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낭포성 섬유증 폐 질환 치료를 위한 유전자 벡터는 말초 폐에서의 유전자 전달은 치료 효과를 제공하지 못하므로, 전도성 기도를 표적으로 삼아야 합니다. 바이러스 유전자 전달 효율은 벡터의 체류 시간과 직접적인 관련이 있습니다. 그러나 유전자 운반체와 같은 전달액은 흡기 시 자연적으로 폐포로 확산되며, 모든 형태의 치료 입자는 점액섬모 수송에 의해 빠르게 제거됩니다. 따라서 기도 내 유전자 운반체의 체류 시간을 연장하는 것이 중요하지만 달성하기 어렵습니다. 기도 표면으로 유도될 수 있는 유전자 운반체 접합 자성 입자는 국소 표적화를 향상시킬 수 있습니다. 생체 내 시각화의 어려움으로 인해, 자기장이 가해진 상태에서 기도 표면에서 이러한 작은 자성 입자의 거동은 제대로 이해되지 않고 있습니다. 본 연구의 목적은 마취된 쥐의 기관에서 일련의 자성 입자의 생체 내 움직임을 싱크로트론 이미징을 이용하여 시각화하고, 생체 내에서 개별 입자 및 전체 입자의 거동의 역동성과 패턴을 조사하는 것입니다. 또한, 자기장이 가해진 상태에서 렌티바이러스 자성 입자를 전달하는 것이 기도 내 유전자 전달 효율을 증가시키는지 평가했습니다. 쥐의 기관지에서 자기 입자의 거동을 싱크로트론 X선 이미징을 통해 관찰한 결과, 생체 내외에서 정지 및 이동 자기장 하에서의 자기 입자의 거동이 밝혀졌습니다. 자석을 이용해 생체 내 기도 표면을 따라 입자를 쉽게 끌어당길 수는 없지만, 이동 중에는 자기장이 가장 강한 영역에 입자가 집중되는 것을 확인할 수 있었습니다. 또한, 렌티바이러스 자기 입자를 자기장 하에서 전달했을 때 유전자 전달 효율이 6배 증가했습니다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 렌티바이러스 자기 입자와 자기장은 생체 내 기도에서 유전자 벡터의 표적화를 개선하고 유전자 전달 수준을 높이는 데 유용한 접근법이 될 수 있음을 시사합니다.
낭포성 섬유증(CF)은 CF 막횡단 전도 조절자(CFTR)라는 단일 유전자의 변이로 인해 발생합니다. CFTR 단백질은 신체 전반의 많은 상피 세포, 특히 CF 발병의 주요 부위인 기도에 존재하는 이온 채널입니다. CFTR 결함은 비정상적인 수분 수송을 유발하여 기도 표면을 탈수시키고 기도 표면액(ASL) 층의 두께를 감소시킵니다. 또한 이는 점액섬모 수송(MCT) 시스템이 기도에서 흡입된 입자와 병원균을 제거하는 능력을 저해합니다. 본 연구의 목표는 CFTR 유전자의 정확한 복제본을 전달하여 ASL, MCT 및 폐 건강을 개선하는 렌티바이러스(LV) 유전자 치료법을 개발하고, 이러한 매개변수를 생체 내에서 측정할 수 있는 새로운 기술을 지속적으로 개발하는 것입니다.
LV 벡터는 CF 기도 유전자 치료의 주요 후보 중 하나인데, 이는 치료 유전자를 기도 기저 세포(기도 줄기 세포)에 영구적으로 통합할 수 있기 때문입니다. 이는 기도 기저 세포가 기능적인 유전자 교정 CF 관련 기도 표면 세포로 분화하여 정상적인 수분 공급과 점액 제거 기능을 회복시켜 평생에 걸쳐 이점을 제공할 수 있기 때문에 중요합니다. LV 벡터는 CF 폐 질환이 시작되는 부위인 기도에 직접 전달되어야 합니다. 벡터를 폐 깊숙이 전달하면 폐포 전달이 발생할 수 있지만, 이는 CF 치료에는 효과가 없습니다. 그러나 유전자 운반체와 같은 액체는 전달 후 흡기 시 자연적으로 폐포로 이동하며3,4 치료 입자는 MCT에 의해 구강으로 빠르게 배출됩니다. LV 전달 효율은 세포 흡수를 위해 벡터가 표적 세포 옆에 머무르는 시간, 즉 "체류 시간"5과 직접적인 관련이 있는데, 이는 일반적인 국소 기류와 입자의 점액 포획 및 MCT에 의해 쉽게 감소됩니다. CF의 경우, 기도 내 LV의 체류 시간을 연장하는 것이 중요합니다. 이 지역에서 높은 수준의 신호 전달을 달성하는 것이 중요하지만, 지금까지는 어려운 과제였습니다.
이러한 장애물을 극복하기 위해 LV 자기 입자(MP)가 두 가지 상호보완적인 방식으로 도움이 될 수 있다고 제안합니다. 첫째, 자기적으로 기도 표면으로 유도되어 표적화를 개선하고 유전자 운반체 입자가 원하는 기도 영역에 머무르도록 도울 수 있습니다. 둘째, ASL(기도 표면액)을 통해 세포층으로 이동할 수 있습니다. 6. MP는 항체, 항암제 또는 세포막에 부착되거나 관련 세포 표면 수용체에 결합하는 기타 소분자와 결합하여 정전기 존재 하에 종양 부위에 축적될 때 표적 약물 전달체로 널리 사용되어 왔습니다. 암 치료를 위한 자기장 7. 다른 "고온" 기술은 진동하는 자기장에 노출될 때 미세입자(MP)를 가열하여 종양 세포를 파괴하는 것을 목표로 합니다. 자기장을 세포로의 DNA 전달을 향상시키는 전이 매개체로 사용하는 자기 전이 원리는, 전이가 어려운 세포주에 대해 다양한 비바이러스성 및 바이러스성 유전자 벡터를 사용하여 시험관 내에서 일반적으로 사용됩니다. LV 자기 전이의 효과는 정적 자기장 존재 하에서 인간 기관지 상피 세포주에 LV-MP를 시험관 내에서 전달함으로써 입증되었으며, LV 벡터 단독 사용에 비해 전이 효율이 186배 증가했습니다. LV-MP는 또한 시험관 내 낭포성 섬유증(CF) 모델에 적용되었으며, 자기 전이는 CF 가래가 존재하는 공기-액체 계면 배양에서 LV 전이를 20배 증가시켰습니다.10 그러나 장기의 생체 내 자기 전이는 상대적으로 관심이 적었으며 몇몇 동물에서만 평가되었습니다. 연구11,12,13,14,15, 특히 폐에서16,17. 그럼에도 불구하고 CF 폐 치료에서 자기 전달의 가능성은 분명합니다. Tan et al.(2020)은 "효율적인 자기 나노입자 폐 전달에 대한 개념 증명 연구는 CF 환자의 임상 결과를 개선하기 위한 미래의 CFTR 흡입 전략의 길을 열 것입니다"6라고 밝혔습니다.
자기장이 가해진 상태에서 기도 표면의 미세한 자성 입자의 거동은 시각화 및 연구가 어려워 제대로 이해되지 못하고 있습니다. 다른 연구에서 우리는 ASL 깊이¹⁸ 및 MCT 거동¹⁹,²⁰의 미세한 생체 내 변화를 비침습적으로 시각화하고 정량화하기 위해 싱크로트론 전파 기반 위상 대비 X선 영상(PB-PCXI) 방법을 개발하여 가스관 표면 수분 함량을 직접 측정하고 치료 효과의 조기 지표로 사용했습니다. 또한, 우리의 MCT 평가 방법은 PB-PCXI²¹를 사용하여 관찰 가능한 MCT 마커로 알루미나 또는 고굴절률 유리로 구성된 직경 10~35µm의 입자를 사용합니다. 두 기술 모두 미세입자를 포함한 다양한 유형의 입자 시각화에 적합합니다.
높은 공간적 및 시간적 해상도로 인해 PB-PCXI 기반 ASL 및 MCT 분석 기술은 생체 내에서 단일 및 대량 입자 행동의 역학과 패턴을 조사하는 데 적합하여 MP 유전자 전달 기술을 이해하고 최적화하는 데 도움이 됩니다. 여기서 사용하는 접근 방식은 SPring-8 BL20B2 빔라인을 사용한 연구에서 파생되었으며, 이 연구에서는 유전자 운반체 용량 동물 연구에서 관찰된 불균일한 유전자 발현 패턴을 설명하는 데 도움이 되도록 마우스의 비강 및 폐 기도에 가짜 벡터 용량을 전달한 후 유체 이동을 시각화했습니다. 3,4
본 연구의 목적은 싱크로트론 PB-PCXI를 이용하여 살아있는 쥐의 기관 내에서 다양한 종류의 미세입자(MP)의 생체 내 움직임을 시각화하는 것이었습니다. 이러한 PB-PCXI 영상 연구는 다양한 미세입자, 자기장 세기 및 위치가 미세입자의 움직임에 미치는 영향을 확인하기 위해 설계되었습니다. 외부에서 가해지는 자기장이 전달된 미세입자가 목표 부위에 머무르거나 이동하는 데 도움이 될 것이라는 가설을 세웠습니다. 또한, 이러한 연구를 통해 기관 내 침착 후 잔류하는 입자 수를 최대화하는 자석 구성을 확인할 수 있었습니다. 두 번째 연구에서는 이러한 최적 구성을 사용하여 생체 내에서 쥐의 기도에 저용량 미세입자(LV-MP)를 전달했을 때 나타나는 신호 전달 패턴을 확인하고자 했습니다. 이는 기도 표적화를 통해 LV-MP를 전달하면 저용량 신호 전달 효율이 향상될 것이라는 가정에 기반합니다.
모든 동물 실험은 애들레이드 대학교(M-2019-060 및 M-2020-022)와 SPring-8 싱크로트론 동물 윤리 위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 실험은 ARRIVE 가이드라인에 따라 진행되었습니다.
모든 X선 이미징은 일본 SPring-8 싱크로트론의 BL20XU 빔라인에서 이전에 설명된 것과 유사한 설정을 사용하여 수행되었습니다.21,22 간단히 설명하면, 실험 상자는 싱크로트론 저장 링에서 245m 떨어진 곳에 위치했습니다. 입자 이미징 연구에는 0.6m, 생체 내 이미징 연구에는 0.3m의 시료-검출기 거리를 사용하여 위상 대비 효과를 생성했습니다. 25keV의 단색 빔 에너지를 사용했습니다. 이미지는 sCMOS 검출기에 연결된 고해상도 X선 변환기(SPring-8 BM3)를 사용하여 획득했습니다. 변환기는 10µm 두께의 섬광체(Gd3Al2Ga3O12)를 사용하여 X선을 가시광선으로 변환한 다음, 10배율 현미경 대물렌즈(NA 0.3)를 통해 sCMOS 센서로 전달합니다. sCMOS 검출기는 Orca-Flash4.0(Hamamatsu Photonics, 일본)이며 어레이 크기는 다음과 같습니다. 2048 × 2048 픽셀 해상도와 6.5 × 6.5 µm의 원시 픽셀 크기를 사용했습니다. 이 설정을 통해 0.51 µm의 유효 등방성 픽셀 크기와 약 1.1 mm × 1.1 mm의 시야를 얻었습니다. 기도 내부와 외부의 자기 입자의 신호 대 잡음비를 최대화하고 호흡으로 인한 움직임 아티팩트를 최소화하기 위해 100 ms의 노출 시간을 선택했습니다. 생체 내 연구에서는 X선 경로에 고속 X선 셔터를 설치하여 노출 사이에 X선 빔을 차단함으로써 방사선량을 제한했습니다.
LV 캐리어는 BL20XU 이미징 챔버가 생물안전등급 2 인증을 받지 못했기 때문에 SPring-8 PB-PCXI 이미징 연구에 사용되지 않았습니다. 대신, 우리는 두 개의 상업 공급업체에서 다양한 크기, 재질, 철 농도 및 응용 분야를 포괄하는 특성이 잘 규명된 다양한 미세입자(MP)를 선택하여, 먼저 자기장이 유리 모세관 내에서, 그리고 그 다음에는 살아있는 기도에서 미세입자의 움직임에 미치는 영향을 이해하고자 했습니다. 표면에서 미세입자(MP)는 0.25~18μm의 크기를 가지며 다양한 재료로 만들어집니다(표 1 참조). 그러나 MP 내 자기 입자의 크기를 포함한 각 샘플의 구성은 알려져 있지 않습니다. 광범위한 MCT 연구(19, 20, 21, 23, 24)를 바탕으로, 예를 들어 연속 프레임을 빼서 MP 움직임의 가시성을 높이는 방식으로 5μm 크기의 MP도 기관 표면에서 관찰할 수 있을 것으로 예상합니다. 0.25μm 크기의 MP 하나는 이미징 장치의 해상도보다 작지만, PB-PCXI는 MP의 부피 대비와 MP가 침착된 후 표면 유체의 움직임을 감지할 수 있을 것으로 예상됩니다.
표 1의 각 MP에 대한 샘플은 내경 0.63mm의 20μl 유리 모세관(Drummond Microcaps, PA, USA)에 준비되었습니다. 미립자는 물에 용해되어 있으며, CombiMag 입자는 제조사 고유의 용액에 용해되어 있습니다. 각 튜브는 액체(약 11μl)로 절반 정도 채운 후 샘플 홀더에 놓았습니다(그림 1 참조). 유리 모세관은 이미징 박스의 샘플 스테이지에 수평으로 놓고, 액체의 가장자리가 샘플에 닿도록 위치시켰습니다. 잔류 자화가 1.17 테슬라인 직경 19mm(길이 28mm)의 니켈 쉘 희토류 네오디뮴 철 붕소(NdFeB) 자석(N35, 카탈로그 번호 LM1652, Jaycar Electronics, Australia)을 별도의 이동 스테이지에 부착하여 이미징 중 원격으로 위치를 변경할 수 있도록 했습니다. X선 이미지 획득은 자석이 샘플 위 약 30mm 위치에 있을 때 시작되며, 이미지는 4프레임/초의 속도로 획득됩니다. 둘째, 이미징 동안 자석을 유리 모세관 튜브에 가까이 (약 1mm 거리) 가져간 다음 튜브를 따라 이동시켜 자기장 세기와 위치의 영향을 평가했습니다.
시료의 xy축 이동 스테이지 위에 유리 모세관에 담긴 MP 시료를 포함하는 시험관 내 이미징 장치. X선 빔의 경로는 빨간색 점선으로 표시되어 있습니다.
MP의 시험관 내 가시성이 확인된 후, 그중 ​​일부를 야생형 암컷 알비노 위스타 쥐(약 12주령, 약 200g)에서 생체 내 시험했습니다. 0.24mg/kg 메데토미딘(Domitor®, Zenoaq, 일본), 3.2mg/kg 미다졸람(Dormicum®, Astellas Pharma, 일본) 및 4mg/kg 부토르파놀(Vetorphale®, Meiji Seika Pharma, 일본) 혼합물을 복강 내 주사하여 쥐를 마취했습니다. 마취 후, 기관 주변의 털을 제거하고 기관내 튜브(ET; 16Ga 정맥 카테터, Terumo BCT)를 삽입한 다음, 체온 유지를 위해 열 백이 들어 있는 맞춤 제작된 이미징 플레이트에 앙와위로 고정하여 이미징 준비를 했습니다. 이미징 플레이트는 기관을 정렬하기 위해 이미징 박스의 샘플 이동 스테이지에 약간 각도를 주어 부착했습니다. 그림 2a에서 보는 바와 같이 X선 이미지에서 수평 방향으로 나타납니다.
(a) SPring-8 이미징 박스 내 생체 내 이미징 설정. X선 빔의 경로는 빨간색 점선으로 표시되어 있다. (b,c) 기관에 대한 자석의 위치는 직교하여 장착된 두 대의 IP 카메라를 사용하여 원격으로 확인하였다. 화면 이미지의 왼쪽에는 머리를 고정하는 와이어 루프와 기관내 튜브 내에 위치한 전달 캐뉼라가 보인다.
100μl 유리 주사기를 사용하는 원격 제어식 주사기 펌프 시스템(UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL)을 30Ga 바늘을 통해 PE10 튜빙(외경 0.61mm, 내경 0.28mm)에 연결했습니다. ET 튜브를 삽입할 때 튜브 끝이 기관 내에서 정확한 위치에 있는지 확인하기 위해 튜브에 표시를 했습니다. 마이크로펌프를 사용하여 튜브 끝이 전달될 MP 샘플에 잠긴 상태에서 주사기 플런저를 당겼습니다. 샘플이 채워진 전달 튜브를 기관내 튜브에 삽입하여 튜브 끝이 예상되는 자기장의 가장 강한 부분에 위치하도록 했습니다. 이미지 획득은 Arduino 기반 타이밍 박스에 연결된 호흡 감지기를 사용하여 제어했으며, 모든 신호(예: 온도, 호흡, 셔터 개폐 및 이미지 획득)는 Powerlab 및 LabChart(AD Instruments, Sydney, Australia)를 사용하여 기록했습니다. 22. 인클로저에 접근할 수 없는 경우, 두 대의 IP 카메라(Panasonic BB-SC382)를 대략적인 위치에 설치하여 이미징을 수행했습니다. 서로 90° 각도를 이루며 영상 촬영 중 기관에 대한 자석의 위치를 ​​모니터링하는 데 사용되었습니다(그림 2b,c). 움직임으로 인한 아티팩트를 최소화하기 위해 호기말 유량 평탄기 동안 호흡마다 한 장의 이미지를 획득했습니다.
자석은 이미징 하우징 외부에서 원격으로 위치시킬 수 있는 2단계 장치에 부착됩니다. 다양한 자석 위치와 구성이 테스트되었으며, 여기에는 기관 위쪽으로 약 30° 각도로 장착하는 경우(그림 2a 및 3a 참조), 동물 위쪽과 아래쪽에 각각 자석을 배치하고 극이 서로 끌어당기도록 설정하는 경우(그림 3b), 동물 위쪽과 아래쪽에 각각 자석을 배치하고 극이 서로 밀어내도록 설정하는 경우(그림 3c), 그리고 기관 위쪽에 자석을 수직으로 배치하는 경우(그림 3d)가 포함됩니다. 동물과 자석을 설정하고 테스트할 MP를 주사기 펌프에 넣은 후, 이미지를 획득하면서 4μl/sec의 속도로 50μl를 주입합니다. 그런 다음 이미지를 계속 획득하면서 자석을 기관을 따라 앞뒤로 또는 측면으로 움직입니다.
생체 내 영상 촬영을 위한 자석 배치: (a) 기관 위쪽에 약 30° 각도로 자석 하나를 배치, (b) 서로 끌어당기도록 배치된 두 개의 자석, (c) 서로 밀어내도록 배치된 두 개의 자석, (d) 기관 위쪽에 수직으로 배치된 자석 하나를 배치. 관찰자는 입에서 기관을 통해 폐까지 내려다보았고, X선 빔은 쥐의 왼쪽을 통과하여 오른쪽으로 나갔다. 자석은 기도 길이를 따라 이동하거나 X선 빔 방향으로 기관 위쪽에서 좌우로 이동할 수 있다.
또한 호흡 및 심장 박동과 같은 교란 요인이 없는 상태에서 기도 내 입자의 가시성과 거동을 확인하고자 했습니다. 따라서 영상 촬영 기간이 끝난 후, 동물들을 펜토바르비탈 과다 투여(솜노펜틸, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; 약 65mg/kg 복강 주사)로 인도적으로 안락사시켰습니다. 일부 동물은 영상 촬영 플랫폼에 그대로 두었고, 호흡과 심장 박동이 멈춘 후 영상 촬영 과정을 반복했습니다. 기도 표면에 MP가 보이지 않는 경우에는 MP를 추가로 투여했습니다.
획득한 이미지는 플랫 필드 및 다크 필드 보정을 거친 후 MATLAB(R2020a, The Mathworks)으로 작성된 맞춤 스크립트를 사용하여 동영상(초당 20프레임, 호흡 속도에 따라 정상 속도의 15~25배)으로 합성되었습니다.
모든 LV 유전자 벡터 전달 연구는 애들레이드 대학교 실험동물연구시설에서 수행되었으며, SPring-8 실험 결과를 활용하여 자기장이 존재하는 환경에서 LV-MP를 전달하는 것이 생체 내 유전자 전달을 향상시킬 수 있는지 평가하는 것을 목표로 했습니다. MP와 자기장의 효과를 평가하기 위해 두 그룹의 동물을 처리했습니다. 한 그룹에는 자석을 부착한 상태에서 LV-MP를 투여했고, 다른 그룹에는 자석 없이 LV-MP를 투여한 대조군을 적용했습니다.
LV 유전자 벡터는 이전에 설명된 방법 25, 26을 사용하여 생성되었습니다. LacZ 벡터는 구성적 MPSV 프로모터(LV-LacZ)에 의해 구동되는 핵 국소화 베타-갈락토시다제 유전자를 발현하며, 이는 형질전환된 세포에서 폐 조직 전면 및 조직 절편에서 볼 수 있는 청색 반응 생성물을 생성합니다. 역가는 세포 배양에서 혈구계산기를 사용하여 LacZ 양성 세포 수를 수동으로 세어 TU/ml 단위로 계산했습니다. 캐리어는 -80°C에서 냉동 보존하고 사용 전에 해동한 다음, 1:1 비율로 혼합하고 배송 전에 최소 30분 동안 얼음 위에서 배양하여 CombiMag에 결합시킵니다.
정상 Sprague Dawley 쥐(n = 3/그룹, 약 2-3마리, 생후 1개월)를 0.4 mg/kg 메데토미딘(Domitor, Ilium, Australia)과 60 mg/kg 케타민(Ilium, Australia) 혼합액으로 복강 내 마취시킨 후, 16 Ga 정맥 카테터를 이용하여 비수술적 경구 카테터 삽입을 시행하였다. 기관 조직이 LV 신호전달을 받도록 하기 위해, 이전에 설명한 기계적 교란 프로토콜을 사용하여 기관 표면을 와이어 바스켓(N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115 -UDH, Cook Medical, USA)으로 축 방향으로 30초간 문질렀다. 교란 후 약 10분 뒤, ​​생물학적 안전 캐비닛에서 LV-MP를 기관 내 투여하였다.
본 실험에 사용된 자기장은 생체 내 X선 영상 연구와 유사한 방식으로 구성되었으며, 증류 스텐트 클립을 사용하여 동일한 자석을 기관 위에 고정했습니다(그림 4). 이전에 설명한 바와 같이 젤 팁이 있는 피펫을 사용하여 50μl 용량(25μl씩 2회)의 LV-MP를 기관에 주입했습니다(n=3마리). 대조군(n=3마리)은 자석을 사용하지 않고 동일한 LV-MP를 투여받았습니다. 주입이 완료되면 기관내 튜브에서 캐뉼라를 제거하고 동물의 기관내관을 발관했습니다. 자석은 10분 동안 제자리에 유지한 후 제거했습니다. 쥐에게 멜록시캄(1ml/kg)(Ilium, 호주)을 피하 주사한 후 아티파마졸 염산염(Antisedan, Zoetis, 호주) 1mg/kg을 복강 주사하여 마취를 해제했습니다. 쥐는 마취에서 완전히 회복될 때까지 따뜻하게 유지하고 관찰했습니다. 마취.
생물학적 안전 캐비닛 내의 LV-MP 전달 장치. 밝은 회색의 ET 튜브 루어 허브가 입 밖으로 돌출되어 있고, 사진에 보이는 피펫의 젤 팁이 ET 튜브를 통해 기관 내 원하는 깊이까지 삽입되어 있다.
LV-MP 투여 절차 후 1주일 뒤, 동물들을 100% CO2 흡입을 통해 인도적으로 안락사시키고, 표준 X-gal 처리법을 사용하여 LacZ 발현을 평가했습니다. 기관내 튜브 삽입으로 인한 기계적 손상이나 체액 저류가 분석에 포함되지 않도록 가장 꼬리쪽의 연골 고리 3개를 제거했습니다. 각 기관은 세로로 절단하여 분석을 위해 두 부분으로 나누고, Minutien 바늘(Fine Science Tools)을 사용하여 실리콘 고무(Sylgard, Dow Inc)가 담긴 접시에 고정하여 내강 표면을 관찰했습니다. 형질전환된 세포의 분포와 패턴은 DigiLite 카메라와 TCapture 소프트웨어(Tucsen Photonics, China)가 장착된 Nikon 현미경(SMZ1500)을 사용하여 정면 사진 촬영으로 확인했습니다. 이미지는 20배율(기관 전체 너비에 대한 최고 설정 포함)로 획득했으며, 기관 전체 길이를 단계적으로 촬영하여 각 이미지 간에 충분한 중첩이 이루어지도록 했습니다. 이미지 "스티칭". 각 기관의 이미지는 평면 모션 알고리즘을 사용하는 Image Composite Editor v2.0.3(Microsoft Research)을 이용하여 하나의 합성 이미지로 합성되었습니다. 각 동물의 기관 합성 이미지에서 LacZ 발현 영역은 이전에 설명한 바와 같이 0.35 < 색조 < 0.58, 채도 > 0.15, 명도 < 0.7 설정을 사용하여 자동화된 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)로 정량화되었습니다. 조직의 윤곽선을 따라 GIMP v2.10.24에서 각 합성 이미지에 대한 마스크를 수동으로 생성하여 조직 영역을 식별하고 기관 조직 외부에서 발생하는 오탐지를 방지했습니다. 각 동물의 모든 합성 이미지에서 염색된 영역을 합산하여 해당 동물의 총 염색 영역을 계산했습니다. 그런 다음 염색 영역을 총 마스크 영역으로 나누어 정규화된 영역을 생성했습니다.
각 기관을 파라핀에 포매한 후 5μm 두께로 절편을 제작하였다. 절편은 중성 패스트 레드로 5분간 대조염색한 후, Nikon Eclipse E400 현미경, DS-Fi3 카메라 및 NIS 요소 캡처 소프트웨어(버전 5.20.00)를 사용하여 이미지를 획득하였다.
모든 통계 분석은 GraphPad Prism v9(GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 수행되었습니다. 통계적 유의성은 p ≤ 0.05로 설정되었습니다. 정규성 검정은 Shapiro-Wilk 검정을 사용하였고, LacZ 염색의 차이는 독립표본 t-검정을 사용하여 평가하였습니다.
표 1에 기술된 6개의 미세입자(MP)를 PCXI를 사용하여 검사했으며, 가시성은 표 2에 기술되어 있습니다. 폴리스티렌 미세입자 2개(MP1 및 MP2; 각각 18μm 및 0.25μm)는 PCXI에서 보이지 않았지만, 나머지 샘플은 식별 가능했습니다(예는 그림 5 참조). MP3 및 MP4(10-15% Fe3O4; 각각 0.25μm 및 0.9μm)는 희미하게 보입니다. 테스트된 입자 중 가장 작은 입자를 포함하고 있음에도 불구하고 MP5(98% Fe3O4; 0.25μm)가 가장 뚜렷하게 나타났습니다. CombiMag 제품인 MP6는 식별하기 어렵습니다. 모든 경우에서 모세관에 평행하게 자석을 앞뒤로 이동시키면 미세입자 검출 능력이 크게 향상되었습니다. 자석이 모세관에서 멀어질수록 입자는 긴 줄 형태로 늘어났지만, 자석이 가까워지고 자기장 세기가 증가함에 따라 입자가 표면으로 이동하면서 입자 줄이 짧아졌습니다. 모세관 표면의 입자 밀도가 증가합니다(보충 영상 S1: MP4 참조). 반대로 자석을 모세관에서 제거하면 자기장 세기가 감소하고 미세 입자(MP)는 모세관 윗면에서 길게 뻗어 나가는 형태로 재배열됩니다(보충 영상 S2: MP4 참조). 자석이 움직임을 멈춘 후에도 입자는 평형 위치에 도달한 후에도 잠시 동안 계속 움직입니다. 미세 입자가 모세관 윗면을 향해 움직이거나 멀어지면서 자기 입자는 일반적으로 유체 속에서 파편을 끌어당깁니다.
PCXI 하에서 MP의 가시성은 샘플마다 크게 다릅니다. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 및 (d) MP6. 여기에 표시된 모든 이미지는 모세관 바로 위 약 10mm 위치에 자석을 놓고 촬영했습니다. 보이는 큰 원은 모세관에 갇힌 기포이며, 위상차 이미징의 흑백 가장자리 특징을 명확하게 보여줍니다. 빨간색 상자는 대비를 향상시킨 확대 영역입니다. 모든 그림에 있는 자석의 직경은 실제 크기와 다르며, 표시된 것보다 약 100배 더 큽니다.
자석이 모세관 상단을 따라 좌우로 이동함에 따라 MP 줄의 각도가 자석과 정렬되도록 변하여(그림 6 참조) 자기장 선이 나타납니다. MP3-5의 경우, 줄이 임계 각도에 도달하면 입자들이 모세관 상단 표면을 따라 끌려갑니다. 이로 인해 MP는 자기장이 가장 강한 곳 근처에서 더 큰 그룹으로 응집되는 경우가 많습니다(보충 영상 S3:MP5 참조). 이는 모세관 끝 부분 근처에서 이미징할 때 특히 두드러지게 나타나는데, 이로 인해 MP가 유체-공기 계면에서 응집되고 농축됩니다. MP3-5보다 식별하기 어려웠던 MP6의 입자는 자석이 모세관을 따라 이동할 때 끌려가지 않았지만, MP 줄이 분리되어 시야에 입자만 남았습니다(보충 영상 S4:MP6 참조). 어떤 경우에는 자석을 이미징 위치에서 멀리 이동시켜 인가된 자기장을 줄이면 남아 있는 MP가 중력에 의해 천천히 튜브 바닥으로 가라앉으면서 줄을 유지했습니다(보충 영상 S5 참조). MP3).
모세관 위에서 자석을 오른쪽으로 이동시키면서 MP 스트링의 각도가 변합니다. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 및 (d) MP6. 빨간색 상자는 대비를 강화한 확대 이미지입니다. 추가 영상은 이러한 정적 이미지에서는 시각화할 수 없는 중요한 입자 구조 및 동적 정보를 보여주므로 유익합니다.
실험 결과, 기관을 따라 자석을 천천히 앞뒤로 움직이면 생체 내 복잡한 움직임 속에서 미세입자(MP)를 시각화하는 데 도움이 된다는 것을 확인했습니다. 폴리스티렌 비드(MP1 및 MP2)는 모세관에서 관찰되지 않아 생체 내 실험은 수행하지 않았습니다. 나머지 네 개의 미세입자는 자석의 긴 축을 기관 위쪽으로 수직에서 약 30° 각도로 설정하여 생체 내 실험을 진행했습니다(그림 2b 및 3a 참조). 이러한 설정은 미세입자 사슬을 더 길게 만들어주었으며, 자석을 끝부분으로 설정했을 때보다 더 효과적이었습니다. MP3, MP4, MP6는 살아있는 동물의 기관에서 검출되지 않았습니다. 동물을 안락사시킨 후 쥐의 기도를 촬영했을 때, 주사기 펌프를 사용하여 추가적인 부피를 주입했음에도 불구하고 입자는 여전히 관찰되지 않았습니다. MP5는 산화철 함량이 가장 높았으며 유일하게 관찰된 입자였기 때문에 미세입자의 생체 내 거동을 평가하고 특성화하는 데 사용되었습니다.
미세입자(MP) 전달 중 기관 위에 자석을 올려놓았을 때, 모든 MP가 관찰된 것은 아니지만 많은 MP가 시야에 집중되었습니다. 기관으로 들어가는 입자는 인도적으로 희생시킨 동물에서 가장 잘 관찰됩니다. 그림 7과 보충 영상 S6: MP5는 기관 복측 표면에서 입자의 빠른 자기 포획 및 정렬을 보여주며, 이는 MP를 기관의 원하는 부위로 유도할 수 있음을 나타냅니다. MP 전달 후 기관을 따라 더 먼 쪽을 탐색했을 때, 일부 MP는 기관분기부 근처에서 발견되었는데, 이는 유체 전달 과정에서 최대 자기장 강도 영역을 통과하여 전달되었기 때문에 자기장 강도가 모든 MP를 수집하고 유지하기에 불충분했음을 시사합니다. 그럼에도 불구하고, 분만 후 MP 농도는 영상 영역 주변에서 더 높게 나타났으며, 이는 적용된 자기장 강도가 가장 높은 기도 영역에 많은 MP가 남아 있음을 나타냅니다.
(a) MP5를 최근 안락사시킨 쥐의 기관에 투여하기 전과 (b) 투여 후의 이미지입니다. 자석은 이미징 영역 바로 위에 위치했습니다. 이미징 영역은 두 개의 연골 고리 사이에 있습니다. MP 투여 전에는 기도에 약간의 체액이 있습니다. 빨간색 상자는 대비를 높여 확대한 영역입니다. 이 이미지는 보충 영상 S6:MP5에 나오는 영상에서 가져온 것입니다.
생체 내에서 기관을 따라 자석을 이동시키면 모세혈관에서 관찰되는 것과 유사하게 기도 표면 내에서 미세입자(MP) 사슬의 각도가 변하는 것을 확인했습니다(그림 8 및 보충 영상 S7:MP5 참조). 그러나 본 연구에서는 모세혈관에서처럼 살아있는 기도 표면을 따라 미세입자를 끌어당길 수는 없었습니다. 어떤 경우에는 자석이 좌우로 움직일 때 미세입자 사슬이 길어지기도 했습니다. 흥미롭게도, 자석을 기관을 따라 세로 방향으로 이동시킬 때 입자 사슬이 표면 유체층의 깊이를 변화시키는 것처럼 보였고, 자석을 바로 머리 위로 이동시키고 입자 사슬을 수직 위치로 회전시킬 때 사슬이 확장되는 것을 발견했습니다(보충 영상 S7 참조). (MP5 0:09, 오른쪽 하단 참조). 자석을 기관 상단에서 측면으로 이동시켰을 때(즉, 기관의 길이를 따라 이동하는 것이 아니라 동물의 왼쪽이나 오른쪽으로 이동시켰을 때) 특징적인 움직임 패턴이 변했습니다. 입자들은 움직이는 동안에도 여전히 명확하게 보였지만, 자석을 기관에서 제거하자 입자 사슬의 끝부분이 보이게 되었습니다(보충 영상 S8:MP5, 0:08부터 참조). 이는 유리 모세관에 자기장을 가했을 때 관찰한 MP의 행동과 일치합니다.
마취된 생쥐의 기관 내 MP5를 보여주는 예시 이미지입니다. (a) 자석을 사용하여 기관의 위쪽과 왼쪽에서 이미지를 획득한 후, (b) 자석을 오른쪽으로 이동시킨 후의 이미지입니다. 빨간색 상자는 대비를 향상시킨 확대 영역입니다. 이 이미지들은 보충 영상 S7:MP5에 나타난 영상에서 발췌한 것입니다.
두 개의 극이 기관 위아래로 남북 방향으로 배치되었을 때(즉, 서로 끌어당기도록, 그림 3b), MP 현은 더 길어 보였고 기관의 등쪽 표면이 아닌 측벽에 위치했습니다(보충 영상 S9:MP5 참조). 그러나 이중 자석 장치를 사용했을 때는 액체 주입 후 단일 자석 장치를 사용했을 때와 달리 한 위치(즉, 기관의 등쪽 표면)에 입자가 고농도로 집중되는 현상이 관찰되지 않았습니다. 그런 다음 하나의 자석을 서로 밀어내도록 극을 반전시켜 배치했을 때(그림 3c), 주입 후 시야에 보이는 입자 수는 증가하지 않는 것으로 나타났습니다. 두 가지 이중 자석 구성 모두 자석을 각각 끌어당기거나 밀어내는 높은 자기장 세기 때문에 설치가 어렵습니다. 따라서 설정을 변경하여 기도에 평행하지만 기도를 90도 각도로 통과하는 단일 자석을 배치하여 자기장 선이 기관 벽을 직각으로 가로지르도록 했습니다. (그림 3d)는 측벽에서 입자 응집 현상을 관찰할 수 있는지 확인하기 위해 설계된 방향입니다. 그러나 이 구성에서는 MP 축적이나 자석의 움직임이 식별되지 않았습니다. 이러한 모든 결과를 바탕으로 생체 내 유전자 운반체 연구를 위해 단일 자석, 30도 방향 구성(그림 3a)을 선택했습니다.
인도적인 방법으로 동물을 안락사시킨 직후 반복적으로 영상을 촬영했을 때, 조직의 움직임으로 인한 혼란이 없어 연골 사이의 명확한 자기장에서 더 가늘고 짧은 입자 선들을 식별할 수 있었으며, 이 선들은 자석의 이동 방향에 따라 "흔들리는" 것처럼 보였습니다. 그럼에도 불구하고, MP6 입자의 존재와 움직임은 여전히 ​​명확하게 관찰할 수 없었습니다.
LV-LacZ 역가는 1.8 × 10⁸ TU/ml였으며, CombiMag MP(MP6)와 1:1로 혼합한 후, 동물에게 9 × 10⁷ TU/ml의 LV 운반체(즉, 4.5 × 10⁶ TU/쥐) 50 μl를 기관 내 투여했습니다. 이 연구에서는 분만 중 자석을 이동시키는 대신 자석을 한 위치에 고정하여 LV 전달이 (a) 자기장이 없는 상태에서 벡터 전달에 비해 개선될 수 있는지, 그리고 (b) 기도 세포가 상기도의 자기 표적 영역으로 집중될 수 있는지를 확인했습니다.
자석의 존재와 LV 벡터와 결합된 CombiMag의 사용은 표준 LV 벡터 전달 프로토콜과 마찬가지로 동물 건강에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 기계적 자극을 가한 기관 부위의 정면 이미지(보충 그림 1)는 자석이 존재할 때 LV-MP로 치료받은 동물 그룹에서 신호 전달 수준이 유의미하게 더 높았음을 보여줍니다(그림 9a). 대조군에서는 소량의 파란색 LacZ 염색만 나타났습니다(그림 9b). 정규화된 X-Gal 염색 영역을 정량화한 결과, 자기장이 존재하는 상태에서 LV-MP를 투여했을 때 약 6배의 개선 효과가 나타났습니다(그림 9c).
LV-MP에 의한 기관 내 신호 전달을 보여주는 합성 이미지 예시: (a) 자기장이 있는 경우, (b) 자기장이 없는 경우. (c) 자기장을 사용했을 때 기관 내 정규화된 LacZ 신호 전달 면적이 통계적으로 유의미하게 향상됨(*p = 0.029, t-검정, 그룹당 n = 3, 평균 ± 표준오차).
중성 속염 적색 염색 단면(보충 그림 2에 예시 제시)에서 LacZ로 염색된 세포들이 이전에 보고된 것과 유사한 패턴과 위치에 존재하는 것이 관찰되었다.
기도 유전자 치료의 핵심 과제는 관심 영역에 운반체 입자를 정확하게 국소화하고, 기류와 활발한 점액 제거가 존재하는 움직이는 폐에서 높은 수준의 신호 전달 효율을 달성하는 것입니다. 낭포성 섬유증(CF) 기도 질환 치료를 위해 설계된 LV 운반체의 경우, 전도성 기도 내에서 운반체 입자의 체류 시간을 늘리는 것이 지금까지 달성하기 어려운 목표였습니다. Castellani 등이 지적했듯이, 신호 전달을 개선하기 위해 자기장을 사용하는 것은 전기천공법과 같은 다른 유전자 전달 방법에 비해 단순성, 비용 효율성, 국소 전달, 효율 증가, 배양 시간 단축, 그리고 더 적은 운반체 용량 등의 장점을 가질 수 있습니다.¹⁰ 그러나 외부 자기력의 영향 하에서 기도 내 자기 입자의 생체 내 침착 및 거동은 아직 설명된 적이 없으며, 실제로 이 방법을 사용하여 살아있는 기도에서 유전자 발현 수준을 향상시키는 것이 가능한지 여부도 생체 내에서 입증된 적이 없습니다.
우리의 체외 싱크로트론 PCXI 실험 결과, 폴리스티렌 미세입자를 제외한 모든 입자가 사용된 이미징 장비에서 관찰되었습니다. 자기장이 존재할 때, 미세입자는 입자의 종류와 자기장의 세기(즉, 자석의 근접성 및 움직임)에 따라 길이가 달라지는 사슬 형태를 이룹니다. 그림 10에서 볼 수 있듯이, 우리가 관찰한 사슬은 각 입자가 자화되어 자체적인 국소 자기장을 유도함으로써 형성됩니다. 이러한 개별 자기장은 다른 유사한 입자들을 응집시키고 연결하여, 다른 입자들의 국소적인 인력과 척력에 의한 국소적인 힘으로 인해 사슬 형태의 움직임을 만들어냅니다.
(a,b) 유체로 채워진 모세관 내부에서 생성된 입자열과 (c,d) 공기로 채워진 기관 내부에서 생성된 입자열을 보여주는 모식도. 모세관과 기관은 실제 크기에 맞춰 그려진 것이 아님에 유의하십시오. (a) 패널에는 사슬 형태로 배열된 Fe3O4 입자를 포함하는 MP에 대한 설명도 포함되어 있습니다.
자석을 모세관 위로 이동시켰을 때, Fe3O4를 함유한 MP3-5의 경우 입자 사슬의 각도가 임계값에 도달한 후 입자 사슬은 원래 위치에 머물지 않고 표면을 따라 새로운 위치로 이동했습니다. 이러한 현상은 유리 모세관 표면이 충분히 매끄러워 입자 사슬의 이동이 가능하기 때문에 발생하는 것으로 추정됩니다. 흥미롭게도 MP6(CombiMag)는 이러한 거동을 보이지 않았는데, 이는 입자 크기가 더 작거나, 코팅이나 표면 전하가 다르거나, 또는 특수 운반 유체가 입자의 이동 능력에 영향을 미쳤기 때문일 수 있습니다. CombiMag 입자의 이미지 대비 또한 약한데, 이는 유체와 입자의 밀도가 유사하여 서로 쉽게 이동하지 않을 수 있음을 시사합니다. 자석이 너무 빠르게 움직이면 입자가 끼일 수도 있는데, 이는 자기장 세기가 유체 내 입자 사이의 마찰력을 항상 극복할 수 없음을 나타냅니다. 따라서 자기장 세기와 자석과 목표 영역 사이의 거리가 매우 중요하다는 것은 놀라운 일이 아닐 것입니다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 자석은 목표 영역을 통과하는 많은 미세입자를 포획할 수 있지만, 모든 미세입자를 포획하는 것은 어려울 수 있음을 시사합니다. 자석을 이용하면 CombiMag 입자를 기관 표면을 따라 이동시킬 수 있다는 것을 확인했습니다. 따라서 생체 내 LV-MP 연구에서는 기도 나무의 특정 부위를 물리적으로 표적화하기 위해 정적 자기장을 활용해야 한다고 결론지었습니다.
체내에 입자가 주입되면 복잡하게 움직이는 신체 조직 속에서 입자를 식별하기 어렵지만, 기관 위쪽에서 자석을 수평으로 이동시켜 미세입자(MP) 가닥을 "흔들면" 검출 능력이 향상되었습니다. 생체 내 영상 촬영도 가능하지만, 동물을 인도적으로 안락사시킨 후에 입자의 움직임을 관찰하는 것이 더 쉽습니다. 자석을 영상 촬영 영역 위에 위치시켰을 때 미세입자 농도는 일반적으로 해당 위치에서 가장 높았지만, 일부 입자는 기관의 더 먼 곳에서도 발견되었습니다. 시험관 내 연구와는 달리, 자석을 이동시켜도 입자를 기관을 따라 끌어당길 수는 없습니다. 이러한 결과는 기관 표면을 덮고 있는 점액이 흡입된 입자를 처리하는 일반적인 방식, 즉 점액에 입자를 가두어 섬모 운동에 의해 제거하는 방식과 일치합니다.
우리는 기관 위아래에 자석을 사용하여 인력을 가하면(그림 3b) 한 지점에 고도로 집중된 자기장이 아닌 보다 균일한 자기장이 생성되어 입자의 분포가 더욱 균일해질 수 있다는 가설을 세웠습니다. 그러나 예비 연구에서는 이 가설을 뒷받침하는 명확한 증거를 찾지 못했습니다. 마찬가지로, 자석 두 개를 서로 밀어내도록 배치해도(그림 3c) 영상 영역에 입자가 더 많이 침착되지 않았습니다. 이 두 가지 결과는 이중 자석 배치가 미세입자(MP) 표적화의 국소 제어를 크게 향상시키지 못하며, 결과적으로 발생하는 강한 자기력을 조절하기 어려워 실용성이 떨어진다는 것을 보여줍니다. 또한, 자석을 기관 위쪽과 관통하는 방향으로 배치해도(그림 3d) 영상 영역에 잔류하는 입자 수가 증가하지 않았습니다. 이러한 다른 배치 방식들은 침착 영역 내 자기장 강도를 낮추기 때문에 효과적이지 않을 수 있습니다. 따라서, 30도 각도로 배치한 단일 자석 구성(그림 3a)이 생체 내 실험에 가장 쉽고 효율적인 방법으로 간주됩니다.
LV-MP 연구는 LV 벡터를 CombiMag와 결합하여 자기장 존재 하에 물리적 교란을 가한 후 전달했을 때, 대조군에 비해 기관 내 유전자 전달 수준이 유의미하게 증가했음을 보여주었습니다. 싱크로트론 영상 연구와 LacZ 분석 결과를 바탕으로, 자기장은 기관 내 LV를 보존하고 폐 깊숙이 침투하는 벡터 입자의 수를 줄이는 데 효과적인 것으로 나타났습니다. 이러한 표적화 개선은 전달되는 유전자 수, 표적 외 유전자 전달, 염증 및 면역 관련 부작용, 그리고 유전자 운반체 비용을 줄이면서 효능을 향상시킬 수 있습니다. 특히, 제조사에 따르면 CombiMag는 다른 바이러스 벡터(예: AAV) 및 핵산을 포함한 다른 유전자 전달 방법과 함께 사용할 수 있습니다.