Dziękujemy za odwiedzenie witryny Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby uzyskać najlepsze efekty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Tymczasem, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
Wektory genowe do leczenia mukowiscydozy powinny być skierowane do przewodzących dróg oddechowych, ponieważ obwodowa transdukcja płucna nie zapewnia korzyści terapeutycznych. Wydajność transdukcji wirusa jest bezpośrednio związana z czasem przebywania wektora. Jednak płyny transportowe, takie jak nośniki genów, naturalnie dyfundują do pęcherzyków płucnych podczas wdechu, a cząsteczki terapeutyczne dowolnej postaci są szybko usuwane przez transport śluzowo-rzęskowy. Wydłużenie czasu przebywania nośników genów w drogach oddechowych jest ważne, ale trudne do osiągnięcia. Cząsteczki magnetyczne sprzężone z nośnikami genów, które można skierować na powierzchnię dróg oddechowych, mogą poprawić celowanie regionalne. Ze względu na wyzwania związane z wizualizacją in vivo zachowanie tak małych cząstek magnetycznych na powierzchni dróg oddechowych w obecności przyłożonego pola magnetycznego jest słabo poznane. Celem tego badania było wykorzystanie obrazowania synchrotronowego do wizualizacji ruchu in vivo szeregu cząstek magnetycznych w tchawicy znieczulonych szczurów w celu zbadania dynamiki i wzorców zachowania pojedynczych i masowych cząstek in vivo. Następnie oceniliśmy również, czy dostarczanie Cząsteczki magnetyczne lentiwirusa w obecności pola magnetycznego zwiększają wydajność transdukcji w tchawicy szczura. Obrazowanie rentgenowskie synchrotronem ujawnia zachowanie się cząstek magnetycznych w stacjonarnych i ruchomych polach magnetycznych in vitro i in vivo. Cząstek nie można łatwo przeciągać po powierzchni żywych dróg oddechowych za pomocą magnesów, ale podczas transportu osady koncentrują się w polu widzenia, gdzie pole magnetyczne jest najsilniejsze. Wydajność transdukcji wzrosła również sześciokrotnie, gdy cząstki magnetyczne lentiwirusa były dostarczane w obecności pola magnetycznego. Łącznie wyniki te sugerują, że cząstki magnetyczne lentiwirusa i pola magnetyczne mogą być cennymi podejściami do poprawy kierowania wektorami genów i zwiększenia poziomów transdukcji w przewodzących drogach oddechowych in vivo.
Mukowiscydoza (CF) jest spowodowana zmiennością pojedynczego genu zwanego regulatorem przewodnictwa transbłonowego CF (CFTR). Białko CFTR to kanał jonowy obecny w wielu komórkach nabłonkowych w całym ciele, w tym w przewodzących drogach oddechowych, które są głównym miejscem patogenezy mukowiscydozy. Defekty CFTR prowadzą do nieprawidłowego transportu wody, odwadniając powierzchnię dróg oddechowych i zmniejszając głębokość warstwy płynu na powierzchni dróg oddechowych (ASL). Upośledza to również zdolność układu transportu śluzowo-rzęskowego (MCT) do usuwania wdychanych cząstek i patogenów z dróg oddechowych. Naszym celem jest opracowanie terapii genowej lentiwirusowej (LV) w celu dostarczenia prawidłowej kopii genu CFTR i poprawy ASL, MCT i zdrowia płuc, a także dalsze opracowywanie nowych technologii umożliwiających pomiar tych parametrów in vivo1.
Wektory LV są jednymi z głównych kandydatów do terapii genowej dróg oddechowych w mukowiscydozie, głównie dlatego, że mogą trwale zintegrować gen terapeutyczny z komórkami podstawnymi dróg oddechowych (komórkami macierzystymi dróg oddechowych). Jest to ważne, ponieważ mogą przywrócić normalne nawodnienie i oczyszczanie śluzu poprzez różnicowanie się w funkcjonalne komórki powierzchniowe dróg oddechowych związane z mukowiscydozą skorygowane genetycznie, co przynosi korzyści przez całe życie. Wektory LV powinny być skierowane przeciwko przewodzeniu dróg oddechowych, ponieważ to tam rozpoczyna się choroba płuc związana z mukowiscydozą. Dostarczanie wektora głębiej do płuc może skutkować transdukcją pęcherzykową, ale nie ma to żadnych korzyści terapeutycznych w mukowiscydozie. Jednak płyny, takie jak nośniki genów, naturalnie migrują do pęcherzyków po wdychaniu po dostarczeniu3,4, a cząsteczki terapeutyczne są szybko usuwane do jamy ustnej przez MCT. Wydajność transdukcji LV jest bezpośrednio związana z czasem, w którym wektor pozostaje obok komórek docelowych, aby umożliwić wychwyt komórkowy – „czas przebywania”5 – który jest łatwo skrócony przez typowy regionalny przepływ powietrza, a także skoordynowane wychwytywanie i MCT. W przypadku mukowiscydozy istotne jest wydłużenie czasu przebywania lewej komory w drogach oddechowych, co pozwoli osiągnąć wysoki poziom transdukcji w tym rejonie, ale do tej pory było to trudne.
Aby pokonać tę przeszkodę, sugerujemy, że cząstki magnetyczne niskiego napięcia (MP) mogą pomóc na dwa uzupełniające się sposoby. Po pierwsze, mogą być kierowane magnetycznie na powierzchnię dróg oddechowych, aby poprawić ukierunkowanie i pomóc cząsteczkom nośnika genu w znalezieniu się w pożądanym regionie dróg oddechowych; oraz (ASL) w przemieszczeniu się do warstwy komórkowej 6. MP są szeroko stosowane jako ukierunkowane nośniki leków, gdy wiążą się z przeciwciałami, lekami chemioterapeutycznymi lub innymi małymi cząsteczkami, które przyłączają się do błon komórkowych lub wiążą się z odpowiednimi receptorami na powierzchni komórki i gromadzą się w miejscach guza w obecności elektryczności statycznej. Pola magnetyczne w leczeniu raka 7. Inne techniki „hipertermiczne” mają na celu podgrzanie MP, gdy są one wystawione na działanie oscylujących pól magnetycznych, niszcząc w ten sposób komórki nowotworowe. Zasada transfeccji magnetycznej, w której pole magnetyczne jest używane jako środek transfeccji w celu zwiększenia transferu DNA do komórek, jest powszechnie stosowana in vitro przy użyciu szeregu niewirusowych i wirusowych wektorów genowych dla trudnych do transdukcji linii komórkowych. Skuteczność magnetotransfekcji LV została ustalona, ​​​​przy podawaniu in vitro LV-MP do linii komórek nabłonka oskrzeli człowieka w obecności statycznego pola magnetycznego, zwiększając wydajność transdukcji 186-krotnie w porównaniu z samym wektorem LV. LV-MP zastosowano również w modelu CF in vitro, gdzie transfeccja magnetyczna zwiększyła transdukcję LV w kulturach na granicy ciecz-powietrze 20-krotnie w obecności plwociny CF10. Jednak magnetotransfekcja narządów in vivo wzbudziła stosunkowo niewielką uwagę i została oceniona tylko w kilka badań na zwierzętach11,12,13,14,15, zwłaszcza w płucach16,17. Niemniej jednak możliwości transfeccji magnetycznej w terapii płuc u chorych na mukowiscydozę są jasne. Tan i in. (2020) stwierdzili, że „badanie koncepcyjne dotyczące wydajnego dostarczania magnetycznych nanocząstek do płuc utoruje drogę przyszłym strategiom inhalacji CFTR w celu poprawy wyników klinicznych u pacjentów z mukowiscydozą”6.
Zachowanie małych cząstek magnetycznych na powierzchniach dróg oddechowych w obecności przyłożonego pola magnetycznego jest trudne do wizualizacji i badania, a zatem słabo poznane. W innych badaniach opracowaliśmy metodę obrazowania rentgenowskiego z kontrastem fazowym opartą na propagacji synchrotronowej (PB-PCXI) w celu nieinwazyjnego uwidocznienia i określenia ilościowego drobnych zmian in vivo w głębokości ASL18 i zachowaniu MCT19,20 w celu bezpośredniego pomiaru nawodnienia powierzchni kanału gazowego i wykorzystania go jako wczesnego wskaźnika skuteczności leczenia. Ponadto nasza metoda oceny MCT wykorzystuje cząstki o średnicy 10–35 µm składające się z tlenku glinu lub szkła o wysokim współczynniku refrakcji jako markery MCT widoczne przy użyciu PB-PCXI21. Obie techniki nadają się do wizualizacji szeregu typów cząstek, w tym MP.
Ze względu na wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową nasze techniki analizy ASL i MCT oparte na PB-PCXI doskonale nadają się do badania dynamiki i wzorców zachowania pojedynczych i masowych cząstek in vivo, co pomaga nam zrozumieć i zoptymalizować techniki dostarczania genu MP. Podejście, które tutaj stosujemy, wywodzi się z naszych badań z wykorzystaniem linii wiązki SPring-8 BL20B2, w której uwidoczniliśmy ruch płynu po podaniu dawki wektora pozorowanego do dróg oddechowych nosa i płuc myszy, co pomaga wyjaśnić nasze nierównomierne wzorce ekspresji genów zaobserwowane w naszych badaniach nad dawką nośnika genu u zwierząt3,4.
Celem tego badania było wykorzystanie synchrotronu PB-PCXI do zobrazowania ruchów in vivo szeregu MP w tchawicy żywych szczurów. Te badania obrazowania PB-PCXI zostały zaprojektowane w celu przetestowania szeregu MP, natężeń pola magnetycznego i lokalizacji w celu określenia ich wpływu na ruch MP. Postawiliśmy hipotezę, że zewnętrznie przyłożone pole magnetyczne pomoże dostarczonemu MP pozostać lub przemieścić się do obszaru docelowego. Badania te pozwoliły nam również zidentyfikować konfiguracje magnesów, które maksymalizują liczbę cząstek zatrzymywanych w tchawicy po ich osadzeniu. W drugiej serii badań staraliśmy się wykorzystać tę optymalną konfigurację, aby zademonstrować wzór transdukcji wynikający z in vivo dostarczenia LV-MP do dróg oddechowych szczura, opierając się na założeniu, że dostarczenie LV-MP w kontekście kierowania do dróg oddechowych skutkowałoby poprawą wydajności transdukcji LV.
Wszystkie badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Uniwersytet w Adelajdzie (M-2019-060 i M-2020-022) oraz Komisję ds. etyki badań na zwierzętach synchrotronu SPring-8. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE.
Wszystkie badania obrazowania rentgenowskiego wykonano na linii wiązki BL20XU w synchrotronie SPring-8 w Japonii, przy użyciu konfiguracji podobnej do opisanej wcześniej21,22. Krótko mówiąc, eksperymentalne pudełko znajdowało się 245 m od pierścienia akumulacyjnego synchrotronu. Odległość próbki od detektora wynosząca 0,6 m jest stosowana do badań obrazowania cząstek, a 0,3 m do badań obrazowania in vivo w celu wygenerowania efektów kontrastu fazowego. Zastosowano monochromatyczną energię wiązki wynoszącą 25 keV. Obrazy uzyskano przy użyciu przetwornika rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości (SPring-8 BM3) połączonego z detektorem sCMOS. Przetwornik przekształca promienie rentgenowskie na światło widzialne przy użyciu scyntylatora o grubości 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), który jest następnie kierowany do czujnika sCMOS przy użyciu obiektywu mikroskopu × 10 (NA 0,3). Detektorem sCMOS był Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonia) o rozmiarze matrycy 2048 × 2048 pikseli i surowym rozmiarze piksela 6,5 ​​× 6,5 µm. Taka konfiguracja zapewnia efektywny izotropowy rozmiar piksela wynoszący 0,51 µm i pole widzenia wynoszące około 1,1 mm × 1,1 mm. Wybrano długość ekspozycji 100 ms, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu cząstek magnetycznych wewnątrz i na zewnątrz dróg oddechowych, jednocześnie minimalizując artefakty ruchu wywołane oddychaniem. W przypadku badań in vivo na ścieżce promieni rentgenowskich umieszczono szybką migawkę rentgenowską, aby ograniczyć dawkę promieniowania poprzez blokowanie wiązki promieni rentgenowskich między ekspozycjami.
Nośnik LV nie był używany w żadnych badaniach obrazowania SPring-8 PB-PCXI, ponieważ komora obrazowania BL20XU nie posiada certyfikatu bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2. Zamiast tego wybraliśmy szereg dobrze scharakteryzowanych MP od dwóch komercyjnych dostawców — obejmujących szereg rozmiarów, materiałów, stężeń żelaza i zastosowań — najpierw, aby zrozumieć, w jaki sposób pola magnetyczne wpływają na ruch MP w szklanych kapilarach, a następnie w żywych drogach oddechowych. na powierzchni. Rozmiary MP wahają się od 0,25 do 18 μm i są wykonane z różnych materiałów (patrz Tabela 1), ale skład każdej próbki, w tym rozmiar cząstek magnetycznych w MP, nie jest znany. Na podstawie naszych obszernych badań MCT19, 20, 21, 23, 24 spodziewamy się, że MP o wielkości zaledwie 5 μm można zobaczyć na powierzchni dróg oddechowych tchawicy, na przykład poprzez odjęcie kolejnych klatek w celu uzyskania lepszej widoczności ruchu MP. Pojedynczy MP o rozmiarze 0,25 μm jest mniejszy niż rozdzielczość urządzenia obrazującego, ale oczekuje się, że PB-PCXI wykryje ich kontrast objętościowy i ruch płynu powierzchniowego, na którym są osadzone po osadzeniu.
Próbki dla każdego MP w Tabeli 1 przygotowano w 20 μl szklanych kapilarach (Drummond Microcaps, PA, USA) o średnicy wewnętrznej 0,63 mm. Cząstki korpuskularne są dostępne w wodzie, podczas gdy cząstki CombiMag są dostępne w opatentowanym płynie producenta. Każda probówka jest w połowie wypełniona cieczą (około 11 μl) i umieszczona w uchwycie na próbkę (patrz Rysunek 1). Szklane kapilary umieszczono poziomo na stoliku na próbkę w pudełku do obrazowania i ustawiono krawędzie płynu. Magnes ziem rzadkich neodymowo-żelazowo-borowy (NdFeB) o średnicy 19 mm (długości 28 mm) z powłoką niklową (N35, nr kat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) o resztkowej magnetyzacji 1,17 Tesli został przymocowany do oddzielnego stolika translacyjnego, aby osiągnąć Zmieniaj jego położenie zdalnie podczas obrazowania. Pozyskiwanie obrazu rentgenowskiego rozpoczyna się, gdy magnes zostanie umieszczony około 30 mm nad próbką, a obrazy są pozyskiwane z szybkością 4 klatek na sekundę. Podczas obrazowania magnes był zbliżany do szklanej rurki kapilarnej (na odległość około 1 mm), a następnie przesuwany wzdłuż rurki, aby ocenić wpływ natężenia pola i położenia.
Zestaw do obrazowania in vitro zawierający próbki MP w szklanych kapilarach na stoliku translacji xy próbki. Ścieżka wiązki promieni rentgenowskich jest oznaczona czerwoną linią przerywaną.
Po ustaleniu widoczności MP in vitro, podgrupę z nich przetestowano in vivo na dzikim typie samic białych szczurów Wistar (~12 tygodni, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidyny (Domitor®, Zenoaq, Japonia), 3,2 mg/kg midazolamu (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonia) i 4 mg/kg butorfanolu (Vetorphale®, Meiji Seika). Szczury znieczulono mieszaniną Pharma), Japonia) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Po znieczuleniu przygotowano je do obrazowania poprzez usunięcie sierści wokół tchawicy, wprowadzenie rurki intubacyjnej (ET; kaniula dożylna 16 Ga, Terumo BCT) i unieruchomienie ich w pozycji leżącej na specjalnie wykonanej płycie obrazowej zawierającej torbę termiczną w celu utrzymania temperatury ciała22. Następnie płytę obrazową przymocowano do platformy translacji próbki w pudełku do obrazowania pod niewielkim kątem, aby wyrównać tchawica poziomo na zdjęciu rentgenowskim, jak pokazano na rysunku 2a.
(a) Obrazowanie in vivo w urządzeniu SPring-8; ścieżka wiązki promieni rentgenowskich jest oznaczona czerwoną przerywaną linią. (b, c) Lokalizację magnesu na tchawicy wykonano zdalnie, używając dwóch ortogonalnie zamontowanych kamer IP. Po lewej stronie obrazu ekranowego widoczna jest pętla drutu trzymająca głowę oraz kaniula wprowadzająca umieszczona w rurce dotchawkowej.
Zdalnie sterowany system pompy strzykawkowej (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) wykorzystujący szklaną strzykawkę o pojemności 100 μl został podłączony do rurki PE10 (średnica zewnętrzna 0,61 mm, średnica wewnętrzna 0,28 mm) za pomocą igły 30 Ga. Oznacz rurkę, aby upewnić się, że końcówka znajduje się we właściwej pozycji w tchawicy podczas wkładania rurki ET. Za pomocą mikropompy wycofano tłok strzykawki, podczas gdy końcówka rurki została zanurzona w próbce MP, która miała zostać podana. Następnie załadowaną rurkę podającą wprowadzono do rurki intubacyjnej, umieszczając końcówkę w najsilniejszej części naszego oczekiwanego przyłożonego pola magnetycznego. Akwizycję obrazu kontrolowano za pomocą detektora oddechu podłączonego do naszego modułu czasowego opartego na Arduino, a wszystkie sygnały (np. temperatura, oddech, otwieranie/zamykanie migawki i akwizycja obrazu) rejestrowano za pomocą Powerlab i LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Podczas obrazowania Gdy obudowa była niedostępna, dwie kamery IP (Panasonic BB-SC382) były ustawione pod kątem około 90° względem siebie i służyły do ​​monitorowania położenia magnesu względem tchawicy podczas obrazowania (ryc. 2b, c). Aby zminimalizować artefakty ruchowe, podczas plateau przepływu końcowo-wydechowego pozyskiwano jeden obraz na oddech.
Magnes jest przymocowany do drugiego stopnia, który może być umieszczony zdalnie z zewnątrz obudowy obrazowania. Przetestowano różne pozycje i konfiguracje magnesu, w tym: Zamontowany pod kątem około 30° nad tchawicą (konfiguracje pokazano na rysunkach 2a i 3a); jeden magnes nad zwierzęciem, a drugi poniżej, z biegunami ustawionymi tak, aby przyciągały (rysunek 3b); jeden magnes nad zwierzęciem, a drugi poniżej, z biegunami ustawionymi tak, aby odpychały (rysunek 3c); oraz jeden magnes nad tchawicą i prostopadle do niej (rysunek 3d). Po skonfigurowaniu zwierzęcia i magnesu oraz załadowaniu testowanego MP do pompy strzykawkowej należy podać dawkę 50 μl z szybkością 4 μl/s, jednocześnie rejestrując obrazy. Następnie magnes jest przesuwany tam i z powrotem wzdłuż lub bocznie przez tchawicę, kontynuując rejestrowanie obrazów.
Konfiguracja magnesów do obrazowania in vivo (a) pojedynczy magnes nad tchawicą pod kątem około 30°, (b) dwa magnesy ustawione tak, aby przyciągały, (c) dwa magnesy ustawione tak, aby odpychały, (d) pojedynczy magnes nad tchawicą i prostopadle do niej. Obserwator spoglądał w dół od ust do płuc przez tchawicę, a wiązka promieni rentgenowskich przechodziła przez lewą stronę szczura i wychodziła prawą stroną. Magnes przesuwano wzdłuż dróg oddechowych lub w lewo i prawo nad tchawicą w kierunku wiązki promieni rentgenowskich.
Chcieliśmy również określić widoczność i zachowanie cząstek w drogach oddechowych przy braku zakłócających oddechów i ruchów serca. Dlatego też pod koniec okresu obrazowania zwierzęta zostały humanitarnie uśmiercone z powodu przedawkowania pentobarbitalu (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Niektóre zwierzęta pozostawiono na platformie obrazowania, a po zatrzymaniu oddechu i bicia serca powtórzono proces obrazowania, dodając dodatkową dawkę MP, jeśli nie było widać MP na powierzchni dróg oddechowych.
Uzyskane obrazy poddano korekcji pola płaskiego i pola ciemnego, a następnie zmontowano w film (20 klatek na sekundę; 15–25 × normalna prędkość w zależności od częstości oddechów) przy użyciu niestandardowego skryptu napisanego w środowisku MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Wszystkie badania nad dostarczaniem wektorów genowych LV przeprowadzono w Laboratory Animal Research Facility na Uniwersytecie w Adelajdzie. Ich celem było wykorzystanie wyników eksperymentu SPring-8 do oceny, czy dostarczanie LV-MP w obecności pola magnetycznego może poprawić transfer genów in vivo. Aby ocenić wpływ MP i pola magnetycznego, poddano leczeniu dwie grupy zwierząt: jednej grupie podawano LV-MP z umieszczonym magnesem, a drugiej grupie kontrolnej podawano LV-MP bez magnesu.
Wektory genu LV wygenerowano przy użyciu wcześniej opisanych metod25, 26. Wektor LacZ wyraża zlokalizowany w jądrze gen beta-galaktozydazy sterowany przez konstytutywny promotor MPSV (LV-LacZ), który wytwarza niebieski produkt reakcji w transdukowanych komórkach, widoczny w przednich warstwach tkanki płucnej i przekrojach tkanek. Miareczkowanie przeprowadzono w hodowlach komórkowych, ręcznie licząc liczbę komórek LacZ-dodatnich za pomocą hemocytometru, aby obliczyć miano w TU/ml. Nośniki kriokonserwowano w temperaturze -80 °C, rozmrażano przed użyciem i wiązano z CombiMag przez zmieszanie w stosunku 1:1 i inkubację na lodzie przez co najmniej 30 minut przed podaniem.
Zdrowe szczury Sprague Dawley (n = 3/grupa, ~2-3 znieczulono dootrzewnowo mieszaniną 0,4 mg/kg medetomidyny (Domitor, Ilium, Australia) i 60 mg/kg ketaminy (Ilium, Australia) w wieku miesięcy) i wykonano im bezoperacyjną doustną kaniulę za pomocą kaniuli 16 Ga dożylnie. Aby mieć pewność, że tkanka dróg oddechowych tchawicy otrzyma transdukcję LV, poddano ją kondycjonowaniu za pomocą naszego wcześniej opisanego protokołu zaburzeń mechanicznych, w którym powierzchnia dróg oddechowych tchawicy była pocierana osiowo drucianym koszykiem (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) przez 30 s28. Następnie, około 10 minut po zaburzeniu, wykonano dotchawicze podanie LV-MP w biologicznej komorze bezpieczeństwa.
Pole magnetyczne użyte w tym eksperymencie skonfigurowano w podobny sposób jak w badaniu obrazowania rentgenowskiego in vivo, przy czym te same magnesy umieszczono nad tchawicą za pomocą klipsów do stentu destylacyjnego (rysunek 4). Objętość 50 μl (2 × 25 μl alikwoty) LV-MP podano do tchawicy (n = 3 zwierzęta) za pomocą pipety zawierającej końcówkę żelową, jak opisano wcześniej. Grupa kontrolna (n = 3 zwierzęta) otrzymała te same LV-MP bez użycia magnesu. Po zakończeniu infuzji kaniula została usunięta z rurki ET, a zwierzę zostało ekstubowane. Magnes pozostaje na miejscu przez 10 minut, a następnie zostaje usunięty. Szczury otrzymały podskórną dawkę meloksykamu (1 ml/kg) (Ilium, Australia), a następnie odwrócono znieczulenie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe 1 mg/kg chlorowodorku atipamazolu (Antisedan, Zoetis, Australia). Szczury utrzymywano go w cieple i monitorowano aż do całkowitego wybudzenia ze znieczulenia.
Urządzenie do podawania leku LV-MP w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Widoczna jest jasnoszara końcówka Luer rurki dotchawiczej wystająca z otworu, a końcówka z żelem pokazana na zdjęciu jest wprowadzona przez rurkę dotchawiczą na żądaną głębokość do tchawicy.
Tydzień po podaniu dawki LV-MP zwierzęta uśmiercono w sposób humanitarny przez inhalację 100% CO2, a ekspresję LacZ oceniono przy użyciu naszego standardowego leczenia X-gal. Trzy najbardziej ogonowe pierścienie chrzęstne usunięto, aby upewnić się, że żadne uszkodzenia mechaniczne lub zatrzymanie płynu spowodowane umieszczeniem rurki intubacyjnej nie zostały uwzględnione w analizie. Każda tchawica została przecięta wzdłużnie, aby utworzyć dwie połówki do analizy, a następnie umieszczono je w naczyniu zawierającym gumę silikonową (Sylgard, Dow Inc) za pomocą igły Minutien (Fine Science Tools), aby uwidocznić powierzchnię światła. Dystrybucję i wzór przetransdukowanych komórek potwierdzono za pomocą fotografii czołowej przy użyciu mikroskopu Nikon (SMZ1500) z kamerą DigiLite i oprogramowaniem TCapture (Tucsen Photonics, Chiny). Obrazy uzyskano przy powiększeniu 20x (w tym przy najwyższym ustawieniu dla całej szerokości tchawicy), przy czym całą długość tchawicy obrazowano krok po kroku, zapewniając wystarczające nakładanie się między każdym obrazu, aby umożliwić „zszywanie” obrazów. Obrazy z każdej tchawicy zostały następnie zmontowane w pojedynczy obraz złożony przy użyciu edytora obrazów złożonych w wersji 2.0.3 (Microsoft Research) wykorzystującego algorytm ruchu planarnego. Obszary ekspresji LacZ w obrazach złożonych tchawicy każdego zwierzęcia zostały skwantyfikowane przy użyciu zautomatyzowanego skryptu MATLAB (R2020a, MathWorks) zgodnie z wcześniejszym opisem, przy użyciu ustawień 0,35 < Odcień < 0,58, Nasycenie > 0,15 i Wartość < 0,7. Poprzez śledzenie konturów tkanki, maska ​​została ręcznie wygenerowana w programie GIMP v2.10.24 dla każdego obrazu złożonego w celu zidentyfikowania obszaru tkanki i zapobieżenia fałszywym wykryciom spoza tkanki tchawicy. Zabarwione obszary ze wszystkich obrazów złożonych od każdego zwierzęcia zostały zsumowane w celu wygenerowania całkowitego obszaru zabarwionego dla tego zwierzęcia. Następnie obszar zabarwiony został podzielony przez całkowity obszar maski w celu wygenerowania obszaru znormalizowanego.
Każdą tchawicę zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki grubości 5 μm. Skrawki kontrastowano obojętną, trwałą czerwienią przez 5 minut, a obrazy uzyskano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse E400, kamery DS-Fi3 i oprogramowania do przechwytywania elementów NIS (wersja 5.20.00).
Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono w oprogramowaniu GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Istotność statystyczną ustalono na poziomie p ≤ 0,05. Normalność weryfikowano za pomocą testu Shapiro-Wilka, a różnice w barwieniu LacZ oceniano za pomocą testu t dla prób niezależnych.
Sześć MP opisanych w Tabeli 1 zbadano przy użyciu PCXI, a widoczność opisano w Tabeli 2. Dwa polistyrenowe MP (MP1 i MP2; odpowiednio 18 μm i 0,25 μm) nie były widoczne pod PCXI, ale pozostałe próbki były identyfikowalne (przykłady pokazano na Rysunku 5). MP3 i MP4 (10-15% Fe3O4; odpowiednio 0,25 μm i 0,9 μm) są słabo widoczne. Chociaż zawierały jedne z najmniejszych testowanych cząstek, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) było najbardziej widoczne. Produkt CombiMag MP6 jest trudny do zauważenia. We wszystkich przypadkach nasza zdolność wykrywania MP została znacznie zwiększona przez przesuwanie magnesu tam i z powrotem równolegle do kapilary. Gdy magnesy oddalały się od kapilary, cząstki rozciągały się w długie sznury, ale gdy magnesy zbliżały się, a pole magnetyczne siła wzrosła, ciągi cząstek skróciły się, gdy cząstki migrowały w kierunku górnej powierzchni kapilary (patrz film uzupełniający S1: MP4), zwiększając gęstość cząstek na powierzchni. Odwrotnie, gdy magnes zostanie usunięty z kapilary, natężenie pola maleje, a MP przekształcają się w długie ciągi rozciągające się od górnej powierzchni kapilary (patrz film uzupełniający S2: MP4). Po zatrzymaniu się magnesu cząstki nadal poruszają się przez krótki czas po osiągnięciu położenia równowagi. Gdy MP przesuwa się w kierunku górnej powierzchni kapilary i od niej, cząstki magnetyczne zazwyczaj przeciągają zanieczyszczenia przez płyn.
Widoczność MP w PCXI znacznie różni się między próbkami. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6. Wszystkie pokazane tutaj obrazy zostały wykonane za pomocą magnesu umieszczonego około 10 mm bezpośrednio nad kapilarą. Widoczne duże okręgi to pęcherzyki powietrza uwięzione w kapilarach, wyraźnie pokazujące czarno-białe cechy krawędzi obrazowania kontrastu fazowego. Czerwone pole zawiera powiększenie zwiększające kontrast. Należy pamiętać, że średnice schematów magnesów na wszystkich rysunkach nie są zgodne ze skalą i są około 100 razy większe niż pokazano.
Gdy magnes jest przesuwany w lewo i prawo wzdłuż górnej części kapilary, kąt ciągu MP zmienia się, aby wyrównać się z magnesem (patrz rysunek 6), wyznaczając w ten sposób linie pola magnetycznego. W przypadku MP3-5, po osiągnięciu przez cięciwę kąta progowego, cząstki są przeciągane wzdłuż górnej powierzchni kapilary. Często powoduje to, że cząstki MP skupiają się w większe grupy w pobliżu miejsca, w którym pole magnetyczne jest najsilniejsze (patrz film uzupełniający S3:MP5). Jest to szczególnie widoczne podczas obrazowania w pobliżu końca kapilary, co powoduje, że cząstki MP agregują i koncentrują się na granicy ciecz-powietrze. Cząstki w MP6, które były trudniejsze do rozróżnienia niż w MP3-5, nie były przeciągane, gdy magnes przesuwał się wzdłuż kapilary, ale ciągi MP rozpadały się, pozostawiając cząstki w polu widzenia (patrz film uzupełniający S4:MP6). W niektórych przypadkach, gdy przyłożone pole magnetyczne zostało zmniejszone przez przesunięcie magnesu na dużą odległość od miejsca obrazowania, wszelkie pozostałe cząstki MP powoli opadały na dolną powierzchnię rurki pod wpływem grawitacji, pozostając w sznurek (zobacz film uzupełniający S5: MP3).
Kąt struny MP zmienia się, gdy magnes przesuwa się w prawo nad kapilarą. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6. Czerwone pole zawiera powiększenie zwiększające kontrast. Należy pamiętać, że filmy uzupełniające mają charakter informacyjny, ponieważ ujawniają ważne informacje o strukturze cząstek i dynamice, których nie można zobaczyć na tych statycznych obrazach.
Nasze testy wykazały, że powolne przesuwanie magnesu tam i z powrotem wzdłuż tchawicy ułatwia wizualizację MP w kontekście złożonego ruchu in vivo. Testy in vivo nie zostały przeprowadzone, ponieważ kulki polistyrenowe (MP1 i MP2) nie były widoczne w kapilarze. Każdy z pozostałych czterech MP został przetestowany in vivo z długą osią magnesu skonfigurowaną nad tchawicą pod kątem około 30° do pionu (patrz rysunki 2b i 3a), ponieważ skutkowało to dłuższymi łańcuchami MP i było bardziej skuteczne niż zakończona konfiguracja magnesu. MP3, MP4 i MP6 nie zostały wykryte w tchawicy żadnych żywych zwierząt. Gdy drogi oddechowe szczurów zostały zobrazowane po humanitarnym uśmierceniu zwierząt, cząstki pozostały niewidoczne nawet po dodaniu dodatkowej objętości za pomocą pompy strzykawkowej. MP5 miał najwyższą zawartość tlenku żelaza i był jedyną widoczną cząstką, dlatego też został użyty do oceny i scharakteryzowania zachowania MP in vivo.
Umieszczenie magnesu nad tchawicą podczas porodu MP spowodowało, że wiele, ale nie wszystkie, MP skoncentrowały się w polu widzenia. Cząsteczki wchodzące do tchawicy są najlepiej obserwowane u zwierząt humanitarnie uśmiercanych. Rycina 7 i film uzupełniający S6: MP5 pokazują szybkie wychwytywanie magnetyczne i układanie cząstek na powierzchni brzusznej części tchawicy, co wskazuje, że MP można skierować do pożądanych obszarów tchawicy. Podczas przeszukiwania bardziej dystalnie wzdłuż tchawicy po porodzie MP, niektóre MP znaleziono bliżej wnęki tchawicy, co sugeruje, że natężenie pola magnetycznego było niewystarczające do zebrania i zatrzymania wszystkich MP, ponieważ zostały one dostarczone przez obszar o maksymalnym natężeniu pola magnetycznego podczas procesu płynowego. Niemniej jednak stężenia MP po porodzie były wyższe wokół obrazowanego obszaru, co sugeruje, że wiele MP pozostało w obszarach dróg oddechowych, w których przyłożone natężenie pola magnetycznego było najwyższe.
Obrazy (a) przed i (b) po podaniu MP5 do tchawicy niedawno uśpionego szczura, przy czym magnes umieszczono bezpośrednio nad obszarem obrazowania. Obszar obrazowania znajduje się pomiędzy dwoma pierścieniami chrząstki. Przed podaniem MP w drogach oddechowych znajduje się trochę płynu. Czerwone pole zawiera powiększenie zwiększające kontrast. Obrazy te pochodzą z filmu pokazanego w materiale dodatkowym S6:MP5.
Przesunięcie magnesu wzdłuż tchawicy in vivo spowodowało zmianę kąta łańcucha MP w obrębie powierzchni dróg oddechowych w sposób podobny do obserwowanego w naczyniach włosowatych (patrz Rysunek 8 i Materiał uzupełniający S7:MP5). Jednak w naszym badaniu MP nie mogły być przeciągane po powierzchni żywych dróg oddechowych, tak jak miało to miejsce w przypadku naczyń włosowatych. W niektórych przypadkach łańcuch MP będzie się wydłużał, gdy magnes będzie się poruszał w lewo i prawo. Co ciekawe, odkryliśmy również, że ciąg cząstek wydaje się zmieniać głębokość warstwy płynu powierzchniowego, gdy magnes jest przesuwany wzdłuż tchawicy, i rozszerza się, gdy magnes jest przesuwany bezpośrednio nad głową, a ciąg cząstek jest obracany do pozycji pionowej (patrz Materiał uzupełniający S7). :MP5 w 0:09, na dole po prawej). Charakterystyczny wzór ruchu zmienił się, gdy magnes został przesunięty wzdłuż górnej części tchawicy w kierunku bocznym (czyli w lewo lub prawo od zwierzęcia, a nie wzdłuż całej długości tchawicy). Cząsteczki były nadal wyraźnie widoczne podczas ruchu, ale gdy magnes został usunięty z tchawicy, końcówki ciągów cząstek stały się widoczne (patrz film uzupełniający S8:MP5, zaczynający się w 0:08). Jest to zgodne z zachowaniem MP, które zaobserwowaliśmy pod wpływem przyłożonego pola magnetycznego w szklanej kapilarze.
Przykładowe obrazy pokazujące MP5 w tchawicy żywego znieczulonego szczura. (a) Magnes jest używany do pozyskiwania obrazów powyżej i po lewej stronie tchawicy, a następnie (b) po przesunięciu magnesu w prawo. Czerwone pole zawiera powiększenie zwiększające kontrast. Obrazy te pochodzą z filmu pokazanego w materiale dodatkowym S7:MP5.
Gdy dwa bieguny skonfigurowano w orientacji północ-południe powyżej i poniżej tchawicy (tj. przyciąganie; rys. 3b), cięciwy MP wydawały się dłuższe i znajdowały się na ścianie bocznej tchawicy, a nie na jej grzbietowej powierzchni (patrz film uzupełniający S9:MP5). Jednak wysokie stężenia cząstek w jednym miejscu (tj. na grzbietowej powierzchni tchawicy) nie zostały wykryte po dostarczeniu płynu, gdy zastosowano urządzenie z dwoma magnesami, co zwykle ma miejsce, gdy stosuje się urządzenie z jednym magnesem. Następnie, gdy jeden magnes skonfigurowano tak, aby odpychał odwrócone bieguny (rys. 3c), liczba cząstek widocznych w polu widzenia nie wydawała się zwiększać po dostarczeniu. Konfiguracja obu konfiguracji z dwoma magnesami jest trudna ze względu na wysokie natężenia pola magnetycznego, które odpowiednio przyciąga lub odpycha magnesy. Następnie zmieniono konfigurację na pojedynczy magnes równoległy do ​​dróg oddechowych, ale przechodzący przez drogi oddechowe pod kątem 90 stopni, tak aby linie pola przecinały ścianę tchawicy prostopadle (rys. 3d), orientacja zaprojektowana w celu ustalenia, czy można zaobserwować agregację cząstek na ścianie bocznej. Jednak w tej konfiguracji nie zaobserwowano żadnego możliwego do zidentyfikowania ruchu akumulacji MP ani ruchu magnesu. Na podstawie wszystkich tych wyników wybrano konfigurację z pojedynczym magnesem i orientacją 30 stopni (rysunek 3a) do badań nośników genów in vivo.
Gdy zwierzę było wielokrotnie obrazowane bezpośrednio po humanitarnym uśmierceniu, brak zakłócającego ruchu tkanek oznaczał, że w czystym polu międzychrzęstnym można było dostrzec drobniejsze i krótsze linie cząstek, „chwiejne” zgodnie z ruchem translacyjnym magnesu. Niemniej jednak nadal nie można wyraźnie zobaczyć obecności i ruchu cząstek MP6.
Miano LV-LacZ wynosiło 1,8 × 108 TU/ml, a po wymieszaniu 1:1 z CombiMag MP (MP6) zwierzętom podano dotchawiczo 50 μl dawki nośnika LV wynoszącej 9 × 107 TU/ml (tj. 4,5 × 106 TU/szczur). W tych badaniach zamiast przesuwać magnes podczas porodu, unieruchomiliśmy magnes w jednej pozycji, aby określić, czy przekazywanie do LV (a) można poprawić w porównaniu z dostarczaniem wektora w nieobecności pola magnetycznego, i (b) można je skupić. Komórki dróg oddechowych są przekazywane do docelowych obszarów magnetycznych górnych dróg oddechowych.
Obecność magnesów i stosowanie CombiMag w połączeniu z wektorami LV nie wydaje się mieć negatywnego wpływu na zdrowie zwierząt, podobnie jak nasz standardowy protokół dostarczania wektorów LV. Obrazy czołowe okolicy tchawicy poddanej zaburzeniom mechanicznym (Rys. uzupełniający 1) wskazały, że w grupie zwierząt leczonych LV-MP, gdy obecny był magnes, odnotowano znacznie wyższe poziomy transdukcji (Rys. 9a). W grupie kontrolnej obecna była tylko niewielka ilość niebieskiego barwienia LacZ (Rys. 9b). Kwantyfikacja znormalizowanych obszarów barwionych X-Gal wykazała, że ​​podanie LV-MP w obecności pola magnetycznego spowodowało około 6-krotną poprawę (Rys. 9c).
Przykładowe obrazy złożone przedstawiające przekazywanie bodźców przez tchawicę za pomocą LV-MP (a) w obecności pola magnetycznego i (b) w nieobecności magnesu. (c) Statystycznie istotna poprawa znormalizowanego obszaru przekazywania LacZ w tchawicy przy użyciu magnesu (*p = 0,029, test t, n = 3 na grupę, średnia ± SEM).
Wycinki barwione obojętną, szybką czerwienią (przykład pokazany na ryc. uzupełniającym 2) wykazały obecność komórek barwionych LacZ w podobnym wzorze i lokalizacji, jak opisano wcześniej.
Kluczowym wyzwaniem dla terapii genowej dróg oddechowych pozostaje dokładna lokalizacja cząstek nośnikowych w obszarach zainteresowania i osiągnięcie wysokiego poziomu wydajności transdukcji w ruchomym płucu w obecności przepływu powietrza i aktywnego oczyszczania śluzu. W przypadku nośników LV zaprojektowanych do leczenia choroby dróg oddechowych związanej z mukowiscydozą wydłużenie czasu przebywania cząstek nośnikowych w przewodzących drogach oddechowych było dotychczas nieuchwytnym celem. Jak wskazali Castellani i in., wykorzystanie pól magnetycznych w celu poprawy transdukcji ma zalety w porównaniu z innymi metodami dostarczania genów, takimi jak elektroporacja, ponieważ łączy w sobie prostotę, opłacalność, lokalizację dostarczania, zwiększoną wydajność i krótsze czasy inkubacji, a także potencjalnie mniejszą dawkę nośnika10. Jednakże nigdy nie opisano osadzania się i zachowania cząstek magnetycznych in vivo w drogach oddechowych pod wpływem zewnętrznych sił magnetycznych, ani też nie wykazano in vivo wykonalności tej metody w celu zwiększenia poziomów ekspresji genów w nienaruszonych żywych drogach oddechowych.
Nasze eksperymenty in vitro z wykorzystaniem synchrotronu PCXI wykazały, że wszystkie testowane przez nas cząstki, z wyjątkiem polistyrenu MP, były widoczne w zastosowanym przez nas układzie obrazowania. W obecności pola magnetycznego cząstki MP tworzą struny, których długość zależy od rodzaju cząstek i natężenia pola magnetycznego (tj. bliskości i ruchu magnesu). Jak pokazano na rysunku 10, obserwowane struny powstają w wyniku namagnesowania każdej pojedynczej cząstki i wytworzenia przez nią własnego lokalnego pola magnetycznego. Te oddzielne pola powodują agregację i łączenie się innych podobnych cząstek, przy czym ruchy grup przypominające struny są wynikiem lokalnych sił pochodzących od lokalnych sił przyciągania i odpychania innych cząstek.
Schemat przedstawiający (a, b) ciągi cząstek powstające wewnątrz naczyń włosowatych wypełnionych płynem oraz (c, d) tchawicę wypełnioną powietrzem. Należy zauważyć, że naczynia włosowate i tchawica nie są narysowane w skali. Panel (a) zawiera również opis MP, który zawiera cząstki Fe3O4 ułożone w ciągi.
Gdy magnes został przesunięty nad kapilarę, kąt ciągu cząstek osiągnął próg krytyczny dla MP3-5 zawierającego Fe3O4, po czym ciąg cząstek nie pozostawał już w pierwotnej pozycji, ale przesunął się wzdłuż powierzchni do nowej pozycji.magnes. Ten efekt prawdopodobnie występuje, ponieważ powierzchnia szklanej kapilary jest wystarczająco gładka, aby umożliwić ten ruch.Co ciekawe, MP6 (CombiMag) nie zachowywał się w ten sposób, prawdopodobnie dlatego, że cząstki były mniejsze, miały różne powłoki lub ładunki powierzchniowe lub zastrzeżony płyn nośny wpłynął na ich zdolność do poruszania się.Kontrast obrazu cząstek CombiMag jest również słabszy, co sugeruje, że płyn i cząstki mogą mieć podobne gęstości i dlatego nie mogą łatwo zbliżać się do siebie.Cząstki mogą również utknąć, jeśli magnes porusza się zbyt szybko, co wskazuje, że siła pola magnetycznego nie zawsze może pokonać tarcie między cząstkami w płynie, co sugeruje, że być może nie jest zaskakujące, że siła pola magnetycznego i odległość między magnesem a obszarem docelowym Bardzo ważne.W sumie wyniki te sugerują również, że podczas gdy magnesy mogą wychwytywać wiele MP przepływających przez obszar docelowy, mało prawdopodobne jest, aby można było polegać na magnesach w celu przemieszczania cząstek CombiMag wzdłuż powierzchni tchawicy. Dlatego też dochodzimy do wniosku, że badania in vivo LV-MP powinny wykorzystywać statyczne pola magnetyczne w celu fizycznego oddziaływania na określone obszary dróg oddechowych.
Gdy cząstki dostaną się do organizmu, trudno je zidentyfikować w kontekście złożonej, ruchomej tkanki ciała, ale możliwość ich wykrywania została zwiększona poprzez poziome przesunięcie magnesu nad tchawicą w celu „poruszania” sznurkami MP. Chociaż możliwe jest obrazowanie na żywo, łatwiej jest dostrzec ruch cząstek, gdy zwierzę zostanie humanitarnie zabite. Stężenia MP były na ogół najwyższe w tym miejscu, gdy magnes był umieszczony nad obszarem obrazowania, chociaż niektóre cząstki zwykle znajdowano dalej wzdłuż tchawicy. W przeciwieństwie do badań in vitro, cząstek nie można przeciągać wzdłuż tchawicy poprzez przesuwanie magnesu. Odkrycie to jest zgodne ze sposobem, w jaki śluz pokrywający powierzchnię tchawicy zazwyczaj przetwarza wdychane cząstki, zatrzymując je w śluzie, a następnie usuwając przez mechanizm oczyszczania śluzowo-rzęskowego.
Postawiliśmy hipotezę, że użycie magnesów do przyciągania powyżej i poniżej tchawicy (rys. 3b) może skutkować bardziej jednolitym polem magnetycznym, a nie polem magnetycznym silnie skoncentrowanym w jednym punkcie, co potencjalnie prowadzi do bardziej równomiernego rozkładu cząstek. Jednak nasze wstępne badanie nie znalazło wyraźnych dowodów na poparcie tej hipotezy. Podobnie, skonfigurowanie pary magnesów do odpychania (rys. 3c) nie skutkowało większym osadzaniem cząstek w obrazowanym obszarze. Te dwa ustalenia pokazują, że konfiguracja z dwoma magnesami nie poprawia znacząco lokalnej kontroli kierowania MP, a wynikające z tego silne siły magnetyczne są trudne do skonfigurowania, co czyni to podejście mniej praktycznym. Podobnie, zorientowanie magnesu powyżej i przez tchawicę (rys. 3d) również nie zwiększyło liczby cząstek zatrzymanych w obrazowanym obszarze. Niektóre z tych alternatywnych konfiguracji mogą być nieskuteczne, ponieważ skutkują niższymi natężeniami pola magnetycznego w obszarze osadzania. Dlatego konfiguracja pojedynczego magnesu pod kątem 30 stopni (rys. 3a) jest uważana za najłatwiejszą i najskuteczniejsza metoda badań in vivo.
Badanie LV-MP wykazało, że gdy wektory LV połączono z CombiMag i podano po zaburzeniu fizycznym w obecności pola magnetycznego, poziomy transdukcji w tchawicy były znacząco wyższe w porównaniu z grupą kontrolną. Na podstawie badań obrazowania synchrotronowego i wyników LacZ, pole magnetyczne najwyraźniej było w stanie zachować LV w tchawicy i zmniejszyć liczbę cząstek wektora, które natychmiast wnikały głęboko do płuc. Takie udoskonalenia w zakresie ukierunkowania mogą prowadzić do wyższej skuteczności przy jednoczesnym zmniejszeniu dostarczonych miana, transdukcji poza celem, działań niepożądanych ze strony układu zapalnego i odpornościowego oraz kosztów nośników genów. Co ważne, według producenta, CombiMag można stosować w połączeniu z innymi metodami transferu genów, w tym z innymi wektorami wirusowymi (takimi jak AAV) i kwasami nukleinowymi.