از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
ناقل‌های ژنی برای درمان بیماری ریوی فیبروز کیستیک باید مجاری هوایی رسانا را هدف قرار دهند زیرا انتقال محیطی ریه فایده درمانی ندارد. راندمان انتقال ویروسی مستقیماً با زمان اقامت ناقل مرتبط است. با این حال، مایعات انتقال مانند حامل‌های ژن به طور طبیعی در طول دم به داخل آلوئول‌ها منتشر می‌شوند و ذرات درمانی از هر شکلی به سرعت توسط انتقال موکوسیلیاری پاک می‌شوند. طولانی کردن زمان اقامت ناقل‌های ژنی در مجاری هوایی مهم است اما دستیابی به آن دشوار است. ذرات مغناطیسی متصل به حامل ژن که می‌توانند به سطح مجاری هوایی هدایت شوند، می‌توانند هدف‌گیری منطقه‌ای را بهبود بخشند. با توجه به چالش‌های تجسم درون‌تنی، رفتار چنین ذرات مغناطیسی کوچکی روی سطح مجاری هوایی در حضور میدان مغناطیسی اعمال شده به خوبی درک نشده است. هدف از این مطالعه استفاده از تصویربرداری سینکروترون برای تجسم حرکت درون‌تنی یک سری ذرات مغناطیسی در نای موش‌های بی‌هوش شده برای بررسی دینامیک و الگوهای رفتار ذرات منفرد و توده‌ای در داخل بدن بود. سپس ما همچنین ارزیابی کردیم که آیا انتقال ذرات مغناطیسی لنتی‌ویروسی در حضور میدان مغناطیسی، راندمان انتقال را در موش صحرایی افزایش می‌دهد یا خیر. نای. تصویربرداری با اشعه ایکس سینکروترون، رفتار ذرات مغناطیسی را در میدان‌های مغناطیسی ثابت و متحرک در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) و درون‌تنی (in vivo) نشان می‌دهد. ذرات را نمی‌توان به راحتی با آهنربا در امتداد سطح راه هوایی زنده کشید، اما در حین انتقال، رسوبات در میدان دیدی که میدان مغناطیسی در آن قوی‌ترین است، متمرکز می‌شوند. همچنین، هنگامی که ذرات مغناطیسی لنتی‌ویروسی در حضور میدان مغناطیسی تحویل داده شدند، راندمان انتقال شش برابر افزایش یافت. در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که ذرات مغناطیسی لنتی‌ویروسی و میدان‌های مغناطیسی ممکن است رویکردهای ارزشمندی برای بهبود هدف‌گیری ناقل ژن و افزایش سطح انتقال در راه‌های هوایی رسانا در درون‌تنی (in vivo) باشند.
فیبروز کیستیک (CF) ناشی از تغییر در یک ژن واحد به نام تنظیم‌کننده هدایت غشایی CF (CFTR) است. پروتئین CFTR یک کانال یونی است که در بسیاری از سلول‌های اپیتلیال در سراسر بدن، از جمله مجاری هوایی رسانا، که محل اصلی پاتوژنز CF است، وجود دارد. نقص‌های CFTR منجر به انتقال غیرطبیعی آب، کم‌آب شدن سطح مجاری هوایی و کاهش عمق لایه مایع سطحی مجاری هوایی (ASL) می‌شود. این امر همچنین توانایی سیستم انتقال موکوسیلیاری (MCT) را برای پاکسازی ذرات استنشاقی و عوامل بیماری‌زا از مجاری هوایی مختل می‌کند. هدف ما توسعه یک ژن‌درمانی لنتی‌ویروسی (LV) برای ارائه نسخه صحیح ژن CFTR و بهبود ASL، MCT و سلامت ریه و ادامه توسعه فناوری‌های جدید قادر به اندازه‌گیری این پارامترها در داخل بدن است.
وکتورهای LV یکی از کاندیداهای اصلی برای ژن‌درمانی راه هوایی CF هستند، عمدتاً به این دلیل که می‌توانند ژن درمانی را به طور دائم در سلول‌های پایه راه هوایی (سلول‌های بنیادی راه هوایی) ادغام کنند. این مهم است زیرا آن‌ها می‌توانند با تمایز به سلول‌های سطحی راه هوایی مرتبط با CF که از نظر ژن اصلاح شده‌اند، هیدراتاسیون طبیعی و پاکسازی مخاط را بازیابی کنند و در نتیجه مزایای مادام‌العمر داشته باشند. وکتورهای LV باید به سمت راه هوایی هدایت شوند، زیرا بیماری ریوی CF از آنجا شروع می‌شود. انتقال وکتور به عمق بیشتر ریه ممکن است منجر به انتقال آلوئولی شود، اما این هیچ فایده درمانی در CF ندارد. با این حال، مایعاتی مانند حامل‌های ژن به طور طبیعی پس از انتقال، پس از دم به آلوئول‌ها مهاجرت می‌کنند3،4 و ذرات درمانی به سرعت توسط MCT به داخل حفره دهان منتقل می‌شوند. راندمان انتقال LV به طور مستقیم با مدت زمانی که وکتور در کنار سلول‌های هدف باقی می‌ماند تا جذب سلولی را ممکن سازد - "زمان اقامت"5 - مرتبط است که به راحتی توسط جریان هوای منطقه‌ای معمولی و همچنین جذب هماهنگ مخاط ذرات و MCT کاهش می‌یابد. برای CF، توانایی طولانی کردن زمان اقامت LV در راه هوایی برای دستیابی به سطوح بالای ... مهم است. انتقال در این منطقه، اما تاکنون چالش برانگیز بوده است.
برای غلبه بر این مانع، ما پیشنهاد می‌کنیم که ذرات مغناطیسی LV (MPs) می‌توانند به دو روش مکمل کمک کنند. اول، می‌توان آنها را به صورت مغناطیسی به سطح راه هوایی هدایت کرد تا هدف‌گیری را بهبود بخشیده و به ذرات حامل ژن کمک کند تا در ناحیه مورد نظر راه هوایی قرار گیرند؛ و ASL) برای حرکت به لایه سلولی 6. MPs به طور گسترده به عنوان حامل‌های دارورسانی هدفمند مورد استفاده قرار گرفته‌اند، زمانی که به آنتی‌بادی‌ها، داروهای شیمی‌درمانی یا سایر مولکول‌های کوچک که به غشای سلولی متصل می‌شوند یا به گیرنده‌های سطح سلولی مربوطه متصل می‌شوند و در محل تومور در حضور الکتریسیته ساکن تجمع می‌یابند، متصل می‌شوند. میدان‌های مغناطیسی برای درمان سرطان ۷. سایر تکنیک‌های «فوق حرارتی» با هدف گرم کردن MPها هنگامی که در معرض میدان‌های مغناطیسی نوسانی قرار می‌گیرند، سلول‌های تومور را از بین می‌برند. اصل ترانسفکشن مغناطیسی، که در آن از یک میدان مغناطیسی به عنوان عامل ترانسفکشن برای افزایش انتقال DNA به سلول‌ها استفاده می‌شود، معمولاً در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از طیف وسیعی از ناقل‌های ژنی غیر ویروسی و ویروسی برای رده‌های سلولی دشوار برای ترانسفکشن استفاده می‌شود. اثربخشی ترانسفکشن مغناطیسی LV با انتقال آزمایشگاهی LV-MPها به یک رده سلولی اپیتلیال برونش انسانی در حضور یک میدان مغناطیسی ایستا، اثبات شده است که راندمان ترانسفکشن را در مقایسه با ناقل LV به تنهایی ۱۸۶ برابر افزایش می‌دهد. LV-MP همچنین در یک مدل CF آزمایشگاهی اعمال شده است، که در آن ترانسفکشن مغناطیسی، ترانسفکشن LV را در کشت‌های رابط هوا-مایع در حضور خلط CF 20 برابر افزایش داد10. با این حال، ترانسفکشن مغناطیسی اندام‌ها در داخل بدن توجه نسبتاً کمی را به خود جلب کرده است و فقط در چند حیوان ارزیابی شده است. مطالعات11،12،13،14،15، به ویژه در ریه‌ها16،17. با این وجود، فرصت‌های ترانسفکشن مغناطیسی در درمان ریه CF واضح است. تان و همکارانش (2020) اظهار داشتند که "یک مطالعه اثبات مفهوم از تحویل ریوی نانوذرات مغناطیسی کارآمد، راه را برای استراتژی‌های استنشاقی CFTR در آینده برای بهبود پیامدهای بالینی در بیماران CF هموار می‌کند".6
رفتار ذرات مغناطیسی کوچک روی سطوح مجاری هوایی در حضور میدان مغناطیسی اعمال‌شده، به سختی قابل مشاهده و مطالعه است و بنابراین به خوبی درک نشده است. در مطالعات دیگر، ما یک روش تصویربرداری اشعه ایکس با کنتراست فاز مبتنی بر انتشار سینکروترون (PB-PCXI) را برای تجسم و تعیین کمیت تغییرات جزئی در عمق ASL18 و رفتار MCT19،20 به صورت غیرتهاجمی در داخل بدن توسعه دادیم تا مستقیماً هیدراتاسیون سطح کانال گاز را اندازه‌گیری کرده و به عنوان شاخص اولیه اثربخشی درمان استفاده کنیم. علاوه بر این، روش ارزیابی MCT ما از ذرات با قطر 10 تا 35 میکرومتر متشکل از آلومینا یا شیشه با ضریب شکست بالا به عنوان نشانگرهای MCT قابل مشاهده با استفاده از PB-PCXI21 استفاده می‌کند. هر دو تکنیک برای تجسم طیف وسیعی از انواع ذرات، از جمله MP، مناسب هستند.
با توجه به وضوح مکانی و زمانی بالای آن، تکنیک‌های تجزیه و تحلیل ASL و MCT مبتنی بر PB-PCXI ما برای بررسی دینامیک و الگوهای رفتار ذرات منفرد و حجیم در داخل بدن (in vivo) بسیار مناسب هستند تا به ما در درک و بهینه‌سازی تکنیک‌های انتقال ژن MP کمک کنند. رویکردی که ما در اینجا به کار می‌بریم، از مطالعات ما با استفاده از خط پرتو SPring-8 BL20B2 گرفته شده است، که در آن ما حرکت سیال را پس از انتقال دوز بردار ساختگی به مجاری هوایی بینی و ریوی موش‌ها تجسم کردیم تا به توضیح الگوهای بیان ژن غیر یکنواخت مشاهده شده در مطالعات حیوانی دوز حامل ژن ما کمک کند (3،4).
هدف از این مطالعه، استفاده از سینکروترون PB-PCXI برای تجسم حرکات درون‌تنی مجموعه‌ای از MPها در نای موش‌های زنده بود. این مطالعات تصویربرداری PB-PCXI برای آزمایش طیف وسیعی از MPها، قدرت میدان مغناطیسی و مکان‌ها برای تعیین تأثیر آنها بر حرکت MPها طراحی شدند. ما فرض کردیم که یک میدان مغناطیسی خارجی اعمال شده به MPهای منتقل شده کمک می‌کند تا در ناحیه هدف باقی بمانند یا حرکت کنند. این مطالعات همچنین به ما امکان داد تا پیکربندی‌های مغناطیسی را شناسایی کنیم که تعداد ذرات باقی مانده در نای را پس از رسوب به حداکثر می‌رسانند. در سری دوم مطالعات، ما بر اساس این فرض که تحویل LV-MPها در زمینه هدف‌گیری راه هوایی منجر به بهبود راندمان انتقال LV می‌شود، تلاش کردیم از این پیکربندی بهینه برای نشان دادن الگوی انتقال ناشی از انتقال درون‌تنی LV-MPها به راه هوایی موش استفاده کنیم.
تمام مطالعات حیوانی طبق پروتکل‌های تأیید شده توسط دانشگاه آدلاید (M-2019-060 و M-2020-022) و کمیته اخلاق حیوانات سینکروترون SPring-8 انجام شد. آزمایش‌ها طبق دستورالعمل‌های ARRIVE انجام شد.
تمام تصویربرداری‌های اشعه ایکس در خط پرتو BL20XU در سینکروترون SPring-8 در ژاپن، با استفاده از چیدمانی مشابه آنچه قبلاً شرح داده شد، انجام شد. به طور خلاصه، جعبه آزمایشی در فاصله 245 متری از حلقه ذخیره‌سازی سینکروترون قرار داشت. فاصله نمونه تا آشکارساز 0.6 متر برای مطالعات تصویربرداری ذرات و 0.3 متر برای مطالعات تصویربرداری درون تنی برای ایجاد اثرات کنتراست فاز استفاده می‌شود. از انرژی پرتو تک‌رنگ 25 کیلوالکترون‌ولت استفاده شد. تصاویر با استفاده از یک مبدل اشعه ایکس با وضوح بالا (SPring-8 BM3) متصل به یک آشکارساز sCMOS گرفته شدند. مبدل، اشعه ایکس را با استفاده از یک سوسوزن با ضخامت 10 میکرومتر (Gd3Al2Ga3O12) به نور مرئی تبدیل می‌کند، که سپس با استفاده از یک میکروسکوپ شیئی × 10 (NA 0.3) به یک حسگر sCMOS هدایت می‌شود. آشکارساز sCMOS، Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics، ژاپن) با اندازه آرایه بود. با ابعاد 2048 × 2048 پیکسل و اندازه پیکسل خام 6.5 × 6.5 میکرومتر. این چیدمان، اندازه پیکسل ایزوتروپیک مؤثر 0.51 میکرومتر و میدان دید تقریباً 1.1 میلی‌متر × 1.1 میلی‌متر را ارائه می‌دهد. طول نوردهی 100 میلی‌ثانیه انتخاب شد تا نسبت سیگنال به نویز ذرات مغناطیسی داخل و خارج از مجاری هوایی به حداکثر برسد و در عین حال مصنوعات حرکتی ناشی از تنفس به حداقل برسد. برای مطالعات درون‌تنی، یک شاتر سریع اشعه ایکس در مسیر اشعه ایکس قرار داده شد تا با مسدود کردن پرتو اشعه ایکس بین نوردهی‌ها، دوز تابش را محدود کند.
حامل LV در هیچ یک از مطالعات تصویربرداری SPring-8 PB-PCXI استفاده نشد زیرا محفظه تصویربرداری BL20XU دارای گواهینامه ایمنی زیستی سطح 2 نیست. در عوض، ما طیف وسیعی از MP های شناخته شده را از دو تأمین کننده تجاری - که طیف وسیعی از اندازه ها، مواد، غلظت آهن و کاربردها را پوشش می دهند - انتخاب کردیم - ابتدا برای درک اینکه چگونه میدان های مغناطیسی بر حرکت MP در مویرگ های شیشه ای و سپس در مجاری هوایی زنده تأثیر می گذارند. روی سطح. اندازه MPها از 0.25 تا 18 میکرومتر متغیر است و از مواد متنوعی ساخته شده‌اند (به جدول 1 مراجعه کنید)، اما ترکیب هر نمونه، از جمله اندازه ذرات مغناطیسی درون MP، ناشناخته است. بر اساس مطالعات گسترده MCT ما 19، 20، 21، 23، 24، انتظار داریم MPهایی به کوچکی 5 میکرومتر را بتوان روی سطح راه هوایی نای مشاهده کرد، به عنوان مثال با کم کردن فریم‌های متوالی برای مشاهده افزایش دید حرکت MP. یک MP با اندازه 0.25 میکرومتر کوچکتر از وضوح دستگاه تصویربرداری است، اما انتظار می‌رود PB-PCXI کنتراست حجمی آنها و حرکت سیال سطحی که پس از رسوب روی آن رسوب می‌کنند را تشخیص دهد.
نمونه‌های مربوط به هر MP در جدول 1 در لوله‌های مویین شیشه‌ای 20 میکرولیتری (Drummond Microcaps، پنسیلوانیا، ایالات متحده) با قطر داخلی 0.63 میلی‌متر تهیه شدند. ذرات کروی در آب موجود هستند، در حالی که ذرات CombiMag در مایع اختصاصی سازنده موجود هستند. هر لوله تا نیمه با مایع پر شده است (تقریباً 11 میکرولیتر) و روی نگهدارنده نمونه قرار داده شده است (شکل 1 را ببینید). لوله‌های مویین شیشه‌ای به ترتیب به صورت افقی روی صفحه نمونه در جعبه تصویربرداری قرار داده شدند و لبه‌های مایع را در موقعیت مناسب قرار دادند. یک آهنربای پوسته نیکلی خاکی کمیاب نئودیمیوم آهن بور (NdFeB) با قطر 19 میلی‌متر (طول 28 میلی‌متر) (N35، شماره کاتالوگ LM1652، Jaycar Electronics، استرالیا) با مغناطش باقیمانده 1.17 تسلا به یک صفحه انتقال جداگانه متصل شد تا موقعیت آن را از راه دور در حین تصویربرداری تغییر دهد. گرفتن تصویر با اشعه ایکس زمانی شروع می‌شود که آهنربا تقریباً 30 میلی‌متر بالاتر از نمونه قرار گیرد و تصاویر با سرعت 4 ثانیه گرفته می‌شوند. فریم در ثانیه. در طول تصویربرداری، آهنربا به لوله مویین شیشه‌ای (حدود ۱ میلی‌متر فاصله) نزدیک شد و سپس در امتداد لوله حرکت داده شد تا اثرات قدرت و موقعیت میدان ارزیابی شود.
چیدمان تصویربرداری آزمایشگاهی حاوی نمونه‌های MP در لوله‌های مویین شیشه‌ای روی صفحه انتقال نمونه xy. مسیر پرتو ایکس با خط چین قرمز مشخص شده است.
پس از مشخص شدن قابلیت مشاهده میکروپارتیکل‌ها در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)، زیرمجموعه‌ای از آنها به صورت in vivo در موش‌های صحرایی ماده آلبینو ویستار وحشی (حدود ۱۲ هفته، حدود ۲۰۰ گرم) آزمایش شدند. 0.24 میلی‌گرم بر کیلوگرم مدتومیدین (Domitor®، Zenoaq، ژاپن)، 3.2 میلی‌گرم بر کیلوگرم میدازولام (Dormicum®، Astellas Pharma، ژاپن) و 4 میلی‌گرم بر کیلوگرم بوتورفانول (Vetorphale®، Meiji Seika). موش‌ها با تزریق داخل صفاقی (با مخلوطی از Pharma، ژاپن) بی‌هوش شدند. پس از بیهوشی، آنها با برداشتن کرک‌های اطراف نای، قرار دادن یک لوله تراشه (ET؛ کانولای داخل وریدی ۱۶ گالیوم، Terumo BCT) و بی‌حرکت کردن آنها به پشت روی یک صفحه تصویربرداری سفارشی حاوی یک کیسه حرارتی برای حفظ دمای بدن، برای تصویربرداری آماده شدند. سپس صفحه تصویربرداری با زاویه کمی به مرحله انتقال نمونه در جعبه تصویربرداری متصل شد تا نای به صورت افقی در یک راستا قرار گیرد. تصویر اشعه ایکس، همانطور که در شکل 2a نشان داده شده است.
(الف) تنظیمات تصویربرداری درون‌تنی در جعبه تصویربرداری SPring-8، مسیر پرتو اشعه ایکس با خط چین قرمز مشخص شده است. (ب، ج) مکان‌یابی آهنربا روی نای از راه دور با استفاده از دو دوربین IP که به صورت قائم نصب شده‌اند، انجام شد. در سمت چپ تصویر صفحه، حلقه سیمی که سر را نگه می‌دارد و کانول تحویل در جای خود در لوله ET دیده می‌شود.
یک سیستم پمپ سرنگ کنترل از راه دور (UMP2، World Precision Instruments، ساراسوتا، فلوریدا) با استفاده از یک سرنگ شیشه‌ای ۱۰۰ میکرولیتری به لوله PE10 (قطر خارجی ۰.۶۱ میلی‌متر، قطر داخلی ۰.۲۸ میلی‌متر) از طریق یک سوزن ۳۰ گالیوم متصل شد. لوله را علامت بزنید تا مطمئن شوید که نوک آن هنگام قرار دادن لوله ET در موقعیت صحیح در نای قرار دارد. با استفاده از میکروپمپ، پیستون سرنگ در حالی که نوک لوله در نمونه MP که قرار است تحویل داده شود غوطه‌ور شده بود، بیرون کشیده شد. سپس لوله تحویل بارگذاری شده به داخل لوله تراشه وارد شد و نوک آن در قوی‌ترین قسمت میدان مغناطیسی اعمال شده مورد انتظار ما قرار گرفت. ثبت تصویر با استفاده از یک آشکارساز تنفس متصل به جعبه زمان‌بندی مبتنی بر آردوینو ما کنترل شد و تمام سیگنال‌ها (مانند دما، تنفس، باز/بسته شدن شاتر و ثبت تصویر) با استفاده از Powerlab و LabChart (AD Instruments، سیدنی، استرالیا) ثبت شدند. ۲۲. هنگام تصویربرداری هنگامی که محفظه غیرقابل دسترس بود، دو دوربین IP (پاناسونیک BB-SC382) تقریباً در موقعیت قرار گرفتند. ۹۰ درجه نسبت به یکدیگر قرار گرفتند و برای نظارت بر موقعیت آهنربا نسبت به نای در طول تصویربرداری استفاده شدند (شکل ۲b، c). برای به حداقل رساندن آرتیفکت‌های حرکتی، در طول فلات جریان انتهای جزر و مدی، به ازای هر تنفس یک تصویر گرفته شد.
یک آهنربا به مرحله دوم متصل است که می‌تواند از راه دور و از خارج از محفظه تصویربرداری قرار گیرد. موقعیت‌ها و پیکربندی‌های مختلف آهنربا آزمایش شدند، از جمله: نصب شده با زاویه تقریباً 30 درجه بالای نای (پیکربندی‌های نشان داده شده در شکل‌های 2a و 3a)؛ یک آهنربا بالای حیوان و دیگری در زیر، با قطب‌های تنظیم شده برای جذب (شکل 3b)؛ یک آهنربا بالای حیوان و دیگری در زیر، با قطب‌های تنظیم شده برای دفع (شکل 3c)؛ و یک آهنربا در بالا و عمود بر نای (شکل 3d). پس از پیکربندی حیوان و آهنربا و قرار دادن MP مورد آزمایش در پمپ سرنگ، هنگام گرفتن تصاویر، یک دوز 50 میکرولیتر با سرعت 4 میکرولیتر در ثانیه تزریق کنید. سپس آهنربا در امتداد یا به صورت جانبی در سراسر نای حرکت داده می‌شود و در عین حال به گرفتن تصاویر ادامه می‌دهد.
پیکربندی آهنربا برای تصویربرداری درون‌تنی (الف) یک آهنربای واحد بالای نای با زاویه تقریبی 30 درجه، (ب) دو آهنربا که برای جذب تنظیم شده‌اند، (ج) دو آهنربا که برای دفع تنظیم شده‌اند، (د) یک آهنربای واحد در بالا و عمود بر نای. ناظر از دهان به ریه‌ها از طریق نای نگاه کرد و پرتو اشعه ایکس از سمت چپ موش عبور کرده و از سمت راست خارج شد. آهنربا یا در امتداد طول راه هوایی یا در سمت چپ و راست بالای نای در جهت پرتو اشعه ایکس حرکت داده می‌شود.
ما همچنین تلاش کردیم تا میزان مشاهده و رفتار ذرات در مجاری هوایی را در غیاب تنفس و حرکت قلب که باعث اختلال می‌شوند، تعیین کنیم. بنابراین، در پایان دوره تصویربرداری، حیوانات به دلیل مصرف بیش از حد پنتوباربیتال (سومنوپنتیل، پیتمن-مور، واشنگتن کراسینگ، ایالات متحده آمریکا؛ تقریباً 65 میلی‌گرم بر کیلوگرم داخل صفاقی) به صورت انسانی کشته شدند. برخی از حیوانات روی سکوی تصویربرداری رها شدند و پس از توقف تنفس و ضربان قلب، فرآیند تصویربرداری تکرار شد و در صورت عدم مشاهده MP در سطح مجاری هوایی، دوز اضافی MP اضافه شد.
تصاویر به دست آمده با میدان تخت و میدان تاریک اصلاح شدند و سپس با استفاده از یک اسکریپت سفارشی نوشته شده در MATLAB (R2020a، The Mathworks) در یک فیلم (20 فریم در ثانیه؛ 15-25 برابر سرعت عادی بسته به میزان تنفس) مونتاژ شدند.
تمام مطالعات انتقال ژن LV در مرکز تحقیقات حیوانات آزمایشگاهی در دانشگاه آدلاید انجام شد و هدف آن استفاده از نتایج آزمایش SPring-8 برای ارزیابی این بود که آیا انتقال LV-MP در حضور میدان مغناطیسی می‌تواند انتقال ژن را در داخل بدن افزایش دهد یا خیر. برای ارزیابی اثرات MP و میدان مغناطیسی، دو گروه از حیوانات تحت درمان قرار گرفتند: به یک گروه LV-MP همراه با آهنربا داده شد و گروه دیگر یک گروه کنترل با LV-MP بدون آهنربا دریافت کردند.
ناقل‌های ژن LV با استفاده از روش‌های قبلاً شرح داده شده 25، 26 تولید شدند. ناقل LacZ ژن بتا-گالاکتوزیداز مستقر در هسته را که توسط پروموتر ساختاری MPSV (LV-LacZ) هدایت می‌شود، بیان می‌کند که یک محصول واکنش آبی رنگ در سلول‌های ترانسداکت شده تولید می‌کند که در جبهه‌های بافت ریه و برش‌های بافتی قابل مشاهده است. تیتراسیون در کشت‌های سلولی با شمارش دستی تعداد سلول‌های مثبت LacZ با هموسیتومتر برای محاسبه تیتر بر حسب TU/ml انجام شد. ناقل‌ها در دمای -80 درجه سانتیگراد منجمد می‌شوند، قبل از استفاده ذوب می‌شوند و با مخلوط کردن با نسبت 1:1 به CombiMag متصل می‌شوند و حداقل 30 دقیقه قبل از تحویل روی یخ انکوبه می‌شوند.
موش‌های صحرایی نرمال نژاد Sprague Dawley (n = 3/گروه، تقریباً 2-3) به صورت داخل صفاقی با مخلوطی از 0.4 میلی‌گرم بر کیلوگرم مدتومیدین (Domitor، ایلیوم، استرالیا) و 60 میلی‌گرم بر کیلوگرم کتامین (ایلیوم، استرالیا) یک ماهه (ip) بیهوش شدند و با یک کانول وریدی 16 گالیوم وریدی، کانولاسیون دهانی غیرجراحی انجام شد. برای اطمینان از اینکه بافت راه هوایی نای، انتقال بطن چپ را دریافت می‌کند، با استفاده از پروتکل آشفتگی مکانیکی که قبلاً شرح داده شده بود، شرطی‌سازی شد، که در آن سطح راه هوایی نای به صورت محوری با یک سبد سیمی (N-Circle، Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH، Cook Medical، ایالات متحده آمریکا) در 30 ثانیه 28 مالیده شد. سپس تجویز بطن چپ (LV-MP) از طریق نای تقریباً 10 دقیقه پس از آشفتگی در یک کابینت ایمنی بیولوژیکی انجام شد.
میدان مغناطیسی مورد استفاده در این آزمایش به شیوه‌ای مشابه با مطالعه تصویربرداری اشعه ایکس درون‌تنی (in vivo) پیکربندی شد، به این صورت که همان آهنرباها با استفاده از گیره‌های استنت تقطیر بالای نای نگه داشته شدند (شکل 4). حجم 50 میکرولیتر (2 × 25 میکرولیتر آلیکوت) از LV-MP با استفاده از یک پیپت حاوی نوک ژل همانطور که قبلاً توضیح داده شد، به نای (n = 3 حیوان) تزریق شد. یک گروه کنترل (n = 3 حیوان) همان LV-MPها را بدون استفاده از آهنربا دریافت کردند. پس از اتمام تزریق، کانول از لوله ET خارج شده و حیوان خارج می‌شود. آهنربا به مدت 10 دقیقه در محل باقی می‌ماند، سپس خارج می‌شود. موش‌ها یک دوز زیر جلدی ملوکسیکام (1 میلی‌لیتر بر کیلوگرم) (ایلیوم، استرالیا) دریافت کردند و پس از آن بیهوشی با تزریق داخل صفاقی 1 میلی‌گرم بر کیلوگرم آتیپامازول هیدروکلراید (آنتیسدان، زوئتیس، استرالیا) معکوس شد. موش‌ها گرم نگه داشته شدند و تا زمان بهبودی کامل از بیهوشی تحت نظر قرار گرفتند.
دستگاه تزریق LV-MP در یک کابینت ایمنی بیولوژیکی. قسمت خاکستری روشن Luer لوله ET را می‌توان دید که از دهان بیرون زده و نوک ژلی پیپت که در تصویر نشان داده شده است، از طریق لوله ET تا عمق مورد نظر در نای وارد می‌شود.
یک هفته پس از روش دوز LV-MP، حیوانات به صورت انسانی با استنشاق ۱۰۰٪ CO2 کشته شدند و بیان LacZ با استفاده از روش استاندارد X-gal ما ارزیابی شد. سه حلقه غضروفی انتهایی برداشته شدند تا اطمینان حاصل شود که هرگونه آسیب مکانیکی یا احتباس مایع ناشی از قرار دادن لوله تراشه در تجزیه و تحلیل لحاظ نشده است. هر نای به صورت طولی برش داده شد تا دو نیمه برای تجزیه و تحلیل ایجاد شود و آنها با استفاده از یک سوزن Minutien (Fine Science Tools) در ظرفی حاوی لاستیک سیلیکونی (Sylgard, Dow Inc) قرار داده شدند تا سطح لومینال قابل مشاهده باشد. توزیع و الگوی سلول‌های ترانسداکت شده با عکاسی از جلو با استفاده از میکروسکوپ نیکون (SMZ1500) با دوربین DigiLite و نرم‌افزار TCapture (Tucsen Photonics, China) تأیید شد. تصاویر با بزرگنمایی ۲۰ برابر (شامل بالاترین تنظیم برای کل عرض نای) گرفته شدند و کل طول نای گام به گام تصویربرداری شد و همپوشانی کافی بین هر تصویر برای امکان تصویربرداری فراهم شد. «دوخت». تصاویر هر نای سپس با استفاده از ویرایشگر ترکیبی تصویر نسخه ۲.۰.۳ (مایکروسافت ریسرچ) و با استفاده از الگوریتم حرکت صفحه‌ای، در یک تصویر ترکیبی واحد مونتاژ شدند. نواحی بیان LacZ در تصاویر ترکیبی نای هر حیوان با استفاده از یک اسکریپت خودکار MATLAB (R2020a، MathWorks) همانطور که قبلاً توضیح داده شد، با استفاده از تنظیمات ۰.۳۵ < Hue < ۰.۵۸، Saturation > ۰.۱۵ و Value < ۰.۷، اندازه‌گیری شدند. با ردیابی خطوط بافت، یک ماسک به صورت دستی در GIMP نسخه ۲.۱۰.۲۴ برای هر تصویر ترکیبی ایجاد شد تا ناحیه بافت شناسایی شود و از هرگونه تشخیص نادرست از خارج از بافت نای جلوگیری شود. نواحی رنگ‌آمیزی شده از تمام تصاویر ترکیبی از هر حیوان برای تولید کل ناحیه رنگ‌آمیزی شده برای آن حیوان جمع شدند. سپس ناحیه رنگ‌آمیزی شده بر کل ناحیه ماسک تقسیم شد تا ناحیه نرمال شده ایجاد شود.
هر نای در پارافین قرار داده شد و برش‌های ۵ میکرومتری از آن بریده شد. برش‌ها به مدت ۵ دقیقه با رنگ قرمز خنثی رنگ‌آمیزی متقابل شدند و تصاویر با استفاده از میکروسکوپ Nikon Eclipse E400، دوربین DS-Fi3 و نرم‌افزار ثبت عنصر NIS (نسخه ۵.۲۰.۰۰) گرفته شدند.
تمام تجزیه و تحلیل‌های آماری در GraphPad Prism نسخه 9 (GraphPad Software, Inc.) انجام شد. سطح معنی‌داری آماری p ≤ 0.05 در نظر گرفته شد. نرمال بودن با استفاده از آزمون Shapiro-Wilk تأیید شد و تفاوت‌ها در رنگ‌آمیزی LacZ با استفاده از آزمون t غیرجفتی ارزیابی شد.
شش MP که در جدول 1 شرح داده شده‌اند با استفاده از PCXI بررسی شدند و میزان دید در جدول 2 شرح داده شده است. دو MP پلی‌استایرن (MP1 و MP2؛ به ترتیب 18 میکرومتر و 0.25 میکرومتر) تحت PCXI قابل مشاهده نبودند، اما بقیه نمونه‌ها قابل شناسایی بودند (مثال‌ها در شکل 5 نشان داده شده است). MP3 و MP4 (به ترتیب 10-15٪ Fe3O4؛ 0.25 میکرومتر و 0.9 میکرومتر) به طور ضعیفی قابل مشاهده هستند. اگرچه MP5 (98٪ Fe3O4؛ 0.25 میکرومتر) حاوی برخی از کوچکترین ذرات آزمایش شده بود، اما برجسته‌ترین آنها بود. MP6 محصول CombiMag به سختی قابل تشخیص است. در همه موارد، توانایی ما در تشخیص MP با حرکت دادن آهنربا به جلو و عقب به موازات لوله مویین به طور قابل توجهی افزایش یافت. هنگامی که آهنرباها از لوله مویین دور می‌شدند، ذرات به صورت رشته‌های طولانی امتداد می‌یافتند، اما با نزدیک شدن آهنرباها و افزایش قدرت میدان مغناطیسی، رشته‌های ذرات با کوتاه شدن ذرات کوتاه‌تر می‌شدند. به سمت سطح بالایی مویرگ مهاجرت می‌کنند (به ویدیوی تکمیلی S1: MP4 مراجعه کنید) و چگالی ذرات سطح را افزایش می‌دهند. برعکس، هنگامی که آهنربا از مویرگ خارج می‌شود، قدرت میدان کاهش می‌یابد و ذرات مغناطیسی به صورت رشته‌های بلندی که از سطح بالایی مویرگ امتداد می‌یابند، دوباره مرتب می‌شوند (به ویدیوی تکمیلی S2: MP4 مراجعه کنید). پس از اینکه آهنربا از حرکت باز می‌ایستد، ذرات پس از رسیدن به موقعیت تعادل، برای مدت کوتاهی به حرکت خود ادامه می‌دهند. همانطور که ذره مغناطیسی به سمت سطح بالایی مویرگ حرکت می‌کند و از آن دور می‌شود، ذرات مغناطیسی معمولاً ذرات را از طریق سیال می‌کشند.
میزان دید MP تحت PCXI بین نمونه‌ها به طور قابل توجهی متفاوت است. (الف) MP3، (ب) MP4، (ج) MP5 و (د) MP6. تمام تصاویر نشان داده شده در اینجا با آهنربایی که تقریباً 10 میلی‌متر مستقیماً بالای مویرگ قرار دارد، گرفته شده‌اند. دایره‌های بزرگ ظاهری، حباب‌های هوا هستند که در مویرگ‌ها به دام افتاده‌اند و به وضوح ویژگی‌های لبه سیاه و سفید تصویربرداری فاز کنتراست را نشان می‌دهند. کادر قرمز حاوی بزرگنمایی افزایش کنتراست است. توجه داشته باشید که قطر شماتیک‌های آهنربا در تمام شکل‌ها مقیاس‌بندی نشده‌اند و تقریباً 100 برابر بزرگتر از آنچه نشان داده شده است، می‌باشند.
همانطور که آهنربا در امتداد بالای لوله مویین به چپ و راست حرکت می‌کند، زاویه رشته MP برای هم‌تراز شدن با آهنربا تغییر می‌کند (شکل 6 را ببینید)، و در نتیجه خطوط میدان مغناطیسی را مشخص می‌کند. برای MP3-5، پس از اینکه وتر به زاویه آستانه می‌رسد، ذرات در امتداد سطح بالای لوله مویین کشیده می‌شوند. این اغلب منجر به خوشه‌بندی MPها در گروه‌های بزرگتر نزدیک به جایی که میدان مغناطیسی قوی‌تر است می‌شود (به ویدیوی تکمیلی S3:MP5 مراجعه کنید). این امر به ویژه هنگام تصویربرداری نزدیک به انتهای لوله مویین مشهود است، که باعث می‌شود MPها در سطح مشترک سیال-هوا تجمع یافته و متمرکز شوند. ذرات در MP6، که تشخیص آنها دشوارتر از MP3-5 بود، با حرکت آهنربا در امتداد لوله مویین کشیده نشدند، اما رشته‌های MP از هم جدا شدند و ذرات را در میدان دید باقی گذاشتند (به ویدیوی تکمیلی S4:MP6 مراجعه کنید). در برخی موارد، هنگامی که میدان مغناطیسی اعمال شده با حرکت آهنربا در فاصله زیادی از محل تصویربرداری کاهش یافت، هر MP باقی مانده به آرامی توسط گرانش به سطح پایین لوله فرود آمد در حالی که در رشته باقی ماند (به ویدیوی تکمیلی S5:MP3 مراجعه کنید).
زاویه رشته MP با حرکت آهنربا به سمت راست بالای مویرگ تغییر می‌کند. (الف) MP3، (ب) MP4، (ج) MP5 و (د) MP6. کادر قرمز شامل بزرگنمایی افزایش کنتراست است. توجه داشته باشید که ویدیوهای تکمیلی آموزنده هستند زیرا ساختار ذرات مهم و اطلاعات پویا را که در این تصاویر استاتیک قابل مشاهده نیستند، نشان می‌دهند.
آزمایش‌های ما نشان داد که حرکت آهسته آهنربا به جلو و عقب در امتداد نای، تجسم MP را در چارچوب حرکت پیچیده در داخل بدن تسهیل می‌کند. آزمایش درون تنی انجام نشد زیرا دانه‌های پلی‌استایرن (MP1 و MP2) در مویرگ قابل مشاهده نبودند. هر یک از چهار MP باقی‌مانده در داخل بدن با محور طولی آهنربا که بالای نای با زاویه حدود 30 درجه نسبت به حالت عمودی پیکربندی شده بود، آزمایش شدند (شکل‌های 2b و 3a را ببینید)، زیرا این امر منجر به زنجیره‌های MP طولانی‌تر شد و نسبت به پیکربندی آهنربای انتهایی، مؤثرتر بود. MP3، MP4 و MP6 در نای هیچ حیوان زنده‌ای شناسایی نشدند. هنگامی که مجاری هوایی موش پس از کشتار انسانی حیوانات تصویربرداری شد، ذرات حتی با اضافه شدن حجم اضافی با استفاده از پمپ سرنگ، نامرئی باقی ماندند. MP5 بیشترین محتوای اکسید آهن را داشت و تنها ذره قابل مشاهده بود و بنابراین برای ارزیابی و توصیف رفتار MP در داخل بدن استفاده شد.
قرار دادن آهنربا روی نای در حین زایمان MP منجر به متمرکز شدن بسیاری از MPها، اما نه همه آنها، در میدان دید شد. ذراتی که وارد نای می‌شوند، به بهترین شکل در حیوانات قربانی شده انسانی مشاهده می‌شوند. شکل 7 و ویدیوی تکمیلی S6: MP5 جذب مغناطیسی سریع و هم‌ترازی ذرات را روی سطح نای شکمی نشان می‌دهد، که نشان می‌دهد MPها می‌توانند به مناطق مورد نظر نای هدایت شوند. هنگام جستجو در امتداد نای پس از زایمان MP، برخی از MPها نزدیک‌تر به کارینا یافت شدند، که نشان می‌دهد قدرت میدان مغناطیسی برای جمع‌آوری و نگهداری همه MPها کافی نبوده است، زیرا آنها در طول فرآیند سیال از طریق ناحیه‌ای با حداکثر قدرت میدان مغناطیسی تحویل داده شدند. با این وجود، غلظت MPها پس از زایمان در اطراف ناحیه تصویربرداری شده بیشتر بود، که نشان می‌دهد بسیاری از MPها در نواحی راه هوایی که قدرت میدان مغناطیسی اعمال شده بالاترین بود، باقی مانده‌اند.
تصاویر (الف) قبل و (ب) پس از تزریق MP5 به نای یک موش صحرایی که اخیراً به روش اتانازی کشته شده است، در حالی که آهنربا مستقیماً بالای ناحیه تصویربرداری قرار گرفته است. ناحیه تصویربرداری شده بین دو حلقه غضروفی قرار دارد. قبل از تزریق MP، مقداری مایع در مجاری هوایی وجود دارد. کادر قرمز حاوی بزرگنمایی کنتراست است. این تصاویر از ویدیوی نمایش داده شده در ویدیوی تکمیلی S6:MP5 گرفته شده است.
حرکت آهنربا در امتداد نای در داخل بدن باعث شد که زنجیره MP در سطح راه هوایی به شیوه‌ای مشابه آنچه در مویرگ‌ها دیده می‌شود، تغییر زاویه دهد (به شکل 8 و ویدیوی تکمیلی S7:MP5 مراجعه کنید). با این حال، در مطالعه ما، MPها را نمی‌توان مانند مویرگ‌ها در امتداد سطح راه هوایی زنده کشید. در برخی موارد، با حرکت آهنربا به چپ و راست، زنجیره MP بلندتر می‌شود. جالب توجه است که ما همچنین دریافتیم که وقتی آهنربا به صورت طولی در امتداد نای حرکت می‌کند، به نظر می‌رسد که رشته ذرات عمق لایه سیال سطحی را تغییر می‌دهد و وقتی آهنربا مستقیماً بالای سر حرکت می‌کند و رشته ذرات به حالت عمودی چرخانده می‌شود، منبسط می‌شود (به ویدیوی تکمیلی S7 مراجعه کنید). : MP5 در دقیقه 0:09، پایین سمت راست). الگوی مشخصه حرکت هنگامی که آهنربا به صورت جانبی در بالای نای (یعنی به سمت چپ یا راست حیوان به جای امتداد طول نای) منتقل می‌شد، تغییر می‌کرد. ذرات همچنان در حین حرکت به وضوح قابل مشاهده بودند، اما هنگامی که آهنربا از نای برداشته شد، نوک رشته‌های ذرات قابل مشاهده شد (به ویدیوی تکمیلی S8:MP5، با شروع از دقیقه 0:08 مراجعه کنید). این با رفتار MP که ما تحت یک میدان مغناطیسی اعمال شده در یک مویرگ شیشه‌ای مشاهده کردیم، سازگار است.
تصاویر نمونه‌ای که MP5 را در نای یک موش صحرایی زنده بیهوش نشان می‌دهند. (الف) از آهنربا برای گرفتن تصاویر در بالا و سمت چپ نای استفاده می‌شود، سپس (ب) پس از اینکه آهنربا به سمت راست منتقل می‌شود. کادر قرمز حاوی بزرگنمایی تقویت‌کننده کنتراست است. این تصاویر از ویدیوی نمایش داده شده در ویدیوی تکمیلی S7:MP5 گرفته شده‌اند.
وقتی دو قطب در جهت شمال-جنوب در بالا و پایین نای پیکربندی شدند (یعنی جذب می‌کنند؛ شکل 3b)، تارهای MP بلندتر به نظر می‌رسیدند و به جای سطح پشتی نای، روی دیواره جانبی نای قرار داشتند (به ویدیوی تکمیلی S9:MP5 مراجعه کنید). با این حال، غلظت بالای ذرات در یک مکان واحد (یعنی سطح پشتی نای) پس از تحویل مایع، هنگامی که از یک دستگاه دو آهنربایی استفاده شد، شناسایی نشد، که معمولاً هنگام استفاده از یک دستگاه تک آهنربایی رخ می‌دهد. سپس هنگامی که یک آهنربا برای دفع قطب‌های معکوس پیکربندی شد (شکل 3c)، تعداد ذرات قابل مشاهده در میدان دید پس از تحویل افزایش نیافت. راه‌اندازی هر دو پیکربندی دو آهنربایی به دلیل قدرت میدان مغناطیسی بالایی که آهنرباها را به ترتیب می‌کشند یا هل می‌دهند، چالش برانگیز است. سپس این چیدمان به یک آهنربای واحد موازی با راه هوایی تغییر یافت اما با زاویه 90 درجه از راه هوایی عبور کرد به طوری که خطوط میدان به صورت عمود از دیواره نای عبور کردند (شکل 3d)، جهتی که برای تعیین اینکه آیا ذرات تجمع روی دیواره جانبی قابل مشاهده بود. با این حال، در این پیکربندی، هیچ حرکت قابل تشخیصی از تجمع MP یا حرکت آهنربا وجود نداشت. بر اساس همه این نتایج، یک پیکربندی تک آهنربا با جهت گیری 30 درجه (شکل 3a) برای مطالعات حامل ژن در داخل بدن انتخاب شد.
وقتی بلافاصله پس از کشتن حیوان به طور مکرر از آن تصویربرداری شد، عدم وجود حرکت بافتی گیج‌کننده به این معنی بود که خطوط ذرات ریزتر و کوتاه‌تر را می‌توان در میدان بین غضروفی واضح تشخیص داد که «لرزان» و با حرکت انتقالی آهنربا هماهنگ هستند. با این وجود، هنوز نمی‌توان حضور و حرکت ذرات MP6 را به وضوح مشاهده کرد.
تیتر LV-LacZ برابر با 1.8 × 108 TU/ml بود و پس از مخلوط کردن 1:1 با CombiMag MP (MP6)، حیوانات دوز 50 میکرولیتری نای از 9 × 107 TU/ml حامل LV (یعنی 4.5 × 106 TU/rat) دریافت کردند. در این مطالعات، به جای انتقال آهنربا در حین زایمان، آهنربا را در یک موقعیت ثابت کردیم تا مشخص کنیم که آیا انتقال LV (الف) می‌تواند در مقایسه با انتقال بردار در غیاب میدان مغناطیسی بهبود یابد، و (ب) می‌تواند متمرکز شود که سلول‌های راه هوایی به مناطق هدف مغناطیسی راه هوایی فوقانی منتقل می‌شوند.
به نظر نمی‌رسد وجود آهنربا و استفاده از CombiMag همراه با ناقل‌های LV، مانند پروتکل استاندارد انتقال ناقل LV ما، اثرات نامطلوبی بر سلامت حیوانات داشته باشد. تصاویر پیشانی از ناحیه نای که تحت آشفتگی مکانیکی قرار گرفته بودند (شکل تکمیلی 1) نشان داد که در گروه حیواناتی که با LV-MP تحت درمان قرار گرفته بودند، هنگام حضور آهنربا، سطوح انتقال به طور قابل توجهی بالاتر بود (شکل 9a). تنها مقدار کمی رنگ‌آمیزی آبی LacZ در گروه کنترل وجود داشت (شکل 9b). کمی‌سازی نواحی رنگ‌آمیزی شده X-Gal نرمال شده نشان داد که تجویز LV-MP در حضور میدان مغناطیسی تقریباً 6 برابر بهبود ایجاد کرده است (شکل 9c).
تصاویر ترکیبی نمونه که انتقال ژن به نای توسط LV-MP را نشان می‌دهند (الف) در حضور میدان مغناطیسی و (ب) در غیاب آهنربا. (ج) بهبود آماری معنی‌دار در ناحیه انتقال ژن LacZ نرمال‌شده در نای هنگام استفاده از آهنربا (*p = 0.029، آزمون t، n = 3 در هر گروه، میانگین ± SEM).
بخش‌های رنگ‌آمیزی شده با رنگ قرمز خنثی (مثال نشان داده شده در شکل تکمیلی ۲) سلول‌های رنگ‌آمیزی شده با LacZ را در الگو و مکانی مشابه آنچه قبلاً گزارش شده بود، نشان دادند.
یک چالش کلیدی برای ژن‌درمانی مجاری هوایی، مکان‌یابی دقیق ذرات حامل در نواحی مورد نظر و دستیابی به سطوح بالای راندمان انتقال در ریه متحرک در حضور جریان هوا و پاکسازی فعال مخاط است. برای حامل‌های LV که برای درمان بیماری مجاری هوایی CF طراحی شده‌اند، افزایش زمان اقامت ذرات حامل در مجاری هوایی رسانا تاکنون هدفی دست‌نیافتنی بوده است. همانطور که کاستلانی و همکارانش اشاره کردند، استفاده از میدان‌های مغناطیسی برای بهبود انتقال در مقایسه با سایر روش‌های انتقال ژن مانند الکتروپوریشن مزایایی دارد، زیرا می‌تواند سادگی، مقرون‌به‌صرفه بودن، مکان‌یابی انتقال، افزایش راندمان و زمان انکوباسیون کوتاه‌تر و احتمالاً دوز حامل کمتر را با هم ترکیب کند10. با این حال، رسوب و رفتار ذرات مغناطیسی در مجاری هوایی تحت تأثیر نیروهای مغناطیسی خارجی در داخل بدن هرگز توصیف نشده است و در واقع امکان‌سنجی این روش در داخل بدن برای افزایش سطح بیان ژن در مجاری هوایی زنده سالم نشان داده نشده است.
آزمایش‌های سینکروترون PCXI آزمایشگاهی ما نشان داد که تمام ذرات آزمایش‌شده، به استثنای MP پلی‌استایرن، در دستگاه تصویربرداری مورد استفاده ما قابل مشاهده بودند. در حضور میدان مغناطیسی، MPها رشته‌هایی را تشکیل می‌دهند که طول آنها به نوع ذره و قدرت میدان مغناطیسی (یعنی نزدیکی و حرکت آهنربا) مرتبط است. همانطور که در شکل 10 نشان داده شده است، رشته‌هایی که مشاهده می‌کنیم به دلیل مغناطیسی شدن هر ذره و القای میدان مغناطیسی محلی خود تشکیل می‌شوند. این میدان‌های جداگانه باعث می‌شوند ذرات مشابه دیگر جمع شوند و به هم متصل شوند، و حرکات رشته‌ای گروهی به دلیل نیروهای محلی ناشی از نیروهای جاذبه و دافعه محلی سایر ذرات ایجاد می‌شود.
شماتیک (الف، ب) قطارهای ذرات تولید شده در داخل مویرگ‌های پر از مایع و (ج، د) نای پر از هوا را نشان می‌دهد. توجه داشته باشید که مویرگ‌ها و نای به صورت مقیاس‌بندی شده رسم نشده‌اند. پنل (الف) همچنین شامل توضیحی از MP است که شامل ذرات Fe3O4 است که به صورت رشته‌ای چیده شده‌اند.
وقتی آهنربا بالای لوله مویین حرکت داده شد، زاویه رشته ذرات برای MP3-5 حاوی Fe3O4 به یک آستانه بحرانی رسید، پس از آن رشته ذرات دیگر در موقعیت اصلی باقی نماند، بلکه در امتداد سطح به موقعیت جدیدی حرکت کرد. آهنربا. این اثر احتمالاً به این دلیل رخ می‌دهد که سطح لوله مویین شیشه‌ای به اندازه کافی صاف است که اجازه می‌دهد این حرکت رخ دهد. جالب توجه است که MP6 (CombiMag) اینگونه رفتار نکرد، احتمالاً به این دلیل که ذرات کوچکتر بودند، پوشش‌ها یا بارهای سطحی متفاوتی داشتند، یا یک سیال حامل اختصاصی بر توانایی حرکت آنها تأثیر گذاشته بود. کنتراست تصویر ذرات CombiMag نیز ضعیف‌تر است، که نشان می‌دهد سیال و ذرات ممکن است چگالی‌های مشابهی داشته باشند و بنابراین به راحتی به سمت یکدیگر حرکت نکنند. اگر آهنربا خیلی سریع حرکت کند، ذرات نیز می‌توانند گیر کنند، که نشان می‌دهد قدرت میدان مغناطیسی همیشه نمی‌تواند بر اصطکاک بین ذرات در سیال غلبه کند، که نشان می‌دهد شاید جای تعجب نباشد که قدرت میدان مغناطیسی و فاصله بین آهنربا و ناحیه هدف بسیار مهم هستند. روی هم رفته، این نتایج همچنین نشان می‌دهد که در حالی که آهنرباها می‌توانند بسیاری از MPهایی را که از ناحیه هدف عبور می‌کنند، جذب کنند، بعید است که آهنرباها می‌توان به حرکت ذرات CombiMag در امتداد سطح نای اعتماد کرد. بنابراین، نتیجه می‌گیریم که مطالعات LV-MP در داخل بدن باید از میدان‌های مغناطیسی ایستا برای هدف قرار دادن فیزیکی مناطق خاص درخت راه هوایی استفاده کنند.
وقتی ذرات وارد بدن می‌شوند، شناسایی آنها در بافت‌های پیچیده‌ی متحرک بدن دشوار است، اما توانایی تشخیص آنها با حرکت افقی آهنربا بالای نای برای "تکان دادن" رشته‌های MP افزایش یافت. اگرچه تصویربرداری زنده امکان‌پذیر است، اما تشخیص حرکت ذرات پس از کشته شدن حیوان به روش انسانی آسان‌تر است. غلظت MPها عموماً در این مکان، زمانی که آهنربا بالای ناحیه تصویربرداری قرار می‌گرفت، در بالاترین حد خود بود، اگرچه برخی از ذرات معمولاً در امتداد نای بیشتر یافت می‌شدند. برخلاف مطالعات آزمایشگاهی، ذرات را نمی‌توان با حرکت آهنربا در امتداد نای کشید. این یافته با نحوه‌ی پردازش ذرات استنشاقی توسط مخاطی که سطح نای را می‌پوشاند، مطابقت دارد، آنها را در مخاط به دام می‌اندازد و متعاقباً توسط مکانیسم پاکسازی مخاطی-مژکی پاکسازی می‌کند.
ما فرض کردیم که استفاده از آهنربا برای جذب در بالا و پایین نای (شکل 3b) ممکن است منجر به یک میدان مغناطیسی یکنواخت‌تر شود، نه یک میدان مغناطیسی که در یک نقطه بسیار متمرکز است و به طور بالقوه منجر به توزیع یکنواخت‌تر ذرات می‌شود. با این حال، مطالعه اولیه ما شواهد روشنی برای پشتیبانی از این فرضیه پیدا نکرد. به همین ترتیب، پیکربندی یک جفت آهنربا برای دفع (شکل 3c) منجر به رسوب بیشتر ذرات در ناحیه تصویربرداری نشده است. این دو یافته نشان می‌دهد که چیدمان آهنربای دوگانه کنترل محلی هدف‌گیری MP را به طور قابل توجهی بهبود نمی‌بخشد و پیکربندی نیروهای مغناطیسی قوی حاصل دشوار است و این رویکرد را کمتر کاربردی می‌کند. به طور مشابه، جهت‌دهی آهنربا در بالا و از طریق نای (شکل 3d) نیز تعداد ذرات باقی مانده در ناحیه تصویربرداری شده را افزایش نداد. برخی از این پیکربندی‌های جایگزین ممکن است موفقیت‌آمیز نباشند زیرا منجر به قدرت میدان مغناطیسی کمتر در ناحیه رسوب می‌شوند. بنابراین، پیکربندی آهنربای تکی با زاویه 30 درجه (شکل 3a) ساده‌ترین و کارآمدترین روش برای آزمایش درون تنی در نظر گرفته می‌شود.
مطالعه LV-MP نشان داد که وقتی ناقل‌های LV با CombiMag ترکیب شده و پس از ایجاد اختلال فیزیکی در حضور میدان مغناطیسی منتقل شدند، سطح انتقال ژن در نای در مقایسه با گروه کنترل به طور قابل توجهی افزایش یافت. بر اساس مطالعات تصویربرداری سینکروترون و نتایج LacZ، ظاهراً میدان مغناطیسی قادر به حفظ LV در نای و کاهش تعداد ذرات ناقلی بود که بلافاصله به عمق ریه نفوذ کردند. چنین بهبودهایی در هدف‌گیری ممکن است منجر به اثربخشی بالاتر شود و در عین حال تیترهای منتقل شده، انتقال ژن خارج از هدف، عوارض جانبی التهابی و ایمنی و هزینه‌های حامل ژن را کاهش دهد. نکته مهم این است که طبق گفته سازنده، CombiMag می‌تواند همراه با سایر روش‌های انتقال ژن، از جمله سایر ناقل‌های ویروسی (مانند AAV) و اسیدهای نوکلئیک استفاده شود.