeung 5 μm bagian anu cut.Sections anu counterstained kalawan nétral gancang beureum pikeun 5 mnt jeung gambar anu kaala maké mikroskop Nikon Eclipse E400, kaméra DS-Fi3 jeung software newak unsur NIS (versi 5.20.00).
Kabéh analisa statistik anu dipigawé dina GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Signifikansi statistik disetel dina p ≤ 0.05. Normalitas ieu diverifikasi ngagunakeun test Shapiro-Wilk, sarta béda dina staining LacZ anu ditaksir ngagunakeun unpaired t-test.
Genep MPs dijelaskeun dina Table 1 ieu nalungtik maké PCXI, sarta pisibilitas dijelaskeun dina Table 2. Dua polystyrene MPs (MP1 jeung MP2; 18 μm jeung 0.25 μm, masing-masing) teu katempo dina PCXI, tapi sesa sampel anu diidentipikasi (conto ditémbongkeun dina 1MP3-O MP5 45). 0,25 μm sareng 0,9 μm, masing-masing) katingali samar. Sanajan ngandung sababaraha partikel pangleutikna anu diuji, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) mangrupikeun anu paling diucapkeun. Produk CombiMag MP6 sesah ditingali. magnét dipindahkeun jauh ti kapilér, partikel ngalegaan dina string panjang, tapi salaku magnet meunang ngadeukeutan sarta kakuatan médan magnét ngaronjat, string partikel disingget salaku partikel hijrah ka arah beungeut luhur kapilér (tingali Suplemén Video S1: MP4), ngaronjatna The dénsitas partikel surfaces.Conversely, nalika magnet dicabut tina kapilér jeung rerange permukaan kakuatan MP4 nurun tina permukaan kawat panjang. kapilér (tingali Suplemén Video S2: MP4) .Saatos magnét eureun gerak, partikel terus gerak pikeun waktu anu singget sanggeus ngahontal posisi kasatimbangan.Salaku MP ngalir ka arah jeung jauh ti beungeut luhur kapilér, partikel magnét ilaharna nyered lebu ngaliwatan cairan.
The pisibilitas tina MP handapeun PCXI beda-beda nyata antara sampel.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 jeung (d) MP6.All gambar ditémbongkeun di dieu dicandak ku magnet lokasina kurang leuwih 10 mm langsung luhureun capillary.The bunderan badag katempo téh gelembung hawa trapped dina kapilér, jelas némbongkeun fitur ujung hideung bodas tina kontras-beureum imaging fase kontras kontras. magnification.Catetan yén diaméter schematics magnet dina sakabéh inohong teu skala na kira 100 kali leuwih badag batan ditémbongkeun.
Nalika magnét ditarjamahkeun ka kénca sareng ka katuhu sapanjang luhureun kapilér, sudut senar MP robih sajajar sareng magnet (tingali Gambar 6), ku kituna ngagambar garis médan magnét. Pikeun MP3-5, saatos chord ngahontal sudut bangbarung, partikel-partikel diseret sapanjang permukaan luhur kapilér. S3:MP5).Ieu ogé utamana dibuktikeun nalika Imaging deukeut tungtung kapilér, nu ngabalukarkeun MPs agrégat jeung konsentrasi dina interface cairan-hawa.Partikel dina MP6, nu éta leuwih hese discern ti MP3-5, teu nyeret salaku magnét dipindahkeun sapanjang kapilér, tapi MP string dissociated dina sawah MP4 dissociated, ninggalkeun sawah tina Video MP4. kasus, lamun médan magnét dilarapkeun diréduksi ku cara ngagerakkeun magnet dina jarak badag ti lokasi Imaging, sagala MPs sésana lalaunan turun ka beungeut handap tabung ku gravitasi bari tetep dina senar (tingali Suplemén Video S5: MP3).
Sudut senar MP robah jadi magnét ditarjamahkeun ka katuhu luhureun kapilér.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 jeung (d) MP6.Kotak beureum ngandung pembesaran kontras-enhancing. Catet yén video suplemén informatif sabab nembongkeun struktur partikel penting jeung informasi dinamis nu teu bisa visualized dina gambar statik ieu.
Tés kami némbongkeun yén mindahkeun magnet lalaunan deui mudik sapanjang trachea facilitates visualisasi MP dina konteks gerakan kompléks di vivo.In vivo nguji teu dipigawé salaku manik polystyrene (MP1 na MP2) teu katempo dina capillary nu.Each tina opat MP sésana anu diuji dina vivo jeung magnet sumbu panjang ngonpigurasi di luhur trachea 3 ° jeung sudut 3. 3a), sabab ieu nyababkeun ranté MP leuwih panjang sarta leuwih éféktif batan konfigurasi magnét terminated.MP3, MP4 jeung MP6 teu kauninga dina trakea sagala sato hirup. Nalika saluran rél beurit anu imaged sanggeus sato dibunuh sacara manusa, partikel tetep siluman sanajan volume tambahan ditambahkeun maké pompa jarum suntik. vivo kabiasaan MP.
Nempatkeun magnet leuwih trachea salila pangiriman MP nyababkeun loba, tapi teu kabeh, MPs keur ngumpul dina widang view.Partikel asup trachea nu pangalusna dititénan dina sato humanely kurban.Gambar 7 jeung Suplemén Video S6: MP5 nembongkeun newak magnét gancang sarta alignment partikel dina beungeut trachea véntral kahayang bisa nunjukkeun yén trachea W. néangan leuwih distally sapanjang trachea sanggeus pangiriman MP, sababaraha MPs kapanggih ngadeukeutan ka carina, suggesting yén kakuatan médan magnét teu cukup pikeun ngumpulkeun jeung nahan sakabéh MPs, sabab dikirimkeun ngaliwatan wewengkon kakuatan médan magnét maksimum salila prosés cairan. Sanajan kitu, konsentrasi MP postpartum leuwih luhur di sabudeureun wewengkon imaged, suggesting yén loba MPs tetep dina kakuatan médan airway pangluhurna.
Gambar ti (a) saméméh jeung (b) sanggeus pangiriman MP5 kana trachea beurit anyar euthanized jeung magnet diposisikan langsung di luhur wewengkon imaging. Wewengkon imaged lokasina antara dua cingcin kartilage.Saméméh pangiriman MP, aya sababaraha cairan dina airway.Kotak beureum ngandung pembesaran kontras-enhancing.These gambar tina video S6 tambahan.
Narjamahkeun magnet sapanjang trakea in vivo ngabalukarkeun ranté MP ngarobah sudut dina beungeut airway dina cara nu sarupa jeung nu ditempo dina kapilér (tingali Gambar 8 jeung Suplemén Video S7: MP5). Sanajan kitu, dina ulikan urang, MPs teu bisa nyeret sapanjang beungeut airway hirup sakumaha maranéhna bisa jeung kapiler. Dina sababaraha kasus, dina sababaraha kasus, ranté MP bakal leuwih panjang, sarta katuhu, salaku rantay ka kénca. string partikel némbongan ngarobah jero lapisan cairan permukaan nalika magnet dipindahkeun longitudinally sapanjang trachea, sarta expands nalika magnet dipindahkeun langsung overhead jeung string partikel diputer ka posisi nangtung (tingali Suplemén Video S7). : MP5 di 0:09, katuhu handap).Pola karakteristik gerak robah nalika magnet ieu ditarjamahkeun sakuliah luhureun trachea laterally (nyaéta, ka kénca atawa katuhu sato tinimbang sapanjang panjang trachea nu).Pola ieu masih jelas katempo nalika aranjeunna dipindahkeun, tapi lamun magnet ieu dikaluarkeun tina trachea nu, ujung senar partikel jadi katempo S:8MP5 ieu. konsisten jeung paripolah MP kami observasi dina hiji médan magnét dilarapkeun dina kapilér kaca.
Conto gambar anu nunjukkeun MP5 dina trakea beurit anu dibius hirup.(a) Magnét dianggo pikeun nyandak gambar di luhur sareng ka kénca trakea, teras (b) saatos magnét dipindahkeun ka katuhu. Kotak beureum ngandung pembesaran anu ningkatkeun kontras. Gambar ieu tina pidéo anu dipidangkeun dina Pidéo Tambahan S7:MP5.
Lamun dua kutub anu ngonpigurasi dina orientasi kalér-kidul luhur jeung handap trachea (ie attracting; Gbr. 3b), chord MP mucunghul leuwih panjang sarta lokasina di sidewall trachea tinimbang dina beungeut dorsal tracheal (tingali Suplemén Video S9: MP5) . Sanajan kitu, konsentrasi luhur partikel dina lokasi dorsala tunggal teu dideteksi sanggeus pangiriman cairan (ie) alat dual-magnét ieu dipaké, nu ilaharna lumangsung nalika alat single-magnét dipaké. Lajeng nalika hiji magnet ieu ngonpigurasi pikeun ngusir kutub dibalikkeun (Gbr. 3c), jumlah partikel ditingali dina widang view teu némbongan naek sanggeus delivery.The setelan duanana konfigurasi dual-magnét anu nangtang alatan kakuatan magnet nu masing-masing nyorong magnet tunggal nu tarik atawa masing-masing. kana airway tapi ngaliwatan airway dina 90 derajat supados garis médan meuntas témbok tracheal orthogonally (Gbr. 3d), hiji orientasi dirancang pikeun nangtukeun lamun aggregation partikel dina témbok samping bisa dititénan .Najan kitu, dina konfigurasi ieu, euweuh gerakan diidentipikasikeunana akumulasi MP atawa gerakan magnet.Dumasar sakabéh hasil konfigurasi-magnét, agrégat tunggal, agrégat 3. 3a) dipilih pikeun studi pamawa gen vivo.
Lamun sato ieu sababaraha kali imaged langsung saatos pembunuhan manusa, henteuna gerak jaringan confounding dimaksudkan yén garis partikel finer tur pondok bisa discerned dina widang interchondral jelas, "wobbly" dina garis kalawan gerak translasi magnet. Sanajan kitu, masih teu bisa ningali jelas ayana jeung gerak partikel MP6.
The LV-LacZ titer éta 1,8 × 108 TU / ml, sarta sanggeus 1: 1 Pergaulan jeung CombiMag MP (MP6), sato narima 50 μl tracheal dosis 9 × 107 TU / ml LV wahana (ie 4,5 × 106 TU / beurit). ).Dina studi ieu, tinimbang narjamahkeun magnet salila kuli, urang dibereskeun magnet dina hiji posisi pikeun nangtukeun naha transduksi LV (a) bisa ningkat dibandingkeun pangiriman vektor dina henteuna médan magnét, sarta (b) bisa difokuskeun sél Airway anu transduced ka wewengkon target magnét tina airway luhur.
Ayana magnet jeung pamakéan CombiMag digabungkeun jeung vektor LV teu kaciri boga épék ngarugikeun kana kaséhatan sato, sakumaha ogé protokol pangiriman vektor LV baku urang. Gambar hareup wewengkon tracheal subjected ka perturbation mékanis (Suplemén Gbr. 1) nunjukkeun yén aya tingkat nyata luhur transduksi dina grup sato dirawat kalayan LV-MP. staining éta hadir dina grup kontrol (Gbr. 9b) .Quantification wewengkon X-Gal dinormalisasi patri némbongkeun yén administrasi LV-MP ku ayana médan magnét dihasilkeun hiji pamutahiran kurang leuwih 6-melu (Gbr. 9c).
Conto gambar komposit némbongkeun transduksi tracheal ku LV-MP (a) dina ayana médan magnét jeung (b) dina henteuna magnet a. (c) Pamutahiran signifikan statistik dina aréa transduksi LacZ dinormalisasi dina trachea nalika maké magnet (* p = 0,029, t-test, n = 3 per grup, mean ± SEM).
nétral gancang bagian beureum-patri (conto ditémbongkeun dina Suplemén Gbr. 2) némbongkeun sél LacZ-patri hadir dina pola sarupa jeung lokasi sakumaha dilaporkeun saméméhna.
Tantangan konci pikeun terapi gen jalan napas tetep lokalisasi akurat partikel pembawa ka daérah anu dipikaresep sareng ngahontal tingkat efisiensi transduksi anu luhur dina paru-paru anu gerak ku ayana aliran udara sareng bersihan mukus aktif. transduksi boga kaunggulan dibandingkeun métode pangiriman gén lianna kayaning éléktroporasi, sabab bisa ngagabungkeun kesederhanaan, ongkos-efektivitas, lokalisasi pangiriman, ngaronjat efisiensi, sarta waktu inkubasi pondok, sarta kamungkinan dosis carrier leutik10.Najan kitu, déposisi in vivo jeung paripolah partikel magnét dina rél dina pangaruh gaya magnét éksternal tina metoda ieu teu acan kungsi digambarkeun, euweuh kamungkinan éksprési vivo. dina saluran napas hirup gembleng.
Percobaan in vitro synchrotron PCXI kami némbongkeun yén sakabéh partikel kami diuji, iwal polystyrene MP, éta katingali dina setup imaging kami dipaké. Dina ayana médan magnét, MPs ngabentuk string anu panjangna aya hubunganana jeung tipe partikel jeung kakuatan médan magnét (ie deukeutna jeung gerak magnet).Saperti ditémbongkeun dina Gambar 10, anu ngabentuk string magnet masing-masing individu jeung observasi lokal urang alatan magnet indu sorangan. field.Ieu widang misah ngabalukarkeun partikel sarupa séjén pikeun agrégat tur nyambung, kalayan gerakan string-kawas grup alatan gaya lokal ti gaya pikaresepeun tur repulsive lokal partikel séjén.
Skématik némbongkeun (a,b) karéta partikel dihasilkeun di jero kapilér cairan-kaeusi jeung (c,d) hawa-kaeusi trachea.Catetan yén kapiler jeung trachea teu ditarik kana skala.Panel (a) ogé ngandung pedaran MP, nu ngandung partikel Fe3O4 disusun dina string.
Nalika magnet ieu dipindahkeun luhureun kapilér nu, sudut string partikel ngahontal bangbarung kritis pikeun MP3-5 ngandung Fe3O4, nu satutasna string partikel euweuh cicing di posisi aslina, tapi dipindahkeun sapanjang beungeut ka posisi anyar.magnet.Efék ieu kamungkinan lumangsung alatan beungeut kaca capillary cukup lemes pikeun ngidinan gerakan ieu lumangsung.Narikna, MP6 ieu teu (beubeunangna) cara partikel (beubeubeuteun) teu (beungeut). leutik, miboga coatings béda atawa muatan permukaan, atawa cairan carrier proprietary kapangaruhan pangabisa maranéhanana move.The kontras gambar partikel CombiMag oge lemah, suggesting yén cairan jeung partikel bisa mibanda kapadetan sarupa sahingga teu gampang pindah ka arah each other.Particles ogé bisa meunang nyangkut lamun magnét ngalir teuing gancang, nunjukkeun yén kakuatan médan magnét teu salawasna overcome antara kakuatan médan magnét, meureun moal overcome antara kakuatan medan magnét. kakuatan médan magnét sarta jarak antara magnet jeung wewengkon target Pohara penting. Dicokot babarengan, hasil ieu ogé nunjukkeun yén, bari magnet bisa néwak loba MPs nu ngalir ngaliwatan wewengkon target, teu mungkin magnet bisa relied on pikeun mindahkeun partikel CombiMag sapanjang beungeut trachea.
Nalika partikel dikirimkeun dina awak, aranjeunna hese pikeun ngaidentipikasi dina konteks jaringan awak obah kompléks, tapi kamampuhan pikeun ngadeteksi aranjeunna ditingkatkeun ku narjamahkeun magnet horisontal luhureun trachea ka "ngagoyangkeun" senar MP. Sanajan pencitraan hirup mungkin, éta gampang discern gerak partikel sakali sato geus humanely ditelasan. MP konsentrasi umumna pangluhurna di wewengkon ieu lokasina, sanajan sababaraha magnét biasana kapanggih di luhur lokasi ieu magnét, sanajan imaging langsung bisa kapanggih. Trakea. Kontras jeung studi in vitro, partikel teu bisa nyeret sapanjang trachea ku narjamahkeun magnet. Temuan ieu konsisten jeung kumaha mukus nu mantel beungeut trachea ilaharna prosés partikel kaseuseup, trapping aranjeunna dina mukus sarta salajengna diberesihan ku mékanisme clearance mucociliary.
Urang hipotésis yén pamakéan magnet pikeun atraksi luhur jeung handap trachea (Gbr. 3b) bisa ngahasilkeun médan magnét leuwih seragam, tinimbang médan magnét anu kacida kentel dina hiji titik, berpotensi ngarah ka distribusi partikel nu leuwih seragam. Tapi, ulikan awal urang teu manggihan bukti jelas pikeun ngarojong hipotésis ieu. déposisi di wewengkon imaged.Dua papanggihan ieu demonstrate yén setelan dual-magnét teu nyata ngaronjatkeun kontrol lokal tina targeting MP, sarta yén kakuatan magnét kuat anu dihasilkeun téh hésé ngonpigurasikeun, sahingga pendekatan ieu kirang praktis. Nya kitu, orienting magnét di luhur sarta ngaliwatan trachea (Gbr. 3d) ogé teu nambahan jumlah partikel dipikagaduh di wewengkon kakuatan magnét anu leuwih handap bisa jadi teu suksés di wewengkon ieu gambar. dina aréa déposisi.Ku kituna, konfigurasi magnet sudut 30-gelar tunggal (Gambar 3a) dianggap métode panggampangna tur pang éfisiénna pikeun nguji in vivo.
Panaliti LV-MP nunjukkeun yén nalika vektor LV digabungkeun sareng CombiMag sareng dikirimkeun saatos gangguan fisik ku ayana médan magnét, tingkat transduksi sacara signifikan ningkat dina trakea dibandingkeun sareng kontrol. ngakibatkeun efficacy luhur bari ngurangan titers dikirimkeun, off-target transduction, efek samping radang jeung imun, jeung ongkos carrier gén.Importantly, nurutkeun produsén, CombiMag bisa dipaké ditéang jeung métode mindahkeun gén séjén, kaasup jeung vektor viral séjén (kayaning AAV) jeung asam nukléat.