Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan winates kanggo CSS.Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer).Sauntara kuwi, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Vektor gen kanggo perawatan penyakit paru-paru cystic fibrosis kudu ngarahake saluran napas amarga transduksi paru-paru perifer ora menehi keuntungan terapeutik. Efisiensi transduksi virus langsung ana hubungane karo wektu panggonan vektor. penting nanging angel digayuh.Partikel magnet konjugasi pembawa gen sing bisa diarahake menyang permukaan saluran napas bisa ningkatake penargetan regional.Amarga tantangan visualisasi in vivo, prilaku partikel magnetik cilik ing permukaan saluran napas nalika ana medan magnet sing ditrapake kurang dimangerteni. Tikus sing dibius kanggo mriksa dinamika lan pola prilaku partikel individu lan akeh ing vivo. Kita uga ngira manawa pangiriman partikel magnetik lentiviral ing ngarsane medan magnet bakal ningkatake efisiensi transduksi ing trakea tikus. wesi sembrani, nanging sak transportasi, celengan klempakan ing lapangan tampilan ngendi Magnetik kolom paling kuat.Efisiensi transduksi uga tambah enem kaping nalika partikel Magnetik lentiviral padha dikirim ing ngarsane saka Magnetik field.Together, asil iki suggest sing partikel Magnetik lentiviral lan Magnetik kolom bisa dadi pendekatan terkenal kanggo nambah nargetake vektor gene lan nambah tingkat transduksi ing nganakake Airways ing vivo.
Fibrosis kistik (CF) disababaké déning variasi ing gen siji sing disebut CF transmembrane conductance regulator (CFTR). ngrusak kemampuan sistem transportasi mucociliary (MCT) kanggo mbusak partikel lan patogen sing dihirup saka saluran napas.Tujuan kita yaiku ngembangake terapi gen lentiviral (LV) kanggo ngirim salinan gen CFTR sing bener lan ningkatake kesehatan ASL, MCT, lan paru-paru, lan terus ngembangake teknologi anyar sing bisa ngukur parameter kasebut ing vivo1.
Vektor LV minangka salah sawijining calon utama kanggo terapi gen saluran napas CF, utamane amarga bisa nggabungake gen terapeutik kanthi permanen menyang sel basal saluran napas (sel stem saluran napas). Pangiriman vektor sing luwih jero menyang paru-paru bisa nyebabake transduksi alveolar, nanging iki ora duwe manfaat terapeutik ing CF. Nanging, cairan kayata operator gen kanthi alami migrasi menyang alveoli sawise inspirasi sawise pangiriman3,4 lan partikel terapeutik kanthi cepet dibuwang menyang rongga lisan dening transduksi MCT.LV - transduksi sel kanggo target wektu sing cocog karo efisiensi sel kanggo tetep ing wektu sabanjure. wektu "5 - kang gampang suda dening aliran udara regional khas uga jupuk partikel lendir terkoordinasi lan MCT.Kanggo CF, kemampuan kanggo ndawakake wektu panggonan LV ing saluran napas penting kanggo entuk tingkat transduksi dhuwur ing wilayah iki, nanging nganti saiki wis tantangan.
Kanggo ngatasi alangan iki, disaranake yen partikel magnetik LV (MPs) bisa mbantu kanthi rong cara pelengkap. Kaping pisanan, bisa dipandu magnetik menyang permukaan saluran napas kanggo nambah penargetan lan mbantu partikel pembawa gen manggon ing wilayah saluran napas sing dikarepake; lan ASL) kanggo pindhah menyang lapisan sel 6.MPs wis digunakake digunakake minangka kendaraan pangiriman tamba diangkah nalika padha ikatan karo antibodi, obatan chemotherapeutic, utawa molekul cilik liyane sing nempel ing membran sel utawa ikatan karo reseptor lumahing sel cocog lan nglumpukake ing situs tumor ing ngarsane listrik statis. Medan Magnetik kanggo Perawatan Kanker 7. Teknik "hipertermal" liyane ngarahake panas anggota parlemen nalika kena pengaruh medan magnet sing osilasi, saéngga ngancurake sel tumor. Prinsip transfeksi magnetik, ing ngendi medan magnet digunakake minangka agen transfeksi kanggo nambah transfer DNA menyang sel, umume digunakake ing vitro nggunakake macem-macem garis non-viral lan virus sing efektif kanggo vektor sel LV. magnetotransfection wis ditetepake, kanthi pangiriman in vitro LV-MPs menyang garis sel epitelium bronkial manungsa ing ngarsane medan magnet statis, nambah efisiensi transduksi kanthi 186-fold dibandhingake karo vektor LV piyambak. vivo magnetotransfection organ wis ditampa relatif sethitik manungsa waé lan mung wis dievaluasi ing sawetara pasinaon kewan11,12,13,14,15, utamané ing paru-paru16,17. Nanging, kesempatan kanggo transfection Magnetik ing therapy paru-paru CF cetha. Tan et al. Strategi inhalasi CFTR kanggo nambah asil klinis ing pasien CF"6.
Prilaku partikel magnetik cilik ing lumahing saluran napas ing ngarsane medan magnet sing ditrapake angel digambarake lan disinaoni, saengga ora bisa dingerteni. lan digunakake minangka indikator awal khasiat perawatan. Kajaba iku, cara evaluasi MCT kita nggunakake partikel diameter 10-35 µm sing kasusun saka alumina utawa kaca indeks bias dhuwur minangka penanda MCT sing katon nggunakake PB-PCXI21. Loro-lorone teknik kasebut cocog kanggo visualisasi sawetara jinis partikel, kalebu MP.
Amarga resolusi spasial lan temporal sing dhuwur, teknik analisis ASL lan MCT adhedhasar PB-PCXI kita cocog kanggo mriksa dinamika lan pola prilaku partikel tunggal lan akeh ing vivo kanggo mbantu kita ngerti lan ngoptimalake teknik pangiriman gen MP. saluran napas paru-paru tikus kanggo mbantu nerangake pola ekspresi gen sing ora seragam sing diamati ing studi kewan dosis pembawa gen 3,4.
Tujuan saka panliten iki yaiku nggunakake synchrotron PB-PCXI kanggo nggambarake gerakan in vivo saka seri MP ing trakea tikus urip. Studi pencitraan PB-PCXI iki dirancang kanggo nguji sawetara MP, kekuatan medan magnet, lan lokasi kanggo nemtokake efek ing gerakan MP. kita kanggo ngenali konfigurasi magnet sing nggedhekake jumlah partikel sing ditahan ing trakea sawise deposition.Ing seri kapindho pasinaon, kita ngupaya nggunakake konfigurasi optimal iki kanggo nduduhake pola transduksi asil saka pangiriman in vivo saka LV-MPs kanggo airway tikus, adhedhasar asumsi sing pangiriman LV-MPs ing konteks nargetake saluran napas bakal ngasilake efisiensi LV.
Kabeh studi kewan ditindakake miturut protokol sing disetujoni dening Universitas Adelaide (M-2019-060 lan M-2020-022) lan Komite Etika Kewan Synchrotron SPring-8. Eksperimen ditindakake miturut pedoman ARRIVE.
Kabeh pencitraan sinar-X ditindakake ing beamline BL20XU ing synchrotron SPring-8 ing Jepang, nggunakake persiyapan sing padha karo sing diterangake sadurunge 21,22. Sedhela, kothak eksperimen dumunung 245 m saka dering panyimpenan synchrotron. Sampel-kanggo-detektor jarak 0,6 m digunakake kanggo studi imaging vivo 0.3 m lan ing fase kontras vivo. Efek. Energi sinar monokromatik 25 keV digunakake. Gambar dijupuk nggunakake konverter sinar-X resolusi dhuwur (SPring-8 BM3) ditambah karo detektor sCMOS. (NA 0.3).Detektor sCMOS yaiku Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) kanthi ukuran larik 2048 × 2048 piksel lan ukuran piksel mentah 6,5 × 6,5 µm. Persiyapan iki ngasilake ukuran piksel isotropik efektif 0.51 µm × 1 tampilan dawane kira-kira 1 mm × 1. 100 ms dipilih kanggo nggedhekake rasio sinyal-kanggo-noise partikel magnetik ing njero lan njaba saluran napas nalika nyilikake artefak gerakan sing diakibatake ambegan.Kanggo studi vivo, rana sinar-X sing cepet dilebokake ing jalur sinar-X kanggo mbatesi dosis radiasi kanthi ngalangi sinar X ing antarane eksposur.
Operator LV ora digunakake ing studi pencitraan SPring-8 PB-PCXI amarga kamar pencitraan BL20XU ora disertifikasi Biosafety Level 2. Nanging, kita milih sawetara MP sing duwe karakter sing apik saka rong pemasok komersial - nyakup macem-macem ukuran, bahan, konsentrasi wesi, lan aplikasi - pisanan ngerti babagan gerakan MP, lan medan magnet ing kaca. ing lumahing.MPs sawetara ukuran saka 0,25 kanggo 18 μm lan digawe saka macem-macem bahan (ndeleng Tabel 1), nanging komposisi saben sampel, kalebu ukuran partikel Magnetik ing MP, ora dingerteni. subtracting pigura consecutive kanggo ndeleng visibilitas meningkat saka MP motion.A single 0,25 μm-ukuran MP luwih cilik saka résolusi saka piranti imaging, nanging PB-PCXI samesthine kanggo ndeteksi kontras volume lan gerakan saka adi lumahing kang padha setor sawise deposition.
Sampel kanggo saben MP ing Tabel 1 disiapake ing kapiler kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) kanthi diameter batin 0,63 mm. Partikel korpuskular kasedhiya ing banyu, nalika partikel CombiMag kasedhiya ing cairan proprietary pabrikan. diselehake horisontal ing tataran sampel ing kothak imaging, mungguh, lan dipanggonke pinggiran saka fluida.A 19 mm diameteripun (28 mm dawa) Nikel Nikel langka bumi neodymium wesi boron (NdFeB) magnet (N35, cat. No. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) karo magnetization ampas saka 1.17 posisi translasi Tesla ditempelake ing posisi kapisah saka 1.17. imaging.Akuisisi gambar sinar-X diwiwiti nalika magnet dipanggonke kira-kira 30 mm ing ndhuwur sampel, lan gambar dipikolehi kanthi kecepatan 4 pigura per detik. Sajrone pencitraan, magnet digawa cedhak karo tabung kapiler kaca (kira-kira 1 mm adoh) lan banjur diterjemahake ing sadawane tabung kanggo netepake efek kekuatan lan posisi lapangan.
Persiyapan pencitraan in vitro ngemot sampel MP ing kapiler kaca ing tataran terjemahan sampel xy. Path saka sinar X ditandhani karo garis putus-putus abang.
Sawise visibilitas in vitro MP ditetepake, subset saka wong-wong mau dites in vivo ing tikus Wistar albino betina jinis liar (umur ~ 12 minggu, ~ 200 g). Seika) Tikus dibius nganggo campuran Pharma), Jepang) kanthi injeksi intraperitoneal. Sawise anestesi, disiapake kanggo pencitraan kanthi ngilangi wulu ing sakubenge trakea, nglebokake tabung endotrakeal (ET; 16 Ga iv kanula, Terumo BCT) lan immobilizing mau supine ing piring imaging suhu sing digawe khusus. ditempelake ing tataran terjemahan sampel ing kothak imaging ing amba tipis kanggo kempal trakea horisontal ing gambar X-ray, minangka ditampilake ing Figure 2a.
(a) In vivo persiyapan imaging ing kothak imaging SPring-8, path sinar X-ray ditandhani karo garis abang.
Sistem pompa syringe sing dikontrol remot (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) nggunakake jarum suntik kaca 100 μl disambungake menyang pipa PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) liwat jarum 30 Ga. Tandhani tabung kanggo mesthekake yen tip ana ing posisi sing bener ing trakea nalika nglebokake tabung mikro syringe. ditarik nalika ujung tabung dicemplungake ing sampel MP sing bakal dikirim. Tabung pangiriman sing dimuat banjur dilebokake menyang tabung endotrakeal, nempatake tip ing bagian paling kuat saka medan magnet sing ditrapake. Akuisisi gambar dikontrol nggunakake detektor respirasi sing disambungake menyang kothak wektu adhedhasar Arduino, lan kabeh sinyal (umpamane, suhu, respirasi, respirasi, lan bukaan gambar Lab). (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Nalika imaging Nalika enclosure ora bisa diakses, loro kamera IP (Panasonic BB-SC382) dipanggonke ing kira-kira 90 ° kanggo saben liyane lan digunakake kanggo ngawasi posisi magnet relatif kanggo trakea sak imaging (Fig. 2b, c) . Kanggo nyilikake artefak gerakan plateau pungkasan ambegan siji.
A magnet ditempelake ing tataran kapindho sing bisa dumunung adoh saka njaba omah imaging.Various posisi magnet lan konfigurasi padha dites, kalebu: Dipasang ing amba saka kira-kira 30 ° ndhuwur trakea (konfigurasi ditampilake ing Figures 2a lan 3a); siji magnet ing ndhuwur kewan lan liyane ing ngisor, karo kutub disetel kanggo narik kawigaten (Gambar 3b); siji magnet ing ndhuwur kewan lan liyane ing ngisor, karo kutub disetel kanggo ngusir (Figure 3c); lan siji magnet ing ndhuwur lan jejeg trakea (Gambar 3d). Sawise kewan lan sembrani wis diatur lan MP kanggo dites dimuat menyang pump syringe, ngirim dosis 50 μl ing tingkat 4 μl / sec nalika ndarbeni gambar.
Konfigurasi magnet kanggo pencitraan in vivo (a) magnet siji ing ndhuwur trakea kanthi sudut kira-kira 30 °, (b) rong magnet sing disetel kanggo narik kawigaten, (c) rong magnet sing disetel kanggo ngusir, (d) magnet siji ing ndhuwur lan jejeg ing trakea. magnet dipindhah ing sadawane dawa saluran napas utawa ngiwa lan nengen ing ndhuwur trakea menyang arah sinar X.
Kita uga ngupaya kanggo nemtokake visibilitas lan prilaku partikel ing saluran napas tanpa ana napas lan gerakan jantung sing mbingungake. Mulane, ing pungkasan periode pencitraan, kewan dipateni kanthi manungsa amarga overdosis pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip). proses iki bola, nambah dosis tambahan MP yen ora MP katon ing lumahing saluran napas.
Gambar sing dipikolehi padha flat-field lan dark-field dikoreksi banjur dirakit dadi film (20 frame per detik; 15-25 × normal kacepetan gumantung tingkat ambegan) nggunakake script khusus ditulis ing MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Kabeh studi pangiriman vektor gen LV ditindakake ing Fasilitas Penelitian Kewan Laboratorium ing Universitas Adelaide lan ngarahake nggunakake asil eksperimen SPring-8 kanggo netepake manawa pangiriman LV-MP ing ngarsane medan magnet bisa ningkatake transfer gen ing vivo.
Vektor gen LV diasilake kanthi nggunakake metode sing wis diterangake sadurunge 25, 26 .Vektor LacZ nyatakake gen beta-galactosidase sing dilokalisasi nuklir sing didorong dening promotor MPSV konstitutif (LV-LacZ), sing ngasilake produk reaksi biru ing sel transduksi, katon ing ngarep jaringan paru-paru lan bagean jaringan. titer ing TU / ml. Carriers cryopreserved ing -80 °C, thawed sadurunge digunakake, lan kaiket kanggo CombiMag dening nyawiji ing rasio 1: 1 lan inkubasi ing es kanggo ing paling 30 menit sadurunge pangiriman.
Tikus Sprague Dawley normal (n = 3 / klompok, ~ 2-3 dibius intraperitoneal kanthi campuran 0.4 mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) lan 60 mg / kg ketamin (Ilium, Australia) ip) injeksi lan kanulasi oral non-bedah kanthi 16 saluran udara, supaya transduksi jaringan 16 Ga iv. iki kahanan nggunakake protokol perturbasi mechanical kita sadurunge diterangake, kang lumahing saluran napas trakea iki ma axially karo basket kabel (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28.Administrasi trakea saka LV-MP banjur dileksanakake ing kira-kira menit safety perturbation sawise 10 menit keamanan biologi.
Medan magnet sing digunakake ing eksperimen iki dikonfigurasi kanthi cara sing padha karo studi pencitraan sinar-X in vivo, kanthi magnet sing padha ditahan ing ndhuwur trakea nggunakake klip stent distilasi (Gambar 4). 3 kewan) nampa LV-MP sing padha tanpa nggunakake magnet. Sawise infus rampung, kanula dicopot saka tabung ET lan kewan kasebut diekstubasi. Magnet tetep ing panggonan kanggo 10 menit, banjur dicopot. Tikus nampa dosis meloxicam subkutan (1 ml / kg) (Ilium, Australia) banjur diterusake kanthi injeksi ip/kgl hidropamazole kanthi anestesi mg/kgklorozol. (Antisedan, Zoetis, Australia).Tikus dipanasake lan dipantau nganti pulih saka anestesi.
Piranti pangiriman LV-MP ing lemari safety biologis. Hub Luer abu-abu cahya saka tabung ET bisa katon metu saka tutuk lan ujung gel pipette sing ditampilake ing gambar dilebokake liwat tabung ET menyang jero sing dikarepake menyang trakea.
Seminggu sawise prosedur dosis LV-MP, kewan dipateni sacara manusiawi kanthi inhalasi 100% CO2 lan ekspresi LacZ ditaksir kanthi nggunakake perawatan X-gal standar. Telung cincin paling cartilaginous caudal dicopot kanggo mesthekake yen karusakan mekanis utawa retensi cairan saka penempatan tabung endotrakeal ora kalebu ing analisis. Saben trakea dipotong kanthi longitudinal kanggo analisa, lan loro-lorone dilebokake ing silikon. (Sylgard, Dow Inc) nggunakake jarum Minutien (Fine Science Tools) kanggo nggambarake lumahing luminal. Distribusi lan pola sel transduksi dikonfirmasi kanthi fotografi frontal nggunakake mikroskop Nikon (SMZ1500) kanthi kamera DigiLite lan piranti lunak TCapture (Tucsen Photonics, China). dawa trakea digambarake kanthi langkah-langkah, njamin tumpang tindih sing cukup ing antarane saben gambar kanggo ngidini gambar "jahitan". (R2020a, MathWorks) kaya sing wis diterangake sadurunge, nggunakake setelan 0.35
Saben trakea ditempelake ing paraffin lan 5 μm bagean dipotong. Bagean padha counterstained karo netral cepet abang kanggo 5 min lan gambar dipikolehi nggunakake mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 lan piranti lunak panangkepan unsur NIS (versi 5.20.00).
Kabeh analisis statistik dileksanakake ing GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Signifikansi statistik disetel ing p ≤ 0.05. Normalitas diverifikasi nggunakake tes Shapiro-Wilk, lan beda ing pewarnaan LacZ ditaksir nggunakake t-test sing ora dipasangake.
Enem MP sing diterangake ing Tabel 1 ditliti nggunakake PCXI, lan visibilitas diterangake ing Tabel 2. Rong MP1 polystyrene (MP1 lan MP2; 18 μm lan 0.25 μm, masing-masing) ora katon ing PCXI, nanging sampel liyane bisa diidentifikasi (conto ditampilake ing Figure 1MP3 lan MP5 5). 0,25 μm lan 0,9 μm, mungguh) katon samar-samar. Sanajan ngemot sawetara partikel paling cilik sing diuji, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) minangka sing paling diucapake. Produk CombiMag MP6 angel ditemokake. wesi sembrani dipindhah adoh saka kapiler, partikel lengkap ing strings dawa, nanging minangka wesi sembrani tak nyedhaki lan kekuatan Magnetik kolom tambah, strings partikel shortened minangka partikel migrasi menyang lumahing ndhuwur kapiler (ndeleng Video Tambahan S1: MP4), nambah Kapadhetan partikel saka lumahing. kapiler (pirsani Video Tambahan S2: MP4) .Sawise magnet mandheg obah, partikel-partikel terus obah kanggo wektu sing cendhak sawise tekan posisi keseimbangan. Nalika MP pindhah menyang lan adoh saka permukaan ndhuwur kapiler, partikel magnet biasane nyeret lebu liwat cairan kasebut.
Visibilitas MP ing PCXI beda-beda sacara signifikan ing antarane sampel.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 lan (d) MP6. Kabeh gambar sing ditampilake ing kene dijupuk nganggo magnet sing ana kira-kira 10 mm ing ndhuwur kapiler. Bunderan gedhe sing katon yaiku gelembung udara sing kepepet ing kapiler, kanthi jelas nuduhake fitur pinggiran ireng lan putih saka kontras kontras abang fase. magnification.Elinga yen dhiameter saka schematics magnet ing kabeh tokoh ora kanggo ukuran lan kira-kira 100 kaping luwih gedhe tinimbang ditampilake.
Minangka magnet dijarwakake ngiwa lan nengen ing sadawane ndhuwur kapiler, amba saka senar MP owah-owahan kanggo kempal karo sembrani (pirsani Figure 6), mangkono delineating garis Magnetik kolom. Kanggo MP3-5, sawise penghubung tekan amba batesan, partikel sing nyeret sadawane lumahing ndhuwur kapiler. Iki asring asil ing MPs clustering menyang kelompok Magnetik paling cedhak Supple kuwat kanggo grup Magnetik Supple kuwat. S3: MP5) .Iki uga utamané bukti nalika imaging cedhak mburi kapiler, kang njalari MPs kanggo aggregate lan musataken ing antarmuka fluid-air.Partikel ing MP6, kang padha luwih angel kanggo mbédakaké saka MP3-5, padha ora nyeret minangka sembrani dipindhah bebarengan kapiler, nanging MP strings dissociated ing lapangan Supple 6 ing Videos (ndeleng saka Video MP6). kasus, nalika Magnetik kolom Applied iki suda dening obah magnet jarak gedhe saka lokasi imaging, sembarang MPs isih alon mudhun menyang lumahing ngisor tabung dening gravitasi nalika isih ing senar (ndeleng Video Tambahan S5: MP3).
Sudut senar MP diganti nalika magnet diterjemahake ing sisih tengen kapiler.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 lan (d) MP6.Kothak abang ngemot pembesaran sing nambah kontras. Elinga yen video tambahan kasebut informatif amarga nuduhake struktur partikel penting lan informasi dinamis sing ora bisa dideleng ing gambar statis kasebut.
Tes kita nuduhake yen ngobahake magnet alon-alon ing trakea nggampangake visualisasi MP ing konteks gerakan kompleks ing vivo. Pengujian vivo ora ditindakake amarga manik polystyrene (MP1 lan MP2) ora katon ing kapiler. 3a), amarga iki nyebabake ranté MP sing luwih dawa lan luwih efektif tinimbang konfigurasi magnet sing diakhiri. vivo prilaku MP.
Nempatake magnet ing trakea sajrone pangiriman MP nyebabake akeh, nanging ora kabeh, anggota parlemen konsentrasi ing bidang pandang.Partikel sing mlebu ing trakea paling apik diamati ing kewan sing dikorbanake manungsa.Gambar 7 lan Video Tambahan S6: MP5 nuduhake panangkepan magnetik kanthi cepet lan keselarasan partikel ing permukaan trakea ventral, nuduhake yen wilayah trakea bisa diarahake menyang trakea. nggoleki luwih distal ing trakea sawise pangiriman MP, sawetara anggota parlemen ditemokake luwih cedhak karo carina, sing nuduhake yen kekuatan medan magnet ora cukup kanggo ngumpulake lan nahan kabeh MP, amarga dikirim liwat wilayah kekuatan medan magnet maksimum sajrone proses cairan.
Gambar saka (a) sadurunge lan (b) sawise ngirim MP5 menyang trakea tikus sing nembe disingkirake kanthi magnet sing dipanggonke langsung ing ndhuwur area pencitraan. Area sing digambar ana ing antarane rong cincin balung rawan. Sadurunge pangiriman MP, ana cairan ing saluran napas. Kothak abang ngemot pembesaran kontras.
Nerjemahake magnet ing trakea ing vivo nyebabake rantai MP ngganti sudut ing permukaan saluran napas kanthi cara sing padha karo kapiler (pirsani Gambar 8 lan Video Tambahan S7: MP5). senar partikel katon kanggo ngganti ambane saka lapisan adi lumahing nalika sembrani wis dipindhah longitudinally bebarengan trakea, lan ngembangaken nalika sembrani dipindhah langsung nduwur sirah lan senar partikel wis diputer menyang posisi vertikal (ndeleng Video Tambahan S7). : MP5 ing 0:09, tengen ngisor).Pola karakteristik gerakan diganti nalika magnet diterjemahake ing sisih ndhuwur trakea laterally (yaiku, ing sisih kiwa utawa tengen kewan tinimbang ing dawa trakea). konsisten karo prilaku MP kita diamati ing lapangan Magnetik Applied ing kapiler kaca.
Conto gambar sing nuduhake MP5 ing trakea tikus bius urip.(a) Magnet digunakake kanggo njupuk gambar ing ndhuwur lan ing sisih kiwa trakea, banjur (b) sawise magnet dipindhah menyang sisih tengen. Kothak abang ngemot pembesaran sing nambah kontras. Gambar kasebut saka video sing ditampilake ing Video Tambahan S7:MP5.
Nalika loro kutub padha diatur ing orientasi lor-kidul ndhuwur lan ngisor trakea (ie narik kawigaten; Fig. 3b), kord MP katon maneh lan dumunung ing sidewall saka trakea tinimbang ing lumahing trakea dorsal (ndeleng Video Tambahan S9: MP5) . piranti dual-magnet digunakake, kang biasane occurs nalika piranti siji-magnet digunakake.Banjur nalika siji sembrani wis diatur kanggo ngusir kutub kuwalik (Fig. 3c), nomer partikel katon ing lapangan tampilan ora katon kanggo nambah sawise delivery.The persiyapan saka loro konfigurasi dual-magnet punika tantangan amarga daya magnet siji-sijine push-up, banjur diganti magnet siji-sijine kekiyatan Magnetik sing narik utawa mung siji. menyang saluran napas nanging ngliwati saluran napas ing 90 derajat supaya garis lapangan nyabrang tembok trakea kanthi ortogonal (Fig. 3d), orientasi sing dirancang kanggo nemtokake manawa agregasi partikel ing tembok sisih bisa diamati .Nanging, ing konfigurasi iki, ora ana gerakan akumulasi MP utawa gerakan magnet sing bisa diidentifikasi. 3a) dipilih kanggo studi pembawa gen vivo.
Nalika kewan kasebut bola-bali digambar sanalika sawise mateni manungsa, ora ana gerakan jaringan sing mbingungake tegese garis partikel sing luwih apik lan luwih cendhek bisa dideleng ing lapangan interchondral sing cetha, "wobbly" selaras karo gerakan translasi magnet. Nanging, isih ora bisa ndeleng kanthi jelas anane lan gerakan partikel MP6.
Titer LV-LacZ yaiku 1,8 × 108 TU / ml, lan sawise 1: 1 nyampur karo CombiMag MP (MP6), kewan nampa dosis trakea 50 μl saka kendaraan LV 9 × 107 TU / ml (yaiku 4,5 × 106 TU / tikus). ).Ing pasinaon iki, tinimbang nerjemahake magnet sajrone tenaga kerja, kita tetep magnet ing siji posisi kanggo nemtokake manawa transduksi LV (a) bisa ditingkatake dibandhingake karo pangiriman vektor tanpa ana medan magnet, lan (b) bisa fokus sel Airway ditransduksi menyang wilayah target magnet ing saluran napas ndhuwur.
Ing ngarsane magnet lan nggunakake CombiMag digabungake karo vektor LV ora katon duwe efek salabetipun ing kesehatan kewan, kaya protokol pangiriman vektor LV standar kita. Gambar ngarep saka wilayah trakea ngalami gangguan mechanical (Tambahan Fig. 1) nuduhake yen ana tingkat Ngartekno luwih saka transduksi ing klompok kéwan dianggep karo LV-MP jumlah cilik (Fig 9. Magnetik biru cilik). pewarnaan ana ing klompok kontrol (Fig. 9b) .Kuantasi wilayah X-Gal dinormalisasi nuduhake yen administrasi LV-MP ing ngarsane medan magnet ngasilake kira-kira 6-fold dandan (Fig. 9c).
Conto gambar komposit sing nuduhake transduksi trakea dening LV-MP (a) ing ngarsane medan magnet lan (b) tanpa magnet. (c) Peningkatan sing signifikan sacara statistik ing area transduksi LacZ sing dinormalisasi ing trakea nalika nggunakake magnet (* p = 0,029, t-test, n = 3 saben klompok, tegese ± SEM).
Bagean sing diwarnai abang kanthi cepet Neutral (conto ditampilake ing Gambar Tambahan 2) nuduhake sel sing diwarnai LacZ ing pola lan lokasi sing padha kaya sing dilaporake sadurunge.
Tantangan utama kanggo terapi gen saluran napas tetep lokalisasi partikel operator sing akurat menyang wilayah sing dikarepake lan entuk efisiensi transduksi tingkat dhuwur ing paru-paru sing obah ing ngarsane aliran udara lan reresik mucus aktif. transduksi nduweni kaluwihan dibandhingake karo cara pangiriman gen liyane kayata elektroporasi, amarga bisa nggabungake kesederhanaan, efektifitas biaya, lokalisasi pangiriman, efisiensi tambah, lan wektu inkubasi sing luwih cendhek, lan bisa uga dosis operator sing luwih cilik10. ing saluran napas urip utuh.
Eksperimen in vitro synchrotron PCXI nuduhake yen kabeh partikel sing diuji, kajaba polystyrene MP, katon ing persiyapan pencitraan sing digunakake. Ing ngarsane medan magnet, MP mbentuk senar sing dawane ana hubungane karo jinis partikel lan kekuatan medan magnet (yaiku jarak lan gerakan magnet). Bidang sing kapisah iki njalari partikel-partikel liyane sing padha bisa aggregate lan nyambung, kanthi gerakan kaya senar klompok amarga pasukan lokal saka gaya atraktif lan repulsive lokal saka partikel liyane.
Skema sing nuduhake (a,b) sepur partikel sing diasilake ing jero kapiler sing diisi cairan lan (c,d) trakea sing diisi udara. Elinga yen kapiler lan trakea ora digambar kanthi skala. Panel (a) uga ngemot katrangan babagan MP, sing ngemot partikel Fe3O4 sing disusun kanthi senar.
Nalika sembrani iki dipindhah ndhuwur kapiler, amba saka senar partikel tekan ambang kritis kanggo MP3-5 ngemot Fe3O4, sawise senar partikel ora maneh manggon ing posisi asli, nanging dipindhah sadawane lumahing kanggo posisi anyar.magnet.Efek iki kamungkinan kanggo kelakon amarga lumahing kaca kapiler cukup Gamelan kanggo ngidini gerakan iki kedaden. Apike, cara iki ora partikel, MP6Combib. cilik, wis kemul beda utawa biaya lumahing, utawa adi operator tertutup kena pengaruh kemampuan kanggo mindhah. Kontras gambar saka partikel CombiMag uga ora pati roso, nyaranke sing adi lan partikel bisa duwe Kapadhetan padha lan mulane ora gampang pindhah menyang saben liyane. kekuatan medan Magnetik lan jarak antarane sembrani lan area target Penting banget. Dijupuk bebarengan, asil iki uga suggest sing, nalika wesi sembrani bisa dijupuk akeh MPs sing mili liwat wilayah target, iku dipercaya sing wesi sembrani bisa gumantung ing kanggo mindhah partikel CombiMag sadawane lumahing trakea. Mulane, kita nganakke sing ing vivo LV-MP pasinaon kudu nggunakke wilayah Magnetik wilayah tartamtu statis.
Nalika partikel sing dikirim ing awak, lagi angel kanggo ngenali ing konteks jaringan awak obah Komplek, nanging kemampuan kanggo ndeteksi wong iki meningkat dening nerjemahake sembrani horisontal ndhuwur trakea kanggo "goyang-goyang" senar MP. Senajan pencitraan urip bisa, iku luwih gampang kanggo mbédakaké gerakan partikel sawise kewan wis humanely matèni. trakea.Beda karo studi in vitro, partikel ora bisa nyeret ing trakea kanthi nerjemahake magnet. Temuan iki konsisten karo carane mucus sing nutupi permukaan trakea biasane ngolah partikel sing dihirup, ngempet ing mucus lan banjur diresiki dening mekanisme mucociliary clearance.
Kita hipotesis yen panggunaan magnet kanggo atraksi ing ndhuwur lan ngisor trakea (Fig. 3b) bisa nyebabake medan magnet sing luwih seragam, tinimbang medan magnet sing konsentrasi banget ing sawijining titik, sing bisa nyebabake distribusi partikel sing luwih seragam. Nanging, studi awal kita ora nemokake bukti sing jelas kanggo ndhukung hipotesis iki. Deposisi ing area sing digambarake. Temuan loro iki nduduhake yen persiyapan dual-magnet ora nambah kontrol lokal penargetan MP, lan pasukan magnetik kuat sing diasilake angel dikonfigurasi, nggawe pendekatan iki kurang praktis. Kajaba iku, orientasi magnet ing ndhuwur lan liwat trakea (Fig. 3d) uga ora nambah jumlah partikel sing ditahan ing medan magnet sing ora bisa diowahi amarga medan magnet sing luwih murah. ing area deposisi.Mulane, konfigurasi magnet sudut 30 derajat tunggal (Gambar 3a) dianggep minangka cara sing paling gampang lan efisien kanggo tes vivo.
Panliten LV-MP nuduhake yen nalika vektor LV digabungake karo CombiMag lan dikirim sawise gangguan fisik ing ngarsane medan magnet, tingkat transduksi mundhak sacara signifikan ing trakea dibandhingake karo kontrol. mimpin kanggo khasiat sing luwih dhuwur nalika ngurangi titer sing dikirim, transduksi mati-target, efek samping inflamasi lan kekebalan, lan biaya operator gen. Sing penting, miturut pabrikan, CombiMag bisa digunakake bebarengan karo cara transfer gen liyane, kalebu karo vektor virus liyane (kayata AAV) lan asam nukleat.
Wektu kirim: Jul-16-2022
