Nature.com پر جانے کے لیے آپ کا شکریہ۔ آپ جو براؤزر ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے CSS کے لیے محدود سپورٹ حاصل ہے۔ بہترین تجربہ کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں کمپیٹیبلٹی موڈ آف کر دیں)۔ اس دوران، مسلسل سپورٹ کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائلز اور جاوا اسکرپٹ کے ڈسپلے کریں گے۔
سسٹک فائبروسس پھیپھڑوں کی بیماری کے علاج کے لیے جین ویکٹرز کو چلانے والی ایئر ویز کو نشانہ بنانا چاہیے کیونکہ پیریفیرل پھیپھڑوں کی نقل و حمل سے علاج معالجہ کا فائدہ نہیں ہوتا ہے۔ وائرل ٹرانزیکشن کی کارکردگی کا براہ راست تعلق ویکٹر کے رہائش کے وقت سے ہوتا ہے۔ تاہم، ڈیلیوری سیال جیسے جین کیریئرز قدرتی طور پر پھیلتے ہیں اور الیوولی کے کسی بھی حصے کے ذریعے صاف ہوتے ہیں۔ mucociliary transport.Airways میں جین کیریئرز کے قیام کے وقت کو طول دینا اہم ہے لیکن حاصل کرنا مشکل ہے۔ جین کیریئر سے منسلک مقناطیسی ذرات جو ایئر ویز کی سطح کی طرف لے جاسکتے ہیں علاقائی ہدف کو بہتر بنا سکتے ہیں۔ Vivo ویژولائزیشن کے چیلنجوں کی وجہ سے، ایسے چھوٹے مقناطیسی ذرات کا استعمال ہوا کے راستے میں مقناطیسی ذرات کی ناقص موجودگی کو سمجھا جاتا ہے۔ اس مطالعے کا مقصد ویوو میں انفرادی اور بلک پارٹیکل رویے کی حرکیات اور نمونوں کی جانچ کرنے کے لیے اینستھیٹائزڈ چوہوں کی ٹریچیا میں مقناطیسی ذرات کی ایک سیریز کی ویوو موشن کو دیکھنے کے لیے سنکروٹرون امیجنگ کا استعمال کرنا تھا۔ پھر ہم نے یہ بھی جائزہ لیا کہ آیا لینٹی وائرل کی ترسیل مقناطیسی فیلڈ میں ٹرانسمیشن کی موجودگی کو بڑھا سکتی ہے۔ rat trachea.Synchrotron X-ray امیجنگ وٹرو اور vivo میں سٹیشنری اور حرکت پذیر مقناطیسی فیلڈز میں مقناطیسی ذرات کے رویے کو ظاہر کرتی ہے۔ ذرات کو میگنےٹ کے ساتھ زندہ ایئر وے کی سطح کے ساتھ آسانی سے نہیں گھسیٹا جا سکتا، لیکن نقل و حمل کے دوران، ذخائر نقطہ نظر کے میدان میں مرکوز ہوتے ہیں جہاں مقناطیسی فیلڈ میں بھی زیادہ مضبوطی ہوتی ہے۔ lentiviral مقناطیسی ذرات مقناطیسی میدان کی موجودگی میں فراہم کیے گئے تھے۔ ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ lentiviral مقناطیسی ذرات اور مقناطیسی فیلڈز جین ویکٹر کے ہدف کو بہتر بنانے اور Vivo میں ایئر ویز کو چلانے میں نقل و حمل کی سطح کو بڑھانے کے لیے قابل قدر نقطہ نظر ہو سکتے ہیں۔
سسٹک فائبروسس (CF) ایک جین میں تغیر کی وجہ سے ہوتا ہے جسے CF ٹرانس میبرن کنڈکٹنس ریگولیٹر (CFTR) کہا جاتا ہے۔ CFTR پروٹین ایک آئن چینل ہے جو پورے جسم کے بہت سے اپکلا خلیوں میں موجود ہوتا ہے، بشمول کنڈکٹنگ ایئر ویز، CF روگجنن کی ایک بڑی جگہ۔ ایئر وے کی سطح مائع (اے ایس ایل) کی تہہ۔ یہ میوکوکیلیری ٹرانسپورٹ (ایم سی ٹی) سسٹم کی ایئر ویز سے سانس لینے والے ذرات اور پیتھوجینز کو صاف کرنے کی صلاحیت کو بھی متاثر کرتا ہے۔ ہمارا مقصد ایک لینٹیو وائرل (ایل وی) جین تھراپی تیار کرنا ہے تاکہ سی ایف ٹی آر جین کی صحیح کاپی فراہم کی جاسکے اور اے ایس ایل، ایم سی ٹی، اور کیپنگ کی نئی صحت کو بہتر بنایا جاسکے۔ vivo1 میں یہ پیرامیٹرز۔
LV ویکٹر CF ایئر وے جین تھراپی کے لیے سرکردہ امیدواروں میں سے ایک ہیں، بنیادی طور پر اس لیے کہ وہ علاج کے جین کو ایئر وے بیسل سیلز (ایئر وے سٹیم سیلز) میں مستقل طور پر ضم کر سکتے ہیں۔ یہ اس لیے اہم ہے کیونکہ وہ فنکشنل جین کی درستگی میں فرق کر کے نارمل ہائیڈریشن اور بلغم کی صفائی کو بحال کر سکتے ہیں۔ چلانے والے ایئر وے کے خلاف ہدایت کی جاتی ہے، کیونکہ یہ وہ جگہ ہے جہاں سے CF پھیپھڑوں کی بیماری شروع ہوتی ہے۔ پھیپھڑوں میں گہرائی تک ویکٹر کی ترسیل کے نتیجے میں الیوولر ٹرانزیکشن ہو سکتا ہے، لیکن اس کا CF میں کوئی علاج معالجہ نہیں ہوتا ہے۔ تاہم، مائعات جیسے جین کیریئرز قدرتی طور پر الیوولی کی طرف ہجرت کر جاتے ہیں اور ڈلیوری کے بعد تیزی سے صاف ہو جاتے ہیں۔ MCT.LV کی نقل و حمل کی کارکردگی کا براہ راست تعلق سیلولر اپٹیک کی اجازت دینے کے لیے ٹارگٹ سیلز کے ساتھ ویکٹر کے ٹارگٹ سیلز کے ساتھ رہنے والے وقت سے ہے - "رہائش کا وقت" 5 - جو کہ عام علاقائی ہوا کے بہاؤ کے ساتھ ساتھ مربوط ذرہ بلغم کی گرفت اور MCT کے ذریعے آسانی سے کم ہو جاتا ہے۔ لیکن اب تک چیلنج کیا گیا ہے.
اس رکاوٹ کو دور کرنے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ LV مقناطیسی ذرات (MPs) دو تکمیلی طریقوں سے مدد کر سکتے ہیں۔ پہلا، ہدف کو بہتر بنانے کے لیے انہیں مقناطیسی طور پر ایئر وے کی سطح پر لے جایا جا سکتا ہے اور مطلوبہ ایئر وے کے علاقے میں رہنے والے جین کیرئیر ذرات کی مدد کی جا سکتی ہے۔ اور ASL) سیل پرت میں جانے کے لیے 6۔ MPs کو بڑے پیمانے پر ٹارگٹڈ ڈرگ ڈیلیوری وہیکلز کے طور پر استعمال کیا گیا ہے جب وہ اینٹی باڈیز، کیموتھراپیٹک ادویات، یا دوسرے چھوٹے مالیکیولز سے منسلک ہوتے ہیں جو سیل کی جھلیوں سے منسلک ہوتے ہیں یا سیل کی سطح کے متعلقہ ریسیپٹرز سے منسلک ہوتے ہیں اور جامد بجلی کی موجودگی میں ٹیومر کی جگہوں پر جمع ہوتے ہیں۔ کینسر کے علاج کے لیے مقناطیسی میدان 7۔ دیگر "ہائپر تھرمل" تکنیکوں کا مقصد ایم پیز کو گرم کرنا ہے جب وہ دوغلی مقناطیسی فیلڈز کے سامنے آتے ہیں، اس طرح ٹیومر کے خلیات کو تباہ کرنا ہے۔ ایک مستحکم مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں انسانی برونکیل اپیتھیلیل سیل لائن میں LV-MPs کی وٹرو ڈیلیوری کے ساتھ، LV میگنیٹو ٹرانسفیکشن کی تاثیر قائم کی گئی ہے، LV ویکٹر کے مقابلے میں نقل و حمل کی کارکردگی میں 186 گنا اضافہ ہوا ہے، جہاں LV ویکٹر میں صرف ویکٹر کا اطلاق ہوتا ہے۔ ٹرانسفیکشن نے CF سپٹم 10 کی موجودگی میں ایئر مائع انٹرفیس کلچرز میں LV کی نقل و حمل میں 20 گنا اضافہ کیا۔ تاہم، اعضاء کی ویوو میگنیٹو ٹرانسفیکشن میں نسبتاً کم توجہ دی گئی ہے اور صرف چند جانوروں کے مطالعے میں اس کا جائزہ لیا گیا ہے، خاص طور پر پھیپھڑوں کے بغیر ٹرانسفیکشن کے مواقع۔ CF پھیپھڑوں کی تھراپی واضح ہے۔ Tan et al.(2020) نے کہا کہ "مؤثر مقناطیسی نینو پارٹیکل پلمونری ڈیلیوری کا ثبوت کا تصوراتی مطالعہ CF مریضوں میں طبی نتائج کو بہتر بنانے کے لئے مستقبل میں CFTR سانس لینے کی حکمت عملیوں کی راہ ہموار کرے گا"6۔
لاگو مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں ہوا کے راستے کی سطحوں پر چھوٹے مقناطیسی ذرات کے رویے کو تصور کرنا اور مطالعہ کرنا مشکل ہے، اور اس طرح اسے اچھی طرح سے سمجھا نہیں جاتا ہے۔ دیگر مطالعات میں، ہم نے ایک سنکروٹران پروپیگیشن پر مبنی فیز کنٹراسٹ ایکس رے امیجنگ (PB-PCXI) طریقہ تیار کیا ہے تاکہ MCT1 میں تبدیلیوں کو غیر مؤثر طریقے سے تصور کیا جا سکے۔ برتاؤ 19,20 گیس کینال کی سطح کی ہائیڈریشن کی براہ راست پیمائش کرنے کے لیے اور علاج کی افادیت کے ابتدائی اشارے کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ اس کے علاوہ، ہمارا MCT تشخیص کا طریقہ 10–35 µm قطر کے ذرات کا استعمال کرتا ہے جو ایلومینا یا ہائی ریفریکٹیو انڈیکس گلاس پر مشتمل ہوتا ہے کیونکہ MCT مارکر PB-PCXI21 کے لیے موزوں ہوتے ہیں۔ ایم پی
اس کے اعلی مقامی اور وقتی ریزولوشن کی وجہ سے، ہماری PB-PCXI پر مبنی ASL اور MCT تجزیہ تکنیک Vivo میں سنگل اور بلک پارٹیکل رویے کی حرکیات اور نمونوں کی جانچ کرنے کے لیے اچھی طرح سے موزوں ہے تاکہ MP جین کی ترسیل کی تکنیک کو سمجھنے اور اسے بہتر بنانے میں ہماری مدد کی جا سکے۔ ہم یہاں جس نقطہ نظر کو استعمال کرتے ہیں وہ ہمارے BL2-8 کے مطالعہ سے اخذ کیا جاتا ہے۔ ہمارے جین کیریئر ڈوز اینیمل اسٹڈیز 3,4 میں مشاہدہ کیے گئے ہمارے غیر یکساں جین کے اظہار کے نمونوں کی وضاحت کرنے میں مدد کرنے کے لیے چوہوں کی ناک اور پلمونری ایئر ویز میں شیم ویکٹر ڈوز کی ترسیل کے بعد مائع کی نقل و حرکت۔
اس مطالعے کا مقصد زندہ چوہوں کی ٹریچیا میں MPs کی ایک سیریز کی vivo کی حرکت کو دیکھنے کے لیے synchrotron PB-PCXI کا استعمال کرنا تھا۔ یہ PB-PCXI امیجنگ اسٹڈیز MPs کی ایک رینج، مقناطیسی فیلڈ کی طاقتوں، اور مقامات کی جانچ کرنے کے لیے بنائے گئے تھے تاکہ MP کی حرکت پر ان کے اثر کا تعین کیا جا سکے۔ ٹارگٹ ایریا تک۔ ان مطالعات نے ہمیں مقناطیسی کنفیگریشنز کی نشاندہی کرنے کی بھی اجازت دی جو جمع ہونے کے بعد ٹریچیا میں موجود ذرات کی تعداد کو زیادہ سے زیادہ بناتی ہے۔ مطالعے کی ایک دوسری سیریز میں، ہم نے اس بہترین ترتیب کو استعمال کرنے کی کوشش کی تاکہ ٹرانزیکشن پیٹرن کا مظاہرہ کیا جا سکے جس کے نتیجے میں LV-MPs کی vivo کی ترسیل کے نتیجے میں LV-MPs کے سیاق و سباق کے سیاق و سباق پر LV-MP کی ترسیل ہوتی ہے۔ ایئر وے کو نشانہ بنانے کے نتیجے میں LV کی نقل و حمل کی کارکردگی میں بہتری آئے گی۔
تمام جانوروں کے مطالعے ایڈیلیڈ یونیورسٹی (M-2019-060 اور M-2020-022) اور SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee کے منظور شدہ پروٹوکول کے مطابق کیے گئے۔ تجربات ARRIVE کے رہنما خطوط کے مطابق کیے گئے۔
تمام ایکس رے امیجنگ جاپان میں SPring-8 synchrotron پر BL20XU بیم لائن پر کی گئی تھی، جس میں پہلے بیان کردہ 21,22 سے ملتا جلتا سیٹ اپ استعمال کیا گیا تھا۔ مختصراً، تجرباتی باکس سنکروٹران اسٹوریج رنگ سے 245 میٹر کے فاصلے پر واقع تھا۔ نمونہ سے ڈٹیکٹر کا فاصلہ 0.6 میٹر اور imvo m3 کے مطالعہ کے لیے حصہ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ فیز کنٹراسٹ اثرات پیدا کریں۔ 25 keV کی یک رنگی بیم انرجی استعمال کی گئی۔ امیجز کو ہائی ریزولوشن ایکس رے کنورٹر (SPring-8 BM3) کا استعمال کرتے ہوئے ایک sCMOS ڈیٹیکٹر کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ کنورٹر ایکس رے کو 10 µm موٹی اسکنٹیلیٹر کا استعمال کرتے ہوئے نظر آنے والی روشنی میں تبدیل کرتا ہے، جس کے بعد 10 µm موٹی اسکنٹیلیٹر (اس کے بعد 3G23G سے)۔ ایک × 10 مائکروسکوپ مقصد (NA 0.3) کا استعمال کرتے ہوئے sCMOS سینسر۔ sCMOS کا پتہ لگانے والا Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) تھا جس کا ایک ارے سائز 2048 × 2048 پکسلز اور خام پکسل سائز 6.5 × 6.5 موثر ہے یہ pixel سائز کا ایک µyl ym کا ایک ارے سائز ہے۔ 0.51 µm اور تقریباً 1.1 mm × 1.1 mm کے منظر کا میدان۔ 100 ms کی نمائش کی لمبائی کو ہوا کے راستے کے اندر اور باہر مقناطیسی ذرات کے سگنل ٹو شور کے تناسب کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے منتخب کیا گیا تھا جبکہ سانس لینے کی حوصلہ افزائی کی حرکت کو کم سے کم کرنے کے لیے، ایکس ایکس ایکس ایکس میں تیز رفتاری کی جگہ پر تحقیق کی گئی تھی۔ ایکس رے کا راستہ تابکاری کی خوراک کو محدود کرنے کے لیے ایکس رے بیم کو ایکسپوژرز کے درمیان روک کر۔
LV کیریئر کو کسی بھی SPring-8 PB-PCXI امیجنگ اسٹڈیز میں استعمال نہیں کیا گیا تھا کیونکہ BL20XU امیجنگ چیمبر بائیو سیفٹی لیول 2 مصدقہ نہیں ہے۔ اس کے بجائے، ہم نے دو کمرشل سپلائرز سے اچھی خصوصیات والے ایم پیز کی ایک رینج کا انتخاب کیا- جس میں سائز، مواد، لوہے کی ایپلی کیشنز کو سمجھنے کے لیے کس طرح اثر انداز ہوتا ہے۔ شیشے کی کیپلیریوں کے اندر، اور پھر زندہ ایئر ویز میں۔ سطح پر۔ MPs کا سائز 0.25 سے 18 μm تک ہوتا ہے اور یہ متعدد مواد سے بنائے جاتے ہیں (جدول 1 دیکھیں)، لیکن MP کے اندر مقناطیسی ذرات کے سائز سمیت ہر نمونے کی ترکیب نامعلوم ہے۔ ہمارے وسیع MCT مطالعات کی بنیاد پر 19, 20, 21, 23، MP5 μm کے طور پر ہم توقع کر سکتے ہیں کہ چھوٹے ہو سکتے ہیں۔ tracheal airway کی سطح، مثال کے طور پر MP حرکت کی بہتر مرئیت کو دیکھنے کے لیے لگاتار فریموں کو گھٹا کر۔ ایک سنگل 0.25 μm سائز کا MP امیجنگ ڈیوائس کے ریزولوشن سے چھوٹا ہوتا ہے، لیکن PB-PCXI سے توقع کی جاتی ہے کہ وہ ان کے حجم کے تضاد اور سطحی سیال کی حرکت کا پتہ لگائے جس پر وہ جمع ہونے کے بعد جمع ہوتے ہیں۔
جدول 1 میں ہر ایم پی کے لیے نمونے 20 μl گلاس کیپلیریوں (ڈرمنڈ مائیکرو کیپس، PA، USA) میں تیار کیے گئے تھے جن کا اندرونی قطر 0.63 ملی میٹر ہے۔ کارپسکولر ذرات پانی میں دستیاب ہیں، جبکہ CombiMag کے ذرات مینوفیکچرر کے ملکیتی سیال میں دستیاب ہیں۔ اور نمونہ ہولڈر پر رکھا گیا (تصویر 1 دیکھیں)۔ شیشے کی کیپلیریوں کو بالترتیب امیجنگ باکس میں نمونے کے اسٹیج پر افقی طور پر رکھا گیا تھا، اور سیال کے کناروں کو رکھا گیا تھا۔ ایک 19 ملی میٹر قطر (28 ملی میٹر لمبا) نکل شیل نایاب زمین نیوڈیمیم آئرن بورون (NdFe no.52، magnet52) Jaycar Electronics, Australia) 1.17 Tesla کی بقایا میگنیٹائزیشن کے ساتھ ایک علیحدہ ترجمے کے مرحلے سے منسلک کیا گیا تھا تاکہ امیجنگ کے دوران اپنی پوزیشن کو دور سے تبدیل کریں۔ ایکس رے امیج کا حصول اس وقت شروع ہوتا ہے جب مقناطیس کو نمونے سے تقریباً 30 ملی میٹر اوپر رکھا جاتا ہے، اور تصاویر حاصل کی جاتی ہیں، فی سیکنڈ فریم میگ نیٹ 4 فریم کے قریب لایا جاتا ہے۔ کیپلیری ٹیوب (تقریبا 1 ملی میٹر دور) اور پھر فیلڈ کی طاقت اور پوزیشن کے اثرات کا اندازہ کرنے کے لیے ٹیوب کے ساتھ ترجمہ کیا جاتا ہے۔
ان وٹرو امیجنگ سیٹ اپ جس میں ایم پی کے نمونے شیشے کی کیپلیریوں میں نمونے کے xy ترجمہ کے مرحلے پر ہوتے ہیں۔ ایکس رے بیم کے راستے کو سرخ رنگ کی لکیر سے نشان زد کیا گیا ہے۔
ایک بار جب ایم پیز کی ان وٹرو ویزیبلٹی قائم ہو گئی تو، ان میں سے ایک ذیلی سیٹ کو جنگلی قسم کے مادہ البینو وِسٹار چوہوں (~ 12 ہفتے پرانا، ~ 200 گرام) میں ویوو میں ٹیسٹ کیا گیا۔ mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika) چوہوں کو intraperitoneal انجیکشن کے ذریعے Pharma, Japan) کے مرکب سے بے ہوشی کی گئی۔ اینستھیزیا کے بعد، انہیں ٹریچیا کے اردگرد کی کھال کو ہٹا کر، ایک اینڈو ٹریچیل ٹیوب ڈال کر، امیجنگ کے لیے تیار کیا گیا تھا، ان میں سے ایک ٹیوب (ETrumobilizing) جسم کا درجہ حرارت 22 کو برقرار رکھنے کے لیے تھرمل بیگ پر مشتمل اپنی مرضی کے مطابق امیجنگ پلیٹ پر سوپائن۔ پھر امیجنگ پلیٹ کو امیجنگ باکس میں نمونے کے ترجمہ کے مرحلے کے ساتھ ہلکے زاویے پر منسلک کیا گیا تاکہ ایکس رے امیج میں ٹریچیا کو افقی طور پر سیدھ کیا جا سکے، جیسا کہ شکل 2a میں دکھایا گیا ہے۔
(a) SPring-8 امیجنگ باکس میں Vivo امیجنگ سیٹ اپ میں، X-ray شعاع کے راستے پر سرخ ڈیشڈ لائن کے ساتھ نشان لگایا گیا ہے۔ (b,c) ٹریچیا پر میگنیٹ لوکلائزیشن کو دور سے دو آرتھوگونلی نصب آئی پی کیمروں کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ اسکرین امیج کے بائیں جانب، ہیڈ لوپ میں ڈلیوری کی جگہ کو دیکھا جا سکتا ہے۔ ٹیوب
100 μl گلاس سرنج کا استعمال کرتے ہوئے ایک ریموٹ کنٹرول سرنج پمپ سسٹم (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) PE10 ٹیوبنگ (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) سے 30 Ga سوئی کے ذریعے جڑا ہوا تھا۔ ٹیوب کو نشان زد کریں تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ ٹیوب کی جگہ درست ہے۔ ٹیوب۔ مائیکرو پمپ کا استعمال کرتے ہوئے، سرنج پلنگر کو واپس لے لیا گیا جب کہ ٹیوب کی نوک کو ڈیلیور کرنے کے لیے MP کے نمونے میں ڈبو دیا گیا۔ پھر بھری ہوئی ڈیلیوری ٹیوب کو اینڈو ٹریچیل ٹیوب میں ڈالا گیا، جس سے ہماری متوقع لاگو مقناطیسی فیلڈ کے سب سے مضبوط حصے میں ٹپ رکھی گئی۔ پاور لیب اور لیب چارٹ (AD انسٹرومینٹس، سڈنی، آسٹریلیا) کا استعمال کرتے ہوئے سگنلز (مثلاً درجہ حرارت، سانس، شٹر کھولنا/کلوزنگ اور امیج ایکوزیشن) ریکارڈ کیے گئے تھے۔ 22۔ امیجنگ کے وقت جب انکلوژر ناقابل رسائی تھا، دو IP کیمرے (Panasonic BB-SC382) ایک دوسرے کی نگرانی کے لیے تقریباً 90 ° پر رکھے گئے تھے۔ امیجنگ کے دوران ٹریچیا (تصویر 2b،c)۔ حرکتی نمونوں کو کم سے کم کرنے کے لیے، آخری سمندری بہاؤ سطح مرتفع کے دوران فی سانس ایک تصویر حاصل کی گئی تھی۔
ایک مقناطیس دوسرے مرحلے سے منسلک ہوتا ہے جسے امیجنگ ہاؤسنگ کے باہر سے دور سے واقع کیا جا سکتا ہے۔ مقناطیس کی مختلف پوزیشنوں اور کنفیگریشنز کا تجربہ کیا گیا، بشمول: ٹریچیا کے اوپر تقریباً 30° کے زاویے پر نصب کیا گیا (تصویر 2a اور 3a میں دکھایا گیا ہے)؛ ایک مقناطیس جانور کے اوپر اور دوسرا نیچے، جس میں کھمبے اپنی طرف متوجہ کرنے کے لیے رکھے گئے ہیں (شکل 3b)؛ ایک مقناطیس جانور کے اوپر اور دوسرا نیچے، کھمبے کو پیچھے ہٹانے کے لیے سیٹ کیا گیا ہے (شکل 3c)؛ اور ایک مقناطیس اوپر اور ٹریچیا کے اوپر کھڑا ہے (شکل 3d)۔ ایک بار جب جانور اور مقناطیس کو کنفیگر کر لیا جائے اور ایم پی کو ٹیسٹ کرنے کے لیے سرنج پمپ میں لوڈ کر دیا جائے تو تصاویر حاصل کرتے وقت 4 μl/sec کی شرح سے 50 μl کی خوراک فراہم کریں۔ تصاویر
ویوو امیجنگ میں مقناطیس کی ترتیب (a) تقریباً 30° کے زاویہ پر ٹریچیا کے اوپر ایک واحد مقناطیس، (b) دو میگنےٹ جو اپنی طرف متوجہ کرنے کے لیے سیٹ کیے جاتے ہیں، (c) دو میگنےٹ کو پیچھے ہٹانے کے لیے سیٹ، (d) ایک واحد مقناطیس اوپر اور ٹریچیا میں کھڑا ہوتا ہے۔ مبصر نے منہ سے نیچے کی طرف دیکھا اور X-Trachea کے ذریعے منہ کی طرف دیکھا۔ چوہے کے بائیں طرف اور دائیں طرف سے باہر نکلا۔ مقناطیس کو یا تو ایئر وے کی لمبائی کے ساتھ منتقل کیا جاتا ہے یا ایکس رے بیم کی سمت میں ٹریچیا کے اوپر بائیں اور دائیں طرف۔
ہم نے الجھنے والی سانس لینے اور کارڈیک موشن کی عدم موجودگی میں ایئر ویز میں ذرات کی مرئیت اور رویے کا تعین کرنے کی بھی کوشش کی۔ اس لیے، امیجنگ کی مدت کے اختتام پر، جانوروں کو انسانی طور پر پینٹو باربیٹل اوور ڈوز کی وجہ سے ہلاک کر دیا گیا (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA ~5g/mgS; امیجنگ پلیٹ فارم، اور ایک بار سانس لینے اور دل کی دھڑکن بند ہونے کے بعد، امیجنگ کے عمل کو دہرایا گیا، جس میں ایم پی کی اضافی خوراک شامل کی گئی اگر کوئی ایم پی ایئر وے کی سطح پر نظر نہ آئے۔
حاصل کی گئی تصاویر کو فلیٹ فیلڈ اور ڈارک فیلڈ کو درست کیا گیا اور پھر MATLAB (R2020a، The Mathworks) میں لکھی گئی اپنی مرضی کے اسکرپٹ کا استعمال کرتے ہوئے ایک فلم (20 فریم فی سیکنڈ؛ 15-25 × عام رفتار سانس کی شرح پر منحصر ہے) میں جمع کیا گیا۔
ایل وی جین ویکٹر کی ترسیل کے تمام مطالعات ایڈیلیڈ یونیورسٹی کی لیبارٹری اینیمل ریسرچ فیسلٹی میں کیے گئے اور اس کا مقصد SPring-8 تجربے کے نتائج کو استعمال کرنا تھا تاکہ یہ اندازہ لگایا جا سکے کہ آیا مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں LV-MP کی ترسیل vivo میں جین کی منتقلی کو بڑھا سکتی ہے۔ MP اور مقناطیسی فیلڈ کے اثرات کا جائزہ لینے کے لیے، LVMP کے دو گروپوں کو ایک جانور کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔ رکھا گیا، اور دوسرے گروپ کو بغیر مقناطیس کے LV-MP کے ساتھ ایک کنٹرول گروپ ملا۔
LV جین ویکٹر پہلے بیان کردہ طریقوں 25, 26 کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے تھے .LacZ ویکٹر جوہری-مقامی بیٹا-galactosidase جین کا اظہار کرتا ہے جو تشکیلاتی MPSV پروموٹر (LV-LacZ) کے ذریعے چلایا جاتا ہے، جو منتقلی خلیوں میں نیلے رنگ کے رد عمل کی مصنوعات تیار کرتا ہے، جو پھیپھڑوں کے ٹشو کلچر کے فرنٹ سیکشن میں ظاہر ہوتا ہے اور ٹیشو ٹشو کلچر میں ظاہر ہوتا ہے۔ TU/ml میں ٹائٹر کا حساب لگانے کے لیے ہیموسی ٹومیٹر کے ساتھ LacZ مثبت خلیوں کی تعداد کو دستی طور پر گننا۔ کیریئرز کو -80 °C پر کریوپریزر کیا جاتا ہے، استعمال سے پہلے پگھلا دیا جاتا ہے، اور 1:1 کے تناسب سے مکس کر کے CombiMag کے ساتھ پابند کیا جاتا ہے اور کم از کم 30 منٹ تک برف پر انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔
نارمل اسپراگ ڈولی چوہوں (n = 3/گروپ، ~2-3 کو 0.4 ملی گرام/کلوگرام میڈیٹومائڈائن (ڈومیٹر، الیوم، آسٹریلیا) اور 60 ملی گرام/کلو کیٹامائن (الیئم، آسٹریلیا) کے مرکب کے ساتھ انٹراپیریٹونلی طور پر اینستھیزائز کیا گیا تھا اور ایک ماہ پرانا اور گائک سرجری کے ساتھ نان-سریوولیشن) کینولا۔ اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ ٹریچیل ایئر وے کے ٹشو کو LV ٹرانسڈکشن حاصل ہوتا ہے، اسے ہمارے پہلے بیان کردہ مکینیکل پرٹربیشن پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے کنڈیشنڈ کیا گیا تھا، جس میں ٹریچیل ایئر وے کی سطح کو تار کی ٹوکری کے ساتھ محوری طور پر رگڑا گیا تھا (N-Circle، Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-020D, USD-02020-2000 میڈیکل) s28. LV-MP کی ٹریچیل ایڈمنسٹریشن اس کے بعد ہنگامہ خیزی کے تقریباً 10 منٹ بعد حیاتیاتی حفاظتی کابینہ میں کی گئی۔
اس تجربے میں استعمال ہونے والے مقناطیسی فیلڈ کو ویوو ایکس رے امیجنگ اسٹڈی کی طرح ترتیب دیا گیا تھا، اسی طرح کے میگنےٹس کو ڈسٹلیشن اسٹینٹ کلپس (شکل 4) کا استعمال کرتے ہوئے ٹریچیا کے اوپر رکھا گیا تھا۔ LV-MP کا 50 μl حجم (2 × 25 μl aliquots) trachea میں پہنچایا گیا تھا۔ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ ایک کنٹرول گروپ (n = 3 جانوروں) نے مقناطیس کے استعمال کے بغیر ایک ہی LV-MPs حاصل کیے تھے۔ انفیوژن مکمل ہونے کے بعد، کینول کو ET ٹیوب سے ہٹا دیا جاتا ہے اور جانور کو باہر نکال دیا جاتا ہے۔ مقناطیس 10 منٹ تک اپنی جگہ پر رہتا ہے، پھر اسے ہٹا دیا جاتا ہے۔ 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia) کے ip انجیکشن کے ذریعے اینستھیزیا کا۔ چوہوں کو اینستھیزیا سے مکمل صحت یابی تک گرم رکھا گیا اور ان کی نگرانی کی گئی۔
حیاتیاتی حفاظتی کابینہ میں LV-MP ڈیلیوری ڈیوائس۔ ET ٹیوب کے ہلکے سرمئی Luer حب کو منہ سے باہر نکلتا ہوا دیکھا جا سکتا ہے اور تصویر میں دکھائی گئی پائپیٹ کی جیل کی نوک ET ٹیوب کے ذریعے ٹریچیا میں مطلوبہ گہرائی تک ڈالی جاتی ہے۔
LV-MP کی خوراک لینے کے طریقہ کار کے ایک ہفتے بعد، جانوروں کو 100% CO2 سانس کے ذریعے انسانی طور پر ہلاک کیا گیا اور ہمارے معیاری X-gal علاج کا استعمال کرتے ہوئے LacZ اظہار کا اندازہ لگایا گیا۔ تین کاڈل سب سے زیادہ کارٹیلیجینس حلقے ہٹا دیے گئے تاکہ اس بات کو یقینی بنایا جا سکے کہ endotracheal tube placement سے کوئی میکانکی نقصان یا سیال برقرار نہ رہے۔ تجزیہ کے لیے آدھے حصے، اور انہیں سلیکون ربڑ (Sylgard, Dow Inc) پر مشتمل ایک ڈش میں نصب کیا گیا تھا جس میں ایک Minutien سوئی (فائن سائنس ٹولز) کا استعمال کرتے ہوئے luminal سطح کا تصور کیا گیا تھا۔ نقلی خلیوں کی تقسیم اور پیٹرن کی تصدیق سامنے والی فوٹوگرافی کے ذریعے Nikon مائکروسکوپ (SMZ150) سافٹ ویئر کے ساتھ کی گئی تھی۔ فوٹوونکس، چین)۔تصاویر 20x میگنیفیکیشن پر حاصل کی گئیں (بشمول ٹریچیا کی پوری چوڑائی کے لیے سب سے زیادہ سیٹنگ)، ٹریچیا کی پوری لمبائی کے ساتھ مرحلہ وار امیج کی گئی، ہر تصویر کے درمیان کافی اوورلیپ کو یقینی بناتے ہوئے امیج "سلائی" کی اجازت دی گئی۔ پھر ہر ٹریچیا سے امیجز کو ایک کمپوزٹ امیج میں اکٹھا کیا گیا۔ v2.0.3 (مائیکروسافٹ ریسرچ) پلانر موشن الگورتھم کا استعمال کرتے ہوئے۔ ہر جانور کی ٹریچیا کی جامع امیجز میں LacZ اظہار کے علاقوں کو ایک خودکار MATLAB اسکرپٹ (R2020a، MathWorks) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کیا گیا، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، 0.35، <5> <5> <5> ویلیویشن،
تمام شماریاتی تجزیے GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) میں کیے گئے تھے۔ شماریاتی اہمیت p ≤ 0.05 پر رکھی گئی تھی۔ معمول کی تصدیق Shapiro-Wilk ٹیسٹ کے ذریعے کی گئی تھی، اور LacZ سٹیننگ میں فرق کا اندازہ لگایا گیا تھا۔
ٹیبل 1 میں بیان کردہ چھ ایم پیز کی جانچ پی سی ایکس آئی کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی، اور مرئیت کو ٹیبل 2 میں بیان کیا گیا ہے۔ دو پولی اسٹیرین ایم پیز (MP1 اور MP2؛ 18 μm اور 0.25 μm، بالترتیب) PCXI کے تحت نظر نہیں آئے تھے، لیکن باقی نمونے قابل شناخت تھے (مثالیں MP3-5 ایم پی میں دکھائی گئی ہیں)۔ Fe3O4؛ بالترتیب 0.25 μm اور 0.9 μm) ہلکے سے دکھائی دے رہے ہیں۔ اگرچہ ٹیسٹ کیے گئے کچھ چھوٹے ذرات پر مشتمل ہے، MP5 (98% Fe3O4؛ 0.25 μm) سب سے زیادہ واضح تھا۔ CombiMag پروڈکٹ MP6 کا پتہ لگانا مشکل ہے۔ اور آگے کیپلیری کے متوازی۔ جب میگنےٹ کیپلیری سے دور چلے گئے تو ذرات لمبی تاروں میں پھیل گئے، لیکن جیسے جیسے میگنےٹ قریب آتے گئے اور مقناطیسی فیلڈ کی طاقت بڑھتی گئی، ذرات کیپلیری کی اوپری سطح کی طرف منتقل ہونے کے ساتھ ہی ذرہ کی تاریں مختصر ہوتی گئیں (دیکھیں: MP4 حصہ کی سپلیمنٹری ویڈیو) سطح۔ اس کے برعکس، جب مقناطیس کو کیپلیری سے ہٹا دیا جاتا ہے، تو فیلڈ کی طاقت کم ہو جاتی ہے اور ایم پیز کیپلیری کی اوپری سطح سے پھیلی ہوئی لمبی تاروں میں دوبارہ ترتیب دیتے ہیں (دیکھیں ضمنی ویڈیو S2:MP4)۔ جب مقناطیس حرکت کرنا بند کر دیتا ہے، تو ذرات تھوڑی دیر کے لیے حرکت کرتے رہتے ہیں اور MP کی سطح کی سطح سے توازن کی طرف بڑھتے ہیں۔ مقناطیسی ذرات عام طور پر ملبے کو سیال کے ذریعے گھسیٹتے ہیں۔
PCXI کے تحت MP کی مرئیت نمونوں کے درمیان نمایاں طور پر مختلف ہوتی ہے۔ (a) MP3، (b) MP4، (c) MP5 اور (d) MP6۔ یہاں دکھائی گئی تمام تصاویر تقریباً 10 ملی میٹر براہ راست کیپلیری کے اوپر واقع مقناطیس کے ساتھ لی گئی تھیں۔ ظاہری بڑے دائرے کیپلیریوں میں پھنسے ہوئے ہوا کے بلبلے ہیں اور سیاہ فام سفید رنگ کی خصوصیات کو واضح طور پر ظاہر کر رہے ہیں۔ باکس میں کنٹراسٹ بڑھانے والی میگنیفیکیشن شامل ہے۔ نوٹ کریں کہ تمام اعداد و شمار میں میگنیٹ اسکیمیٹکس کے قطر پیمانہ کے لیے نہیں ہیں اور دکھائے گئے سے تقریباً 100 گنا بڑے ہیں۔
جیسے ہی مقناطیس کا کیپلیری کے اوپری حصے میں بائیں اور دائیں ترجمہ کیا جاتا ہے، MP سٹرنگ کا زاویہ مقناطیس کے ساتھ سیدھ میں بدل جاتا ہے (شکل 6)، اس طرح مقناطیسی میدان کی لکیروں کو بیان کیا جاتا ہے۔ MP3-5 کے لیے، راگ ایک حد کے زاویے تک پہنچنے کے بعد، ذرات کو گھسیٹ کر لے جایا جاتا ہے جس کے نتیجے میں ایم پی سٹرنگ کی اوپری سطح کے قریب ہوتا ہے۔ مقناطیسی میدان سب سے مضبوط ہے (ضمنی ویڈیو S3:MP5 دیکھیں)۔ یہ خاص طور پر اس وقت بھی واضح ہوتا ہے جب کیپلیری اینڈ کے قریب امیجنگ کی جاتی ہے، جس کی وجہ سے ایم پیز فلوئیڈ ایئر انٹرفیس پر جمع اور توجہ مرکوز کرتے ہیں۔ MP6 میں ذرات، جو MP3-5 کے مقابلے میں سمجھنا زیادہ مشکل تھے، MP3-5 کے مقابلے میں میگنگ کو گھسیٹ کر نہیں گھسیٹتے تھے، لیکن ایم پی کے ساتھ گھسیٹا جاتا ہے۔ منقطع، ذرات کو منظر کے میدان میں چھوڑ کر (دیکھیں ضمنی ویڈیو S4:MP6)۔ بعض صورتوں میں، جب لاگو مقناطیسی میدان مقناطیس کو امیجنگ کے مقام سے کافی فاصلے پر منتقل کر کے کم کر دیا گیا تھا، تو کوئی بھی باقی ماندہ ایم پی سٹرنگ میں رہتے ہوئے آہستہ آہستہ کشش ثقل کے ذریعے ٹیوب کی نچلی سطح پر اترتے تھے (Supplementary Video: MP53 دیکھیں)۔
ایم پی سٹرنگ کا زاویہ تبدیل ہوتا ہے کیونکہ مقناطیس کا کیپلیری کے اوپر دائیں طرف ترجمہ ہوتا ہے۔ (a) MP3، (b) MP4، (c) MP5 اور (d) MP6۔ سرخ باکس میں کنٹراسٹ بڑھانے والی میگنیفیکیشن ہوتی ہے۔ نوٹ کریں کہ ضمنی ویڈیوز معلوماتی ہوتے ہیں کیونکہ وہ اہم ذرات کو ظاہر کرتے ہیں جو کہ انفارمیشن سٹرکچر میں انفارمیشن سٹرکچر کو متحرک نہیں کر سکتے۔
ہمارے ٹیسٹوں سے معلوم ہوا کہ ٹریچیا کے ساتھ مقناطیس کو آہستہ آہستہ آگے پیچھے کرنے سے Vivo میں پیچیدہ حرکت کے تناظر میں MP کے تصور کو آسان بناتا ہے۔ Vivo میں ٹیسٹنگ اس لیے نہیں کی گئی تھی کیونکہ پولی اسٹیرین موتیوں (MP1 اور MP2) کیپلیری میں دکھائی نہیں دے رہے تھے۔ باقی چار ایم پیز میں سے ہر ایک کو ویوو میں طویل میگ نیٹ کنفیگریٹ کے ساتھ ٹیسٹ کیا گیا تھا۔ عمودی سے تقریباً 30° کا زاویہ (ملاحظہ کریں اعداد و شمار 2b اور 3a)، کیونکہ اس کے نتیجے میں MP کی زنجیریں لمبی ہوئیں اور یہ مقناطیسی ترتیب کے ختم ہونے سے زیادہ موثر تھیں۔ MP3، MP4 اور MP6 کسی بھی زندہ جانوروں کی ٹریچیا میں نہیں پائے گئے۔ جب چوہے کی ایئر ویز کی تصویر کشی کے بعد جب جانوروں کو انسانی طور پر ہلاک کیا گیا تو اضافی مقدار میں اضافہ کیا گیا جو انسانی طور پر غیر معمولی طور پر باقی رہ گیا تھا۔ syringe pump.MP5 میں آئرن آکسائیڈ کا مواد سب سے زیادہ تھا اور یہ واحد نظر آنے والا ذرہ تھا، اور اس وجہ سے MP کے vivo کے رویے کا اندازہ لگانے اور اس کی خصوصیات کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔
ایم پی ڈیلیوری کے دوران ٹریچیا پر مقناطیس رکھنے کے نتیجے میں بہت سے، لیکن تمام نہیں، ایم پیز منظر کے میدان میں مرکوز ہیں۔ ٹریچیا میں داخل ہونے والے ذرات انسانی طور پر قربان ہونے والے جانوروں میں سب سے بہتر دیکھے جاتے ہیں۔ شکل 7 اور ضمنی ویڈیو S6: MP5 تیزی سے مقناطیسی گرفت اور ذرات کی سیدھ میں دکھاتا ہے، جو ایم پی کی سطح پر براہ راست ٹریچیا میں ذرات کی مقناطیسی گرفت کو ظاہر کرتا ہے۔ ٹریچیا کے مطلوبہ علاقوں تک۔ MP کی ترسیل کے بعد ٹریچیا کے ساتھ ساتھ زیادہ دور تلاش کرنے پر، کچھ ایم پیز کیرینا کے قریب پائے گئے، جس سے پتہ چلتا ہے کہ مقناطیسی فیلڈ کی طاقت تمام ایم پیز کو جمع کرنے اور برقرار رکھنے کے لیے ناکافی تھی، کیونکہ وہ سیال کے عمل کے دوران زیادہ سے زیادہ مقناطیسی فیلڈ کی طاقت کے علاقے کے ذریعے پہنچائے گئے تھے۔ بہر حال، ایم پی کے ارد گرد زیادہ سے زیادہ امیجز ایم پی کے ارد گرد موجود ہیں، جو تجویز کرتے ہیں۔ ہوا کے راستے والے علاقے جہاں لاگو مقناطیسی فیلڈ کی طاقت سب سے زیادہ تھی۔
(a) سے پہلے کی تصاویر اور (b) MP5 کی ترسیل کے بعد حال ہی میں euthanized چوہے کی ٹریچیا میں مقناطیس کے ساتھ براہ راست امیجنگ ایریا کے اوپر رکھا گیا ہے۔ امیجڈ ایریا کارٹلیج کے دو حلقوں کے درمیان واقع ہے۔ MP کی ترسیل سے پہلے، ایئر وے میں کچھ سیال ہوتا ہے۔ سرخ باکس پر مشتمل ہوتا ہے اس کے برعکس ویڈیو میں دکھائے جانے والے میگنیفکیشن کی تصویر کے برعکس اضافہ ہوتا ہے۔ S6:MP5۔
ویوو میں ٹریچیا کے ساتھ مقناطیس کا ترجمہ کرنے سے ایم پی چین ایئر وے کی سطح کے اندر زاویہ تبدیل کرنے کا سبب بنتا ہے جیسا کہ کیپلیریوں میں دیکھا جاتا ہے (شکل 8 اور ضمنی ویڈیو S7:MP5 دیکھیں)۔ تاہم، ہمارے مطالعے میں، ایم پیز کو زندہ ایئر وے کی سطح کے ساتھ نہیں گھسیٹا جا سکتا تھا کیونکہ وہ ایم پی کیلریز کے ساتھ لمبے لمبے ہوتے ہیں اور کچھ معاملات میں ایم پی میگنےٹ کے ساتھ چلتے ہیں۔ دائیں طرف۔دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے یہ بھی پایا کہ جب مقناطیس کو طولانی طور پر ٹریچیا کے ساتھ منتقل کیا جاتا ہے تو پارٹیکل سٹرنگ سطحی سیال کی تہہ کی گہرائی کو تبدیل کرتی دکھائی دیتی ہے، اور جب مقناطیس کو براہ راست اوپر کی طرف منتقل کیا جاتا ہے اور پارٹیکل سٹرنگ کو عمودی پوزیشن پر گھمایا جاتا ہے تو پھیلتا ہے (ضمنی ویڈیو S7 دیکھیں)۔ : MP5 0:09 پر، نیچے دائیں)۔ حرکت کا خصوصیت کا نمونہ اس وقت بدل گیا جب مقناطیس کو ٹریچیا کے اوپری حصے میں ترجمہ کیا گیا تھا (یعنی ٹریچیا کی لمبائی کے بجائے جانور کے بائیں یا دائیں طرف)۔ ذرات اب بھی واضح طور پر دکھائی دے رہے تھے جب وہ حرکت کرتے تھے، لیکن جب مقناطیس کو ٹریچیا سے ہٹایا گیا تو ٹریچیا کا حصہ بن گیا۔ ضمنی ویڈیو S8:MP5، 0:08 سے شروع ہوتا ہے۔ یہ MP کے رویے سے مطابقت رکھتا ہے جو ہم نے شیشے کی کیپلیری میں لاگو مقناطیسی فیلڈ کے تحت دیکھا۔
ایک زندہ بے ہوشی والے چوہے کی ٹریچیا میں MP5 کو دکھانے والی مثال کی تصاویر۔ (a) ٹریچیا کے اوپر اور بائیں جانب تصاویر حاصل کرنے کے لیے مقناطیس کا استعمال کیا جاتا ہے، پھر (b) مقناطیس کو دائیں جانب منتقل کرنے کے بعد۔ سرخ باکس میں کنٹراسٹ بڑھانے والی میگنیفیکیشن ہوتی ہے۔ یہ تصاویر ویڈیو SMP5 میں دکھائی گئی SMP 5 سے ہیں۔
جب دو قطبوں کو ٹریچیا کے اوپر اور نیچے شمال-جنوب کی سمت میں ترتیب دیا گیا تھا (یعنی متوجہ ہونا؛ تصویر 3b)، MP chords لمبے لمبے نمودار ہوئے اور trachea کے سائیڈ وال پر نہ کہ ڈورسل tracheal سطح پر واقع تھے (دیکھیں ضمنی ویڈیو S9:MP5)۔ trachea) سیال کی ترسیل کے بعد نہیں پایا گیا تھا جب ایک دوہری مقناطیس آلہ استعمال کیا گیا تھا، جو عام طور پر اس وقت ہوتا ہے جب ایک واحد مقناطیس کا آلہ استعمال کیا جاتا ہے. پھر جب ایک مقناطیس کو کھمبوں کو پیچھے ہٹانے کے لئے ترتیب دیا گیا تھا (تصویر 3c)، منظر کے میدان میں نظر آنے والے ذرات کی تعداد میں اضافہ ظاہر نہیں ہوا تھا. مقناطیسی فیلڈ کی طاقتیں جو بالترتیب میگنےٹس کو کھینچتی یا دھکیلتی ہیں۔ پھر سیٹ اپ کو ایئر وے کے متوازی واحد مقناطیس میں تبدیل کیا گیا لیکن 90 ڈگری پر ایئر وے سے گزرنا تاکہ فیلڈ لائنز ٹریچیل دیوار کو آرتھوگونلی طور پر عبور کریں (تصویر 3d)، ایک واقفیت اس بات کا تعین کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے کہ آیا اس پارٹیکل کی ترتیب دیوار میں اس طرف جمع ہو سکتی ہے یا نہیں۔ ایم پی کے جمع ہونے یا مقناطیس کی نقل و حرکت کی کوئی قابل شناخت حرکت نہیں تھی۔ ان تمام نتائج کی بنیاد پر، ویوو جین کیریئر اسٹڈیز کے لیے ایک واحد مقناطیس، 30 ڈگری اورینٹیشن کنفیگریشن (شکل 3a) کا انتخاب کیا گیا تھا۔
جب انسانی قتل کے فوراً بعد جانور کی بار بار تصویر کشی کی گئی تو، الجھنے والی بافتوں کی حرکت کی عدم موجودگی کا مطلب یہ تھا کہ مقناطیس کی ترجمے کی حرکت کے مطابق، واضح انٹرکونڈرل فیلڈ میں باریک اور چھوٹی ذرات کی لکیروں کو دیکھا جا سکتا ہے۔ بہر حال، اب بھی MP6 ذرات کی موجودگی اور حرکت کو واضح طور پر نہیں دیکھ سکتا۔
LV-LacZ ٹائٹر 1.8 × 108 TU/ml تھا، اور CombiMag MP (MP6) کے ساتھ 1:1 اختلاط کے بعد، جانوروں کو 9 × 107 TU/ml LV گاڑی (یعنی 4.5 × 106 TU/چوہا) کی 50 μl ٹریچیل خوراک ملی۔ .ان مطالعات میں، مشقت کے دوران مقناطیس کا ترجمہ کرنے کے بجائے، ہم نے مقناطیس کو ایک پوزیشن میں طے کیا تاکہ یہ تعین کیا جا سکے کہ آیا مقناطیسی میدان کی عدم موجودگی میں ویکٹر کی ترسیل کے مقابلے LV ٹرانزیکشن (a) کو بہتر بنایا جا سکتا ہے، اور (b) فوکس کیا جا سکتا ہے ایئر وے کے خلیات کو اوپری ایئر وے کے مقناطیسی ہدف والے علاقوں میں منتقل کیا جاتا ہے۔
میگنےٹ کی موجودگی اور LV ویکٹر کے ساتھ مل کر CombiMag کے استعمال سے جانوروں کی صحت پر منفی اثرات مرتب ہوتے نظر نہیں آئے، جیسا کہ ہمارے معیاری LV ویکٹر ڈیلیوری پروٹوکول نے دیکھا۔ ٹریچیل ریجن کی فرنٹل امیجز جو کہ میکانکی خرابی کا شکار ہیں (ضمیمہ تصویر 1) نے اشارہ کیا کہ جب LV-MP کے ساتھ جانوروں کے گروپ میں نمایاں طور پر اعلیٰ سطح کا علاج کیا گیا تھا۔ موجودہ (تصویر 9a)۔ کنٹرول گروپ (تصویر 9b) میں نیلے رنگ کے LacZ داغ کی صرف ایک چھوٹی سی مقدار موجود تھی۔ معمول کے مطابق X-Gal کے داغ والے علاقوں کی مقدار سے پتہ چلتا ہے کہ مقناطیسی میدان کی موجودگی میں LV-MP کی انتظامیہ نے تقریباً 6 گنا بہتری پیدا کی (تصویر 9c)۔
مثال کے طور پر جامع تصاویر جو LV-MP (a) مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں اور (b) مقناطیس کی عدم موجودگی میں tracheal transduction کو دکھاتی ہیں۔
غیر جانبدار تیز سرخ داغ والے حصے (مثال کے طور پر ضمنی شکل 2 میں دکھایا گیا ہے) نے LacZ کے داغ والے خلیات کو اسی طرح کے پیٹرن اور مقام پر ظاہر کیا جیسا کہ پہلے بتایا گیا ہے۔
ایئر وے جین تھراپی کے لیے ایک اہم چیلنج کیریئر کے ذرات کی دلچسپی کے علاقوں میں درست لوکلائزیشن اور ہوا کے بہاؤ اور فعال بلغم کی صفائی کی موجودگی میں حرکت پذیر پھیپھڑوں میں اعلی درجے کی نقل و حمل کی کارکردگی کو حاصل کرنا ہے۔ Castellani et al. کی طرف سے نشاندہی کی گئی، نقل و حمل کو بہتر بنانے کے لیے مقناطیسی شعبوں کے استعمال کے دیگر جین کی ترسیل کے طریقوں جیسے الیکٹرو پوریشن کے مقابلے میں فوائد ہیں، کیونکہ یہ سادگی، لاگت کی تاثیر، ترسیل کی لوکلائزیشن، کارکردگی میں اضافہ، اور انکیوبیشن کے مختصر اوقات کو یکجا کر سکتا ہے، اور ممکنہ طور پر ایک چھوٹا کیریئر اور ممکنہ طور پر خوراک کی مقدار میں کمی کا امکان ہے۔ بیرونی مقناطیسی قوتوں کے زیر اثر ہوا کی نالیوں میں موجود ذرات کو کبھی بیان نہیں کیا گیا ہے، اور نہ ہی اس طریقہ کار کی فزیبلٹی کو vivo میں ظاہر کیا گیا ہے تاکہ برقرار زندہ ایئر ویز میں جین کے اظہار کی سطح کو بڑھایا جا سکے۔
ہمارے ان وٹرو سنکروٹون PCXI تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ پولی اسٹیرین ایم پی کے استثناء کے ساتھ ہم نے جانچے گئے تمام ذرات امیجنگ سیٹ اپ میں دکھائی دے رہے تھے جو ہم نے استعمال کیا تھا۔ مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں، MPs تار بناتے ہیں جن کی لمبائی ذرہ کی قسم اور مقناطیسی فیلڈ کی طاقت سے متعلق ہوتی ہے (یعنی قربت اور حرکت مقناطیس کی شکل میں ہمیں دکھایا گیا ہے)۔ ہر انفرادی ذرہ کو مقناطیسی کیا جا رہا ہے اور اس کے اپنے مقامی مقناطیسی میدان کو شامل کیا جا رہا ہے۔ یہ الگ الگ فیلڈ دوسرے ذرات کی مقامی کشش اور تخریبی قوتوں کی مقامی قوتوں کی وجہ سے گروپ سٹرنگ جیسی حرکات کے ساتھ دوسرے ملتے جلتے ذرات کو جمع اور مربوط کرنے کا سبب بنتے ہیں۔
سیال سے بھرے کیپلیریوں اور (c،d) ہوا سے بھرے ٹریچیا کے اندر پیدا ہونے والی اسکیمیٹک نمائش (a,b) پارٹیکل ٹرینز۔ نوٹ کریں کہ کیپلیریاں اور trachea پیمانے پر نہیں کھینچے جاتے ہیں۔ پینل (a) میں MP کی تفصیل بھی ہوتی ہے، جس میں Fe3O4 ذرات کو تاروں میں ترتیب دیا جاتا ہے۔
جب مقناطیس کو کیپلیری کے اوپر منتقل کیا گیا تو، پارٹیکل سٹرنگ کا زاویہ MP3-5 کے لیے Fe3O4 پر مشتمل ایک نازک حد تک پہنچ گیا، جس کے بعد پارٹیکل سٹرنگ اصل پوزیشن میں نہیں رہی، بلکہ سطح کے ساتھ ساتھ ایک نئی پوزیشن پر چلی گئی۔ یہ اثر اس لیے ہونے کا امکان ہے کیونکہ شیشے کی کیپلیری سطح اس حد تک ہموار ہوتی ہے کہ MP6 ایم پی میں حرکت کرنے کے لیے کافی ہموار ہو۔ اس طرح سے برتاؤ نہیں کیا، ممکنہ طور پر کیونکہ ذرات چھوٹے تھے، مختلف کوٹنگز یا سطح کے چارجز تھے، یا ملکیتی کیریئر سیال نے ان کی حرکت کرنے کی صلاحیت کو متاثر کیا تھا۔ CombiMag ذرات کا امیج کنٹراسٹ بھی کمزور ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ سیال اور ذرات کی کثافت یکساں ہو سکتی ہے اور اس وجہ سے اگر وہ ایک دوسرے کی طرف بہت تیزی سے حرکت کر سکتے ہیں، تو وہ آسانی سے حرکت نہیں کر سکتے۔ اس بات کی نشاندہی کرتے ہوئے کہ مقناطیسی میدان کی طاقت ہمیشہ سیال میں موجود ذرات کے درمیان رگڑ پر قابو نہیں پا سکتی، یہ تجویز کرتی ہے کہ شاید یہ حیرت کی بات نہیں ہے کہ مقناطیسی میدان کی طاقت اور مقناطیس اور ہدف کے علاقے کے درمیان فاصلہ بہت اہم ہے۔ یہ نتائج یہ بھی بتاتے ہیں کہ، جب کہ میگنےٹ بہت سے ایم پیز کو پکڑ سکتے ہیں جو ہدف کے علاقے سے گزرتے ہیں، یہ کم میگنیٹ کے برعکس حرکت پذیر ہو سکتا ہے۔ trachea کی سطح کے ساتھ ذرات۔ اس لیے، ہم یہ نتیجہ اخذ کرتے ہیں کہ Vivo LV-MP اسٹڈیز میں جامد مقناطیسی فیلڈز کو جسمانی طور پر فضائی راستے کے درخت کے مخصوص علاقوں کو نشانہ بنانے کے لیے استعمال کرنا چاہیے۔
جب ذرات جسم میں پہنچائے جاتے ہیں، تو پیچیدہ حرکت پذیر جسمانی بافتوں کے تناظر میں ان کی شناخت مشکل ہوتی ہے، لیکن ان کا پتہ لگانے کی صلاحیت میں مقناطیس کو ٹریچیا کے اوپر افقی طور پر ایم پی سٹرنگز کو "مگلنے" کے لیے ترجمہ کر کے بڑھایا گیا تھا۔ اگرچہ لائیو امیجنگ ممکن ہے، یہ جاننا آسان ہے کہ جب ذرہ انسانی طور پر سب سے زیادہ مقام پر انسانی ایم پی حرکت میں مارا جاتا ہے۔ مقناطیس کو امیجنگ ایریا کے اوپر رکھا گیا تھا، حالانکہ کچھ ذرات عام طور پر ٹریچیا کے ساتھ ساتھ پائے جاتے تھے۔ وٹرو اسٹڈیز کے برعکس، مقناطیس کا ترجمہ کرکے ذرات کو ٹریچیا کے ساتھ نہیں گھسیٹا جا سکتا۔ یہ دریافت اس بات سے مطابقت رکھتی ہے کہ کس طرح ٹریچیا کی سطح کو کوٹ کرنے والا بلغم عام طور پر ان کے اندر ذرات کو مساوی طور پر پروسس کرتا ہے۔ mucociliary کلیئرنس میکانزم کی طرف سے صاف.
ہم نے قیاس کیا کہ ٹریچیا (تصویر 3b) کے اوپر اور نیچے کشش کے لیے میگنےٹس کے استعمال کا نتیجہ زیادہ یکساں مقناطیسی فیلڈ کا باعث بن سکتا ہے، بجائے اس کے کہ ایک مقناطیسی میدان جو ایک نقطہ پر انتہائی مرتکز ہو، ممکنہ طور پر ذرات کی زیادہ یکساں تقسیم کا باعث بنتا ہے۔ پیچھے ہٹانے کے لیے میگنےٹ (تصویر 3c) کے نتیجے میں امیج والے علاقے میں ذرہ ذیادہ جمع نہیں ہوا۔ یہ دونوں نتائج یہ ظاہر کرتے ہیں کہ دوہری مقناطیس سیٹ اپ ایم پی ٹارگٹنگ کے مقامی کنٹرول کو نمایاں طور پر بہتر نہیں کرتا ہے، اور اس کے نتیجے میں مضبوط مقناطیسی قوتوں کو ترتیب دینا مشکل ہے، جس سے یہ نقطہ نظر کم عملی ہوتا ہے۔ تصویر والے حصے میں رکھے ہوئے ذرات کی تعداد میں اضافہ نہیں ہوا۔ ان میں سے کچھ متبادل کنفیگریشنز کامیاب نہیں ہو سکتیں کیونکہ ان کے نتیجے میں جمع ہونے والے علاقے کے اندر مقناطیسی فیلڈ کی طاقت کم ہوتی ہے۔ اس لیے، ویوو ٹیسٹنگ کے لیے واحد 30 ڈگری زاویہ مقناطیس کنفیگریشن (شکل 3a) کو سب سے آسان اور موثر طریقہ سمجھا جاتا ہے۔
LV-MP مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ جب LV ویکٹرز کو CombiMag کے ساتھ ملایا گیا اور مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں جسمانی ہنگامہ آرائی کے بعد پہنچایا گیا تو ٹراچیا میں کنٹرول کے مقابلے میں نقل و حمل کی سطح نمایاں طور پر بڑھ گئی تھی۔ سنکروٹرون امیجنگ اسٹڈیز اور LacZ کے نتائج کی بنیاد پر، مقناطیسی فیلڈ بظاہر اس قابل تھا کہ LV کی تعداد کو محفوظ کر سکے اور LV کی تعداد کو کم کر سکے۔ فوری طور پر پھیپھڑوں میں گہرائی میں داخل ہو جاتا ہے۔ اس طرح کی ٹارگٹنگ بہتری ڈیلیور شدہ ٹائٹرز، آف ٹارگٹ ٹرانسڈکشن، سوزش اور مدافعتی ضمنی اثرات، اور جین کیریئر کے اخراجات کو کم کرتے ہوئے اعلی افادیت کا باعث بن سکتی ہے۔ تیزاب
پوسٹ ٹائم: جولائی 16-2022
