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सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों की बीमारी के उपचार के लिए जीन वैक्टर को वायुमार्गों को लक्षित करना चाहिए क्योंकि परिधीय फेफड़ों का ट्रांसडक्शन चिकित्सीय लाभ प्रदान नहीं करता है। वायरल ट्रांसडक्शन दक्षता सीधे वेक्टर के निवास समय से संबंधित है। हालांकि, जीन वाहक जैसे वितरण तरल पदार्थ स्वाभाविक रूप से श्वास के दौरान एल्वियोली में फैल जाते हैं, और किसी भी रूप के चिकित्सीय कण म्यूकोसिलियरी परिवहन द्वारा तेजी से साफ हो जाते हैं। वायुमार्गों में जीन वाहकों के निवास समय को बढ़ाना महत्वपूर्ण है लेकिन इसे प्राप्त करना कठिन है। जीन वाहक-संयुग्मित चुंबकीय कण जिन्हें वायुमार्गों की सतह पर निर्देशित किया जा सकता है, क्षेत्रीय लक्ष्यीकरण में सुधार कर सकते हैं। जीवित शरीर में दृश्यता की चुनौतियों के कारण, लागू चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में वायुमार्ग की सतह पर ऐसे छोटे चुंबकीय कणों के व्यवहार को ठीक से समझा नहीं गया है। इस अध्ययन का उद्देश्य सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग का उपयोग करके बेहोश चूहों की श्वासनली में चुंबकीय कणों की एक श्रृंखला की जीवित शरीर में गति को देखना था ताकि जीवित शरीर में व्यक्तिगत और थोक कण व्यवहार की गतिशीलता और पैटर्न की जांच की जा सके। इसके बाद हमने यह भी मूल्यांकन किया कि क्या लेंटिवाइरल चुंबकीय कणों का वितरण चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति से चूहे की श्वासनली में ट्रांसडक्शन दक्षता बढ़ जाती है। सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे इमेजिंग से स्थिर और गतिशील चुंबकीय क्षेत्रों में चुंबकीय कणों के व्यवहार का पता चलता है, चाहे वह इन विट्रो हो या इन विवो। कणों को चुम्बकों की सहायता से जीवित वायुमार्ग की सतह पर आसानी से नहीं खींचा जा सकता है, लेकिन परिवहन के दौरान, वे उस क्षेत्र में केंद्रित हो जाते हैं जहां चुंबकीय क्षेत्र सबसे मजबूत होता है। चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में लेंटिवाइरल चुंबकीय कणों को पहुंचाने पर ट्रांसडक्शन दक्षता छह गुना बढ़ गई। ये सभी परिणाम बताते हैं कि लेंटिवाइरल चुंबकीय कण और चुंबकीय क्षेत्र, जीन वेक्टर लक्ष्यीकरण को बेहतर बनाने और इन विवो में संवाहक वायुमार्गों में ट्रांसडक्शन स्तर को बढ़ाने के लिए उपयोगी तरीके हो सकते हैं।
सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) एक जीन में भिन्नता के कारण होता है जिसे सीएफ ट्रांसमेम्ब्रेन कंडक्टेंस रेगुलेटर (सीएफटीआर) कहा जाता है। सीएफटीआर प्रोटीन एक आयन चैनल है जो शरीर भर में कई उपकला कोशिकाओं में मौजूद होता है, जिसमें वायुमार्ग भी शामिल हैं, जो सीएफ रोगजनन का एक प्रमुख स्थल है। सीएफटीआर दोष असामान्य जल परिवहन का कारण बनते हैं, जिससे वायुमार्ग की सतह निर्जलित हो जाती है और वायुमार्ग की सतह तरल (एएसएल) परत की गहराई कम हो जाती है। इससे श्वसन कणों और रोगजनकों को वायुमार्ग से बाहर निकालने की श्लेष्मा परिवहन (एमसीटी) प्रणाली की क्षमता भी प्रभावित होती है। हमारा लक्ष्य सीएफटीआर जीन की सही प्रतिलिपि पहुंचाने और एएसएल, एमसीटी और फेफड़ों के स्वास्थ्य में सुधार करने के लिए एक लेंटिवाइरल (एलवी) जीन थेरेपी विकसित करना है, और इन मापदंडों को इन विवो1 में मापने में सक्षम नई तकनीकों को विकसित करना जारी रखना है।
LV वैक्टर, CF वायुमार्ग जीन थेरेपी के लिए प्रमुख उम्मीदवारों में से एक हैं, मुख्य रूप से इसलिए क्योंकि वे चिकित्सीय जीन को वायुमार्ग की बेसल कोशिकाओं (वायुमार्ग स्टेम कोशिकाओं) में स्थायी रूप से एकीकृत कर सकते हैं। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि वे कार्यात्मक जीन-सुधारित CF-संबंधित वायुमार्ग सतह कोशिकाओं में विभेदित होकर सामान्य जलयोजन और बलगम निकासी को बहाल कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप जीवन भर लाभ मिलता है। LV वैक्टर को कंडक्टिंग वायुमार्ग के विरुद्ध निर्देशित किया जाना चाहिए, क्योंकि यहीं से CF फेफड़ों की बीमारी शुरू होती है। वेक्टर को फेफड़े में गहराई तक पहुँचाने से एल्वियोलर ट्रांसडक्शन हो सकता है, लेकिन CF में इसका कोई चिकित्सीय लाभ नहीं है। हालांकि, जीन वाहक जैसे तरल पदार्थ डिलीवरी के बाद साँस लेने पर स्वाभाविक रूप से एल्वियोली में चले जाते हैं3,4 और चिकित्सीय कण MCT द्वारा तेजी से मुख गुहा में साफ हो जाते हैं। LV ट्रांसडक्शन दक्षता सीधे उस समय की अवधि से संबंधित है जब वेक्टर सेलुलर अपटेक की अनुमति देने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के पास रहता है - "निवास समय"5 - जो विशिष्ट क्षेत्रीय वायु प्रवाह के साथ-साथ समन्वित कण बलगम कैप्चर और MCT द्वारा आसानी से कम हो जाता है। CF के लिए, निवास समय को बढ़ाने की क्षमता महत्वपूर्ण है। इस क्षेत्र में उच्च स्तर के ट्रांसडक्शन को प्राप्त करने के लिए वायुमार्ग के भीतर एलवी का समय महत्वपूर्ण है, लेकिन अब तक यह चुनौतीपूर्ण रहा है।
इस बाधा को दूर करने के लिए, हमारा सुझाव है कि एलवी चुंबकीय कण (एमपी) दो पूरक तरीकों से मदद कर सकते हैं। पहला, उन्हें चुंबकीय रूप से वायुमार्ग की सतह पर निर्देशित किया जा सकता है ताकि लक्ष्यीकरण में सुधार हो सके और जीन वाहक कणों को वांछित वायुमार्ग क्षेत्र में रहने में मदद मिल सके; और एएसएल) कोशिका परत 6 तक पहुंचने में मदद मिल सके। एमपी का व्यापक रूप से लक्षित दवा वितरण वाहनों के रूप में उपयोग किया जाता है जब वे एंटीबॉडी, कीमोथेरेप्यूटिक दवाओं, या अन्य छोटे अणुओं से जुड़ते हैं जो कोशिका झिल्ली से जुड़ते हैं या प्रासंगिक कोशिका सतह रिसेप्टर्स से जुड़ते हैं और स्थिर विद्युत की उपस्थिति में ट्यूमर स्थलों पर जमा होते हैं। कैंसर उपचार के लिए चुंबकीय क्षेत्र 7. अन्य "हाइपरथर्मल" तकनीकों का उद्देश्य दोलनशील चुंबकीय क्षेत्रों के संपर्क में आने पर एमपी को गर्म करना है, जिससे ट्यूमर कोशिकाओं को नष्ट किया जा सके। चुंबकीय ट्रांसफेक्शन का सिद्धांत, जिसमें डीएनए को कोशिकाओं में स्थानांतरित करने को बढ़ाने के लिए एक चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग ट्रांसफेक्शन एजेंट के रूप में किया जाता है, आमतौर पर विट्रो में विभिन्न प्रकार के गैर-वायरल और वायरल जीन वैक्टर का उपयोग करके उन सेल लाइनों के लिए किया जाता है जिन्हें ट्रांसड्यूस करना मुश्किल होता है। एलवी मैग्नेटोट्रांसफेक्शन की प्रभावशीलता स्थापित हो चुकी है, जिसमें एक स्थिर चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में मानव ब्रोन्कियल उपकला सेल लाइन में एलवी-एमपी की विट्रो डिलीवरी से अकेले एलवी वेक्टर की तुलना में ट्रांसडक्शन दक्षता 186 गुना बढ़ जाती है। एलवी-एमपी को एक विट्रो सीएफ मॉडल में भी लागू किया गया है, जहां चुंबकीय ट्रांसफेक्शन ने सीएफ थूक की उपस्थिति में वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों में एलवी ट्रांसडक्शन को 20 गुना बढ़ा दिया है10। हालांकि, अंगों के विवो मैग्नेटोट्रांसफेक्शन पर अपेक्षाकृत कम ध्यान दिया गया है और इसका मूल्यांकन केवल एक कुछ पशु अध्ययन11,12,13,14,15, विशेष रूप से फेफड़ों में16,17। फिर भी, सीएफ फेफड़े की चिकित्सा में चुंबकीय ट्रांसफ़ेक्शन के अवसर स्पष्ट हैं। टैन एट अल. (2020) ने कहा कि "कुशल चुंबकीय नैनोकण फुफ्फुसीय वितरण का एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन सीएफ रोगियों में नैदानिक ​​परिणामों को बेहतर बनाने के लिए भविष्य की सीएफ़टीआर साँस लेने की रणनीतियों का मार्ग प्रशस्त करेगा"6।
लागू चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में वायुमार्ग की सतहों पर छोटे चुंबकीय कणों के व्यवहार को देखना और उसका अध्ययन करना कठिन है, और इसलिए इसे ठीक से समझा नहीं गया है। अन्य अध्ययनों में, हमने एएसएल गहराई18 और एमसीटी व्यवहार19,20 में सूक्ष्म इन विवो परिवर्तनों को गैर-आक्रामक रूप से देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए सिंक्रोट्रॉन-प्रसार-आधारित चरण-विपरीत एक्स-रे इमेजिंग (पीबी-पीसीएक्सआई) विधि विकसित की, ताकि गैस नहर की सतह जलयोजन को सीधे मापा जा सके और उपचार प्रभावकारिता के प्रारंभिक संकेतक के रूप में इसका उपयोग किया जा सके। इसके अलावा, हमारी एमसीटी मूल्यांकन विधि एल्यूमिना या उच्च अपवर्तक सूचकांक कांच से बने 10-35 µm व्यास के कणों का उपयोग एमसीटी मार्कर के रूप में करती है जो पीबी-पीसीएक्सआई21 का उपयोग करके दिखाई देते हैं। दोनों तकनीकें एमपी सहित कई प्रकार के कणों को देखने के लिए उपयुक्त हैं।
उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के कारण, हमारी PB-PCXI-आधारित ASL और MCT विश्लेषण तकनीकें इन विवो में एकल और थोक कण व्यवहार की गतिशीलता और पैटर्न की जांच के लिए अच्छी तरह से उपयुक्त हैं, जिससे हमें MP जीन वितरण तकनीकों को समझने और अनुकूलित करने में मदद मिलती है। यहां हम जिस दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं, वह SPring-8 BL20B2 बीमलाइन का उपयोग करके हमारे अध्ययनों से लिया गया है, जिसमें हमने चूहों के नाक और फुफ्फुसीय वायुमार्ग में नकली वेक्टर खुराक वितरण के बाद द्रव गति की कल्पना की, ताकि हमारे जीन वाहक खुराक पशु अध्ययनों 3,4 में देखे गए हमारे गैर-समान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को समझाने में मदद मिल सके।
इस अध्ययन का उद्देश्य सिंक्रोट्रॉन PB-PCXI का उपयोग करके जीवित चूहों की श्वासनली में माइक्रोप्लास्टिक कणों (एमपी) की एक श्रृंखला की आंतरिक गति का अवलोकन करना था। इन PB-PCXI इमेजिंग अध्ययनों को विभिन्न प्रकार के एमपी, चुंबकीय क्षेत्र की तीव्रता और स्थानों का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था ताकि एमपी की गति पर उनके प्रभाव का पता लगाया जा सके। हमने परिकल्पना की कि बाह्य रूप से लगाया गया चुंबकीय क्षेत्र वितरित एमपी को लक्ष्य क्षेत्र में बने रहने या वहां तक ​​पहुंचने में मदद करेगा। इन अध्ययनों ने हमें चुंबक विन्यासों की पहचान करने में भी सक्षम बनाया जो जमाव के बाद श्वासनली में बरकरार रहने वाले कणों की संख्या को अधिकतम करते हैं। अध्ययनों की एक दूसरी श्रृंखला में, हमने इस इष्टतम विन्यास का उपयोग करके चूहे के वायुमार्ग में एलवी-एमपी के आंतरिक वितरण से उत्पन्न होने वाले ट्रांसडक्शन पैटर्न को प्रदर्शित करने का प्रयास किया, इस धारणा के आधार पर कि वायुमार्ग को लक्षित करने के संदर्भ में एलवी-एमपी के वितरण से एलवी ट्रांसडक्शन दक्षता में सुधार होगा।
सभी पशु अध्ययन एडिलेड विश्वविद्यालय (एम-2019-060 और एम-2020-022) और स्प्रिंग-8 सिंक्रोट्रॉन पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे। प्रयोग एआरआरआईवीई दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे।
सभी एक्स-रे इमेजिंग जापान के SPring-8 सिंक्रोट्रॉन में BL20XU बीमलाइन पर की गई, जिसमें पहले वर्णित सेटअप21,22 के समान सेटअप का उपयोग किया गया। संक्षेप में, प्रायोगिक बॉक्स सिंक्रोट्रॉन स्टोरेज रिंग से 245 मीटर की दूरी पर स्थित था। कण इमेजिंग अध्ययनों के लिए नमूने से डिटेक्टर की दूरी 0.6 मीटर और इन विवो इमेजिंग अध्ययनों के लिए 0.3 मीटर रखी गई ताकि फेज कंट्रास्ट प्रभाव उत्पन्न हो सकें। 25 keV की मोनोक्रोमैटिक बीम ऊर्जा का उपयोग किया गया। छवियों को एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे कनवर्टर (SPring-8 BM3) का उपयोग करके कैप्चर किया गया, जो एक sCMOS डिटेक्टर से जुड़ा था। कनवर्टर 10 µm मोटे सिंटिलेटर (Gd3Al2Ga3O12) का उपयोग करके एक्स-रे को दृश्य प्रकाश में परिवर्तित करता है, जिसे फिर × 10 माइक्रोस्कोप ऑब्जेक्टिव (NA 0.3) का उपयोग करके sCMOS सेंसर पर निर्देशित किया जाता है। sCMOS डिटेक्टर Orca-Flash4.0 (Hamamatsu) था। फोटोनिक्स, जापान) द्वारा निर्मित एक उपकरण का उपयोग किया गया था जिसमें 2048 × 2048 पिक्सेल आकार की सरणी और 6.5 × 6.5 µm का कच्चा पिक्सेल आकार था। इस सेटअप से 0.51 µm का प्रभावी आइसोट्रोपिक पिक्सेल आकार और लगभग 1.1 mm × 1.1 mm का दृश्य क्षेत्र प्राप्त होता है। वायुमार्ग के अंदर और बाहर चुंबकीय कणों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने और सांस लेने से उत्पन्न गति संबंधी त्रुटियों को कम करने के लिए 100 मिलीसेकंड की एक्सपोज़र अवधि चुनी गई थी। जीवित जीवों पर किए जाने वाले अध्ययनों के लिए, एक्सपोज़र के बीच एक्स-रे किरण को अवरुद्ध करके विकिरण खुराक को सीमित करने के लिए एक्स-रे पथ में एक तेज़ एक्स-रे शटर लगाया गया था।
SPring-8 PB-PCXI इमेजिंग अध्ययनों में LV कैरियर का उपयोग नहीं किया गया था क्योंकि BL20XU इमेजिंग चैंबर बायोसेफ्टी लेवल 2 प्रमाणित नहीं है। इसके बजाय, हमने दो वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से विभिन्न आकारों, सामग्रियों, लौह सांद्रता और अनुप्रयोगों को कवर करते हुए, अच्छी तरह से परिभाषित MP की एक श्रृंखला का चयन किया - पहले यह समझने के लिए कि चुंबकीय क्षेत्र कांच की केशिकाओं के भीतर और फिर जीवित वायुमार्गों में MP की गति को कैसे प्रभावित करते हैं। सतह पर। एमपी का आकार 0.25 से 18 μm तक होता है और ये विभिन्न सामग्रियों से बने होते हैं (तालिका 1 देखें), लेकिन एमपी के भीतर चुंबकीय कणों के आकार सहित प्रत्येक नमूने की संरचना अज्ञात है। हमारे व्यापक एमसीटी अध्ययनों 19, 20, 21, 23, 24 के आधार पर, हम उम्मीद करते हैं कि 5 μm जितने छोटे एमपी को श्वासनली की वायुमार्ग सतह पर देखा जा सकता है, उदाहरण के लिए एमपी की गति की बेहतर दृश्यता देखने के लिए लगातार फ्रेम को घटाकर। एक 0.25 μm आकार का एमपी इमेजिंग उपकरण के रिज़ॉल्यूशन से छोटा होता है, लेकिन PB-PCXI से उनके आयतन कंट्रास्ट और जमाव के बाद उस सतह के तरल पदार्थ की गति का पता लगाने की उम्मीद है जिस पर वे जमा होते हैं।
तालिका 1 में प्रत्येक माइक्रोपॉलीमर (MP) के नमूने 0.63 मिमी के आंतरिक व्यास वाली 20 μl कांच की केशिकाओं (ड्रमंड माइक्रोकेप्स, पीए, यूएसए) में तैयार किए गए थे। कणिका कण पानी में उपलब्ध हैं, जबकि कॉम्बीमैग कण निर्माता के स्वामित्व वाले तरल में उपलब्ध हैं। प्रत्येक ट्यूब को आधा तरल (लगभग 11 μl) से भरा गया और नमूना धारक पर रखा गया (चित्र 1 देखें)। कांच की केशिकाओं को इमेजिंग बॉक्स में नमूना स्टेज पर क्षैतिज रूप से रखा गया और तरल के किनारों को स्थिति में लाया गया। 1.17 टेस्ला के अवशिष्ट चुंबकत्व वाले 19 मिमी व्यास (28 मिमी लंबा) निकल शेल दुर्लभ पृथ्वी नियोडिमियम आयरन बोरॉन (NdFeB) चुंबक (N35, कैटलॉग संख्या LM1652, जयकार इलेक्ट्रॉनिक्स, ऑस्ट्रेलिया) को इमेजिंग के दौरान इसकी स्थिति को दूरस्थ रूप से बदलने के लिए एक अलग ट्रांसलेशन स्टेज से जोड़ा गया था। एक्स-रे छवि अधिग्रहण तब शुरू होता है जब चुंबक नमूने से लगभग 30 मिमी ऊपर स्थित होता है, और छवियां छवियों को 4 फ्रेम प्रति सेकंड की दर से प्राप्त किया जाता है। इमेजिंग के दौरान, चुंबक को कांच की केशिका ट्यूब के करीब (लगभग 1 मिमी दूर) लाया गया और फिर क्षेत्र की शक्ति और स्थिति के प्रभावों का आकलन करने के लिए ट्यूब के साथ स्थानांतरित किया गया।
इन विट्रो इमेजिंग सेटअप में सैंपल एक्सवाई ट्रांसलेशन स्टेज पर कांच की केशिकाओं में एमपी सैंपल रखे गए हैं। एक्स-रे किरण के पथ को लाल रंग की डैश वाली रेखा से दर्शाया गया है।
एक बार जब एमपी की इन विट्रो दृश्यता स्थापित हो गई, तो उनमें से एक उपसमूह का जंगली प्रकार की मादा एल्बिनो विस्टार चूहों (~12 सप्ताह पुरानी, ​​~200 ग्राम) में इन विवो परीक्षण किया गया। 0.24 मिलीग्राम/किलोग्राम मेडेटोमिडीन (डोमिटर®, ज़ेनोएक, जापान), 3.2 मिलीग्राम/किलोग्राम मिडाज़ोलम (डॉर्मिकम®, एस्टेलस फार्मा, जापान) और 4 मिलीग्राम/किलोग्राम ब्यूटोरफेनॉल (वेटोरफेल®, मेइजी सेइका फार्मा, जापान) के मिश्रण से चूहों को इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बेहोश किया गया। बेहोशी के बाद, श्वासनली के चारों ओर के बालों को हटाकर, एक एंडोट्रैकियल ट्यूब (ईटी; 16 गा iv कैनुला, टेरुमो बीसीटी) डालकर और उन्हें शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए थर्मल बैग वाली एक विशेष रूप से निर्मित इमेजिंग प्लेट पर पीठ के बल लिटाकर इमेजिंग के लिए तैयार किया गया। इमेजिंग प्लेट को फिर इमेजिंग बॉक्स में नमूना अनुवाद मंच से थोड़े कोण पर जोड़ा गया। एक्स-रे इमेज में श्वासनली को क्षैतिज रूप से संरेखित करें, जैसा कि चित्र 2a में दिखाया गया है।
(a) SPring-8 इमेजिंग बॉक्स में इन विवो इमेजिंग सेटअप, एक्स-रे बीम का पथ लाल डैश वाली रेखा से चिह्नित है। (b,c) श्वासनली पर चुंबक का स्थान निर्धारण दो लंबवत रूप से लगे आईपी कैमरों का उपयोग करके दूर से किया गया था। स्क्रीन छवि के बाईं ओर, सिर को पकड़े हुए तार का लूप और ईटी ट्यूब के भीतर डिलीवरी कैनुला को देखा जा सकता है।
एक रिमोट-नियंत्रित सिरिंज पंप सिस्टम (UMP2, वर्ल्ड प्रेसिजन इंस्ट्रूमेंट्स, सारासोटा, FL) जिसमें 100 μl की कांच की सिरिंज का उपयोग किया गया था, को 30 Ga सुई के माध्यम से PE10 ट्यूबिंग (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) से जोड़ा गया था। ET ट्यूब डालते समय यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब पर निशान लगाएं कि टिप श्वासनली में सही स्थिति में है। माइक्रो पंप का उपयोग करके, सिरिंज प्लंजर को तब तक खींचा गया जब तक कि ट्यूब की टिप डिलीवर किए जाने वाले MP नमूने में डूबी हुई थी। फिर भरी हुई डिलीवरी ट्यूब को एंडोट्रैकियल ट्यूब में डाला गया, जिससे टिप हमारे अपेक्षित लागू चुंबकीय क्षेत्र के सबसे मजबूत हिस्से में आ गई। इमेज अधिग्रहण को हमारे Arduino आधारित टाइमिंग बॉक्स से जुड़े श्वसन डिटेक्टर का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था, और सभी सिग्नल (जैसे तापमान, श्वसन, शटर का खुलना/बंद होना और इमेज अधिग्रहण) को Powerlab और LabChart (AD इंस्ट्रूमेंट्स, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) 22 का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था। इमेजिंग के दौरान जब एनक्लोजर तक पहुंचना संभव नहीं था, तो दो IP कैमरों का उपयोग किया गया था। पैनासोनिक बीबी-एससी382 को एक दूसरे से लगभग 90° के कोण पर रखा गया था और इमेजिंग के दौरान श्वासनली के सापेक्ष चुंबक की स्थिति की निगरानी के लिए इनका उपयोग किया गया था (चित्र 2बी,सी)। गति संबंधी त्रुटियों को कम करने के लिए, अंत-ज्वारीय प्रवाह पठार के दौरान प्रति सांस एक छवि प्राप्त की गई थी।
एक चुंबक को दूसरे चरण से जोड़ा जाता है जिसे इमेजिंग हाउसिंग के बाहर से दूर से भी नियंत्रित किया जा सकता है। चुंबक की विभिन्न स्थितियों और विन्यासों का परीक्षण किया गया, जिनमें शामिल हैं: श्वासनली के ऊपर लगभग 30° के कोण पर स्थापित (चित्र 2a और 3a में दिखाए गए विन्यास); एक चुंबक जानवर के ऊपर और दूसरा नीचे, जिनके ध्रुव एक दूसरे को आकर्षित करते हैं (चित्र 3b); एक चुंबक जानवर के ऊपर और दूसरा नीचे, जिनके ध्रुव एक दूसरे को प्रतिकर्षित करते हैं (चित्र 3c); और एक चुंबक श्वासनली के ऊपर और लंबवत (चित्र 3d)। जानवर और चुंबक को सही स्थिति में रखने और परीक्षण किए जाने वाले एमपी को सिरिंज पंप में लोड करने के बाद, चित्र लेते समय 4 μl/सेकंड की दर से 50 μl की खुराक दें। फिर चित्र लेते समय चुंबक को श्वासनली के आर-पार या अगल-बगल आगे-पीछे घुमाया जाता है।
जीवित शरीर की इमेजिंग के लिए चुंबक विन्यास: (a) श्वासनली के ऊपर लगभग 30° के कोण पर एक चुंबक, (b) दो चुंबक एक दूसरे को आकर्षित करते हुए, (c) दो चुंबक एक दूसरे को प्रतिकर्षित करते हुए, (d) श्वासनली के ऊपर लंबवत एक चुंबक। प्रेक्षक मुख से श्वासनली के माध्यम से फेफड़ों तक नीचे की ओर देखता है, और एक्स-रे किरण चूहे के बाईं ओर से गुजरती है और दाईं ओर से बाहर निकलती है। चुंबक को या तो वायुमार्ग की लंबाई के साथ या श्वासनली के ऊपर एक्स-रे किरण की दिशा में बाएँ और दाएँ घुमाया जाता है।
हमने सांस लेने और हृदय गति की बाधाओं के बिना वायुमार्ग में कणों की दृश्यता और व्यवहार का निर्धारण करने का भी प्रयास किया। इसलिए, इमेजिंग अवधि के अंत में, जानवरों को पेंटोबार्बिटल की अधिक मात्रा (सोम्नोपेंटिल, पिटमैन-मूर, वाशिंगटन क्रॉसिंग, यूएसए; ~65 मिलीग्राम/किलोग्राम आईपी) देकर मानवीय तरीके से मार दिया गया। कुछ जानवरों को इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर छोड़ दिया गया, और सांस लेने और हृदय गति रुकने के बाद, इमेजिंग प्रक्रिया को दोहराया गया, और यदि वायुमार्ग की सतह पर कोई एमपी दिखाई नहीं दिया तो एमपी की एक अतिरिक्त खुराक दी गई।
प्राप्त छवियों को फ्लैट-फील्ड और डार्क-फील्ड करेक्शन किया गया और फिर MATLAB (R2020a, द मैथवर्क्स) में लिखे गए एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग करके उन्हें एक मूवी (20 फ्रेम प्रति सेकंड; श्वसन दर के आधार पर सामान्य गति से 15-25 गुना) में असेंबल किया गया।
एलवी जीन वेक्टर वितरण से संबंधित सभी अध्ययन एडिलेड विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु अनुसंधान केंद्र में किए गए थे और इनका उद्देश्य एसपीआरिंग-8 प्रयोग के परिणामों का उपयोग करके यह आकलन करना था कि क्या चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में एलवी-एमपी वितरण से जीवित प्राणियों में जीन स्थानांतरण को बढ़ाया जा सकता है। एमपी और चुंबकीय क्षेत्र के प्रभावों का आकलन करने के लिए, जानवरों के दो समूहों का उपचार किया गया: एक समूह को चुंबक के साथ एलवी-एमपी दिया गया, और दूसरे समूह को बिना चुंबक के एलवी-एमपी दिया गया।
LV जीन वैक्टर को पूर्व वर्णित विधियों 25, 26 का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। LacZ वेक्टर, कॉन्स्टिट्यूटिव MPSV प्रमोटर (LV-LacZ) द्वारा संचालित न्यूक्लियर-लोकेलाइज़्ड बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ जीन को व्यक्त करता है, जो ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में एक नीला प्रतिक्रिया उत्पाद उत्पन्न करता है, जो फेफड़े के ऊतक के अग्रभागों और ऊतक अनुभागों में दिखाई देता है। कोशिका संवर्धनों में टाइट्रेशन, हेमोसाइटोमीटर से LacZ पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को मैन्युअल रूप से गिनकर TU/ml में टाइटर की गणना करने के लिए किया गया था। वाहकों को -80 °C पर क्रायोप्रिजर्व किया जाता है, उपयोग से पहले पिघलाया जाता है, और 1:1 अनुपात में मिलाकर और डिलीवरी से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करके CombiMag से बांधा जाता है।
सामान्य स्प्रैग डॉली चूहों (n = 3/समूह, लगभग 2-3 महीने पुराने) को 0.4 मिलीग्राम/किलोग्राम मेडेटोमिडीन (डोमिटर, इलियम, ऑस्ट्रेलिया) और 60 मिलीग्राम/किलोग्राम केटामाइन (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) के मिश्रण के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से एनेस्थीसिया दिया गया और 16 Ga इंट्रावेनस कैनुला के साथ गैर-सर्जिकल ओरल कैनुलेशन किया गया। यह सुनिश्चित करने के लिए कि श्वासनली वायुमार्ग ऊतक को एलवी ट्रांसडक्शन प्राप्त हो, इसे हमारे पहले वर्णित यांत्रिक गड़बड़ी प्रोटोकॉल का उपयोग करके कंडीशन किया गया था, जिसमें श्वासनली वायुमार्ग की सतह को एक तार की टोकरी (एन-सर्कल, नाइट्रिनोल टिपलेस स्टोन एक्सट्रैक्टर NTSE-022115 -UDH, कुक मेडिकल, यूएसए) के साथ अक्षीय रूप से 30 सेकंड 28 तक रगड़ा गया था। गड़बड़ी के लगभग 10 मिनट बाद एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एलवी-एमपी का श्वासनली प्रशासन किया गया।
इस प्रयोग में प्रयुक्त चुंबकीय क्षेत्र को इन विवो एक्स-रे इमेजिंग अध्ययन के समान ही कॉन्फ़िगर किया गया था, जिसमें आसवन स्टेंट क्लिप का उपयोग करके श्वासनली के ऊपर समान चुंबक रखे गए थे (चित्र 4)। 50 μl आयतन (2 × 25 μl एलिक्वोट) LV-MP को पहले वर्णित विधि के अनुसार जेल टिप वाले पिपेट का उपयोग करके श्वासनली में पहुँचाया गया (n = 3 जानवर)। एक नियंत्रण समूह (n = 3 जानवर) को चुंबक के उपयोग के बिना समान LV-MP दिए गए। जलसेक पूरा होने के बाद, कैनुला को ET ट्यूब से हटा दिया गया और जानवर को एक्सट्यूबेट कर दिया गया। चुंबक 10 मिनट तक अपनी जगह पर रहा, फिर उसे हटा दिया गया। चूहों को मेलॉक्सिकैम (1 मिली/किग्रा) (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) की सबक्यूटेनियस खुराक दी गई, जिसके बाद 1 मिलीग्राम/किग्रा एटिपामाज़ोल हाइड्रोक्लोराइड (एंटीसेडान, ज़ोएटिस, ऑस्ट्रेलिया) के आईपी इंजेक्शन द्वारा एनेस्थीसिया को उलट दिया गया। चूहों को गर्म रखा गया। और एनेस्थीसिया से पूरी तरह ठीक होने तक उनकी निगरानी की गई।
एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में LV-MP डिलीवरी डिवाइस। ET ट्यूब का हल्का ग्रे ल्यूर हब मुंह से बाहर निकला हुआ दिखाई दे रहा है और चित्र में दिखाए गए पिपेट का जेल टिप ET ट्यूब के माध्यम से श्वासनली में वांछित गहराई तक डाला गया है।
LV-MP खुराक देने की प्रक्रिया के एक सप्ताह बाद, जानवरों को 100% CO2 साँस द्वारा मानवीय तरीके से मार दिया गया और हमारे मानक X-gal उपचार का उपयोग करके LacZ अभिव्यक्ति का आकलन किया गया। विश्लेषण में एंडोट्रैकियल ट्यूब लगाने से होने वाली किसी भी यांत्रिक क्षति या द्रव प्रतिधारण को शामिल न करने के लिए, सबसे पीछे की तीन उपास्थि वलय हटा दी गईं। विश्लेषण के लिए प्रत्येक श्वासनली को अनुदैर्ध्य रूप से काटकर दो भाग बनाए गए, और उन्हें एक मिनुटियन सुई (फाइन साइंस टूल्स) का उपयोग करके सिलिकॉन रबर (सिल्गार्ड, डॉव इंक) युक्त एक डिश में लगाया गया ताकि आंतरिक सतह को देखा जा सके। ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के वितरण और पैटर्न की पुष्टि एक निकॉन माइक्रोस्कोप (SMZ1500) का उपयोग करके सामने से ली गई तस्वीरों द्वारा की गई, जिसमें एक डिजीलाइट कैमरा और टीकैप्चर सॉफ्टवेयर (टक्सन फोटोनिक्स, चीन) लगा हुआ था। छवियों को 20 गुना आवर्धन पर प्राप्त किया गया (जिसमें श्वासनली की पूरी चौड़ाई के लिए उच्चतम सेटिंग शामिल है), श्वासनली की पूरी लंबाई को चरण-दर-चरण चित्रित किया गया, जिससे पर्याप्त ओवरलैप सुनिश्चित हो सके। प्रत्येक छवि को "स्टिचिंग" के लिए अलग-अलग किया गया। प्रत्येक श्वासनली से प्राप्त छवियों को इमेज कम्पोजिट एडिटर v2.0.3 (माइक्रोसॉफ्ट रिसर्च) का उपयोग करके एक समतल गति एल्गोरिदम के साथ एक एकल समग्र छवि में संयोजित किया गया। प्रत्येक जानवर की श्वासनली की समग्र छवियों में LacZ अभिव्यक्ति क्षेत्रों को पहले वर्णित अनुसार एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके मापा गया, जिसमें 0.35 < ह्यू < 0.58, संतृप्ति > 0.15 और मान < 0.7 की सेटिंग्स का उपयोग किया गया। ऊतक की रूपरेखा का पता लगाकर, ऊतक क्षेत्र की पहचान करने और श्वासनली के ऊतक के बाहर से किसी भी गलत पहचान को रोकने के लिए प्रत्येक समग्र छवि के लिए GIMP v2.10.24 में मैन्युअल रूप से एक मास्क बनाया गया। प्रत्येक जानवर की सभी समग्र छवियों से रंगे हुए क्षेत्रों को जोड़कर उस जानवर के लिए कुल रंगे हुए क्षेत्र को प्राप्त किया गया। फिर रंगे हुए क्षेत्र को कुल मास्क क्षेत्र से विभाजित करके सामान्यीकृत क्षेत्र प्राप्त किया गया।
प्रत्येक श्वासनली को पैराफिन में समाहित किया गया और 5 μm के खंड काटे गए। खंडों को 5 मिनट के लिए न्यूट्रल फास्ट रेड से प्रतिरंजित किया गया और निकॉन एक्लिप्स E400 माइक्रोस्कोप, DS-Fi3 कैमरा और NIS एलिमेंट कैप्चर सॉफ्टवेयर (संस्करण 5.20.00) का उपयोग करके छवियां प्राप्त की गईं।
सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म v9 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, इंक.) में किए गए। सांख्यिकीय सार्थकता का स्तर p ≤ 0.05 निर्धारित किया गया। सामान्यता की पुष्टि शापिरो-विल्क परीक्षण का उपयोग करके की गई, और LacZ स्टेनिंग में अंतर का आकलन अनपेयर्ड t-परीक्षण का उपयोग करके किया गया।
तालिका 1 में वर्णित छह माइक्रोप्लास्टिक कणों (एमपी) की जांच पीसीएक्सआई का उपयोग करके की गई, और दृश्यता का विवरण तालिका 2 में दिया गया है। दो पॉलीस्टाइरीन माइक्रोप्लास्टिक कण (एमपी1 और एमपी2; क्रमशः 18 μm और 0.25 μm) पीसीएक्सआई के तहत दिखाई नहीं दे रहे थे, लेकिन बाकी नमूने पहचानने योग्य थे (उदाहरण चित्र 5 में दिखाए गए हैं)। एमपी3 और एमपी4 (10-15% Fe3O4; क्रमशः 0.25 μm और 0.9 μm) धुंधले रूप से दिखाई दे रहे थे। हालांकि परीक्षण किए गए सबसे छोटे कणों में से कुछ को समाहित करने के बावजूद, एमपी5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) सबसे अधिक स्पष्ट था। कॉम्बीमैग उत्पाद एमपी6 को पहचानना मुश्किल है। सभी मामलों में, चुंबक को केशिका के समानांतर आगे-पीछे स्थानांतरित करने से माइक्रोप्लास्टिक कणों का पता लगाने की हमारी क्षमता में काफी वृद्धि हुई। जब चुंबक केशिका से दूर चले गए, तो कण लंबी कतारों में फैल गए, लेकिन जैसे-जैसे चुंबक करीब आते गए और चुंबकीय क्षेत्र की शक्ति बढ़ती गई, कण कम दिखाई देने लगे। कणों के केशिका की ऊपरी सतह की ओर बढ़ने पर कणों की श्रृंखला छोटी हो जाती है (पूरक वीडियो S1: MP4 देखें), जिससे सतह पर कणों का घनत्व बढ़ जाता है। इसके विपरीत, जब चुंबक को केशिका से हटा दिया जाता है, तो क्षेत्र की तीव्रता कम हो जाती है और चुंबकीय कण केशिका की ऊपरी सतह से फैली लंबी श्रृंखलाओं में पुनर्व्यवस्थित हो जाते हैं (पूरक वीडियो S2: MP4 देखें)। चुंबक के रुकने के बाद, कण संतुलन स्थिति में पहुँचने के बाद भी कुछ समय तक गतिमान रहते हैं। जैसे-जैसे चुंबकीय कण केशिका की ऊपरी सतह की ओर और उससे दूर गति करते हैं, वे आमतौर पर मलबे को द्रव में खींचते हुए आगे बढ़ते हैं।
PCXI के अंतर्गत MP की दृश्यता नमूनों के बीच काफी भिन्न होती है। (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 और (d) MP6। यहाँ दिखाए गए सभी चित्र केशिका के ठीक ऊपर लगभग 10 मिमी की दूरी पर स्थित चुंबक से लिए गए हैं। दिखाई देने वाले बड़े वृत्त केशिकाओं में फँसे वायु के बुलबुले हैं, जो फेज कंट्रास्ट इमेजिंग की काली और सफेद किनारों की विशेषताओं को स्पष्ट रूप से दर्शाते हैं। लाल बॉक्स में कंट्रास्ट बढ़ाने वाला आवर्धन दर्शाया गया है। ध्यान दें कि सभी चित्रों में चुंबक आरेखों के व्यास वास्तविक पैमाने के अनुसार नहीं हैं और दिखाए गए व्यास से लगभग 100 गुना बड़े हैं।
जैसे ही चुंबक को केशिका के शीर्ष पर बाएँ और दाएँ स्थानांतरित किया जाता है, एमपी स्ट्रिंग का कोण चुंबक के साथ संरेखित होने के लिए बदल जाता है (चित्र 6 देखें), इस प्रकार चुंबकीय क्षेत्र रेखाओं को स्पष्ट किया जाता है। एमपी3-5 के लिए, कॉर्ड के एक सीमा कोण तक पहुँचने के बाद, कण केशिका की ऊपरी सतह पर खिंच जाते हैं। इसके परिणामस्वरूप अक्सर एमपी चुंबकीय क्षेत्र के सबसे मजबूत बिंदु के पास बड़े समूहों में एकत्रित हो जाते हैं (पूरक वीडियो S3: एमपी5 देखें)। यह विशेष रूप से केशिका के सिरे के पास इमेजिंग करते समय स्पष्ट होता है, जिससे एमपी द्रव-वायु इंटरफ़ेस पर एकत्रित और केंद्रित हो जाते हैं। एमपी6 में कण, जिन्हें एमपी3-5 की तुलना में पहचानना अधिक कठिन था, चुंबक के केशिका के साथ चलने पर नहीं खिंचे, बल्कि एमपी स्ट्रिंग अलग हो गए, जिससे कण दृश्य क्षेत्र में रह गए (पूरक वीडियो S4: एमपी6 देखें)। कुछ मामलों में, जब इमेजिंग स्थान से चुंबक को बहुत दूर ले जाकर लागू चुंबकीय क्षेत्र को कम किया गया, तो कोई भी शेष एमपी स्ट्रिंग में रहते हुए गुरुत्वाकर्षण द्वारा धीरे-धीरे ट्यूब की निचली सतह पर उतर गए (पूरक वीडियो देखें)। S5: एमपी3).
कैपिलरी के ऊपर चुंबक को दाईं ओर खिसकाने पर एमपी स्ट्रिंग का कोण बदल जाता है। (a) एमपी3, (b) एमपी4, (c) एमपी5 और (d) एमपी6। लाल बॉक्स में कंट्रास्ट बढ़ाने वाला आवर्धन दिखाया गया है। ध्यान दें कि पूरक वीडियो जानकारीपूर्ण हैं क्योंकि वे महत्वपूर्ण कण संरचना और गतिशील जानकारी प्रकट करते हैं जो इन स्थिर छवियों में दिखाई नहीं देती हैं।
हमारे परीक्षणों से पता चला कि श्वासनली के साथ चुंबक को धीरे-धीरे आगे-पीछे करने से जीवित अवस्था में जटिल गति के संदर्भ में एमपी को देखना आसान हो जाता है। जीवित अवस्था में परीक्षण नहीं किया गया क्योंकि पॉलीस्टायरीन बीड्स (एमपी1 और एमपी2) केशिका में दिखाई नहीं दे रहे थे। शेष चार एमपी में से प्रत्येक का जीवित अवस्था में परीक्षण चुंबक की लंबी धुरी को श्वासनली के ऊपर लगभग 30° के कोण पर रखकर किया गया (चित्र 2b और 3a देखें), क्योंकि इससे एमपी श्रृंखलाएं लंबी हो गईं और यह चुंबक की सीमित स्थिति की तुलना में अधिक प्रभावी था। एमपी3, एमपी4 और एमपी6 किसी भी जीवित जानवर की श्वासनली में नहीं पाए गए। जानवरों को मानवीय तरीके से मारने के बाद जब चूहों के वायुमार्ग की इमेजिंग की गई, तो सिरिंज पंप का उपयोग करके अतिरिक्त मात्रा डालने पर भी कण अदृश्य रहे। एमपी5 में आयरन ऑक्साइड की मात्रा सबसे अधिक थी और यह एकमात्र दिखाई देने वाला कण था, इसलिए इसका उपयोग एमपी के जीवित अवस्था में व्यवहार का आकलन और लक्षण वर्णन करने के लिए किया गया।
एमपी डिलीवरी के दौरान श्वासनली के ऊपर चुंबक रखने से कई एमपी कण दृश्य क्षेत्र में केंद्रित हो गए, लेकिन सभी नहीं। श्वासनली में प्रवेश करने वाले कणों को मानवीय रूप से बलि दिए गए जानवरों में सबसे अच्छी तरह देखा जा सकता है। चित्र 7 और पूरक वीडियो S6: एमपी5 श्वासनली के उदर भाग की सतह पर कणों के तीव्र चुंबकीय पकड़ और संरेखण को दर्शाता है, जिससे पता चलता है कि एमपी कणों को श्वासनली के वांछित क्षेत्रों में निर्देशित किया जा सकता है। एमपी डिलीवरी के बाद श्वासनली के साथ अधिक दूर तक खोज करने पर, कुछ एमपी कण कैरिना के करीब पाए गए, जिससे पता चलता है कि चुंबकीय क्षेत्र की शक्ति सभी एमपी कणों को एकत्र करने और बनाए रखने के लिए अपर्याप्त थी, क्योंकि वे द्रव प्रक्रिया के दौरान अधिकतम चुंबकीय क्षेत्र शक्ति वाले क्षेत्र से होकर गुजरे थे। फिर भी, प्रसवोत्तर एमपी सांद्रता चित्रित क्षेत्र के आसपास अधिक थी, जिससे पता चलता है कि कई एमपी कण वायुमार्ग के उन क्षेत्रों में रह गए जहां लागू चुंबकीय क्षेत्र की शक्ति सबसे अधिक थी।
(a) MP5 को श्वासनली में डालने से पहले और (b) MP5 डालने के बाद की छवियां, जिसमें चुंबक को इमेजिंग क्षेत्र के ठीक ऊपर रखा गया है। इमेजिंग क्षेत्र दो उपास्थि वलयों के बीच स्थित है। MP5 डालने से पहले, वायुमार्ग में कुछ तरल पदार्थ मौजूद है। लाल बॉक्स में कंट्रास्ट बढ़ाने वाला आवर्धन दिखाया गया है। ये छवियां पूरक वीडियो S6:MP5 में दिखाए गए वीडियो से ली गई हैं।
जीवित शरीर में श्वासनली के अनुदिश चुंबक को स्थानांतरित करने से वायुमार्ग की सतह के भीतर एमपी श्रृंखला का कोण उसी प्रकार बदल गया जैसा कि केशिकाओं में देखा जाता है (चित्र 8 और पूरक वीडियो S7:MP5 देखें)। हालांकि, हमारे अध्ययन में, एमपी कणों को जीवित वायुमार्ग की सतह पर उस प्रकार नहीं खींचा जा सका जैसे वे केशिकाओं में खींचे जा सकते थे। कुछ मामलों में, चुंबक के बाएं और दाएं जाने पर एमपी श्रृंखला लंबी हो जाती है। रोचक बात यह है कि हमने यह भी पाया कि जब चुंबक को श्वासनली के अनुदिश अनुदैर्ध्य रूप से स्थानांतरित किया जाता है तो कणों की श्रृंखला सतह के तरल परत की गहराई को बदलती हुई प्रतीत होती है, और जब चुंबक को सीधे ऊपर ले जाया जाता है और कणों की श्रृंखला को ऊर्ध्वाधर स्थिति में घुमाया जाता है तो यह फैलती है (पूरक वीडियो S7 देखें)। (0:09 पर MP5, नीचे दाईं ओर देखें)। जब चुंबक को श्वासनली के ऊपरी भाग पर पार्श्व रूप से (अर्थात, श्वासनली की लंबाई के साथ नहीं बल्कि जानवर के बाईं या दाईं ओर) स्थानांतरित किया गया, तो गति का विशिष्ट पैटर्न बदल गया। कण गति करते समय स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, लेकिन जब चुंबक को श्वासनली से हटा दिया गया, तो कणों की कड़ियों के सिरे दिखाई देने लगे (पूरक वीडियो S8:MP5 देखें, 0:08 से शुरू)। यह कांच की केशिका में लगाए गए चुंबकीय क्षेत्र के तहत हमने जो MP व्यवहार देखा था, उसके अनुरूप है।
उदाहरण चित्र एक जीवित, बेहोश चूहे की श्वासनली में MP5 को दर्शाते हैं। (a) चुंबक का उपयोग श्वासनली के ऊपर और बाईं ओर के चित्र प्राप्त करने के लिए किया जाता है, फिर (b) चुंबक को दाईं ओर ले जाने के बाद के चित्र। लाल बॉक्स में कंट्रास्ट बढ़ाने वाला आवर्धन दिखाया गया है। ये चित्र पूरक वीडियो S7:MP5 में दिखाए गए वीडियो से लिए गए हैं।
जब दोनों ध्रुवों को श्वासनली के ऊपर और नीचे उत्तर-दक्षिण दिशा में व्यवस्थित किया गया (अर्थात आकर्षित करते हुए; चित्र 3b), तो एमपी कॉर्ड लंबी दिखाई दीं और श्वासनली की पृष्ठीय सतह के बजाय उसकी पार्श्व दीवार पर स्थित थीं (पूरक वीडियो S9:MP5 देखें)। हालांकि, जब दोहरे चुंबक वाले उपकरण का उपयोग किया गया, तो द्रव देने के बाद किसी एक स्थान (अर्थात श्वासनली की पृष्ठीय सतह) पर कणों की उच्च सांद्रता का पता नहीं चला, जो आमतौर पर एकल चुंबक वाले उपकरण के उपयोग में होता है। फिर जब एक चुंबक को प्रतिकर्षित करने के लिए विपरीत ध्रुवों के साथ व्यवस्थित किया गया (चित्र 3c), तो द्रव देने के बाद दृश्य क्षेत्र में दिखाई देने वाले कणों की संख्या में वृद्धि नहीं हुई। दोनों दोहरे चुंबक विन्यासों की स्थापना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि चुंबकीय क्षेत्र की ताकतें क्रमशः चुंबकों को खींचती या धकेलती हैं। फिर सेटअप को एक एकल चुंबक में बदल दिया गया जो वायुमार्ग के समानांतर था लेकिन वायुमार्ग से 90 डिग्री के कोण पर गुजर रहा था ताकि क्षेत्र रेखाएं श्वासनली की दीवार को लंबवत रूप से पार कर सकें। (चित्र 3डी), एक ऐसा अभिविन्यास जिसे पार्श्व दीवार पर कणों के एकत्रीकरण का अवलोकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। हालाँकि, इस विन्यास में, एमपी संचय या चुंबक की गति का कोई पहचानने योग्य संचलन नहीं था। इन सभी परिणामों के आधार पर, इन विवो जीन वाहक अध्ययनों के लिए एक एकल-चुंबक, 30-डिग्री अभिविन्यास विन्यास (चित्र 3ए) का चयन किया गया।
जब पशु को मानवीय तरीके से मारने के तुरंत बाद बार-बार इमेजिंग की गई, तो ऊतकों की गति के अवरोध की अनुपस्थिति से यह स्पष्ट हो गया कि स्पष्ट अंतरकोन्द्रल क्षेत्र में महीन और छोटी कण रेखाओं को चुंबक की स्थानांतरीय गति के अनुरूप "डगमगाते" हुए देखा जा सकता था। फिर भी, एमपी6 कणों की उपस्थिति और गति को स्पष्ट रूप से नहीं देखा जा सका।
LV-LacZ का टाइटर 1.8 × 108 TU/ml था, और CombiMag MP (MP6) के साथ 1:1 मिश्रण के बाद, जानवरों को 9 × 107 TU/ml LV वाहन (यानी 4.5 × 106 TU/चूहा) की 50 μl श्वासनली खुराक दी गई। इन अध्ययनों में, प्रसव के दौरान चुंबक को स्थानांतरित करने के बजाय, हमने चुंबक को एक ही स्थिति में स्थिर रखा ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या LV ट्रांसडक्शन (a) चुंबकीय क्षेत्र की अनुपस्थिति में वेक्टर डिलीवरी की तुलना में बेहतर हो सकता है, और (b) ऊपरी वायुमार्ग के चुंबकीय लक्ष्य क्षेत्रों में वायुमार्ग कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस किया जा सकता है।
चुंबकों की उपस्थिति और एलवी वैक्टर के साथ कॉम्बीमैग के उपयोग से पशु स्वास्थ्य पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं पड़ा, जैसा कि हमारे मानक एलवी वेक्टर वितरण प्रोटोकॉल में देखा गया था। यांत्रिक व्यवधान के अधीन श्वासनली क्षेत्र की सामने से ली गई छवियों (पूरक चित्र 1) से पता चला कि चुंबक की उपस्थिति में एलवी-एमपी से उपचारित पशुओं के समूह में ट्रांसडक्शन का स्तर काफी अधिक था (चित्र 9ए)। नियंत्रण समूह में केवल थोड़ी मात्रा में नीला लैकजेड दाग मौजूद था (चित्र 9बी)। सामान्यीकृत एक्स-गैल दाग वाले क्षेत्रों के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला कि चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में एलवी-एमपी देने से लगभग 6 गुना सुधार हुआ (चित्र 9सी)।
उदाहरण के तौर पर, चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में (a) और चुंबक की अनुपस्थिति में (b) LV-MP द्वारा श्वासनली में होने वाले ट्रांसडक्शन को दर्शाने वाली मिश्रित छवियां। (c) चुंबक का उपयोग करने पर श्वासनली के भीतर सामान्यीकृत LacZ ट्रांसडक्शन क्षेत्र में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण सुधार (*p = 0.029, t-परीक्षण, प्रति समूह n = 3, माध्य ± SEM)।
न्यूट्रल फास्ट रेड से रंगे हुए सेक्शन (उदाहरण सप्लीमेंट्री फिगर 2 में दिखाया गया है) में LacZ से रंगे हुए सेल पहले की रिपोर्ट के समान पैटर्न और स्थान पर मौजूद थे।
वायुमार्ग जीन थेरेपी के लिए एक प्रमुख चुनौती वाहक कणों को लक्षित क्षेत्रों में सटीक रूप से पहुंचाना और वायु प्रवाह और सक्रिय बलगम निकासी की उपस्थिति में गतिशील फेफड़े में उच्च स्तर की ट्रांसडक्शन दक्षता प्राप्त करना है। सीएफ वायुमार्ग रोग के उपचार के लिए डिज़ाइन किए गए एलवी वाहकों के लिए, संवाहक वायुमार्गों के भीतर वाहक कणों के निवास समय को बढ़ाना अब तक एक मायावी लक्ष्य रहा है। जैसा कि कैस्टेलानी एट अल. ने बताया है, ट्रांसडक्शन को बेहतर बनाने के लिए चुंबकीय क्षेत्रों का उपयोग इलेक्ट्रोपोरेशन जैसी अन्य जीन वितरण विधियों की तुलना में लाभप्रद है, क्योंकि यह सरलता, लागत-प्रभावशीलता, वितरण स्थानीयकरण, बढ़ी हुई दक्षता और कम ऊष्मायन समय को संयोजित कर सकता है, और संभवतः एक छोटी वाहक खुराक की आवश्यकता होती है।10 हालांकि, बाहरी चुंबकीय बलों के प्रभाव में वायुमार्गों में चुंबकीय कणों के इन विवो जमाव और व्यवहार का कभी वर्णन नहीं किया गया है, न ही वास्तव में इस विधि की व्यवहार्यता को बरकरार जीवित वायुमार्गों में जीन अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाने के लिए इन विवो में प्रदर्शित किया गया है।
हमारे इन विट्रो सिंक्रोट्रॉन पीसीएक्सआई प्रयोगों से पता चला कि पॉलीस्टाइरीन एमपी को छोड़कर, हमारे द्वारा परीक्षण किए गए सभी कण हमारे द्वारा उपयोग किए गए इमेजिंग सेटअप में दिखाई दे रहे थे। चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में, एमपी स्ट्रिंग बनाते हैं जिनकी लंबाई कण के प्रकार और चुंबकीय क्षेत्र की शक्ति (अर्थात चुंबक की निकटता और गति) से संबंधित होती है। जैसा कि चित्र 10 में दिखाया गया है, हमारे द्वारा देखी गई स्ट्रिंग प्रत्येक कण के चुम्बकित होने और अपना स्थानीय चुंबकीय क्षेत्र उत्पन्न करने के कारण बनती हैं। ये अलग-अलग क्षेत्र अन्य समान कणों को एकत्रित होने और जुड़ने का कारण बनते हैं, जिससे अन्य कणों के स्थानीय आकर्षण और प्रतिकर्षण बलों के कारण समूह स्ट्रिंग जैसी गति होती है।
चित्र (a,b) में द्रव से भरी केशिकाओं के अंदर उत्पन्न कणों की श्रृंखला और (c,d) में वायु से भरी श्वासनली को दर्शाया गया है। ध्यान दें कि केशिकाओं और श्वासनली को पैमाने के अनुसार नहीं दर्शाया गया है। पैनल (a) में एमपी का विवरण भी है, जिसमें Fe3O4 कण एक पंक्ति में व्यवस्थित हैं।
जब चुंबक को केशिका के ऊपर ले जाया गया, तो Fe3O4 युक्त MP3-5 के लिए कण स्ट्रिंग का कोण एक महत्वपूर्ण सीमा तक पहुँच गया, जिसके बाद कण स्ट्रिंग अपनी मूल स्थिति में नहीं रुकी, बल्कि सतह के साथ-साथ एक नई स्थिति में चली गई। यह प्रभाव संभवतः इसलिए हुआ क्योंकि कांच की केशिका की सतह इतनी चिकनी है कि यह गति संभव हो पाती है। दिलचस्प बात यह है कि MP6 (कॉम्बीमैग) ने ऐसा व्यवहार नहीं किया, संभवतः इसलिए क्योंकि कण छोटे थे, उन पर अलग-अलग कोटिंग या सतह आवेश थे, या किसी विशेष वाहक द्रव ने उनकी गति करने की क्षमता को प्रभावित किया था। कॉम्बीमैग कणों का छवि कंट्रास्ट भी कमजोर है, जिससे पता चलता है कि द्रव और कणों का घनत्व समान हो सकता है और इसलिए वे आसानी से एक दूसरे की ओर नहीं बढ़ पाते। यदि चुंबक बहुत तेजी से चलता है तो कण फंस भी सकते हैं, यह दर्शाता है कि चुंबकीय क्षेत्र की शक्ति हमेशा द्रव में कणों के बीच घर्षण को दूर नहीं कर पाती है, जिससे यह पता चलता है कि शायद यह आश्चर्य की बात नहीं है कि चुंबकीय क्षेत्र की शक्ति और चुंबक तथा लक्ष्य क्षेत्र के बीच की दूरी बहुत महत्वपूर्ण हैं। कुल मिलाकर, ये परिणाम यह भी बताते हैं कि, हालांकि चुंबक लक्ष्य क्षेत्र से बहने वाले कई MP को पकड़ सकते हैं, इस बात की संभावना कम है कि श्वासनली की सतह पर कॉम्बीमैग कणों को स्थानांतरित करने के लिए चुम्बकों पर भरोसा किया जा सके। इसलिए, हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि इन विवो एलवी-एमपी अध्ययनों में वायुमार्ग वृक्ष के विशिष्ट क्षेत्रों को भौतिक रूप से लक्षित करने के लिए स्थिर चुंबकीय क्षेत्रों का उपयोग किया जाना चाहिए।
जब कण शरीर में प्रवेश करते हैं, तो जटिल गतिशील शारीरिक ऊतकों के संदर्भ में उनकी पहचान करना कठिन होता है, लेकिन श्वासनली के ऊपर चुंबक को क्षैतिज रूप से स्थानांतरित करके एमपी स्ट्रिंग्स को "हिलाने" से उनकी पहचान करने की क्षमता में वृद्धि हुई। यद्यपि लाइव इमेजिंग संभव है, लेकिन जानवर को मानवीय तरीके से मारने के बाद कणों की गति को समझना आसान होता है। इमेजिंग क्षेत्र के ऊपर चुंबक की स्थिति में एमपी सांद्रता आमतौर पर इस स्थान पर सबसे अधिक थी, हालांकि कुछ कण आमतौर पर श्वासनली में आगे भी पाए गए। इन विट्रो अध्ययनों के विपरीत, चुंबक को स्थानांतरित करने से कणों को श्वासनली के साथ नहीं खींचा जा सकता है। यह निष्कर्ष इस बात से मेल खाता है कि श्वासनली की सतह को ढकने वाला बलगम आमतौर पर साँस द्वारा लिए गए कणों को कैसे संसाधित करता है, उन्हें बलगम में फंसा लेता है और बाद में श्लेष्मा-सिलियरी क्लीयरेंस तंत्र द्वारा साफ कर देता है।
हमने परिकल्पना की थी कि श्वासनली के ऊपर और नीचे आकर्षण के लिए चुम्बकों का उपयोग (चित्र 3b) एक बिंदु पर अत्यधिक केंद्रित चुंबकीय क्षेत्र के बजाय अधिक समान चुंबकीय क्षेत्र उत्पन्न कर सकता है, जिससे कणों का अधिक समान वितरण संभव हो सकता है। हालांकि, हमारे प्रारंभिक अध्ययन में इस परिकल्पना का समर्थन करने वाला कोई स्पष्ट प्रमाण नहीं मिला। इसी प्रकार, दो चुम्बकों को प्रतिकर्षित करने के लिए व्यवस्थित करने (चित्र 3c) से भी चित्रित क्षेत्र में कणों का अधिक निक्षेपण नहीं हुआ। ये दोनों निष्कर्ष दर्शाते हैं कि दोहरे चुम्बक सेटअप से माइक्रोप्लास्टिक लक्ष्यीकरण के स्थानीय नियंत्रण में कोई खास सुधार नहीं होता है, और परिणामस्वरूप उत्पन्न होने वाले प्रबल चुंबकीय बलों को व्यवस्थित करना कठिन है, जिससे यह दृष्टिकोण कम व्यावहारिक हो जाता है। इसी प्रकार, चुंबक को श्वासनली के ऊपर और उसके माध्यम से रखने (चित्र 3d) से भी चित्रित क्षेत्र में रखे गए कणों की संख्या में वृद्धि नहीं हुई। इनमें से कुछ वैकल्पिक विन्यास सफल नहीं हो सकते हैं क्योंकि इनके परिणामस्वरूप निक्षेपण क्षेत्र में चुंबकीय क्षेत्र की शक्ति कम हो जाती है। इसलिए, एकल 30-डिग्री कोण चुंबक विन्यास (चित्र 3a) को माइक्रोप्लास्टिक लक्ष्यीकरण के लिए सबसे आसान और सबसे कुशल विधि माना जाता है। जीवित अवस्था में परीक्षण।
LV-MP अध्ययन से पता चला कि जब LV वैक्टर को CombiMag के साथ मिलाकर चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में भौतिक व्यवधान के बाद पहुँचाया गया, तो नियंत्रण की तुलना में श्वासनली में ट्रांसडक्शन स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग अध्ययनों और LacZ परिणामों के आधार पर, चुंबकीय क्षेत्र स्पष्ट रूप से श्वासनली के भीतर LV को संरक्षित करने और फेफड़ों में गहराई तक प्रवेश करने वाले वेक्टर कणों की संख्या को कम करने में सक्षम था। इस प्रकार के लक्षित सुधारों से उच्च प्रभावकारिता प्राप्त हो सकती है, साथ ही वितरित टाइटर्स, ऑफ-टारगेट ट्रांसडक्शन, सूजन और प्रतिरक्षा संबंधी दुष्प्रभावों और जीन वाहक लागत में कमी आ सकती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि निर्माता के अनुसार, CombiMag का उपयोग अन्य जीन स्थानांतरण विधियों के साथ किया जा सकता है, जिसमें अन्य वायरल वैक्टर (जैसे AAV) और न्यूक्लिक एसिड शामिल हैं।