Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Các vector gen để điều trị bệnh phổi xơ nang cần nhắm mục tiêu vào đường dẫn khí vì việc truyền gen vào phổi ngoại vi không mang lại lợi ích điều trị. Hiệu quả truyền gen bằng virus có liên quan trực tiếp đến thời gian lưu trú của vector. Tuy nhiên, các chất lỏng vận chuyển như chất mang gen tự nhiên khuếch tán vào phế nang trong quá trình hít thở, và các hạt điều trị ở bất kỳ dạng nào cũng nhanh chóng bị loại bỏ bởi cơ chế vận chuyển chất nhầy. Kéo dài thời gian lưu trú của chất mang gen trong đường dẫn khí là rất quan trọng nhưng khó đạt được. Các hạt từ tính liên hợp với chất mang gen có thể được định hướng đến bề mặt đường dẫn khí có thể cải thiện khả năng nhắm mục tiêu theo vùng. Do những thách thức trong việc hình dung in vivo, hành vi của các hạt từ tính nhỏ như vậy trên bề mặt đường dẫn khí khi có từ trường tác dụng vẫn chưa được hiểu rõ. Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng hình ảnh synchrotron để hình dung chuyển động in vivo của một loạt các hạt từ tính trong khí quản của chuột được gây mê để kiểm tra động lực và mô hình hành vi của từng hạt riêng lẻ và khối lượng lớn hạt in vivo. Sau đó, chúng tôi cũng đánh giá xem việc truyền các hạt từ tính lentivirus khi có từ trường có làm tăng hiệu quả truyền gen ở chuột hay không. Hình ảnh chụp X-quang synchrotron cho thấy hành vi của các hạt từ tính trong từ trường tĩnh và chuyển động trong ống nghiệm và trong cơ thể sống. Các hạt không thể dễ dàng bị kéo dọc theo bề mặt đường thở sống bằng nam châm, nhưng trong quá trình vận chuyển, các chất lắng đọng được tập trung trong trường quan sát nơi từ trường mạnh nhất. Hiệu quả chuyển gen cũng tăng gấp sáu lần khi các hạt từ tính lentivirus được đưa vào trong sự hiện diện của từ trường. Nhìn chung, những kết quả này cho thấy các hạt từ tính lentivirus và từ trường có thể là những phương pháp hữu ích để cải thiện khả năng nhắm mục tiêu của vector gen và tăng mức độ chuyển gen trong đường dẫn khí trong cơ thể sống.
Xơ nang (CF) là do sự biến đổi trong một gen duy nhất gọi là gen điều hòa dẫn truyền qua màng tế bào CF (CFTR). Protein CFTR là một kênh ion có mặt trong nhiều tế bào biểu mô khắp cơ thể, bao gồm cả đường dẫn khí, một vị trí chính gây bệnh CF. Các khiếm khuyết của CFTR dẫn đến vận chuyển nước bất thường, làm mất nước bề mặt đường thở và giảm độ dày của lớp dịch bề mặt đường thở (ASL). Điều này cũng làm suy giảm khả năng của hệ thống vận chuyển chất nhầy (MCT) trong việc loại bỏ các hạt và mầm bệnh hít vào khỏi đường thở. Mục tiêu của chúng tôi là phát triển liệu pháp gen bằng lentivirus (LV) để cung cấp bản sao chính xác của gen CFTR và cải thiện ASL, MCT và sức khỏe phổi, đồng thời tiếp tục phát triển các công nghệ mới có khả năng đo lường các thông số này trên cơ thể sống¹.
Vector LV là một trong những ứng cử viên hàng đầu cho liệu pháp gen đường thở trong bệnh xơ nang (CF), chủ yếu vì chúng có thể tích hợp vĩnh viễn gen điều trị vào các tế bào đáy đường thở (tế bào gốc đường thở). Điều này rất quan trọng vì chúng có thể khôi phục lại khả năng giữ ẩm và làm sạch chất nhầy bình thường bằng cách biệt hóa thành các tế bào bề mặt đường thở liên quan đến CF đã được chỉnh sửa gen chức năng, mang lại lợi ích suốt đời. Vector LV nên được hướng vào đường dẫn khí, vì đây là nơi bệnh phổi CF bắt đầu. Việc đưa vector sâu hơn vào phổi có thể dẫn đến sự chuyển gen ở phế nang, nhưng điều này không mang lại lợi ích điều trị nào trong bệnh CF. Tuy nhiên, các chất lỏng như chất mang gen tự nhiên di chuyển đến phế nang khi hít vào sau khi đưa vào3,4 và các hạt điều trị được nhanh chóng loại bỏ vào khoang miệng bởi MCT. Hiệu quả chuyển gen của LV liên quan trực tiếp đến thời gian vector lưu lại bên cạnh các tế bào đích để cho phép tế bào hấp thụ – “thời gian lưu trú”5 – thời gian này dễ dàng bị giảm bởi luồng không khí khu vực điển hình cũng như sự phối hợp giữa việc bắt giữ chất nhầy của các hạt và MCT. Đối với CF, khả năng kéo dài thời gian lưu trú của LV trong đường thở rất quan trọng để đạt được mức độ chuyển gen cao trong khu vực này, nhưng cho đến nay vẫn còn là một thách thức.
Để khắc phục trở ngại này, chúng tôi đề xuất rằng các hạt từ tính LV (MPs) có thể hỗ trợ theo hai cách bổ sung. Thứ nhất, chúng có thể được dẫn hướng bằng từ tính đến bề mặt đường thở để cải thiện khả năng nhắm mục tiêu và giúp các hạt mang gen cư trú trong vùng đường thở mong muốn; và (ASL) để di chuyển đến lớp tế bào 6. Các hạt MPs đã được sử dụng rộng rãi như các phương tiện vận chuyển thuốc nhắm mục tiêu khi chúng liên kết với kháng thể, thuốc hóa trị liệu hoặc các phân tử nhỏ khác gắn vào màng tế bào hoặc liên kết với các thụ thể bề mặt tế bào có liên quan và tích tụ tại các vị trí khối u khi có tĩnh điện. Từ trường trong điều trị ung thư 7. Các kỹ thuật “siêu nhiệt” khác nhằm mục đích làm nóng các MP khi chúng tiếp xúc với từ trường dao động, từ đó phá hủy các tế bào khối u. Nguyên tắc chuyển gen bằng từ trường, trong đó từ trường được sử dụng như một tác nhân chuyển gen để tăng cường việc chuyển DNA vào tế bào, thường được sử dụng trong ống nghiệm bằng cách sử dụng một loạt các vectơ gen không virus và virus cho các dòng tế bào khó chuyển gen. Hiệu quả của chuyển gen bằng từ trường LV đã được chứng minh, với việc truyền LV-MP trong ống nghiệm vào dòng tế bào biểu mô phế quản người khi có mặt của từ trường tĩnh, làm tăng hiệu quả chuyển gen lên 186 lần so với chỉ sử dụng vectơ LV. LV-MP cũng đã được áp dụng cho mô hình CF trong ống nghiệm, trong đó chuyển gen bằng từ trường đã làm tăng khả năng chuyển gen LV trong nuôi cấy giao diện không khí-chất lỏng lên 20 lần khi có mặt đờm CF10. Tuy nhiên, chuyển gen bằng từ trường trong cơ thể sống ở các cơ quan đã nhận được tương đối ít sự chú ý và chỉ được đánh giá trong một vài nghiên cứu trên động vật11,12,13,14,15. đặc biệt là ở phổi16,17. Tuy nhiên, cơ hội chuyển gen từ tính trong điều trị phổi CF là rõ ràng. Tan et al. (2020) đã tuyên bố rằng “một nghiên cứu chứng minh khái niệm về việc phân phối hạt nano từ tính hiệu quả vào phổi sẽ mở đường cho các chiến lược hít CFTR trong tương lai nhằm cải thiện kết quả lâm sàng ở bệnh nhân CF”6.
Hành vi của các hạt từ tính nhỏ trên bề mặt đường thở khi có từ trường tác dụng rất khó hình dung và nghiên cứu, do đó chưa được hiểu rõ. Trong các nghiên cứu khác, chúng tôi đã phát triển phương pháp chụp ảnh X-quang tương phản pha dựa trên sự lan truyền synchrotron (PB-PCXI) để hình dung và định lượng không xâm lấn những thay đổi nhỏ trong cơ thể sống về độ sâu ASL18 và hành vi MCT19,20 nhằm đo trực tiếp độ ẩm bề mặt kênh khí và được sử dụng như một chỉ báo sớm về hiệu quả điều trị. Ngoài ra, phương pháp đánh giá MCT của chúng tôi sử dụng các hạt có đường kính 10–35 µm được cấu tạo từ alumina hoặc thủy tinh có chiết suất cao làm dấu hiệu MCT có thể nhìn thấy bằng PB-PCXI21. Cả hai kỹ thuật đều phù hợp để hình dung nhiều loại hạt, bao gồm cả MP.
Nhờ độ phân giải không gian và thời gian cao, các kỹ thuật phân tích ASL và MCT dựa trên PB-PCXI của chúng tôi rất phù hợp để kiểm tra động lực và mô hình hành vi của các hạt đơn lẻ và khối lượng lớn trong cơ thể sống nhằm giúp chúng ta hiểu và tối ưu hóa các kỹ thuật truyền gen MP. Phương pháp chúng tôi sử dụng ở đây bắt nguồn từ các nghiên cứu của chúng tôi sử dụng đường truyền tia SPring-8 BL20B2, trong đó chúng tôi đã hình dung chuyển động của chất lỏng sau khi truyền liều vector giả vào đường mũi và phổi của chuột để giúp giải thích các mô hình biểu hiện gen không đồng nhất được quan sát thấy trong các nghiên cứu trên động vật về liều mang gen của chúng tôi 3,4.
Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng máy gia tốc synchrotron PB-PCXI để hình dung chuyển động in vivo của một loạt các MP trong khí quản của chuột sống. Các nghiên cứu hình ảnh PB-PCXI này được thiết kế để kiểm tra một loạt các MP, cường độ từ trường và vị trí khác nhau nhằm xác định ảnh hưởng của chúng đến chuyển động của MP. Chúng tôi giả thuyết rằng từ trường tác dụng từ bên ngoài sẽ giúp MP được đưa vào giữ nguyên vị trí hoặc di chuyển đến khu vực mục tiêu. Những nghiên cứu này cũng cho phép chúng tôi xác định cấu hình nam châm tối đa hóa số lượng hạt được giữ lại trong khí quản sau khi lắng đọng. Trong loạt nghiên cứu thứ hai, chúng tôi tìm cách sử dụng cấu hình tối ưu này để chứng minh mô hình chuyển đổi thu được từ việc đưa LV-MP vào đường thở của chuột sống, dựa trên giả định rằng việc đưa LV-MP vào trong bối cảnh nhắm mục tiêu đường thở sẽ dẫn đến hiệu quả chuyển đổi LV được cải thiện.
Tất cả các nghiên cứu trên động vật đều được thực hiện theo các quy trình đã được Đại học Adelaide (M-2019-060 và M-2020-022) và Ủy ban Đạo đức Động vật của SPring-8 Synchrotron phê duyệt. Các thí nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn ARRIVE.
Tất cả các hình ảnh X-quang đều được thực hiện tại đường truyền tia BL20XU tại máy gia tốc đồng bộ SPring-8 ở Nhật Bản, sử dụng thiết lập tương tự như đã mô tả trước đây21,22. Tóm lại, hộp thí nghiệm được đặt cách vòng lưu trữ của máy gia tốc đồng bộ 245 m. Khoảng cách từ mẫu đến đầu dò là 0,6 m được sử dụng cho các nghiên cứu hình ảnh hạt và 0,3 m cho các nghiên cứu hình ảnh in vivo để tạo ra hiệu ứng tương phản pha. Năng lượng chùm tia đơn sắc là 25 keV. Hình ảnh được chụp bằng bộ chuyển đổi tia X độ phân giải cao (SPring-8 BM3) được ghép nối với đầu dò sCMOS. Bộ chuyển đổi chuyển đổi tia X thành ánh sáng nhìn thấy được bằng cách sử dụng chất phát quang dày 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), sau đó được hướng đến cảm biến sCMOS bằng cách sử dụng vật kính hiển vi × 10 (NA 0,3). Đầu dò sCMOS là Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Nhật Bản) với kích thước mảng là Độ phân giải là 2048 × 2048 pixel và kích thước pixel thô là 6,5 × 6,5 µm. Cấu hình này cho kích thước pixel đẳng hướng hiệu quả là 0,51 µm và trường nhìn khoảng 1,1 mm × 1,1 mm. Thời gian phơi sáng 100 ms được chọn để tối đa hóa tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu của các hạt từ tính bên trong và bên ngoài đường thở, đồng thời giảm thiểu các hiện tượng nhiễu do chuyển động hô hấp gây ra. Đối với các nghiên cứu in vivo, một màn chắn tia X tốc độ cao được đặt trong đường đi của tia X để hạn chế liều bức xạ bằng cách chặn chùm tia X giữa các lần phơi sáng.
Buồng chụp ảnh BL20XU không được sử dụng trong bất kỳ nghiên cứu hình ảnh SPring-8 PB-PCXI nào vì buồng chụp ảnh BL20XU không đạt chứng nhận An toàn sinh học cấp độ 2. Thay vào đó, chúng tôi đã chọn một loạt các hạt vi mô (MP) được đặc trưng tốt từ hai nhà cung cấp thương mại—bao gồm nhiều kích thước, vật liệu, nồng độ sắt và ứng dụng khác nhau—trước tiên để hiểu cách từ trường ảnh hưởng đến chuyển động của MP bên trong mao mạch thủy tinh, và sau đó trong đường thở của sinh vật sống. Trên bề mặt, các MP có kích thước từ 0,25 đến 18 μm và được làm từ nhiều loại vật liệu khác nhau (xem Bảng 1), nhưng thành phần của mỗi mẫu, bao gồm cả kích thước của các hạt từ tính bên trong MP, vẫn chưa được biết. Dựa trên các nghiên cứu MCT mở rộng của chúng tôi 19, 20, 21, 23, 24, chúng tôi kỳ vọng rằng các MP nhỏ đến 5 μm có thể được nhìn thấy trên bề mặt đường thở khí quản, ví dụ bằng cách trừ các khung hình liên tiếp để thấy rõ hơn chuyển động của MP. Một MP có kích thước 0,25 μm nhỏ hơn độ phân giải của thiết bị hình ảnh, nhưng PB-PCXI dự kiến ​​sẽ phát hiện độ tương phản thể tích của chúng và chuyển động của chất lỏng bề mặt mà chúng được lắng đọng sau khi lắng đọng.
Các mẫu cho mỗi MP trong Bảng 1 được chuẩn bị trong các ống mao dẫn thủy tinh 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) với đường kính trong là 0,63 mm. Các hạt dạng hạt có sẵn trong nước, trong khi các hạt CombiMag có sẵn trong dung dịch độc quyền của nhà sản xuất. Mỗi ống được đổ đầy một nửa dung dịch (khoảng 11 μl) và đặt trên giá đỡ mẫu (xem Hình 1). Các ống mao dẫn thủy tinh được đặt nằm ngang trên giá đỡ mẫu trong hộp chụp ảnh và định vị các cạnh của dung dịch. Một nam châm đất hiếm neodymium sắt boron (NdFeB) vỏ niken đường kính 19 mm (dài 28 mm) (N35, mã số LM1652, Jaycar Electronics, Australia) với từ hóa dư 1,17 Tesla được gắn vào một bàn dịch chuyển riêng biệt để thay đổi vị trí từ xa trong quá trình chụp ảnh. Việc thu nhận hình ảnh tia X bắt đầu khi nam châm được đặt cách mẫu khoảng 30 mm, và hình ảnh được thu nhận với tốc độ 4 khung hình/giây. Thứ hai, trong quá trình chụp ảnh, nam châm được đưa lại gần ống mao dẫn thủy tinh (cách khoảng 1 mm) và sau đó được di chuyển dọc theo ống để đánh giá ảnh hưởng của cường độ từ trường và vị trí.
Thiết lập chụp ảnh trong ống nghiệm chứa các mẫu MP trong ống mao dẫn thủy tinh trên bàn dịch chuyển xy của mẫu. Đường đi của chùm tia X được đánh dấu bằng một đường chấm đỏ.
Sau khi xác định được khả năng quan sát MP trong ống nghiệm, một phần nhỏ trong số chúng đã được thử nghiệm in vivo trên chuột Wistar cái bạch tạng kiểu hoang dã (~12 tuần tuổi, ~200 g). Chuột được gây mê bằng hỗn hợp thuốc gồm 0,24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Nhật Bản), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Nhật Bản) và 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma, Nhật Bản) bằng cách tiêm phúc mạc. Sau khi gây mê, chúng được chuẩn bị để chụp ảnh bằng cách cạo lông xung quanh khí quản, đặt ống nội khí quản (ET; ống thông tĩnh mạch 16 Ga, Terumo BCT) và cố định chúng nằm ngửa trên một tấm chụp ảnh được chế tạo riêng có chứa túi giữ nhiệt để duy trì nhiệt độ cơ thể 22. Sau đó, tấm chụp ảnh được gắn vào bàn dịch chuyển mẫu trong hộp chụp ảnh ở một góc nhỏ để căn chỉnh khí quản theo chiều ngang trong ảnh X-quang. như thể hiện trong Hình 2a.
(a) Thiết lập chụp ảnh in vivo trong hộp chụp ảnh SPring-8, đường đi của chùm tia X được đánh dấu bằng đường chấm đỏ. (b, c) Định vị nam châm trên khí quản được thực hiện từ xa bằng cách sử dụng hai camera IP được gắn vuông góc. Ở phía bên trái của hình ảnh trên màn hình, có thể thấy vòng dây giữ đầu và ống dẫn được đặt đúng vị trí bên trong ống nội khí quản.
Hệ thống bơm tiêm điều khiển từ xa (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) sử dụng ống tiêm thủy tinh 100 μl được kết nối với ống PE10 (đường kính ngoài 0,61 mm, đường kính trong 0,28 mm) thông qua kim 30 Ga. Đánh dấu ống để đảm bảo đầu ống nằm đúng vị trí trong khí quản khi đưa ống nội khí quản vào. Sử dụng bơm vi mô, rút ​​pít tông ống tiêm trong khi đầu ống được nhúng vào mẫu MP cần đưa vào. Sau đó, ống dẫn đã được nạp được đưa vào ống nội khí quản, đặt đầu ống vào phần mạnh nhất của từ trường dự kiến. Việc thu nhận hình ảnh được điều khiển bằng máy dò hô hấp được kết nối với hộp định thời dựa trên Arduino của chúng tôi, và tất cả các tín hiệu (ví dụ: nhiệt độ, hô hấp, đóng/mở màn trập và thu nhận hình ảnh) được ghi lại bằng Powerlab và LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Khi chụp ảnh, khi không thể tiếp cận buồng kín, hai camera IP (Panasonic BB-SC382) được đặt ở góc xấp xỉ 90° với nhau và được sử dụng. Để theo dõi vị trí của nam châm so với khí quản trong quá trình chụp ảnh (Hình 2b,c). Để giảm thiểu hiện tượng nhiễu do chuyển động, một hình ảnh được thu thập cho mỗi nhịp thở trong giai đoạn bình ổn của lưu lượng khí thở ra cuối kỳ.
Một nam châm được gắn vào một thiết bị điều khiển thứ hai có thể được đặt từ xa bên ngoài vỏ máy chụp ảnh. Nhiều vị trí và cấu hình nam châm khác nhau đã được thử nghiệm, bao gồm: Gắn ở góc khoảng 30° phía trên khí quản (các cấu hình được hiển thị trong Hình 2a và 3a); một nam châm ở phía trên con vật và một nam châm ở phía dưới, với các cực được đặt để hút nhau (Hình 3b); một nam châm ở phía trên con vật và một nam châm ở phía dưới, với các cực được đặt để đẩy nhau (Hình 3c); và một nam châm ở phía trên và vuông góc với khí quản (Hình 3d). Sau khi con vật và nam châm được cấu hình và MP cần thử nghiệm được nạp vào bơm tiêm, hãy bơm một liều 50 μl với tốc độ 4 μl/giây trong khi thu thập hình ảnh. Sau đó, nam châm được di chuyển qua lại dọc theo hoặc ngang qua khí quản trong khi tiếp tục thu thập hình ảnh.
Cấu hình nam châm cho hình ảnh in vivo: (a) một nam châm đơn đặt phía trên khí quản ở góc khoảng 30°, (b) hai nam châm được đặt để hút nhau, (c) hai nam châm được đặt để đẩy nhau, (d) một nam châm đơn đặt phía trên và vuông góc với khí quản. Người quan sát nhìn từ miệng xuống phổi qua khí quản, và tia X đi qua phía bên trái của chuột và đi ra phía bên phải. Nam châm được di chuyển dọc theo chiều dài đường thở hoặc sang trái và phải phía trên khí quản theo hướng của tia X.
Chúng tôi cũng tìm cách xác định khả năng quan sát và hành vi của các hạt trong đường thở khi không có sự nhiễu loạn do nhịp thở và chuyển động tim gây ra. Do đó, vào cuối giai đoạn chụp ảnh, các động vật được giết mổ nhân đạo bằng cách tiêm quá liều pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Hoa Kỳ; ~65 mg/kg tiêm phúc mạc). Một số động vật được để lại trên bệ chụp ảnh, và khi nhịp thở và nhịp tim ngừng lại, quá trình chụp ảnh được lặp lại, bổ sung thêm một liều MP nếu không thấy MP nào trên bề mặt đường thở.
Các hình ảnh thu được đã được hiệu chỉnh trường phẳng và trường tối, sau đó được ghép lại thành một đoạn phim (20 khung hình/giây; tốc độ nhanh hơn 15-25 lần so với bình thường tùy thuộc vào nhịp thở) bằng cách sử dụng một kịch bản tùy chỉnh được viết bằng MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tất cả các nghiên cứu về truyền tải vector gen LV đều được tiến hành tại Cơ sở Nghiên cứu Động vật Thí nghiệm thuộc Đại học Adelaide và nhằm mục đích sử dụng kết quả của thí nghiệm SPring-8 để đánh giá xem việc truyền tải LV-MP trong sự hiện diện của từ trường có thể tăng cường chuyển gen in vivo hay không. Để đánh giá tác động của MP và từ trường, hai nhóm động vật đã được điều trị: một nhóm được tiêm LV-MP khi có đặt nam châm, và nhóm còn lại nhận nhóm đối chứng được tiêm LV-MP mà không có nam châm.
Các vector gen LV được tạo ra bằng các phương pháp đã được mô tả trước đây 25, 26. Vector LacZ biểu hiện gen beta-galactosidase định vị trong nhân được điều khiển bởi promoter MPSV cấu thành (LV-LacZ), tạo ra sản phẩm phản ứng màu xanh lam trong các tế bào được chuyển gen, có thể nhìn thấy ở các mặt cắt mô phổi và các lát cắt mô. Việc chuẩn độ được thực hiện trong nuôi cấy tế bào bằng cách đếm thủ công số lượng tế bào dương tính với LacZ bằng kính đếm hồng cầu để tính toán hiệu giá tính bằng TU/ml. Các chất mang được bảo quản đông lạnh ở -80 °C, rã đông trước khi sử dụng và gắn vào CombiMag bằng cách trộn theo tỷ lệ 1:1 và ủ trên đá trong ít nhất 30 phút trước khi vận chuyển.
Chuột Sprague Dawley bình thường (n = 3/nhóm, ~2-3 con/tháng tuổi) được gây mê bằng cách tiêm phúc mạc hỗn hợp 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Úc) và 60 mg/kg ketamine (Ilium, Úc) và đặt ống thông miệng không phẫu thuật bằng ống thông tĩnh mạch 16 Ga. Để đảm bảo mô đường thở khí quản nhận được sự chuyển hóa LV, nó được xử lý bằng quy trình gây nhiễu cơ học đã mô tả trước đây của chúng tôi, trong đó bề mặt đường thở khí quản được chà xát theo trục bằng một rọ dây (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, Hoa Kỳ) trong 30 giây. Sau đó, việc đưa LV-MP vào khí quản được thực hiện trong tủ an toàn sinh học khoảng 10 phút sau khi gây nhiễu.
Từ trường được sử dụng trong thí nghiệm này được cấu hình tương tự như nghiên cứu chụp X-quang in vivo, với cùng một loại nam châm được giữ phía trên khí quản bằng kẹp stent chưng cất (Hình 4). Một thể tích 50 μl (2 phần nhỏ 25 μl) LV-MP được đưa vào khí quản (n = 3 con vật) bằng pipet có đầu gel như đã mô tả trước đây. Nhóm đối chứng (n = 3 con vật) nhận cùng một lượng LV-MP mà không sử dụng nam châm. Sau khi truyền xong, ống thông được rút ra khỏi ống nội khí quản và con vật được rút ống nội khí quản. Nam châm được giữ nguyên vị trí trong 10 phút, sau đó được lấy ra. Chuột được tiêm dưới da meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Úc) sau đó được đảo ngược gây mê bằng cách tiêm phúc mạc 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Úc). Chuột được giữ ấm và theo dõi cho đến khi hồi phục hoàn toàn sau gây mê.
Thiết bị đưa LV-MP vào trong tủ an toàn sinh học. Có thể thấy đầu nối Luer màu xám nhạt của ống nội khí quản nhô ra khỏi miệng và đầu gel của pipet trong hình được đưa qua ống nội khí quản đến độ sâu mong muốn vào khí quản.
Một tuần sau quy trình tiêm LV-MP, các động vật được giết mổ nhân đạo bằng cách hít khí CO2 100% và sự biểu hiện LacZ được đánh giá bằng phương pháp điều trị X-gal tiêu chuẩn của chúng tôi. Ba vòng sụn ở phía đuôi nhất được loại bỏ để đảm bảo rằng bất kỳ tổn thương cơ học hoặc sự tích tụ dịch nào do đặt ống nội khí quản không được đưa vào phân tích. Mỗi khí quản được cắt dọc để tạo thành hai nửa để phân tích, và chúng được gắn vào một đĩa chứa cao su silicon (Sylgard, Dow Inc) bằng kim Minutien (Fine Science Tools) để quan sát bề mặt lòng ống. Sự phân bố và mô hình của các tế bào được chuyển gen được xác nhận bằng cách chụp ảnh từ phía trước bằng kính hiển vi Nikon (SMZ1500) với camera DigiLite và phần mềm TCapture (Tucsen Photonics, Trung Quốc). Hình ảnh được thu thập ở độ phóng đại 20x (bao gồm cả cài đặt cao nhất cho toàn bộ chiều rộng của khí quản), với toàn bộ chiều dài của khí quản được chụp ảnh từng bước, đảm bảo sự chồng chéo đủ giữa mỗi hình ảnh để cho phép "ghép" hình ảnh. Hình ảnh từ mỗi Sau đó, các hình ảnh khí quản được ghép lại thành một hình ảnh tổng hợp duy nhất bằng cách sử dụng Trình chỉnh sửa hình ảnh tổng hợp v2.0.3 (Microsoft Research) sử dụng thuật toán chuyển động phẳng. Diện tích biểu hiện LacZ trong các hình ảnh tổng hợp của khí quản từ mỗi con vật được định lượng bằng cách sử dụng một kịch bản MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như đã mô tả trước đây, sử dụng các thiết lập 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 và Value < 0,7. Bằng cách vẽ theo đường viền của mô, một mặt nạ được tạo thủ công trong GIMP v2.10.24 cho mỗi hình ảnh tổng hợp để xác định vùng mô và ngăn chặn bất kỳ phát hiện sai nào từ bên ngoài mô khí quản. Diện tích được nhuộm từ tất cả các hình ảnh tổng hợp của mỗi con vật được cộng lại để tạo ra tổng diện tích được nhuộm cho con vật đó. Diện tích được nhuộm sau đó được chia cho tổng diện tích mặt nạ để tạo ra diện tích được chuẩn hóa.
Mỗi khí quản được nhúng trong parafin và cắt thành các lát mỏng 5 μm. Các lát cắt được nhuộm đối chứng bằng thuốc nhuộm đỏ trung tính trong 5 phút và hình ảnh được thu thập bằng kính hiển vi Nikon Eclipse E400, camera DS-Fi3 và phần mềm thu thập hình ảnh NIS element (phiên bản 5.20.00).
Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Mức ý nghĩa thống kê được đặt ở p ≤ 0,05. Tính chuẩn được kiểm chứng bằng phép thử Shapiro-Wilk, và sự khác biệt về mức độ nhuộm LacZ được đánh giá bằng phép thử t không ghép cặp.
Sáu hạt vi nhựa (MP) được mô tả trong Bảng 1 đã được kiểm tra bằng PCXI, và khả năng quan sát được mô tả trong Bảng 2. Hai hạt vi nhựa polystyrene (MP1 và MP2; lần lượt là 18 μm và 0,25 μm) không thể nhìn thấy dưới PCXI, nhưng các mẫu còn lại đều có thể nhận dạng được (ví dụ được thể hiện trong Hình 5). MP3 và MP4 (10-15% Fe3O4; lần lượt là 0,25 μm và 0,9 μm) có thể nhìn thấy mờ. Mặc dù chứa một số hạt nhỏ nhất được thử nghiệm, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) lại dễ nhận thấy nhất. Sản phẩm CombiMag MP6 rất khó phát hiện. Trong tất cả các trường hợp, khả năng phát hiện MP của chúng tôi được tăng cường đáng kể bằng cách di chuyển nam châm qua lại song song với mao quản. Khi nam châm di chuyển ra xa mao quản, các hạt kéo dài thành chuỗi dài, nhưng khi nam châm đến gần hơn và cường độ từ trường tăng lên, các chuỗi hạt ngắn lại khi các hạt di chuyển về phía mao quản. trên bề mặt trên cùng của mao quản (xem Video bổ sung S1: MP4), mật độ hạt trên bề mặt tăng lên. Ngược lại, khi nam châm được lấy ra khỏi mao quản, cường độ từ trường giảm và các hạt MP sắp xếp lại thành các chuỗi dài kéo dài từ bề mặt trên cùng của mao quản (xem Video bổ sung S2: MP4). Sau khi nam châm ngừng chuyển động, các hạt tiếp tục chuyển động trong một thời gian ngắn sau khi đạt đến vị trí cân bằng. Khi hạt MP di chuyển về phía và ra xa bề mặt trên cùng của mao quản, các hạt từ tính thường kéo theo các mảnh vụn trong chất lỏng.
Khả năng quan sát MP dưới PCXI thay đổi đáng kể giữa các mẫu. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 và (d) MP6. Tất cả các hình ảnh được hiển thị ở đây đều được chụp với nam châm đặt cách mao quản khoảng 10 mm. Các vòng tròn lớn rõ ràng là các bọt khí bị mắc kẹt trong mao quản, cho thấy rõ các đặc điểm cạnh đen trắng của hình ảnh tương phản pha. Khung màu đỏ chứa độ phóng đại tăng cường độ tương phản. Lưu ý rằng đường kính của sơ đồ nam châm trong tất cả các hình không theo tỷ lệ và lớn hơn khoảng 100 lần so với hình minh họa.
Khi nam châm được di chuyển sang trái và phải dọc theo đỉnh của mao quản, góc của chuỗi MP thay đổi để thẳng hàng với nam châm (xem Hình 6), do đó làm nổi bật các đường sức từ. Đối với MP3-5, sau khi dây cung đạt đến một góc ngưỡng, các hạt bị kéo dọc theo bề mặt trên cùng của mao quản. Điều này thường dẫn đến việc các MP tập trung thành các nhóm lớn hơn gần nơi có từ trường mạnh nhất (xem Video bổ sung S3:MP5). Điều này cũng đặc biệt rõ ràng khi chụp ảnh gần đầu mao quản, khiến các MP kết tụ và tập trung tại giao diện chất lỏng-không khí. Các hạt trong MP6, khó phân biệt hơn MP3-5, không bị kéo khi nam châm di chuyển dọc theo mao quản, nhưng các chuỗi MP bị phân tách, để lại các hạt trong trường nhìn (xem Video bổ sung S4:MP6). Trong một số trường hợp, khi từ trường được giảm bằng cách di chuyển nam châm một khoảng cách lớn khỏi vị trí chụp ảnh, bất kỳ MP nào còn lại sẽ từ từ chìm xuống bề mặt đáy của ống do trọng lực trong khi vẫn nằm trong chuỗi (xem Video bổ sung S5: MP3).
Góc của dây MP thay đổi khi nam châm được dịch chuyển sang phải phía trên mao quản. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 và (d) MP6. Khung màu đỏ chứa hình ảnh phóng đại tăng cường độ tương phản. Lưu ý rằng các video bổ sung rất hữu ích vì chúng tiết lộ cấu trúc hạt quan trọng và thông tin động mà không thể hình dung được trong các hình ảnh tĩnh này.
Các thử nghiệm của chúng tôi cho thấy việc di chuyển nam châm chậm rãi qua lại dọc theo khí quản giúp dễ dàng quan sát MP trong bối cảnh chuyển động phức tạp trong cơ thể sống. Thử nghiệm trong cơ thể sống không được thực hiện vì các hạt polystyrene (MP1 và MP2) không nhìn thấy được trong mao mạch. Bốn MP còn lại được thử nghiệm trong cơ thể sống với trục dài của nam châm được đặt phía trên khí quản ở góc khoảng 30° so với phương thẳng đứng (xem Hình 2b và 3a), vì điều này tạo ra các chuỗi MP dài hơn và hiệu quả hơn so với cấu hình nam châm bị cắt cụt. MP3, MP4 và MP6 không được phát hiện trong khí quản của bất kỳ động vật sống nào. Khi chụp ảnh đường thở của chuột sau khi động vật được giết mổ nhân đạo, các hạt vẫn không nhìn thấy được ngay cả khi thêm thể tích bằng bơm tiêm. MP5 có hàm lượng oxit sắt cao nhất và là hạt duy nhất có thể nhìn thấy được, do đó được sử dụng để đánh giá và mô tả đặc điểm hành vi của MP trong cơ thể sống.
Việc đặt nam châm lên trên khí quản trong quá trình đưa MP vào dẫn đến việc nhiều, nhưng không phải tất cả, các MP được tập trung trong trường quan sát. Các hạt đi vào khí quản được quan sát rõ nhất ở những động vật được giết mổ nhân đạo. Hình 7 và Video bổ sung S6: MP5 cho thấy sự bắt giữ từ tính nhanh chóng và sự sắp xếp các hạt trên bề mặt khí quản phía bụng, cho thấy rằng các MP có thể được hướng đến các vùng mong muốn của khí quản. Khi tìm kiếm xa hơn dọc theo khí quản sau khi đưa MP vào, một số MP được tìm thấy gần carina hơn, cho thấy cường độ từ trường không đủ để thu thập và giữ lại tất cả các MP, vì chúng được đưa qua vùng có cường độ từ trường tối đa trong quá trình truyền dịch. Tuy nhiên, nồng độ MP sau sinh cao hơn xung quanh khu vực được chụp ảnh, cho thấy nhiều MP vẫn còn trong các vùng đường thở nơi cường độ từ trường được áp dụng cao nhất.
Hình ảnh từ (a) trước và (b) sau khi đưa MP5 vào khí quản của một con chuột vừa được gây chết nhân đạo, với nam châm được đặt ngay phía trên vùng chụp ảnh. Vùng chụp ảnh nằm giữa hai vòng sụn. Trước khi đưa MP vào, có một ít dịch trong đường thở. Khung màu đỏ chứa vùng phóng đại tăng cường độ tương phản. Những hình ảnh này được trích từ video được hiển thị trong Video bổ sung S6:MP5.
Việc di chuyển nam châm dọc theo khí quản trong cơ thể sống khiến chuỗi MP thay đổi góc độ trên bề mặt đường thở theo cách tương tự như quan sát thấy ở mao mạch (xem Hình 8 và Video bổ sung S7:MP5). Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, các MP không thể được kéo dọc theo bề mặt đường thở sống như với mao mạch. Trong một số trường hợp, chuỗi MP sẽ dài ra khi nam châm di chuyển sang trái và phải. Điều thú vị là, chúng tôi cũng nhận thấy rằng chuỗi hạt dường như thay đổi độ sâu của lớp chất lỏng bề mặt khi nam châm được di chuyển dọc theo khí quản, và giãn nở khi nam châm được di chuyển thẳng lên trên và chuỗi hạt được xoay đến vị trí thẳng đứng (xem Video bổ sung S7). (Xem MP5 ở phút 0:09, phía dưới bên phải). Mô hình chuyển động đặc trưng thay đổi khi nam châm được di chuyển ngang qua đỉnh khí quản (tức là sang trái hoặc phải của con vật chứ không phải dọc theo chiều dài của khí quản). Các hạt vẫn có thể nhìn thấy rõ khi chúng di chuyển, nhưng khi nam châm được lấy ra khỏi khí quản, các đầu của chuỗi hạt trở nên rõ ràng (xem Video bổ sung S8:MP5, bắt đầu từ phút 0:08). Điều này phù hợp với hành vi MP mà chúng tôi quan sát được dưới tác dụng của từ trường trong mao quản thủy tinh.
Hình ảnh ví dụ cho thấy MP5 trong khí quản của một con chuột sống đã được gây mê. (a) Nam châm được sử dụng để thu thập hình ảnh phía trên và bên trái khí quản, sau đó (b) sau khi nam châm được di chuyển sang bên phải. Khung màu đỏ chứa độ phóng đại tăng cường độ tương phản. Những hình ảnh này được trích từ video được hiển thị trong Video bổ sung S7:MP5.
Khi hai cực được cấu hình theo hướng bắc-nam phía trên và phía dưới khí quản (tức là hút; Hình 3b), các dây MP xuất hiện dài hơn và nằm trên thành bên của khí quản thay vì trên bề mặt lưng của khí quản (xem Video bổ sung S9:MP5). Tuy nhiên, nồng độ hạt cao tại một vị trí duy nhất (tức là bề mặt lưng của khí quản) không được phát hiện sau khi truyền dịch khi sử dụng thiết bị hai nam châm, điều này thường xảy ra khi sử dụng thiết bị một nam châm. Sau đó, khi một nam châm được cấu hình để đẩy các cực đảo ngược (Hình 3c), số lượng hạt có thể nhìn thấy trong trường quan sát dường như không tăng lên sau khi truyền dịch. Việc thiết lập cả hai cấu hình hai nam châm đều khó khăn do cường độ từ trường cao hút hoặc đẩy nam châm. Sau đó, thiết lập được thay đổi thành một nam châm đơn song song với đường thở nhưng đi xuyên qua đường thở ở góc 90 độ sao cho các đường sức từ cắt ngang thành khí quản một cách vuông góc (Hình 3d), một hướng được thiết kế để xác định xem hạt có bị ảnh hưởng hay không. Có thể quan sát thấy sự tập trung trên thành bên. Tuy nhiên, trong cấu hình này, không có chuyển động tích tụ MP hoặc chuyển động của nam châm nào có thể nhận dạng được. Dựa trên tất cả các kết quả này, cấu hình định hướng 30 độ với một nam châm duy nhất (Hình 3a) đã được chọn cho các nghiên cứu vận chuyển gen in vivo.
Khi con vật được chụp ảnh nhiều lần ngay sau khi bị giết mổ nhân đạo, việc không có chuyển động mô gây nhiễu cho phép phân biệt được các đường hạt nhỏ hơn và ngắn hơn trong vùng giữa các sụn rõ ràng, "lắc lư" theo chuyển động tịnh tiến của nam châm. Tuy nhiên, vẫn không thể nhìn thấy rõ sự hiện diện và chuyển động của các hạt MP6.
Nồng độ LV-LacZ là 1,8 × 108 TU/ml, và sau khi trộn 1:1 với CombiMag MP (MP6), động vật được tiêm vào khí quản liều 50 μl dung dịch LV với nồng độ 9 × 107 TU/ml (tức là 4,5 × 106 TU/chuột). Trong các nghiên cứu này, thay vì di chuyển nam châm trong quá trình chuyển dạ, chúng tôi cố định nam châm ở một vị trí để xác định xem quá trình chuyển gen LV (a) có thể được cải thiện so với việc truyền vector khi không có từ trường, và (b) có thể tập trung các tế bào đường thở được chuyển gen đến các vùng mục tiêu từ tính của đường hô hấp trên.
Sự hiện diện của nam châm và việc sử dụng CombiMag kết hợp với vectơ LV dường như không gây ra tác dụng phụ nào đối với sức khỏe động vật, cũng như quy trình truyền vectơ LV tiêu chuẩn của chúng tôi. Hình ảnh mặt trước của vùng khí quản chịu tác động cơ học (Hình bổ sung 1) cho thấy mức độ chuyển đổi cao hơn đáng kể ở nhóm động vật được điều trị bằng LV-MP khi có mặt nam châm (Hình 9a). Chỉ có một lượng nhỏ thuốc nhuộm LacZ màu xanh lam xuất hiện ở nhóm đối chứng (Hình 9b). Định lượng diện tích nhuộm X-Gal được chuẩn hóa cho thấy việc sử dụng LV-MP khi có mặt từ trường tạo ra sự cải thiện gấp khoảng 6 lần (Hình 9c).
Ví dụ về hình ảnh tổng hợp cho thấy sự chuyển hóa tín hiệu LacZ trong khí quản bằng LV-MP (a) khi có từ trường và (b) khi không có nam châm. (c) Sự cải thiện đáng kể về mặt thống kê trong diện tích chuyển hóa tín hiệu LacZ được chuẩn hóa trong khí quản khi sử dụng nam châm (*p = 0,029, kiểm định t, n = 3 mỗi nhóm, giá trị trung bình ± SEM).
Các lát cắt nhuộm đỏ nhanh trung tính (ví dụ được hiển thị trong Hình bổ sung 2) cho thấy các tế bào nhuộm LacZ xuất hiện theo mô hình và vị trí tương tự như đã được báo cáo trước đây.
Một thách thức quan trọng đối với liệu pháp gen đường hô hấp vẫn là việc định vị chính xác các hạt mang đến các vùng cần thiết và đạt được hiệu quả chuyển gen cao trong phổi đang chuyển động khi có luồng khí và quá trình làm sạch chất nhầy tích cực. Đối với các chất mang LV được thiết kế để điều trị bệnh đường hô hấp của xơ nang, việc tăng thời gian lưu trú của các hạt mang trong đường dẫn khí vẫn là một mục tiêu khó đạt được. Như Castellani và cộng sự đã chỉ ra, việc sử dụng từ trường để cải thiện quá trình chuyển gen có những ưu điểm so với các phương pháp truyền gen khác như điện xung, vì nó có thể kết hợp tính đơn giản, hiệu quả về chi phí, định vị phân phối, hiệu quả cao hơn, thời gian ủ ngắn hơn và có thể là liều lượng chất mang nhỏ hơn¹⁰. Tuy nhiên, sự lắng đọng và hành vi của các hạt từ tính trong đường hô hấp dưới tác động của lực từ bên ngoài chưa bao giờ được mô tả, cũng như tính khả thi của phương pháp này chưa được chứng minh trên thực tế trong việc tăng cường mức độ biểu hiện gen trong đường hô hấp sống nguyên vẹn.
Các thí nghiệm trong ống nghiệm sử dụng bức xạ synchrotron PCXI của chúng tôi cho thấy tất cả các hạt mà chúng tôi đã thử nghiệm, ngoại trừ hạt vi mô polystyrene, đều có thể nhìn thấy được trong thiết lập hình ảnh mà chúng tôi đã sử dụng. Khi có từ trường, các hạt vi mô tạo thành các chuỗi có chiều dài liên quan đến loại hạt và cường độ từ trường (tức là khoảng cách và chuyển động của nam châm). Như thể hiện trong Hình 10, các chuỗi mà chúng ta quan sát được hình thành do mỗi hạt riêng lẻ bị từ hóa và tạo ra từ trường cục bộ riêng của nó. Các từ trường riêng biệt này khiến các hạt tương tự khác kết tụ và liên kết với nhau, tạo thành các chuyển động dạng chuỗi do lực cục bộ từ lực hút và lực đẩy cục bộ của các hạt khác.
Sơ đồ minh họa (a,b) các chuỗi hạt được tạo ra bên trong các mao mạch chứa đầy chất lỏng và (c,d) các khí quản chứa đầy không khí. Lưu ý rằng các mao mạch và khí quản không được vẽ theo tỷ lệ. Hình (a) cũng bao gồm mô tả về MP, chứa các hạt Fe3O4 được sắp xếp thành chuỗi.
Khi nam châm được di chuyển phía trên mao quản, góc của chuỗi hạt đạt đến ngưỡng tới hạn đối với MP3-5 chứa Fe3O4, sau đó chuỗi hạt không còn giữ nguyên vị trí ban đầu mà di chuyển dọc theo bề mặt đến một vị trí mới. Hiệu ứng này có thể xảy ra vì bề mặt mao quản thủy tinh đủ nhẵn để cho phép chuyển động này diễn ra. Điều thú vị là, MP6 (CombiMag) không có hành vi như vậy, có thể là do các hạt nhỏ hơn, có lớp phủ hoặc điện tích bề mặt khác nhau, hoặc chất lỏng mang độc quyền ảnh hưởng đến khả năng di chuyển của chúng. Độ tương phản hình ảnh của các hạt CombiMag cũng yếu hơn, cho thấy chất lỏng và các hạt có thể có mật độ tương tự nhau và do đó không dễ dàng di chuyển về phía nhau. Các hạt cũng có thể bị kẹt nếu nam châm di chuyển quá nhanh, cho thấy cường độ từ trường không phải lúc nào cũng có thể vượt qua ma sát giữa các hạt trong chất lỏng, cho thấy có lẽ không có gì đáng ngạc nhiên khi cường độ từ trường và khoảng cách giữa nam châm và vùng mục tiêu rất quan trọng. Tóm lại, những kết quả này cũng cho thấy rằng, mặc dù nam châm có thể bắt giữ nhiều MP chảy qua vùng mục tiêu, nhưng nam châm khó có thể... có thể dựa vào đó để di chuyển các hạt CombiMag dọc theo bề mặt khí quản. Do đó, chúng tôi kết luận rằng các nghiên cứu LV-MP in vivo nên sử dụng từ trường tĩnh để nhắm mục tiêu vật lý vào các vùng cụ thể của đường thở.
Khi các hạt được đưa vào cơ thể, chúng rất khó nhận biết trong bối cảnh mô cơ thể chuyển động phức tạp, nhưng khả năng phát hiện chúng được tăng cường bằng cách di chuyển nam châm theo chiều ngang phía trên khí quản để "lắc" các sợi MP. Mặc dù có thể chụp ảnh trực tiếp, nhưng việc nhận biết chuyển động của hạt sẽ dễ dàng hơn sau khi động vật đã được giết mổ nhân đạo. Nồng độ MP thường cao nhất ở vị trí này khi nam châm được đặt phía trên khu vực chụp ảnh, mặc dù một số hạt thường được tìm thấy xa hơn dọc theo khí quản. Trái ngược với các nghiên cứu trong ống nghiệm, các hạt không thể bị kéo dọc theo khí quản bằng cách di chuyển nam châm. Phát hiện này phù hợp với cách chất nhầy bao phủ bề mặt khí quản thường xử lý các hạt hít vào, giữ chúng lại trong chất nhầy và sau đó được loại bỏ bởi cơ chế làm sạch niêm mạc lông mao.
Chúng tôi giả thuyết rằng việc sử dụng nam châm để hút các hạt ở phía trên và phía dưới khí quản (Hình 3b) có thể tạo ra từ trường đồng đều hơn, thay vì từ trường tập trung cao độ tại một điểm, từ đó có khả năng dẫn đến sự phân bố hạt đồng đều hơn. Tuy nhiên, nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi không tìm thấy bằng chứng rõ ràng để hỗ trợ giả thuyết này. Tương tự, việc cấu hình một cặp nam châm để đẩy nhau (Hình 3c) cũng không làm tăng lượng hạt lắng đọng trong vùng được chụp ảnh. Hai phát hiện này cho thấy rằng thiết lập nam châm kép không cải thiện đáng kể khả năng kiểm soát cục bộ việc nhắm mục tiêu MP, và lực từ mạnh tạo ra rất khó cấu hình, khiến phương pháp này kém thực tiễn hơn. Tương tự, việc định hướng nam châm phía trên và xuyên qua khí quản (Hình 3d) cũng không làm tăng số lượng hạt được giữ lại trong vùng được chụp ảnh. Một số cấu hình thay thế này có thể không thành công vì chúng tạo ra cường độ từ trường thấp hơn trong vùng lắng đọng. Do đó, cấu hình nam châm đơn góc 30 độ (Hình 3a) được coi là phương pháp dễ dàng và hiệu quả nhất để thử nghiệm in vivo.
Nghiên cứu LV-MP cho thấy rằng khi các vector LV được kết hợp với CombiMag và được đưa vào sau khi bị tác động vật lý dưới sự hiện diện của từ trường, mức độ chuyển gen đã tăng lên đáng kể trong khí quản so với nhóm đối chứng. Dựa trên các nghiên cứu hình ảnh synchrotron và kết quả LacZ, từ trường rõ ràng có khả năng bảo tồn LV bên trong khí quản và giảm số lượng hạt vector xâm nhập sâu vào phổi ngay lập tức. Những cải tiến về khả năng nhắm mục tiêu như vậy có thể dẫn đến hiệu quả cao hơn đồng thời giảm nồng độ virus được đưa vào, chuyển gen ngoài mục tiêu, tác dụng phụ gây viêm và miễn dịch, và chi phí chất mang gen. Quan trọng hơn, theo nhà sản xuất, CombiMag có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp chuyển gen khác, bao gồm cả các vector virus khác (như AAV) và axit nucleic.