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सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों की बीमारी के उपचार के लिए जीन वैक्टर को संवाहक वायुमार्ग को लक्षित करना चाहिए क्योंकि परिधीय फेफड़ों का पारगमन चिकित्सीय लाभ प्रदान नहीं करता है। वायरल पारगमन दक्षता सीधे वेक्टर निवास समय से संबंधित है। हालांकि, जीन वाहक जैसे डिलीवरी तरल पदार्थ स्वाभाविक रूप से प्रेरणा के दौरान एल्वियोली में फैल जाते हैं, और किसी भी रूप के चिकित्सीय कण म्यूकोसिलरी परिवहन द्वारा तेजी से साफ हो जाते हैं। वायुमार्ग में जीन वाहकों के निवास समय को बढ़ाना महत्वपूर्ण है लेकिन इसे हासिल करना मुश्किल है। जीन वाहक-संयुग्मित चुंबकीय कण जिन्हें वायुमार्ग की सतह पर निर्देशित किया जा सकता है, क्षेत्रीय लक्ष्यीकरण में सुधार कर सकते हैं। इन विवो विज़ुअलाइज़ेशन की चुनौतियों के कारण, लागू चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में वायुमार्ग की सतह पर ऐसे छोटे चुंबकीय कणों का व्यवहार कम समझा जाता है। इस अध्ययन का उद्देश्य एनेस्थेटाइज्ड चूहों के ट्रेकिआ में चुंबकीय कणों की एक श्रृंखला की इन विवो गति को देखने के लिए सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग का उपयोग करना था ताकि इन विवो में व्यक्तिगत और थोक कण व्यवहार की गतिशीलता और पैटर्न की जांच की जा सके। चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में चुंबकीय कण चूहे की श्वासनली में पारगमन क्षमता को बढ़ाएंगे। सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे इमेजिंग से इन विट्रो और इन विवो में स्थिर और गतिशील चुंबकीय क्षेत्रों में चुंबकीय कणों के व्यवहार का पता चलता है। कणों को चुंबकों के साथ जीवित वायुमार्ग की सतह पर आसानी से नहीं खींचा जा सकता है, लेकिन परिवहन के दौरान, जमाव दृष्टि के क्षेत्र में केंद्रित होते हैं जहां चुंबकीय क्षेत्र सबसे मजबूत होता है। जब चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में लेंटिवायरल चुंबकीय कणों को वितरित किया गया तो पारगमन क्षमता भी छह गुना बढ़ गई। साथ में, ये परिणाम बताते हैं कि लेंटिवायरल चुंबकीय कण और चुंबकीय क्षेत्र जीन वेक्टर लक्ष्यीकरण में सुधार करने और इन विवो में संचालन वायुमार्ग में पारगमन के स्तर को बढ़ाने के लिए मूल्यवान दृष्टिकोण हो सकते हैं।
सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) सीएफ ट्रांसमेम्ब्रेन कंडक्टेंस रेगुलेटर (सीएफटीआर) नामक एक जीन में भिन्नता के कारण होता है। सीएफटीआर प्रोटीन एक आयन चैनल है जो पूरे शरीर में कई उपकला कोशिकाओं में मौजूद होता है, जिसमें संवाहक वायुमार्ग भी शामिल है, जो सीएफ रोगजनन का एक प्रमुख स्थल है। सीएफटीआर दोष असामान्य जल परिवहन की ओर ले जाता है, वायुमार्ग की सतह को निर्जलित करता है और वायुमार्ग की सतह तरल (एएसएल) परत की गहराई को कम करता है। यह श्वसन पथ से अंदर जाने वाले कणों और रोगजनकों को साफ करने के लिए म्यूकोसिलरी ट्रांसपोर्ट (एमसीटी) प्रणाली की क्षमता को भी बाधित करता है। हमारा लक्ष्य सीएफटीआर जीन की सही प्रतिलिपि प्रदान करने और एएसएल, एमसीटी और फेफड़ों के स्वास्थ्य में सुधार करने के लिए एक लेंटिवायरल (एलवी) जीन थेरेपी विकसित करना है,
LV वेक्टर CF वायुमार्ग जीन थेरेपी के लिए अग्रणी उम्मीदवारों में से एक हैं, मुख्यतः इसलिए क्योंकि वे वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं (वायुमार्ग स्टेम कोशिकाओं) में चिकित्सीय जीन को स्थायी रूप से एकीकृत कर सकते हैं। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि वे कार्यात्मक जीन-सही CF-संबंधित वायुमार्ग सतह कोशिकाओं में विभेदित करके सामान्य जलयोजन और बलगम निकासी को बहाल कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप आजीवन लाभ होता है। LV वेक्टर को संवाहक वायुमार्ग के विरुद्ध निर्देशित किया जाना चाहिए, क्योंकि यहीं से CF फेफड़ों की बीमारी शुरू होती है। वेक्टर को फेफड़ों में गहराई तक पहुंचाने से एल्वियोलर ट्रांसडक्शन हो सकता है, लेकिन CF में इसका कोई चिकित्सीय लाभ नहीं है। हालाँकि, जीन वाहक जैसे तरल पदार्थ डिलीवरी3,4 के बाद प्रेरणा पर स्वाभाविक रूप से एल्वियोली में चले जाते हैं और चिकित्सीय कण MCT द्वारा मौखिक गुहा में तेज़ी से साफ़ हो जाते हैं। LV ट्रांसडक्शन दक्षता सीधे उस समय की लंबाई से संबंधित होती है, जब वेक्टर सेलुलर अपटेक की अनुमति देने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के बगल में रहता है - "निवास समय"5 - जिसे विशिष्ट क्षेत्रीय वायुप्रवाह के साथ-साथ समन्वित कण बलगम कैप्चर और MCT द्वारा आसानी से कम किया जा सकता है। CF के लिए, इस क्षेत्र में उच्च स्तर के पारगमन को प्राप्त करने के लिए वायुमार्ग के भीतर एल.वी. के निवास समय को लम्बा करना महत्वपूर्ण है, लेकिन अब तक यह चुनौतीपूर्ण रहा है।
इस बाधा को दूर करने के लिए, हम सुझाव देते हैं कि एल.वी. चुंबकीय कण (एम.पी.) दो पूरक तरीकों से मदद कर सकते हैं। सबसे पहले, उन्हें लक्ष्यीकरण में सुधार करने और जीन वाहक कणों को वांछित वायुमार्ग क्षेत्र में रहने में मदद करने के लिए वायुमार्ग की सतह पर चुंबकीय रूप से निर्देशित किया जा सकता है; और ए.एस.एल.) को कोशिका परत 6 में जाने में मदद करता है। एम.पी. का व्यापक रूप से लक्षित दवा वितरण वाहनों के रूप में उपयोग किया जाता है, जब वे एंटीबॉडी, कीमोथेरेपीटिक दवाओं, या अन्य छोटे अणुओं से बंधते हैं जो कोशिका झिल्ली से जुड़ते हैं या प्रासंगिक कोशिका सतह रिसेप्टर्स से बंधते हैं और स्थैतिक बिजली की उपस्थिति में ट्यूमर स्थलों पर जमा होते हैं। कैंसर उपचार के लिए चुंबकीय क्षेत्र 7. अन्य "हाइपरथर्मल" तकनीकों का उद्देश्य एमपी को गर्म करना है जब वे दोलनशील चुंबकीय क्षेत्रों के संपर्क में आते हैं, जिससे ट्यूमर कोशिकाएं नष्ट हो जाती हैं। चुंबकीय संक्रमण का सिद्धांत, जिसमें एक चुंबकीय क्षेत्र को कोशिकाओं में डीएनए के हस्तांतरण को बढ़ाने के लिए एक संक्रमण एजेंट के रूप में उपयोग किया जाता है, आमतौर पर मुश्किल-से-संचारित सेल लाइनों के लिए गैर-वायरल और वायरल जीन वैक्टर की एक श्रृंखला का उपयोग करके इन विट्रो में उपयोग किया जाता है। एलवी मैग्नेटोट्रांसफेक्शन की प्रभावशीलता स्थापित की गई है, एक स्थिर चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में मानव ब्रोन्कियल उपकला सेल लाइन में एलवी-एमपी की इन विट्रो डिलीवरी के साथ, अकेले एलवी वेक्टर की तुलना में 186 गुना अधिक संक्रमण दक्षता बढ़ जाती है। एलवी-एमपी को इन विट्रो सीएफ मॉडल में भी लागू किया गया है, जहां चुंबकीय संक्रमण ने सीएफ थूक की उपस्थिति में वायु-तरल इंटरफेस संस्कृतियों में एलवी संक्रमण को 20 गुना बढ़ा दिया कुछ पशु अध्ययनों में मूल्यांकन किया गया है11,12,13,14,15, विशेष रूप से फेफड़ों में16,17। फिर भी, सीएफ फेफड़ों की चिकित्सा में चुंबकीय संक्रमण के अवसर स्पष्ट हैं। टैन एट अल। (2020) ने कहा कि "कुशल चुंबकीय नैनोकण फुफ्फुसीय वितरण का एक प्रमाण-अवधारणा अध्ययन सीएफ रोगियों में नैदानिक ​​​​परिणामों को बेहतर बनाने के लिए भविष्य की सीएफटीआर साँस लेना रणनीतियों का मार्ग प्रशस्त करेगा"6।
लागू चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में वायुमार्ग की सतहों पर छोटे चुंबकीय कणों के व्यवहार को कल्पना करना और अध्ययन करना मुश्किल है, और इसलिए इसे ठीक से समझा नहीं जा सका है। अन्य अध्ययनों में, हमने एएसएल गहराई18 और एमसीटी व्यवहार19,20 में इन विवो परिवर्तनों को गैर-आक्रामक रूप से देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सिंक्रोट्रॉन-प्रसार-आधारित चरण-विपरीत एक्स-रे इमेजिंग (पीबी-पीसीएक्सआई) विधि विकसित की है ताकि गैस कैनाल सतह हाइड्रेशन को सीधे मापा जा सके और उपचार प्रभावकारिता के प्रारंभिक संकेतक के रूप में उपयोग किया जा सके। इसके अलावा, हमारी एमसीटी मूल्यांकन विधि पीबी-पीसीएक्सआई21 का उपयोग करके दृश्यमान एमसीटी मार्कर के रूप में एल्यूमिना या उच्च अपवर्तक सूचकांक ग्लास से बने 10-35 माइक्रोन व्यास के कणों का उपयोग करती है।
इसके उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के कारण, हमारे पीबी-पीसीएक्सआई-आधारित एएसएल और एमसीटी विश्लेषण तकनीकें एमपी जीन डिलीवरी तकनीकों को समझने और अनुकूलित करने में हमारी मदद करने के लिए विवो में एकल और थोक कण व्यवहार की गतिशीलता और पैटर्न की जांच करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। यहां हम जो दृष्टिकोण अपनाते हैं वह एसपीआरिंग -8 बीएल 20 बी 2 बीमलाइन का उपयोग करके हमारे अध्ययनों से निकलता है, जिसमें हमने चूहों के नाक और फुफ्फुसीय वायुमार्ग में शम वेक्टर खुराक वितरण के बाद द्रव आंदोलन को देखा, ताकि हमारे जीन वाहक खुराक पशु अध्ययन 3,4 में देखे गए गैर-समान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को समझने में मदद मिल सके।
इस अध्ययन का उद्देश्य जीवित चूहों के श्वासनली में एमपीएस की एक श्रृंखला की इन विवो गतिविधियों को देखने के लिए सिंक्रोट्रॉन पीबी-पीसीएक्सआई का उपयोग करना था। इन पीबी-पीसीएक्सआई इमेजिंग अध्ययनों को एमपी की एक श्रृंखला, चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और स्थानों का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था ताकि एमपी की गति पर उनका प्रभाव निर्धारित किया जा सके। हमने परिकल्पना की कि बाहरी रूप से लगाया गया चुंबकीय क्षेत्र वितरित एमपी को लक्ष्य क्षेत्र में रहने या जाने में मदद करेगा। इन अध्ययनों से हम चुंबक विन्यास की पहचान भी कर पाए जो जमा होने के बाद श्वासनली में बनाए गए कणों की संख्या को अधिकतम करता है। अध्ययनों की एक दूसरी श्रृंखला में, हमने इस इष्टतम विन्यास का उपयोग चूहे के वायुमार्ग में एलवी-एमपी की इन विवो डिलीवरी से उत्पन्न पारगमन पैटर्न को प्रदर्शित करने के लिए किया
सभी पशु अध्ययन एडिलेड विश्वविद्यालय (एम-2019-060 और एम-2020-022) और स्प्रिंग-8 सिंक्रोट्रॉन पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे। प्रयोग ARRIVE दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।
सभी एक्स-रे इमेजिंग जापान में SPring-8 सिंक्रोट्रॉन में BL20XU बीमलाइन पर की गई थी, जो पहले वर्णित 21,22 के समान सेटअप का उपयोग कर रही थी। संक्षेप में, प्रायोगिक बॉक्स सिंक्रोट्रॉन स्टोरेज रिंग से 245 मीटर की दूरी पर स्थित था। चरण विपरीत प्रभाव उत्पन्न करने के लिए कण इमेजिंग अध्ययन के लिए 0.6 मीटर की सैंपल-टू-डिटेक्टर दूरी और इन विवो इमेजिंग अध्ययन के लिए 0.3 मीटर का उपयोग किया जाता है। 25 keV की एक मोनोक्रोमैटिक बीम ऊर्जा का उपयोग किया गया था। छवियों को एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे कनवर्टर (SPring-8 BM3) का उपयोग करके कैप्चर किया गया था, जो एक sCMOS डिटेक्टर से जुड़ा हुआ था। कनवर्टर 10 µm मोटे सिंटिलेटर (Gd3Al2Ga3O12) का उपयोग करके एक्स-रे को दृश्य प्रकाश में परिवर्तित करता है, जिसे फिर × 10 माइक्रोस्कोप ऑब्जेक्टिव (NA 0.3) का उपयोग करके sCMOS सेंसर में निर्देशित किया जाता है। sCMOS डिटेक्टर Orca-Flash4.0 था (हमामात्सू फोटोनिक्स, जापान) 2048 × 2048 पिक्सल के सरणी आकार और 6.5 × 6.5 µm के कच्चे पिक्सेल आकार के साथ। यह सेटअप 0.51 µm का एक प्रभावी आइसोट्रोपिक पिक्सेल आकार और लगभग 1.1 मिमी × 1.1 मिमी का दृश्य क्षेत्र प्रदान करता है। श्वास-प्रेरित गति कलाकृतियों को न्यूनतम करते हुए वायुमार्ग के अंदर और बाहर चुंबकीय कणों के संकेत-से-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए 100 एमएस की एक्सपोजर लंबाई चुनी गई थी। इन विवो अध्ययनों के लिए, एक्सपोजर के बीच एक्स-रे किरण को अवरुद्ध करके विकिरण खुराक को सीमित करने के लिए एक्स-रे पथ में एक तेज एक्स-रे शटर रखा गया था।
एलवी वाहक का उपयोग किसी भी स्प्रिंग-8 पीबी-पीसीएक्सआई इमेजिंग अध्ययन में नहीं किया गया था क्योंकि बीएल20एक्सयू इमेजिंग कक्ष जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रमाणित नहीं है। इसके बजाय, हमने दो वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से अच्छी तरह से विशेषता वाले एमपी की एक श्रृंखला का चयन किया - जो आकार, सामग्री, लौह सांद्रता और अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला को कवर करते हैं - पहले यह समझने के लिए कि चुंबकीय क्षेत्र ग्लास केशिकाओं के भीतर एमपी गति को कैसे प्रभावित करते हैं, और फिर जीवित वायुमार्ग में। सतह पर। एमपीएस का आकार 0.25 से 18 माइक्रोन तक होता है और विभिन्न सामग्रियों से बना होता है (तालिका 1 देखें), लेकिन प्रत्येक नमूने की संरचना, एमपी के भीतर चुंबकीय कणों के आकार सहित, अज्ञात है। हमारे व्यापक एमसीटी अध्ययन 19, 20, 21, 23, 24 के आधार पर, हम उम्मीद करते हैं कि 5 माइक्रोन जितने छोटे एमपी को ट्रेकियल वायुमार्ग की सतह पर देखा जा सकता है, उदाहरण के लिए एमपी की गति की बढ़ी हुई दृश्यता देखने के लिए लगातार फ़्रेम घटाकर। एक 0.25 माइक्रोन आकार का एमपी इमेजिंग डिवाइस के रिज़ॉल्यूशन से छोटा होता है, लेकिन पीबी-पीसीएक्सआई से उनके वॉल्यूम कंट्रास्ट और सतह तरल पदार्थ की गति का पता लगाने की उम्मीद की जाती है,
तालिका 1 में प्रत्येक एमपी के लिए नमूने 20 μl ग्लास केशिकाओं (ड्रमंड माइक्रोकैप्स, पीए, यूएसए) में 0.63 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ तैयार किए गए थे। कॉर्पस्क्यूलर कण पानी में उपलब्ध हैं, जबकि कॉम्बीमैग कण निर्माता के स्वामित्व वाले तरल पदार्थ में उपलब्ध हैं। प्रत्येक ट्यूब तरल (लगभग 11 μl) से आधा भरा हुआ है और नमूना धारक पर रखा गया है (चित्र 1 देखें)। ग्लास केशिकाओं को क्रमशः इमेजिंग बॉक्स में नमूना चरण पर क्षैतिज रूप से रखा गया था, और तरल पदार्थ के किनारों को स्थित किया गया था। 1.17 टेस्ला के अवशिष्ट चुंबकत्व के साथ 19 मिमी व्यास (28 मिमी लंबा) निकल खोल दुर्लभ पृथ्वी नियोडिमियम आयरन बोरॉन (एनडीएफईबी) चुंबक (एन 35, नमूने पर चित्र बनाए जाते हैं, तथा प्रति सेकंड 4 फ्रेम की दर से चित्र प्राप्त किए जाते हैं। चित्र बनाने के दौरान, चुम्बक को कांच की केशिका ट्यूब के करीब (लगभग 1 मिमी दूर) लाया जाता है, तथा फिर क्षेत्र की शक्ति और स्थिति के प्रभावों का आकलन करने के लिए ट्यूब के साथ-साथ स्थानांतरित किया जाता है।
नमूना xy अनुवाद चरण पर ग्लास केशिकाओं में एमपी नमूने युक्त इन विट्रो इमेजिंग सेटअप। एक्स-रे बीम का पथ लाल धराशायी रेखा के साथ चिह्नित है।
एक बार जब एमपीएस की इन विट्रो दृश्यता स्थापित हो गई, तो उनमें से एक उपसमूह का परीक्षण जंगली-प्रकार की मादा एल्बिनो विस्टार चूहों (~12 सप्ताह की उम्र, ~200 ग्राम) में विवो में किया गया। 0.24 मिलीग्राम/किलोग्राम मेडेटोमिडाइन (डोमिटर®, ज़ेनोआक, जापान), 3.2 मिलीग्राम/किलोग्राम मिडज़ोलम (डोरमिकम®, एस्टेलास फार्मा, जापान) और 4 मिलीग्राम/किलोग्राम ब्यूटोरफेनॉल (वेटोरफेल®, मीजी सेका) चूहों को फार्मा), जापान) के मिश्रण से इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बेहोश किया गया। संज्ञाहरण के बाद, उन्हें श्वासनली के चारों ओर के फर को हटाकर, एक एंडोट्रैचियल ट्यूब (ईटी; 16 Ga iv कैनुला, टेरुमो बीसीटी) डालकर और शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए थर्मल बैग युक्त एक कस्टम-निर्मित इमेजिंग प्लेट पर पीठ के बल स्थिर करके इमेजिंग के लिए तैयार किया गया। एक्स-रे छवि में श्वासनली को क्षैतिज रूप से संरेखित करने के लिए कोण का उपयोग करें, जैसा कि चित्र 2a में दिखाया गया है।
(ए) स्प्रिंग-8 इमेजिंग बॉक्स में इन विवो इमेजिंग सेटअप में, एक्स-रे किरण के पथ को लाल धराशायी रेखा से चिह्नित किया गया है। (बी, सी) श्वासनली पर चुंबक का स्थानीयकरण दो ऑर्थोगोनली माउंटेड आईपी कैमरों का उपयोग करके दूर से किया गया था। स्क्रीन छवि के बाईं ओर, सिर को पकड़े हुए वायर लूप को देखा जा सकता है, और ईटी ट्यूब के भीतर डिलीवरी कैनुला को जगह में रखा गया है।
एक 100 μl ग्लास सिरिंज का उपयोग कर एक रिमोट-नियंत्रित सिरिंज पंप सिस्टम (UMP2, वर्ल्ड प्रिसिजन इंस्ट्रूमेंट्स, सारासोटा, FL) को 30 Ga सुई के माध्यम से PE10 ट्यूबिंग (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) से जोड़ा गया था। ET ट्यूब डालते समय यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को चिह्नित करें कि टिप श्वासनली में सही स्थिति में है। माइक्रोपंप का उपयोग करते हुए, सिरिंज प्लंजर को वापस ले लिया गया, जबकि ट्यूब की नोक को वितरित किए जाने वाले MP नमूने में डुबोया गया था। फिर भरी हुई डिलीवरी ट्यूब को एंडोट्रैचियल ट्यूब में डाला गया, जिससे टिप हमारे अपेक्षित लागू चुंबकीय क्षेत्र के सबसे मजबूत हिस्से में आ गई (पैनासोनिक बीबी-एससी382) को एक दूसरे से लगभग 90 डिग्री पर रखा गया था और इमेजिंग के दौरान श्वासनली के सापेक्ष चुंबक की स्थिति की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्र 2 बी, सी)। गति कलाकृतियों को कम करने के लिए, अंत-ज्वारीय प्रवाह पठार के दौरान प्रति सांस एक छवि प्राप्त की गई थी।
एक चुंबक दूसरे चरण से जुड़ा होता है जिसे इमेजिंग हाउसिंग के बाहर से दूर से स्थित किया जा सकता है। विभिन्न चुंबक स्थितियों और विन्यासों का परीक्षण किया गया, जिनमें शामिल हैं: श्वासनली के ऊपर लगभग 30° के कोण पर स्थापित (विन्यास चित्र 2a और 3a में दिखाए गए हैं); एक चुंबक पशु के ऊपर और दूसरा नीचे, ध्रुवों को आकर्षित करने के लिए सेट किया गया है (चित्र 3b); एक चुंबक पशु के ऊपर और दूसरा नीचे, ध्रुवों को पीछे हटाने के लिए सेट किया गया है (चित्र 3c); और एक चुंबक श्वासनली के ऊपर और लंबवत (चित्र 3d)। एक बार जब पशु और चुंबक को कॉन्फ़िगर कर दिया जाता है और परीक्षण किए जाने वाले एमपी को सिरिंज पंप में लोड किया जाता है, तो चित्र प्राप्त करते समय 4 μl/सेकंड की दर से 50 μl खुराक दें।
विवो इमेजिंग के लिए चुंबक विन्यास (ए) लगभग 30 डिग्री के कोण पर श्वासनली के ऊपर एक चुंबक, (बी) आकर्षित करने के लिए सेट दो चुंबक, (सी) प्रतिकर्षित करने के लिए सेट दो चुंबक, (डी) श्वासनली के ऊपर और लंबवत एक चुंबक। पर्यवेक्षक ने श्वासनली के माध्यम से मुंह से फेफड़ों तक नीचे देखा, और एक्स-रे किरण चूहे के बाईं ओर से गुजरी और दाईं ओर से बाहर निकल गई। चुंबक को या तो वायुमार्ग की लंबाई के साथ या एक्स-रे किरण की दिशा में श्वासनली के ऊपर बाएं और दाएं घुमाया जाता है।
हमने सांस लेने और हृदय की गति की अनुपस्थिति में वायुमार्ग में कणों की दृश्यता और व्यवहार को निर्धारित करने की भी कोशिश की। इसलिए, इमेजिंग अवधि के अंत में, जानवरों को पेंटोबार्बिटल ओवरडोज (सोम्नोपेंटिल, पिटमैन-मूर, वाशिंगटन क्रॉसिंग, यूएसए; ~ 65 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) के लिए मानवीय रूप से मार दिया गया। कुछ जानवरों को इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर छोड़ दिया गया, और एक बार सांस लेने और दिल की धड़कन बंद हो जाने पर, इमेजिंग प्रक्रिया को दोहराया गया, यदि वायुमार्ग की सतह पर कोई एमपी दिखाई नहीं दे रहा था, तो एमपी की एक अतिरिक्त खुराक जोड़ दी गई।
प्राप्त छवियों को फ्लैट-फील्ड और डार्क-फील्ड में सुधारा गया और फिर MATLAB (R2020a, द मैथवर्क्स) में लिखी गई एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग करके एक मूवी (20 फ्रेम प्रति सेकंड; श्वसन दर के आधार पर 15-25 × सामान्य गति) में जोड़ा गया।
सभी LV जीन वेक्टर डिलीवरी अध्ययन एडिलेड विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु अनुसंधान सुविधा में आयोजित किए गए थे और इसका उद्देश्य SPring-8 प्रयोग के परिणामों का उपयोग यह आकलन करने के लिए करना था कि क्या चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में LV-MP डिलीवरी विवो में जीन स्थानांतरण को बढ़ा सकती है। MP और चुंबकीय क्षेत्र के प्रभावों का आकलन करने के लिए, जानवरों के दो समूहों का इलाज किया गया: एक समूह को चुंबक के साथ LV-MP दिया गया, और दूसरे समूह को चुंबक के बिना LV-MP वाला नियंत्रण समूह दिया गया।
LV जीन वेक्टर पहले से वर्णित विधियों 25, 26 का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। LacZ वेक्टर, संघटक MPSV प्रमोटर (LV-LacZ) द्वारा संचालित परमाणु-स्थानीयकृत बीटा-गैलेक्टोसिडेस जीन को व्यक्त करता है, जो संचरित कोशिकाओं में एक नीला प्रतिक्रिया उत्पाद उत्पन्न करता है, जो फेफड़े के ऊतक मोर्चों और ऊतक खंडों में दिखाई देता है। TU/ml में टिटर की गणना करने के लिए हीमोसाइटोमीटर के साथ LacZ पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को मैन्युअल रूप से गिनकर सेल संस्कृतियों में अनुमापन किया गया था। वाहकों को -80 °C पर क्रायोप्रिजर्व किया जाता है, उपयोग से पहले पिघलाया जाता है, और 1:1 अनुपात में मिश्रण करके और डिलीवरी से कम से कम 30 मिनट पहले बर्फ पर इनक्यूबेट करके कॉम्बीमैग से बांध दिया जाता है।
सामान्य स्प्रैग डॉली चूहों (n = 3/समूह, ~2-3 को 0.4 मिलीग्राम/किलोग्राम मेडेटोमिडाइन (डोमिटर, इलियम, ऑस्ट्रेलिया) और 60 मिलीग्राम/किलोग्राम केटामाइन (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) के मिश्रण के साथ अंतःस्रावी रूप से एनेस्थेटाइज किया गया था। महीने पुराना) आईपी) इंजेक्शन और 16 Ga iv कैनुला के साथ गैर-सर्जिकल मौखिक कैनुलेशन। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ट्रैकियल वायुमार्ग ऊतक LV ट्रांसडक्शन प्राप्त करता है, इसे हमारे पहले वर्णित यांत्रिक गड़बड़ी प्रोटोकॉल का उपयोग करके कंडीशन किया गया था, जिसमें ट्रैकियल वायुमार्ग की सतह को एक तार की टोकरी (एन-सर्किल, नीटिनॉल टिपलेस स्टोन एक्सट्रैक्टर NTSE-022115) -UDH, कुक मेडिकल, USA) 30 s28 के साथ अक्षीय रूप से रगड़ा गया था। एलवी-एमपी का ट्रैकियल प्रशासन तब एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में गड़बड़ी के लगभग 10 मिनट बाद किया गया था।
इस प्रयोग में प्रयुक्त चुंबकीय क्षेत्र को इन विवो एक्स-रे इमेजिंग अध्ययन के समान तरीके से कॉन्फ़िगर किया गया था, जिसमें डिस्टिलेशन स्टेंट क्लिप (चित्रा 4) का उपयोग करके श्वासनली के ऊपर समान चुंबक रखे गए थे। एलवी-एमपी की 50 μl मात्रा (2 × 25 μl एलिक्वॉट्स) को पहले बताए अनुसार जेल टिप वाले पिपेट का उपयोग करके श्वासनली (n = 3 जानवर) में पहुंचाया गया था। एक नियंत्रण समूह (n = 3 जानवर) ने चुंबक का उपयोग किए बिना समान एलवी-एमपी प्राप्त किए। जलसेक पूरा होने के बाद, प्रवेशनी को ईटी ट्यूब से हटा दिया जाता है और जानवर को एक्सट्यूबेट किया जाता है। चुंबक 10 मिनट तक अपनी जगह पर रहता है, फिर इसे हटा दिया जाता है। एनेस्थीसिया से पूरी तरह ठीक होने तक उन्हें गर्म रखा गया और निगरानी में रखा गया।
जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एलवी-एमपी डिलीवरी डिवाइस। ईटी ट्यूब का हल्का ग्रे ल्यूअर हब मुंह से बाहर निकलता हुआ देखा जा सकता है और चित्र में दिखाए गए पिपेट की जेल टिप को ईटी ट्यूब के माध्यम से श्वासनली में वांछित गहराई तक डाला जाता है।
एलवी-एमपी खुराक प्रक्रिया के एक सप्ताह बाद, जानवरों को 100% सीओ2 श्वास द्वारा मानवीय रूप से मार दिया गया और हमारे मानक एक्स-गैल उपचार का उपयोग करके लैकजेड अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया गया। यह सुनिश्चित करने के लिए कि एंडोट्रैचियल ट्यूब प्लेसमेंट से कोई यांत्रिक क्षति या द्रव प्रतिधारण विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया था, तीन दुम के सबसे उपास्थि के छल्ले हटा दिए गए थे। विश्लेषण के लिए दो हिस्सों को बनाने के लिए प्रत्येक ट्रेकिआ को अनुदैर्ध्य रूप से काटा गया था, और उन्हें ल्यूमिनल सतह को देखने के लिए मिनुटियन सुई (फाइन साइंस टूल्स) का उपयोग करके सिलिकॉन रबर (सिलगार्ड, डॉव इंक) वाले डिश में रखा गया था। डिजिलाइट कैमरा और टीकैप्चर सॉफ्टवेयर (टक्सन फोटोनिक्स, चीन) के साथ निकॉन माइक्रोस्कोप (एसएमजेड1500) का उपयोग करके छवि "सिलाई" की अनुमति देने के लिए प्रत्येक छवि के बीच पर्याप्त ओवरलैप। फिर प्रत्येक श्वासनली से छवियों को एक प्लानर मोशन एल्गोरिदम का उपयोग करके इमेज कंपोजिट एडिटर v2.0.3 (माइक्रोसॉफ्ट रिसर्च) का उपयोग करके एक एकल समग्र छवि में इकट्ठा किया गया था। प्रत्येक जानवर से श्वासनली की समग्र छवियों में lacZ अभिव्यक्ति क्षेत्रों को एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके पहले वर्णित अनुसार मात्रा निर्धारित किया गया था, 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, और Value < 0.7 की सेटिंग्स का उपयोग करके। ऊतक के आकृति का पता लगाने के द्वारा, ऊतक क्षेत्र की पहचान करने और श्वासनली के ऊतक के बाहर से किसी भी गलत पहचान को रोकने के लिए प्रत्येक समग्र छवि के लिए GIMP v2.10.24 में मैन्युअल रूप से एक मुखौटा तैयार किया गया था।
प्रत्येक श्वासनली को पैराफिन में दबा दिया गया था और 5 μm के टुकड़े काट दिए गए थे। टुकड़ों को 5 मिनट के लिए तटस्थ तेज लाल रंग से रंगा गया था और निकॉन एक्लिप्स E400 माइक्रोस्कोप, DS-Fi3 कैमरा और NIS एलिमेंट कैप्चर सॉफ्टवेयर (संस्करण 5.20.00) का उपयोग करके छवियां प्राप्त की गई थीं।
सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म v9 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, इंक.) में किए गए थे। सांख्यिकीय महत्व को p ≤ 0.05 पर सेट किया गया था। शापिरो-विल्क परीक्षण का उपयोग करके सामान्यता को सत्यापित किया गया था, और लैकज़ेड धुंधलापन में अंतर का मूल्यांकन अयुग्मित टी-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था।
तालिका 1 में वर्णित छह एमपी की जांच पीसीएक्सआई का उपयोग करके की गई थी, और दृश्यता तालिका 2 में वर्णित है। दो पॉलीस्टाइरीन एमपी (एमपी1 और एमपी2; क्रमशः 18 माइक्रोन और 0.25 माइक्रोन) पीसीएक्सआई के तहत दिखाई नहीं दे रहे थे, लेकिन शेष नमूने पहचाने जा सकते थे (उदाहरण चित्र 5 में दिखाए गए हैं)। एमपी3 और एमपी4 (क्रमशः 10-15% Fe3O4; 0.25 माइक्रोन और 0.9 माइक्रोन) हल्के से दिखाई दे रहे हैं। हालांकि परीक्षण किए गए सबसे छोटे कणों में से कुछ शामिल हैं, एमपी5 (98% Fe3O4; 0.25 माइक्रोन) सबसे स्पष्ट था। कॉम्बीमैग उत्पाद एमपी6 को पहचानना मुश्किल है। सभी मामलों में, केशिका के समानांतर चुंबक को आगे और पीछे स्थानांतरित करके एमपी का पता लगाने की हमारी क्षमता काफी बढ़ गई थी बढ़ गया, कणों के तार छोटे हो गए क्योंकि कण केशिका की ऊपरी सतह की ओर चले गए (पूरक वीडियो एस 1: एमपी 4 देखें), सतह की कण घनत्व में वृद्धि हुई। इसके विपरीत, जब चुंबक केशिका से हटा दिया जाता है, तो क्षेत्र की ताकत कम हो जाती है और एमपी केशिका की ऊपरी सतह से विस्तारित लंबी तारों में पुनर्व्यवस्थित होते हैं (पूरक वीडियो एस 2: एमपी 4 देखें)। चुंबक के हिलना बंद करने के बाद, कण संतुलन की स्थिति में पहुंचने के बाद थोड़े समय के लिए हिलना जारी रखते हैं। जैसे ही एमपी केशिका की ऊपरी सतह की ओर और उससे दूर जाता है, चुंबकीय कण आमतौर पर मलबे को तरल पदार्थ के माध्यम से खींचते हैं।
पीसीएक्सआई के तहत एमपी की दृश्यता नमूनों के बीच काफी भिन्न होती है। (ए) एमपी 3, (बी) एमपी 4, (सी) एमपी 5 और (डी) एमपी 6। यहां दिखाए गए सभी चित्र केशिकाओं के लगभग 10 मिमी ऊपर स्थित एक चुंबक के साथ लिए गए थे। स्पष्ट बड़े वृत्त केशिकाओं में फंसे हवा के बुलबुले हैं, जो स्पष्ट रूप से चरण विपरीत इमेजिंग के काले और सफेद किनारे की विशेषताओं को दिखाते हैं। लाल बॉक्स में विपरीत-बढ़ाने वाला आवर्धन होता है। ध्यान दें कि सभी आंकड़ों में चुंबक योजनाबद्ध के व्यास पैमाने पर नहीं हैं और दिखाए गए से लगभग 100 गुना बड़े हैं।
जैसे ही चुंबक केशिका के शीर्ष के साथ बाएं और दाएं स्थानांतरित होता है, एमपी स्ट्रिंग का कोण चुंबक के साथ संरेखित करने के लिए बदल जाता है (चित्र 6 देखें), इस प्रकार चुंबकीय क्षेत्र रेखाओं को चित्रित करता है। एमपी 3-5 के लिए, कॉर्ड के एक सीमा कोण पर पहुंचने के बाद, कणों को केशिका की ऊपरी सतह के साथ खींचा जाता है। यह अक्सर एमपी को बड़े समूहों में समूहीकृत करने के परिणामस्वरूप होता है जहां चुंबकीय क्षेत्र सबसे मजबूत होता है (पूरक वीडियो एस 3: एमपी 5 देखें)। यह विशेष रूप से तब भी स्पष्ट होता है जब केशिका के अंत के करीब इमेजिंग की जाती है, जो एमपी को द्रव-वायु इंटरफेस पर एकत्रित और केंद्रित करने का कारण बनता है। एमपी 6 में कण, जो एमपी 3-5 की तुलना में पहचानना अधिक कठिन थे, चुंबक के केशिका के साथ आगे बढ़ने पर खींचे नहीं गए थे, लेकिन एमपी स्ट्रिंग अलग हो गए, जिससे कण दृश्य के क्षेत्र में रह गए (पूरक वीडियो एस 4: एमपी 6 देखें)। वीडियो एस5: एमपी3).
एमपी स्ट्रिंग का कोण बदल जाता है क्योंकि चुंबक केशिका के ऊपर दाईं ओर स्थानांतरित होता है। (ए) एमपी 3, (बी) एमपी 4, (सी) एमपी 5 और (डी) एमपी 6। लाल बॉक्स में कंट्रास्ट बढ़ाने वाला आवर्धन होता है। ध्यान दें कि पूरक वीडियो जानकारीपूर्ण हैं क्योंकि वे महत्वपूर्ण कण संरचना और गतिशील जानकारी प्रकट करते हैं जिन्हें इन स्थिर छवियों में नहीं देखा जा सकता है।
हमारे परीक्षणों से पता चला है कि चुंबक को श्वासनली के साथ धीरे-धीरे आगे-पीछे करने से इन विवो में जटिल गति के संदर्भ में एमपी को देखने में सुविधा होती है। इन विवो परीक्षण नहीं किया गया क्योंकि केशिका में पॉलीस्टाइनिन मोती (एमपी 1 और एमपी 2) दिखाई नहीं दे रहे थे। शेष चार एमपी में से प्रत्येक का परीक्षण इन विवो में चुंबक की लंबी धुरी के साथ श्वासनली के ऊपर लगभग 30 डिग्री के कोण पर लंबवत रूप से किया गया था (चित्र 2 बी और 3 ए देखें), क्योंकि इसके परिणामस्वरूप लंबी एमपी श्रृंखलाएं हुईं और यह समाप्त चुंबक विन्यास की तुलना में अधिक प्रभावी था। एमपी 3, एमपी 4 और एमपी 6 किसी भी जीवित जानवरों के श्वासनली में नहीं पाए गए। जब ​​जानवरों को मानवीय तरीके से मारने के बाद चूहे के वायुमार्ग की छवि बनाई गई,
एमपी डिलीवरी के दौरान चुंबक को श्वासनली के ऊपर रखने से कई, लेकिन सभी नहीं, एमपी दृश्य क्षेत्र में केंद्रित हो गए। श्वासनली में प्रवेश करने वाले कणों को मानवीय रूप से बलि दिए गए जानवरों में सबसे अच्छा देखा जाता है। चित्र 7 और पूरक वीडियो एस 6: एमपी 5 उदर श्वासनली की सतह पर कणों के तेजी से चुंबकीय कैप्चर और संरेखण को दर्शाता है, यह दर्शाता है कि एमपी को श्वासनली के वांछित क्षेत्रों में निर्देशित किया जा सकता है। एमपी डिलीवरी के बाद श्वासनली के साथ अधिक दूर तक खोज करने पर, कुछ एमपी कैरिना के करीब पाए गए, यह सुझाव देते हुए कि चुंबकीय क्षेत्र की ताकत सभी एमपी को इकट्ठा करने और बनाए रखने के लिए अपर्याप्त थी, क्योंकि उन्हें द्रव प्रक्रिया के दौरान अधिकतम चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के क्षेत्र से वितरित किया गया था।
हाल ही में इच्छामृत्यु दिए गए चूहे के श्वासनली में एमपी5 की डिलीवरी से पहले (ए) और बाद में (बी) छवियां, जिसमें चुंबक इमेजिंग क्षेत्र के ठीक ऊपर स्थित है। चित्रित क्षेत्र दो उपास्थि के छल्लों के बीच स्थित है। एमपी डिलीवरी से पहले, वायुमार्ग में कुछ तरल पदार्थ होता है। लाल बॉक्स में कंट्रास्ट बढ़ाने वाला आवर्धन होता है। ये छवियां पूरक वीडियो एस 6: एमपी 5 में दिखाए गए वीडियो से हैं।
जीव में श्वासनली के साथ चुंबक को स्थानांतरित करने से एमपी श्रृंखला ने वायुमार्ग की सतह के भीतर कोण को उसी तरह बदल दिया जैसा कि केशिकाओं में देखा जाता है (चित्र 8 और पूरक वीडियो S7: MP5 देखें)। हालाँकि, हमारे अध्ययन में, MP को जीवित वायुमार्ग की सतह पर नहीं खींचा जा सका जैसा कि केशिकाओं के साथ किया जा सकता है। कुछ मामलों में, जैसे ही चुंबक बाएँ और दाएँ चलता है, MP श्रृंखला लंबी हो जाती है। दिलचस्प बात यह है कि हमने यह भी पाया कि जब चुंबक को श्वासनली के साथ अनुदैर्ध्य रूप से चलाया जाता है, तो कण स्ट्रिंग सतह द्रव परत की गहराई को बदलती हुई प्रतीत होती है, और जब चुंबक को सीधे ऊपर की ओर ले जाया जाता है और कण स्ट्रिंग को ऊर्ध्वाधर स्थिति में घुमाया जाता है, तो इसका विस्तार होता है (पूरक वीडियो S7 देखें)। : एमपी5 0:09 पर, नीचे दाएं)। गति का विशिष्ट पैटर्न तब बदल गया जब चुंबक को श्वासनली के शीर्ष पर पार्श्व रूप से स्थानांतरित किया गया (यानी, श्वासनली की लंबाई के बजाय पशु के बाईं या दाईं ओर)। कण हिलते हुए अभी भी स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, लेकिन जब चुंबक को श्वासनली से हटा दिया गया, तो कण तारों की युक्तियाँ दिखाई देने लगीं (देखें पूरक वीडियो S8:MP5, 0:08 से शुरू)। यह एमपी व्यवहार के अनुरूप है जिसे हमने एक ग्लास केशिका में लागू चुंबकीय क्षेत्र के तहत देखा था।
जीवित संवेदनाहारी चूहे की श्वासनली में एमपी5 दिखाने वाली उदाहरण छवियां। (ए) चुंबक का उपयोग श्वासनली के ऊपर और बाईं ओर की छवियों को प्राप्त करने के लिए किया जाता है, फिर (बी) चुंबक को दाईं ओर ले जाने के बाद। लाल बॉक्स में कंट्रास्ट बढ़ाने वाला आवर्धन होता है। ये छवियां पूरक वीडियो एस 7: एमपी 5 में दिखाए गए वीडियो से हैं।
जब दो ध्रुवों को श्वासनली के ऊपर और नीचे उत्तर-दक्षिण दिशा में स्थापित किया गया (अर्थात् आकर्षित करते हुए; चित्र 3बी), तो एमपी कॉर्ड लंबे दिखाई दिए और श्वासनली की पार्श्व दीवार पर स्थित थे न कि पृष्ठीय श्वासनली सतह पर (पूरक वीडियो एस9:एमपी5 देखें)।हालांकि, दोहरे चुंबक वाले उपकरण का उपयोग करने पर द्रव वितरण के बाद एकल स्थान (अर्थात् श्वासनली की पृष्ठीय सतह) पर कणों की उच्च सांद्रता का पता नहीं चला, जो आमतौर पर एकल-चुंबक वाले उपकरण का उपयोग करने पर होता है।फिर जब एक चुंबक को ध्रुवों को उलट कर पीछे हटाने के लिए स्थापित किया गया (चित्र 3सी), तो वितरण के बाद दृश्य क्षेत्र में दिखाई देने वाले कणों की संख्या में वृद्धि नहीं हुई।दोनों दोहरे चुंबक विन्यासों की स्थापना उच्च चुंबकीय क्षेत्र शक्तियों के कारण चुनौतीपूर्ण है जो क्रमशः चुंबकों को खींचती या धकेलती हैं ऑर्थोगोनली (चित्र 3डी), एक अभिविन्यास जिसे यह निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि क्या साइड वॉल पर कण एकत्रीकरण देखा जा सकता है। हालांकि, इस विन्यास में, एमपी संचय या चुंबक आंदोलन की कोई पहचान योग्य गति नहीं थी। इन सभी परिणामों के आधार पर, इन विवो जीन वाहक अध्ययन के लिए एकल-चुंबक, 30-डिग्री अभिविन्यास विन्यास (चित्र 3ए) को चुना गया था।
जब जानवर को मानवीय हत्या के तुरंत बाद बार-बार चित्रित किया गया, तो भ्रमित करने वाले ऊतक गति की अनुपस्थिति का मतलब था कि स्पष्ट इंटरकॉन्ड्रल क्षेत्र में महीन और छोटी कण रेखाएँ देखी जा सकती थीं, जो चुंबक की स्थानान्तरणीय गति के अनुरूप "डगमगाती" थीं। फिर भी, MP6 कणों की उपस्थिति और गति को अभी भी स्पष्ट रूप से नहीं देखा जा सकता है।
LV-LacZ टिटर 1.8 × 108 TU/ml था, और कॉम्बीमैग MP (MP6) के साथ 1:1 मिश्रण के बाद, जानवरों को 9 × 107 TU/ml LV वाहन (यानी 4.5 × 106 TU/चूहा) की 50 μl ट्रेकियल खुराक दी गई। इन अध्ययनों में, प्रसव के दौरान चुंबक का अनुवाद करने के बजाय, हमने यह निर्धारित करने के लिए चुंबक को एक स्थिति में स्थिर किया कि क्या चुंबकीय क्षेत्र की अनुपस्थिति में वेक्टर डिलीवरी की तुलना में LV ट्रांसडक्शन (a) में सुधार किया जा सकता है, और (b) केंद्रित किया जा सकता है वायुमार्ग की कोशिकाओं को ऊपरी वायुमार्ग के चुंबकीय लक्ष्य क्षेत्रों में स्थानांतरित किया जाता है।
चुंबकों की उपस्थिति और एलवी वेक्टरों के साथ कॉम्बीमैग के उपयोग से पशु स्वास्थ्य पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं पड़ता है, जैसा कि हमारे मानक एलवी वेक्टर वितरण प्रोटोकॉल से होता है। यांत्रिक गड़बड़ी (पूरक चित्र 1) के अधीन श्वासनली क्षेत्र की ललाट छवियों ने संकेत दिया कि जब चुंबक मौजूद था, तब एलवी-एमपी के साथ इलाज किए गए जानवरों के समूह में पारगमन के स्तर काफी अधिक थे (चित्र 9 ए)। नियंत्रण समूह में केवल थोड़ी मात्रा में नीला लैकजेड धुंधलापन मौजूद था (चित्र 9 बी)। सामान्यीकृत एक्स-गैल दाग वाले क्षेत्रों की मात्रा का पता चला कि चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में एलवी-एमपी के प्रशासन ने लगभग 6 गुना सुधार किया (चित्र 9 सी)।
एल.वी.-एम.पी. द्वारा श्वासनली पारगमन को दर्शाने वाली उदाहरण संयुक्त छवियां (क) चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में और (ख) चुंबक की अनुपस्थिति में। (ग) चुंबक का उपयोग करते समय श्वासनली के भीतर सामान्यीकृत लैकजेड पारगमन क्षेत्र में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण सुधार (*पी = 0.029, टी-परीक्षण, एन = 3 प्रति समूह, औसत ± एसईएम)।
तटस्थ तीव्र लाल-रंजित खंडों (उदाहरण अनुपूरक चित्र 2 में दिखाया गया है) में LacZ-रंजित कोशिकाएं उसी पैटर्न और स्थान पर मौजूद दिखाई दीं, जैसा कि पहले रिपोर्ट किया गया था।
वायुमार्ग जीन थेरेपी के लिए एक प्रमुख चुनौती रुचि के क्षेत्रों में वाहक कणों का सटीक स्थानीयकरण और वायुप्रवाह और सक्रिय बलगम निकासी की उपस्थिति में गतिशील फेफड़ों में पारगमन दक्षता के उच्च स्तर को प्राप्त करना है। सीएफ वायुमार्ग रोग के इलाज के लिए डिजाइन किए गए एलवी वाहकों के लिए, संवाहक वायुमार्ग के भीतर वाहक कणों के निवास समय को बढ़ाना अब तक एक मायावी लक्ष्य रहा है। जैसा कि कैस्टेलानी एट अल द्वारा बताया गया है, पारगमन में सुधार करने के लिए चुंबकीय क्षेत्रों का उपयोग इलेक्ट्रोपोरेशन जैसे अन्य जीन वितरण विधियों की तुलना में फायदे हैं, क्योंकि यह सादगी, लागत प्रभावशीलता, वितरण स्थानीयकरण, बढ़ी हुई दक्षता और कम ऊष्मायन समय और संभवतः एक छोटी वाहक खुराक को जोड़ सकता है। 10। हालांकि,
हमारे इन विट्रो सिंक्रोट्रॉन पीसीएक्सआई प्रयोगों से पता चला है कि हमने जिन सभी कणों का परीक्षण किया था, पॉलीस्टाइरीन एमपी के अपवाद के साथ, वे हमारे द्वारा उपयोग किए गए इमेजिंग सेटअप में दिखाई दे रहे थे। चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में, एमपी तार बनाते हैं जिनकी लंबाई कण के प्रकार और चुंबकीय क्षेत्र की ताकत (यानी चुंबक की निकटता और गति) से संबंधित होती है। जैसा कि चित्र 10 में दिखाया गया है, हम जो तार देखते हैं वे प्रत्येक व्यक्तिगत कण के चुंबकित होने और अपने स्वयं के स्थानीय चुंबकीय क्षेत्र को प्रेरित करने के कारण बनते हैं। ये अलग-अलग क्षेत्र अन्य समान कणों को एकत्रित करने और जुड़ने का कारण बनते हैं, अन्य कणों के स्थानीय आकर्षक और प्रतिकर्षक बलों से स्थानीय बलों के कारण समूह स्ट्रिंग जैसी गति के साथ।
योजनाबद्ध रूप से (a,b) द्रव से भरी केशिकाओं के अंदर उत्पन्न कण श्रृंखलाओं और (c,d) वायु से भरी श्वासनली को दर्शाया गया है। ध्यान दें कि केशिकाओं और श्वासनली को पैमाने पर नहीं खींचा गया है। पैनल (a) में MP का विवरण भी है, जिसमें स्ट्रिंग में व्यवस्थित Fe3O4 कण हैं।
जब चुंबक को केशिका के ऊपर ले जाया गया, तो कण स्ट्रिंग का कोण Fe3O4 युक्त MP3-5 के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा तक पहुंच गया, जिसके बाद कण स्ट्रिंग अब मूल स्थिति में नहीं रही, बल्कि सतह के साथ एक नई स्थिति में चली गई। यह प्रभाव होने की संभावना है क्योंकि कांच की केशिका सतह इस आंदोलन को होने देने के लिए पर्याप्त चिकनी है। दिलचस्प बात यह है कि MP6 (कॉम्बीमैग) ने इस तरह से व्यवहार नहीं किया, संभवतः इसलिए क्योंकि कण छोटे थे, अलग-अलग कोटिंग्स या सतह के चार्ज थे, या एक मालिकाना वाहक तरल पदार्थ ने उनकी गति करने की क्षमता को प्रभावित किया। कॉम्बीमैग कणों की छवि का कंट्रास्ट भी कमजोर है, यह सुझाव देते हुए कि द्रव और कणों का घनत्व समान हो सकता है और इसलिए आसानी से एक दूसरे की ओर नहीं बढ़ सकते हैं। यदि चुंबक बहुत तेजी से चलता है तो कण फंस भी सकते हैं, यह दर्शाता है कि चुंबकीय क्षेत्र की ताकत हमेशा तरल पदार्थ में कणों के बीच घर्षण को दूर नहीं कर सकती है, यह सुझाव देते हुए कि शायद यह आश्चर्यजनक नहीं है कि चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और चुंबक और लक्ष्य क्षेत्र के बीच की दूरी बहुत महत्वपूर्ण है। एक साथ लिया गया, ये परिणाम यह भी सुझाव देते हैं कि, जबकि चुंबक लक्ष्य के माध्यम से बहने वाले कई एमपी को पकड़ सकते हैं क्षेत्र में, यह संभावना नहीं है कि चुंबकों पर श्वासनली की सतह के साथ कॉम्बीमैग कणों को स्थानांतरित करने के लिए भरोसा किया जा सकता है। इसलिए, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि इन विवो एलवी-एमपी अध्ययनों में वायुमार्ग के विशिष्ट क्षेत्रों को भौतिक रूप से लक्षित करने के लिए स्थैतिक चुंबकीय क्षेत्रों का उपयोग करना चाहिए।
जब कण शरीर में पहुंचाए जाते हैं, तो जटिल गतिशील शरीर के ऊतकों के संदर्भ में उन्हें पहचानना मुश्किल होता है, लेकिन एमपी तारों को "हिला" करने के लिए चुंबक को क्षैतिज रूप से श्वासनली के ऊपर स्थानांतरित करके उन्हें पता लगाने की क्षमता को बढ़ाया गया था। हालांकि लाइव इमेजिंग संभव है, लेकिन जानवर को मानवीय तरीके से मारने के बाद कणों की गति को समझना आसान है। जब चुंबक इमेजिंग क्षेत्र के ऊपर स्थित होता था, तब एमपी की सांद्रता आमतौर पर इस स्थान पर सबसे अधिक होती थी, हालांकि कुछ कण आमतौर पर श्वासनली के साथ आगे पाए जाते थे। इन विट्रो अध्ययनों के विपरीत, चुंबक को स्थानांतरित करके कणों को श्वासनली के साथ नहीं खींचा जा सकता है। यह खोज इस बात के अनुरूप है कि कैसे श्वासनली की सतह को कोट करने वाला बलगम आमतौर पर साँस के साथ कणों को संसाधित करता है, उन्हें बलगम में फंसाता है
हमने यह अनुमान लगाया कि श्वासनली के ऊपर और नीचे चुंबकों के आकर्षण के लिए उपयोग (चित्र 3बी) के परिणामस्वरूप एक समान चुंबकीय क्षेत्र हो सकता है, बजाय एक बिंदु पर अत्यधिक केंद्रित चुंबकीय क्षेत्र के, जो संभावित रूप से कणों के अधिक समान वितरण की ओर ले जाता है। हालाँकि, हमारे प्रारंभिक अध्ययन में इस परिकल्पना का समर्थन करने के लिए स्पष्ट सबूत नहीं मिले। इसी तरह, चुंबकों की एक जोड़ी को पीछे हटाने के लिए कॉन्फ़िगर करना (चित्र 3सी) छवि वाले क्षेत्र में अधिक कण जमा नहीं करता है। ये दो निष्कर्ष दर्शाते हैं कि दोहरे चुंबक सेटअप एमपी लक्ष्यीकरण के स्थानीय नियंत्रण में महत्वपूर्ण रूप से सुधार नहीं करता है, और परिणामस्वरूप मजबूत चुंबकीय बलों को कॉन्फ़िगर करना मुश्किल है, जिससे यह दृष्टिकोण कम व्यावहारिक हो जाता है। इसी तरह, श्वासनली के ऊपर और उसके माध्यम से चुंबक को उन्मुख करना (चित्र 3डी) भी छवि वाले क्षेत्र में बनाए गए कणों की संख्या में वृद्धि नहीं करता है इन विवो परीक्षण के लिए कुशल विधि.
LV-MP अध्ययन से पता चला है कि जब LV वेक्टर को कॉम्बीमैग के साथ संयोजित किया गया और चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में भौतिक गड़बड़ी के बाद वितरित किया गया, तो नियंत्रण की तुलना में श्वासनली में पारगमन के स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग अध्ययन और LacZ परिणामों के आधार पर, चुंबकीय क्षेत्र स्पष्ट रूप से श्वासनली के भीतर LV को संरक्षित करने और वेक्टर कणों की संख्या को कम करने में सक्षम था, जो तुरंत फेफड़ों में गहराई तक प्रवेश कर जाते थे। इस तरह के लक्ष्यीकरण सुधारों से उच्च प्रभावकारिता हो सकती है जबकि वितरित टिटर, ऑफ-टारगेट पारगमन, सूजन और प्रतिरक्षा दुष्प्रभावों और जीन वाहक लागत को कम किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि निर्माता के अनुसार, कॉम्बीमैग का उपयोग अन्य जीन स्थानांतरण विधियों के साथ संयोजन में किया जा सकता है