Merci d'avoir visité Nature.com. La version du navigateur que vous utilisez a un support limité pour CSS. Pour une expérience optimale, nous vous recommandons d'utiliser un navigateur mis à jour (ou de désactiver le mode de compatibilité dans Internet Explorer). En attendant, pour assurer un support continu, nous afficherons le site sans styles ni JavaScript.
Les vecteurs de gènes pour le traitement de la mucoviscidose pulmonaire doivent cibler les voies aériennes conductrices, car la transduction pulmonaire périphérique n'apporte aucun bénéfice thérapeutique. L'efficacité de la transduction virale est directement liée au temps de résidence du vecteur. Cependant, les fluides d'administration tels que les porteurs de gènes diffusent naturellement dans les alvéoles pendant l'inspiration, et les particules thérapeutiques de toute forme sont rapidement éliminées par transport mucociliaire. Prolonger le temps de résidence des porteurs de gènes dans les voies aériennes est important mais difficile à réaliser. Les particules magnétiques conjuguées aux porteurs de gènes, qui peuvent être dirigées vers la surface des voies aériennes, peuvent améliorer le ciblage régional. En raison des difficultés de visualisation in vivo, le comportement de ces petites particules magnétiques à la surface des voies aériennes en présence d'un champ magnétique appliqué est mal compris. L'objectif de cette étude était d'utiliser l'imagerie synchrotron pour visualiser le mouvement in vivo d'une série de particules magnétiques dans la trachée de rats anesthésiés afin d'examiner la dynamique et les schémas de comportement des particules individuelles et globales in vivo. Nous avons ensuite également évalué si l'administration de particules magnétiques lentivirales en présence d'un champ magnétique L'imagerie par rayons X synchrotron révèle le comportement des particules magnétiques dans des champs magnétiques stationnaires et mobiles in vitro et in vivo. Les particules ne peuvent pas être facilement traînées le long de la surface des voies respiratoires vivantes avec des aimants, mais pendant le transport, les dépôts sont concentrés dans le champ de vision où le champ magnétique est le plus fort. L'efficacité de la transduction a également été multipliée par six lorsque des particules magnétiques lentivirales ont été délivrées en présence d'un champ magnétique. Ensemble, ces résultats suggèrent que les particules magnétiques lentivirales et les champs magnétiques peuvent être des approches précieuses pour améliorer le ciblage des vecteurs génétiques et augmenter les niveaux de transduction dans les voies respiratoires conductrices in vivo.
La fibrose kystique (FK) est causée par une variation d'un seul gène appelé régulateur de conductance transmembranaire de la FK (CFTR). La protéine CFTR est un canal ionique présent dans de nombreuses cellules épithéliales de tout le corps, y compris les voies respiratoires conductrices, un site majeur de la pathogenèse de la FK. Les défauts de la CFTR entraînent un transport d'eau anormal, déshydratant la surface des voies respiratoires et réduisant la profondeur de la couche de liquide de surface des voies respiratoires (ASL). Cela altère également la capacité du système de transport mucociliaire (MCT) à éliminer les particules inhalées et les agents pathogènes des voies respiratoires. Notre objectif est de développer une thérapie génique lentivirale (LV) pour délivrer la copie correcte du gène CFTR et améliorer l'ASL, le MCT et la santé pulmonaire, et de continuer à développer de nouvelles technologies capables de mesurer ces paramètres in vivo1.
Les vecteurs LV sont parmi les principaux candidats à la thérapie génique des voies aériennes dans la mucoviscidose, principalement parce qu'ils peuvent intégrer de manière permanente le gène thérapeutique dans les cellules basales des voies aériennes (cellules souches des voies aériennes). Ceci est important car ils peuvent restaurer une hydratation et une élimination normales du mucus en se différenciant en cellules de surface des voies aériennes fonctionnelles associées à la mucoviscidose, corrigées par le gène, ce qui entraîne des bénéfices à vie. Les vecteurs LV doivent être dirigés contre les voies aériennes conductrices, car c'est là que débute la maladie pulmonaire liée à la mucoviscidose. L'introduction du vecteur plus profondément dans le poumon peut entraîner une transduction alvéolaire, mais cela n'apporte aucun bénéfice thérapeutique dans la mucoviscidose. Cependant, les fluides tels que les porteurs de gènes migrent naturellement vers les alvéoles lors de l'inspiration après l'administration3,4 et les particules thérapeutiques sont rapidement éliminées dans la cavité buccale par MCT. L'efficacité de la transduction du LV est directement liée à la durée pendant laquelle le vecteur reste à proximité des cellules cibles pour permettre l'absorption cellulaire – le « temps de résidence »5 – qui est facilement réduit par le flux d'air régional typique ainsi que par la capture coordonnée du mucus par les particules et la MCT. Dans la mucoviscidose, la capacité à prolonger le temps de résidence du LV dans les voies aériennes est importante. Il est important d’atteindre des niveaux élevés de transduction dans cette région, mais cela a jusqu’à présent été un défi.
Pour surmonter cet obstacle, nous suggérons que les particules magnétiques LV (MP) peuvent aider de deux manières complémentaires. Premièrement, elles peuvent être guidées magnétiquement vers la surface des voies respiratoires pour améliorer le ciblage et aider les particules porteuses de gènes à résider dans la région souhaitée des voies respiratoires ; et ASL) pour se déplacer vers la couche cellulaire 6. Les MP ont été largement utilisés comme véhicules d'administration ciblée de médicaments lorsqu'ils se lient à des anticorps, des médicaments chimiothérapeutiques ou d'autres petites molécules qui se fixent aux membranes cellulaires ou se lient aux récepteurs de surface cellulaire pertinents et s'accumulent sur les sites tumoraux en présence d'électricité statique. Champs magnétiques pour le traitement du cancer 7. D'autres techniques « hyperthermiques » visent à chauffer les MP lorsqu'ils sont exposés à des champs magnétiques oscillants, détruisant ainsi les cellules tumorales. Le principe de la transfection magnétique, dans lequel un champ magnétique est utilisé comme agent de transfection pour améliorer le transfert d'ADN aux cellules, est couramment utilisé in vitro en utilisant une gamme de vecteurs de gènes non viraux et viraux pour les lignées cellulaires difficiles à transduire. L'efficacité de la magnétotransfection LV a été établie, avec l'administration in vitro de LV-MP à une lignée de cellules épithéliales bronchiques humaines en présence d'un champ magnétique statique, augmentant l'efficacité de la transduction de 186 fois par rapport au vecteur LV seul. LV-MP a également été appliqué à un modèle de mucoviscidose in vitro, où la transfection magnétique a augmenté la transduction du LV dans des cultures d'interface air-liquide de 20 fois en présence d'expectorations de mucoviscidose10. Cependant, la magnétotransfection in vivo d'organes a reçu relativement peu d'attention et n'a été évaluée que chez quelques animaux études11,12,13,14,15, en particulier dans les poumons16,17.Néanmoins, les opportunités de transfection magnétique dans la thérapie pulmonaire de la mucoviscidose sont claires.Tan et al. (2020) ont déclaré qu'« une étude de preuve de concept de l'administration pulmonaire efficace de nanoparticules magnétiques ouvrira la voie à de futures stratégies d'inhalation de CFTR pour améliorer les résultats cliniques chez les patients atteints de mucoviscidose »6.
Français Le comportement des petites particules magnétiques sur les surfaces des voies respiratoires en présence d'un champ magnétique appliqué est difficile à visualiser et à étudier, et donc mal compris. Dans d'autres études, nous avons développé une méthode d'imagerie par rayons X à contraste de phase basée sur la propagation synchrotron (PB-PCXI) pour visualiser et quantifier de manière non invasive les changements in vivo infimes de la profondeur de l'ASL18 et du comportement du MCT19,20 pour mesurer directement l'hydratation de la surface du canal gazeux et utilisé comme indicateur précoce de l'efficacité du traitement. De plus, notre méthode d'évaluation du MCT utilise des particules de 10 à 35 µm de diamètre composées d'alumine ou de verre à indice de réfraction élevé comme marqueurs MCT visibles à l'aide du PB-PCXI21. Les deux techniques conviennent à la visualisation d'une gamme de types de particules, y compris le MP.
En raison de sa haute résolution spatiale et temporelle, nos techniques d'analyse ASL et MCT basées sur PB-PCXI sont bien adaptées pour examiner la dynamique et les modèles de comportement des particules simples et en vrac in vivo pour nous aider à comprendre et à optimiser les techniques d'administration de gènes MP. L'approche que nous utilisons ici dérive de nos études utilisant la ligne de lumière SPring-8 BL20B2, dans laquelle nous avons visualisé le mouvement du fluide après l'administration d'une dose de vecteur fictive dans les voies respiratoires nasales et pulmonaires de souris pour aider à expliquer nos modèles d'expression génétique non uniformes observés dans nos études animales sur la dose de porteur de gènes 3,4.
Français L'objectif de cette étude était d'utiliser le synchrotron PB-PCXI pour visualiser les mouvements in vivo d'une série de MP dans la trachée de rats vivants. Ces études d'imagerie PB-PCXI ont été conçues pour tester une gamme de MP, d'intensités de champ magnétique et d'emplacements afin de déterminer leur effet sur le mouvement des MP. Nous avons émis l'hypothèse qu'un champ magnétique appliqué de l'extérieur aiderait le MP délivré à rester ou à se déplacer vers la zone cible. Ces études nous ont également permis d'identifier des configurations d'aimants qui maximisent le nombre de particules retenues dans la trachée après dépôt. Dans une deuxième série d'études, nous avons cherché à utiliser cette configuration optimale pour démontrer le modèle de transduction résultant de l'administration in vivo de LV-MPs aux voies respiratoires du rat, en partant de l'hypothèse que l'administration de LV-MPs dans le contexte du ciblage des voies respiratoires entraînerait une amélioration de l'efficacité de la transduction du VG.
Toutes les études animales ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par l'Université d'Adélaïde (M-2019-060 et M-2020-022) et le Comité d'éthique animale du synchrotron SPring-8. Les expériences ont été réalisées conformément aux directives ARRIVE.
Français Toutes les images à rayons X ont été réalisées sur la ligne de faisceau BL20XU du synchrotron SPring-8 au Japon, en utilisant une configuration similaire à celle décrite précédemment21,22. En bref, la boîte expérimentale était située à 245 m de l'anneau de stockage du synchrotron. Une distance échantillon-détecteur de 0,6 m est utilisée pour les études d'imagerie des particules et de 0,3 m pour les études d'imagerie in vivo afin de générer des effets de contraste de phase. Une énergie de faisceau monochromatique de 25 keV a été utilisée. Les images ont été capturées à l'aide d'un convertisseur de rayons X haute résolution (SPring-8 BM3) couplé à un détecteur sCMOS. Le convertisseur convertit les rayons X en lumière visible à l'aide d'un scintillateur de 10 µm d'épaisseur (Gd3Al2Ga3O12), qui est ensuite dirigé vers un capteur sCMOS à l'aide d'un objectif de microscope × 10 (NA 0,3). Le détecteur sCMOS était Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japon) avec un réseau taille de 2048 × 2048 pixels et une taille de pixel brute de 6,5 × 6,5 µm. Cette configuration donne une taille de pixel isotrope effective de 0,51 µm et un champ de vision d'environ 1,1 mm × 1,1 mm. Une durée d'exposition de 100 ms a été choisie pour maximiser le rapport signal/bruit des particules magnétiques à l'intérieur et à l'extérieur des voies respiratoires tout en minimisant les artefacts de mouvement induits par la respiration. Pour les études in vivo, un obturateur à rayons X rapide a été placé sur le trajet des rayons X pour limiter la dose de rayonnement en bloquant le faisceau de rayons X entre les expositions.
Le support LV n'a été utilisé dans aucune étude d'imagerie SPring-8 PB-PCXI car la chambre d'imagerie BL20XU n'est pas certifiée Biosafety Level 2. Au lieu de cela, nous avons sélectionné une gamme de MP bien caractérisés auprès de deux fournisseurs commerciaux - couvrant une gamme de tailles, de matériaux, de concentrations en fer et d'applications - d'abord pour comprendre comment les champs magnétiques affectent le mouvement des MP dans les capillaires en verre, puis dans les voies respiratoires vivantes. à la surface. Les MP varient en taille de 0,25 à 18 μm et sont fabriqués à partir d'une variété de matériaux (voir tableau 1), mais la composition de chaque échantillon, y compris la taille des particules magnétiques dans le MP, est inconnue. Sur la base de nos études MCT approfondies 19, 20, 21, 23, 24, nous nous attendons à ce que des MP aussi petits que 5 μm puissent être vus sur la surface des voies respiratoires trachéales, par exemple en soustrayant des images consécutives pour voir une visibilité améliorée du mouvement du MP. Un seul MP ​​de 0,25 μm est plus petit que la résolution du dispositif d'imagerie, mais PB-PCXI devrait détecter leur contraste de volume et le mouvement du fluide de surface sur lequel ils sont déposés après le dépôt.
Des échantillons pour chaque MP du tableau 1 ont été préparés dans des capillaires en verre de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, États-Unis) d'un diamètre intérieur de 0,63 mm. Les particules corpusculaires sont disponibles dans l'eau, tandis que les particules CombiMag sont disponibles dans le liquide exclusif du fabricant. Chaque tube est à moitié rempli de liquide (environ 11 μl) et placé sur le porte-échantillon (voir figure 1). Les capillaires en verre ont été placés horizontalement sur la platine d'échantillon dans la boîte d'imagerie, respectivement, et positionnés sur les bords du liquide. Un aimant en terre rare néodyme fer bore (NdFeB) à coque en nickel de 19 mm de diamètre (28 mm de long) (N35, n° de catalogue LM1652, Jaycar Electronics, Australie) avec une aimantation résiduelle de 1,17 Tesla a été fixé à une platine de translation séparée pour permettre le changement de position à distance pendant l'imagerie. L'acquisition des images radiographiques commence lorsque l'aimant est positionné à environ 30 mm au-dessus de l'échantillon, et les images sont acquises à une vitesse de 4 images par seconde. Pendant l'imagerie, l'aimant a été rapproché du tube capillaire en verre (à environ 1 mm de distance) puis déplacé le long du tube pour évaluer les effets de l'intensité du champ et de la position.
Configuration d'imagerie in vitro contenant des échantillons MP dans des capillaires en verre sur la platine de translation xy de l'échantillon. Le trajet du faisceau de rayons X est marqué par une ligne pointillée rouge.
Une fois la visibilité in vitro des MP établie, un sous-ensemble d'entre eux a été testé in vivo chez des rats Wistar albinos femelles de type sauvage (~ 12 semaines, ~ 200 g).0,24 mg/kg de médétomidine (Domitor®, Zenoaq, Japon), 3,2 mg/kg de midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japon) et 4 mg/kg de butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Les rats ont été anesthésiés avec un mélange de Pharma), Japon) par injection intrapéritonéale.Après l'anesthésie, ils ont été préparés pour l'imagerie en retirant la fourrure autour de la trachée, en insérant un tube endotrachéal (ET ; canule iv 16 Ga, Terumo BCT) et en les immobilisant en décubitus dorsal sur une plaque d'imagerie sur mesure contenant un sac thermique pour maintenir la température corporelle 22 .La plaque d'imagerie a ensuite été fixée à la platine de translation de l'échantillon dans la boîte d'imagerie à un léger angle pour aligner la trachée horizontalement dans le Image radiographique, comme illustré dans la figure 2a.
(a) Configuration d'imagerie in vivo dans la boîte d'imagerie SPring-8, le trajet du faisceau de rayons X est marqué d'une ligne pointillée rouge. (b, c) La localisation de l'aimant sur la trachée a été réalisée à distance à l'aide de deux caméras IP montées orthogonalement. Sur le côté gauche de l'image de l'écran, la boucle de fil maintenant la tête peut être vue et la canule d'administration en place dans le tube ET.
Un système de pompe à seringue télécommandé (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) utilisant une seringue en verre de 100 μl a été connecté à un tube PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) via une aiguille de 30 Ga.Marquer le tube pour s'assurer que l'embout est dans la bonne position dans la trachée lors de l'insertion du tube ET.À l'aide de la micropompe, le piston de la seringue a été retiré tandis que l'embout du tube était immergé dans l'échantillon MP à administrer.Le tube d'administration chargé a ensuite été inséré dans le tube endotrachéal, en plaçant l'embout dans la partie la plus forte de notre champ magnétique appliqué prévu.L'acquisition d'images a été contrôlée à l'aide d'un détecteur de respiration connecté à notre boîtier de synchronisation basé sur Arduino, et tous les signaux (par exemple, température, respiration, ouverture/fermeture de l'obturateur et acquisition d'images) ont été enregistrés à l'aide de Powerlab et LabChart (AD Instruments, Sydney, Australie) 22. Lors de l'imagerie Lorsque l'enceinte était inaccessible, deux caméras IP (Panasonic BB-SC382) ont été positionnées à environ 90° par rapport à les uns avec les autres et ont été utilisés pour surveiller la position de l'aimant par rapport à la trachée pendant l'imagerie (Fig. 2b, c). Pour minimiser les artefacts de mouvement, une image a été acquise par respiration pendant le plateau de flux de fin d'expiration.
Français Un aimant est fixé à un deuxième étage qui peut être situé à distance de l'extérieur du boîtier d'imagerie. Différentes positions et configurations d'aimants ont été testées, notamment : Monté à un angle d'environ 30° au-dessus de la trachée (configurations illustrées dans les figures 2a et 3a) ; un aimant au-dessus de l'animal et l'autre en dessous, avec des pôles réglés pour attirer (figure 3b) ; un aimant au-dessus de l'animal et l'autre en dessous, avec des pôles réglés pour repousser (figure 3c) ; et un aimant au-dessus et perpendiculaire à la trachée (figure 3d). Une fois l'animal et l'aimant configurés et le MP à tester chargé dans la pompe à seringue, administrez une dose de 50 μl à un débit de 4 μl/sec tout en acquérant des images. L'aimant est ensuite déplacé d'avant en arrière le long ou latéralement à travers la trachée tout en continuant à acquérir des images.
Configuration de l'aimant pour l'imagerie in vivo (a) un seul aimant au-dessus de la trachée à un angle d'environ 30°, (b) deux aimants réglés pour attirer, (c) deux aimants réglés pour repousser, (d) un seul aimant au-dessus et perpendiculairement à la trachée. L'observateur regardait de la bouche aux poumons à travers la trachée, et le faisceau de rayons X traversait le côté gauche du rat et sortait du côté droit. L'aimant est déplacé soit le long des voies respiratoires, soit à gauche et à droite au-dessus de la trachée dans la direction du faisceau de rayons X.
Nous avons également cherché à déterminer la visibilité et le comportement des particules dans les voies respiratoires en l'absence de respiration et de mouvement cardiaque confondants. Par conséquent, à la fin de la période d'imagerie, les animaux ont été sacrifiés sans cruauté pour surdose de pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, États-Unis ; ~65 mg/kg ip). Certains animaux ont été laissés sur la plate-forme d'imagerie et, une fois la respiration et le rythme cardiaque arrêtés, le processus d'imagerie a été répété, en ajoutant une dose supplémentaire de MP si aucun MP n'était visible à la surface des voies respiratoires.
Les images acquises ont été corrigées en champ plat et en champ sombre, puis assemblées dans un film (20 images par seconde ; 15 à 25 × vitesse normale selon la fréquence respiratoire) à l'aide d'un script personnalisé écrit en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Toutes les études de distribution de vecteurs de gènes LV ont été menées au Laboratory Animal Research Facility de l'Université d'Adélaïde et visaient à utiliser les résultats de l'expérience SPring-8 pour évaluer si la distribution de LV-MP en présence d'un champ magnétique pouvait améliorer le transfert de gènes in vivo. Pour évaluer les effets du MP et du champ magnétique, deux groupes d'animaux ont été traités : un groupe a reçu du LV-MP avec un aimant placé, et l'autre groupe a reçu un groupe témoin avec du LV-MP sans aimant.
Les vecteurs de gènes LV ont été générés à l'aide de méthodes décrites précédemment 25, 26. Le vecteur LacZ exprime le gène bêta-galactosidase localisé dans le noyau, piloté par le promoteur constitutif du MPSV (LV-LacZ), qui produit un produit de réaction bleu dans les cellules transduites, visible dans les fronts de tissu pulmonaire et les coupes de tissu. Le titrage a été effectué dans des cultures cellulaires en comptant manuellement le nombre de cellules positives à LacZ avec un hémocytomètre pour calculer le titre en TU/ml. Les supports sont cryoconservés à -80 °C, décongelés avant utilisation et liés à CombiMag par mélange dans un rapport 1:1 et incubation sur glace pendant au moins 30 minutes avant l'administration.
Des rats Sprague Dawley normaux (n = 3/groupe, ~2-3 ont été anesthésiés par voie intrapéritonéale avec un mélange de 0,4 mg/kg de médétomidine (Domitor, Ilium, Australie) et de 60 mg/kg de kétamine (Ilium, Australie) par injection ip (un mois) et canulation orale non chirurgicale avec une canule iv de 16 Ga. Pour garantir que le tissu des voies respiratoires trachéales reçoit une transduction du ventricule gauche, il a été conditionné à l'aide de notre protocole de perturbation mécanique décrit précédemment, dans lequel la surface des voies respiratoires trachéales a été frottée axialement avec un panier métallique (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, États-Unis) 30 s28. L'administration trachéale de LV-MP a ensuite été réalisée dans une enceinte de sécurité biologique environ 10 minutes après la perturbation.
Français Le champ magnétique utilisé dans cette expérience a été configuré de manière similaire à l'étude d'imagerie par rayons X in vivo, avec les mêmes aimants maintenus au-dessus de la trachée à l'aide de clips de stent de distillation (Figure 4). Un volume de 50 μl (2 × 25 μl aliquotes) de LV-MP a été délivré dans la trachée (n = 3 animaux) à l'aide d'une pipette contenant un embout en gel comme décrit précédemment. Un groupe témoin (n = 3 animaux) a reçu les mêmes LV-MP sans l'utilisation d'un aimant. Une fois la perfusion terminée, la canule est retirée du tube ET et l'animal est extubé. L'aimant reste en place pendant 10 minutes, puis il est retiré. Les rats ont reçu une dose sous-cutanée de méloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australie) suivie d'une inversion de l'anesthésie par injection ip de 1 mg/kg de chlorhydrate d'atipamazole (Antisedan, Zoetis, Australie). Les rats ont été maintenus au chaud et surveillés jusqu'à leur rétablissement complet de l'anesthésie.
Dispositif d'administration LV-MP dans une enceinte de sécurité biologique. L'embout Luer gris clair du tube ET peut être vu dépassant de la bouche et l'embout en gel de la pipette illustrée sur l'image est inséré à travers le tube ET jusqu'à la profondeur souhaitée dans la trachée.
Une semaine après la procédure de dosage LV-MP, les animaux ont été euthanasiés de manière humaine par inhalation de CO2 à 100 % et l'expression de LacZ a été évaluée à l'aide de notre traitement X-gal standard. Les trois anneaux cartilagineux caudaux les plus importants ont été retirés afin de garantir que tout dommage mécanique ou rétention de liquide dû à la mise en place d'une sonde endotrachéale ne soit pas inclus dans l'analyse. Chaque trachée a été coupée longitudinalement pour créer deux moitiés pour l'analyse, et elles ont été montées dans une boîte contenant du caoutchouc de silicone (Sylgard, Dow Inc) à l'aide d'une aiguille Minutien (Fine Science Tools) pour visualiser la surface luminale. La distribution et le motif des cellules transduites ont été confirmés par photographie frontale à l'aide d'un microscope Nikon (SMZ1500) avec une caméra DigiLite et le logiciel TCapture (Tucsen Photonics, Chine). Les images ont été acquises à un grossissement de 20x (y compris le réglage le plus élevé pour toute la largeur de la trachée), avec toute la longueur de la trachée imagée étape par étape, assurant un chevauchement suffisant entre chaque image pour permettre l'assemblage des images. Images de chaque Les trachées ont ensuite été assemblées en une seule image composite à l'aide de l'éditeur d'images composites v2.0.3 (Microsoft Research) en utilisant un algorithme de mouvement planaire. Les zones d'expression de LacZ dans les images composites de la trachée de chaque animal ont été quantifiées à l'aide d'un script MATLAB automatisé (R2020a, MathWorks) comme décrit précédemment, en utilisant des paramètres de 0,35 < Teinte < 0,58, Saturation > 0,15 et Valeur < 0,7. En traçant les contours du tissu, un masque a été généré manuellement dans GIMP v2.10.24 pour chaque image composite afin d'identifier la zone du tissu et d'éviter toute fausse détection de l'extérieur du tissu trachéal. Les zones colorées de toutes les images composites de chaque animal ont été additionnées pour générer la zone colorée totale pour cet animal. La zone colorée a ensuite été divisée par la zone totale du masque pour générer la zone normalisée.
Chaque trachée a été incluse dans de la paraffine et des sections de 5 µm ont été coupées. Les sections ont été contre-colorées avec du rouge neutre rapide pendant 5 minutes et les images ont été acquises à l'aide d'un microscope Nikon Eclipse E400, d'une caméra DS-Fi3 et d'un logiciel de capture d'éléments NIS (version 5.20.00).
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées dans GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). La signification statistique a été fixée à p ≤ 0,05. La normalité a été vérifiée à l'aide du test de Shapiro-Wilk et les différences de coloration LacZ ont été évaluées à l'aide du test t non apparié.
Les six MP décrits dans le tableau 1 ont été examinés à l'aide de PCXI, et la visibilité est décrite dans le tableau 2. Deux MP de polystyrène (MP1 et MP2 ; 18 μm et 0,25 μm, respectivement) n'étaient pas visibles sous PCXI, mais le reste des échantillons était identifiable (des exemples sont présentés dans la figure 5). MP3 et MP4 (10-15 % Fe3O4 ; 0,25 μm et 0,9 μm, respectivement) sont faiblement visibles. Bien que contenant certaines des plus petites particules testées, MP5 (98 % Fe3O4 ; 0,25 μm) était la plus prononcée. Le produit CombiMag MP6 est difficile à repérer. Dans tous les cas, notre capacité à détecter les MP a été considérablement améliorée en déplaçant l'aimant d'avant en arrière parallèlement au capillaire. Lorsque les aimants s'éloignaient du capillaire, les particules s'étendaient en longues chaînes, mais à mesure que les aimants se rapprochaient et que l'intensité du champ magnétique augmentait, les chaînes de particules se raccourcissaient. Les particules ont migré vers la surface supérieure du capillaire (voir la vidéo supplémentaire S1 : MP4), augmentant la densité de particules de la surface. À l'inverse, lorsque l'aimant est retiré du capillaire, l'intensité du champ diminue et les MP se réorganisent en longues chaînes s'étendant depuis la surface supérieure du capillaire (voir la vidéo supplémentaire S2 : MP4). Une fois que l'aimant a cessé de bouger, les particules continuent de se déplacer pendant une courte période après avoir atteint la position d'équilibre. Lorsque le MP se rapproche et s'éloigne de la surface supérieure du capillaire, les particules magnétiques entraînent généralement les débris à travers le fluide.
La visibilité du MP sous PCXI varie considérablement entre les échantillons. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6. Toutes les images présentées ici ont été prises avec un aimant situé à environ 10 mm directement au-dessus du capillaire. Les grands cercles apparents sont des bulles d'air piégées dans les capillaires, montrant clairement les caractéristiques de bord noir et blanc de l'imagerie en contraste de phase. Le cadre rouge contient le grossissement améliorant le contraste. Notez que les diamètres des schémas d'aimant dans toutes les figures ne sont pas à l'échelle et sont environ 100 fois plus grands que ceux indiqués.
Lorsque l'aimant est déplacé vers la gauche et la droite le long de la partie supérieure du capillaire, l'angle de la corde MP change pour s'aligner avec l'aimant (voir Figure 6), délimitant ainsi les lignes de champ magnétique. Pour MP3-5, une fois que la corde atteint un angle seuil, les particules sont entraînées le long de la surface supérieure du capillaire. Cela entraîne souvent un regroupement des MP en groupes plus importants à proximité de l'endroit où le champ magnétique est le plus fort (voir Vidéo supplémentaire S3:MP5). Ce phénomène est également particulièrement évident lors de l'imagerie à proximité de l'extrémité du capillaire, ce qui entraîne l'agrégation et la concentration des MP à l'interface fluide-air. Les particules de MP6, plus difficiles à discerner que celles de MP3-5, n'ont pas été entraînées lors du déplacement de l'aimant le long du capillaire, mais les cordes MP se sont dissociées, laissant les particules dans le champ de vision (voir Vidéo supplémentaire S4:MP6). Dans certains cas, lorsque le champ magnétique appliqué était réduit en déplaçant l'aimant sur une grande distance du point d'imagerie, les MP restantes descendaient lentement vers la surface inférieure du tube par gravité tout en restant dans la corde (voir Vidéo supplémentaire S5 : MP3).
L'angle de la chaîne MP change lorsque l'aimant est déplacé vers la droite au-dessus du capillaire. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 et (d) MP6. La case rouge contient le grossissement améliorant le contraste. Notez que les vidéos supplémentaires sont informatives car elles révèlent une structure de particules importante et des informations dynamiques qui ne peuvent pas être visualisées dans ces images statiques.
Français Nos tests ont montré que le déplacement lent de l'aimant d'avant en arrière le long de la trachée facilite la visualisation du MP dans le contexte d'un mouvement complexe in vivo. Les tests in vivo n'ont pas été effectués car les billes de polystyrène (MP1 et MP2) n'étaient pas visibles dans le capillaire. Chacun des quatre MP restants a été testé in vivo avec l'axe long de l'aimant configuré au-dessus de la trachée à un angle d'environ 30° par rapport à la verticale (voir les figures 2b et 3a), car cela a donné lieu à des chaînes de MP plus longues et était plus efficace que la configuration de l'aimant terminée. MP3, MP4 et MP6 n'ont pas été détectés dans la trachée d'animaux vivants. Lorsque les voies respiratoires du rat ont été imagées après que les animaux ont été tués sans cruauté, les particules sont restées invisibles même lorsqu'un volume supplémentaire a été ajouté à l'aide d'une pompe à seringue. MP5 avait la teneur en oxyde de fer la plus élevée et était la seule particule visible, et a donc été utilisé pour évaluer et caractériser le comportement in vivo du MP.
Français Le placement de l'aimant sur la trachée pendant l'administration de MP a entraîné la concentration de nombreux MP, mais pas de tous, dans le champ de vision. Les particules pénétrant dans la trachée sont mieux observées chez les animaux sacrifiés sans cruauté. La figure 7 et la vidéo supplémentaire S6 : MP5 montrent une capture magnétique rapide et un alignement des particules sur la surface de la trachée ventrale, indiquant que les MP peuvent être dirigés vers les régions souhaitées de la trachée. Lors d'une recherche plus distale le long de la trachée après l'administration de MP, certains MP ont été trouvés plus près de la carène, ce qui suggère que l'intensité du champ magnétique était insuffisante pour collecter et retenir tous les MP, car ils étaient délivrés à travers la région d'intensité de champ magnétique maximale pendant le processus de fluide. Néanmoins, les concentrations de MP post-partum étaient plus élevées autour de la zone imagée, ce qui suggère que de nombreux MP restaient dans les régions des voies respiratoires où l'intensité du champ magnétique appliqué était la plus élevée.
Images de (a) avant et (b) après l'administration de MP5 dans la trachée d'un rat récemment euthanasié avec l'aimant positionné directement au-dessus de la zone d'imagerie. La zone imagée est située entre les deux anneaux cartilagineux. Avant l'administration de MP, il y a du liquide dans les voies respiratoires. La boîte rouge contient le grossissement améliorant le contraste. Ces images proviennent de la vidéo présentée dans la vidéo supplémentaire S6 : MP5.
Français La translation de l'aimant le long de la trachée in vivo a provoqué un changement d'angle de la chaîne MP à l'intérieur de la surface des voies respiratoires d'une manière similaire à celle observée dans les capillaires (voir la figure 8 et la vidéo supplémentaire S7:MP5). Cependant, dans notre étude, les MP ne pouvaient pas être entraînés le long de la surface des voies respiratoires vivantes comme ils le pourraient avec les capillaires. Dans certains cas, la chaîne MP s'allonge à mesure que l'aimant se déplace vers la gauche et la droite. Il est intéressant de noter que nous avons également constaté que la chaîne de particules semble modifier la profondeur de la couche de fluide de surface lorsque l'aimant est déplacé longitudinalement le long de la trachée, et se dilate lorsque l'aimant est déplacé directement au-dessus et que la chaîne de particules est tournée vers une position verticale (voir la vidéo supplémentaire S7). : MP5 à 0:09, en bas à droite). Le modèle caractéristique du mouvement a changé lorsque l'aimant a été déplacé latéralement sur le dessus de la trachée (c'est-à-dire vers la gauche ou la droite de l'animal plutôt que le long de la trachée). Les particules étaient toujours clairement visibles lorsqu'elles se déplaçaient, mais lorsque l'aimant a été retiré de la trachée, les extrémités des chaînes de particules sont devenues visibles (voir la vidéo supplémentaire S8:MP5, à partir de 0:08). Ceci est cohérent avec le comportement MP que nous avons observé sous un champ magnétique appliqué dans un capillaire en verre.
Exemples d'images montrant MP5 dans la trachée d'un rat vivant anesthésié. (a) L'aimant est utilisé pour acquérir des images au-dessus et à gauche de la trachée, puis (b) après que l'aimant est déplacé vers la droite. La case rouge contient le grossissement améliorant le contraste. Ces images proviennent de la vidéo présentée dans la vidéo supplémentaire S7 : MP5.
Lorsque les deux pôles étaient configurés selon une orientation nord-sud au-dessus et en dessous de la trachée (c'est-à-dire en attraction ; Fig. 3b), les cordes MP apparaissaient plus longues et étaient situées sur la paroi latérale de la trachée plutôt que sur la surface trachéale dorsale (voir la vidéo supplémentaire S9:MP5). Cependant, de fortes concentrations de particules à un seul endroit (c'est-à-dire la surface dorsale de la trachée) n'étaient pas détectées après l'administration de liquide lorsqu'un dispositif à double aimant était utilisé, ce qui se produit généralement lorsqu'un dispositif à aimant unique est utilisé. Ensuite, lorsqu'un aimant était configuré pour repousser les pôles inversés (Fig. 3c), le nombre de particules visibles dans le champ de vision ne semblait pas augmenter après l'administration. La configuration des deux configurations à double aimant est difficile en raison des fortes intensités du champ magnétique qui attirent ou poussent les aimants, respectivement. La configuration a ensuite été modifiée pour un seul aimant parallèle aux voies aériennes mais traversant les voies aériennes à 90 degrés de sorte que les lignes de champ traversent la paroi trachéale orthogonalement (Fig. 3d), une orientation conçue pour déterminer si l'agrégation des particules sur la paroi latérale pouvait être observée. Cependant, dans cette configuration, il n'y avait aucun mouvement identifiable d'accumulation de MP ou de mouvement d'aimant. Sur la base de tous ces résultats, une configuration d'orientation à aimant unique de 30 degrés (Figure 3a) a été choisie pour les études de porteurs de gènes in vivo.
Lors de l'imagerie répétée de l'animal immédiatement après l'abattage, l'absence de mouvements tissulaires gênants a permis de distinguer des lignes de particules plus fines et plus courtes dans le champ interchondral clair, oscillant en fonction du mouvement de translation de l'aimant. Néanmoins, la présence et le mouvement des particules MP6 ne sont toujours pas clairement visibles.
Le titre LV-LacZ était de 1,8 × 108 TU/ml, et après mélange 1:1 avec CombiMag MP (MP6), les animaux ont reçu une dose trachéale de 50 μl de 9 × 107 TU/ml de véhicule LV (soit 4,5 × 106 TU/rat). ).Dans ces études, au lieu de translater l'aimant pendant le travail, nous avons fixé l'aimant dans une position pour déterminer si la transduction LV (a) pouvait être améliorée par rapport à l'administration du vecteur en l'absence de champ magnétique, et (b) pouvait être focalisée. Les cellules des voies aériennes sont transduites vers des régions cibles magnétiques des voies aériennes supérieures.
Français La présence d'aimants et l'utilisation de CombiMag combiné à des vecteurs LV ne semblent pas avoir d'effets indésirables sur la santé animale, comme l'a fait notre protocole standard d'administration de vecteurs LV. Les images frontales de la région trachéale soumise à une perturbation mécanique (Fig. 1 supplémentaire) ont indiqué qu'il y avait des niveaux de transduction significativement plus élevés dans le groupe d'animaux traités avec LV-MP lorsque l'aimant était présent (Fig. 9a). Seule une petite quantité de coloration bleue LacZ était présente dans le groupe témoin (Fig. 9b). La quantification des zones colorées au X-Gal normalisées a montré que l'administration de LV-MP en présence d'un champ magnétique produisait une amélioration d'environ 6 fois (Fig. 9c).
Exemples d'images composites montrant la transduction trachéale par LV-MP (a) en présence d'un champ magnétique et (b) en l'absence d'aimant. (c) Amélioration statistiquement significative de la zone de transduction LacZ normalisée dans la trachée lors de l'utilisation de l'aimant (*p = 0,029, test t, n = 3 par groupe, moyenne ± SEM).
Les sections colorées au rouge neutre rapide (exemple présenté dans la figure supplémentaire 2) ont montré des cellules colorées au LacZ présentes selon un modèle et un emplacement similaires à ceux rapportés précédemment.
Français Un défi majeur pour la thérapie génique des voies respiratoires reste la localisation précise des particules porteuses dans les régions d'intérêt et l'obtention de niveaux élevés d'efficacité de transduction dans le poumon en mouvement en présence d'un flux d'air et d'une clairance active du mucus. Pour les transporteurs LV conçus pour traiter la maladie des voies respiratoires de la mucoviscidose, l'augmentation du temps de séjour des particules porteuses dans les voies respiratoires conductrices a été un objectif jusqu'ici insaisissable. Comme l'ont souligné Castellani et al., l'utilisation de champs magnétiques pour améliorer la transduction présente des avantages par rapport à d'autres méthodes d'administration de gènes telles que l'électroporation, car elle peut combiner simplicité, rentabilité, localisation de l'administration, efficacité accrue et temps d'incubation plus courts, et éventuellement une dose de porteur plus faible10. Cependant, le dépôt et le comportement in vivo des particules magnétiques dans les voies respiratoires sous l'influence de forces magnétiques externes n'ont jamais été décrits, et la faisabilité de cette méthode n'a pas été démontrée in vivo pour améliorer les niveaux d'expression des gènes dans les voies respiratoires vivantes intactes.
Nos expériences in vitro au synchrotron PCXI ont montré que toutes les particules que nous avons testées, à l'exception du polystyrène MP, étaient visibles dans la configuration d'imagerie que nous avons utilisée. En présence d'un champ magnétique, les MP forment des chaînes dont les longueurs sont liées au type de particule et à l'intensité du champ magnétique (c'est-à-dire la proximité et le mouvement de l'aimant). Comme le montre la figure 10, les chaînes que nous observons se forment parce que chaque particule individuelle est magnétisée et induit son propre champ magnétique local. Ces champs séparés provoquent l'agrégation et la connexion d'autres particules similaires, avec des mouvements de type chaîne de groupe dus aux forces locales provenant des forces attractives et répulsives locales d'autres particules.
Schéma montrant (a, b) les trains de particules générés à l'intérieur des capillaires remplis de liquide et (c, d) la trachée remplie d'air. Notez que les capillaires et la trachée ne sont pas dessinés à l'échelle. Le panneau (a) contient également une description du MP, qui contient des particules de Fe3O4 disposées en chaînes.
Lorsque l'aimant a été déplacé au-dessus du capillaire, l'angle de la chaîne de particules a atteint un seuil critique pour le MP3-5 contenant du Fe3O4, après quoi la chaîne de particules n'est plus restée dans sa position d'origine, mais s'est déplacée le long de la surface vers une nouvelle position.aimant. Cet effet est susceptible de se produire car la surface du capillaire en verre est suffisamment lisse pour permettre ce mouvement. Il est intéressant de noter que le MP6 (CombiMag) ne s'est pas comporté de cette manière, probablement parce que les particules étaient plus petites, avaient des revêtements ou des charges de surface différents, ou qu'un fluide porteur exclusif affectait leur capacité à se déplacer. Le contraste de l'image des particules CombiMag est également plus faible, ce qui suggère que le fluide et les particules peuvent avoir des densités similaires et donc ne pas se déplacer facilement les uns vers les autres. Les particules peuvent également se coincer si l'aimant se déplace trop vite, ce qui indique que l'intensité du champ magnétique ne peut pas toujours surmonter la friction entre les particules dans le fluide, ce qui suggère qu'il n'est peut-être pas surprenant que l'intensité du champ magnétique et la distance entre l'aimant et la zone cible soient très importantes. Pris ensemble, ces résultats suggèrent également que, bien que les aimants puissent capturer de nombreux MP qui circulent dans la zone cible, il est peu probable que l'on peut compter sur des aimants pour déplacer les particules CombiMag le long de la surface de la trachée. Par conséquent, nous concluons que les études LV-MP in vivo devraient utiliser des champs magnétiques statiques pour cibler physiquement des régions spécifiques de l'arbre des voies respiratoires.
Français Lorsque les particules sont délivrées dans le corps, elles sont difficiles à identifier dans le contexte de tissus corporels complexes en mouvement, mais la capacité de les détecter a été améliorée en déplaçant l'aimant horizontalement au-dessus de la trachée pour « remuer » les cordes MP. Bien que l'imagerie en direct soit possible, il est plus facile de discerner le mouvement des particules une fois que l'animal a été tué sans cruauté. Les concentrations de MP étaient généralement les plus élevées à cet endroit lorsque l'aimant était positionné au-dessus de la zone d'imagerie, bien que certaines particules se trouvaient généralement plus loin le long de la trachée. Contrairement aux études in vitro, les particules ne peuvent pas être entraînées le long de la trachée en déplaçant l'aimant. Cette découverte est cohérente avec la façon dont le mucus qui recouvre la surface de la trachée traite généralement les particules inhalées, les piégeant dans le mucus et les éliminant ensuite par le mécanisme de clairance mucociliaire.
Nous avons émis l'hypothèse que l'utilisation d'aimants pour l'attraction au-dessus et au-dessous de la trachée (Fig. 3b) pourrait produire un champ magnétique plus uniforme, plutôt qu'un champ magnétique fortement concentré en un point, ce qui pourrait conduire à une distribution plus uniforme des particules. Cependant, notre étude préliminaire n'a pas apporté de preuves claires pour étayer cette hypothèse. De même, la configuration d'une paire d'aimants pour la répulsion (Fig. 3c) n'a pas entraîné de dépôt de particules plus important dans la zone imagée. Ces deux résultats démontrent que la configuration à double aimant n'améliore pas significativement le contrôle local du ciblage des micro-ondes, et que les forces magnétiques élevées qui en résultent sont difficiles à configurer, ce qui rend cette approche moins pratique. De même, l'orientation de l'aimant au-dessus et à travers la trachée (Fig. 3d) n'a pas non plus augmenté le nombre de particules retenues dans la zone imagée. Certaines de ces configurations alternatives pourraient ne pas être efficaces, car elles entraînent des intensités de champ magnétique plus faibles dans la zone de dépôt. Par conséquent, la configuration à aimant unique à 30 degrés (Figure 3a) est considérée comme la plus simple et la plus méthode efficace pour les tests in vivo.
Français L'étude LV-MP a montré que lorsque les vecteurs LV étaient combinés avec CombiMag et délivrés après une perturbation physique en présence d'un champ magnétique, les niveaux de transduction étaient significativement augmentés dans la trachée par rapport aux témoins. D'après les études d'imagerie synchrotron et les résultats de LacZ, le champ magnétique était apparemment capable de préserver le LV dans la trachée et de réduire le nombre de particules vectorielles qui pénétraient immédiatement profondément dans le poumon. De telles améliorations de ciblage peuvent conduire à une efficacité plus élevée tout en réduisant les titres délivrés, la transduction hors cible, les effets secondaires inflammatoires et immunitaires et les coûts des porteurs de gènes. Il est important de noter que, selon le fabricant, CombiMag peut être utilisé en conjonction avec d'autres méthodes de transfert de gènes, y compris avec d'autres vecteurs viraux (tels que l'AAV) et les acides nucléiques.