Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет. Сіз қолданып жатқан шолғыш нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Әзірге қолдауды жалғастыру үшін сайтты мәнерлерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Өкпенің муковисцидозын емдеуге арналған гендік векторлар өткізгіш тыныс жолдарын нысанаға алуы керек, өйткені өкпенің шеткері трансдукциясы емдік пайда бермейді. Вирустық трансдукцияның тиімділігі вектордың тұру уақытына тікелей байланысты. Дегенмен, генді тасымалдаушылар сияқты жеткізуші сұйықтықтар тыныс алу кезінде альвеолаларға табиғи түрде диффузияланады және кез келген кілегей қабықшалары тез тазаланады. тасымалдау. Тыныс алу жолдарында гендік тасымалдаушылардың тұру уақытын ұзарту маңызды, бірақ оған қол жеткізу қиын. Тыныс жолдарының бетіне бағытталуы мүмкін гендік тасымалдаушы-конъюгацияланған магниттік бөлшектер аймақтық мақсаттылықты жақсарта алады. In vivo визуализациясының қиындықтарына байланысты осындай кішкентай магниттік бөлшектердің тыныс алу жолының бетіндегі мінез-құлқы магнит өрісінің болуы жағдайында нашар зерттеу мақсатында қолданылды. жансыздандырылған егеуқұйрықтардың трахеясындағы магниттік бөлшектердің сериясының in vivo қозғалысын визуализациялау үшін синхротронды бейнелеу in vivo жеке және көлемді бөлшектердің мінез-құлқының динамикасы мен заңдылықтарын зерттеу үшін. Содан кейін біз лентивирустық магниттік бөлшектердің магнит өрісі болған кезде жеткізілуі трансдукциялық трахеяның рентгендік сәулеленуінің тиімділігін арттыра ма, жоқ па, соны бағаладық. стационарлық және қозғалатын магнит өрістеріндегі магниттік бөлшектердің әрекетін in vitro және in vivo көрсетеді. Бөлшектерді тірі тыныс жолдарының беті бойымен магниттермен оңай сүйреп апару мүмкін емес, бірақ тасымалдау кезінде шөгінділер магнит өрісі ең күшті болатын көру аймағында шоғырланады. Сондай-ақ лентивирустық бөлшектердің магниттік өрісінде магниттік өрісті жеткізу кезінде өткізгіштік тиімділігі алты есе артты. бұл нәтижелер лентивирустық магниттік бөлшектер мен магниттік өрістер ген векторының мақсаттылығын жақсарту және in vivo тыныс жолдарын өткізуде трансдукция деңгейін арттыру үшін құнды тәсілдер болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Муковисцидоз (CF) CF трансмембраналық өткізгіштік реттегіші (CFTR) деп аталатын бір геннің вариациясынан туындайды. CFTR протеині дененің көптеген эпителий жасушаларында, соның ішінде өткізгіш тыныс жолдарында, CF патогенезінің негізгі учаскесінде болатын иондық арна болып табылады. (ASL) қабаты. Бұл сонымен қатар шырышты тасымалдау (MCT) жүйесінің тыныс алу жолдарынан ингаляциялық бөлшектер мен қоздырғыштарды тазарту қабілетін нашарлатады. Біздің мақсатымыз CFTR генінің дұрыс көшірмесін жеткізу және ASL, MCT және өкпе денсаулығын жақсарту және осы жаңа технологияларды дамытуды жалғастыру үшін лентивирустық (LV) гендік терапияны жасау болып табылады.
LV векторлары CF тыныс жолдарының гендік терапиясына жетекші үміткерлердің бірі болып табылады, себебі олар емдік генді тыныс алу жолдарының базальды жасушаларына (тыныс жолдарының дің жасушалары) тұрақты түрде біріктіре алады. Бұл маңызды, өйткені олар функционалды гендік түзетілген CF-байланысты жасушаларға қарсы дифференциациялау арқылы қалыпты гидратация мен шырыш клиренсін қалпына келтіре алады, бұл вектордың өмір сүру ұзақтығына тікелей әсер етеді. тыныс алу жолдары, өйткені бұл жерде CF өкпе ауруы басталады. Вектордың өкпеге тереңірек жеткізілуі альвеолярлық трансдукцияға әкелуі мүмкін, бірақ бұл CF-де емдік пайдасы жоқ. Дегенмен, ген тасымалдаушылары сияқты сұйықтықтар босанғаннан кейін тыныс алу кезінде альвеолаларға табиғи түрде ауысады3,4 және емдік таза бөлшектер MLV-ге тез ауысады. тиімділік жасушаны қабылдауға мүмкіндік беру үшін вектордың мақсатты жасушалардың жанында болатын уақыт ұзақтығына тікелей байланысты – «тұру уақыты»5 – бұл әдеттегі аймақтық ауа ағыны, сондай-ақ үйлестірілген бөлшектердің шырышты ұстауы және MCT арқылы оңай қысқартылады. CF үшін тыныс алу жолындағы LV тұру уақытын ұзарту мүмкіндігі осы аймақта трансдукцияның жоғары деңгейіне қол жеткізу үшін маңызды, бірақ әлі күнге дейін өтпелі.
Бұл кедергіні еңсеру үшін LV магниттік бөлшектері (МП) екі қосымша жолмен көмектесуі мүмкін деп ұсынамыз. Біріншіден, олар мақсатты жақсарту және ген тасымалдаушы бөлшектердің қажетті тыныс алу аймағында тұруына көмектесу үшін тыныс жолдарының бетіне магниттік бағытталуы мүмкін; және ASL) жасуша қабатына көшу үшін 6.MPs антиденелермен, химиотерапевтік препараттармен немесе жасуша мембраналарына қосылатын немесе тиісті жасуша бетінің рецепторларымен байланысатын және статикалық электр тогының қатысуымен ісік ошақтарында жинақталатын басқа да шағын молекулалармен байланысқан кезде мақсатты дәрі-дәрмек жеткізу құралдары ретінде кеңінен қолданылды. Қатерлі ісіктерді емдеуге арналған магниттік өрістер 7. Басқа «гипертермиялық» әдістер тербелмелі магнит өрістерінің әсеріне ұшыраған кезде МП-ны қыздыруға, осылайша ісік жасушаларын жоюға бағытталған. Магниттік өріс ДНҚ-ның жасушаларға тасымалдануын күшейту үшін трансфекция агенті ретінде пайдаланылатын магниттік трансфекция принципі in vitroviral емес векторлар диапазоны үшін әдетте қолданылады. Қиын трансдукцияланатын жасуша желілері. LV магнитотрансфекциясының тиімділігі статикалық магнит өрісінің қатысуымен адамның бронх эпителий жасушаларының сызығына LV-MPs in vitro жеткізілуімен, жалғыз LV векторымен салыстырғанда трансдукция тиімділігін 186 есе арттыратыны анықталды. LV-MP сонымен қатар in vitroV трансляциясы жоғарылаған LV магнитті моделіне қолданылды. CF қақырығы болған кезде ауа-сұйықтық интерфейсі мәдениеттері 20 есе ұлғаяды10. Дегенмен, ағзалардың in vivo магнитотрансфекциясы салыстырмалы түрде аз көңіл бөлді және жануарларға арналған бірнеше зерттеулерде ғана бағаланды11,12,13,14,15, әсіресе өкпеде16,17. Соған қарамастан, CF қақырығында 16,17. Сөйтсе де, магнитті трансфекциялық терапияда айқын мүмкіндіктер бар. al.(2020) «Өкпе арқылы тиімді магниттік нанобөлшектерді жеткізуді дәлелдейтін зерттеу CF пациенттеріндегі клиникалық нәтижелерді жақсарту үшін болашақ CFTR ингаляциялық стратегияларына жол ашады» деп мәлімдеді6.
Қолданылатын магнит өрісі болған кезде тыныс алу жолдарының беттеріндегі шағын магниттік бөлшектердің әрекетін визуализациялау және зерттеу қиын, сондықтан нашар түсіндірілді. Басқа зерттеулерде біз синхротронды таралу негізіндегі фазалық контрастты рентгендік бейнелеу (PB-PCXI) әдісін инвазивті емес түрде визуализациялау және ASL181 минуттағы мінез-құлықты және MSL180 минуттағы өзгерістерді анықтау үшін әзірледік. газ каналының бетінің ылғалдануын өлшейді және емдеу тиімділігінің ерте индикаторы ретінде пайдаланылады. Сонымен қатар, біздің MCT бағалау әдісіміз PB-PCXI21 арқылы көрінетін MCT маркерлері ретінде алюминий тотығынан немесе жоғары сыну көрсеткіші шыныдан тұратын диаметрі 10–35 мкм бөлшектерді пайдаланады. Екі әдіс те MP бөлшектер ауқымын қоса алғанда, визуализацияға жарамды.
Кеңістіктік және уақытша ажыратымдылығы жоғары болғандықтан, біздің PB-PCXI негізіндегі ASL және MCT талдау әдістері MP генін жеткізу әдістерін түсінуге және оңтайландыруға көмектесу үшін in vivo бір және көлемді бөлшектердің мінез-құлқының динамикасы мен үлгілерін зерттеуге өте қолайлы. Бұл жерде біз қолданатын әдіс SPring-8 BL20B2 көмегімен жүргізілген зерттеулерден алынған. тышқандардың өкпе тыныс жолдары біздің гендік тасымалдаушы дозасын жануарларға зерттеуде байқалған біркелкі емес ген экспрессия үлгілерін түсіндіруге көмектесу үшін 3,4.
Бұл зерттеудің мақсаты тірі егеуқұйрықтардың трахеясындағы МП сериясының in vivo қозғалысын визуализациялау үшін PB-PCXI синхротронын пайдалану болды. Бұл PB-PCXI бейнелеу зерттеулері MP қозғалысына әсерін анықтау үшін МП диапазонын, магнит өрісінің күштерін және орналасу орындарын сынауға арналған. Бұл зерттеулер сонымен қатар тұндырудан кейін трахеяда сақталатын бөлшектердің санын барынша арттыратын магниттік конфигурацияларды анықтауға мүмкіндік берді. Зерттеулердің екінші сериясында біз LV-MP-ті егеуқұйрықтардың тыныс алу жолына in vivo жеткізу нәтижесінде пайда болатын трансдукция үлгісін көрсету үшін осы оңтайлы конфигурацияны қолдануға тырыстық. трансдукция тиімділігі.
Жануарларға барлық зерттеулер Аделаида университеті (M-2019-060 және M-2020-022) және SPring-8 Synchrotron Animal этика комитеті бекіткен хаттамаларға сәйкес орындалды. Эксперимент ARRIVE нұсқауларына сәйкес орындалды.
Барлық рентгендік бейнелеу Жапониядағы SPring-8 синхротронында BL20XU сәулелік сызығында, бұрын сипатталғанға ұқсас орнату арқылы орындалды21,22. Қысқаша айтқанда, эксперименттік қорап синхротронды сақтау сақинасынан 245 м қашықтықта орналасқан. Үлгіден детекторға дейінгі қашықтық 0,6 м және бөлшектерді бейнелеуді зерттеу үшін пайдаланылады. фазалық контраст әсерлерін генерациялау үшін. 25 кВ монохроматикалық сәуле энергиясы пайдаланылды. Суреттер sCMOS детекторына қосылған жоғары ажыратымдылықты рентгендік түрлендіргіштің (SPring-8 BM3) көмегімен түсірілді. Түрлендіргіш рентген сәулелерін қалыңдығы 10 мкм сцинтиллятор (Gd3Al2G) арқылы тікелей сцинтиллятор (Gd3Al2G) көмегімен көрінетін жарыққа түрлендіреді. × 10 микроскоп объектісі (NA 0,3). sCMOS детекторы массив өлшемі 2048 × 2048 пиксель және өңделмеген пиксель өлшемі 6,5 × 6,5 мкм болатын Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Жапония) болды. Бұл орнату тропикалық өлшемді 5x пиксель өрісін және тропикалық өлшемді 5 мкм пиксельді көрсетеді. шамамен 1,1 мм × 1,1 мм. Экспозиция ұзындығы 100 мс. Тыныс алудан туындайтын қозғалыс артефактілерін азайту кезінде тыныс алу жолының ішіндегі және сыртындағы магниттік бөлшектердің сигнал-шуыл қатынасын барынша арттыру үшін таңдалды. In vivo зерттеулер үшін рентген сәулелері арасындағы әсерді шектеу арқылы рентгендік сәулелену жолына жылдам рентген ысырмасы орналастырылды.
LV тасымалдағышы SPring-8 PB-PCXI кескіндеу зерттеулерінде пайдаланылмады, себебі BL20XU бейнелеу камерасы биоқауіпсіздіктің 2-деңгейі сертификатталмаған. Оның орнына біз екі коммерциялық жеткізушіден жақсы сипатталған MP диапазонын таңдадық — өлшемдер, материалдар, темір концентрациялары және MP шыныларының магнит өрісіндегі бірінші қозғалыстар мен қолданбаларды түсінуге қалай әсер ететінін қамтитын диапазонды таңдадық. тірі тыныс жолдарында. бетінде.MPs өлшемдері 0,25-тен 18 мкм-ге дейін ауытқиды және әртүрлі материалдардан жасалған (1-кестені қараңыз), бірақ әрбір үлгінің құрамы, оның ішінде МП ішіндегі магниттік бөлшектердің мөлшері белгісіз. Біздің кең ауқымды MCT зерттеулеріне негізделген 19, 20, 21, 23, 24, біз MP5 тракті ретінде кішкентай болуы мүмкін деп күтеміз. беті, мысалы, MP қозғалысының жақсартылған көрінуін көру үшін дәйекті кадрларды шегеру арқылы. Бір 0,25 мкм өлшемді МП бейнелеу құрылғысының ажыратымдылығынан кішірек, бірақ PB-PCXI олардың көлемдік контрастын және тұндырылғаннан кейін олар тұндырылған беттік сұйықтықтың қозғалысын анықтайды деп күтілуде.
1-кестедегі әрбір МП үшін үлгілер ішкі диаметрі 0,63 мм болатын 20 мкл шыны капиллярларда (Drummond Microcaps, PA, АҚШ) дайындалды. Корпускулярлы бөлшектер суда, ал CombiMag бөлшектері өндірушінің меншікті сұйықтығында бар. Әрбір түтік жартылай сұйықтықпен толтырылған және сынаманың 1 мкл ұстағышында орналасқан. (1-суретті қараңыз). Шыны капиллярлар сәйкесінше бейнелеу қорабындағы үлгі сатысына көлденең орналастырылды және сұйықтықтың шеттерін орналастырды. Диаметрі 19 мм (ұзындығы 28 мм) никель қабықшасы сирек жер неодим темір бор (NdFeB) магниті (N35, кат. № LM1652s, электронды магнитизациясы бар австралиялық) 1.17 Тесла қол жеткізу үшін бөлек аударма сатысына бекітілді. Суретке түсіру кезінде оның орнын қашықтан өзгертіңіз. Рентгендік кескінді алу магнит үлгіден шамамен 30 мм жоғары орналасқанда басталады және кескіндер секундына 4 кадр жылдамдығымен алынады. Бейнелеу кезінде магнит шыны капиллярлық түтікке жақындатылды, содан кейін түтіктің позициясы (шамамен трансляциялық түтік) бойымен әсер ету өрісін бағалаңыз.
Үлгіні xy трансляциялау сатысында шыны капиллярлардағы МП үлгілерін қамтитын in vitro бейнелеу қондырғысы. Рентген сәулесінің жолы қызыл үзік сызықпен белгіленген.
Депутаттардың in vitro көріну мүмкіндігі анықталғаннан кейін олардың ішкі жиыны жабайы типтегі аналық альбинос Wistar егеуқұйрықтарында (~12 апталық, ~200 г) in vivo сыналған. 0,24 мг/кг медетомидин (Домитор®, Зеноак, Жапония), 3,2 мг/кг мидазолам (Дормикум®, Жапония, Астеллас4антор) және (Vetorphale®, Meiji Seika) Егеуқұйрықтар құрсақішілік инъекция арқылы Pharma қоспасымен жансыздандырылды, Жапония). дене температурасын ұстап тұруға арналған термиялық қапшықты қамтитын пластина 22 . Одан кейін кескіндеу тақтасы 2a суретінде көрсетілгендей рентгендік кескінде трахеяны көлденеңінен туралау үшін кескіндеу қорабындағы үлгіні аудару сатысына сәл бұрышпен бекітілді.
(a) SPring-8 кескіндеу қорабындағы in vivo кескінді орнату, рентген сәулесінің жолы қызыл үзік сызықпен белгіленеді.(b,c) трахеядағы магнитті локализациялау екі ортогональды орнатылған IP камералары арқылы қашықтан орындалды. Экран кескінінің сол жағында басын ұстап тұрған сым ілмегі көрінеді және жеткізу түтігінің ішіне орналастырылады.
100 мкл шыны шприцті пайдаланатын қашықтан басқарылатын шприц сорғы жүйесі (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) PE10 түтігіне (OD 0,61 мм, ID 0,28 мм) 30 Га ине арқылы қосылды. ETU түтігін микромпингке салу кезінде ұшы дұрыс күйде екеніне көз жеткізу үшін түтікшені белгілеңіз. Түтіктің ұшы жеткізілетін МП үлгісіне батырылған кезде шприц поршені шығарылды. Жүктелген жеткізу түтігі содан кейін ұшын күтілетін қолданылатын магнит өрісінің ең күшті бөлігіне орналастырып, эндотрахеальді түтікке салынды. Кескінді алу Arduino қорабына қосылған тыныс алу детекторының көмегімен басқарылды (температура және уақытты белгілеу, барлық сигналдарды өлшеу) ашу/жабу және суретті алу) Powerlab және LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) көмегімен жазылды 22. Бейнелеу кезінде Қоршауға қол жеткізу мүмкін болмаған кезде екі IP камерасы (Panasonic BB-SC382) бір-біріне шамамен 90° орналасты және олар магнитті қалпына келтіру кезіндегі позицияны бақылау үшін пайдаланылды. Қозғалыс артефактілері, ақырғы толқын ағыны үстіртінде тыныс алу үшін бір сурет алынды.
Бейнелеу корпусының сыртынан қашықтан орналасуы мүмкін екінші кезеңге магнит бекітілген. Магниттің әртүрлі позициялары мен конфигурациялары сыналған, соның ішінде: Трахеядан шамамен 30° бұрышта орнатылған (конфигурациялар 2a және 3a суреттерінде көрсетілген); бір магнит жануардың үстінде, ал екіншісі төменде, полюстер тарту үшін орнатылған (3б-сурет); бір магнит жануардың үстінде, екіншісі төменде, полюстер кері қайтару үшін орнатылған (3в-сурет); және трахеяның үстінде және перпендикуляр бір магнит (3d-сурет). Жануар мен магнит конфигурацияланғаннан кейін және тексерілетін МП шприц сорғысына жүктелгеннен кейін, кескіндерді алу кезінде 50 мкл дозаны 4 мкл/сек жылдамдықпен жіберіңіз. Содан кейін магнит трахеяның бойымен немесе көлденеңінен конфигурацияланған кезде алға-артқа жылжытылады.
In vivo бейнелеуге арналған магнит конфигурациясы (a) трахеяның үстінде шамамен 30° бұрыштағы жалғыз магнит, (б) тартуға орнатылған екі магнит, (c) кері қайтаратын екі магнит, (d) жоғарыда және трахеяда перпендикуляр болатын жалғыз магнит. Бақылаушы ауыздан өкпеге қарады, трахеяның сол жақ бүйірінен өтіп, рентген сәулесі арқылы өтеді. оң жақтан шықты. Магнит тыныс алу жолының ұзындығы бойынша немесе рентген сәулесінің бағыты бойынша трахеяның солға және оңға жылжытылады.
Біз сондай-ақ тыныс алу жолдарындағы бөлшектердің көрінуі мен мінез-құлқын анықтауға тырыстық, тыныс алу және жүрек қозғалысының бұзылуы болмаған кезде. Сондықтан, бейнелеу кезеңінің соңында жануарлар пентобарбиталдың артық дозалануы үшін адамдық түрде өлтірілді (Сомнопентил, Питман-Мур, Вашингтон Кроссинг, АҚШ; және бір рет тыныс алу платформасында ~ 65 мг/кг жануарлар қалдырылды). жүрек соғысы тоқтады, бейнелеу процесі қайталанды, егер тыныс алу жолының бетінде МП көрінбесе, қосымша МП дозасын қосқан.
Алынған кескіндер тегіс өріс пен күңгірт өріс түзетілді, содан кейін MATLAB (R2020a, The Mathworks) жүйесінде жазылған теңшелетін сценарий арқылы фильмге жинақталды (секундына 20 кадр; тыныс алу жиілігіне байланысты 15-25 × қалыпты жылдамдық).
LV генінің векторын жеткізу бойынша барлық зерттеулер Аделаида университетінің Жануарларды зерттеу зертханасында жүргізілді және SPring-8 экспериментінің нәтижелерін магнит өрісі болған кезде LV-MP жеткізуі in vivo геннің тасымалдануын күшейте алатынын бағалау үшін пайдалануға бағытталған. МП және магнит өрісінің әсерін бағалау үшін жануарлардың екі тобы өңделді: бір топқа LV-қондырылған V тобымен бақылау және LV-қондырылған V тобының магниттік бақылау тобы тағайындалды. магнитсіз.
LV генінің векторлары бұрын сипатталған 25, 26 әдістерді пайдалана отырып жасалды. LacZ векторы конститутивтік MPSV промоторы (LV-LacZ) басқаратын ядролық-локализацияланған бета-галактозидаза генін білдіреді, ол трансдукцияланған жасушаларда көк реакция өнімін шығарады, өкпе тінінің фронттарында көрінетін және тіндердің бөлімдерін қолмен санау арқылы жасушаларды санау арқылы орындалды. ТУ/мл титрін есептеу үшін гемоцитометрі бар LacZ оң жасушалары. Тасымалдаушылар -80 °C температурада криоконсервацияланады, қолданар алдында ерітіледі және 1:1 қатынасында араластыру және жеткізуге дейін кемінде 30 минут мұзда инкубациялау арқылы CombiMag-пен байланысады.
Қалыпты Sprague Dawley егеуқұйрықтары (n = 3/топ, ~2-3) 0,4 мг/кг медетомидин (Домитор, Илиум, Австралия) және 60 мг/кг кетамин (Ilium, Австралия) қоспасымен құрсақ ішіне жансыздандырылды) инъекция және хирургиялық емес ауыз қуысының транзакциясын қамтамасыз ету үшін. Тыныс алу жолдарының тіндері LV трансдукциясын алады, ол біздің бұрын сипатталған механикалық бұзылу хаттамасы арқылы кондицияланды, онда трахеяның тыныс алу жолының беті сым себетпен осьтік түрде сүртілді (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, АҚШ). Қозғалыстан кейін 10 минут.
Бұл тәжірибеде пайдаланылған магнит өрісі in vivo рентгендік бейнелеуді зерттеуге ұқсас етіп конфигурацияланды, дәл сол магниттер трахеяның үстінде дистилляциялық стент қыстырғыштары арқылы ұсталды (4-сурет). LV-MP 50 мкл көлемі (2 × 25 мкл аликвоттар) трахеяға жеткізілді (n = A3 құрамындағы түтік бар) алдыңғы сипатталған түтік бар. тобы (n = 3 жануар) магнитті қолданбай бірдей LV-MPs алды. Инфузия аяқталғаннан кейін канюля ET түтікшесінен шығарылады және жануар экстубацияланады. Магнит 10 минут бойы орнында қалады, содан кейін оны алып тастайды. Егеуқұйрықтар тері астына мелоксикам дозасын (1 мл/кг) алды. 1 мг/кг атимазол гидрохлориді (Антиседан, Зоетис, Австралия). Егеуқұйрықтар анестезиядан толық қалпына келгенше жылы ұсталды және бақыланды.
Биологиялық қауіпсіздік шкафындағы LV-MP жеткізу құрылғысы. ET түтігінің ашық сұр Luer түйіні ауыздан шығып тұрғанын көруге болады және суретте көрсетілген тамшуырдың гель ұшы ET түтігі арқылы трахеяға қажетті тереңдікке енгізілген.
LV-MP дозалау процедурасынан кейін бір аптадан кейін жануарлар 100% CO2 ингаляциясы арқылы адамдық түрде өлтірілді және LacZ экспрессиясы стандартты X-gal өңдеуіміз арқылы бағаланды. Эндотрахеальды түтіктің орналасуынан кез келген механикалық зақым немесе сұйықтықтың сақталуы талдауға қосылмағанына көз жеткізу үшін үш каудальды ең шеміршекті сақиналар жойылды. Әрбір трахея талдауға кесіліп, ұзындық бойынша екі бөлікке бөлінді. құрамында силикон резеңкесі бар (Sylgard, Dow Inc) люминалды бетті визуализациялау үшін Minutien инесін (Fine Science Tools) пайдаланады. Трансдукцияланған жасушалардың таралуы мен үлгісі DigiLite камерасы және TCapture бағдарламалық құралымен (Tucsen Photonics, accluin 20) Nikon микроскопы (SMZ1500) көмегімен фронтальды фотосурет арқылы расталды. трахеяның толық ені үшін ең жоғары параметр), трахеяның бүкіл ұзындығы кезең-кезеңімен кескінделеді, бұл кескіннің «тігілуіне» мүмкіндік беру үшін әрбір кескіннің жеткілікті қабаттасуын қамтамасыз етеді. Содан кейін әр трахеядан алынған кескіндер кескіндердің композиттік өңдегіші v2.0.3 (Microsoft Research) көмегімен кескіндер құрамдас бөлігінің өңдегішін пайдалану арқылы бір композиттік кескінге жиналды. 0,35 < Реңк < 0,58, Қаныққандық > 0,15 және Мән < 0,7 параметрлерін пайдаланып, бұрын сипатталғандай автоматтандырылған MATLAB сценарийі (R2020a, MathWorks) арқылы әрбір жануардан алынған трахеяның саны анықталды. Тіндердің контурын қадағалау арқылы әрбір GIMP2 кескіні үшін маска GIMP2-ге ретімен қолмен жасалды. тін аймағын анықтаңыз және трахея тінінің сыртындағы кез келген жалған анықтауды болдырмаңыз. Әрбір жануардың барлық композиттік кескіндеріндегі боялған аумақтар сол жануардың жалпы боялған аймағын құру үшін қосылды. Содан кейін қалыпты аймақты жасау үшін боялған аймақ жалпы маска аймағына бөлінді.
Әрбір трахея парафинге салынып, 5 мкм кесінділер кесілді. Бөлімдер 5 минут бойы бейтарап жылдам қызыл түспен боялды және кескіндер Nikon Eclipse E400 микроскопы, DS-Fi3 камерасы және NIS элементін түсіру бағдарламалық құралы арқылы алынды (5.20.00 нұсқасы).
Барлық статистикалық талдаулар GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) ішінде орындалды. Статистикалық маңыздылық p ≤ 0,05 мәніне орнатылды. Қалыптылық Шапиро-Уилк сынағы арқылы тексерілді және LacZ бояуындағы айырмашылықтар жұпталмаған t-сынағы арқылы бағаланды.
1-кестеде сипатталған алты МП PCXI көмегімен зерттелді, ал көріну 2-кестеде сипатталған. Екі полистирол МП (MP1 және MP2; тиісінше 18 мкм және 0,25 мкм) PCXI астында көрінбеді, бірақ қалған үлгілерді анықтауға болатын (Мысалдар MP5MP1- және MP410-суретте көрсетілген). Fe3O4; сәйкесінше 0,25 мкм және 0,9 мкм) әлсіз көрінеді. Құрамында сыналған ең кішкентай бөлшектер болғанымен, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) ең айқын болды. CombiMag өнімі MP6. Барлық жағдайларда магнитті анықтау және магнитті анықтау мүмкіндігін арттыру қиын болды. капиллярға параллель. Магниттер капиллярдан алыстаған кезде, бөлшектер ұзын жіптерге созылды, бірақ магниттер жақындаған сайын және магнит өрісінің күші артқан сайын, бөлшектер капиллярдың үстіңгі бетіне қарай жылжыған сайын бөлшектердің жіптері қысқарды (Қосымша бейне S1: MP4 қараңыз), Магниттен шығарылған кезде бөлшектердің бетінің күші артады. капилляр, өріс күші төмендейді және МП капиллярдың үстіңгі бетінен созылып жатқан ұзын жіптерге қайта орналасады (Қосымша бейне S2:MP4 қараңыз). Магнит қозғалуын тоқтатқаннан кейін тепе-теңдік күйіне жеткеннен кейін бөлшектер қысқа уақыт бойы қозғала береді. МП қозғалған кезде және одан алыстаған кезде капиллярдың үстіңгі бетіне қарай және одан алыстаған кезде, капиллярдың үстіңгі бетінен магниттік бөлшектер деп аталады.
PCXI астында MP көрінуі үлгілер арасында айтарлықтай өзгереді.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 және (d) MP6. Мұнда көрсетілген барлық кескіндер капиллярдан шамамен 10 мм жоғары орналасқан магнитпен түсірілген. Көрінетін үлкен шеңберлер капиллярларда ұсталған ауа көпіршіктері болып табылады. ұлғайту. Барлық фигуралардағы магнит схемаларының диаметрлері масштабталмағанын және көрсетілгеннен шамамен 100 есе үлкен екенін ескеріңіз.
Магнит капиллярдың үстіңгі жағында солға және оңға аударылғандықтан, МП жолының бұрышы магнитпен теңестіру үшін өзгереді (6-суретті қараңыз), осылайша магнит өрісінің сызықтары белгіленеді. MP3-5 үшін аккорд шекті бұрышқа жеткеннен кейін бөлшектер капиллярдың үстіңгі беті бойымен сүйретіледі. Бұл көбінесе магниттік өрістің үлкен топтарына жақын болатын жерде магнит өрісінің үлкен тобына айналады. ең күшті (Қосымша бейне S3:MP5 қараңыз). Бұл әсіресе капиллярлардың ұшына жақын бейнелеу кезінде айқын көрінеді, бұл MP-нің сұйықтық-ауа интерфейсінде шоғырлануын және шоғырлануын тудырады. MP3-5-ке қарағанда ажырату қиынырақ болатын MP6-дағы бөлшектер магниттің MP3-5 бойымен қозғалуы кезінде сүйретілмеді, бірақ капиллярлардағы бөліктер MP жолының бойымен қозғалып, көріністен шығып кетті. (Қосымша бейне S4:MP6 қараңыз). Кейбір жағдайларда магнитті бейнелеу орнынан үлкен қашықтыққа жылжыту арқылы қолданылатын магнит өрісі азайған кезде, қалған MP-дер жіпте қалған кезде ауырлық күшімен түтіктің төменгі бетіне баяу түсті (Қосымша S5 бейне: MP3 қараңыз).
МП жолының бұрышы магнит капиллярдың үстінде оң жаққа аударылған сайын өзгереді.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 және (d) MP6. Қызыл қорапта контрастты күшейтетін үлкейту бар. Қосымша бейнелер ақпаратты болып табылатынын ескеріңіз, өйткені олар маңызды бөлшектер құрылымын және осы статикалық кескіндерде бейнеленбейтін динамикалық ақпаратты ашады.
Біздің сынақтарымыз магнитті трахея бойымен алға-артқа баяу жылжыту МП күрделі қозғалыс контекстінде in vivo визуализациясын жеңілдететінін көрсетті. In vivo тестілеу жүргізілмеді, өйткені полистирол түйіршіктері (MP1 және MP2) капиллярда көрінбеді. Қалған төрт МП-ның әрқайсысы трахеяның шамамен 3 ° бұрышында конфигурацияланған магнитпен in vivo сыналған. тік (2b және 3a суреттерін қараңыз), өйткені бұл ұзағырақ МП тізбектеріне әкелді және тоқтатылған магнит конфигурациясынан тиімдірек болды. MP3, MP4 және MP6 ешбір тірі жануарлардың трахеясында анықталмады. Жануарлар адам өлтіргеннен кейін егеуқұйрықтардың тыныс алу жолдары суретке түскенде, бөлшектер МП5 оксиді сақинасының қосымша мөлшері қосылған кезде де көрінбейтін болып қала берді. тек көрінетін бөлшек, сондықтан МП-ның in vivo мінез-құлқын бағалау және сипаттау үшін пайдаланылды.
МП жеткізу кезінде магнитті трахеяның үстіне қою көптеген депутаттардың көру өрісінде шоғырлануына әкелді, бірақ барлығы емес. Трахеяға түсетін бөлшектер адам құрбандыққа шалынған жануарларда жақсы байқалады. 7-сурет және қосымша S6 бейне: MP5 жылдам магниттік түсіру мен бөлшектердің теңестірілуін көрсетеді. трахея.МП жеткізілгеннен кейін трахея бойымен дистальды іздестіру кезінде кейбір МП-лар каринаға жақынырақ табылды, бұл магнит өрісінің күші барлық МП-ны жинау және ұстап тұру үшін жеткіліксіз болды, өйткені олар сұйықтық процесі кезінде магнит өрісінің максималды күші аймағы арқылы жеткізілді. Соған қарамастан, босанғаннан кейінгі МП концентрациясы бейнеленген ауа жолының айналасында қолданылған магнит өрісінің көптеген аймақтарында жоғарырақ болды. ең жоғары болды.
(a) дейінгі және (b) суреттері MP5 жақында эвтанизацияланған егеуқұйрықтың трахеясына жеткізілгеннен кейін, магниті тікелей бейнелеу аймағының үстінде орналасқан. Бейнеленген аймақ екі шеміршек сақиналарының арасында орналасқан. МП жеткізгенге дейін тыныс алу жолында біраз сұйықтық бар. Қызыл қорапта контрастты арттыратын үлкейту бар. Бұл суреттер S6MP бейнеден алынған.
Магнитті трахея бойымен in vivo аудару МП тізбегінің тыныс алу жолының бетіндегі бұрышын капиллярларда көрінетіндей етіп өзгертуге әкелді (8-суретті және S7 Қосымша бейнені қараңыз: MP5). Дегенмен, біздің зерттеуімізде депутаттарды тірі тыныс жолдарының беті бойымен сүйреп апару мүмкін емес еді, өйткені олар капиллярлармен мүмкін болды. Кейбір жағдайларда магнит солға және оңға қарай жылжиды. Біз сондай-ақ магнитті трахея бойымен бойлық жылжытқанда бөлшектер тізбегі беткі сұйықтық қабатының тереңдігін өзгертетінін және магнитті тікелей жоғары жылжытқанда және бөлшектер тізбегін тік күйге айналдырғанда кеңейетінін анықтадық (Қосымша бейне S7 қараңыз). : MP5, 0:09, төменгі оң жақ).Магнит трахеяның жоғарғы жағынан бүйір жағынан аударылғанда (яғни, трахеяның ұзындығына емес, жануардың сол немесе оң жағына) қозғалған кезде қозғалыстың тән үлгісі өзгерді. Бөлшектер қозғалған кезде әлі де анық көрінді, бірақ магнит трахеядан шығарылған кезде бөлшектердің ұштары (бейнежазбалар) көрінетін болды. S8:MP5, 0:08 басталады). Бұл шыны капиллярдағы қолданылған магнит өрісі астында біз байқаған MP әрекетіне сәйкес келеді.
Тірі жансыздандырылған егеуқұйрықтың трахеясында MP5 көрсететін мысалдар.(a) Магнит трахеяның үстінде және сол жағындағы кескіндерді алу үшін пайдаланылады, содан кейін (b) магнитті оңға жылжытқаннан кейін. Қызыл қорапта контрастты күшейтетін үлкейту бар. Бұл кескіндер S7:MP5 қосымшасында көрсетілген бейнеден алынған.
Екі полюстер трахеяның үстінде және астында солтүстік-оңтүстік бағытында конфигурацияланған кезде (яғни тарту; 3b-сурет), МП аккордтары ұзағырақ пайда болды және трахеяның арқа бетінде емес, трахеяның бүйір қабырғасында орналасты (Қосымша бейне S9: MP5 қараңыз). Дегенмен, бөлшектердің жоғары концентрациясы (трахеяның жалғыз орналасуы, трахея бетінде анықталмады) қос магнитті құрылғы пайдаланылған кезде сұйықтық жеткізілгеннен кейін, бұл әдетте бір магнитті құрылғы пайдаланылған кезде пайда болады. Содан кейін бір магнит полюстерді кері қайтару үшін конфигурацияланған кезде (3c-сурет), көру өрісінде көрінетін бөлшектердің саны жеткізілгеннен кейін көбеймеген сияқты. Екі магнитті конфигурацияларды орнату екі магниттік күшке немесе магнит өрісінің жоғары тартылуына байланысты қиын. содан кейін орнату тыныс жолына параллель, бірақ өріс сызықтары трахея қабырғасын ортогональды кесіп өтетіндей 90 градуста тыныс алу жолынан өтетін жалғыз магнитке өзгертілді (3d-сурет), бүйір қабырғадағы бөлшектердің агрегациясының байқалуы мүмкін екенін анықтауға арналған бағдар .Алайда, бұл конфигурацияда бұл конфигурацияда магнитті анықтауға болатын қозғалыс немесе барлық магниттік қозғалыс байқалмады. бір магнитті, 30 градустық бағдар конфигурациясы (3a-сурет) in vivo гендік тасымалдаушыны зерттеу үшін таңдалды.
Жануарды адам өлтіргеннен кейін бірден қайта-қайта суретке түсіргенде, шатастырушы тін қозғалысының болмауы магниттің трансляциялық қозғалысына сәйкес «тербеліс» айқын интерхондральды өрісте ұсақ және қысқа бөлшектер сызықтарын анықтауға болатынын білдіреді. Осыған қарамастан, MP6 бөлшектерінің болуы мен қозғалысын әлі анық көре алмайды.
LV-LacZ титрі 1,8 × 108 ТУ/мл болды және CombiMag MP (MP6) 1:1 араластырғаннан кейін жануарлар 9 × 107 TU/ml LV көлік құралының (яғни 4,5 × 106 ТУ/егеуқұйрық) 50 мкл трахеялық дозасын алды. ).Бұл зерттеулерде, еңбек кезінде магнитті аударудың орнына, магнит өрісі болмаған кезде LV трансдукциясын (a) векторлық жеткізумен салыстырғанда жақсартуға болатынын және (b) фокусталуы мүмкін екенін анықтау үшін магнитті бір позицияға бекіттік.
Магниттердің болуы және LV векторларымен біріктірілген CombiMag қолдануы, біздің стандартты LV векторын жеткізу хаттамасы сияқты жануарлардың денсаулығына жағымсыз әсер етпеді. Механикалық бұзылуларға ұшыраған трахея аймағының алдыңғы суреттері (Қосымша 1-сурет) жануарлар тобында трансдукцияның айтарлықтай жоғары деңгейлері бар екенін көрсетті (Қосымша сурет. LV-MP). бақылау тобында аз мөлшерде көк LacZ бояуы болды (9б-сурет). Қалыптастырылған X-Gal боялған аймақтарды сандық анықтау магнит өрісі болған кезде LV-MP енгізу шамамен 6 есе жақсарғанын көрсетті (9в-сурет).
LV-MP (a) магнит өрісі болған кезде және (b) магнит жоқ кезде трахея трансдукциясын көрсететін композиттік кескіндердің мысалы. (c) магнитті пайдаланған кезде трахеядағы қалыпты LacZ трансдукция аймағында статистикалық маңызды жақсарту (*p = 0,029, t-сынағы, әр топқа n = 3 EM).
Бейтарап жылдам қызыл боялған секциялар (қосымша 2-суретте көрсетілген мысал) бұрын хабарланғандай ұқсас үлгіде және жерде орналасқан LacZ-боялған жасушаларды көрсетті.
Тыныс алу жолдарының гендік терапиясы үшін негізгі мәселе тасымалдаушы бөлшектерді қызықтыратын аймақтарға дәл локализациялау және ауа ағыны мен белсенді шырыш клиренсі болған кезде қозғалатын өкпеде трансдукция тиімділігінің жоғары деңгейіне қол жеткізу болып қала береді. CF тыныс жолдарының ауруын емдеуге арналған LV тасымалдаушылары үшін, өткізгіш тыныс жолдарының ішінде тасымалдаушы бөлшектердің тұру уақытын ұлғайту Castella et al. трансдукцияны жақсарту үшін магнит өрістерін пайдалану электропорация сияқты генді жеткізудің басқа әдістерімен салыстырғанда артықшылықтарға ие, өйткені ол қарапайымдылықты, үнемділікті, жеткізуді локализациялауды, жоғары тиімділікті және қысқа инкубация уақытын және, мүмкін, тасымалдаушы дозаның аз болуын біріктіре алады10. Алайда, in vivo тұндыру және магниттік ауа жолындағы магниттік бөлшектердің сыртқы әсерінің әрекеті ешқашан сипатталған емес. сондай-ақ тірі тыныс алу жолдарында гендердің экспрессия деңгейін арттыру үшін бұл әдістің in vivo мүмкіндігі нақты көрсетілмеген.
Біздің in vitro синхротронды PCXI тәжірибелеріміз полистирол МП қоспағанда, біз сынаған барлық бөлшектер біз пайдаланған бейнелеу қондырғысында көрінетінін көрсетті. Магниттік өріс болған кезде, МП ұзындықтары бөлшектердің түріне және магнит өрісінің күшіне (яғни, магнит өрісінің жақындығы мен қозғалысына байланысты) байланысты болатын жолдарды құрайды (суретте көрсетілгендей). әрбір жеке бөлшек магниттеліп, өзінің жергілікті магнит өрісін индукциялайды. Бұл бөлек өрістер басқа бөлшектердің жергілікті тартымды және тебілу күштерінің жергілікті күштерінің әсерінен топтық жіп тәрізді қозғалыстармен басқа ұқсас бөлшектерді біріктіреді және біріктіреді.
(a,b) сұйықтық толтырылған капиллярларда және (c,d) ауамен толтырылған трахеяда түзілген бөлшектер тізбегінің схемалық көрінісі. Капиллярлар мен трахеяның масштабта тартылмайтынын ескеріңіз. (а) панелінде сонымен қатар жолдарда орналасқан Fe3O4 бөлшектері бар МП сипаттамасы бар.
Магнит капиллярдан жоғары жылжытылған кезде бөлшектер тізбегінің бұрышы құрамында Fe3O4 бар MP3-5 үшін критикалық шекке жетті, содан кейін бөлшектер тізбегі бұрынғы орнында қалмай, бет бойымен жаңа орынға жылжыды.магнит. Бұл әсер болуы мүмкін, себебі шыны капилляр беті бұл қозғалыстың орын алуына мүмкіндік беретіндей тегіс болғандықтан, бұлай емес. бөлшектер кішірек болғандықтан, әртүрлі жабындары немесе беттік зарядтары болды немесе меншікті тасымалдаушы сұйықтық олардың қозғалу қабілетіне әсер етті. CombiMag бөлшектерінің кескін контрасты да әлсіз, бұл сұйықтық пен бөлшектердің тығыздығы ұқсас болуы мүмкін, сондықтан бір-біріне оңай жылжи алмайды. Сұйықтықтағы бөлшектер арасындағы үйкелісті жеңу, бұл магнит өрісінің күші мен магнит пен мақсатты аймақ арасындағы қашықтықтың өте маңызды екендігі таңқаларлық емес екенін болжайды. Біріктірілген бұл нәтижелер сонымен бірге магниттер мақсатты аймақ арқылы өтетін көптеген МП-ны ұстай алатынына қарамастан, біз тракті бөлшектердің бойымен қозғалу үшін магниттерге сүйену екіталай екенін көрсетеді. in vivo LV-MP зерттеулері тыныс жолдары ағашының нақты аймақтарын физикалық нысанаға алу үшін статикалық магнит өрістерін пайдалану керек деген қорытындыға келеді.
Бөлшектерді денеге жеткізген кезде оларды күрделі қозғалатын дене тінінің контекстінде анықтау қиын, бірақ оларды анықтау мүмкіндігі магнитті трахеяның үстінен көлденеңінен аударып, МП жіптерін «айналдыру» арқылы күшейтілді. Тікелей бейнелеу мүмкін болғанымен, жануар адам өлтірген кезде бөлшектердің қозғалысын анықтау оңайырақ. аймақ, дегенмен кейбір бөлшектер әдетте трахея бойынан табылды. In vitro зерттеулерінен айырмашылығы, бөлшектерді магнитті аудару арқылы трахея бойымен сүйреп апару мүмкін емес. Бұл нәтиже трахеяның бетін жабатын шырыштың әдетте ингаляциялық бөлшектерді қалай өңдейтініне сәйкес келеді, оларды шырышта ұстайды және кейіннен шырышты қабықпен тазартылады.
Біз трахеяның үстінде және астындағы тартылыс үшін магниттерді пайдалану (3б-сурет) бір нүктеде жоғары шоғырланған магнит өрісінен гөрі біркелкі магнит өрісіне әкелуі мүмкін деп болжадық, бұл бөлшектердің біркелкі таралуына әкелуі мүмкін. Дегенмен, біздің алдын ала зерттеуіміз бұл гипотезаны растайтын нақты дәлелдерді таппады. 3c) бейнеленген аймақта бөлшектердің көбірек тұндырылуына әкелмеді. Бұл екі нәтиже қос магнитті орнату MP нысанаға алуды жергілікті басқаруды айтарлықтай жақсартпайтынын және нәтижесінде пайда болатын күшті магниттік күштерді конфигурациялау қиын екенін көрсетеді, бұл бұл тәсілді практикалық емес етеді. Сол сияқты, магнитті жоғарыда және трахея арқылы бағдарлау (3-сурет, сондай-ақ бейнеленген бөлшектердің санын көбейтпейді) Бұл балама конфигурациялардың кейбірі сәтті болмауы мүмкін, себебі олар тұндыру аймағындағы магнит өрісінің кернеулігін төмендетеді. Сондықтан, жалғыз 30 градус бұрыштық магнит конфигурациясы (3a-сурет) in vivo сынау үшін ең оңай және тиімді әдіс болып саналады.
LV-MP зерттеуі LV векторларын CombiMag-пен біріктіргенде және магнит өрісінің қатысуымен физикалық бұзылудан кейін жеткізілгенде, трахеядағы трансдукция деңгейлері бақылаумен салыстырғанда айтарлықтай жоғарылағанын көрсетті. Синхротронды бейнелеу зерттеулері мен LacZ нәтижелеріне сүйене отырып, магнит өрісі трахеядағы трахеяның тереңдіктегі бөлшектерінің санын бірден сақтай алатыны анық болды. өкпе. Бұндай мақсатты жақсартулар жеткізілетін титрлерді, мақсаттан тыс трансдукцияны, қабыну және иммундық жанама әсерлерді және ген тасымалдаушы шығындарды азайту кезінде жоғары тиімділікке әкелуі мүмкін. Маңыздысы, өндірушіге сәйкес, CombiMag генді тасымалдаудың басқа әдістерімен, соның ішінде басқа вирустық векторлармен (мысалы, ядролық қышқылдармен және AAV) бірге пайдаланылуы мүмкін.