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I vettori genetichi per u trattamentu di a malatia pulmonare di fibrosi cistica devenu indirizzà e vie aeree conduttrici perchè a trasduzione pulmonare periferica ùn furnisce micca benefiziu terapeuticu. L'efficienza di a trasduzione virale hè direttamente ligata à u tempu di residenza di u vettore. Tuttavia, i fluidi di consegna cum'è i purtatori di geni si diffondenu naturalmente in l'alveoli durante l'ispirazione, è e particelle terapeutiche di qualsiasi forma sò rapidamente eliminate da u trasportu mucociliare. Prulungà u tempu di residenza di i purtatori di geni in e vie aeree hè impurtante ma difficiule da ottene. E particelle magnetiche cunjugate à u purtatore di geni chì ponu esse dirette à a superficia di e vie aeree ponu migliurà u targeting regiunale. A causa di e sfide di a visualizazione in vivo, u cumpurtamentu di tali piccule particelle magnetiche nantu à a superficia di e vie aeree in presenza di un campu magneticu applicatu hè pocu capitu. U scopu di questu studiu era di utilizà l'imaghjini di sincrotrone per visualizà u muvimentu in vivo di una seria di particelle magnetiche in a trachea di ratti anestetizzati per esaminà a dinamica è i mudelli di cumpurtamentu di e particelle individuali è in massa in vivo. Avemu ancu valutatu se a consegna di particelle magnetiche lentivirali in presenza di un campu magneticu aumenterebbe l'efficienza di trasduzione in a trachea di u rattu. Sincrotrone L'imaghjini à raggi X rivelanu u cumpurtamentu di e particelle magnetiche in campi magnetichi stazionarii è in muvimentu in vitro è in vivo. E particelle ùn ponu esse trascinate facilmente longu a superficia di e vie aeree viventi cù magneti, ma durante u trasportu, i depositi sò cuncentrati in u campu visuale induve u campu magneticu hè u più forte. L'efficienza di trasduzione hè stata ancu aumentata sei volte quandu e particelle magnetiche lentivirali sò state consegnate in presenza di un campu magneticu. Inseme, questi risultati suggerenu chì e particelle magnetiche lentivirali è i campi magnetichi ponu esse approcci preziosi per migliurà u targeting di i vettori genetichi è aumentà i livelli di trasduzione in e vie aeree conduttrici in vivo.
A fibrosi cistica (FC) hè causata da a variazione di un unicu genu chjamatu regulatore di conduttanza transmembrana CF (CFTR). A proteina CFTR hè un canale ionicu presente in parechje cellule epiteliali in tuttu u corpu, cumprese e vie aeree conduttrici, un situ maiò di patogenesi CF. I difetti CFTR portanu à un trasportu anormale di l'acqua, disidratendu a superficia di e vie aeree è riducendu a prufundità di u stratu liquidu di a superficia di e vie aeree (ASL). Questu impedisce ancu a capacità di u sistema di trasportu mucociliare (MCT) di eliminà e particelle inalate è i patogeni da e vie aeree. U nostru scopu hè di sviluppà una terapia genica lentivirale (LV) per furnisce a copia curretta di u genu CFTR è migliurà a salute ASL, MCT è pulmonare, è di cuntinuà à sviluppà nuove tecnulugie capaci di misurà questi parametri in vivo1.
I vettori LV sò unu di i principali candidati per a terapia genica di e vie aeree CF, principalmente perchè ponu integrà permanentemente u genu terapeuticu in e cellule basali di e vie aeree (cellule staminali di e vie aeree). Questu hè impurtante perchè ponu restaurà l'idratazione nurmale è a pulizia di u mucus differenziendu si in cellule di superficie di e vie aeree associate à a CF currette da i geni funziunali, risultendu in benefici per tutta a vita. I vettori LV devenu esse diretti contr'à e vie aeree conduttrici, postu chì hè quì chì a malatia pulmonare CF principia. A consegna di u vettore più in fondu in u pulmone pò risultà in una trasduzione alveolare, ma questu ùn hà alcun benefiziu terapeuticu in a CF. Tuttavia, i fluidi cum'è i purtatori di geni migranu naturalmente versu l'alveoli dopu l'ispirazione dopu a consegna3,4 è e particelle terapeutiche sò rapidamente eliminate in a cavità orale da MCT. L'efficienza di a trasduzione LV hè direttamente ligata à a durata di u tempu chì u vettore ferma accantu à e cellule bersaglio per permette l'assorbimentu cellulare - u "tempu di residenza"5 - chì hè facilmente riduttu da u flussu d'aria regiunale tipicu è ancu da a cattura coordinata di u mucus di e particelle è MCT. Per a CF, a capacità di prolongà u tempu di residenza di u LV in e vie aeree hè impurtante per ottene alti livelli di trasduzione in questa regione, ma finu à avà hè stata difficiule.
Per superà questu ostaculu, suggeremu chì e particelle magnetiche LV (MP) possinu aiutà in dui modi cumplementari. Prima, ponu esse guidate magneticamente versu a superficia di e vie aeree per migliurà u targeting è aiutà e particelle di trasportu di geni à reside in a regione desiderata di e vie aeree; è ASL) per spustassi versu u stratu cellulare 6. L'MP sò stati largamente aduprati cum'è veiculi di consegna di farmaci mirati quandu si leganu à anticorpi, farmaci chemioterapici, o altre piccule molecule chì si attaccanu à e membrane cellulari o si leganu à i recettori di a superficia cellulare pertinenti è si accumulanu in i siti tumorali in presenza di elettricità statica. Campi Magnetici per u Trattamentu di u Cancru 7. Altre tecniche "ipertermali" miranu à riscaldà i MP quandu sò esposti à campi magnetichi oscillanti, distruggendu cusì e cellule tumorali. U principiu di a trasfezione magnetica, in u quale un campu magneticu hè adupratu cum'è agente di trasfezione per migliurà u trasferimentu di DNA à e cellule, hè cumunamente adupratu in vitro aduprendu una gamma di vettori genichi non virali è virali per linee cellulari difficili da trasduce. L'efficacia di a magnetotrasfezione LV hè stata stabilita, cù a consegna in vitro di LV-MP à una linea cellulare epiteliale bronchiale umana in presenza di un campu magneticu staticu, aumentendu l'efficienza di trasduzione di 186 volte paragunata à u vettore LV solu. LV-MP hè statu ancu applicatu à un mudellu CF in vitro, induve a trasfezione magnetica hà aumentatu a trasduzione LV in culture di interfaccia aria-liquidu di 20 volte in presenza di sputum CF10. Tuttavia, a magnetotrasfezione in vivo di organi hà ricevutu relativamente poca attenzione è hè stata valutata solu in pochi studii animali11,12,13,14,15, in particulare in u pulmoni16,17. Eppuru, l'opportunità per a trasfezione magnetica in a terapia pulmonare CF sò chjare. Tan et al. (2020) anu dichjaratu chì "un studiu di prova di cuncettu di una somministrazione pulmonare efficiente di nanoparticelle magnetiche apre a strada à e future strategie di inalazione CFTR per migliurà i risultati clinichi in i pazienti CF"6.
U cumpurtamentu di e piccule particelle magnetiche nantu à e superfici di e vie aeree in presenza di un campu magneticu applicatu hè difficiule da visualizà è studià, è dunque pocu capitu. In altri studii, avemu sviluppatu un metudu di imaging à raggi X à cuntrastu di fase basatu annantu à a propagazione di sincrotrone (PB-PCXI) per visualizà è quantificà in modu non invasivu i cambiamenti in vivo minuti in a prufundità ASL18 è u cumpurtamentu MCT19,20 per misurà direttamente l'idratazione di a superficia di u canale di gas è hè statu utilizatu cum'è un indicatore precoce di l'efficacia di u trattamentu. Inoltre, u nostru metudu di valutazione MCT utilizza particelle di diametru 10-35 µm cumposte da allumina o vetru à altu indice di rifrazione cum'è marcatori MCT visibili cù PB-PCXI21. E duie tecniche sò adatte per a visualizazione di una gamma di tipi di particelle, cumprese MP.
A causa di a so alta risoluzione spaziale è temporale, e nostre tecniche d'analisi ASL è MCT basate nantu à PB-PCXI sò adatte per esaminà a dinamica è i mudelli di cumpurtamentu di e particelle singole è in massa in vivo per aiutà ci à capisce è ottimizà e tecniche di consegna di u genu MP. L'approcciu chì impieghemu quì deriva da i nostri studii utilizendu a linea di fasciu SPring-8 BL20B2, in a quale avemu visualizatu u muvimentu di u fluidu dopu a consegna di a dosa vettoriale simulata in e vie aeree nasali è pulmonari di i topi per aiutà à spiegà i nostri mudelli d'espressione genica non uniformi osservati in i nostri studii nantu à l'animali cù dosi di trasportatori di geni 3,4.
U scopu di questu studiu era di utilizà u sincrotrone PB-PCXI per visualizà i movimenti in vivo di una seria di MP in a trachea di ratti viventi. Quessi studii d'imaghjini PB-PCXI sò stati cuncipiti per testà una gamma di MP, forze di campu magneticu è locu per determinà u so effettu nantu à u muvimentu di MP. Avemu ipotizzatu chì un campu magneticu applicatu esternamente aiuterebbe u MP furnitu à stà o à spustassi in a zona di destinazione. Quessi studii ci anu ancu permessu di identificà cunfigurazioni di magneti chì massimizanu u numeru di particelle ritenute in a trachea dopu a deposizione. In una seconda seria di studii, avemu cercatu di utilizà sta cunfigurazione ottima per dimustrà u mudellu di trasduzione risultante da a consegna in vivo di LV-MP à e vie aeree di u rattu, basatu annantu à l'ipotesi chì a consegna di LV-MP in u cuntestu di u targeting di e vie aeree avaria risultatu in una migliore efficienza di trasduzione LV.
Tutti i studii nantu à l'animali sò stati realizati secondu i protokolli appruvati da l'Università di Adelaide (M-2019-060 è M-2020-022) è u Cumitatu d'Etica Animale di u Sincrotrone SPring-8. L'esperimenti sò stati realizati secondu e linee guida ARRIVE.
Tutte l'imaghjini à raggi X sò state realizate à a linea di fasciu BL20XU di u sincrotrone SPring-8 in Giappone, utilizendu una cunfigurazione simile à quella descritta prima21,22. In breve, a scatula sperimentale era situata à 245 m da l'anellu di almacenamentu di u sincrotrone. Una distanza campione-detector di 0,6 m hè aduprata per studii d'imaghjini di particelle è 0,3 m per studii d'imaghjini in vivo per generà effetti di cuntrastu di fase. Hè stata aduprata una energia di fasciu monocromaticu di 25 keV. L'imaghjini sò state catturate utilizendu un convertitore di raggi X à alta risoluzione (SPring-8 BM3) accoppiatu à un detector sCMOS. U convertitore cunverte i raggi X in luce visibile utilizendu un scintillatore di 10 µm di spessore (Gd3Al2Ga3O12), chì hè poi direttu à un sensore sCMOS utilizendu un obiettivu di microscopiu × 10 (NA 0.3). U detector sCMOS era Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Giappone) cù una dimensione di matrice di 2048 × 2048 pixel è una dimensione di pixel grezza di 6,5 × 6,5 µm. Questa cunfigurazione produce una dimensione di pixel isotropica effettiva di 0,51 µm è un campu di vista di circa 1,1 mm × 1,1 mm. Una lunghezza di esposizione di 100 ms hè stata scelta per massimizà u rapportu segnale-rumore di e particelle magnetiche dentru è fora di e vie aeree, minimizendu al contempo l'artefatti di muvimentu indotti da a respirazione. Per i studii in vivo, un otturatore rapidu à raggi X hè statu piazzatu in u percorsu di i raggi X per limità a dosa di radiazioni bluccendu u fasciu di raggi X trà l'esposizioni.
U trasportatore LV ùn hè statu utilizatu in alcun studiu d'imaghjini SPring-8 PB-PCXI perchè a camera d'imaghjini BL20XU ùn hè micca certificata Biosafety Level 2. Invece, avemu sceltu una gamma di MP ben caratterizati da dui fornitori cummerciali - chì coprenu una gamma di dimensioni, materiali, concentrazioni di ferru è applicazioni - prima per capisce cumu i campi magnetichi influenzanu u muvimentu di MP in i capillari di vetru, è dopu in e vie aeree viventi. nantu à a superficia. I MP varianu in grandezza da 0,25 à 18 μm è sò fatti di una varietà di materiali (vede a Tabella 1), ma a cumpusizione di ogni campione, cumprese a dimensione di e particelle magnetiche in u MP, hè scunnisciuta. Basatu annantu à i nostri ampi studii MCT 19, 20, 21, 23, 24, ci aspettiamu chì MP di dimensioni pari à 5 μm possinu esse visti nantu à a superficia di e vie aeree tracheali, per esempiu sottraendu fotogrammi consecutivi per vede una visibilità migliorata di u muvimentu di MP. Un unicu MP di dimensioni di 0,25 μm hè più chjucu di a risoluzione di u dispusitivu d'imaghjini, ma si prevede chì PB-PCXI rilevi u so cuntrastu di vulume è u muvimentu di u fluidu superficiale nantu à u quale sò depositati dopu a deposizione.
I campioni per ogni MP in a Tavula 1 sò stati preparati in capillari di vetru di 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) cù un diametru internu di 0,63 mm. E particelle corpusculari sò dispunibili in acqua, mentre chì e particelle CombiMag sò dispunibili in u fluidu pruprietariu di u fabricatore. Ogni tubu hè pienu à metà di liquidu (circa 11 μl) è piazzatu nantu à u supportu di u campione (vede a Figura 1). I capillari di vetru sò stati piazzati orizzontalmente nantu à u palcuscenicu di u campione in a scatula di imaging, rispettivamente, è pusizionati i bordi di u fluidu. Un magnete di 19 mm di diametru (28 mm di lunghezza) di nichel, neodimio, ferru, boro (NdFeB) di terre rare (N35, cat. n. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) cù una magnetizazione residuale di 1,17 Tesla hè statu attaccatu à un palcuscenicu di traslazione separatu per ottene Cambià a so pusizione à distanza durante l'imaging. L'acquisizione di l'imagine à raggi X principia quandu u magnete hè pusizionatu circa 30 mm sopra u campione, è l'imagine sò acquistate à una velocità di 4 fotogrammi per secondu. Durante l'imaging, u magnete hè statu purtatu vicinu à u tubu capillare di vetru (circa 1 mm di distanza) è dopu traslatu longu u tubu per valutà l'effetti di l'intensità di u campu è di a pusizione.
Cunfigurazione d'imaghjini in vitro chì cuntene campioni MP in capillari di vetru nantu à u palcuscenicu di traduzzione xy di u campione. U percorsu di u fasciu di raggi X hè marcatu cù una linea tratteggiata rossa.
Una volta stabilita a visibilità in vitro di i MP, un sottogruppu di elli hè statu testatu in vivo in ratti Wistar albini femine di tipu salvaticu (~ 12 settimane, ~ 200 g). 0,24 mg / kg di medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Giappone), 3,2 mg / kg di midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Giappone) è 4 mg / kg di butorfanolo (Vetorphale®, Meiji Seika) I ratti sò stati anestetizzati cù una mistura di Pharma), Giappone) per iniezione intraperitoneale. Dopu l'anestesia, sò stati preparati per l'imaging eliminendu a pelliccia intornu à a trachea, inserendu un tubu endotracheale (ET; cannula iv 16 Ga, Terumo BCT) è immobilizzenduli supini nantu à una piastra di imaging fatta à misura chì cuntene una sacca termica per mantene a temperatura di u corpu 22. A piastra di imaging hè stata poi attaccata à u stadiu di traslazione di u campione in a scatula di imaging cù un ligeru angulu per allineà a trachea orizzontalmente in l'immagine à raggi X, cum'è mostratu in a Figura. 2a.
(a) Cunfigurazione di l'imaghjini in vivo in a scatula d'imaghjini SPring-8, u percorsu di u fasciu di raggi X hè marcatu cù una linea tratteggiata rossa. (b, c) A lucalizazione di u magnetu nantu à a trachea hè stata realizata à distanza utilizendu duie camere IP muntate ortogonalmente. À manca di l'imagine di u schermu, si pò vede u cappiu di filu chì tene a testa, è a cannula di consegna in u locu in u tubu ET.
Un sistema di pompa di siringa à cuntrollu remotu (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) chì utilizava una siringa di vetru di 100 μl hè statu cunnessu à un tubu PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) via un agulla di 30 Ga. Marcate u tubu per assicurà chì a punta sia in a pusizione curretta in a trachea quandu si inserisce u tubu ET. Usendu a micropompa, u pistone di a siringa hè statu ritiratu mentre a punta di u tubu era immersa in u campione MP da esse furnitu. U tubu di consegna caricatu hè statu poi inseritu in u tubu endotracheale, piazzendu a punta in a parte più forte di u nostru campu magneticu applicatu previstu. L'acquisizione di l'imagine hè stata cuntrullata utilizendu un rilevatore di respirazione cunnessu à a nostra scatula di timing basata nantu à Arduino, è tutti i signali (per esempiu, temperatura, respirazione, apertura/chiusura di l'otturatore è acquisizione di l'imagine) sò stati registrati utilizendu Powerlab è LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Durante l'imaghjini Quandu u recintu era inaccessibile, duie camere IP (Panasonic BB-SC382) sò state posizionate à circa 90° l'una da l'altra è sò state aduprate per monitorà a pusizione di u magnetu in relazione à à a trachea durante l'imaghjini (Fig. 2b,c). Per minimizà l'artefatti di muvimentu, hè stata acquistata una maghjina per respirazione durante u plateau di flussu di fine marea.
Un magnetu hè attaccatu à una seconda tappa chì pò esse situata à distanza da fora di l'alloghju di l'imaghjini. Diverse pusizioni è cunfigurazioni di magneti sò state testate, cumprese: Muntatu à un angulu di circa 30° sopra a trachea (cunfigurazioni mostrate in e Figure 2a è 3a); un magnetu sopra l'animale è l'altru sottu, cù i poli disposti per attirà (Figura 3b); un magnetu sopra l'animale è l'altru sottu, cù i poli disposti per respinghje (Figura 3c); è un magnetu sopra è perpendiculare à a trachea (Figura 3d). Una volta chì l'animale è u magnetu sò cunfigurati è u MP da testà hè caricatu in a pompa di a siringa, furnisce una dosa di 50 μl à una velocità di 4 μl/sec mentre acquisite immagini. U magnetu hè poi mossu avanti è indietro longu o lateralmente attraversu a trachea mentre cuntinueghja à acquistà immagini.
Cunfigurazione di i magneti per l'imaghjini in vivo (a) un unicu magnetu sopra a trachea à un angulu di circa 30°, (b) dui magneti disposti per attirà, (c) dui magneti disposti per respinghje, (d) un unicu magnetu sopra è perpendiculare in a trachea. L'osservatore hà guardatu in ghjò da a bocca à i pulmoni attraversu a trachea, è u fasciu di raggi X hè passatu per u latu sinistro di u topu è hè surtitu da u latu drittu. U magnetu hè spustatu longu a lunghezza di e vie aeree o à manca è à diritta sopra a trachea in a direzzione di u fasciu di raggi X.
Avemu ancu cercatu di determinà a visibilità è u cumpurtamentu di e particelle in e vie aeree in assenza di respirazione è muvimentu cardiacu cunfusi. Dunque, à a fine di u periodu d'imaghjini, l'animali sò stati uccisi umanamente per sobredose di pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Certi animali sò stati lasciati nantu à a piattaforma d'imaghjini, è una volta chì a respirazione è u battitu cardiacu si sò fermati, u prucessu d'imaghjini hè statu ripetutu, aghjunghjendu una dosa supplementaria di MP se ùn ci era micca MP visibile nantu à a superficia di e vie aeree.
L'imagine acquistate sò state currette in campu pianu è in campu scuru è dopu assemblate in un filmu (20 fotogrammi per seconda; 15-25 × velocità nurmale secondu a frequenza respiratoria) utilizendu un script persunalizatu scrittu in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tutti i studii di consegna di vettori di geni LV sò stati realizati à u Laboratoriu Animal Research Facility di l'Università di Adelaide è avianu cum'è scopu di utilizà i risultati di l'esperimentu SPring-8 per valutà se a consegna di LV-MP in presenza di un campu magneticu puderia migliurà u trasferimentu di geni in vivo. Per valutà l'effetti di MP è di u campu magneticu, dui gruppi d'animali sò stati trattati: un gruppu hà ricevutu LV-MP cù un magnetu piazzatu, è l'altru gruppu hà ricevutu un gruppu di cuntrollu cù LV-MP senza magnetu.
I vettori di u genu LV sò stati generati aduprendu metudi descritti prima 25, 26. U vettore LacZ esprime u genu di a beta-galactosidasi lucalizatu in u nucleu guidatu da u promotore custitutivu MPSV (LV-LacZ), chì produce un pruduttu di reazione blu in e cellule trasdotte, visibile in i fronti di u tissutu pulmonariu è in e sezioni di tissutu. A titolazione hè stata realizata in culture cellulari cuntendu manualmente u numeru di cellule LacZ positive cù un emocitometru per calculà u titulu in TU/ml. I trasportatori sò crioconservati à -80 °C, scongelati prima di l'usu, è ligati à CombiMag mischjendu à un rapportu 1:1 è incubando nantu à u ghjacciu per almenu 30 minuti prima di a consegna.
I ratti Sprague Dawley nurmali (n = 3/gruppu, ~2-3 sò stati anestetizzati intraperitonealmente cù una mistura di 0,4 mg/kg di medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) è 60 mg/kg di ketamina (Ilium, Australia) (mesi d'età) ip) iniezione è cannulazione orale non chirurgica cù una cannula iv di 16 Ga. Per assicurà chì u tissutu di e vie aeree tracheali riceva a trasduzione LV, hè statu cundiziunatu utilizendu u nostru protocolu di perturbazione meccanica descrittu prima, in u quale a superficia di e vie aeree tracheali hè stata strofinata assialmente cù un cestinu di filu (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. L'amministrazione tracheale di LV-MP hè stata poi effettuata in una cabina di sicurezza biologica circa 10 minuti dopu a perturbazione.
U campu magneticu utilizatu in questu esperimentu hè statu cunfiguratu in modu simile à u studiu di imaging à raggi X in vivo, cù i stessi magneti tenuti sopra a trachea utilizendu clip di stent di distillazione (Figura 4). Un vulume di 50 μl (2 × 25 μl aliquote) di LV-MP hè statu amministratu in a trachea (n = 3 animali) utilizendu una pipetta chì cuntene una punta di gel cum'è descrittu prima. Un gruppu di cuntrollu (n = 3 animali) hà ricevutu i stessi LV-MP senza l'usu di un magnetu. Dopu chì l'infusione hè cumpleta, a cannula hè rimossa da u tubu ET è l'animale hè estubatu. U magnetu ferma in piazza per 10 minuti, poi hè rimossu. I ratti anu ricevutu una dosa sottutanea di meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguita da l'inversione di l'anestesia per iniezione ip di 1 mg/kg di cloridrato di atipamazolo (Antisedan, Zoetis, Australia). I ratti sò stati tenuti caldi è monitorati finu à a piena ripresa da l'anestesia.
Dispositivu di consegna LV-MP in una cabina di sicurezza biologica. U mozzu Luer grisgiu chjaru di u tubu ET pò esse vistu spuntà da a bocca è a punta di gel di a pipetta mostrata in l'imagine hè inserita attraversu u tubu ET à a prufundità desiderata in a trachea.
Una settimana dopu à a prucedura di dosaggio LV-MP, l'animali sò stati uccisi umanamente per inalazione di CO2 à 100% è l'espressione di LacZ hè stata valutata utilizendu u nostru trattamentu standard X-gal. I trè anelli caudali più cartilaginosi sò stati rimossi per assicurà chì qualsiasi dannu meccanicu o ritenzione di fluidi da u piazzamentu di u tubu endotracheale ùn sia micca inclusu in l'analisi. Ogni trachea hè stata tagliata longitudinalmente per creà duie metà per l'analisi, è sò state muntate in un piattu chì cuntene gomma siliconica (Sylgard, Dow Inc) utilizendu un agulla Minutien (Fine Science Tools) per visualizà a superficia luminale. A distribuzione è u mudellu di e cellule trasdotte sò stati cunfirmati da a fotografia frontale utilizendu un microscopiu Nikon (SMZ1500) cù una camera DigiLite è u software TCapture (Tucsen Photonics, Cina). L'imaghjini sò state acquistate à un ingrandimentu di 20x (cumprendu l'impostazione più alta per a larghezza cumpleta di a trachea), cù tutta a lunghezza di a trachea ripresa passu à passu, assicurendu una sovrapposizione sufficiente trà ogni maghjina per permette a "cucitura" di l'imaghjini. L'imaghjini di ogni trachea sò state poi assemblate. in una sola maghjina cumposta aduprendu Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) utilizendu un algoritmu di muvimentu planare. L'aree d'espressione LacZ in l'imagine cumposte di a trachea di ogni animale sò state quantificate aduprendu un script MATLAB automatizatu (R2020a, MathWorks) cum'è descrittu prima, aduprendu paràmetri di 0,35 < Tonalità < 0,58, Saturazione > 0,15 è Valore < 0,7. Tracciendu i contorni di u tissutu, una maschera hè stata generata manualmente in GIMP v2.10.24 per ogni maghjina cumposta per identificà l'area di u tissutu è impedisce ogni falsa rilevazione da fora di u tissutu tracheale. L'aree culurite da tutte l'imagine cumposte di ogni animale sò state summate per generà l'area culurita tutale per quellu animale. L'area culurita hè stata poi divisa per l'area tutale di a maschera per generà l'area nurmalizzata.
Ogni trachea hè stata inclusa in paraffina è sò state tagliate sezioni di 5 μm. E sezioni sò state contracolorate cù rossu neutru veloce per 5 minuti è l'imaghjini sò state acquisite cù un microscopiu Nikon Eclipse E400, una camera DS-Fi3 è un software di cattura di elementi NIS (versione 5.20.00).
Tutte l'analisi statistiche sò state realizate in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). A significatività statistica hè stata fissata à p ≤ 0,05. A nurmalità hè stata verificata cù u test Shapiro-Wilk, è e differenze in a culurazione LacZ sò state valutate cù u test t micca appaiatu.
I sei MP descritti in a Tavula 1 sò stati esaminati cù PCXI, è a visibilità hè descritta in a Tavula 2. Dui MP di polistirene (MP1 è MP2; 18 μm è 0,25 μm, rispettivamente) ùn eranu micca visibili sottu PCXI, ma u restu di i campioni eranu identificabili (esempi sò mostrati in a Figura 5). MP3 è MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm è 0,9 μm, rispettivamente) sò appena visibili. Ancu s'ellu cuntene alcune di e particelle più chjuche testate, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) era u più pronunciatu. U pruduttu CombiMag MP6 hè difficiule da individuà. In tutti i casi, a nostra capacità di rilevà MP hè stata significativamente migliorata traducendu u magnetu avanti è indietro parallelamente à u capillare. Quandu i magneti si sò alluntanati da u capillare, e particelle si sò estese in lunghe stringhe, ma mentre i magneti si avvicinavanu è a forza di u campu magneticu aumentava, e stringhe di particelle si sò accorciate mentre e particelle migravanu versu a superficia superiore di u capillare (vede Video Supplementare S1: MP4), aumentendu a densità di e particelle di a superficia. À u cuntrariu, quandu u magnetu hè cacciatu da u capillare, a forza di u campu diminuisce è i MP si riorganizzanu in lunghe stringhe chì si estendenu da a superficia superiore di u capillare (vede u Video Supplementare S2: MP4). Dopu chì u magnetu smette di muoversi, e particelle cuntinueghjanu à muoversi per un cortu periodu dopu avè righjuntu a pusizione d'equilibriu. Mentre u MP si move versu è si alluntana da a superficia superiore di u capillare, e particelle magnetiche trascinanu tipicamente i detriti attraversu u fluidu.
A visibilità di MP sottu PCXI varieghja significativamente trà i campioni. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 è (d) MP6. Tutte l'imagine mostrate quì sò state pigliate cù un magnetu situatu circa 10 mm direttamente sopra u capillare. I grandi cerchi apparenti sò bolle d'aria intrappulate in i capillari, chì mostranu chjaramente e caratteristiche di u bordu biancu è neru di l'imaghjini di cuntrastu di fase. A scatula rossa cuntene l'ingrandimentu chì migliora u cuntrastu. Nutate bè chì i diametri di i schemi di u magnetu in tutte e figure ùn sò micca in scala è sò circa 100 volte più grandi di ciò chì hè mostratu.
Mentre u magnetu hè traslatu à manca è à diritta longu a cima di u capillare, l'angulu di a stringa MP cambia per allineassi cù u magnetu (vede Figura 6), delineendu cusì e linee di u campu magneticu. Per MP3-5, dopu chì a corda ghjunghje à un angulu di soglia, e particelle sò trascinate longu a superficia superiore di u capillare. Questu spessu porta à raggruppamenti di MP in gruppi più grandi vicinu à induve u campu magneticu hè u più forte (vede Video Supplementare S3: MP5). Questu hè ancu particularmente evidente quandu si face l'imaghjini vicinu à a fine di u capillare, ciò chì face chì i MP si aggreghinu è si cuncentrinu à l'interfaccia fluidu-aria. E particelle in MP6, chì eranu più difficiuli da discernisce chè MP3-5, ùn sò state trascinate mentre u magnetu si muvia longu u capillare, ma e stringhe MP si sò dissociate, lascendu e particelle in u campu visuale (vede Video Supplementare S4: MP6). In certi casi, quandu u campu magneticu applicatu hè statu riduttu spustendu u magnetu una grande distanza da a pusizione di l'imaghjini, qualsiasi MP rimanente hè discendutu lentamente à a superficia inferiore di u tubu per gravità mentre restava in a stringa (vede Video Supplementare S5: MP3).
L'angulu di a stringa MP cambia quandu u magnetu hè traslatu à diritta sopra u capillare. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 è (d) MP6. A scatula rossa cuntene l'ingrandimentu chì migliora u cuntrastu. Nutate bè chì i video supplementari sò informativi postu chì rivelanu informazioni impurtanti nantu à a struttura di e particelle è a dinamica chì ùn ponu esse visualizate in queste imagine statiche.
I nostri testi anu dimustratu chì u muvimentu lentu di u magnetu avanti è indietro longu a trachea facilita a visualizazione di MP in u cuntestu di un muvimentu cumplessu in vivo. I testi in vivo ùn sò stati realizati perchè e perle di polistirene (MP1 è MP2) ùn eranu micca visibili in u capillare. Ognunu di i quattru MP rimanenti hè statu testatu in vivo cù l'asse longu di u magnetu cunfiguratu sopra a trachea à un angulu di circa 30° rispettu à a verticale (vede e Figure 2b è 3a), postu chì questu hà risultatu in catene MP più lunghe è era più efficace di a cunfigurazione di u magnetu terminata. MP3, MP4 è MP6 ùn sò stati rilevati in a trachea di alcun animale vivu. Quandu e vie aeree di u rattu sò state fotografate dopu chì l'animali sò stati uccisi umanamente, e particelle sò rimaste invisibili ancu quandu hè statu aghjuntu un vulume supplementu cù una pompa à siringa. MP5 avia u più altu cuntenutu di ossidu di ferru è era l'unica particella visibile, è hè stata dunque aduprata per valutà è caratterizà u cumpurtamentu in vivo di MP.
Piazzà u magnetu sopra a trachea durante a consegna di MP hà risultatu in parechji, ma micca tutti, MP cuncentrati in u campu visuale. E particelle chì entranu in a trachea sò megliu osservate in animali sacrificati umanamente. A Figura 7 è u Video Supplementare S6: MP5 mostra una rapida cattura magnetica è allineamentu di e particelle nantu à a superficia di a trachea ventrale, chì indica chì i MP ponu esse diretti à e regioni desiderate di a trachea. Quandu si cercava più distalmente longu a trachea dopu a consegna di MP, alcuni MP sò stati trovati più vicinu à a carina, chì suggerisce chì a forza di u campu magneticu era insufficiente per raccoglie è mantene tutti i MP, postu chì sò stati consegnati attraversu a regione di massima forza di u campu magneticu durante u prucessu di u fluidu. Tuttavia, e concentrazioni di MP postpartum eranu più alte intornu à l'area imaghjata, chì suggerisce chì parechji MP sò rimasti in e regioni di e vie aeree induve a forza di u campu magneticu applicatu era a più alta.
Imagine di (a) prima è (b) dopu a consegna di MP5 in a trachea di un rattu recentemente eutanasizatu cù u magnetu pusizionatu direttamente sopra l'area di imaging. L'area imaginata si trova trà i dui anelli di cartilagine. Prima di a consegna di MP, ci hè un pocu di fluidu in e vie aeree. A scatula rossa cuntene l'ingrandimentu chì migliora u cuntrastu. Queste imagine sò da u video mostratu in u Video Supplementariu S6: MP5.
A traduzzione di u magnetu longu a trachea in vivo hà fattu chì a catena MP cambiassi l'angulu in a superficia di e vie aeree in un modu simile à quellu vistu in i capillari (vede a Figura 8 è u Video Supplementare S7: MP5). Tuttavia, in u nostru studiu, i MP ùn pudianu micca esse trascinati longu a superficia di e vie aeree viventi cum'è puderanu cù i capillari. In certi casi, a catena MP diventerà più longa mentre u magnetu si move à manca è à diritta. Hè interessante nutà chì avemu ancu trovu chì a stringa di particelle pare cambià a prufundità di u stratu di fluidu superficiale quandu u magnetu hè mossu longitudinalmente longu a trachea, è si espande quandu u magnetu hè mossu direttamente sopra a testa è a stringa di particelle hè rotata in una pusizione verticale (vede u Video Supplementare S7). : MP5 à 0:09, in fondu à diritta). U schema caratteristicu di u muvimentu hè cambiatu quandu u magnetu hè statu traslatu lateralmente in cima à a trachea (vale à dì, à manca o à diritta di l'animale piuttostu chè longu à a lunghezza di a trachea). E particelle eranu sempre chjaramente visibili mentre si muvianu, ma quandu u magnetu hè statu cacciatu da a trachea, e punte di e stringhe di particelle sò diventate visibili (vede u Video Supplementariu S8:MP5, cuminciendu à 0:08). Questu hè coerente cù u cumpurtamentu MP chì avemu osservatu sottu à un campu magneticu applicatu in un capillare di vetru.
Esempi d'imagine chì mostranu MP5 in a trachea di un rattu anestetizatu vivu. (a) U magnetu hè adupratu per acquistà imagine sopra è à manca di a trachea, dopu (b) dopu chì u magnetu hè statu spustatu à diritta. A scatula rossa cuntene l'ingrandimentu chì migliora u cuntrastu. Queste imagine sò da u video mostratu in u Video Supplementariu S7: MP5.
Quandu i dui poli eranu cunfigurati in un orientamentu nordu-sud sopra è sottu à a trachea (vale à dì attraendu; Fig. 3b), l'accordi MP parevanu più longhi è eranu situati nantu à a parete laterale di a trachea piuttostu chè nantu à a superficia tracheale dorsale (vede Video Supplementare S9:MP5). Tuttavia, alte concentrazioni di particelle in un unicu locu (vale à dì, a superficia dorsale di a trachea) ùn sò state rilevate dopu a consegna di fluidi quandu hè statu utilizatu un dispositivu à doppiu magnete, chì tipicamente si verifica quandu hè utilizatu un dispositivu à un solu magnete. Dopu, quandu un magnete hè statu cunfiguratu per respinghje i poli invertiti (Fig. 3c), u numeru di particelle visibili in u campu di vista ùn pare micca aumentà dopu a consegna. A cunfigurazione di e duie cunfigurazioni à doppiu magnete hè difficiule per via di l'alte forze di u campu magneticu chì tiranu o spinghjenu i magneti, rispettivamente. A cunfigurazione hè stata poi cambiata in un unicu magnete parallelu à e vie aeree, ma chì passa per e vie aeree à 90 gradi in modu chì e linee di campu attraversavanu a parete tracheale ortogonalmente (Fig. 3d), un orientamentu cuncipitu per determinà se l'aggregazione di particelle nantu à a parete laterale puderia esse osservata. Tuttavia, in questu cunfigurazione, ùn ci era nisun muvimentu identificabile di accumulazione di MP o di muvimentu di magneti. Basatu annantu à tutti questi risultati, una cunfigurazione di un magnetu unicu, cù una orientazione di 30 gradi (Figura 3a) hè stata scelta per studii in vivo di purtatori di geni.
Quandu l'animale hè statu ripetutamente fotografatu subitu dopu à l'uccisione umana, l'assenza di muvimentu tissutale cunfusu significava chì si pudianu discerne linee di particelle più fini è più corte in u campu intercondrale chjaru, "traballanti" in linea cù u muvimentu traslazionale di u magnetu. Eppuru, ùn si pò ancu vede chjaramente a presenza è u muvimentu di e particelle MP6.
U titru LV-LacZ era 1,8 × 108 TU/ml, è dopu à una mistura 1:1 cù CombiMag MP (MP6), l'animali anu ricevutu una dosa tracheale di 50 μl di 9 × 107 TU/ml di veiculu LV (vale à dì 4,5 × 106 TU/rattu). In questi studii, invece di traduce u magnetu durante u travagliu, avemu fissatu u magnetu in una pusizione per determinà se a trasduzione LV (a) puderia esse migliorata paragunata à a consegna vettoriale in assenza di un campu magneticu, è (b) puderia esse focalizzata. E cellule di e vie aeree sò trasdotte in e regioni bersaglio magnetiche di e vie aeree superiori.
A prisenza di magneti è l'usu di CombiMag cumminatu cù vettori LV ùn parenu micca avè effetti avversi nantu à a salute di l'animali, cum'è u nostru protocolu standard di consegna di vettori LV. L'imaghjini frontali di a regione tracheale sottumessa à perturbazione meccanica (Fig. Supplementare 1) indicavanu chì ci eranu livelli significativamente più alti di trasduzione in u gruppu di animali trattati cù LV-MP quandu u magnetu era presente (Fig. 9a). Solu una piccula quantità di culurazione blu LacZ era presente in u gruppu di cuntrollu (Fig. 9b). A quantificazione di e zone culurate X-Gal nurmalizate hà dimustratu chì l'amministrazione di LV-MP in presenza di un campu magneticu hà pruduttu un miglioramentu di circa 6 volte (Fig. 9c).
Esempi d'imagine cumposte chì mostranu a trasduzione tracheale da LV-MP (a) in presenza di un campu magneticu è (b) in assenza di un magnete. (c) Miglioramentu statisticamente significativu di l'area di trasduzione LacZ nurmalizzata in a trachea quandu si usa u magnete (*p = 0,029, t-test, n = 3 per gruppu, media ± SEM).
E sezzioni culurite di rossu rapidu neutru (esempiu mostratu in a Figura Supplementare 2) anu mostratu cellule culurate cù LacZ presenti in un mudellu è una locu simili cum'è riportatu prima.
Una sfida chjave per a terapia genica di e vie aeree ferma a lucalizazione precisa di e particelle trasportatrici in e regioni d'interessu è ottene alti livelli di efficienza di trasduzione in u pulmone in muvimentu in presenza di flussu d'aria è eliminazione attiva di u mucus. Per i trasportatori LV cuncepiti per trattà a malatia di e vie aeree CF, aumentà u tempu di residenza di e particelle trasportatrici in e vie aeree conduttrici hè statu un scopu finora sfuggente. Cum'è indicatu da Castellani et al., l'usu di campi magnetichi per migliurà a trasduzione hà vantaghji paragunati à altri metudi di consegna di geni cum'è l'elettroporazione, postu chì pò cumminà simplicità, costu-efficacia, lucalizazione di consegna, maggiore efficienza è tempi d'incubazione più brevi, è forse una dosa di trasportatore più chjuca10. Tuttavia, a deposizione in vivo è u cumpurtamentu di e particelle magnetiche in e vie aeree sottu l'influenza di forze magnetiche esterne ùn sò mai stati descritti, nè hè stata dimustrata a fattibilità di stu metudu in vivo per migliurà i livelli di espressione genica in e vie aeree viventi intatte.
I nostri esperimenti in vitro di sincrotrone PCXI anu dimustratu chì tutte e particelle chì avemu testatu, à l'eccezzione di u MP di polistirene, eranu visibili in a cunfigurazione d'imaghjini chì avemu utilizatu. In presenza di un campu magneticu, i MP formanu stringhe chì e so lunghezze sò ligate à u tipu di particella è à a forza di u campu magneticu (vale à dì a vicinanza è u muvimentu di u magnetu). Cum'è mostratu in a Figura 10, e stringhe chì observemu sò furmate per via di ogni particella individuale chì hè magnetizzata è induce u so propiu campu magneticu lucale. Quessi campi separati causanu l'aggregazione è a cunnessione di altre particelle simili, cù muvimenti simili à stringhe di gruppu per via di forze lucali da e forze lucali attrattive è repulsive di altre particelle.
Schema chì mostra (a,b) treni di particelle generati in capillari pieni di fluidu è (c,d) trachea piena d'aria. Nutate bè chì i capillari è a trachea ùn sò micca disegnati in scala. U pannellu (a) cuntene ancu una descrizzione di u MP, chì cuntene particelle di Fe3O4 disposte in stringhe.
Quandu u magnetu hè statu spustatu sopra u capillare, l'angulu di a stringa di particelle hà righjuntu una soglia critica per MP3-5 chì cuntene Fe3O4, dopu à quale a stringa di particelle ùn hè più stata in a pusizione originale, ma s'hè mossa longu a superficia versu una nova pusizione. Stu effettu hè prubabile di accade perchè a superficia capillare di vetru hè abbastanza liscia per permette à stu muvimentu di accade. Curiosamente, MP6 (CombiMag) ùn si hè micca cumportatu cusì, forse perchè e particelle eranu più chjuche, avianu rivestimenti o cariche superficiali diversi, o un fluidu vettore pruprietariu hà affettatu a so capacità di spustassi. U cuntrastu di l'immagine di e particelle CombiMag hè ancu più debule, ciò chì suggerisce chì u fluidu è e particelle ponu avè densità simili è dunque ùn si movenu micca facilmente l'una versu l'altra. E particelle ponu ancu esse bluccate se u magnetu si move troppu veloce, ciò chì indica chì a forza di u campu magneticu ùn pò micca sempre superà l'attritu trà e particelle in u fluidu, ciò chì suggerisce chì forse ùn hè micca surprisante chì a forza di u campu magneticu è a distanza trà u magnetu è l'area di destinazione sianu assai impurtanti. Pigliati inseme, questi risultati suggeriscenu ancu chì, mentre i magneti ponu catturà parechji MP chì scorrenu attraversu l'area di destinazione, hè improbabile chì si possa fidà di i magneti per spustassi. Particelle CombiMag longu a superficia di a trachea. Dunque, cuncludemu chì i studii LV-MP in vivo devenu utilizà campi magnetichi statichi per indirizzà fisicamente regioni specifiche di l'arburu di e vie aeree.
Quandu e particelle sò purtate in u corpu, sò difficiuli d'identificà in u cuntestu di tessuti corporei in muvimentu cumplessu, ma a capacità di rilevà li hè stata migliurata traducendu u magnetu orizzontalmente sopra a trachea per "muovere" e corde MP. Ancu s'è l'imaghjini in diretta hè pussibule, hè più faciule discernisce u muvimentu di e particelle una volta chì l'animale hè statu uccisu umanamente. E concentrazioni di MP eranu generalmente più alte in questu locu quandu u magnetu era posizionatu sopra l'area d'imaghjini, ancu s'è alcune particelle si truvavanu generalmente più luntanu longu a trachea. In cuntrastu cù i studii in vitro, e particelle ùn ponu esse trascinate longu a trachea traducendu u magnetu. Questa scuperta hè coerente cù u modu in cui u mucus chì riveste a superficia di a trachea processa tipicamente e particelle inalate, intrappulendule in u mucus è successivamente eliminate da u mecanismu di clearance mucociliare.
Avemu ipotizzatu chì l'usu di magneti per l'attrazione sopra è sottu à a trachea (Fig. 3b) puderia risultà in un campu magneticu più uniforme, invece di un campu magneticu assai cuncintratu in un puntu, chì puderia purtà à una distribuzione più uniforme di particelle. Tuttavia, u nostru studiu preliminare ùn hà micca trovu evidenze chjare per sustene sta ipotesi. In listessu modu, a cunfigurazione di una coppia di magneti per respinghje (Fig. 3c) ùn hà micca risultatu in più deposizione di particelle in l'area ripresa. Queste duie scuperte dimustranu chì a cunfigurazione à doppiu magnete ùn migliora micca significativamente u cuntrollu lucale di u targeting MP, è chì e forze magnetiche forti risultanti sò difficili da cunfigurà, rendendu questu approcciu menu praticu. In listessu modu, orientà u magnete sopra è attraversu a trachea (Fig. 3d) ùn hà ancu aumentatu u numeru di particelle ritenute in l'area ripresa. Alcune di queste cunfigurazioni alternative ùn ponu micca avè successu perchè risultanu in forze di campu magneticu più basse in l'area di deposizione. Dunque, a cunfigurazione di un magnete à un angulu unicu di 30 gradi (Figura 3a) hè cunsiderata u metudu più faciule è efficiente per i testi in vivo.
U studiu LV-MP hà dimustratu chì quandu i vettori LV sò stati cumminati cù CombiMag è furniti dopu à perturbazione fisica in presenza di un campu magneticu, i livelli di trasduzione sò stati significativamente aumentati in a trachea paragunatu à i cuntrolli. Basatu annantu à i studii d'imaghjini di sincrotrone è i risultati di LacZ, u campu magneticu era apparentemente capace di priservà u LV in a trachea è di riduce u numeru di particelle vettoriali chì penetravanu immediatamente in prufundità in u pulmone. Tali miglioramenti di targeting ponu purtà à una maggiore efficacia riducendu i tituli furniti, a trasduzione fora di u bersagliu, l'effetti secundari infiammatori è immunitari, è i costi di i purtatori di geni. Impurtantemente, secondu u fabricatore, CombiMag pò esse adupratu in cunghjunzione cù altri metudi di trasferimentu di geni, cumpresi altri vettori virali (cum'è AAV) è acidi nucleichi.