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Les vecteurs géniques utilisés pour le traitement de la mucoviscidose doivent cibler les voies aériennes conductrices, car la transduction pulmonaire périphérique n'apporte aucun bénéfice thérapeutique. L'efficacité de la transduction virale est directement liée au temps de résidence du vecteur. Cependant, les fluides de délivrance, tels que les vecteurs géniques, diffusent naturellement dans les alvéoles lors de l'inspiration, et les particules thérapeutiques, quelle que soit leur forme, sont rapidement éliminées par transport mucociliaire. Prolonger le temps de résidence des vecteurs géniques dans les voies aériennes est important, mais difficile à obtenir. Les particules magnétiques conjuguées à un vecteur génique, pouvant être dirigées vers la surface des voies aériennes, pourraient améliorer le ciblage régional. En raison des difficultés de visualisation in vivo, le comportement de ces petites particules magnétiques à la surface des voies aériennes en présence d'un champ magnétique appliqué est mal connu. L'objectif de cette étude était d'utiliser l'imagerie synchrotron pour visualiser le mouvement in vivo d'une série de particules magnétiques dans la trachée de rats anesthésiés, afin d'examiner la dynamique et les caractéristiques du comportement des particules individuelles et collectives in vivo. Nous avons ensuite évalué si l'administration de particules magnétiques lentivirales en présence d'un champ magnétique permettrait d'améliorer la transduction. L'efficacité de transduction dans la trachée du rat a été étudiée. L'imagerie par rayons X synchrotron révèle le comportement de particules magnétiques dans des champs magnétiques stationnaires et mobiles, in vitro et in vivo. Les particules ne peuvent pas être facilement entraînées à la surface des voies respiratoires vivantes à l'aide d'aimants, mais lors du transport, les dépôts se concentrent dans la zone où le champ magnétique est le plus intense. L'efficacité de transduction a également été multipliée par six lorsque des particules magnétiques lentivirales ont été administrées en présence d'un champ magnétique. Ces résultats suggèrent que les particules magnétiques lentivirales et les champs magnétiques pourraient constituer des approches intéressantes pour améliorer le ciblage des vecteurs de gènes et augmenter les niveaux de transduction dans les voies respiratoires conductrices in vivo.
La mucoviscidose est causée par une variation d'un seul gène appelé régulateur de conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR). La protéine CFTR est un canal ionique présent dans de nombreuses cellules épithéliales de l'organisme, notamment au niveau des voies respiratoires, un site majeur de la pathogenèse de la mucoviscidose. Les anomalies du gène CFTR entraînent un transport anormal de l'eau, déshydratant la surface des voies respiratoires et réduisant l'épaisseur de la couche de liquide de surface des voies respiratoires (ASL). Ceci altère également la capacité du système de transport mucociliaire (MCT) à éliminer les particules inhalées et les agents pathogènes des voies respiratoires. Notre objectif est de développer une thérapie génique lentivirale (LV) pour délivrer la copie correcte du gène CFTR et améliorer l'ASL, le MCT et la santé pulmonaire, et de poursuivre le développement de nouvelles technologies permettant de mesurer ces paramètres in vivo¹.
Les vecteurs LV sont parmi les candidats les plus prometteurs pour la thérapie génique des voies respiratoires dans la mucoviscidose, principalement parce qu'ils peuvent intégrer de façon permanente le gène thérapeutique dans les cellules basales des voies respiratoires (cellules souches des voies respiratoires). Ceci est important car ils peuvent restaurer une hydratation et une clairance du mucus normales en se différenciant en cellules de surface des voies respiratoires fonctionnelles, corrigées génétiquement et associées à la mucoviscidose, ce qui procure des bénéfices à vie. Les vecteurs LV doivent être dirigés vers les voies respiratoires conductrices, car c'est là que débute la maladie pulmonaire liée à la mucoviscidose. L'administration du vecteur plus profondément dans le poumon peut entraîner une transduction alvéolaire, mais celle-ci n'a aucun intérêt thérapeutique dans la mucoviscidose. Cependant, les fluides tels que les vecteurs de gènes migrent naturellement vers les alvéoles lors de l'inspiration après leur administration^3,4 et les particules thérapeutiques sont rapidement éliminées dans la cavité buccale par le MCT. L'efficacité de la transduction LV est directement liée à la durée pendant laquelle le vecteur reste à proximité des cellules cibles pour permettre leur absorption cellulaire – le « temps de résidence »⁵ – qui est facilement réduit par le flux d'air régional typique ainsi que par la capture coordonnée des particules par le mucus et le MCT. Dans le cas de la mucoviscidose, la capacité à prolonger le temps de résidence du LV dans les voies respiratoires est importante. atteindre des niveaux élevés de transduction dans cette région s'est avéré jusqu'à présent difficile.
Pour surmonter cet obstacle, nous suggérons que les particules magnétiques LV (MP) puissent aider de deux manières complémentaires. Premièrement, elles peuvent être guidées magnétiquement vers la surface des voies respiratoires pour améliorer le ciblage et aider les particules porteuses de gènes à se loger dans la région des voies respiratoires souhaitée ; et ASL) pour se déplacer vers la couche cellulaire 6. Les MP ont été largement utilisées comme vecteurs d'administration ciblée de médicaments lorsqu'elles se lient à des anticorps, à des médicaments chimiothérapeutiques ou à d'autres petites molécules qui se fixent aux membranes cellulaires ou se lient aux récepteurs de surface cellulaire pertinents et s'accumulent au niveau des tumeurs en présence d'électricité statique. Champs magnétiques pour le traitement du cancer 7. D'autres techniques « hyperthermiques » visent à chauffer les microparticules (MP) lorsqu'elles sont exposées à des champs magnétiques oscillants, détruisant ainsi les cellules tumorales. Le principe de la transfection magnétique, dans lequel un champ magnétique est utilisé comme agent de transfection pour améliorer le transfert d'ADN aux cellules, est couramment utilisé in vitro avec divers vecteurs géniques viraux et non viraux pour les lignées cellulaires difficiles à transduire. L'efficacité de la magnétotransfection par vecteur lentiviral (LV) a été établie : l'administration in vitro de LV-MP à une lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine en présence d'un champ magnétique statique a augmenté l'efficacité de transduction de 186 fois par rapport au vecteur LV seul. Les LV-MP ont également été appliquées à un modèle in vitro de mucoviscidose, où la transfection magnétique a augmenté la transduction du vecteur LV de 20 fois dans des cultures à l'interface air-liquide en présence d'expectorations de patients atteints de mucoviscidose¹⁰. Cependant, la magnétotransfection in vivo d'organes a reçu relativement peu d'attention et n'a été évaluée que dans quelques études animales^{11,12,13,14,15}. notamment dans les poumons16,17. Néanmoins, les possibilités de transfection magnétique dans la thérapie pulmonaire de la mucoviscidose sont claires. Tan et al. (2020) ont déclaré qu’« une étude de validation de principe d’une administration pulmonaire efficace de nanoparticules magnétiques ouvrira la voie à de futures stratégies d’inhalation de CFTR pour améliorer les résultats cliniques chez les patients atteints de mucoviscidose »6.
Le comportement des petites particules magnétiques à la surface des voies respiratoires en présence d'un champ magnétique appliqué est difficile à visualiser et à étudier, et donc mal compris. Dans d'autres études, nous avons développé une méthode d'imagerie par rayons X à contraste de phase basée sur la propagation du synchrotron (PB-PCXI) pour visualiser et quantifier de manière non invasive les variations in vivo, même minimes, de la profondeur de la couche de susceptibilité magnétique (ASL)¹⁸ et du comportement des microparticules magnétiques (MCT)¹⁹,²⁰, afin de mesurer directement l'hydratation de la surface des canaux gazeux et de l'utiliser comme indicateur précoce de l'efficacité du traitement. De plus, notre méthode d'évaluation des MCT utilise des particules de 10 à 35 µm de diamètre, composées d'alumine ou de verre à indice de réfraction élevé, comme marqueurs de MCT visibles par PB-PCXI²¹. Ces deux techniques conviennent à la visualisation de différents types de particules, y compris les microparticules magnétiques (MP).
Grâce à leur haute résolution spatiale et temporelle, nos techniques d'analyse ASL et MCT basées sur PB-PCXI sont parfaitement adaptées à l'examen de la dynamique et des modèles de comportement des particules individuelles et en masse in vivo, afin de nous aider à comprendre et à optimiser les techniques de délivrance de gènes MP. L'approche que nous employons ici découle de nos études réalisées sur la ligne de faisceau SPring-8 BL20B2, dans laquelle nous avons visualisé le mouvement des fluides après l'administration d'une dose de vecteur factice dans les voies respiratoires nasales et pulmonaires de souris, afin d'expliquer les modèles d'expression génique non uniformes observés dans nos études animales sur la dose de vecteur de gènes 3,4.
L'objectif de cette étude était d'utiliser le synchrotron PB-PCXI pour visualiser les mouvements in vivo d'une série de microparticules (MP) dans la trachée de rats vivants. Ces études d'imagerie PB-PCXI visaient à tester différents types de MP, intensités de champ magnétique et emplacements afin de déterminer leur effet sur le mouvement des MP. Nous avons émis l'hypothèse qu'un champ magnétique externe favoriserait le maintien des MP délivrées dans la zone cible ou leur déplacement vers celle-ci. Ces études nous ont également permis d'identifier les configurations magnétiques maximisant le nombre de particules retenues dans la trachée après dépôt. Dans une seconde série d'études, nous avons cherché à utiliser cette configuration optimale pour démontrer le profil de transduction résultant de l'administration in vivo de MP à volume cellulaire élevé (LV-MP) dans les voies respiratoires du rat, en supposant que l'administration de LV-MP dans le cadre d'un ciblage des voies respiratoires améliorerait l'efficacité de transduction des LV.
Toutes les études animales ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par l'Université d'Adélaïde (M-2019-060 et M-2020-022) et le Comité d'éthique animale du synchrotron SPring-8. Les expériences ont été réalisées conformément aux directives ARRIVE.
Toutes les acquisitions d'images par rayons X ont été réalisées sur la ligne de faisceau BL20XU du synchrotron SPring-8 au Japon, selon un dispositif similaire à celui décrit précédemment^21,22. Brièvement, le dispositif expérimental était situé à 245 m de l'anneau de stockage du synchrotron. Une distance échantillon-détecteur de 0,6 m a été utilisée pour les études d'imagerie de particules et de 0,3 m pour les études d'imagerie in vivo afin de générer des effets de contraste de phase. Un faisceau monochromatique d'une énergie de 25 keV a été utilisé. Les images ont été acquises à l'aide d'un convertisseur de rayons X haute résolution (SPring-8 BM3) couplé à un détecteur sCMOS. Le convertisseur transforme les rayons X en lumière visible grâce à un scintillateur de 10 µm d'épaisseur (Gd₃Al₂Ga₃O₁₂), qui est ensuite dirigée vers un capteur sCMOS à l'aide d'un objectif de microscope × 10 (NA 0,3). Le détecteur sCMOS était un Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu Photonics, Japon) avec une matrice de… L'image comporte 2048 × 2048 pixels et une taille de pixel brute de 6,5 × 6,5 µm. Cette configuration permet d'obtenir une taille de pixel isotrope effective de 0,51 µm et un champ de vision d'environ 1,1 mm × 1,1 mm. Un temps d'exposition de 100 ms a été choisi afin d'optimiser le rapport signal/bruit des particules magnétiques à l'intérieur et à l'extérieur des voies respiratoires, tout en minimisant les artefacts liés aux mouvements respiratoires. Pour les études in vivo, un obturateur à rayons X rapide a été placé sur le trajet des rayons X afin de limiter la dose de rayonnement en bloquant le faisceau entre les expositions.
Le support LV n'a été utilisé dans aucune étude d'imagerie SPring-8 PB-PCXI car la chambre d'imagerie BL20XU n'est pas certifiée de niveau de biosécurité 2. À la place, nous avons sélectionné une gamme de MP bien caractérisées provenant de deux fournisseurs commerciaux — couvrant une gamme de tailles, de matériaux, de concentrations en fer et d'applications — d'abord pour comprendre comment les champs magnétiques affectent le mouvement des MP dans les capillaires en verre, puis dans les voies respiratoires vivantes. Les microparticules (MP) ont une taille variant de 0,25 à 18 μm et sont composées de divers matériaux (voir tableau 1), mais la composition de chaque échantillon, notamment la taille des particules magnétiques qu'elles contiennent, est inconnue. D'après nos nombreuses études MCT^{19, 20, 21, 23, 24}, nous pensons que des MP d'une taille aussi réduite que 5 μm peuvent être observées à la surface de la trachée, par exemple en soustrayant des images consécutives pour mieux visualiser leur mouvement. Une MP de 0,25 μm est plus petite que la résolution du dispositif d'imagerie, mais la technique PB-PCXI devrait permettre de détecter leur contraste volumique et le mouvement du fluide de surface sur lequel elles se déposent.
Les échantillons de chaque microparticule (MP) du tableau 1 ont été préparés dans des capillaires en verre de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, États-Unis) d'un diamètre intérieur de 0,63 mm. Les particules corpusculaires sont disponibles dans l'eau, tandis que les particules CombiMag sont disponibles dans le fluide propriétaire du fabricant. Chaque tube est rempli à moitié de liquide (environ 11 μl) et placé sur le porte-échantillon (voir figure 1). Les capillaires en verre ont été placés horizontalement sur la platine porte-échantillon de la boîte d'imagerie, de manière à ce que les bords du fluide soient positionnés de façon à ce que le liquide soit aligné avec l'échantillon. Un aimant en néodyme-fer-bore (NdFeB) de terres rares (N35, réf. LM1652, Jaycar Electronics, Australie) de 19 mm de diamètre (28 mm de long), à coque en nickel et présentant une aimantation rémanente de 1,17 Tesla, a été fixé sur une platine de translation séparée afin de permettre son déplacement à distance pendant l'acquisition d'images. L'acquisition d'images par rayons X commence lorsque l'aimant est positionné à environ 30 mm au-dessus de l'échantillon, et les images sont acquises à une fréquence de 4 images par seconde. images par seconde. Pendant l'imagerie, l'aimant a été approché du tube capillaire en verre (à environ 1 mm de distance) puis déplacé le long du tube pour évaluer les effets de l'intensité du champ et de la position.
Dispositif d'imagerie in vitro contenant des échantillons MP dans des capillaires en verre sur la platine de translation xy de l'échantillon. Le trajet du faisceau de rayons X est marqué par une ligne pointillée rouge.
Une fois la visibilité in vitro des microparticules (MP) établie, un sous-ensemble d'entre elles a été testé in vivo chez des rates Wistar albinos femelles de type sauvage (âgées d'environ 12 semaines, pesant environ 200 g). Les rates ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale d'un mélange de médétomidine (Domitor®, Zenoaq, Japon), de midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japon) à la dose de 0,24 mg/kg, et de butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma, Japon) à la dose de 3,2 mg/kg. Après anesthésie, elles ont été préparées pour l'imagerie : les poils autour de la trachée ont été retirés, une sonde endotrachéale (TE ; canule intraveineuse de calibre 16 Ga, Terumo BCT) a été insérée et les rates ont été immobilisées en décubitus dorsal sur une plaque d'imagerie conçue sur mesure et contenant un sac thermique pour maintenir leur température corporelle. La plaque d'imagerie a ensuite été fixée à la platine de translation de l'échantillon dans la boîte d'imagerie, selon un léger angle afin d'aligner horizontalement la trachée sur le cliché radiographique. image, comme le montre la figure 2a.
(a) Configuration d'imagerie in vivo dans le boîtier d'imagerie SPring-8 ; le trajet du faisceau de rayons X est indiqué par une ligne pointillée rouge. (b, c) La localisation de l'aimant sur la trachée a été réalisée à distance à l'aide de deux caméras IP montées orthogonalement. Sur la gauche de l'image, on peut voir la boucle métallique maintenant la tête et la canule d'administration en place dans la sonde endotrachéale.
Un système de pompe à seringue télécommandée (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, Floride) utilisant une seringue en verre de 100 μl a été connecté à un tube PE10 (diamètre extérieur 0,61 mm, diamètre intérieur 0,28 mm) via une aiguille de calibre 30. Marquez le tube pour vous assurer que son extrémité est correctement positionnée dans la trachée lors de l'insertion de la sonde endotrachéale. À l'aide de la micropompe, le piston de la seringue a été retiré tandis que l'extrémité du tube était immergée dans l'échantillon MP à administrer. Le tube d'administration chargé a ensuite été inséré dans la sonde endotrachéale, en plaçant son extrémité dans la zone de champ magnétique appliqué la plus intense. L'acquisition d'images a été contrôlée par un détecteur de respiration connecté à un boîtier de synchronisation Arduino, et tous les signaux (température, respiration, ouverture/fermeture de l'obturateur et acquisition d'images) ont été enregistrés à l'aide des logiciels Powerlab et LabChart (AD Instruments, Sydney, Australie) 22. Lors de l'imagerie, lorsque l'enceinte était inaccessible, deux caméras IP (Panasonic BB-SC382) ont été positionnées à environ 90° l'une de l'autre. ont été utilisés pour surveiller la position de l'aimant par rapport à la trachée pendant l'imagerie (Fig. 2b,c). Pour minimiser les artefacts de mouvement, une image a été acquise par respiration pendant le plateau du flux de fin d'expiration.
Un aimant est fixé à un second étage pouvant être positionné à distance de l'enceinte d'imagerie. Différentes positions et configurations de l'aimant ont été testées : monté à un angle d'environ 30° au-dessus de la trachée (configurations illustrées sur les figures 2a et 3a) ; un aimant au-dessus de l'animal et l'autre en dessous, pôles orientés pour s'attirer (figure 3b) ; un aimant au-dessus de l'animal et l'autre en dessous, pôles orientés pour se repousser (figure 3c) ; et un aimant au-dessus et perpendiculaire à la trachée (figure 3d). Une fois l'animal et l'aimant positionnés et le produit à tester chargé dans la pompe à seringue, une dose de 50 µl est administrée à un débit de 4 µl/s pendant l'acquisition des images. L'aimant est ensuite déplacé d'avant en arrière le long de la trachée ou latéralement, tout en poursuivant l'acquisition des images.
Configuration magnétique pour l'imagerie in vivo : (a) un aimant unique placé au-dessus de la trachée à un angle d'environ 30°, (b) deux aimants configurés pour s'attirer, (c) deux aimants configurés pour se repousser, (d) un aimant unique placé au-dessus de la trachée et perpendiculairement à celle-ci. L'observateur suivait la trachée du regard, de la bouche aux poumons. Le faisceau de rayons X traversait le côté gauche du rat et ressortait du côté droit. L'aimant était déplacé soit le long des voies respiratoires, soit latéralement au-dessus de la trachée, dans le sens du faisceau de rayons X.
Nous avons également cherché à déterminer la visibilité et le comportement des particules dans les voies respiratoires en l'absence de perturbations liées à la respiration et aux mouvements cardiaques. Par conséquent, à la fin de la période d'imagerie, les animaux ont été euthanasiés par surdosage de pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, États-Unis ; environ 65 mg/kg, voie intrapéritonéale). Certains animaux ont été laissés sur la plateforme d'imagerie et, une fois la respiration et les battements cardiaques arrêtés, la procédure d'imagerie a été répétée, avec ajout d'une dose supplémentaire de microparticules si aucune microparticule n'était visible à la surface des voies respiratoires.
Les images acquises ont été corrigées en champ plat et en champ sombre, puis assemblées en un film (20 images par seconde ; 15 à 25 fois la vitesse normale en fonction de la fréquence respiratoire) à l'aide d'un script personnalisé écrit en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Toutes les études de délivrance de vecteurs géniques LV ont été menées au sein du service de recherche sur les animaux de laboratoire de l'Université d'Adélaïde et visaient à utiliser les résultats de l'expérience SPring-8 pour évaluer si la délivrance de LV-MP en présence d'un champ magnétique pouvait améliorer le transfert de gènes in vivo. Afin d'évaluer les effets des MP et du champ magnétique, deux groupes d'animaux ont été traités : un groupe a reçu du LV-MP avec un aimant placé, et l'autre groupe a reçu un groupe témoin recevant du LV-MP sans aimant.
Les vecteurs géniques LV ont été générés selon les méthodes décrites précédemment^25,26. Le vecteur LacZ exprime le gène de la β-galactosidase nucléaire sous le contrôle du promoteur constitutif MPSV (LV-LacZ), ce qui induit une réaction bleue dans les cellules transduites, visible au niveau des fronts de migration et des coupes tissulaires pulmonaires. Le titrage a été réalisé en culture cellulaire par comptage manuel des cellules LacZ positives à l'aide d'une cellule de Malassez, afin de calculer le titre en TU/ml. Les vecteurs sont cryoconservés à -80 °C, décongelés avant utilisation, puis liés à CombiMag par mélange à parts égales et incubation sur glace pendant au moins 30 minutes avant administration.
Des rats Sprague Dawley normaux (n = 3/groupe, âgés de 2 à 3 mois) ont été anesthésiés par voie intrapéritonéale avec un mélange de 0,4 mg/kg de médétomidine (Domitor, Ilium, Australie) et de 60 mg/kg de kétamine (Ilium, Australie). Une injection intrapéritonéale a été administrée, suivie d'une canulation orale non chirurgicale à l'aide d'une canule intraveineuse de calibre 16 Ga. Afin de garantir la transduction du LV dans les voies aériennes trachéales, celles-ci ont été conditionnées selon notre protocole de perturbation mécanique précédemment décrit, consistant à frotter axialement la surface des voies aériennes trachéales avec un panier métallique (N-Circle, extracteur de calculs sans pointe en nitinol NTSE-022115 -UDH, Cook Medical, États-Unis) pendant 30 secondes. L'administration trachéale de LV-MP a ensuite été réalisée sous une hotte à flux laminaire environ 10 minutes après la perturbation.
Le champ magnétique utilisé dans cette expérience était configuré de manière similaire à celui de l'étude d'imagerie par rayons X in vivo, les mêmes aimants étant maintenus au-dessus de la trachée à l'aide de clips de stent de distillation (Figure 4). Un volume de 50 μl (2 aliquotes de 25 μl) de LV-MP a été administré dans la trachée (n = 3 animaux) à l'aide d'une pipette à embout gel, comme décrit précédemment. Un groupe témoin (n = 3 animaux) a reçu les mêmes LV-MP sans aimant. Une fois la perfusion terminée, la canule est retirée de la sonde endotrachéale et l'animal est extubé. L'aimant est maintenu en place pendant 10 minutes, puis retiré. Les rats ont reçu une dose sous-cutanée de méloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australie), suivie d'une antagonisation de l'anesthésie par injection intrapéritonéale de 1 mg/kg de chlorhydrate d'atipamazole (Antisedan, Zoetis, Australie). Les rats ont été maintenus au chaud et surveillés jusqu'à leur réveil complet.
Dispositif d'administration LV-MP dans une enceinte de sécurité biologique. L'embout Luer gris clair du tube ET est visible au niveau de la bouche et l'extrémité en gel de la pipette montrée sur la photo est insérée à travers le tube ET jusqu'à la profondeur souhaitée dans la trachée.
Une semaine après l'administration de LV-MP, les animaux ont été euthanasiés par inhalation de CO2 pur et l'expression de LacZ a été évaluée par notre traitement standard au X-gal. Les trois anneaux cartilagineux les plus caudaux ont été retirés afin d'exclure toute lésion mécanique ou rétention hydrique liée à la mise en place de la sonde endotrachéale. Chaque trachée a été coupée longitudinalement en deux pour l'analyse, puis montée dans une boîte de Petri contenant du caoutchouc de silicone (Sylgard, Dow Inc.) à l'aide d'une aiguille Minutien (Fine Science Tools) pour visualiser la surface luminale. La distribution et la configuration des cellules transduites ont été confirmées par photographie frontale à l'aide d'un microscope Nikon (SMZ1500) équipé d'une caméra DigiLite et du logiciel TCapture (Tucsen Photonics, Chine). Les images ont été acquises à un grossissement de 20x (y compris le grossissement maximal pour toute la largeur de la trachée), la trachée entière étant imagée étape par étape, avec un chevauchement suffisant entre chaque image pour permettre leur assemblage. Les images composites ont ensuite été assemblées en une seule image composite à l'aide du logiciel Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) et d'un algorithme de mouvement planaire. Les zones d'expression de LacZ dans les images composites de la trachée de chaque animal ont été quantifiées à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks), comme décrit précédemment, avec les paramètres suivants : 0,35 < Teinte < 0,58, Saturation > 0,15 et Valeur < 0,7. Un masque a été généré manuellement dans GIMP v2.10.24 pour chaque image composite, en traçant les contours du tissu, afin d'identifier la zone tissulaire et d'éviter toute détection erronée en dehors du tissu trachéal. Les surfaces colorées de toutes les images composites de chaque animal ont été additionnées pour obtenir la surface colorée totale de cet animal. Cette surface a ensuite été divisée par la surface totale du masque pour obtenir la surface normalisée.
Chaque trachée a été incluse dans de la paraffine et des sections de 5 μm ont été coupées. Les sections ont été contre-colorées au rouge neutre rapide pendant 5 min et les images ont été acquises à l'aide d'un microscope Nikon Eclipse E400, d'une caméra DS-Fi3 et du logiciel de capture d'éléments NIS (version 5.20.00).
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Le seuil de signification statistique a été fixé à p ≤ 0,05. La normalité a été vérifiée à l'aide du test de Shapiro-Wilk et les différences de coloration LacZ ont été évaluées à l'aide du test t non apparié.
Les six microparticules (MP) décrites dans le tableau 1 ont été examinées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (PCXI), et leur visibilité est présentée dans le tableau 2. Deux microparticules de polystyrène (MP1 et MP2 ; respectivement de 18 μm et 0,25 μm) n'étaient pas visibles sous PCXI, mais les autres échantillons étaient identifiables (voir exemples sur la figure 5). Les microparticules MP3 et MP4 (10-15 % Fe3O4 ; respectivement de 0,25 μm et 0,9 μm) sont faiblement visibles. Bien que contenant certaines des plus petites particules testées, la microparticule MP5 (98 % Fe3O4 ; 0,25 μm) était la plus visible. Le produit CombiMag MP6 est difficile à repérer. Dans tous les cas, notre capacité à détecter les microparticules a été significativement améliorée en déplaçant l'aimant d'avant en arrière parallèlement au capillaire. Lorsque les aimants s'éloignaient du capillaire, les particules s'allongeaient en longs filaments, mais à mesure que les aimants se rapprochaient et que l'intensité du champ magnétique augmentait, les filaments de particules se raccourcissaient à mesure que les particules migraient. Vers la surface supérieure du capillaire (voir la vidéo supplémentaire S1 : MP4), la densité de particules augmente. Inversement, lorsque l’aimant est retiré du capillaire, l’intensité du champ magnétique diminue et les particules magnétiques se réorganisent en longs filaments s’étendant depuis la surface supérieure du capillaire (voir la vidéo supplémentaire S2 : MP4). Après l’arrêt de l’aimant, les particules continuent de se déplacer brièvement après avoir atteint leur position d’équilibre. Lorsque les particules magnétiques se déplacent vers et depuis la surface supérieure du capillaire, elles entraînent généralement les débris dans le fluide.
La visibilité des MP sous PCXI varie considérablement d'un échantillon à l'autre. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6. Toutes les images présentées ici ont été prises avec un aimant placé à environ 10 mm directement au-dessus du capillaire. Les grands cercles apparents correspondent à des bulles d'air emprisonnées dans les capillaires, révélant clairement les contours noirs et blancs caractéristiques de l'imagerie par contraste de phase. Le cadre rouge indique le grossissement améliorant le contraste. Veuillez noter que les diamètres des schémas d'aimants dans toutes les figures ne sont pas à l'échelle et sont environ 100 fois plus grands que ceux représentés.
Lorsque l'aimant se déplace de gauche à droite le long de la paroi supérieure du capillaire, l'angle du filament de microparticules (MP) s'aligne avec l'aimant (voir figure 6), délimitant ainsi les lignes de champ magnétique. Pour les MP3 à MP5, lorsque le filament atteint un angle seuil, les particules sont entraînées le long de la surface supérieure du capillaire. Ceci entraîne souvent l'agglomération des MP en groupes plus importants à proximité des zones de champ magnétique maximal (voir la vidéo supplémentaire S3 : MP5). Ce phénomène est particulièrement visible lors de l'imagerie à proximité de l'extrémité du capillaire, ce qui provoque l'agrégation et la concentration des MP à l'interface fluide-air. Les particules de l'échantillon MP6, plus difficiles à discerner que celles des échantillons MP3 à MP5, ne sont pas entraînées par le déplacement de l'aimant le long du capillaire ; les filaments de MP se dissocient, laissant les particules dans le champ de vision (voir la vidéo supplémentaire S4 : MP6). Dans certains cas, lorsque le champ magnétique appliqué est réduit en éloignant l'aimant du point d'imagerie, les MP restantes descendent lentement par gravité vers la surface inférieure du tube tout en restant groupées (voir la vidéo supplémentaire S5). MP3).
L'angle de la chaîne MP change lorsque l'aimant est déplacé vers la droite au-dessus du capillaire. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6. Le cadre rouge contient le grossissement améliorant le contraste. Notez que les vidéos supplémentaires sont informatives car elles révèlent des informations importantes sur la structure et la dynamique des particules qui ne peuvent pas être visualisées sur ces images statiques.
Nos tests ont montré que le déplacement lent de l'aimant d'avant en arrière le long de la trachée facilite la visualisation des microparticules (MP) dans le contexte de mouvements complexes in vivo. Les tests in vivo n'ont pas été réalisés car les billes de polystyrène (MP1 et MP2) n'étaient pas visibles dans le capillaire. Chacune des quatre autres MP a été testée in vivo avec l'axe longitudinal de l'aimant positionné au-dessus de la trachée, à un angle d'environ 30° par rapport à la verticale (voir figures 2b et 3a). Cette configuration a permis d'obtenir des chaînes de MP plus longues et s'est avérée plus efficace que la configuration initiale de l'aimant. Les MP3, MP4 et MP6 n'ont été détectées dans la trachée d'aucun animal vivant. Lors de l'imagerie des voies respiratoires des rats après euthanasie, les particules sont restées invisibles, même après ajout de volume à l'aide d'une pompe à seringue. La MP5, présentant la plus forte teneur en oxyde de fer, était la seule particule visible et a donc été utilisée pour évaluer et caractériser le comportement in vivo des MP.
Le positionnement de l'aimant au-dessus de la trachée lors de l'administration de microparticules (MP) a entraîné la concentration de nombreuses MP, mais pas de toutes, dans le champ d'observation. L'entrée des particules dans la trachée est mieux observée chez les animaux euthanasiés. La figure 7 et la vidéo supplémentaire S6 (MP5) montrent la capture magnétique rapide et l'alignement des particules à la surface de la trachée ventrale, indiquant que les MP peuvent être dirigées vers les régions souhaitées de la trachée. Lors d'une recherche plus distale le long de la trachée après l'administration des MP, certaines MP ont été trouvées plus près de la carène, suggérant que l'intensité du champ magnétique était insuffisante pour collecter et retenir toutes les MP, car elles ont été administrées dans la région de champ magnétique maximal pendant le processus fluidique. Néanmoins, les concentrations de MP post-partum étaient plus élevées autour de la zone imagée, suggérant que de nombreuses MP sont restées dans les régions des voies respiratoires où l'intensité du champ magnétique appliqué était la plus élevée.
Images (a) avant et (b) après administration de MP5 dans la trachée d'un rat récemment euthanasié, l'aimant étant positionné directement au-dessus de la zone d'imagerie. Cette zone se situe entre les deux anneaux cartilagineux. Avant l'administration de MP5, on observe la présence de liquide dans les voies respiratoires. Le cadre rouge indique le grossissement améliorant le contraste. Ces images sont extraites de la vidéo présentée dans la vidéo supplémentaire S6 : MP5.
Le déplacement de l'aimant le long de la trachée in vivo a induit une modification de l'angle de la chaîne de microparticules (MP) à la surface des voies respiratoires, similaire à celle observée dans les capillaires (voir figure 8 et vidéo supplémentaire S7 : MP5). Cependant, dans notre étude, les MP n'ont pas pu être entraînées le long de la surface des voies respiratoires vivantes comme cela a été le cas pour les capillaires. Dans certains cas, la chaîne de MP s'allonge lorsque l'aimant se déplace latéralement. De manière intéressante, nous avons également constaté que la profondeur de la couche de fluide superficielle semble varier lorsque l'aimant est déplacé longitudinalement le long de la trachée, et que la chaîne s'étend lorsque l'aimant est placé directement au-dessus et que la chaîne de particules est orientée verticalement (voir vidéo supplémentaire S7). (Voir MP5 à 0:09, en bas à droite). Le schéma de mouvement caractéristique a changé lorsque l'aimant a été déplacé latéralement au-dessus de la trachée (c'est-à-dire à gauche ou à droite de l'animal plutôt que dans le sens de la longueur de la trachée). Les particules restaient clairement visibles pendant leur déplacement, mais lorsque l'aimant a été retiré de la trachée, les extrémités des chaînes de particules sont devenues visibles (voir la vidéo supplémentaire S8 : MP5, à partir de 0:08). Ceci est cohérent avec le comportement des particules magnétiques que nous avons observé sous un champ magnétique appliqué dans un capillaire de verre.
Exemples d'images montrant le MP5 dans la trachée d'un rat vivant anesthésié. (a) L'aimant est utilisé pour acquérir des images au-dessus et à gauche de la trachée, puis (b) après que l'aimant a été déplacé vers la droite. Le cadre rouge contient le grossissement améliorant le contraste. Ces images proviennent de la vidéo présentée dans la vidéo supplémentaire S7 : MP5.
Lorsque les deux pôles étaient orientés nord-sud au-dessus et en dessous de la trachée (attraction ; Fig. 3b), les cordes des particules magnétiques (PM) paraissaient plus longues et situées sur la paroi latérale de la trachée plutôt que sur sa surface dorsale (voir la vidéo supplémentaire S9 : PM5). Cependant, aucune forte concentration de particules à un endroit précis (surface dorsale de la trachée) n'a été détectée après l'administration du fluide avec un dispositif à double aimant, contrairement à ce qui se produit généralement avec un dispositif à aimant unique. Ensuite, lorsqu'un aimant était configuré pour repousser les pôles inversés (Fig. 3c), le nombre de particules visibles dans le champ de vision ne semblait pas augmenter après l'administration. La mise en place de ces deux configurations à double aimant est complexe en raison des fortes intensités de champ magnétique qui attirent ou repoussent les aimants, respectivement. Le dispositif a ensuite été modifié pour utiliser un aimant unique parallèle aux voies respiratoires, mais les traversant à 90° de sorte que les lignes de champ croisent la paroi trachéale orthogonalement (Fig. 3d), une orientation conçue pour déterminer si les particules Une agrégation sur la paroi latérale a pu être observée. Cependant, dans cette configuration, aucun mouvement identifiable d'accumulation de MP ou de mouvement de l'aimant n'a été constaté. Sur la base de tous ces résultats, une configuration à aimant unique, orientée à 30 degrés (Figure 3a), a été choisie pour les études de vecteurs de gènes in vivo.
Lorsque l'animal a été imagé à plusieurs reprises immédiatement après son euthanasie, l'absence de mouvements tissulaires parasites a permis de discerner des lignes de particules plus fines et plus courtes dans le champ interchondral clair, « ondulantes » en fonction du mouvement de translation de l'aimant. Néanmoins, la présence et le mouvement des particules MP6 restent difficilement observables.
Le titre de LV-LacZ était de 1,8 × 10⁸ TU/ml. Après mélange à parts égales avec CombiMag MP (MP6), les animaux ont reçu une dose trachéale de 50 μl de véhicule LV à 9 × 10⁷ TU/ml (soit 4,5 × 10⁶ TU/rat). Dans ces études, au lieu de déplacer l'aimant pendant le travail, nous l'avons fixé en position afin de déterminer si la transduction LV (a) pouvait être améliorée par rapport à l'administration vectorielle en l'absence de champ magnétique, et (b) pouvait être ciblée. Les cellules des voies respiratoires sont transduites vers des régions cibles magnétiques des voies respiratoires supérieures.
La présence d'aimants et l'utilisation de CombiMag en association avec des vecteurs LV ne semblent pas avoir d'effets indésirables sur la santé animale, tout comme notre protocole standard d'administration de vecteurs LV. Les images frontales de la région trachéale soumise à une perturbation mécanique (Fig. suppl. 1) indiquent des niveaux de transduction significativement plus élevés dans le groupe d'animaux traités par LV-MP en présence de l'aimant (Fig. 9a). Seule une faible coloration bleue LacZ est présente dans le groupe témoin (Fig. 9b). La quantification des surfaces colorées au X-Gal normalisées montre que l'administration de LV-MP en présence d'un champ magnétique induit une amélioration d'environ six fois (Fig. 9c).
Exemples d'images composites montrant la transduction trachéale par LV-MP (a) en présence d'un champ magnétique et (b) en l'absence d'aimant. (c) Amélioration statistiquement significative de la zone de transduction LacZ normalisée dans la trachée lors de l'utilisation de l'aimant (*p = 0,029, test t, n = 3 par groupe, moyenne ± SEM).
Les coupes colorées au rouge neutre rapide (exemple présenté dans la figure supplémentaire 2) ont montré des cellules colorées au LacZ présentes dans un schéma et un emplacement similaires à ceux rapportés précédemment.
Un défi majeur de la thérapie génique des voies respiratoires réside dans la localisation précise des particules vectrices dans les régions d'intérêt et l'obtention d'une efficacité de transduction élevée dans le poumon en mouvement, en présence de flux d'air et d'une clairance active du mucus. Pour les vecteurs à lentivirus conçus pour traiter la mucoviscidose, l'augmentation du temps de résidence des particules vectrices dans les voies respiratoires conductrices demeure un objectif difficile à atteindre. Comme l'ont souligné Castellani et al., l'utilisation de champs magnétiques pour améliorer la transduction présente des avantages par rapport à d'autres méthodes de transfert de gènes telles que l'électroporation : elle combine simplicité, rentabilité, localisation du transfert, efficacité accrue, temps d'incubation plus courts et, potentiellement, une dose de vecteur plus faible¹⁰. Cependant, le dépôt et le comportement in vivo des particules magnétiques dans les voies respiratoires sous l'influence de forces magnétiques externes n'ont jamais été décrits, et la faisabilité de cette méthode pour améliorer les niveaux d'expression génique dans des voies respiratoires vivantes intactes n'a pas encore été démontrée in vivo.
Nos expériences in vitro au synchrotron PCXI ont montré que toutes les particules testées, à l'exception des microparticules de polystyrène, étaient visibles avec le dispositif d'imagerie utilisé. En présence d'un champ magnétique, les microparticules forment des chaînes dont la longueur dépend du type de particule et de l'intensité du champ magnétique (c'est-à-dire la proximité et le mouvement de l'aimant). Comme illustré sur la figure 10, les chaînes observées se forment grâce à la magnétisation de chaque particule, qui induit son propre champ magnétique local. Ces champs magnétiques distincts provoquent l'agrégation et la connexion de particules similaires, avec des mouvements de groupe semblables à des chaînes, sous l'effet des forces d'attraction et de répulsion locales exercées par les autres particules.
Schéma montrant (a,b) des trains de particules générés à l'intérieur de capillaires remplis de fluide et (c,d) une trachée remplie d'air. Notez que les capillaires et la trachée ne sont pas dessinés à l'échelle. Le panneau (a) contient également une description du MP, qui contient des particules de Fe3O4 disposées en chaînes.
Lorsque l'aimant a été déplacé au-dessus du capillaire, l'angle de la chaîne de particules a atteint un seuil critique pour les MP3-5 contenant du Fe3O4. Au-delà de ce seuil, la chaîne de particules n'est plus restée dans sa position initiale, mais s'est déplacée le long de la surface vers une nouvelle position. Cet effet est probablement dû à la surface suffisamment lisse du capillaire en verre pour permettre ce mouvement. Curieusement, les MP6 (CombiMag) n'ont pas réagi de la même manière, peut-être parce que les particules étaient plus petites, présentaient des revêtements ou des charges de surface différents, ou encore parce qu'un fluide porteur propriétaire affectait leur mobilité. Le contraste de l'image des particules CombiMag est également plus faible, ce qui suggère que le fluide et les particules ont des densités similaires et, par conséquent, ne se déplacent pas facilement l'un vers l'autre. Les particules peuvent également se bloquer si l'aimant se déplace trop vite, ce qui indique que l'intensité du champ magnétique ne peut pas toujours compenser la friction entre les particules dans le fluide. Il n'est donc pas surprenant que l'intensité du champ magnétique et la distance entre l'aimant et la zone cible soient des paramètres très importants. L'ensemble de ces résultats suggère également que, bien que les aimants puissent capturer de nombreuses microparticules circulant dans la zone cible, il est peu probable qu'ils les capturent systématiquement. On peut compter sur cette méthode pour déplacer les particules CombiMag le long de la surface de la trachée. Par conséquent, nous concluons que les études LV-MP in vivo devraient utiliser des champs magnétiques statiques pour cibler physiquement des régions spécifiques de l'arbre respiratoire.
Lorsqu'elles sont introduites dans l'organisme, les particules sont difficiles à identifier au sein des tissus corporels complexes et en mouvement. Cependant, leur détection a été améliorée en déplaçant l'aimant horizontalement au-dessus de la trachée afin de « faire onduler » les filaments de microparticules. Bien que l'imagerie en temps réel soit possible, il est plus aisé de discerner le mouvement des particules une fois l'animal euthanasié. Les concentrations de microparticules étaient généralement les plus élevées à cet endroit lorsque l'aimant était positionné au-dessus de la zone d'imagerie, même si certaines particules étaient généralement retrouvées plus loin dans la trachée. Contrairement aux études in vitro, les particules ne peuvent pas être entraînées le long de la trachée par le déplacement de l'aimant. Ce résultat concorde avec la façon dont le mucus qui recouvre la surface de la trachée traite généralement les particules inhalées, les piégeant dans le mucus avant leur élimination par le mécanisme de clairance mucociliaire.
Nous avons émis l'hypothèse que l'utilisation d'aimants pour l'attraction au-dessus et au-dessous de la trachée (Fig. 3b) pourrait générer un champ magnétique plus uniforme, plutôt qu'un champ magnétique fortement concentré en un point, ce qui pourrait conduire à une distribution plus homogène des particules. Cependant, notre étude préliminaire n'a pas permis de confirmer cette hypothèse. De même, la configuration d'une paire d'aimants en opposition (Fig. 3c) n'a pas entraîné une augmentation du dépôt de particules dans la zone imagée. Ces deux observations démontrent que le dispositif à double aimant n'améliore pas significativement le contrôle local du ciblage des microparticules et que les forces magnétiques importantes qui en résultent sont difficiles à obtenir, ce qui rend cette approche moins pratique. De même, l'orientation de l'aimant au-dessus et à travers la trachée (Fig. 3d) n'a pas non plus augmenté le nombre de particules retenues dans la zone imagée. Certaines de ces configurations alternatives pourraient ne pas être efficaces car elles génèrent des champs magnétiques plus faibles dans la zone de dépôt. Par conséquent, la configuration avec un seul aimant à angle de 30 degrés (Fig. 3a) est considérée comme la méthode la plus simple et la plus efficace. Tests in vivo.
L'étude LV-MP a démontré que l'association de vecteurs LV avec CombiMag, suivie d'une perturbation physique en présence d'un champ magnétique, augmentait significativement les niveaux de transduction dans la trachée par rapport aux témoins. D'après les études d'imagerie synchrotron et les résultats LacZ, le champ magnétique semblait préserver le vecteur LV dans la trachée et réduire le nombre de particules vectorielles pénétrant profondément dans le poumon. Ces améliorations du ciblage pourraient accroître l'efficacité tout en réduisant les titres administrés, la transduction hors cible, les effets secondaires inflammatoires et immunitaires, ainsi que les coûts liés aux vecteurs de gènes. De plus, selon le fabricant, CombiMag peut être utilisé en association avec d'autres méthodes de transfert de gènes, notamment avec d'autres vecteurs viraux (comme l'AAV) et les acides nucléiques.