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낭포성 섬유증 폐 질환 치료를 위한 유전자 벡터는 주변 폐 전달이 치료적 이점을 제공하지 않기 때문에 전도성 기도를 표적으로 삼아야 합니다.바이러스 전달 효율은 벡터 체류 시간과 직접적인 관련이 있습니다.그러나 유전자 운반체와 같은 전달 유체는 흡입 중에 자연스럽게 폐포로 확산되고 모든 형태의 치료 입자는 점액섬모 수송을 통해 빠르게 제거됩니다.기도에서 유전자 운반체의 체류 시간을 연장하는 것은 중요하지만 달성하기 어렵습니다.기도 표면으로 향할 수 있는 유전자 운반체 접합 자기 입자는 지역 타겟팅을 개선할 수 있습니다.생체 내 시각화의 어려움으로 인해 자기장이 인가된 상태에서 기도 표면에서 이러한 작은 자기 입자의 거동은 잘 이해되지 않습니다.이 연구의 목적은 싱크로트론 이미징을 사용하여 마취된 쥐의 기관에서 일련의 자기 입자의 생체 내 운동을 시각화하여 생체 내 개별 및 대량 입자 거동의 역학 및 패턴을 조사하는 것이었습니다.그런 다음 자기장이 있는 상태에서 렌티바이러스 자기 입자를 전달하면 전달이 증가하는지 여부도 평가했습니다. 쥐 기관에서의 효율성. 싱크로트론 X-선 영상은 시험관 내 및 생체 내에서 정지 및 이동 자기장에서 자기 입자의 거동을 보여줍니다. 입자는 자석으로 살아있는 기도 표면을 따라 쉽게 끌려갈 수 없지만, 운반하는 동안 침전물은 자기장이 가장 강한 시야에 집중됩니다. 렌티바이러스 자기 입자를 자기장이 있는 상태에서 전달했을 때 전달 효율도 6배 증가했습니다. 이러한 결과를 종합해 보면 렌티바이러스 자기 입자와 자기장이 유전자 벡터 타겟팅을 개선하고 생체 내 전도성 기도에서 전달 수준을 높이는 데 귀중한 접근 방식이 될 수 있음을 시사합니다.
낭포성 섬유증(CF)은 CF 막 전도 조절자(CFTR)라는 단일 유전자의 변이로 인해 발생합니다. CFTR 단백질은 신체 전체의 많은 상피 세포에 존재하는 이온 채널로, CF 발병의 주요 부위인 전도성 기도를 포함합니다. CFTR 결함은 비정상적인 수분 운반을 초래하여 기도 표면의 수분을 감소시키고 기도 표면 액체(ASL) 층의 깊이를 줄입니다. 또한 이는 점액섬모 수송(MCT) 시스템이 흡입된 입자와 병원균을 기도에서 제거하는 능력을 손상시킵니다. 저희의 목표는 CFTR 유전자의 정확한 사본을 전달하고 ASL, MCT 및 폐 건강을 개선하는 렌티바이러스(LV) 유전자 치료법을 개발하고 이러한 매개변수를 생체 내에서 측정할 수 있는 새로운 기술을 계속 개발하는 것입니다.
LV 벡터는 CF 기도 유전자 치료의 주요 후보 중 하나이며, 주로 치료 유전자를 기도 기저 세포(기도 줄기 세포)에 영구적으로 통합할 수 있기 때문입니다.이것은 정상적인 수분 공급과 점액 제거를 기능적 유전자 교정 CF 관련 기도 표면 세포로 분화하여 회복할 수 있기 때문에 중요합니다.따라서 평생 이점을 제공합니다.LV 벡터는 CF 폐 질환이 시작되는 전도성 기도에 대해 지시되어야 합니다.벡터를 폐 깊숙이 전달하면 폐포 전환이 발생할 수 있지만 CF에서는 치료적 이점이 없습니다.그러나 유전자 운반체와 같은 체액은 전달 후 흡입 시 자연스럽게 폐포로 이동하고3,4 치료 입자는 MCT에 의해 구강으로 빠르게 제거됩니다.LV 전환 효율은 세포 흡수를 허용하기 위해 벡터가 표적 세포 옆에 머무르는 시간("거주 시간")과 직접적으로 관련되며5, 이는 일반적인 지역적 기류와 조정된 입자 점액 포획 및 MCT에 의해 쉽게 감소됩니다.CF의 경우 LV의 체류 시간을 연장하는 능력 이 지역에서 높은 수준의 전달을 달성하려면 기도가 중요하지만 지금까지는 어려움이 있었습니다.
이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 LV 자기 입자(MP)가 두 가지 상호 보완적인 방식으로 도움이 될 수 있다고 제안합니다. 첫째, 이들은 자기적으로 기도 표면으로 유도되어 타겟팅을 개선하고 유전자 운반 입자가 원하는 기도 영역에 머무르도록 돕습니다. 둘째, ASL(항원 전달체)이 세포층 6으로 이동합니다. MP는 항체, 항암제 또는 세포막에 부착되거나 관련 세포 표면 수용체에 결합되어 정전기가 존재하는 종양 부위에 축적되는 기타 소분자에 결합할 때 표적 약물 전달 매개체로 널리 사용되었습니다. 암 치료를 위한 자기장 7. 다른 "고열" 기술은 진동하는 자기장에 노출된 MP를 가열하여 종양 세포를 파괴하는 것을 목표로 합니다. 자기장을 형질감염제로 사용하여 세포로의 DNA 전달을 향상시키는 자기 형질감염 원리는 다양한 비바이러스 및 바이러스 유전자 벡터를 사용하여 형질도입이 어려운 세포주에 시험관 내에서 일반적으로 사용됩니다. LV 자기 형질감염의 효과는 정적 자기장 존재 하에 LV-MP를 인간 기관지 상피 세포주에 시험관 내에서 전달하여 LV 벡터 단독 투여 시보다 형질도입 효율이 186배 증가한 것으로 확인되었습니다. LV-MP는 또한 시험관 내 낭포성 섬유증(CF) 모델에도 적용되었는데, 자기 형질감염은 CF 객담 존재 하에 공기-액체 계면 배양에서 LV 형질도입을 20배 증가시켰습니다.10 그러나 장기의 생체 내 자기 형질감염은 상대적으로 주목받지 못했으며, 몇몇 동물 실험에서만 평가되었습니다. 연구11,12,13,14,15, 특히 폐16,17에서.그럼에도 불구하고 CF 폐 치료에서 자기 형질감염의 가능성은 분명합니다.Tan et al.(2020)은 "효율적인 자기 나노입자 폐 전달에 대한 개념 증명 연구는 CF 환자의 임상 결과를 개선하기 위한 미래의 CFTR 흡입 전략의 길을 열어줄 것"이라고 말했습니다.6
자기장이 인가된 상태에서 기도 표면에서 작은 자기 입자의 거동은 시각화하고 연구하기 어려우므로 잘 이해되지 않습니다. 다른 연구에서 우리는 ASL 깊이18와 MCT 거동19,20의 미세한 생체 내 변화를 비침습적으로 시각화하고 정량화하여 가스관 표면 수화를 직접 측정하고 치료 효능의 초기 지표로 사용하는 싱크로트론 전파 기반 위상차 X선 영상(PB-PCXI) 방법을 개발했습니다. 또한, 우리의 MCT 평가 방법은 PB-PCXI21을 사용하여 볼 수 있는 MCT 마커로 알루미나 또는 고굴절률 유리로 구성된 직경 10~35µm 입자를 사용합니다. 두 기술 모두 MP를 포함한 다양한 입자 유형을 시각화하는 데 적합합니다.
높은 공간적, 시간적 분해능 덕분에 PB-PCXI 기반 ASL 및 MCT 분석 기술은 생체 내 단일 및 대량 입자 행동의 역학 및 패턴을 조사하여 MP 유전자 전달 기술을 이해하고 최적화하는 데 적합합니다. 여기에서 사용하는 접근 방식은 SPring-8 BL20B2 빔라인을 사용한 연구에서 파생되었으며, 여기서 우리는 쥐의 비강과 폐 기도로 가성 벡터 용량을 전달한 후 유체 이동을 시각화하여 유전자 운반체 용량 동물 연구에서 관찰된 비균일 유전자 발현 패턴을 설명하는 데 도움을 얻었습니다 3,4.
이 연구의 목적은 싱크로트론 PB-PCXI를 사용하여 살아있는 쥐의 기관에서 일련의 MP의 생체 내 움직임을 시각화하는 것이었습니다.이러한 PB-PCXI 이미징 연구는 MP의 범위, 자기장 강도 및 위치를 테스트하여 MP 운동에 미치는 영향을 확인하도록 설계되었습니다.우리는 외부에서 인가되는 자기장이 전달된 MP가 목표 영역에 머무르거나 이동하는 데 도움이 될 것이라는 가설을 세웠습니다.또한 이러한 연구를 통해 증착 후 기관에 잔류하는 입자의 수를 최대화하는 자석 구성을 식별할 수 있었습니다.두 번째 연구 시리즈에서 우리는 이 최적의 구성을 사용하여 기도 타겟팅 맥락에서 LV-MP를 전달하면 LV 전달 효율이 향상될 것이라는 가정에 근거하여 쥐 기도로의 생체 내 LV-MP 전달로 인한 전달 패턴을 보여주고자 했습니다.
모든 동물 연구는 애들레이드 대학(M-2019-060 및 M-2020-022)과 SPring-8 싱크로트론 동물 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 실험은 ARRIVE 가이드라인에 따라 수행되었습니다.
모든 X선 이미징은 이전에 설명된 것과 유사한 설정을 사용하여 일본의 SPring-8 싱크로트론에 있는 BL20XU 빔라인에서 수행되었습니다.간단히 말해서, 실험 상자는 싱크로트론 저장 링에서 245m 떨어진 곳에 위치했습니다.0.6m의 샘플-검출기 거리는 입자 이미징 연구에 사용되고 0.3m는 위상차 효과를 생성하기 위한 생체 내 이미징 연구에 사용됩니다.25 keV의 단색 빔 에너지가 사용되었습니다.이미지는 sCMOS 검출기에 연결된 고해상도 X선 변환기(SPring-8 BM3)를 사용하여 캡처했습니다.변환기는 10µm 두께의 섬광체(Gd3Al2Ga3O12)를 사용하여 X선을 가시광선으로 변환한 다음 × 10 현미경 대물렌즈(NA 0.3)를 사용하여 sCMOS 센서로 향하게 합니다.sCMOS 검출기는 어레이 크기가 있는 Orca-Flash4.0(Hamamatsu Photonics, 일본)이었습니다. 2048 x 2048 픽셀과 6.5 x 6.5 µm의 원시 픽셀 크기입니다. 이 설정은 0.51 µm의 효과적인 등방성 픽셀 크기와 약 1.1 mm x 1.1 mm의 시야를 제공합니다. 호흡으로 인한 동작 아티팩트를 최소화하면서 기도 내부와 외부의 자기 입자의 신호 대 잡음비를 최대화하기 위해 100ms의 노출 길이가 선택되었습니다. 생체 내 연구의 경우, 노출 사이에 X선 빔을 차단하여 방사선량을 제한하기 위해 X선 경로에 빠른 X선 셔터를 배치했습니다.
BL20XU 영상 챔버는 생물안전수준 2 인증을 받지 않았기 때문에 LV 캐리어는 SPring-8 PB-PCXI 영상 연구에 사용되지 않았습니다. 대신, 우리는 다양한 크기, 재료, 철 농도 및 응용 분야를 포괄하는 두 개의 상업 공급업체로부터 잘 특성화된 다양한 MP를 선택하여 먼저 자기장이 유리 모세관 내에서 MP의 움직임에 어떻게 영향을 미치는지, 그 다음에는 살아있는 기도에서 어떻게 영향을 미치는지 이해했습니다. 표면에서.MP의 크기는 0.25~18μm이고 다양한 재료로 만들어졌지만(표 1 참조), MP 내의 자성 입자 크기를 포함한 각 샘플의 구성은 알려져 있지 않습니다. 광범위한 MCT 연구 19, 20, 21, 23, 24에 따르면, 예를 들어 연속 프레임을 빼서 MP 동작의 가시성을 향상시킴으로써 5μm만큼 작은 MP를 기관 기도 표면에서 볼 수 있을 것으로 예상합니다. 단일 0.25μm 크기의 MP는 이미징 장치의 해상도보다 작지만 PB-PCXI는 체적 대비와 증착 후 증착된 표면 유체의 움직임을 감지할 것으로 예상됩니다.
표 1의 각 MP에 대한 샘플은 내경이 0.63mm인 20μl 유리 모세관(Drummond Microcaps, PA, USA)에서 준비되었습니다.미립자는 물에서 구할 수 있지만 CombiMag 입자는 제조업체의 독점 유체에서 구할 수 있습니다.각 튜브는 액체(약 11μl)로 반쯤 채워지고 샘플 홀더에 놓입니다(그림 1 참조).유리 모세관은 각각 이미징 상자의 샘플 스테이지에 수평으로 놓고 유체의 가장자리에 위치했습니다.잔류 자화가 1.17테슬라인 19mm 직경(28mm 길이) 니켈 쉘 희토류 네오디뮴 철 붕소(NdFeB) 자석(N35, 카탈로그 번호 LM1652, Jaycar Electronics, Australia)을 별도의 이동 스테이지에 부착하여 이미징 중에 원격으로 위치를 변경했습니다.자석이 샘플 위로 약 30mm 떨어진 곳에 위치하면 X선 이미지 획득이 시작되고 이미지는 초당 4프레임의 속도로 획득됩니다. 두 번째. 이미징 중에 자석을 유리 모세관에 가까이 가져간 다음(약 1mm 떨어짐) 관을 따라 이동하여 전계 강도와 위치의 효과를 평가했습니다.
MP 샘플을 샘플 xy 이동 스테이지의 유리 모세관에 넣은 시험관 내 이미징 설정입니다. X선 빔의 경로는 빨간색 점선으로 표시되어 있습니다.
MP의 시험관 내 가시성이 확립된 후, 그 중 일부를 야생형 암컷 알비노 위스타 쥐(~12주령, ~200g)에서 생체 내로 시험했습니다.0.24mg/kg 메데토미딘(Domitor®, Zenoaq, 일본), 3.2mg/kg 미다졸람(Dormicum®, Astellas Pharma, 일본) 및 4mg/kg 부토르파놀(Vetorphale®, Meiji Seika) 쥐는 복강 내 주사로 Pharma, Japan)의 혼합물로 마취되었습니다.마취 후 기관 주위의 털을 제거하고 기관 내 튜브(ET; 16 Ga iv 캐뉼라, Terumo BCT)를 삽입한 다음 체온을 유지하기 위한 열 백이 들어 있는 맞춤형 영상 플레이트에 엎드려 고정하여 영상 촬영을 준비했습니다.그런 다음 영상 플레이트를 약간 각도를 맞춰 영상 상자의 샘플 이동 단계에 부착하여 그림 2a에 나타난 것처럼, X선 이미지에서 기관은 수평으로 위치합니다.
(a) SPring-8 영상 상자의 생체 영상 설정에서 X선 ​​빔의 경로는 빨간색 점선으로 표시되어 있습니다.(b,c) 기관의 자석 국소화는 두 개의 직교적으로 설치된 IP 카메라를 사용하여 원격으로 수행되었습니다. 화면 이미지의 왼쪽에는 머리를 고정하는 와이어 루프와 ET 튜브 내에 있는 전달 캐뉼라가 보입니다.
영어: 100 μl 유리 주사기를 사용하는 원격 제어 주사기 펌프 시스템(UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL)은 30 Ga 바늘을 통해 PE10 튜빙(OD 0.61 mm, ID 0.28 mm)에 연결되었습니다.ET 튜브를 삽입할 때 팁이 기관에서 올바른 위치에 있는지 확인하기 위해 튜브에 표시를 합니다.마이크로 펌프를 사용하여 튜브 팁이 전달될 MP 샘플에 담긴 상태에서 주사기 플런저를 빼냈습니다.그런 다음 로드된 전달 튜브를 기관 내 튜브에 삽입하여 팁을 예상되는 적용 자기장의 가장 강한 부분에 두었습니다.이미지 수집은 Arduino 기반 타이밍 박스에 연결된 호흡 감지기를 사용하여 제어했으며 모든 신호(예: 온도, 호흡, 셔터 열림/닫힘 및 이미지 수집)는 Powerlab 및 LabChart(AD Instruments, Sydney, Australia)를 사용하여 기록했습니다.22. 이미징 시 인클로저에 접근할 수 없을 때 두 대의 IP 카메라(Panasonic BB-SC382)를 대략 서로 90° 각도로 배치하여 영상 촬영 중 기관에 대한 자석의 위치를 ​​모니터링하는 데 사용했습니다(그림 2b, c). 동작 인공물을 최소화하기 위해 호기말 혈류 고원기 동안 호흡당 한 장의 영상을 획득했습니다.
영상 하우징 외부에서 원격으로 위치시킬 수 있는 2단계에 자석을 부착합니다.다음을 포함하여 다양한 자석 위치 및 구성을 테스트했습니다.기관 위로 약 30° 각도로 장착(구성은 그림 2a 및 3a에 표시됨);동물 위에 자석 하나, 아래에 다른 자석, 극은 끌어당기도록 설정(그림 3b);동물 위에 자석 하나, 아래에 다른 자석, 극은 밀어내도록 설정(그림 3c);기관 위에 수직으로 자석 하나(그림 3d).동물과 자석이 구성되고 테스트할 MP가 주사기 펌프에 로드되면 이미지를 획득하는 동안 4μl/초의 속도로 50μl 용량을 전달합니다.그런 다음 자석은 이미지를 계속 획득하면서 기관을 따라 앞뒤로 또는 측면으로 움직입니다.
생체 내 영상을 위한 자석 구성 (a) 기관 위에 약 30° 각도로 설치된 단일 자석, (b) 끌어당기는 자석 2개, (c) 밀어내는 자석 2개, (d) 기관 위에 수직으로 설치된 단일 자석. 관찰자는 입에서 기관을 통해 폐를 내려다보았고, X선 빔은 쥐의 왼쪽을 통과하여 오른쪽으로 나왔습니다. 자석은 기도의 길이를 따라 움직이거나 X선 빔 방향으로 기관 위 좌우로 움직입니다.
또한 우리는 교란성 호흡과 심장 운동이 없는 상태에서 기도에서 입자의 가시성과 행동을 결정하고자 했습니다. 따라서 영상 촬영 기간이 끝난 후 동물은 펜토바르비탈 과다 복용(솜노펜틸, 피트먼-무어, 워싱턴 크로싱, 미국; ~65 mg/kg ip)으로 인해 인도적으로 죽었습니다. 일부 동물은 영상 촬영 플랫폼에 남겨두고 호흡과 심장 박동이 멈춘 후 영상 촬영 과정을 반복했으며 기도 표면에 MP가 보이지 않으면 MP를 추가로 투여했습니다.
획득한 이미지는 평탄 시야 및 암시야 보정을 거친 후 MATLAB(R2020a, The Mathworks)로 작성된 사용자 정의 스크립트를 사용하여 동영상(초당 20프레임, 호흡 수에 따라 정상 속도의 15~25배)으로 조립되었습니다.
모든 LV 유전자 벡터 전달 연구는 애들레이드 대학의 실험 동물 연구 시설에서 수행되었으며, SPring-8 실험 결과를 사용하여 자기장이 있는 상태에서 LV-MP를 전달하면 생체 내 유전자 전달을 향상시킬 수 있는지 평가하는 것을 목표로 했습니다. MP와 자기장의 효과를 평가하기 위해 두 그룹의 동물을 치료했습니다. 한 그룹은 자석이 놓인 LV-MP를 투여받았고, 다른 그룹은 자석이 없는 LV-MP가 있는 대조군을 투여받았습니다.
LV 유전자 벡터는 이전에 설명된 방법 25, 26을 사용하여 생성되었습니다. LacZ 벡터는 구성적 MPSV 프로모터(LV-LacZ)에 의해 구동되는 핵 국소화 베타-갈락토시다제 유전자를 발현하며, 이는 폐 조직 전면과 조직 절편에서 볼 수 있는 파란색 반응 생성물을 전달된 세포에서 생성합니다. 적정은 혈구계산기로 LacZ 양성 세포의 수를 수동으로 세어 TU/ml 단위의 역가를 계산하여 세포 배양에서 수행되었습니다. 담체는 -80°C에서 냉동 보관하고 사용 전에 해동한 다음 1:1 비율로 혼합하여 CombiMag에 결합하고 전달하기 전에 최소 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
일반 Sprague Dawley 쥐(n = 3/군, ~2-3마리)를 0.4mg/kg 메데토미딘(Domitor, Ilium, Australia)과 60mg/kg 케타민(Ilium, Australia)을 혼합하여 복강내 마취시키고(한 달) 복강내 주사한 후 16 Ga 정맥 캐뉼라를 사용하여 비수술적 경구 캐뉼라를 삽입했습니다. 기관 기도 조직이 LV 전도를 받도록 하기 위해 이전에 설명한 기계적 교란 프로토콜을 사용하여 조절했습니다. 이 프로토콜에서는 기관 기도 표면을 와이어 바구니(N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115)-UDH, Cook Medical, USA)로 축 방향으로 문질렀습니다(30초28). LV-MP의 기관 투여는 교란 후 약 10분 후에 생물학적 안전 캐비닛에서 수행했습니다.
이 실험에서 사용된 자기장은 기관 위에 증류 스텐트 클립을 사용하여 동일한 자석을 고정한 생체 내 X선 영상 연구와 유사한 방식으로 설정되었습니다(그림 4). 50 μl 용량(2 × 25 μl 분취량)의 LV-MP를 이전에 설명한 바와 같이 겔 팁이 포함된 피펫을 사용하여 기관(n = 3마리 동물)으로 주입했습니다. 대조군(n = 3마리 동물)은 자석을 사용하지 않고 동일한 LV-MP를 투여받았습니다. 주입이 완료되면 캐뉼라를 ET 튜브에서 제거하고 동물의 관을 제거합니다. 자석은 10분 동안 그대로 두었다가 제거합니다. 쥐에게 멜록시캄(1 ml/kg)(Ilium, Australia)을 피하 주사한 후 1 mg/kg의 아티파마졸 염산염(Antisedan, Zoetis, Australia)을 복강 내 주사하여 마취를 해제했습니다. 쥐는 따뜻하게 유지하고 완전히 회복될 때까지 모니터링했습니다. 마취로부터.
생물학적 안전 캐비닛에 있는 LV-MP 전달 장치. ET 튜브의 밝은 회색 루어 허브가 입에서 튀어나와 있는 것을 볼 수 있으며, 그림에 나와 있는 피펫의 젤 팁이 ET 튜브를 통해 기관 내 원하는 깊이까지 삽입됩니다.
LV-MP 투여 절차 1주일 후, 동물은 100% CO2 흡입으로 인도적으로 희생되었고 LacZ 발현은 표준 X-gal 처리를 사용하여 평가되었습니다.기관 내 튜브 삽입으로 인한 기계적 손상이나 체액 잔류가 분석에 포함되지 않도록 하기 위해 가장 뒤쪽에 있는 세 개의 연골 고리를 제거했습니다.각 기관은 세로로 잘라서 분석을 위해 두 개의 반쪽을 만들고 Minutien 바늘(Fine Science Tools)을 사용하여 루멘 표면을 시각화하기 위해 실리콘 고무(Sylgard, Dow Inc)가 들어 있는 접시에 장착했습니다.전사된 세포의 분포와 패턴은 DigiLite 카메라와 TCapture 소프트웨어(Tucsen Photonics, China)가 있는 Nikon 현미경(SMZ1500)을 사용하여 정면 사진을 통해 확인했습니다.기관의 전체 너비에 대한 가장 높은 설정을 포함하여 20배 확대율로 이미지를 얻었으며 각 이미지 사이에 충분한 중복을 보장하면서 기관의 전체 길이를 단계별로 이미지화했습니다. 이미지 "스티칭"을 허용합니다. 그런 다음 각 기관의 이미지를 평면 모션 알고리즘을 활용하는 Image Composite Editor v2.0.3(Microsoft Research)을 사용하여 단일 합성 이미지로 조립했습니다. 각 동물의 기관 합성 이미지에서 LacZ 발현 영역은 이전에 설명한 대로 자동화된 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)를 사용하여 정량화했으며, 설정은 0.35 < 색조 < 0.58, 채도 > 0.15, 값 < 0.7이었습니다. 조직의 윤곽을 추적하여 각 합성 이미지에 대해 GIMP v2.10.24에서 마스크를 수동으로 생성하여 조직 영역을 식별하고 기관 조직 외부에서 잘못된 감지를 방지했습니다. 각 동물의 모든 합성 이미지에서 염색된 영역을 합산하여 해당 동물의 총 염색 영역을 생성했습니다. 그런 다음 염색된 영역을 총 마스크 영역으로 나누어 정규화된 영역을 생성했습니다.
각 기관을 파라핀에 포매하고 5μm 절편을 절단했습니다. 절편은 중성 고속 적색으로 5분간 대조 염색한 후 Nikon Eclipse E400 현미경, DS-Fi3 카메라 및 NIS 요소 캡처 소프트웨어(버전 5.20.00)를 사용하여 이미지를 얻었습니다.
모든 통계 분석은 GraphPad Prism v9(GraphPad Software, Inc.)에서 수행되었습니다. 통계적 유의성은 p ≤ 0.05로 설정되었습니다. Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 정규성을 검증했고, LacZ 염색의 차이는 쌍을 이루지 않은 t 검정을 사용하여 평가했습니다.
표 1에 설명된 6개의 MP는 PCXI를 사용하여 검사되었으며 가시성은 표 2에 설명되어 있습니다.두 개의 폴리스티렌 MP(MP1 및 MP2; 각각 18μm 및 0.25μm)는 PCXI에서 보이지 않았지만 나머지 샘플은 식별 가능했습니다(예는 그림 5에 표시됨).MP3 및 MP4(10-15% Fe3O4; 각각 0.25μm 및 0.9μm)는 희미하게 보입니다.테스트한 가장 작은 입자 중 일부를 포함하고 있지만 MP5(98% Fe3O4; 0.25μm)가 가장 두드러졌습니다.CombiMag 제품 MP6는 발견하기 어렵습니다.모든 경우에서 자석을 모세관과 평행하게 앞뒤로 이동시킴으로써 MP를 감지하는 능력이 크게 향상되었습니다.자석이 모세관에서 멀어지면 입자가 긴 줄로 늘어났지만 자석이 가까워지고 자기장 강도가 증가함에 따라 입자가 쪽으로 이동하면서 입자 줄이 짧아졌습니다. 모세관의 윗면(보충 영상 S1: MP4 참조)이 증가하면 표면의 입자 밀도가 증가합니다.반대로, 자석을 모세관에서 제거하면 자기장 강도가 감소하고 MP는 모세관의 윗면에서 뻗어 나오는 긴 줄로 재배열됩니다(보충 영상 S2: MP4 참조).자석이 움직임을 멈춘 후에도 입자는 평형 위치에 도달한 후 잠시 동안 계속 움직입니다.MP가 모세관의 윗면을 향해 움직이거나 멀어짐에 따라 자기 입자는 일반적으로 유체를 통해 파편을 끌어냅니다.
PCXI에서 MP의 가시성은 샘플 간에 상당히 다릅니다.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 및 (d) MP6. 여기에 표시된 모든 이미지는 모세관 바로 위 약 10mm에 위치한 자석으로 촬영되었습니다. 눈에 띄는 큰 원은 모세관에 갇힌 공기 방울로, 위상차 영상의 흑백 가장자리 특징을 명확하게 보여줍니다. 빨간색 상자에는 대비를 높이는 배율이 포함되어 있습니다. 모든 그림에서 자석 개략도의 직경은 축척에 맞지 않으며 표시된 것보다 약 100배 더 큽니다.
자석이 모세관 상단을 따라 좌우로 이동함에 따라 MP 스트링의 각도가 자석에 맞춰 바뀌어(그림 6 참조) 자기장 선이 나타납니다.MP3-5의 경우 코드가 임계 각도에 도달한 후 입자가 모세관 상단 표면을 따라 끌립니다.이로 인해 자기장이 가장 강한 곳 근처에서 MP가 더 큰 그룹으로 클러스터링되는 경우가 많습니다(보충 영상 S3:MP5 참조).또한 모세관 끝부분에 가깝게 이미징할 때 특히 분명하게 나타나며, 이로 인해 MP가 유체-공기 계면에 응집되고 집중됩니다.MP3-5보다 구별하기 어려운 MP6의 입자는 자석이 모세관을 따라 이동할 때 끌리지 않았지만 MP 스트링이 분리되어 입자가 시야에 남았습니다(보충 영상 S4:MP6 참조).어떤 경우에는 자석을 이미징 위치에서 멀리 옮겨 인가된 자기장을 줄이면 남아 있는 MP가 스트링에 남아 있는 동안 중력에 의해 튜브의 바닥면으로 천천히 내려갔습니다(보충 영상 참조). S5: MP3).
MP 스트링의 각도는 자석이 모세관 바로 위로 이동함에 따라 변합니다.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 및 (d) MP6. 빨간색 상자에는 대비를 높이기 위한 확대율이 포함되어 있습니다. 보충 영상은 이러한 정적 이미지에서 시각화할 수 없는 중요한 입자 구조와 동적 정보를 보여주므로 유익합니다.
우리의 시험은 기관을 따라 자석을 천천히 앞뒤로 움직이면 생체 내 복잡한 움직임의 맥락에서 MP를 시각화하는 데 도움이 된다는 것을 보여주었습니다.모세관에서 폴리스티렌 비드(MP1 및 MP2)가 보이지 않아 생체 내 시험은 수행하지 않았습니다.나머지 4개의 MP 각각은 기관 위에 수직에 대해 약 30° 각도로 구성된 자석 장축으로 생체 내에서 시험했습니다(그림 2b 및 3a 참조).이렇게 하면 MP 사슬이 더 길어지고 자석 구성이 종료되는 것보다 더 효과적이었습니다.MP3, MP4 및 MP6은 살아있는 동물의 기관에서 감지되지 않았습니다.동물을 인도적으로 죽인 후 쥐의 기도를 영상화했을 때 주사기 펌프를 사용하여 추가 용량을 추가해도 입자가 보이지 않았습니다.MP5는 산화철 함량이 가장 높고 유일하게 보이는 입자였으므로 MP의 생체 내 행동을 평가하고 특성화하는 데 사용되었습니다.
MP를 전달하는 동안 기관 위에 자석을 놓으면 많은 MP가 시야에 집중되지만 모든 MP는 아닙니다. 기관으로 들어가는 입자는 인도적으로 희생된 동물에서 가장 잘 관찰됩니다. 그림 7과 보충 비디오 S6: MP5는 복부 기관 표면에 있는 입자의 빠른 자기 포획 및 정렬을 보여주며, 이는 MP가 기관의 원하는 영역으로 향할 수 있음을 나타냅니다. MP 전달 후 기관을 따라 더 먼쪽으로 검색할 때 일부 MP는 기관분기에 더 가깝게 발견되었는데, 이는 유체 과정 동안 최대 자기장 강도 영역을 통해 전달되었기 때문에 모든 MP를 수집하고 유지하기에 자기장 강도가 부족했음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고, 영상화된 영역 주변의 산후 MP 농도가 더 높았는데, 이는 많은 MP가 적용된 자기장 강도가 가장 높은 기도 영역에 남아 있음을 시사합니다.
(a) 최근 안락사된 쥐의 기관에 MP5를 투여하기 전과 (b) 투여한 후의 이미지. 자석을 영상 영역 바로 위에 위치시켰습니다. 영상 영역은 두 개의 연골 고리 사이에 위치해 있습니다. MP를 투여하기 전에는 기도에 약간의 체액이 있었습니다. 빨간색 상자에는 대비를 높이기 위한 확대경이 들어 있습니다. 이 이미지는 보충 영상 S6:MP5에 표시된 비디오에서 가져온 것입니다.
생체 내에서 기관을 따라 자석을 이동시키면 MP 사슬이 모세혈관에서 볼 수 있는 것과 유사한 방식으로 기도 표면 내에서 각도를 변경합니다(그림 8 및 보충 영상 S7: MP5 참조). 그러나 우리 연구에서는 모세혈관에서처럼 MP를 생체 기도 표면을 따라 끌 수 없었습니다. 어떤 경우에는 자석이 좌우로 움직이면서 MP 사슬이 더 길어집니다. 흥미롭게도 자석을 기관을 따라 세로로 움직이면 입자 줄이 표면 유체층의 깊이를 변경하는 것처럼 보이고 자석을 바로 머리 위로 움직이고 입자 줄이 수직 위치로 회전하면 확장되는 것을 발견했습니다(보충 영상 S7 참조). : MP5 0:09, 오른쪽 아래). 자석이 기관의 상단을 가로질러 측면으로 이동했을 때(즉, 기관의 길이를 따라가기보다는 동물의 왼쪽이나 오른쪽으로 이동했을 때) 운동의 특징적인 패턴이 바뀌었습니다. 입자는 움직일 때에도 여전히 명확하게 보였지만, 자석을 기관에서 제거하자 입자 줄의 끝이 보이게 되었습니다(보충 영상 S8:MP5, 0:08에서 시작 참조). 이는 유리 모세관에서 자기장이 인가되었을 때 관찰된 MP 동작과 일치합니다.
마취된 생쥐의 기관에 있는 MP5를 보여주는 예시 이미지. (a) 자석을 사용하여 기관의 위쪽과 왼쪽에서 이미지를 얻은 다음 (b) 자석을 오른쪽으로 이동한 후. 빨간색 상자에는 대비를 높이기 위한 확대율이 포함되어 있습니다. 이 이미지는 보충 영상 S7:MP5에 표시된 영상에서 가져온 것입니다.
두 극이 기관 위와 아래에서 남북 방향으로 구성되었을 때(즉, 끌어당김, 그림 3b), MP 코드가 더 길어 보였고 기관의 등쪽 표면이 아닌 기관의 측벽에 위치했습니다(보충 비디오 S9:MP5 참조).그러나 듀얼 자석 장치를 사용했을 때 유체 전달 후 단일 위치(즉, 기관의 등쪽 표면)에서 높은 농도의 입자가 감지되지 않았는데, 이는 일반적으로 단일 자석 장치를 사용했을 때 발생합니다.그런 다음 하나의 자석이 반전된 극을 밀어내도록 구성되었을 때(그림 3c), 시야에서 볼 수 있는 입자의 수는 전달 후 증가하지 않는 것으로 나타났습니다.두 듀얼 자석 구성의 설정은 각각 자석을 당기거나 미는 높은 자기장 강도로 인해 까다롭습니다.그런 다음 설정을 기도와 평행하지만 90도로 기도를 통과하는 단일 자석으로 변경하여 자기장 선이 기관 벽을 가로지르도록 했습니다. 직교적으로(그림 3d), 측벽에서 입자 응집을 관찰할 수 있는지 확인하기 위해 설계된 방향입니다. 그러나 이 구성에서는 MP 축적이나 자석의 움직임이 식별 가능하지 않았습니다. 이러한 모든 결과를 바탕으로 생체 내 유전자 운반체 연구를 위해 단일 자석, 30도 방향 구성(그림 3a)이 선택되었습니다.
동물을 인도적으로 도살한 직후 반복적으로 촬영했을 때, 교란을 일으키는 조직 운동이 없었기 때문에, 선명한 연골간 영역에서 더 미세하고 짧은 입자 선들이 자석의 병진 운동에 따라 "흔들리는" 것처럼 보였습니다. 그럼에도 불구하고, MP6 입자의 존재와 운동은 여전히 ​​명확하게 볼 수 없었습니다.
LV-LacZ 역가는 1.8 × 108 TU/ml이었고, CombiMag MP(MP6)와 1:1 혼합한 후, 동물은 9 × 107 TU/ml LV 운반체(즉, 4.5 × 106 TU/쥐)의 50 μl 기관 내 투여량을 받았습니다. 이 연구에서는 분만 중 자석을 움직이는 대신 자석을 한 위치에 고정하여 LV 전도가 (a) 자기장이 없는 벡터 전달에 비해 개선될 수 있는지, (b) 기도 세포가 상기도의 자기 표적 영역으로 전도될 수 있는지 확인했습니다.
자석의 존재와 CombiMag를 LV 벡터와 함께 사용하는 것은 동물 건강에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 표준 LV 벡터 전달 프로토콜에서도 마찬가지였다. 기계적 교란을 받은 기관 영역의 정면 이미지(보충 그림 1)는 자석이 있을 때 LV-MP로 처리한 동물 그룹에서 전달 수준이 상당히 더 높았음을 나타냈다(그림 9a). 대조군에서는 소량의 파란색 LacZ 염색만 존재했다(그림 9b). 표준화된 X-Gal 염색 영역을 정량화한 결과, 자기장이 있는 상태에서 LV-MP를 투여하면 약 6배의 개선이 나타났다(그림 9c).
(a) 자기장이 있는 경우와 (b) 자석이 없는 경우 LV-MP에 의한 기관 전도를 보여주는 예시 합성 이미지. (c) 자석을 사용했을 때 기관 내 정규화된 LacZ 전도 영역이 통계적으로 유의미하게 개선됨(*p = 0.029, t-검정, 그룹당 n = 3, 평균 ± SEM).
중성 빠른 적색 염색 단면(보충 그림 2에 표시된 예)은 이전에 보고된 것과 유사한 패턴과 위치로 존재하는 LacZ 염색 세포를 보여주었습니다.
기도 유전자 치료의 핵심 과제는 관심 영역에 운반체 입자를 정확하게 위치시키고 공기 흐름과 활성 점액 제거가 있는 움직이는 폐에서 높은 수준의 전도 효율을 달성하는 것입니다.CF 기도 질환을 치료하기 위해 설계된 LV 운반체의 경우 전도 기도 내에서 운반체 입자의 체류 시간을 늘리는 것은 지금까지 달성하기 어려운 목표였습니다.Castellani 등이 지적했듯이, 자기장을 사용하여 전도를 개선하는 것은 전기천공과 같은 다른 유전자 전달 방법에 비해 단순성, 비용 효율성, 전달 국소화, 효율성 증가, 더 짧은 배양 시간, 그리고 더 작은 운반체 복용량을 결합할 수 있기 때문에 이점이 있습니다.10 그러나 외부 자기력의 영향을 받는 기도에서 자기 입자의 생체 내 침전 및 거동은 설명된 적이 없으며, 실제로 이 방법이 온전한 생체 기도에서 유전자 발현 수준을 증가시키는 생체 내 실행 가능성이 입증된 적도 없습니다.
시험관 내 싱크로트론 PCXI 실험 결과, 폴리스티렌 MP를 제외한 모든 입자가 우리가 사용한 이미징 설정에서 볼 수 있었습니다.자기장이 존재하는 경우 MP는 길이가 입자 유형과 자기장 강도(즉, 자석의 근접성과 움직임)에 따라 달라지는 줄을 형성합니다.그림 10에서 볼 수 있듯이, 우리가 관찰하는 줄은 각 입자가 자화되어 자체적인 국소 자기장을 유도하기 때문에 형성됩니다.이러한 별도의 자기장은 다른 유사한 입자가 뭉치고 연결되도록 하며, 다른 입자의 국소적인 인력과 척력으로 인한 국소적인 힘으로 인해 끈과 같은 그룹 운동을 합니다.
(a, b) 유체로 채워진 모세혈관 내부에서 생성된 입자 행렬과 (c, d) 공기로 채워진 기관을 보여주는 개략도. 모세혈관과 기관은 실제 비율에 맞게 그려지지 않았습니다. 패널 (a)에는 또한 끈으로 배열된 Fe3O4 입자가 포함된 MP에 ​​대한 설명이 포함되어 있습니다.
자석을 모세관 위로 이동시켰을 때, 입자 열의 각도는 Fe3O4를 함유한 MP3-5의 임계 한계점에 도달했고, 그 후 입자 열은 더 이상 원래 위치에 머물지 않고 표면을 따라 새로운 위치로 이동했습니다.자석.이 효과는 유리 모세관 표면이 이러한 움직임을 허용할 만큼 충분히 매끄러워서 발생할 가능성이 높습니다.흥미롭게도 MP6(CombiMag)는 이러한 현상이 나타나지 않았는데, 아마도 입자가 더 작거나, 코팅이나 표면 전하가 다르거나, 또는 독점적인 운반 유체가 이동 능력에 영향을 미쳤기 때문일 수 있습니다.CombiMag 입자의 이미지 대비도 약했는데, 이는 유체와 입자의 밀도가 유사하여 서로 쉽게 이동하지 않을 수 있음을 시사합니다.자석이 너무 빨리 움직이면 입자가 갇힐 수도 있는데, 이는 자기장 강도가 유체 내 입자 간의 마찰을 항상 극복할 수 없음을 의미하며, 아마도 자기장 강도와 자석과 목표 영역 사이의 거리가 매우 중요하다는 것은 놀라운 일이 아닐 것입니다.이러한 결과를 종합해 보면, 자석은 목표 영역을 통과하는 많은 MP를 포획할 수 있지만, CombiMag 입자를 기관 표면을 따라 이동시키는 데 자석을 사용하는 것은 불가능할 것으로 보인다. 따라서 생체 내 LV-MP 연구에서는 정적 자기장을 활용하여 기도의 특정 영역을 물리적으로 표적으로 삼아야 한다는 결론을 내렸다.
입자가 체내에 전달되면 복잡하게 움직이는 신체 조직에서는 식별하기 어렵지만, 기관 위로 자석을 수평으로 이동시켜 MP 줄을 "흔들면" 입자를 감지하는 능력이 향상되었습니다.생체 영상이 가능하지만 동물을 인도적으로 죽인 후에 입자의 움직임을 식별하는 것이 더 쉽습니다.자석이 영상 영역 위에 위치했을 때 이 위치에서 MP 농도가 일반적으로 가장 높았지만 일부 입자는 보통 기관을 따라 더 멀리서도 발견되었습니다.시험관 내 연구와 달리 자석을 이동시켜 입자를 기관을 따라 끌 수 없습니다.이 발견은 기관 표면을 코팅하는 점액이 일반적으로 흡입된 입자를 처리하여 점액에 가두고 이후 점액섬모 청소 메커니즘을 통해 제거하는 방식과 일치합니다.
우리는 기관 위아래로 자석을 사용하여 끌어당기면(그림 3b) 한 지점에 고농도의 자기장이 아닌 더 균일한 자기장이 생성되어 입자의 분포가 더 균일해질 수 있다는 가설을 세웠습니다. 그러나 예비 연구에서는 이 가설을 뒷받침할 명확한 증거를 찾지 못했습니다. 마찬가지로, 한 쌍의 자석을 밀어내는 방식으로 구성해도(그림 3c) 영상 영역에 입자가 더 많이 침착되지 않았습니다. 이 두 가지 결과는 이중 자석 구성이 MP 표적화의 국소 제어를 크게 향상시키지 못하며, 그 결과로 발생하는 강력한 자기력을 구성하기 어려워 이 접근 방식이 실용적이지 못함을 보여줍니다. 마찬가지로 자석을 기관 위와 기관을 통과하도록 배치해도(그림 3d) 영상 영역에 잔류하는 입자 수가 증가하지 않았습니다. 이러한 대안 구성 중 일부는 침착 영역 내에서 자기장 강도가 낮아지기 때문에 성공적이지 못할 수 있습니다. 따라서 단일 30도 각도 자석 구성(그림 3a)이 생체 내 실험에서 가장 쉽고 효율적인 방법으로 간주됩니다. 테스트.
LV-MP 연구에서는 LV 벡터를 CombiMag와 결합하고 자기장이 있는 상태에서 물리적 교란을 준 후 전달했을 때 기관에서의 전달 수준이 대조군에 비해 상당히 증가한 것을 보여주었습니다. 싱크로트론 영상 연구와 LacZ 결과에 따르면, 자기장은 기관 내에서 LV를 보존하고 폐 깊숙이 즉시 침투하는 벡터 입자의 수를 줄이는 효과가 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 타겟팅 개선을 통해 전달 역가, 오프타겟 전달, 염증 및 면역 부작용, 유전자 운반체 비용을 줄이는 동시에 효능을 높일 수 있습니다. 중요한 점은 제조업체에 따르면 CombiMag는 다른 바이러스 벡터(예: AAV) 및 핵산을 포함한 다른 유전자 전달 방법과 함께 사용할 수 있다는 것입니다.