Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильдерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Муковисцидозды өкпе ауруын емдеуге арналған ген векторлары өткізгіш тыныс алу жолдарына бағытталуы керек, себебі перифериялық өкпе трансдукциясы терапиялық пайда әкелмейді. Вирустық трансдукция тиімділігі вектордың тұру уақытына тікелей байланысты. Дегенмен, ген тасымалдаушылары сияқты жеткізу сұйықтықтары дем алу кезінде альвеолаларға табиғи түрде диффузияланады және кез келген түрдегі терапиялық бөлшектер шырышты-цилиарлы тасымалдау арқылы тез жойылады. Тыныс алу жолдарында ген тасымалдаушыларының тұру уақытын ұзарту маңызды, бірақ оған қол жеткізу қиын. Тыныс алу жолдарының бетіне бағытталуы мүмкін ген тасымалдаушысымен конъюгацияланған магниттік бөлшектер аймақтық нысанаға алуды жақсарта алады. In vivo визуализациясының қиындықтарына байланысты, қолданбалы магнит өрісі болған кезде тыныс алу жолының бетіндегі мұндай кішкентай магниттік бөлшектердің әрекеті нашар түсініледі. Бұл зерттеудің мақсаты анестезияланған егеуқұйрықтардың трахеясындағы бірқатар магниттік бөлшектердің in vivo қозғалысын визуализациялау үшін синхротронды бейнелеуді пайдалану болды, бұл in vivo жеке және көлемді бөлшектердің әрекетінің динамикасы мен заңдылықтарын зерттеу болды. Содан кейін біз магнит өрісі болған кезде лентивирустық магниттік бөлшектерді жеткізу егеуқұйрықта трансдукция тиімділігін арттыратынын бағаладық. Трахея. Синхротронды рентгендік бейнелеу магниттік бөлшектердің in vitro және in vivo стационарлық және қозғалмалы магнит өрістеріндегі әрекетін көрсетеді. Бөлшектерді магниттермен тірі тыныс алу жолының беті бойымен оңай сүйреу мүмкін емес, бірақ тасымалдау кезінде шөгінділер магнит өрісі ең күшті болатын көру өрісінде шоғырланады. Лентивирустық магниттік бөлшектер магнит өрісінің қатысуымен жеткізілген кезде трансдукция тиімділігі алты есеге артты. Бұл нәтижелер бірге лентивирустық магниттік бөлшектер мен магнит өрістері ген векторын нысанаға алуды жақсарту және in vivo өткізгіш тыныс алу жолдарында трансдукция деңгейін арттыру үшін құнды тәсілдер болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Муковисцидоз (КФ) CF трансмембраналық өткізгіштік реттегіші (CFTR) деп аталатын бір геннің өзгеруінен туындайды. CFTR ақуызы - бұл CF патогенезінің негізгі орны болып табылатын өткізгіш тыныс алу жолдарын қоса алғанда, дененің көптеген эпителий жасушаларында болатын иондық арна. CFTR ақаулары судың қалыптан тыс тасымалдануына, тыныс алу жолдарының бетін құрғатуға және тыныс алу жолдарының бетіндегі сұйықтық (ASL) қабатының тереңдігін азайтуға әкеледі. Бұл сондай-ақ шырышты тасымалдау (MCT) жүйесінің тыныс алу жолдарынан ингаляциялық бөлшектер мен патогендерді тазарту қабілетін нашарлатады. Біздің мақсатымыз - CFTR генінің дұрыс көшірмесін жеткізу және ASL, MCT және өкпе денсаулығын жақсарту үшін лентивирустық (LV) гендік терапияны әзірлеу, сондай-ақ осы параметрлерді in vivo1 өлшеуге қабілетті жаңа технологияларды әзірлеуді жалғастыру.
Сол жақ қарынша векторлары CF тыныс алу жолдарының гендік терапиясының жетекші кандидаттарының бірі болып табылады, себебі олар терапиялық генді тыныс алу жолдарының базальды жасушаларына (тыныс алу бағаналы жасушаларына) тұрақты түрде біріктіре алады. Бұл маңызды, себебі олар функционалды генмен түзетілген CF-байланысты тыныс алу жолдарының беткі жасушаларына дифференциациялау арқылы қалыпты ылғалдану мен шырышты тазартуды қалпына келтіре алады, бұл өмір бойы пайда әкеледі. Сол жақ қарынша векторлары өткізгіш тыныс алу жолына қарсы бағытталуы керек, себебі CF өкпе ауруы осы жерден басталады. Векторды өкпеге тереңірек жеткізу альвеолярлық трансдукцияға әкелуі мүмкін, бірақ бұл CF-де терапиялық пайда әкелмейді. Дегенмен, ген тасымалдаушылар сияқты сұйықтықтар босанғаннан кейін дем алғанда альвеолаларға табиғи түрде ауысады3,4 және терапиялық бөлшектер MCT арқылы ауыз қуысына тез тазартылады. Сол жақ қарыншаның трансдукция тиімділігі вектордың жасушалық сіңіруге мүмкіндік беру үшін нысана жасушаларының жанында қалу уақытының ұзақтығына тікелей байланысты - «тұру уақыты»5 - бұл әдеттегі аймақтық ауа ағынымен, сондай-ақ үйлестірілген бөлшектердің шырышты ұстауы және MCT арқылы оңай азаяды. CF үшін сол жақ қарыншаның тыныс алу жолында болу уақытын ұзарту мүмкіндігі бұл аймақта трансдукцияның жоғары деңгейіне жету үшін маңызды, бірақ... әлдеқайда қиын болды.
Бұл кедергіні жеңу үшін біз сол жақ қарыншаның магниттік бөлшектерінің (СҚБ) екі өзара толықтыратын жолмен көмектесе алатынын болжаймыз. Біріншіден, оларды нысанаға алуды жақсарту және ген тасымалдаушы бөлшектерінің қажетті тыныс алу аймағында орналасуына көмектесу үшін тыныс алу жолдарының бетіне магниттік бағыттауға болады; және ASL) жасуша қабатына 6 жылжуға көмектеседі. СҚБ антиденелерге, химиотерапиялық препараттарға немесе жасуша мембраналарына бекітілетін немесе тиісті жасуша бетінің рецепторларына байланысатын және статикалық электр тогының қатысуымен ісік орындарында жиналатын басқа да ұсақ молекулаларға байланысқан кезде дәрі-дәрмектің нысанаға бағытталған жеткізу құралдары ретінде кеңінен қолданылды. Қатерлі ісіктерді емдеуге арналған магнит өрістері 7. Басқа «гипертермиялық» әдістер тербелмелі магнит өрістеріне ұшыраған кезде MP-лерді қыздыруға, осылайша ісік жасушаларын жоюға бағытталған. ДНҚ-ны жасушаларға тасымалдауды күшейту үшін магнит өрісі трансфекция агенті ретінде қолданылатын магниттік трансфекция принципі in vitro жағдайында трансдюциясы қиын жасуша желілері үшін вирустық емес және вирустық ген векторларының бірқатарын қолдану арқылы кеңінен қолданылады. Сол жақ қарыншаның магнитотрансфекциясының тиімділігі анықталды, статикалық магнит өрісі болған кезде LV-MP-лерді адам бронх эпителий жасуша желісіне in vitro жеткізу арқылы трансдукция тиімділігін тек сол жақ қарынша векторымен салыстырғанда 186 есе арттырады. Сол жақ қарыншаның магнитотрансфекциясы in vitro CF моделіне де қолданылды, мұнда магниттік трансфекция CF қақырығы болған кезде ауа-сұйықтық интерфейс дақылдарындағы сол жақ қарыншаның трансдюкциясын 20 есе арттырды10. Дегенмен, органдардың in vivo магнитотрансфекциясы салыстырмалы түрде аз көңіл бөлінді және тек бірнеше жануарларда бағаланды. зерттеулер11,12,13,14,15, әсіресе өкпеде16,17. Соған қарамастан, CF өкпе терапиясында магниттік трансфекция мүмкіндіктері айқын. Тан және т.б. (2020) «тиімді магниттік нанобөлшектерді өкпеге жеткізудің тұжырымдамасын дәлелдейтін зерттеу CFTR ингаляциялық стратегияларының болашақта CFTR науқастарында клиникалық нәтижелерді жақсартуға жол ашады»6 деп мәлімдеді.
Қолданылған магнит өрісі болған кезде тыныс алу жолдарының беттеріндегі ұсақ магниттік бөлшектердің әрекетін визуализациялау және зерттеу қиын, сондықтан ол нашар түсініледі. Басқа зерттеулерде біз ASL тереңдігіндегі18 және MCT мінез-құлқындағы19,20 минуттық in vivo өзгерістерді инвазивті емес түрде визуализациялау және сандық бағалау үшін синхротронды таралуға негізделген фазалық-контрастты рентгендік бейнелеу (PB-PCXI) әдісін әзірледік, бұл газ каналының беткі гидратациясын тікелей өлшеу үшін қолданылады және емдеу тиімділігінің ерте көрсеткіші ретінде пайдаланылады. Сонымен қатар, біздің MCT бағалау әдісіміз PB-PCXI21 көмегімен көрінетін MCT маркерлері ретінде алюминий оксидінен немесе жоғары сыну көрсеткіші бар шыныдан тұратын диаметрі 10-35 мкм бөлшектерді пайдаланады. Екі әдіс те MP-ді қоса алғанда, әртүрлі бөлшектер түрлерін визуализациялауға жарамды.
Кеңістіктік және уақытша ажыратымдылығының жоғары болуына байланысты, біздің PB-PCXI негізіндегі ASL және MCT талдау әдістеріміз MP генін жеткізу әдістерін түсінуге және оңтайландыруға көмектесетін in vivo жеке және көлемді бөлшектердің мінез-құлқының динамикасы мен үлгілерін зерттеуге өте қолайлы. Біз мұнда қолданатын тәсіл SPring-8 BL20B2 сәулелік сызығын пайдаланатын зерттеулерімізден туындайды, онда біз ген тасымалдаушы дозасын жануарларға зерттеуде байқалған біркелкі емес ген экспрессиясының үлгілерін түсіндіруге көмектесу үшін тышқандардың мұрын және өкпе тыныс алу жолдарына жалған векторлық дозаны жеткізуден кейінгі сұйықтық қозғалысын көрнекі түрде көрсеттік 3,4.
Бұл зерттеудің мақсаты тірі егеуқұйрықтардың трахеясындағы бірқатар MP-лердің in vivo қозғалыстарын визуализациялау үшін синхротрон PB-PCXI пайдалану болды. Бұл PB-PCXI бейнелеу зерттеулері MP қозғалысына әсерін анықтау үшін MP диапазонын, магнит өрісінің күшін және орналасуын тексеруге арналған. Біз сыртқы қолданылатын магнит өрісі жеткізілген MP-нің мақсатты аймақта қалуына немесе қозғалуына көмектеседі деп болжадық. Бұл зерттеулер сонымен қатар тұндырылғаннан кейін трахеяда сақталатын бөлшектердің санын барынша арттыратын магнит конфигурацияларын анықтауға мүмкіндік берді. Зерттеулердің екінші сериясында біз LV-MP-лерді егеуқұйрықтың тыныс алу жолына in vivo жеткізу нәтижесінде пайда болатын трансдукция үлгісін көрсету үшін осы оңтайлы конфигурацияны пайдалануға тырыстық, бұл LV-MP-лерді тыныс алу жолдарын нысанаға алу аясында жеткізу сол жақ трансдукция тиімділігін арттырады деген болжамға негізделген.
Барлық жануарларға жүргізілген зерттеулер Аделаида университеті (M-2019-060 және M-2020-022) және SPring-8 Синхротронды жануарлар этикасы комитеті бекіткен хаттамаларға сәйкес жүргізілді. Тәжірибелер ARRIVE нұсқауларына сәйкес жүргізілді.
Барлық рентгендік бейнелеу Жапониядағы SPring-8 синхротронындағы BL20XU сәулелік желісінде бұрын сипатталғанға ұқсас қондырғыны пайдаланып жүргізілді21,22. Қысқаша айтқанда, эксперименттік қорап синхротронды сақтау сақинасынан 245 м қашықтықта орналасқан. Фазалық контраст әсерлерін жасау үшін бөлшектерді бейнелеу зерттеулері үшін 0,6 м үлгіден детекторға дейінгі қашықтық және in vivo бейнелеу зерттеулері үшін 0,3 м пайдаланылады. 25 кэВ монохроматикалық сәуле энергиясы қолданылды. Кескіндер sCMOS детекторына қосылған жоғары ажыратымдылықтағы рентгендік түрлендіргіш (SPring-8 BM3) арқылы түсірілді. Түрлендіргіш рентген сәулелерін көрінетін жарыққа 10 мкм қалыңдықтағы сцинтиллятор (Gd3Al2Ga3O12) арқылы түрлендіреді, содан кейін ол × 10 микроскоптық объектив (NA 0,3) көмегімен sCMOS сенсорына бағытталады. sCMOS детекторы массив өлшемі бар Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Жапония) болды. 2048 × 2048 пиксель және шикі пиксель өлшемі 6,5 × 6,5 мкм. Бұл орнату 0,51 мкм тиімді изотропты пиксель өлшемін және шамамен 1,1 мм × 1,1 мм көру өрісін береді. Тыныс алудан туындаған қозғалыс артефактілерін азайта отырып, тыныс алу жолының ішіндегі және сыртындағы магниттік бөлшектердің сигнал-шу қатынасын барынша арттыру үшін 100 мс экспозиция ұзындығы таңдалды. In vivo зерттеулер үшін рентген сәулесін экспозициялар арасында блоктау арқылы сәулелену дозасын шектеу үшін рентген жолына жылдам рентген жапқышы орналастырылды.
Сол жақ қарыншаның тасымалдаушысы SPring-8 PB-PCXI бейнелеу зерттеулерінде пайдаланылмады, себебі BL20XU бейнелеу камерасы 2-ші биоқауіпсіздік деңгейі бойынша сертификатталмаған. Оның орнына, біз екі коммерциялық жеткізушіден әртүрлі өлшемдерді, материалдарды, темір концентрацияларын және қолданылуын қамтитын жақсы сипатталған MP-лерді таңдадық, алдымен магнит өрістерінің шыны капиллярлардағы, содан кейін тірі тыныс алу жолдарындағы MP қозғалысына қалай әсер ететінін түсіну үшін. бетінде. МП өлшемі 0,25-тен 18 мкм-ге дейін және әртүрлі материалдардан жасалған (1-кестені қараңыз), бірақ әрбір үлгінің құрамы, соның ішінде МП ішіндегі магниттік бөлшектердің өлшемі белгісіз. Біздің кең ауқымды MCT зерттеулерімізге 19, 20, 21, 23, 24 сүйене отырып, біз 5 мкм-ге дейінгі МП-ларды трахея тыныс алу жолдарының бетінде көруге болады деп күтеміз, мысалы, МП қозғалысының көрінуін жақсарту үшін тізбекті кадрларды алып тастау арқылы. Бір 0,25 мкм өлшемді МП бейнелеу құрылғысының ажыратымдылығынан кішірек, бірақ PB-PCXI олардың көлемдік контрастын және олар тұндырылған беттік сұйықтықтың қозғалысын анықтайды деп күтілуде.
1-кестедегі әрбір MP үшін үлгілер ішкі диаметрі 0,63 мм болатын 20 мкл шыны капиллярларда (Drummond Microcaps, PA, АҚШ) дайындалды. Корпускулярлық бөлшектер суда, ал CombiMag бөлшектері өндірушінің меншікті сұйықтығында қолжетімді. Әрбір түтік сұйықтықпен жартылай толтырылған (шамамен 11 мкл) және үлгі ұстағышқа орналастырылған (1-суретті қараңыз). Шыны капиллярлар сәйкесінше бейнелеу қорабындағы үлгі сатысына көлденең орналастырылды және сұйықтықтың шеттері орналастырылды. Диаметрі 19 мм (ұзындығы 28 мм) никель қабығы бар сирек кездесетін жер неодимий темір бор (NdFeB) магниті (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) бейнелеу кезінде оның орнын қашықтан өзгерту үшін бөлек трансляция сатысына бекітілді. Рентген кескінін алу магнит үлгіден шамамен 30 мм жоғары орналасқан кезде басталады және кескіндер секундына 4 кадр жылдамдығымен алынады. Бейнелеу кезінде магнит жақындатылды. шыны капиллярлық түтікке (шамамен 1 мм қашықтықта), содан кейін өріс кернеулігі мен орналасуының әсерін бағалау үшін түтік бойымен жылжытылады.
Xy трансляция сатысындағы шыны капиллярлардағы MP үлгілерін қамтитын in vitro бейнелеу қондырғысы. Рентген сәулесінің жолы қызыл үзік сызықпен белгіленген.
MP-лердің in vitro көрінуі анықталғаннан кейін, олардың бір бөлігі жабайы типтегі аналық альбинос Wistar егеуқұйрықтарында (~12 апталық, ~200 г) in vivo сыналды. 0,24 мг/кг медетомидин (Domitor®, Zenoaq, Жапония), 3,2 мг/кг мидазолам (Dormicum®, Astellas Pharma, Жапония) және 4 мг/кг буторфанол (Vetorphale®, Meiji Seika) егеуқұйрықтары Pharma (Japan) қоспасымен ішперде ішіне енгізу арқылы анестезияланды. Анестезиядан кейін олар трахеяның айналасындағы жүнді алып тастау, эндотрахеальды түтікті (ET; 16 Ga iv канюлясы, Terumo BCT) енгізу және дене температурасын ұстап тұру үшін термиялық пакеті бар арнайы жасалған бейнелеу пластинасына шалқасынан жатқызу арқылы бейнелеуге дайындалды. 22 Содан кейін бейнелеу пластинасы рентгендік кескінде трахеяны көлденеңінен туралау үшін бейнелеу қорабындағы үлгіні аудару сатысына аздап бұрышпен бекітілді, 2a суретте көрсетілгендей.
(a) SPring-8 бейнелеу қорабындағы in vivo бейнелеу қондырғысында рентген сәулесінің жолы қызыл үзік сызықпен белгіленген.(b,c) Трахеядағы магнитті локализациялау екі ортогональды орнатылған IP камераны пайдаланып қашықтан орындалды. Экрандағы кескіннің сол жағында басты ұстап тұрған сым ілмегі және ЭТ түтігінің ішіндегі жеткізу канюлясы көрінеді.
100 мкл шыны шприцті пайдаланатын қашықтан басқарылатын шприц сорғы жүйесі (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) 30 Ga ине арқылы PE10 түтігіне (OD 0,61 мм, ID 0,28 мм) қосылды. ET түтігін енгізген кезде ұшының кеңірдектегі дұрыс күйде екеніне көз жеткізу үшін түтікті белгілеңіз. Микросорғыны пайдаланып, шприц поршені түтіктің ұшы жеткізілетін MP үлгісіне батырылған кезде алынып тасталды. Содан кейін жүктелген жеткізу түтігі эндотрахеальды түтікке енгізіліп, ұшы күтілетін магнит өрісінің ең күшті бөлігіне орналастырылды. Кескінді алу Arduino негізіндегі уақыт қорабына қосылған тыныс алу детекторы арқылы басқарылды және барлық сигналдар (мысалы, температура, тыныс алу, жапқышты ашу/жабу және кескін алу) Powerlab және LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) 22 көмегімен жазылды. Кескінді алу кезінде Қоршау қолжетімсіз болған кезде, екі IP камера (Panasonic BB-SC382) бір-біріне шамамен 90° бұрышта орналастырылды және пайдаланылды. бейнелеу кезінде магниттің кеңірдекпен салыстырғандағы орнын бақылау үшін (2b,c-сурет). Қозғалыс артефактілерін азайту үшін, толқын ағынының соңындағы плато кезінде әр тыныс алу үшін бір кескін алынды.
Магнит екінші сатыға бекітілген, оны бейнелеу корпусының сыртынан қашықтан орналастыруға болады. Магниттің әртүрлі орналасулары мен конфигурациялары тексерілді, соның ішінде: Трахеядан шамамен 30° бұрышпен орнатылған (конфигурациялар 2a және 3a суреттерінде көрсетілген); бір магнит жануардың үстінде, екіншісі төменде, полюстері тартылатындай етіп орнатылған (3b сурет); бір магнит жануардың үстінде, екіншісі төменде, полюстері итерілетіндей етіп орнатылған (3c сурет); және бір магнит трахеяның үстінде және оған перпендикуляр (3d сурет). Жануар мен магнит конфигурацияланғаннан кейін және тексерілетін MP шприц сорғысына салынғаннан кейін, кескіндерді алу кезінде 4 мкл/сек жылдамдықпен 50 мкл дозаны енгізіңіз. Содан кейін магнит кескіндерді алуды жалғастыра отырып, трахея бойымен немесе көлденеңінен алға және артқа жылжытылады.
In vivo бейнелеуге арналған магнит конфигурациясы (а) кеңірдектің үстінде шамамен 30° бұрышта орналасқан бір магнит, (b) тарту үшін орнатылған екі магнит, (c) тебу үшін орнатылған екі магнит, (d) кеңірдектің үстінде және оған перпендикуляр орналасқан бір магнит. Бақылаушы ауыздан кеңірдек арқылы өкпеге қарады, ал рентген сәулесі егеуқұйрықтың сол жағынан өтіп, оң жағынан шықты. Магнит тыныс алу жолының бойымен немесе рентген сәулесінің бағыты бойынша кеңірдектің үстінде солға және оңға қарай қозғалады.
Біз сондай-ақ тыныс алу мен жүрек қозғалысын шатастырмаған кезде тыныс алу жолдарындағы бөлшектердің көрінуін және мінез-құлқын анықтауға тырыстық. Сондықтан, бейнелеу кезеңінің соңында жануарлар пентобарбиталдың артық дозалануы үшін адамгершілікпен өлтірілді (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, АҚШ; ~65 мг/кг ip). Кейбір жануарлар бейнелеу платформасында қалдырылды, ал тыныс алу мен жүрек соғысы тоқтағаннан кейін, бейнелеу процесі қайталанды, егер тыныс алу жолдарының бетінде MP көрінбесе, қосымша MP дозасы қосылды.
Алынған кескіндер жазық және күңгірт өрістерде түзетіліп, содан кейін MATLAB (R2020a, The Mathworks) тілінде жазылған арнайы сценарийді пайдаланып фильмге жиналды (секундына 20 кадр; тыныс алу жиілігіне байланысты 15-25 × қалыпты жылдамдық).
Барлық сол қарынша генінің векторын жеткізу зерттеулері Аделаида университетінің зертханалық жануарларды зерттеу орталығында жүргізілді және SPring-8 экспериментінің нәтижелерін магнит өрісі болған кезде сол қарынша-мольді геннің in vivo тасымалын күшейте алатынын бағалау үшін пайдалануға бағытталған. MP және магнит өрісінің әсерін бағалау үшін екі топ жануарлар емделді: бір топқа магнит орналастырылған сол қарынша-мольді ген берілді, ал екінші топқа магнитсіз сол қарынша-мольді гені бар бақылау тобы берілді.
LV генінің векторлары бұрын сипатталған 25, 26 әдістерін қолдану арқылы жасалды. LacZ векторы трансдуктивті жасушаларда көк реакция өнімін шығаратын, өкпе тінінің алдыңғы бөліктерінде және тін бөлімдерінде көрінетін конститутивті MPSV промоторы (LV-LacZ) басқаратын ядролық локализацияланған бета-галактозидаза генін білдіреді. Титрлеу жасуша дақылдарында LacZ оң жасушаларының санын гемоцитометрмен қолмен санау арқылы титрді TU/мл-де есептеу арқылы жүргізілді. Тасымалдаушылар -80 °C температурада криоконсервацияланады, қолданар алдында ерітіледі және жеткізу алдында 1:1 қатынасында араластыру және мұзда кемінде 30 минут инкубациялау арқылы CombiMag-қа байланады.
Қалыпты Sprague Dawley егеуқұйрықтарына (n = 3/топ, ~2-3) 0,4 мг/кг медетомидин (Domitor, Ilium, Австралия) және 60 мг/кг кетамин (Ilium, Австралия) айлық) ипп) инъекциясы және 16 Ga көктамыр ішіне канюлямен хирургиялық емес ауыз қуысына канюляция жасалды. Трахея тыныс алу жолдарының тінінің сол жақ трансдукцияны қабылдауын қамтамасыз ету үшін, ол бұрын сипатталған механикалық пертурбация хаттамасын қолдана отырып кондицияланды, онда трахея тыныс алу жолдарының беті сым себетпен (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, АҚШ) 30 с28 бойы осьтік түрде ысқыланды. Содан кейін сол жақ перкуссия-MP трахеяға енгізілді, бұл пертурбациядан шамамен 10 минуттан кейін биологиялық қауіпсіздік шкафында жүргізілді.
Бұл экспериментте қолданылған магнит өрісі in vivo рентгендік бейнелеу зерттеуіне ұқсас түрде конфигурацияланды, дәл сол магниттер дистилляциялық стент қысқыштарын пайдаланып трахеяның үстінде ұсталды (4-сурет). Бұрын сипатталғандай, гель ұшы бар пипетка арқылы трахеяға 50 мкл көлемдегі (2 × 25 мкл аликвоттар) LV-MP енгізілді (n = 3 жануар). Бақылау тобына (n = 3 жануар) магнит қолданбай бірдей LV-MP енгізілді. Инфузия аяқталғаннан кейін, канюля ET түтігінен алынады және жануар экстубацияланады. Магнит 10 минут бойы орнында қалады, содан кейін ол алынып тасталады. Егеуқұйрықтарға тері астына мелоксикам (1 мл/кг) дозасы берілді (Ilium, Австралия), содан кейін 1 мг/кг атипамазол гидрохлоридін (Antisedan, Zoetis, Австралия) ішке енгізу арқылы анестезияны кері қайтару жүргізілді. Егеуқұйрықтар анестезиядан толық айығып кеткенше жылы ұсталды және бақыланды.
Биологиялық қауіпсіздік шкафындағы LV-MP жеткізу құрылғысы. ЭТ түтігінің ашық сұр түсті Люер орталығы ауыздан шығып тұрғанын көруге болады, ал суретте көрсетілген пипетканың гель ұшы ЭТ түтігі арқылы трахеяға қажетті тереңдікке енгізіледі.
LV-MP дозалау процедурасынан кейін бір аптадан кейін жануарлар 100% CO2 ингаляциясы арқылы адамгершілікпен өлтірілді және LacZ экспрессиясы біздің стандартты X-gal емімізді қолдану арқылы бағаланды. Эндотрахеальды түтікті орналастырудан туындаған кез келген механикалық зақымдану немесе сұйықтықтың сақталуы талдауға кірмейтініне көз жеткізу үшін үш каудальды ең шеміршек сақинасы алынып тасталды. Әрбір трахея талдау үшін екі жарты жасау үшін бойлық кесілді және олар люминальды бетті көру үшін Minutien инесін (Fine Science Tools) пайдаланып силикон резеңкесі бар ыдысқа (Sylgard, Dow Inc) орнатылды. Трансдукцияланған жасушалардың таралуы мен үлгісі DigiLite камерасы және TCapture бағдарламалық жасақтамасы (Tucsen Photonics, Қытай) бар Nikon микроскопын (SMZ1500) пайдаланып фронтальды фотосуретке түсіру арқылы расталды. Кескіндер 20 есе үлкейтумен (кеңірдектің толық ені үшін ең жоғары параметрді қоса алғанда) алынды, трахеяның бүкіл ұзындығы біртіндеп бейнеленді, бұл әрбір кескіннің арасында кескінді «тігуге» мүмкіндік беретін жеткілікті қабаттасуды қамтамасыз етеді. Кескіндерден алынған суреттер Әрбір трахея жазық қозғалыс алгоритмін пайдаланып, Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) көмегімен бірыңғай композиттік кескінге жиналды. Әрбір жануардың трахеясының композиттік кескіндеріндегі LacZ экспрессия аймақтары бұрын сипатталғандай автоматтандырылған MATLAB скриптін (R2020a, MathWorks) пайдаланып, 0,35 < реңк < 0,58, қанықтылық > 0,15 және мән < 0,7 параметрлерін пайдаланып сандық анықталды. Тіннің контурларын бақылау арқылы тін аймағын анықтау және трахея тінінің сыртынан кез келген жалған анықтаулардың алдын алу үшін әрбір композиттік кескін үшін GIMP v2.10.24 нұсқасында маска қолмен жасалды. Әрбір жануардың барлық композиттік кескіндерінен боялған аймақтар сол жануардың боялған жалпы ауданын жасау үшін қосылды. Содан кейін боялған аймақ қалыпқа келтірілген аймақты жасау үшін масканың жалпы ауданына бөлінді.
Әрбір кеңірдек парафинге салынып, 5 мкм кесінділер кесілді. Кесіндтер 5 минут бойы бейтарап қызыл түспен боялды және кескіндер Nikon Eclipse E400 микроскопы, DS-Fi3 камерасы және NIS элементтерін түсіру бағдарламалық жасақтамасы (5.20.00 нұсқасы) арқылы алынды.
Барлық статистикалық талдаулар GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) бағдарламасында жүргізілді. Статистикалық маңыздылық p ≤ 0,05 деңгейінде белгіленді. Қалыптылық Шапиро-Уилк сынағы арқылы тексерілді, ал LacZ бояуындағы айырмашылықтар жұпталмаған t-тесті арқылы бағаланды.
1-кестеде сипатталған алты MP PCXI көмегімен зерттелді, ал көріну 2-кестеде сипатталған. PCXI астында екі полистирол MP (MP1 және MP2; сәйкесінше 18 мкм және 0,25 мкм) көрінбеді, бірақ қалған үлгілерді анықтауға болатын (мысалдар 5-суретте көрсетілген). MP3 және MP4 (сәйкесінше 10-15% Fe3O4; 0,25 мкм және 0,9 мкм) әлсіз көрінеді. Сыналған ең кішкентай бөлшектердің кейбірін қамтығанымен, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) ең айқын болды. CombiMag өнімі MP6 анықтау қиын. Барлық жағдайларда магнитті капиллярға параллель алға және артқа аудару арқылы MP анықтау мүмкіндігіміз айтарлықтай жақсарды. Магниттер капиллярдан алыстаған кезде, бөлшектер ұзын жіптер түрінде созылды, бірақ магниттер жақындаған сайын және магнит өрісінің күші артқан сайын, бөлшектер капиллярдың жоғарғы бетіне қарай жылжыған сайын бөлшектер жіптері қысқарды (қосымша S1 бейнесін қараңыз: MP4), беттің бөлшектер тығыздығын арттырады. Керісінше, магнит капиллярдан алынған кезде өріс кернеулігі төмендейді және MP-лер капиллярдың жоғарғы бетінен созылатын ұзын жіптерге қайта орналасады (қосымша S2 бейнесін қараңыз: MP4). Магнит қозғалуын тоқтатқаннан кейін, бөлшектер тепе-теңдік күйіне жеткеннен кейін қысқа уақыт бойы қозғала береді. MP капиллярдың жоғарғы бетіне қарай және одан алыстаған кезде, магниттік бөлшектер әдетте қоқысты сұйықтық арқылы сүйрейді.
PCXI астындағы MP көрінуі үлгілер арасында айтарлықтай өзгереді.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 және (d) MP6. Мұнда көрсетілген барлық суреттер капиллярдың үстінде шамамен 10 мм қашықтықта орналасқан магнитпен түсірілген. Көрінетін үлкен шеңберлер капиллярларда ұсталған ауа көпіршіктері болып табылады, олар фазалық контрастты бейнелеудің қара және ақ жиек ерекшеліктерін анық көрсетеді. Қызыл қорапта контрастты күшейтетін үлкейту көрсетілген. Барлық суреттердегі магнит схемаларының диаметрлері масштабталмағанын және көрсетілгеннен шамамен 100 есе үлкен екенін ескеріңіз.
Магнит капиллярдың жоғарғы жағы бойымен солға және оңға жылжытылған кезде, MP тізбегінің бұрышы магнитпен тураланады (6-суретті қараңыз), осылайша магнит өрісі сызықтарын анықтайды. MP3-5 үшін хорда шекті бұрышқа жеткеннен кейін бөлшектер капиллярдың жоғарғы беті бойымен сүйреледі. Бұл көбінесе MP-лердің магнит өрісі ең күшті жерге жақын үлкен топтарға жиналуына әкеледі (қосымша S3:MP5 бейнесін қараңыз). Бұл әсіресе капиллярдың ұшына жақын бейнелеу кезінде айқын көрінеді, бұл MP-лердің сұйықтық-ауа интерфейсінде агрегациялануына және шоғырлануына әкеледі. MP6 құрамындағы MP3-5-ке қарағанда ажырату қиынырақ бөлшектер магнит капилляр бойымен қозғалған кезде сүйрелмеді, бірақ MP тізбектері диссоциацияланып, бөлшектерді көру өрісінде қалдырды (қосымша S4:MP6 бейнесін қараңыз). Кейбір жағдайларда, магнитті бейнелеу орнынан үлкен қашықтыққа жылжыту арқылы қолданылатын магнит өрісі азайған кезде, қалған MP-лер тізбекте қалып, ауырлық күшімен түтіктің төменгі бетіне баяу түсті (қосымша S5: MP3 бейнесін қараңыз).
Магнит капиллярдың үстінен оңға қарай жылжыған сайын MP тізбегінің бұрышы өзгереді.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 және (d) MP6. Қызыл қорапта контрастты күшейтетін үлкейту бар. Қосымша бейнелер ақпараттық екенін ескеріңіз, себебі олар осы статикалық кескіндерде көрінбейтін маңызды бөлшектердің құрылымы мен динамикалық ақпаратты ашады.
Біздің сынақтарымыз магнитті трахея бойымен баяу алға-артқа жылжыту in vivo күрделі қозғалыс жағдайында MP-ді визуализациялауды жеңілдететінін көрсетті. In vivo сынақтары жүргізілген жоқ, себебі полистирол моншақтары (MP1 және MP2) капиллярда көрінбеді. Қалған төрт MP-нің әрқайсысы магниттің ұзын осі трахеяның үстінде тікке шамамен 30° бұрышта конфигурацияланған кезде in vivo сыналды (2b және 3a суреттерін қараңыз), себебі бұл MP тізбектерінің ұзағырақ болуына әкелді және магнит конфигурациясы аяқталғаннан гөрі тиімдірек болды. MP3, MP4 және MP6 тірі жануарлардың трахеясында анықталмады. Жануарлар адамгершілікпен өлтірілгеннен кейін егеуқұйрықтардың тыныс алу жолдары бейнеленгенде, шприц сорғысын пайдаланып қосымша көлем қосылған кезде де бөлшектер көрінбей қалды. MP5 құрамында темір оксидінің мөлшері ең жоғары болды және жалғыз көрінетін бөлшек болды, сондықтан MP-нің in vivo мінез-құлқын бағалау және сипаттау үшін пайдаланылды.
MP жеткізу кезінде магнитті трахеяға қою көптеген MP-лердің, бірақ барлығы емес, көру аймағында шоғырлануына әкелді. Трахеяға енетін бөлшектерді адамгершілікпен құрбан етілген жануарларда жақсы байқауға болады. 7-сурет және қосымша бейне S6: MP5 вентральды трахея бетіндегі бөлшектердің тез магниттік ұсталуын және туралануын көрсетеді, бұл MP-лердің трахеяның қажетті аймақтарына бағытталуы мүмкін екенін көрсетеді. MP жеткізілгеннен кейін трахея бойымен дисталды түрде іздеу кезінде кейбір MP-лер каринаға жақынырақ табылды, бұл магнит өрісінің күші барлық MP-лерді жинау және ұстап тұру үшін жеткіліксіз екенін көрсетеді, себебі олар сұйықтық процесі кезінде магнит өрісінің максималды күші аймағы арқылы жеткізілді. Дегенмен, босанғаннан кейінгі MP концентрациясы бейнеленген аймақтың айналасында жоғары болды, бұл көптеген MP-лердің қолданылатын магнит өрісінің күші ең жоғары болатын тыныс алу жолдарының аймақтарында қалғанын көрсетеді.
Жақында эвтаназиядан өткен егеуқұйрықтың трахеясына MP5 жеткізілгенге дейінгі және (b) кейінгі суреттер, магнит бейнелеу аймағының тікелей үстінде орналасқан. Бейнеленген аймақ екі шеміршек сақинасының арасында орналасқан. MP жеткізілгенге дейін тыныс алу жолында сұйықтық болады. Қызыл қорапта контрастты күшейтетін үлкейту көрсетілген. Бұл суреттер S6:MP5 қосымша бейнесінде көрсетілген бейнеден алынған.
Магниттің трахея бойымен in vivo ауысуы MP тізбегінің тыныс алу жолының бетіндегі бұрышын капиллярларда байқалатындай етіп өзгертуіне әкелді (8-суретті және S7 қосымша бейнесін қараңыз: MP5). Дегенмен, біздің зерттеуімізде MP-ді тірі тыныс алу жолының беті бойымен капиллярлардағыдай сүйреу мүмкін болмады. Кейбір жағдайларда магнит солға және оңға қозғалған сайын MP тізбегі ұзарады. Қызығы, біз сондай-ақ магнит трахея бойымен бойлық қозғалған кезде бөлшектер тізбегінің беткі сұйықтық қабатының тереңдігін өзгертетінін және магнит тікелей жоғары қозғалғанда және бөлшектер тізбегі тік күйге бұрылғанда кеңейетінін анықтадық (S7 қосымша бейнесін қараңыз). : MP5 0:09-да, төменгі оң жақта). Магнит кеңірдектің жоғарғы жағына бүйірге қарай жылжытылған кезде қозғалыстың сипаттамалық үлгісі өзгерді (яғни, кеңірдектің ұзындығы бойынша емес, жануардың сол немесе оң жағына). Бөлшектер қозғалған кезде әлі де айқын көрінді, бірақ магнит кеңірдектен алынған кезде, бөлшектер тізбектерінің ұштары көрінді (0:08-ден бастап S8:MP5 қосымша бейнесін қараңыз). Бұл шыны капиллярдағы магнит өрісі кезінде байқаған MP әрекетіне сәйкес келеді.
Тірі анестезияланған егеуқұйрықтың кеңірдегіндегі MP5 көрсететін мысал суреттері.(a) Магнит кеңірдектің үстінде және сол жағындағы кескіндерді алу үшін қолданылады, содан кейін (b) магнит оңға жылжытылғаннан кейін. Қызыл қорапта контрастты күшейтетін үлкейту бар. Бұл кескіндер S7:MP5 қосымша бейнесінде көрсетілген бейнеден алынған.
Екі полюс кеңірдектің үстінде және астында солтүстік-оңтүстік бағытта конфигурацияланған кезде (яғни, тарту; 3b-сурет), MP хордалары ұзағырақ болып көрінді және дорсальды кеңірдек бетінде емес, кеңірдектің бүйір қабырғасында орналасқан (S9 қосымша бейнесін қараңыз: MP5). Дегенмен, қос магнитті құрылғы қолданылған кезде сұйықтық жеткізілгеннен кейін бір жерде (яғни, кеңірдектің дорсальды бетінде) бөлшектердің жоғары концентрациясы анықталмады, бұл әдетте бір магнитті құрылғы қолданылған кезде болады. Содан кейін бір магнит полюстерді кері итеруге конфигурацияланған кезде (3c-сурет), көру өрісінде көрінетін бөлшектер саны жеткізілгеннен кейін артпаған сияқты. Екі қос магнитті конфигурацияны да орнату магниттерді тиісінше тартатын немесе итеретін жоғары магнит өрісінің күшіне байланысты қиын. Содан кейін орнату тыныс алу жолына параллель, бірақ тыныс алу жолынан 90 градус бұрышта өтетін бір магнитке өзгертілді, сондықтан өріс сызықтары кеңірдек қабырғасын ортогональды түрде кесіп өтті (3d-сурет), бүйір қабырғадағы бөлшектердің агрегациясын байқауға болатынын анықтауға арналған бағыт. Дегенмен, бұл конфигурацияда MP жинақталуының немесе магнит қозғалысының анықталатын қозғалысы болған жоқ. Осы нәтижелердің барлығына сүйене отырып, in vivo ген тасымалдаушыларын зерттеу үшін бір магнитті, 30 градустық бағдарлау конфигурациясы (3a-сурет) таңдалды.
Жануар адамгершілікпен өлтірілгеннен кейін бірден бірнеше рет бейнеленгенде, шатастыратын тіндердің қозғалысының болмауы магниттің трансляциялық қозғалысына сәйкес «дірілдейтін» айқын интерхондральды өрісте ұсақ және қысқа бөлшектер сызықтарын ажыратуға болатынын білдірді. Дегенмен, MP6 бөлшектерінің болуы мен қозғалысын әлі де анық көре алмайды.
LV-LacZ титрі 1,8 × 108 TU/мл болды, ал CombiMag MP (MP6)-мен 1:1 араластырғаннан кейін жануарларға 9 × 107 TU/мл сол жақ қарыншаның 50 мкл трахеялық дозасы берілді (яғни 4,5 × 106 TU/егеуқұйрық). Бұл зерттеулерде босану кезінде магнитті аударудың орнына, біз магнитті бір қалыпта бекітіп, сол жақ қарыншаның трансдукциясын (а) магнит өрісі болмаған кезде векторлық жеткізумен салыстырғанда жақсартуға болатынын және (b) фокустауға болатынын анықтадық. Әуе жолдарының жасушалары жоғарғы тыныс алу жолдарының магниттік нысана аймақтарына трансдукцияланады.
Магниттердің болуы және CombiMag препаратын сол жақ қарынша векторларымен бірге қолдану жануарлар денсаулығына кері әсерін тигізбеген сияқты, біздің стандартты сол жақ қарынша векторын жеткізу хаттамамыз да солай болды. Механикалық бұзылуға ұшыраған трахея аймағының фронтальды суреттері (1-қосымша сурет) магнит болған кезде сол жақ қарынша-MP препаратымен емделген жануарлар тобында трансдукция деңгейінің айтарлықтай жоғары екенін көрсетті (9a-сурет). Бақылау тобында тек аз мөлшерде көк LacZ бояуы болды (9b-сурет). Қалыпқа келтірілген X-Gal боялған аймақтарды сандық бағалау сол жақ қарынша-MP препаратын магнит өрісі болған кезде енгізу шамамен 6 есе жақсарғанын көрсетті (9c-сурет).
LV-MP арқылы трахея трансдукциясын көрсететін мысалдық композиттік кескіндер (а) магнит өрісі болған кезде және (b) магнит болмаған кезде.(c) Магнит қолданған кезде трахеядағы қалыпқа келтірілген LacZ трансдукция аймағының статистикалық тұрғыдан маңызды жақсаруы (*p = 0,029, t-тест, әр топ үшін n = 3, орташа ± SEM).
Бейтарап тез қызыл боялған кесінділер (мысал 2-қосымша суретте көрсетілген) бұрын хабарланғандай ұқсас үлгіде және орналасқан жерде LacZ боялған жасушаларды көрсетті.
Тыныс алу жолдарының гендік терапиясының негізгі міндеті тасымалдаушы бөлшектердің қызығушылық аймақтарына дәл орналасуы және ауа ағыны мен белсенді шырышты тазарту кезінде қозғалатын өкпеде трансдукция тиімділігінің жоғары деңгейіне жету болып қала береді. CF тыныс алу жолдарының ауруын емдеуге арналған сол жақ қарынша тасымалдаушылары үшін тасымалдаушы бөлшектердің өткізгіш тыныс алу жолдарында болу уақытын арттыру бұрын-соңды қол жетпейтін мақсат болды. Кастеллани және т.б. атап өткендей, трансдукцияны жақсарту үшін магнит өрістерін пайдалану электропорация сияқты басқа ген жеткізу әдістерімен салыстырғанда артықшылықтарға ие, себебі ол қарапайымдылықты, үнемділікті, жеткізуді локализациялауды, тиімділікті арттыруды және инкубация уақытын қысқартуды және мүмкін тасымалдаушы дозасын азайтуды біріктіре алады10. Дегенмен, сыртқы магниттік күштердің әсерінен тыныс алу жолдарында магниттік бөлшектердің in vivo тұндыру және әрекеті ешқашан сипатталмаған, сондай-ақ бұл әдістің тірі тыныс алу жолдарында ген экспрессиясының деңгейін арттыру үшін in vivo мүмкіндігі көрсетілмеген.
Біздің in vitro синхротронды PCXI тәжірибелеріміз полистирол MP-ден басқа барлық бөлшектердің біз қолданған бейнелеу қондырғысында көрінетінін көрсетті. Магнит өрісі болған кезде MP-лер ұзындығы бөлшектердің түрі мен магнит өрісінің күшіне (яғни магниттің жақындығы мен қозғалысына) байланысты жіптерді құрайды. 10-суретте көрсетілгендей, біз байқайтын жіптер әрбір жеке бөлшектің магниттелуіне және өзінің жергілікті магнит өрісін тудыруына байланысты пайда болады. Бұл бөлек өрістер басқа ұқсас бөлшектердің агрегациялануына және қосылуына әкеледі, басқа бөлшектердің жергілікті тартымды және итеру күштерінен туындайтын жергілікті күштерге байланысты топтық жіп тәрізді қозғалыстар пайда болады.
Сызба (a,b) сұйықтыққа толы капиллярлардың ішінде және (c,d) ауаға толы кеңірдектің ішінде пайда болатын бөлшектер тізбегін көрсетеді. Капиллярлар мен кеңірдек масштаб бойынша салынбағанын ескеріңіз. (a) панелінде сонымен қатар Fe3O4 бөлшектерін тізбектерге орналастырған MP сипаттамасы бар.
Магнит капиллярдың үстінен жылжытылған кезде, бөлшектер тізбегінің бұрышы Fe3O4 бар MP3-5 үшін маңызды шекке жетті, содан кейін бөлшектер тізбегі бастапқы қалпында қалмай, беті бойымен жаңа қалыпқа жылжыды. магнит. Бұл әсер шыны капилляр беті бұл қозғалыстың орын алуына мүмкіндік беретіндей тегіс болғандықтан пайда болуы мүмкін. Қызығы, MP6 (CombiMag) бұлай әрекет етпеді, мүмкін бөлшектер кішірек, әртүрлі жабындары немесе беттік зарядтары болған немесе меншікті тасымалдаушы сұйықтық олардың қозғалу қабілетіне әсер еткен болуы мүмкін. CombiMag бөлшектерінің кескін контрасты да әлсіз, бұл сұйықтық пен бөлшектердің тығыздығы ұқсас болуы мүмкін және сондықтан бір-біріне оңай қозғалмайтынын көрсетеді. Магнит тым жылдам қозғалса, бөлшектер де тұрып қалуы мүмкін, бұл магнит өрісінің күші сұйықтықтағы бөлшектер арасындағы үйкелісті әрқашан жеңе алмайтынын көрсетеді, бұл магнит өрісінің күші мен магнит пен нысана аймағы арасындағы қашықтықтың өте маңызды екендігі таңқаларлық емес екенін көрсетеді. Жалпы алғанда, бұл нәтижелер магниттер нысана аймағы арқылы ағатын көптеген MP-ді ұстай алатын болса да, магниттерге сену екіталай екенін көрсетеді. CombiMag бөлшектерін трахея беті бойымен жылжытады. Сондықтан, біз in vivo LV-MP зерттеулерінде тыныс алу жолдары ағашының белгілі бір аймақтарын физикалық түрде нысанаға алу үшін статикалық магнит өрістерін пайдалану керек деген қорытындыға келдік.
Бөлшектер денеге жеткізілгенде, күрделі қозғалатын дене тіндері жағдайында оларды анықтау қиын, бірақ оларды анықтау мүмкіндігі магнитті көлденеңінен трахеяның үстіне аударып, MP жіптерін «қозғау» арқылы жақсартылды. Тікелей бейнелеу мүмкін болғанымен, жануар адамгершілікпен өлтірілгеннен кейін бөлшектердің қозғалысын анықтау оңайырақ. Магнит бейнелеу аймағының үстінде орналасқан кезде MP концентрациясы әдетте осы жерде ең жоғары болды, дегенмен кейбір бөлшектер әдетте трахея бойымен табылған. In vitro зерттеулерден айырмашылығы, бөлшектерді магнитті аударып трахея бойымен сүйреу мүмкін емес. Бұл тұжырым трахеяның бетін жабатын шырыштың әдетте деммен жұтылатын бөлшектерді қалай өңдейтініне, оларды шырышта ұстап қалатынына және кейіннен шырышты клиренс механизмі арқылы тазартылатынына сәйкес келеді.
Біз трахеяның үстінде және астында тартылыс үшін магниттерді пайдалану (3b-сурет) бір нүктеде жоғары шоғырланған магнит өрісіне қарағанда біркелкі магнит өрісін тудыруы мүмкін деген болжам жасадық, бұл бөлшектердің біркелкі таралуына әкелуі мүмкін. Дегенмен, біздің алдын ала зерттеуіміз бұл гипотезаны растайтын айқын дәлелдер таппады. Сол сияқты, магнит жұбын итеру үшін конфигурациялау (3c-сурет) кескінделген аймақта бөлшектердің көбірек тұндырылуына әкелмеді. Бұл екі нәтиже қос магнитті орнату MP нысаналауының жергілікті басқаруын айтарлықтай жақсартпайтынын және нәтижесінде пайда болған күшті магниттік күштерді конфигурациялау қиын екенін, бұл тәсілді онша практикалық емес ететінін көрсетеді. Сол сияқты, магнитті трахеяның үстінде және арқылы бағыттау (3d-сурет) кескінделген аймақта сақталған бөлшектердің санын арттырмады. Бұл балама конфигурациялардың кейбіреулері сәтті болмауы мүмкін, себебі олар тұндыру аймағындағы магнит өрісінің күшінің төмендеуіне әкеледі. Сондықтан, бірыңғай 30 градус бұрышты магнит конфигурациясы (3a-сурет) in vivo сынау үшін ең оңай және ең тиімді әдіс болып саналады.
Сол жақ қарыншаның (СҚҚ) зерттеуі сол жақ қарынша векторларын CombiMag-пен біріктіріп, магнит өрісінің қатысуымен физикалық ауытқудан кейін жеткізген кезде, бақылау тобымен салыстырғанда трахеядағы трансдукция деңгейінің айтарлықтай жоғарылағанын көрсетті. Синхротронды бейнелеу зерттеулері мен LacZ нәтижелеріне сүйене отырып, магнит өрісі сол жақ қарыншаны трахеяда сақтап, өкпеге бірден терең енетін векторлық бөлшектер санын азайта алған сияқты. Мұндай нысанаға алуды жақсарту титрлерді, нысанадан тыс трансдукцияны, қабыну және иммундық жанама әсерлерді және ген тасымалдаушыларының шығындарын азайта отырып, жоғары тиімділікке әкелуі мүмкін. Маңыздысы, өндірушінің айтуынша, CombiMag басқа гендерді тасымалдау әдістерімен, соның ішінде басқа вирустық векторлармен (мысалы, AAV) және нуклеин қышқылдарымен бірге қолданыла алады.