Cảm ơn bạn đã truy cập Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ hạn chế cho CSS. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Các vectơ gen để điều trị bệnh phổi xơ nang nên nhắm vào các đường dẫn khí vì sự chuyển hóa phổi ngoại vi không mang lại lợi ích điều trị. Hiệu quả chuyển hóa vi-rút có liên quan trực tiếp đến thời gian lưu trú của vectơ. Tuy nhiên, các chất lỏng vận chuyển như chất mang gen khuếch tán tự nhiên vào phế nang trong quá trình hít vào và các hạt điều trị ở bất kỳ dạng nào đều nhanh chóng được làm sạch bằng quá trình vận chuyển niêm mạc. Việc kéo dài thời gian lưu trú của chất mang gen trong đường thở là quan trọng nhưng khó đạt được. Các hạt từ liên hợp với chất mang gen có thể được hướng đến bề mặt của đường thở có thể cải thiện khả năng nhắm mục tiêu theo vùng. Do những thách thức trong việc hình dung trong cơ thể sống, nên hành vi của các hạt từ nhỏ như vậy trên bề mặt đường thở khi có từ trường được áp dụng vẫn chưa được hiểu rõ. Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng hình ảnh synchrotron để hình dung chuyển động trong cơ thể sống của một loạt các hạt từ trong khí quản của chuột được gây mê để kiểm tra động lực và kiểu hành vi của từng hạt và hạt khối trong cơ thể sống. Sau đó, chúng tôi cũng đánh giá xem việc đưa các hạt từ lentivirus khi có từ trường có làm tăng hiệu quả chuyển hóa ở chuột hay không khí quản. Chụp X-quang bằng máy gia tốc synchrotron cho thấy hành vi của các hạt từ tính trong từ trường tĩnh và động trong ống nghiệm và trong cơ thể sống. Các hạt không thể dễ dàng bị kéo dọc theo bề mặt của đường thở sống bằng nam châm, nhưng trong quá trình vận chuyển, các chất lắng đọng sẽ tập trung ở trường nhìn nơi có từ trường mạnh nhất. Hiệu quả chuyển đổi cũng tăng gấp sáu lần khi các hạt từ tính lentivirus được đưa vào khi có từ trường. Cùng nhau, những kết quả này cho thấy rằng các hạt từ tính lentivirus và từ trường có thể là những phương pháp tiếp cận có giá trị để cải thiện mục tiêu vectơ gen và tăng mức độ chuyển đổi trong đường thở dẫn truyền trong cơ thể sống.
Xơ nang (CF) là do biến thể của một gen duy nhất được gọi là bộ điều hòa dẫn truyền màng CF (CFTR). Protein CFTR là một kênh ion có trong nhiều tế bào biểu mô trên khắp cơ thể, bao gồm cả đường dẫn khí, một vị trí chính của bệnh sinh CF. Các khiếm khuyết CFTR dẫn đến vận chuyển nước bất thường, làm mất nước bề mặt đường dẫn khí và làm giảm độ sâu của lớp dịch bề mặt đường dẫn khí (ASL). Điều này cũng làm suy yếu khả năng của hệ thống vận chuyển niêm mạc (MCT) trong việc làm sạch các hạt hít vào và mầm bệnh khỏi đường dẫn khí. Mục tiêu của chúng tôi là phát triển liệu pháp gen lentivirus (LV) để cung cấp bản sao chính xác của gen CFTR và cải thiện ASL, MCT và sức khỏe phổi, đồng thời tiếp tục phát triển các công nghệ mới có khả năng đo các thông số này trong cơ thể sống1.
Các vectơ LV là một trong những ứng cử viên hàng đầu cho liệu pháp gen đường thở CF, chủ yếu là vì chúng có thể tích hợp vĩnh viễn gen điều trị vào các tế bào đáy đường thở (tế bào gốc đường thở). Điều này rất quan trọng vì chúng có thể phục hồi quá trình hydrat hóa và thanh thải chất nhầy bình thường bằng cách biệt hóa thành các tế bào bề mặt đường thở liên quan đến CF đã được hiệu chỉnh gen chức năng, mang lại lợi ích suốt đời. Các vectơ LV nên được hướng đến đường thở dẫn truyền, vì đây là nơi bệnh phổi CF bắt đầu. Việc đưa vectơ sâu hơn vào phổi có thể dẫn đến chuyển gen phế nang, nhưng điều này không mang lại lợi ích điều trị ở CF. Tuy nhiên, các chất lỏng như chất mang gen tự nhiên di chuyển đến phế nang khi hít vào sau khi đưa ra3,4 và các hạt điều trị nhanh chóng được MCT làm sạch vào khoang miệng. Hiệu quả chuyển gen LV liên quan trực tiếp đến khoảng thời gian vectơ ở bên cạnh các tế bào đích để cho phép tế bào hấp thụ - "thời gian lưu trú"5 - dễ dàng giảm đi nhờ luồng không khí khu vực điển hình cũng như quá trình bắt giữ chất nhầy của các hạt được phối hợp và MCT. Đối với CF, khả năng kéo dài thời gian lưu trú của LV trong đường thở là rất quan trọng để đạt được mức độ chuyển gen cao trong vùng này, nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều thách thức.
Để khắc phục trở ngại này, chúng tôi đề xuất rằng các hạt từ tính LV (MP) có thể hỗ trợ theo hai cách bổ sung. Đầu tiên, chúng có thể được dẫn hướng bằng từ tính đến bề mặt đường thở để cải thiện khả năng nhắm mục tiêu và giúp các hạt mang gen cư trú trong vùng đường thở mong muốn; và ASL) để di chuyển đến lớp tế bào 6. MP đã được sử dụng rộng rãi như chất vận chuyển thuốc có mục tiêu khi chúng liên kết với kháng thể, thuốc hóa trị hoặc các phân tử nhỏ khác bám vào màng tế bào hoặc liên kết với các thụ thể bề mặt tế bào có liên quan và tích tụ tại các vị trí khối u khi có tĩnh điện. Từ trường để điều trị ung thư 7. Các kỹ thuật “siêu nhiệt” khác nhằm mục đích làm nóng MP khi chúng tiếp xúc với từ trường dao động, do đó tiêu diệt các tế bào khối u. Nguyên lý chuyển gen từ trường, trong đó từ trường được sử dụng như một tác nhân chuyển gen để tăng cường quá trình chuyển DNA vào tế bào, thường được sử dụng trong ống nghiệm bằng cách sử dụng một loạt các vectơ gen không phải virus và virus cho các dòng tế bào khó chuyển gen. Hiệu quả của chuyển gen từ LV đã được xác định, với việc đưa LV-MP vào dòng tế bào biểu mô phế quản của người trong ống nghiệm khi có từ trường tĩnh, làm tăng hiệu quả chuyển gen lên 186 lần so với chỉ dùng vectơ LV. LV-MP cũng đã được áp dụng cho mô hình CF trong ống nghiệm, trong đó chuyển gen từ trường làm tăng quá trình chuyển gen LV trong nuôi cấy giao diện không khí-lỏng lên 20 lần khi có đờm CF10. Tuy nhiên, chuyển gen từ trường trong cơ thể sống của các cơ quan nhận được tương đối ít sự chú ý và chỉ được đánh giá ở một số ít động vật nghiên cứu11,12,13,14,15, đặc biệt là ở phổi16,17.Tuy nhiên, các cơ hội cho việc chuyển từ tính trong liệu pháp phổi CF là rõ ràng. Tan et al.(2020) tuyên bố rằng “một nghiên cứu chứng minh khái niệm về việc cung cấp hạt nano từ tính hiệu quả vào phổi sẽ mở đường cho các chiến lược hít CFTR trong tương lai để cải thiện kết quả lâm sàng ở bệnh nhân CF”6.
Hành vi của các hạt từ tính nhỏ trên bề mặt đường thở khi có từ trường tác dụng rất khó hình dung và nghiên cứu, do đó ít được hiểu rõ. Trong các nghiên cứu khác, chúng tôi đã phát triển phương pháp chụp X-quang tương phản pha dựa trên truyền synchrotron (PB-PCXI) để hình dung và định lượng không xâm lấn những thay đổi nhỏ trong cơ thể sống về độ sâu ASL18 và hành vi MCT19,20 để đo trực tiếp độ ẩm bề mặt ống khí và được sử dụng làm chỉ báo sớm về hiệu quả điều trị. Ngoài ra, phương pháp đánh giá MCT của chúng tôi sử dụng các hạt có đường kính 10–35 µm bao gồm alumina hoặc thủy tinh có chiết suất cao làm dấu hiệu MCT có thể nhìn thấy bằng PB-PCXI21. Cả hai kỹ thuật đều phù hợp để hình dung nhiều loại hạt, bao gồm MP.
Nhờ độ phân giải không gian và thời gian cao, các kỹ thuật phân tích ASL và MCT dựa trên PB-PCXI của chúng tôi rất phù hợp để kiểm tra động lực và kiểu hành vi của các hạt đơn lẻ và hạt khối trong cơ thể sống nhằm giúp chúng tôi hiểu và tối ưu hóa các kỹ thuật phân phối gen MP. Phương pháp chúng tôi sử dụng ở đây bắt nguồn từ các nghiên cứu của chúng tôi sử dụng đường chùm tia SPring-8 BL20B2, trong đó chúng tôi hình dung chuyển động của chất lỏng sau khi phân phối liều vectơ giả vào đường hô hấp mũi và phổi của chuột để giúp giải thích các kiểu biểu hiện gen không đồng nhất được quan sát thấy trong các nghiên cứu trên động vật về liều mang gen của chúng tôi 3,4 .
Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng máy gia tốc synchrotron PB-PCXI để hình dung các chuyển động in vivo của một loạt MP trong khí quản của chuột sống. Các nghiên cứu hình ảnh PB-PCXI này được thiết kế để kiểm tra một loạt MP, cường độ từ trường và vị trí để xác định tác động của chúng lên chuyển động MP. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng một từ trường được áp dụng bên ngoài sẽ giúp MP được đưa vào ở lại hoặc di chuyển đến khu vực mục tiêu. Các nghiên cứu này cũng cho phép chúng tôi xác định các cấu hình nam châm giúp tối đa hóa số lượng các hạt được giữ lại trong khí quản sau khi lắng đọng. Trong một loạt nghiên cứu thứ hai, chúng tôi tìm cách sử dụng cấu hình tối ưu này để chứng minh mô hình chuyển hóa kết quả từ việc đưa LV-MP vào đường thở của chuột in vivo, dựa trên giả định rằng việc đưa LV-MP trong bối cảnh nhắm mục tiêu đường thở sẽ dẫn đến hiệu quả chuyển hóa LV được cải thiện.
Tất cả các nghiên cứu trên động vật đều được thực hiện theo các giao thức đã được Đại học Adelaide (M-2019-060 và M-2020-022) và Ủy ban đạo đức động vật SPring-8 Synchrotron chấp thuận. Các thí nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn của ARRIVE.
Tất cả hình ảnh tia X đều được thực hiện tại đường chùm tia BL20XU tại máy gia tốc đồng bộ SPring-8 ở Nhật Bản, sử dụng thiết lập tương tự như thiết lập đã mô tả trước đây21,22. Tóm lại, hộp thử nghiệm được đặt cách vòng lưu trữ máy gia tốc đồng bộ 245 m. Khoảng cách từ mẫu đến máy dò là 0,6 m được sử dụng cho các nghiên cứu hình ảnh hạt và 0,3 m cho các nghiên cứu hình ảnh trong cơ thể sống để tạo ra hiệu ứng tương phản pha. Năng lượng chùm tia đơn sắc 25 keV đã được sử dụng. Hình ảnh được chụp bằng bộ chuyển đổi tia X có độ phân giải cao (SPring-8 BM3) được ghép nối với máy dò sCMOS. Bộ chuyển đổi chuyển đổi tia X thành ánh sáng khả kiến ​​bằng cách sử dụng chất phát quang dày 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), sau đó được hướng đến cảm biến sCMOS bằng vật kính hiển vi × 10 (NA 0,3). Máy dò sCMOS là Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Nhật Bản) với kích thước mảng của 2048 × 2048 pixel và kích thước pixel thô là 6,5 × 6,5 µm. Thiết lập này tạo ra kích thước pixel đẳng hướng hiệu dụng là 0,51 µm và trường nhìn khoảng 1,1 mm × 1,1 mm. Độ dài phơi sáng là 100 ms được chọn để tối đa hóa tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu của các hạt từ tính bên trong và bên ngoài đường thở đồng thời giảm thiểu các hiện tượng nhiễu do chuyển động do thở gây ra. Đối với các nghiên cứu trong cơ thể sống, một màn trập tia X nhanh được đặt trên đường đi của tia X để hạn chế liều bức xạ bằng cách chặn chùm tia X giữa các lần phơi sáng.
Bộ phận mang LV không được sử dụng trong bất kỳ nghiên cứu hình ảnh SPring-8 PB-PCXI nào vì buồng hình ảnh BL20XU không được chứng nhận An toàn sinh học Cấp độ 2. Thay vào đó, chúng tôi đã chọn một loạt MP được mô tả rõ ràng từ hai nhà cung cấp thương mại—bao gồm nhiều kích cỡ, vật liệu, nồng độ sắt và ứng dụng—trước tiên là để hiểu cách từ trường ảnh hưởng đến chuyển động MP trong mao quản thủy tinh và sau đó là trong đường thở của người sống. trên bề mặt. Kích thước của MP dao động từ 0,25 đến 18 μm và được làm từ nhiều loại vật liệu khác nhau (xem Bảng 1), nhưng thành phần của từng mẫu, bao gồm kích thước của các hạt từ tính bên trong MP, vẫn chưa được biết. Dựa trên các nghiên cứu MCT mở rộng của chúng tôi 19, 20, 21, 23, 24, chúng tôi mong đợi rằng MP nhỏ tới 5 μm có thể được nhìn thấy trên bề mặt đường dẫn khí quản, ví dụ bằng cách trừ các khung liên tiếp để xem khả năng hiển thị chuyển động MP được cải thiện. Một MP có kích thước 0,25 μm nhỏ hơn độ phân giải của thiết bị tạo ảnh, nhưng PB-PCXI dự kiến ​​sẽ phát hiện độ tương phản thể tích của chúng và chuyển động của chất lỏng bề mặt mà chúng được lắng đọng sau khi lắng đọng.
Các mẫu cho mỗi MP trong Bảng 1 được chuẩn bị trong các mao quản thủy tinh 20 μl (Drummond Microcaps, PA, Hoa Kỳ) có đường kính trong là 0,63 mm. Các hạt dạng hạt có sẵn trong nước, trong khi các hạt CombiMag có sẵn trong chất lỏng độc quyền của nhà sản xuất. Mỗi ống được đổ một nửa chất lỏng (khoảng 11 μl) và được đặt trên giá đỡ mẫu (xem Hình 1). Các mao quản thủy tinh được đặt nằm ngang trên bệ mẫu trong hộp tạo ảnh, tương ứng và định vị các cạnh của chất lỏng. Một nam châm đất hiếm neodymium sắt bo (NdFeB) vỏ niken đường kính 19 mm (dài 28 mm) (N35, số cat. LM1652, Jaycar Electronics, Úc) có từ hóa dư là 1,17 Tesla được gắn vào một bệ dịch chuyển riêng biệt để đạt được Thay đổi vị trí của nó từ xa trong quá trình tạo ảnh. Việc thu thập hình ảnh tia X bắt đầu khi nam châm được định vị cách mẫu khoảng 30 mm và hình ảnh được thu thập với tốc độ 4 khung hình mỗi giây. Trong quá trình chụp ảnh, nam châm được đưa lại gần ống mao dẫn thủy tinh (cách khoảng 1 mm) và sau đó dịch chuyển dọc theo ống để đánh giá tác động của cường độ từ trường và vị trí.
Thiết lập hình ảnh trong ống nghiệm chứa mẫu MP trong mao quản thủy tinh trên giai đoạn dịch chuyển xy của mẫu. Đường đi của chùm tia X được đánh dấu bằng đường đứt nét màu đỏ.
Sau khi khả năng hiển thị trong ống nghiệm của MP được thiết lập, một tập hợp con trong số chúng đã được thử nghiệm in vivo trên chuột Wistar bạch tạng cái kiểu hoang dã (~12 tuần tuổi, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Nhật Bản), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Nhật Bản) và 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Chuột được gây mê bằng hỗn hợp Pharma), Nhật Bản) bằng cách tiêm phúc mạc. Sau khi gây mê, chúng được chuẩn bị để chụp ảnh bằng cách loại bỏ lông xung quanh khí quản, đưa ống nội khí quản (ET; ống thông iv 16 Ga, Terumo BCT) và cố định chúng nằm ngửa trên một tấm chụp ảnh tùy chỉnh có chứa túi nhiệt để duy trì nhiệt độ cơ thể 22. Sau đó, tấm chụp ảnh được gắn vào giai đoạn dịch chuyển mẫu trong hộp chụp ảnh ở một góc nhỏ để căn chỉnh khí quản theo chiều ngang trong Hình ảnh X-quang như thể hiện ở Hình 2a.
(a) Thiết lập hình ảnh trong cơ thể trong hộp hình ảnh SPring-8, đường đi của chùm tia X được đánh dấu bằng đường đứt nét màu đỏ. (b, c) Định vị từ trường trên khí quản được thực hiện từ xa bằng hai camera IP gắn vuông góc. Ở phía bên trái của hình ảnh màn hình, có thể nhìn thấy vòng dây giữ đầu và ống thông dẫn thuốc được đặt đúng vị trí bên trong ống ET.
Hệ thống bơm tiêm điều khiển từ xa (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) sử dụng ống tiêm thủy tinh 100 μl được kết nối với ống PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) thông qua kim 30 Ga. Đánh dấu ống để đảm bảo đầu ống ở đúng vị trí trong khí quản khi đưa ống ET vào. Sử dụng máy bơm vi mô, pít-tông ống tiêm được rút ra trong khi đầu ống được nhúng vào mẫu MP cần đưa vào. Sau đó, ống dẫn đã nạp được đưa vào ống nội khí quản, đặt đầu ống vào phần mạnh nhất của từ trường dự kiến ​​được áp dụng của chúng tôi. Việc thu thập hình ảnh được kiểm soát bằng cách sử dụng một máy dò hô hấp được kết nối với hộp thời gian dựa trên Arduino của chúng tôi và tất cả các tín hiệu (ví dụ như nhiệt độ, hô hấp, đóng/mở màn trập và thu thập hình ảnh) được ghi lại bằng Powerlab và LabChart (AD Instruments, Sydney, Úc) 22. Khi chụp ảnh Khi không thể tiếp cận được vỏ bọc, hai camera IP (Panasonic BB-SC382) được đặt ở góc khoảng 90° so với nhau và được sử dụng để theo dõi vị trí của nam châm so với khí quản trong quá trình chụp ảnh (Hình 2b, c). Để giảm thiểu hiện tượng nhiễu do chuyển động, một hình ảnh được chụp cho mỗi nhịp thở trong quá trình ổn định dòng chảy cuối kỳ thở ra.
Một nam châm được gắn vào giai đoạn thứ hai có thể được đặt từ xa bên ngoài vỏ máy chụp ảnh. Nhiều vị trí và cấu hình nam châm khác nhau đã được thử nghiệm, bao gồm: Được lắp ở góc khoảng 30° so với khí quản (cấu hình được hiển thị trong Hình 2a và 3a); một nam châm phía trên động vật và nam châm kia ở phía dưới, với các cực được thiết lập để hút (Hình 3b); một nam châm phía trên động vật và nam châm kia ở phía dưới, với các cực được thiết lập để đẩy (Hình 3c); và một nam châm phía trên và vuông góc với khí quản (Hình 3d). Sau khi động vật và nam châm được định hình và MP cần thử nghiệm được nạp vào bơm tiêm, hãy truyền liều 50 μl với tốc độ 4 μl/giây trong khi thu thập hình ảnh. Sau đó, nam châm được di chuyển qua lại dọc theo hoặc ngang qua khí quản trong khi tiếp tục thu thập hình ảnh.
Cấu hình nam châm để chụp ảnh trong cơ thể sống (a) một nam châm duy nhất phía trên khí quản ở góc khoảng 30°, (b) hai nam châm được đặt để hút, (c) hai nam châm được đặt để đẩy, (d) một nam châm duy nhất phía trên và vuông góc trong khí quản. Người quan sát nhìn xuống từ miệng đến phổi qua khí quản và chùm tia X đi qua phía bên trái của chuột và thoát ra khỏi phía bên phải. Nam châm được di chuyển dọc theo chiều dài của đường thở hoặc sang trái và phải phía trên khí quản theo hướng của chùm tia X.
Chúng tôi cũng tìm cách xác định khả năng hiển thị và hành vi của các hạt trong đường thở khi không có sự nhầm lẫn giữa hơi thở và chuyển động của tim. Do đó, vào cuối thời gian chụp, các con vật đã bị giết một cách nhân đạo vì quá liều pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Hoa Kỳ; ~65 mg/kg ip). Một số con vật được để lại trên nền tảng chụp ảnh và khi hơi thở và nhịp tim ngừng lại, quá trình chụp ảnh được lặp lại, thêm một liều MP bổ sung nếu không nhìn thấy MP trên bề mặt đường thở.
Các hình ảnh thu được đã được hiệu chỉnh trường phẳng và trường tối rồi sau đó ghép lại thành một bộ phim (20 khung hình/giây; gấp 15-25 lần tốc độ bình thường tùy thuộc vào nhịp hô hấp) bằng cách sử dụng một tập lệnh tùy chỉnh được viết trong MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tất cả các nghiên cứu về cung cấp vectơ gen LV đều được tiến hành tại Cơ sở nghiên cứu động vật thí nghiệm thuộc Đại học Adelaide và nhằm mục đích sử dụng kết quả của thí nghiệm SPring-8 để đánh giá liệu việc cung cấp LV-MP khi có từ trường có thể tăng cường quá trình truyền gen trong cơ thể sống hay không. Để đánh giá tác động của MP và từ trường, hai nhóm động vật đã được điều trị: một nhóm được cung cấp LV-MP có gắn nam châm và nhóm còn lại được cung cấp nhóm đối chứng với LV-MP nhưng không có nam châm.
Các vectơ gen LV được tạo ra bằng các phương pháp đã mô tả trước đây 25, 26 . Vectơ LacZ biểu hiện gen beta-galactosidase định vị trong nhân được điều khiển bởi trình khởi động MPSV cấu thành (LV-LacZ), tạo ra sản phẩm phản ứng màu xanh lam trong các tế bào chuyển gen, có thể nhìn thấy ở mặt trước mô phổi và các lát cắt mô. Chuẩn độ được thực hiện trong nuôi cấy tế bào bằng cách đếm thủ công số lượng tế bào dương tính với LacZ bằng máy đếm tế bào máu để tính giá trị chuẩn độ theo TU/ml. Các chất mang được bảo quản lạnh ở -80 °C, rã đông trước khi sử dụng và liên kết với CombiMag bằng cách trộn theo tỷ lệ 1:1 và ủ trên đá ít nhất 30 phút trước khi truyền.
Chuột Sprague Dawley bình thường (n = 3/nhóm, ~2-3 con được gây mê trong phúc mạc bằng hỗn hợp 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Úc) và 60 mg/kg ketamine (Ilium, Úc) tháng tuổi) ip) tiêm và đặt ống thông đường uống không phẫu thuật bằng ống thông tĩnh mạch 16 Ga. Để đảm bảo mô đường thở khí quản nhận được sự chuyển hóa thất trái, mô này được xử lý bằng giao thức nhiễu loạn cơ học đã mô tả trước đây của chúng tôi, trong đó bề mặt đường thở khí quản được cọ xát theo trục bằng một giỏ kim loại (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, Hoa Kỳ) 30 giây 28. Sau đó, tiến hành đưa LV-MP vào khí quản trong tủ an toàn sinh học khoảng 10 phút sau khi nhiễu loạn.
Từ trường được sử dụng trong thí nghiệm này được cấu hình theo cách tương tự như nghiên cứu hình ảnh X-quang trong cơ thể sống, với cùng một nam châm được giữ phía trên khí quản bằng kẹp stent chưng cất (Hình 4). Một thể tích 50 μl (2 × 25 μl phần nhỏ) LV-MP được đưa vào khí quản (n = 3 con vật) bằng cách sử dụng một pipet có chứa đầu gel như đã mô tả trước đây. Một nhóm đối chứng (n = 3 con vật) đã nhận được cùng một LV-MP mà không sử dụng nam châm. Sau khi truyền xong, ống thông được lấy ra khỏi ống ET và con vật được rút nội khí quản. Nam châm được giữ nguyên trong 10 phút, sau đó được lấy ra. Chuột được tiêm dưới da một liều meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Úc) sau đó được đảo ngược mê bằng cách tiêm ip atipamazole hydrochloride 1 mg/kg (Antisedan, Zoetis, Úc). Chuột được giữ ấm và theo dõi cho đến khi hồi phục hoàn toàn sau khi gây mê.
Thiết bị cung cấp LV-MP trong tủ an toàn sinh học. Có thể nhìn thấy đầu Luer màu xám nhạt của ống ET nhô ra khỏi miệng và đầu gel của ống nhỏ giọt hiển thị trong hình được đưa qua ống ET đến độ sâu mong muốn vào khí quản.
Một tuần sau quy trình định lượng LV-MP, các con vật đã bị giết một cách nhân đạo bằng cách hít 100% CO2 và biểu hiện LacZ đã được đánh giá bằng cách sử dụng phương pháp điều trị X-gal tiêu chuẩn của chúng tôi. Ba vòng sụn đuôi nhất đã được loại bỏ để đảm bảo rằng bất kỳ tổn thương cơ học hoặc giữ lại chất lỏng nào từ vị trí đặt ống nội khí quản đều không được đưa vào phân tích. Mỗi khí quản được cắt theo chiều dọc để tạo thành hai nửa để phân tích và chúng được gắn vào một đĩa chứa cao su silicon (Sylgard, Dow Inc) bằng kim Minutien (Fine Science Tools) để hình dung bề mặt lòng ống. Sự phân bố và kiểu mẫu của các tế bào chuyển gen đã được xác nhận bằng cách chụp ảnh trực diện bằng kính hiển vi Nikon (SMZ1500) với máy ảnh DigiLite và phần mềm TCapture (Tucsen Photonics, Trung Quốc). Hình ảnh được chụp ở độ phóng đại 20 lần (bao gồm cài đặt cao nhất cho toàn bộ chiều rộng của khí quản), với toàn bộ chiều dài của khí quản được chụp từng bước, đảm bảo có đủ sự chồng chéo giữa mỗi hình ảnh để cho phép chụp ảnh “khâu”. Sau đó, hình ảnh từ mỗi khí quản được lắp ráp thành một hình ảnh tổng hợp duy nhất bằng Trình chỉnh sửa tổng hợp hình ảnh v2.0.3 (Microsoft Research) sử dụng thuật toán chuyển động phẳng. Các vùng biểu hiện LacZ trong hình ảnh tổng hợp của khí quản từ mỗi con vật được định lượng bằng tập lệnh MATLAB tự động (R2020a, MathWorks) như đã mô tả trước đó, sử dụng cài đặt 0,35 < Sắc thái < 0,58, Độ bão hòa > 0,15 và Giá trị < 0,7. Bằng cách theo dõi các đường viền của mô, mặt nạ đã được tạo thủ công trong GIMP v2.10.24 cho mỗi hình ảnh tổng hợp để xác định vùng mô và ngăn ngừa mọi phát hiện sai từ bên ngoài mô khí quản. Các vùng nhuộm từ tất cả các hình ảnh tổng hợp từ mỗi con vật được cộng lại để tạo ra tổng vùng nhuộm cho con vật đó. Sau đó, diện tích nhuộm được chia cho tổng diện tích mặt nạ để tạo ra vùng chuẩn hóa.
Mỗi khí quản được nhúng trong parafin và cắt các lát cắt 5 μm. Các lát cắt được nhuộm tương phản bằng màu đỏ trung tính nhanh trong 5 phút và hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi Nikon Eclipse E400, máy ảnh DS-Fi3 và phần mềm chụp phần tử NIS (phiên bản 5.20.00).
Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện trong GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Ý nghĩa thống kê được đặt ở mức p ≤ 0,05. Tính chuẩn được xác minh bằng kiểm định Shapiro-Wilk và sự khác biệt trong nhuộm LacZ được đánh giá bằng kiểm định t không ghép cặp.
Sáu MP được mô tả trong Bảng 1 đã được kiểm tra bằng PCXI và khả năng hiển thị được mô tả trong Bảng 2. Hai MP polystyrene (MP1 và MP2; lần lượt là 18 μm và 0,25 μm) không nhìn thấy được dưới PCXI, nhưng các mẫu còn lại có thể nhận dạng được (các ví dụ được hiển thị trong Hình 5). MP3 và MP4 (lần lượt là 10-15% Fe3O4; 0,25 μm và 0,9 μm) có thể nhìn thấy mờ nhạt. Mặc dù chứa một số hạt nhỏ nhất được thử nghiệm, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) là hạt rõ rệt nhất. Sản phẩm CombiMag MP6 rất khó phát hiện. Trong mọi trường hợp, khả năng phát hiện MP của chúng tôi được tăng cường đáng kể bằng cách dịch chuyển nam châm qua lại song song với mao quản. Khi nam châm di chuyển ra xa mao quản, các hạt kéo dài thành các chuỗi dài, nhưng khi nam châm đến gần hơn và cường độ từ trường tăng lên, các chuỗi hạt ngắn lại khi các hạt di chuyển về phía bề mặt trên cùng của mao quản (xem Video bổ sung S1: MP4), làm tăng mật độ hạt của bề mặt. Ngược lại, khi nam châm được lấy ra khỏi mao quản, cường độ từ trường giảm và các MP sắp xếp lại thành các chuỗi dài kéo dài từ bề mặt trên cùng của mao quản (xem Video bổ sung S2: MP4). Sau khi nam châm ngừng chuyển động, các hạt tiếp tục chuyển động trong một thời gian ngắn sau khi đạt đến vị trí cân bằng. Khi MP di chuyển về phía và ra khỏi bề mặt trên cùng của mao quản, các hạt từ tính thường kéo các mảnh vụn qua chất lỏng.
Khả năng hiển thị MP dưới PCXI thay đổi đáng kể giữa các mẫu. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 và (d) MP6. Tất cả hình ảnh hiển thị ở đây đều được chụp bằng nam châm đặt cách mao quản khoảng 10 mm ngay phía trên. Các vòng tròn lớn rõ ràng là các bong bóng khí bị mắc kẹt trong mao quản, cho thấy rõ các đặc điểm cạnh đen và trắng của hình ảnh tương phản pha. Hộp màu đỏ chứa độ phóng đại tăng cường độ tương phản. Lưu ý rằng đường kính của sơ đồ nam châm trong tất cả các hình không theo tỷ lệ và lớn hơn khoảng 100 lần so với hình ảnh hiển thị.
Khi nam châm dịch chuyển sang trái và phải dọc theo đỉnh của mao quản, góc của chuỗi MP thay đổi để thẳng hàng với nam châm (xem Hình 6), do đó phân định các đường sức từ. Đối với MP3-5, sau khi dây đạt đến góc ngưỡng, các hạt bị kéo dọc theo bề mặt trên cùng của mao quản. Điều này thường dẫn đến việc MP tập trung thành các nhóm lớn hơn gần nơi có từ trường mạnh nhất (xem Video bổ sung S3:MP5). Điều này cũng đặc biệt rõ ràng khi chụp ảnh gần đầu mao quản, khiến MP kết tụ và tập trung tại giao diện chất lỏng-không khí. Các hạt trong MP6, khó phân biệt hơn MP3-5, không bị kéo khi nam châm di chuyển dọc theo mao quản, nhưng các chuỗi MP tách ra, để lại các hạt trong trường nhìn (xem Video bổ sung S4:MP6). Trong một số trường hợp, khi từ trường được áp dụng bị giảm bằng cách di chuyển nam châm một khoảng cách lớn khỏi vị trí chụp ảnh, bất kỳ MP nào còn lại sẽ từ từ hạ xuống bề mặt dưới của ống do trọng lực trong khi vẫn nằm trong chuỗi (xem Video bổ sung S5: (MP3).
Góc của chuỗi MP thay đổi khi nam châm dịch chuyển sang phải phía trên mao dẫn. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 và (d) MP6. Hộp màu đỏ chứa độ phóng đại tăng cường độ tương phản. Lưu ý rằng các video bổ sung có tính thông tin vì chúng tiết lộ cấu trúc hạt quan trọng và thông tin động không thể hình dung được trong các hình ảnh tĩnh này.
Các thử nghiệm của chúng tôi cho thấy việc di chuyển nam châm chậm rãi qua lại dọc theo khí quản giúp dễ dàng quan sát MP trong bối cảnh chuyển động phức tạp trong cơ thể sống. Thử nghiệm trong cơ thể sống không được thực hiện vì các hạt polystyren (MP1 và MP2) không nhìn thấy được trong mao quản. Mỗi một trong bốn MP còn lại đã được thử nghiệm trong cơ thể sống với trục dài của nam châm được định hình phía trên khí quản ở góc khoảng 30° so với phương thẳng đứng (xem Hình 2b và 3a), vì điều này dẫn đến các chuỗi MP dài hơn và hiệu quả hơn so với cấu hình nam châm bị chấm dứt. MP3, MP4 và MP6 không được phát hiện trong khí quản của bất kỳ động vật sống nào. Khi chụp ảnh đường thở của chuột sau khi những con vật này bị giết một cách nhân đạo, các hạt vẫn vô hình ngay cả khi thêm thể tích bằng bơm tiêm. MP5 có hàm lượng oxit sắt cao nhất và là hạt duy nhất có thể nhìn thấy được, do đó được sử dụng để đánh giá và mô tả hành vi trong cơ thể sống của MP.
Đặt nam châm lên khí quản trong quá trình cung cấp MP dẫn đến nhiều, nhưng không phải tất cả, MP tập trung trong trường nhìn. Các hạt đi vào khí quản được quan sát tốt nhất ở các động vật bị hiến tế một cách nhân đạo. Hình 7 và Video bổ sung S6: MP5 cho thấy sự bắt giữ từ tính nhanh chóng và sự sắp xếp các hạt trên bề mặt khí quản bụng, cho thấy MP có thể được hướng đến các vùng mong muốn của khí quản. Khi tìm kiếm xa hơn dọc theo khí quản sau khi cung cấp MP, một số MP được tìm thấy gần carina hơn, cho thấy cường độ từ trường không đủ để thu thập và giữ lại tất cả MP, vì chúng được cung cấp qua vùng có cường độ từ trường tối đa trong quá trình dịch chuyển. Tuy nhiên, nồng độ MP sau sinh cao hơn xung quanh khu vực được chụp, cho thấy nhiều MP vẫn ở trong các vùng đường thở có cường độ từ trường được áp dụng là cao nhất.
Hình ảnh từ (a) trước và (b) sau khi đưa MP5 vào khí quản của một con chuột mới bị an tử với nam châm được đặt ngay phía trên vùng chụp. Vùng chụp nằm giữa hai vòng sụn. Trước khi đưa MP, có một ít chất lỏng trong đường thở. Hộp màu đỏ chứa độ phóng đại tăng cường độ tương phản. Những hình ảnh này được trích từ video được hiển thị trong Video bổ sung S6:MP5.
Việc dịch chuyển nam châm dọc theo khí quản trong cơ thể sống khiến chuỗi MP thay đổi góc bên trong bề mặt đường thở theo cách tương tự như trong mao mạch (xem Hình 8 và Video bổ sung S7:MP5). Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, MP không thể bị kéo dọc theo bề mặt đường thở sống như khi chúng bị kéo theo mao mạch. Trong một số trường hợp, chuỗi MP sẽ dài ra khi nam châm di chuyển sang trái và phải. Điều thú vị là chúng tôi cũng phát hiện ra rằng chuỗi hạt dường như làm thay đổi độ sâu của lớp chất lỏng bề mặt khi nam châm di chuyển theo chiều dọc dọc theo khí quản và giãn ra khi nam châm được di chuyển trực tiếp lên trên đầu và chuỗi hạt được xoay theo chiều thẳng đứng (xem Video bổ sung S7). :MP5 ở 0:09, góc dưới bên phải). Mẫu chuyển động đặc trưng thay đổi khi nam châm được dịch chuyển qua đỉnh khí quản theo chiều ngang (tức là sang trái hoặc phải của con vật thay vì dọc theo chiều dài của khí quản). Các hạt vẫn có thể nhìn thấy rõ khi chúng di chuyển, nhưng khi nam châm được lấy ra khỏi khí quản, các đầu của chuỗi hạt trở nên có thể nhìn thấy được (xem Video bổ sung S8:MP5, bắt đầu từ 0:08). Điều này phù hợp với hành vi MP mà chúng tôi quan sát thấy dưới từ trường được áp dụng trong mao quản thủy tinh.
Ví dụ hình ảnh cho thấy MP5 trong khí quản của một con chuột được gây mê sống. (a) Nam châm được sử dụng để thu thập hình ảnh phía trên và bên trái khí quản, sau đó (b) sau khi nam châm được di chuyển sang bên phải. Hộp màu đỏ chứa độ phóng đại tăng cường độ tương phản. Những hình ảnh này được trích từ video được hiển thị trong Video bổ sung S7:MP5.
Khi hai cực được định hình theo hướng bắc-nam ở trên và dưới khí quản (tức là thu hút; Hình 3b), các dây MP xuất hiện dài hơn và nằm trên thành bên của khí quản thay vì trên bề mặt khí quản lưng (xem Video bổ sung S9:MP5). Tuy nhiên, nồng độ hạt cao tại một vị trí duy nhất (tức là bề mặt lưng của khí quản) không được phát hiện sau khi cung cấp chất lỏng khi sử dụng thiết bị nam châm kép, điều này thường xảy ra khi sử dụng thiết bị nam châm đơn. Sau đó, khi một nam châm được định hình để đẩy các cực ngược lại (Hình 3c), số lượng hạt có thể nhìn thấy trong trường nhìn dường như không tăng sau khi cung cấp. Việc thiết lập cả hai cấu hình nam châm kép đều gặp khó khăn do cường độ từ trường cao kéo hoặc đẩy các nam châm tương ứng. Sau đó, thiết lập được thay đổi thành một nam châm đơn song song với đường thở nhưng đi qua đường thở ở góc 90 độ sao cho các đường sức từ cắt ngang thành khí quản theo phương vuông góc (Hình 3d), một hướng được thiết kế để xác định xem hạt có thể quan sát thấy sự kết tụ trên thành bên. Tuy nhiên, trong cấu hình này, không có chuyển động nào có thể nhận dạng được của sự tích tụ MP hoặc chuyển động của nam châm. Dựa trên tất cả các kết quả này, cấu hình định hướng 30 độ, một nam châm đơn (Hình 3a) đã được chọn cho các nghiên cứu về vật mang gen trong cơ thể sống.
Khi con vật được chụp ảnh nhiều lần ngay sau khi giết mổ nhân đạo, việc không có chuyển động mô gây nhiễu có nghĩa là các đường hạt mịn hơn và ngắn hơn có thể được phân biệt trong trường liên sụn rõ ràng, "lắc lư" theo chuyển động tịnh tiến của nam châm. Tuy nhiên, vẫn không thể nhìn rõ sự hiện diện và chuyển động của các hạt MP6.
Nồng độ LV-LacZ là 1,8 × 108 TU/ml và sau khi trộn theo tỷ lệ 1:1 với CombiMag MP (MP6), các con vật được tiêm liều khí quản 50 μl dung môi LV 9 × 107 TU/ml (tức là 4,5 × 106 TU/chuột). Trong các nghiên cứu này, thay vì dịch chuyển nam châm trong quá trình chuyển dạ, chúng tôi cố định nam châm ở một vị trí để xác định xem quá trình chuyển đổi LV (a) có thể được cải thiện so với việc truyền vector khi không có từ trường hay không và (b) có thể tập trung các tế bào đường dẫn khí được chuyển đổi đến các vùng mục tiêu từ tính của đường dẫn khí trên.
Sự hiện diện của nam châm và việc sử dụng CombiMag kết hợp với các vectơ LV dường như không có tác động xấu đến sức khỏe động vật, giống như giao thức cung cấp vectơ LV tiêu chuẩn của chúng tôi. Hình ảnh mặt trước của vùng khí quản chịu nhiễu loạn cơ học (Hình bổ sung 1) chỉ ra rằng có mức độ chuyển hóa cao hơn đáng kể ở nhóm động vật được điều trị bằng LV-MP khi có nam châm (Hình 9a). Chỉ có một lượng nhỏ nhuộm LacZ màu xanh lam có trong nhóm đối chứng (Hình 9b). Định lượng các vùng nhuộm X-Gal chuẩn hóa cho thấy việc sử dụng LV-MP khi có từ trường tạo ra sự cải thiện khoảng 6 lần (Hình 9c).
Ví dụ hình ảnh tổng hợp cho thấy sự chuyển hóa khí quản bằng LV-MP (a) khi có từ trường và (b) khi không có nam châm. (c) Sự cải thiện đáng kể về mặt thống kê trong diện tích chuyển hóa LacZ chuẩn hóa trong khí quản khi sử dụng nam châm (*p = 0,029, kiểm định t, n = 3 trên mỗi nhóm, trung bình ± SEM).
Các lát cắt nhuộm đỏ trung tính nhanh (ví dụ được hiển thị trong Hình bổ sung 2) cho thấy các tế bào nhuộm LacZ có kiểu mẫu và vị trí tương tự như đã báo cáo trước đây.
Một thách thức chính đối với liệu pháp gen đường thở vẫn là định vị chính xác các hạt mang đến các vùng quan tâm và đạt được hiệu quả chuyển gen ở mức cao trong phổi đang chuyển động khi có luồng không khí và quá trình thanh thải chất nhầy tích cực. Đối với các hạt mang LV được thiết kế để điều trị bệnh đường thở CF, việc tăng thời gian lưu trú của các hạt mang trong đường thở dẫn truyền là một mục tiêu khó nắm bắt cho đến nay. Như Castellani và cộng sự đã chỉ ra, việc sử dụng từ trường để cải thiện quá trình chuyển gen có nhiều ưu điểm so với các phương pháp đưa gen khác như điện di, vì nó có thể kết hợp tính đơn giản, hiệu quả về chi phí, định vị đưa gen, hiệu quả cao hơn và thời gian ủ ngắn hơn, và có thể là liều lượng hạt mang nhỏ hơn10. Tuy nhiên, sự lắng đọng và hành vi trong cơ thể sống của các hạt từ tính trong đường thở dưới tác động của lực từ bên ngoài chưa bao giờ được mô tả, và tính khả thi của phương pháp này trong cơ thể sống để tăng cường mức độ biểu hiện gen trong các đường thở sống nguyên vẹn cũng chưa bao giờ được chứng minh.
Các thí nghiệm synchrotron PCXI trong ống nghiệm của chúng tôi cho thấy rằng tất cả các hạt mà chúng tôi đã thử nghiệm, ngoại trừ polystyrene MP, đều có thể nhìn thấy được trong thiết lập hình ảnh mà chúng tôi sử dụng. Khi có từ trường, MP tạo thành các chuỗi có độ dài liên quan đến loại hạt và cường độ từ trường (tức là độ gần và chuyển động của nam châm). Như thể hiện trong Hình 10, các chuỗi mà chúng tôi quan sát được hình thành do mỗi hạt riêng lẻ bị từ hóa và tạo ra từ trường cục bộ của riêng nó. Các trường riêng biệt này khiến các hạt tương tự khác tập hợp lại và kết nối với nhau, với các chuyển động giống như chuỗi nhóm do các lực cục bộ từ các lực hút và lực đẩy cục bộ của các hạt khác.
Sơ đồ minh họa (a, b) các chuỗi hạt được tạo ra bên trong các mao mạch chứa đầy chất lỏng và (c, d) khí quản chứa đầy không khí. Lưu ý rằng các mao mạch và khí quản không được vẽ theo tỷ lệ. Bảng (a) cũng chứa mô tả về MP, chứa các hạt Fe3O4 được sắp xếp thành chuỗi.
Khi nam châm được di chuyển lên trên mao quản, góc của chuỗi hạt đạt đến ngưỡng tới hạn đối với MP3-5 chứa Fe3O4, sau đó chuỗi hạt không còn ở vị trí ban đầu nữa mà di chuyển dọc theo bề mặt đến vị trí mới. nam châm. Hiệu ứng này có thể xảy ra vì bề mặt mao quản thủy tinh đủ nhẵn để cho phép chuyển động này xảy ra. Điều thú vị là MP6 (CombiMag) không hoạt động theo cách này, có thể là do các hạt nhỏ hơn, có lớp phủ hoặc điện tích bề mặt khác nhau hoặc chất lỏng mang độc quyền ảnh hưởng đến khả năng di chuyển của chúng. Độ tương phản hình ảnh của các hạt CombiMag cũng yếu hơn, cho thấy chất lỏng và các hạt có thể có mật độ tương tự nhau và do đó không dễ di chuyển về phía nhau. Các hạt cũng có thể bị kẹt nếu nam châm di chuyển quá nhanh, cho thấy cường độ từ trường không phải lúc nào cũng thắng được ma sát giữa các hạt trong chất lỏng, cho thấy có lẽ không có gì ngạc nhiên khi cường độ từ trường và khoảng cách giữa nam châm và khu vực mục tiêu Rất quan trọng. Xét về tổng thể, những kết quả này cũng cho thấy rằng, trong khi nam châm có thể thu được nhiều MP chảy qua khu vực mục tiêu, thì không có khả năng có thể dựa vào nam châm để di chuyển các hạt CombiMag dọc theo bề mặt khí quản. Do đó, chúng tôi kết luận rằng các nghiên cứu LV-MP trong cơ thể sống nên sử dụng từ trường tĩnh để nhắm mục tiêu vật lý vào các vùng cụ thể của cây đường thở.
Khi các hạt được đưa vào cơ thể, chúng khó được xác định trong bối cảnh mô cơ thể chuyển động phức tạp, nhưng khả năng phát hiện chúng đã được tăng cường bằng cách dịch chuyển nam châm theo chiều ngang phía trên khí quản để "lắc lư" các chuỗi MP. Mặc dù có thể chụp ảnh trực tiếp, nhưng sẽ dễ dàng hơn để phân biệt chuyển động của các hạt sau khi con vật đã bị giết một cách nhân đạo. Nồng độ MP thường cao nhất tại vị trí này khi nam châm được đặt phía trên khu vực chụp ảnh, mặc dù một số hạt thường được tìm thấy xa hơn dọc theo khí quản. Trái ngược với các nghiên cứu trong ống nghiệm, các hạt không thể bị kéo dọc theo khí quản bằng cách dịch chuyển nam châm. Phát hiện này phù hợp với cách chất nhầy bao phủ bề mặt khí quản thường xử lý các hạt hít vào, giữ chúng trong chất nhầy và sau đó được làm sạch bằng cơ chế thanh thải của niêm mạc.
Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng việc sử dụng nam châm để hút ở phía trên và phía dưới khí quản (Hình 3b) có thể tạo ra từ trường đồng đều hơn, thay vì từ trường tập trung cao độ tại một điểm, có khả năng dẫn đến sự phân bố hạt đồng đều hơn. Tuy nhiên, nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi không tìm thấy bằng chứng rõ ràng để hỗ trợ cho giả thuyết này. Tương tự như vậy, việc định hình một cặp nam châm để đẩy lùi (Hình 3c) không dẫn đến lắng đọng nhiều hạt hơn ở vùng được chụp. Hai phát hiện này chứng minh rằng thiết lập nam châm kép không cải thiện đáng kể khả năng kiểm soát cục bộ của mục tiêu MP và lực từ mạnh thu được rất khó định hình, khiến cách tiếp cận này kém thực tế hơn. Tương tự như vậy, việc định hướng nam châm ở phía trên và xuyên qua khí quản (Hình 3d) cũng không làm tăng số lượng hạt được giữ lại trong vùng được chụp. Một số cấu hình thay thế này có thể không thành công vì chúng tạo ra cường độ từ trường thấp hơn trong vùng lắng đọng. Do đó, cấu hình nam châm góc 30 độ đơn (Hình 3a) được coi là phương pháp dễ nhất và hiệu quả nhất để thử nghiệm trong cơ thể sống.
Nghiên cứu LV-MP cho thấy khi các vectơ LV được kết hợp với CombiMag và được đưa vào sau khi nhiễu loạn vật lý trong sự hiện diện của từ trường, mức độ chuyển hóa tăng lên đáng kể trong khí quản so với nhóm đối chứng. Dựa trên các nghiên cứu hình ảnh synchrotron và kết quả LacZ, từ trường rõ ràng có thể bảo tồn LV trong khí quản và làm giảm số lượng các hạt vectơ xâm nhập sâu ngay lập tức vào phổi. Những cải tiến nhắm mục tiêu như vậy có thể dẫn đến hiệu quả cao hơn trong khi giảm nồng độ được đưa vào, chuyển hóa ngoài mục tiêu, tác dụng phụ gây viêm và miễn dịch, cũng như chi phí mang gen. Quan trọng là, theo nhà sản xuất, CombiMag có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp chuyển gen khác, bao gồm cả các vectơ vi-rút khác (như AAV) và axit nucleic.