Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Vektor gen kanggo perawatan penyakit paru-paru fibrosis kistik kudu nargetake saluran napas penghantar amarga transduksi paru-paru perifer ora menehi mupangat terapeutik. Efisiensi transduksi virus ana hubungane langsung karo wektu tinggal vektor. Nanging, cairan pangiriman kayata pembawa gen kanthi alami nyebar menyang alveoli sajrone inspirasi, lan partikel terapeutik saka sembarang bentuk cepet diresiki dening transportasi mukosiliar. Ngluwihi wektu tinggal pembawa gen ing saluran napas iku penting nanging angel digayuh. Partikel magnetik konjugasi pembawa gen sing bisa diarahake menyang permukaan saluran napas bisa nambah target regional. Amarga tantangan visualisasi in vivo, prilaku partikel magnetik cilik kasebut ing permukaan saluran napas ing ngarsane medan magnet sing ditrapake kurang dingerteni. Tujuan saka panliten iki yaiku nggunakake pencitraan sinkrotron kanggo nggambarake gerakan in vivo saka seri partikel magnetik ing trakea tikus sing dibius kanggo mriksa dinamika lan pola prilaku partikel individu lan massal in vivo. Kita banjur uga ngevaluasi apa pangiriman partikel magnetik lentiviral ing ngarsane medan magnet bakal nambah efisiensi transduksi ing trakea tikus. Sinar-X sinkrotron Pencitraan nuduhake prilaku partikel magnetik ing medan magnet sing stasioner lan obah in vitro lan in vivo. Partikel ora bisa gampang diseret ing sadawane permukaan saluran napas urip nganggo magnet, nanging sajrone transportasi, endapan kasebut dikonsentrasi ing bidang pandang ing ngendi medan magnet paling kuat. Efisiensi transduksi uga tambah enem kali lipat nalika partikel magnetik lentiviral dikirim ing ngarsane medan magnet. Bebarengan, asil kasebut nuduhake yen partikel magnetik lentiviral lan medan magnet bisa dadi pendekatan sing penting kanggo ningkatake penargetan vektor gen lan nambah tingkat transduksi ing saluran napas in vivo.
Fibrosis kistik (CF) disebabake dening variasi ing gen tunggal sing diarani regulator konduktansi transmembran CF (CFTR). Protein CFTR minangka saluran ion sing ana ing akeh sel epitel ing saindenging awak, kalebu saluran napas penghantar, situs utama patogenesis CF. Cacat CFTR nyebabake transportasi banyu sing ora normal, nggaringake permukaan saluran napas lan nyuda ambane lapisan cairan permukaan saluran napas (ASL). Iki uga ngrusak kemampuan sistem transportasi mukosiliar (MCT) kanggo ngresiki partikel lan patogen sing dihirup saka saluran napas. Tujuan kita yaiku ngembangake terapi gen lentiviral (LV) kanggo ngirim salinan gen CFTR sing bener lan ningkatake kesehatan ASL, MCT, lan paru-paru, lan terus ngembangake teknologi anyar sing bisa ngukur parameter kasebut ing vivo1.
Vektor LV minangka salah sawijining kandidat utama kanggo terapi gen saluran napas CF, utamane amarga bisa nggabungake gen terapeutik kanthi permanen menyang sel basal saluran napas (sel punca saluran napas). Iki penting amarga bisa mulihake hidrasi normal lan pembersihan lendir kanthi mbedakake dadi sel permukaan saluran napas sing ana gandhengane karo CF sing dikoreksi gen fungsional, sing ngasilake keuntungan seumur hidup. Vektor LV kudu diarahake nglawan saluran napas penghantar, amarga iki minangka papan penyakit paru-paru CF diwiwiti. Pangiriman vektor sing luwih jero menyang paru-paru bisa nyebabake transduksi alveolar, nanging iki ora duwe manfaat terapeutik ing CF. Nanging, cairan kayata pembawa gen kanthi alami migrasi menyang alveoli sawise inspirasi sawise pangiriman3,4 lan partikel terapeutik cepet diresiki menyang rongga lisan dening MCT. Efisiensi transduksi LV ana hubungane langsung karo suwene wektu vektor tetep ing jejere sel target kanggo ngidini serapan seluler - "wektu panggonan"5 - sing gampang dikurangi dening aliran udara regional khas uga penangkapan lendir partikel sing terkoordinasi lan MCT. Kanggo CF, kemampuan kanggo ngluwihi wektu panggonan LV ing saluran napas penting kanggo entuk tingkat transduksi sing dhuwur ing wilayah iki, nanging nganti saiki wis dadi tantangan.
Kanggo ngatasi alangan iki, disaranake supaya partikel magnetik LV (MP) bisa mbantu kanthi rong cara sing saling melengkapi. Kapisan, partikel kasebut bisa dipandu sacara magnetik menyang permukaan saluran napas kanggo nambah target lan mbantu partikel pembawa gen manggon ing wilayah saluran napas sing dikarepake; lan ASL) kanggo pindhah menyang lapisan sel 6. MP wis digunakake sacara wiyar minangka kendaraan pangiriman obat sing ditarget nalika kaiket karo antibodi, obat kemoterapi, utawa molekul cilik liyane sing nempel ing membran sel utawa kaiket karo reseptor permukaan sel sing relevan lan nglumpuk ing situs tumor nalika ana listrik statis. Medan Magnet kanggo Perawatan Kanker 7. Teknik "hipertermal" liyane ngarahake kanggo manasi MP nalika kena medan magnet sing osilasi, saengga ngrusak sel tumor. Prinsip transfeksi magnetik, ing ngendi medan magnet digunakake minangka agen transfeksi kanggo nambah transfer DNA menyang sel, umume digunakake in vitro nggunakake macem-macem vektor gen non-virus lan virus kanggo garis sel sing angel ditransduksi. Efektivitas magnetotransfeksi LV wis ditetepake, kanthi pangiriman in vitro LV-MP menyang garis sel epitel bronkial manungsa ing ngarsane medan magnet statis, nambah efisiensi transduksi nganti 186 kali lipat dibandhingake karo vektor LV wae. LV-MP uga wis diterapake ing model CF in vitro, ing ngendi transfeksi magnetik nambah transduksi LV ing kultur antarmuka udara-cair nganti 20 kali lipat ing ngarsane sputum CF10. Nanging, magnetotransfeksi organ in vivo wis nampa perhatian sing relatif sithik lan mung dievaluasi ing sawetara studi kewan11,12,13,14,15, utamane ing paru-paru16,17. Nanging, kesempatan kanggo transfeksi magnetik ing terapi paru-paru CF jelas. Tan et al. (2020) nyatakake yen "studi bukti-konsep babagan pangiriman paru nanopartikel magnetik sing efisien bakal mbukak dalan kanggo strategi inhalasi CFTR ing mangsa ngarep kanggo ningkatake asil klinis ing pasien CF"6.
Prilaku partikel magnetik cilik ing permukaan saluran napas nalika ana medan magnet sing ditrapake angel divisualisasikake lan disinaoni, mula kurang dingerteni. Ing panliten liyane, kita ngembangake metode pencitraan sinar-X kontras fase berbasis propagasi sinkrotron (PB-PCXI) kanggo visualisasi lan ngitung owah-owahan in vivo menit ing ambane ASL18 lan prilaku MCT19,20 kanthi noninvasif kanggo ngukur langsung hidrasi permukaan Saluran gas lan digunakake minangka indikator awal efektifitas perawatan. Kajaba iku, metode evaluasi MCT kita nggunakake partikel diameter 10-35 µm sing kasusun saka alumina utawa kaca indeks bias dhuwur minangka penanda MCT sing katon nggunakake PB-PCXI21. Kaloro teknik kasebut cocog kanggo visualisasi macem-macem jinis partikel, kalebu MP.
Amarga resolusi spasial lan temporal sing dhuwur, teknik analisis ASL lan MCT berbasis PB-PCXI kita cocog banget kanggo mriksa dinamika lan pola prilaku partikel tunggal lan massal in vivo kanggo mbantu kita mangerteni lan ngoptimalake teknik pangiriman gen MP. Pendekatan sing kita gunakake ing kene asale saka panliten kita nggunakake beamline SPring-8 BL20B2, ing ngendi kita nggambarake gerakan cairan sawise pangiriman dosis vektor palsu menyang saluran napas irung lan paru tikus kanggo mbantu nerangake pola ekspresi gen Non-seragam sing diamati ing panliten kewan dosis pembawa gen kita 3,4.
Tujuan saka panliten iki yaiku nggunakake sinkrotron PB-PCXI kanggo nggambarake gerakan in vivo saka seri MP ing trakea tikus urip. Panliten pencitraan PB-PCXI iki dirancang kanggo nguji macem-macem MP, kekuatan medan magnet, lan lokasi kanggo nemtokake efek ing gerakan MP. Kita duwe hipotesis manawa medan magnet sing ditrapake sacara eksternal bakal mbantu MP sing dikirim tetep utawa pindhah menyang area target. Panliten kasebut uga ngidini kita ngenali konfigurasi magnet sing ngoptimalake jumlah partikel sing ditahan ing trakea sawise deposisi. Ing seri panliten kapindho, kita ngupaya nggunakake konfigurasi optimal iki kanggo nduduhake pola transduksi sing diasilake saka pangiriman LV-MP in vivo menyang saluran napas tikus, adhedhasar asumsi manawa pangiriman LV-MP ing konteks penargetan saluran napas bakal nyebabake efisiensi transduksi LV sing luwih apik.
Kabeh panliten kewan ditindakake miturut protokol sing disetujoni dening Universitas Adelaide (M-2019-060 lan M-2020-022) lan Komite Etika Kewan Synchrotron SPring-8. Eksperimen ditindakake miturut pedoman ARRIVE.
Kabeh pencitraan sinar-X ditindakake ing beamline BL20XU ing sinkrotron SPring-8 ing Jepang, nggunakake persiyapan sing padha karo sing diterangake sadurunge21,22. Cekakipun, kothak eksperimen dumunung 245 m saka cincin panyimpenan sinkrotron. Jarak sampel-menyang-detektor 0,6 m digunakake kanggo studi pencitraan partikel lan 0,3 m kanggo studi pencitraan in vivo kanggo ngasilake efek kontras fase. Energi sinar monokromatik 25 keV digunakake. Gambar dijupuk nggunakake konverter sinar-X resolusi dhuwur (SPring-8 BM3) sing dipasangake karo detektor sCMOS. Konverter ngowahi sinar-X dadi cahya sing katon nggunakake sintilator kandel 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), sing banjur diarahake menyang sensor sCMOS nggunakake objektif mikroskop × 10 (NA 0,3). Detektor sCMOS yaiku Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) kanthi ukuran array 2048 × 2048 piksel lan ukuran piksel mentah 6,5 × 6,5 µm. Setelan iki ngasilake ukuran piksel isotropik efektif 0,51 µm lan lapangan pandang kira-kira 1,1 mm × 1,1 mm. Dawane paparan 100 ms dipilih kanggo ngoptimalake rasio sinyal-kanggo-noise partikel magnetik ing njero lan njaba saluran napas nalika nyuda artefak gerakan sing disebabake ambegan. Kanggo panliten in vivo, rana sinar-X cepet diselehake ing jalur sinar-X kanggo mbatesi dosis radiasi kanthi mblokir sinar-X antarane paparan.
Pembawa LV ora digunakake ing studi pencitraan SPring-8 PB-PCXI amarga ruang pencitraan BL20XU ora disertifikasi Biosafety Level 2. Nanging, kita milih sawetara MP sing wis diidentifikasi kanthi apik saka rong pemasok komersial—sing nyakup macem-macem ukuran, bahan, konsentrasi wesi, lan aplikasi—pisanan kanggo mangerteni kepiye medan magnet mengaruhi gerakan MP ing kapiler kaca, lan banjur ing saluran napas sing urip. ing lumahing. MP ukurane antara 0,25 nganti 18 μm lan digawe saka macem-macem bahan (waca Tabel 1), nanging komposisi saben sampel, kalebu ukuran partikel magnetik ing MP, ora dingerteni. Adhedhasar panliten MCT ekstensif 19, 20, 21, 23, 24, kita ngarepake MP cilik nganti 5 μm bisa dideleng ing lumahing saluran napas trakea, contone kanthi nyuda pigura sing berturut-turut kanggo ndeleng visibilitas gerakan MP sing luwih apik. MP ukuran 0,25 μm tunggal luwih cilik tinimbang resolusi piranti pencitraan, nanging PB-PCXI diarepake bisa ndeteksi kontras volume lan gerakan cairan lumahing sing diendapke sawise pengendapan.
Sampel kanggo saben MP ing Tabel 1 disiapake ing kapiler kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) kanthi diameter njero 0,63 mm. Partikel korpuskular kasedhiya ing banyu, dene partikel CombiMag kasedhiya ing cairan duweke pabrikan. Saben tabung diisi setengah karo cairan (kurang luwih 11 μl) lan diselehake ing wadhah sampel (waca Gambar 1). Kapiler kaca diselehake kanthi horisontal ing tahap sampel ing kothak pencitraan, lan diselehake ing pinggir cairan. Magnet boron besi neodymium (NdFeB) cangkang nikel kanthi diameter 19 mm (dawa 28 mm) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) kanthi magnetisasi residual 1,17 Tesla dipasang ing tahap terjemahan sing kapisah kanggo entuk Owah-owahan posisine saka jarak jauh sajrone pencitraan. Akuisisi gambar sinar-X diwiwiti nalika magnet diposisikake kira-kira 30 mm ing ndhuwur sampel, lan gambar dijupuk kanthi kecepatan 4 pigura per detik. Sajrone pencitraan, magnet digawa cedhak karo tabung kapiler kaca. (udakara 1 mm) banjur diterjemahake sadawane tabung kanggo neliti efek saka kekuatan lan posisi medan.
Persiapan pencitraan in vitro sing ngemot sampel MP ing kapiler kaca ing tahap terjemahan xy sampel. Jalur sinar-X ditandhani nganggo garis putus-putus abang.
Sawise visibilitas in vitro MP wis ditetepake, sawetara subset saka tikus kasebut diuji in vivo ing tikus Wistar albino wadon tipe liar (umur ~ 12 minggu, ~ 200 g). 0,24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Jepang), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepang) lan 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Tikus-tikus kasebut dibius nganggo campuran Pharma), Jepang) kanthi injeksi intraperitoneal. Sawise anestesi, dheweke disiapake kanggo pencitraan kanthi mbusak wulu ing sekitar trakea, masang tabung endotrakeal (ET; 16 Ga iv kanula, Terumo BCT) lan ngimobilisasi dheweke ing piring pencitraan khusus sing ngemot tas termal kanggo njaga suhu awak 22. Piring pencitraan banjur dipasang ing tahap terjemahan sampel ing kothak pencitraan kanthi sudut sing rada sithik kanggo nyetel trakea kanthi horisontal ing gambar sinar-X, kaya sing dituduhake ing Gambar 2a.
(a) Persiapan pencitraan in vivo ing kothak pencitraan SPring-8, jalur sinar-X ditandhani nganggo garis putus-putus abang. (b,c) Lokalisasi magnet ing trakea ditindakake saka jarak jauh nggunakake rong kamera IP sing dipasang sacara ortogonal. Ing sisih kiwa gambar layar, lengkungan kawat sing nyekeli sirah bisa dideleng, lan kanula pangiriman ana ing panggonane ing njero tabung ET.
Sistem pompa syringe sing dikontrol saka jarak jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) nggunakake syringe kaca 100 μl disambungake menyang tabung PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) liwat jarum 30 Ga. Tandhani tabung kanggo mesthekake yen pucuke ana ing posisi sing bener ing trakea nalika masang tabung ET. Nggunakake pompa mikro, plunger syringe ditarik nalika pucuk tabung dicelupake ing sampel MP sing bakal dikirim. Tabung pangiriman sing dimuat banjur dilebokake menyang tabung endotrakeal, nyelehake pucuke ing bagean paling kuat saka medan magnet sing diarepake. Akuisisi gambar dikontrol nggunakake detektor respirasi sing disambungake menyang kothak wektu berbasis Arduino, lan kabeh sinyal (kayata suhu, respirasi, mbukak/nutup rana lan akuisisi gambar) direkam nggunakake Powerlab lan LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Nalika pencitraan Nalika wadhah ora bisa diakses, rong kamera IP (Panasonic BB-SC382) diposisikan kira-kira 90° siji lan sijine lan digunakake kanggo ngawasi posisi kasebut. saka magnet relatif marang trakea sajrone pencitraan (Gambar 2b, c). Kanggo nyuda artefak gerakan, siji gambar dijupuk saben ambegan sajrone plato aliran pasang surut pungkasan.
Magnet dipasang ing tahap kapindho sing bisa diselehake saka njaba omah pencitraan. Macem-macem posisi lan konfigurasi magnet diuji, kalebu: Dipasang ing sudut kira-kira 30° ing ndhuwur trakea (konfigurasi sing dituduhake ing Gambar 2a lan 3a); siji magnet ing ndhuwur kewan lan liyane ing ngisor, kanthi kutub sing disetel kanggo narik (Gambar 3b); siji magnet ing ndhuwur kewan lan liyane ing ngisor, kanthi kutub sing disetel kanggo nolak (Gambar 3c); lan siji magnet ing ndhuwur lan tegak lurus karo trakea (Gambar 3d). Sawise kewan lan magnet dikonfigurasi lan MP sing bakal diuji dimuat menyang pompa syringe, wenehake dosis 50 μl kanthi kecepatan 4 μl/detik nalika njupuk gambar. Magnet banjur dipindhah maju mundur utawa lateral ing trakea nalika terus njupuk gambar.
Konfigurasi magnet kanggo pencitraan in vivo (a) magnet tunggal ing ndhuwur trakea kanthi sudut kira-kira 30°, (b) rong magnet sing disetel kanggo narik kawigaten, (c) rong magnet sing disetel kanggo nolak, (d) magnet tunggal ing ndhuwur lan tegak lurus ing trakea. Pengamat ndeleng mudhun saka cangkem menyang paru-paru liwat trakea, lan sinar-X ngliwati sisih kiwa tikus lan metu saka sisih tengen. Magnet kasebut dipindhah ing sadawane saluran napas utawa kiwa lan tengen ing ndhuwur trakea ing arah sinar-X.
Kita uga ngupaya nemtokake visibilitas lan prilaku partikel ing saluran napas tanpa ana gangguan pernapasan lan gerakan jantung. Mulane, ing pungkasan periode pencitraan, kewan-kewan dipateni kanthi manusiawi amarga overdosis pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Sawetara kewan ditinggal ing platform pencitraan, lan sawise ambegan lan detak jantung mandheg, proses pencitraan diulang, nambahake dosis MP tambahan yen ora ana MP sing katon ing permukaan saluran napas.
Gambar sing dipikolehi dikoreksi medan datar lan medan peteng banjur dirakit dadi film (20 pigura per detik; 15-25 × kecepatan normal gumantung saka tingkat pernapasan) nggunakake skrip khusus sing ditulis ing MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Kabeh panliten pangiriman vektor gen LV ditindakake ing Fasilitas Riset Kewan Laboratorium ing Universitas Adelaide lan tujuane nggunakake asil eksperimen SPring-8 kanggo neliti apa pangiriman LV-MP nalika ana medan magnet bisa ningkatake transfer gen in vivo. Kanggo neliti efek MP lan medan magnet, rong klompok kewan diwenehi perawatan: siji klompok diwenehi LV-MP kanthi magnet sing dipasang, lan klompok liyane nampa klompok kontrol kanthi LV-MP tanpa magnet.
Vektor gen LV digawe nggunakake metode sing wis diterangake sadurunge 25, 26. Vektor LacZ ngekspresikake gen beta-galaktosidase sing dilokalisasi nuklir sing didorong dening promotor MPSV konstitutif (LV-LacZ), sing ngasilake produk reaksi biru ing sel sing ditransduksi, katon ing ngarep jaringan paru-paru lan bagean jaringan. Titrasi ditindakake ing kultur sel kanthi ngetung jumlah sel positif LacZ kanthi manual nganggo hemocytometer kanggo ngetung titer ing TU/ml. Operator dikriopreservasi ing -80 °C, dicairke sadurunge digunakake, lan diikat menyang CombiMag kanthi nyampur kanthi rasio 1:1 lan diinkubasi ing es paling ora 30 menit sadurunge dikirim.
Tikus Sprague Dawley normal (n = 3/klompok, ~2-3 dibius intraperitoneal nganggo campuran injeksi 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) lan 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australia) umur sewulan) ip) lan kanulasi oral non-bedah nganggo kanula 16 Ga iv. Kanggo mesthekake yen jaringan saluran napas trakea nampa transduksi LV, dikondisikake nggunakake protokol perturbasi mekanik sing wis diterangake sadurunge, ing ngendi permukaan saluran napas trakea digosok kanthi aksial nganggo kranjang kawat (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Administrasi trakea LV-MP banjur ditindakake ing lemari keamanan biologis kira-kira 10 menit sawise perturbasi.
Medan magnet sing digunakake ing eksperimen iki dikonfigurasi kanthi cara sing padha karo studi pencitraan sinar-X in vivo, kanthi magnet sing padha ditahan ing ndhuwur trakea nggunakake klip stent distilasi (Gambar 4). Volume 50 μl (2 × 25 μl aliquot) LV-MP dikirim menyang trakea (n = 3 kewan) nggunakake pipet sing ngemot ujung gel kaya sing diterangake sadurunge. Klompok kontrol (n = 3 kewan) nampa LV-MP sing padha tanpa nggunakake magnet. Sawise infus rampung, kanula dicopot saka tabung ET lan kewan kasebut diekstubasi. Magnet tetep ana ing panggonane sajrone 10 menit, banjur dicopot. Tikus nampa dosis meloxicam subkutan (1 ml/kg) (Ilium, Australia) diikuti karo pembalikan anestesi kanthi injeksi ip 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia). Tikus dijaga anget lan dipantau nganti pulih lengkap saka anestesi.
Piranti pangiriman LV-MP ing lemari keamanan biologis. Pusat Luer abu-abu enom saka tabung ET bisa dideleng metu saka cangkem lan pucuk gel pipet sing dituduhake ing gambar dilebokake liwat tabung ET nganti jerone sing dikarepake menyang trakea.
Seminggu sawise prosedur dosis LV-MP, kewan-kewan kasebut dipateni kanthi manusiawi kanthi inhalasi CO2 100% lan ekspresi LacZ ditaksir nggunakake perawatan X-gal standar. Telung cincin paling rawan kaudal dicopot kanggo mesthekake yen kerusakan mekanik utawa retensi cairan saka penempatan tabung endotrakeal ora kalebu ing analisis. Saben trakea dipotong kanthi longitudinal kanggo nggawe rong bagian kanggo analisis, lan dipasang ing piring sing ngemot karet silikon (Sylgard, Dow Inc) nggunakake jarum Minutien (Fine Science Tools) kanggo nggambarake permukaan luminal. Distribusi lan pola sel sing ditransduksi dikonfirmasi kanthi fotografi frontal nggunakake mikroskop Nikon (SMZ1500) nganggo kamera DigiLite lan piranti lunak TCapture (Tucsen Photonics, China). Gambar dijupuk kanthi pembesaran 20x (kalebu setelan paling dhuwur kanggo jembar trakea), kanthi kabeh dawa trakea dicitra langkah demi langkah, njamin tumpang tindih sing cukup antarane saben gambar kanggo ngidini gambar "jahitan". Gambar saka saben trakea yaiku banjur dirakit dadi siji gambar komposit nggunakake Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) nggunakake algoritma gerakan planar. Area ekspresi LacZ ing gambar komposit trakea saka saben kewan diukur nggunakake skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) kaya sing diterangake sadurunge, nggunakake setelan 0,35 < Hue < 0,58, Saturasi > 0,15, lan Nilai < 0,7. Kanthi nglacak kontur jaringan, topeng digawe kanthi manual ing GIMP v2.10.24 kanggo saben gambar komposit kanggo ngenali area jaringan lan nyegah deteksi palsu saka njaba jaringan trakea. Area sing diwarnai saka kabeh gambar komposit saka saben kewan dijumlah kanggo ngasilake total area sing diwarnai kanggo kewan kasebut. Area sing diwarnai banjur dibagi karo total area topeng kanggo ngasilake area sing dinormalisasi.
Saben trakea dilebokake ing parafin lan bagean 5 μm dipotong. Bagean kasebut diwarnai maneh nganggo warna abang cepet netral sajrone 5 menit lan gambar dijupuk nggunakake mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 lan piranti lunak penangkap elemen NIS (versi 5.20.00).
Kabeh analisis statistik ditindakake ing GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Signifikansi statistik disetel ing p ≤ 0,05. Normalitas diverifikasi nggunakake uji Shapiro-Wilk, lan bedane pewarnaan LacZ ditaksir nggunakake uji-t sing ora dipasangake.
Enem MP sing diterangake ing Tabel 1 ditliti nggunakake PCXI, lan visibilitas diterangake ing Tabel 2. Rong MP polistirena (MP1 lan MP2; 18 μm lan 0,25 μm, masing-masing) ora katon ing PCXI, nanging sampel liyane bisa diidentifikasi (conto dituduhake ing Gambar 5). MP3 lan MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm lan 0,9 μm, masing-masing) katon samar-samar. Sanajan ngemot sawetara partikel paling cilik sing diuji, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) minangka sing paling jelas. Produk CombiMag MP6 angel dideleng. Ing kabeh kasus, kemampuan kita kanggo ndeteksi MP saya tambah kanthi signifikan kanthi nerjemahake magnet maju mundur sejajar karo kapiler. Nalika magnet pindhah saka kapiler, partikel kasebut dawa kanthi senar sing dawa, nanging nalika magnet saya cedhak lan kekuatan medan magnet saya tambah, senar partikel saya cendhek nalika partikel pindhah menyang permukaan ndhuwur kapiler (waca Video Tambahan S1: MP4), nambah The Kapadhetan partikel ing lumahing. Kosok baline, nalika magnet dicopot saka kapiler, kekuwatan medan mudhun lan MP nyusun ulang dadi senar dawa sing metu saka lumahing ndhuwur kapiler (waca Video Tambahan S2:MP4). Sawise magnet mandheg obah, partikel terus obah sajrone wektu sing cendhak sawise tekan posisi keseimbangan. Nalika MP obah menyang lan adoh saka lumahing ndhuwur kapiler, partikel magnetik biasane nyeret lebu liwat cairan.
Visibilitas MP ing PCXI beda-beda banget antarane sampel. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 lan (d) MP6. Kabeh gambar sing dituduhake ing kene dijupuk nganggo magnet sing dumunung kira-kira 10 mm langsung ing ndhuwur kapiler. Bunderan gedhe sing katon yaiku gelembung udara sing kejebak ing kapiler, kanthi jelas nuduhake fitur pinggiran ireng lan putih saka pencitraan kontras fase. Kothak abang ngemot pembesaran sing ningkatake kontras. Elinga yen diameter skema magnet ing kabeh gambar ora miturut skala lan kira-kira 100 kali luwih gedhe tinimbang sing dituduhake.
Nalika magnet ditranslasikake kiwa lan tengen ing sadawane ndhuwur kapiler, sudut senar MP owah supaya sejajar karo magnet (waca Gambar 6), saengga nggambarake garis medan magnet. Kanggo MP3-5, sawise akord tekan sudut ambang, partikel-partikel kasebut diseret ing sadawane permukaan ndhuwur kapiler. Iki asring nyebabake MP nglumpuk dadi klompok sing luwih gedhe cedhak karo papan medan magnet paling kuat (waca Video Tambahan S3:MP5). Iki uga katon banget nalika pencitraan cedhak karo ujung kapiler, sing nyebabake MP nglumpuk lan konsentrasi ing antarmuka cairan-udara. Partikel ing MP6, sing luwih angel dibedakake tinimbang MP3-5, ora diseret nalika magnet obah ing sadawane kapiler, nanging senar MP disosiasi, ninggalake partikel ing bidang pandang (waca Video Tambahan S4:MP6). Ing sawetara kasus, nalika medan magnet sing ditrapake dikurangi kanthi mindhah magnet jarak sing adoh saka lokasi pencitraan, MP sing isih ana alon-alon mudhun menyang permukaan ngisor tabung kanthi gravitasi nalika tetep ana ing senar (waca Video Tambahan S5: MP3).
Sudut senar MP owah nalika magnet diterjemahake menyang tengen ing ndhuwur kapiler. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 lan (d) MP6. Kothak abang ngemot pembesaran sing ningkatake kontras. Elinga yen video tambahan informatif amarga nuduhake struktur partikel penting lan informasi dinamis sing ora bisa divisualisasikake ing gambar statis iki.
Tes kita nuduhake yen mindhah magnet alon-alon maju mundur ing sadawane trakea nggampangake visualisasi MP ing konteks gerakan kompleks in vivo. Tes in vivo ora ditindakake amarga manik-manik polistirena (MP1 lan MP2) ora katon ing kapiler. Saben papat MP sing isih ana diuji in vivo kanthi sumbu dawa magnet sing dikonfigurasi ing ndhuwur trakea kanthi sudut udakara 30° nganti vertikal (waca Gambar 2b lan 3a), amarga iki nyebabake rantai MP sing luwih dawa lan luwih efektif tinimbang konfigurasi magnet sing diakhiri. MP3, MP4 lan MP6 ora dideteksi ing trakea kewan urip. Nalika saluran napas tikus dicitrakake sawise kewan dipateni kanthi manusiawi, partikel kasebut tetep ora katon sanajan volume tambahan ditambahake nggunakake pompa syringe. MP5 nduweni kandungan oksida wesi paling dhuwur lan minangka siji-sijine partikel sing katon, lan mulane digunakake kanggo netepake lan menehi ciri prilaku in vivo MP.
Masang magnet ing ndhuwur trakea sajrone pangiriman MP nyebabake akeh, nanging ora kabeh, MP sing terkonsentrasi ing bidang pandang. Partikel sing mlebu trakea paling apik diamati ing kewan sing dikorbanake kanthi manusiawi. Gambar 7 lan Video Tambahan S6: MP5 nuduhake penangkapan magnetik kanthi cepet lan penyelarasan partikel ing permukaan trakea ventral, sing nuduhake yen MP bisa diarahake menyang wilayah trakea sing dikarepake. Nalika nggoleki luwih distal ing sadawane trakea sawise pangiriman MP, sawetara MP ditemokake luwih cedhak karo carina, sing nuduhake yen kekuatan medan magnet ora cukup kanggo ngumpulake lan nahan kabeh MP, amarga dikirim liwat wilayah kekuatan medan magnet maksimum sajrone proses cairan. Nanging, konsentrasi MP postpartum luwih dhuwur ing sekitar area sing dicitrakake, sing nuduhake yen akeh MP tetep ana ing wilayah saluran napas ing ngendi kekuatan medan magnet sing ditrapake paling dhuwur.
Gambar saka (a) sadurunge lan (b) sawise pangiriman MP5 menyang trakea tikus sing nembe dieutanasia kanthi magnet sing dipasang langsung ing ndhuwur area pencitraan. Area sing dicitrakake dumunung ing antarane rong cincin balung rawan. Sadurunge pangiriman MP, ana sawetara cairan ing saluran napas. Kothak abang ngemot pembesaran sing ningkatake kontras. Gambar-gambar iki saka video sing ditampilake ing Video Tambahan S6:MP5.
Nransfer magnet ing sadawane trakea in vivo nyebabake rantai MP ngganti sudut ing permukaan saluran napas kanthi cara sing padha karo sing katon ing kapiler (waca Gambar 8 lan Video Tambahan S7: MP5). Nanging, ing panliten kita, MP ora bisa diseret ing sadawane permukaan saluran napas urip kaya sing bisa ditindakake nganggo kapiler. Ing sawetara kasus, rantai MP bakal dadi luwih dawa nalika magnet obah kiwa lan tengen. Sing menarik, kita uga nemokake manawa senar partikel katon ngganti ambane lapisan cairan permukaan nalika magnet dipindhah kanthi longitudinal ing sadawane trakea, lan ngembang nalika magnet dipindhah langsung ing ndhuwur lan senar partikel diputer menyang posisi vertikal (waca Video Tambahan S7). : MP5 jam 0:09, tengen ngisor). Pola gerakan sing khas owah nalika magnet diterjemahake ing sisih ndhuwur trakea kanthi lateral (yaiku, ing sisih kiwa utawa tengen kewan tinimbang ing sadawane trakea). Partikel-partikel kasebut isih katon jelas nalika obah, nanging nalika magnet dicopot saka trakea, pucuk senar partikel dadi katon (waca Video Tambahan S8:MP5, diwiwiti jam 0:08). Iki konsisten karo prilaku MP sing diamati ing sangisore medan magnet sing ditrapake ing kapiler kaca.
Conto gambar sing nuduhake MP5 ing trakea tikus urip sing dibius. (a) Magnet digunakake kanggo njupuk gambar ing ndhuwur lan ing sisih kiwa trakea, banjur (b) sawise magnet dipindhah menyang tengen. Kothak abang ngemot pembesaran sing ningkatake kontras. Gambar-gambar iki saka video sing ditampilake ing Video Tambahan S7:MP5.
Nalika rong kutub kasebut dikonfigurasi kanthi orientasi lor-kidul ing ndhuwur lan ngisor trakea (yaiku narik kawigaten; Gambar 3b), akord MP katon luwih dawa lan dumunung ing dinding samping trakea tinimbang ing permukaan trakea dorsal (waca Video Tambahan S9:MP5). Nanging, konsentrasi partikel sing dhuwur ing siji lokasi (yaiku, permukaan dorsal trakea) ora dideteksi sawise pangiriman cairan nalika piranti magnet ganda digunakake, sing biasane kedadeyan nalika piranti magnet tunggal digunakake. Banjur nalika siji magnet dikonfigurasi kanggo nolak kutub sing dibalik (Gambar 3c), jumlah partikel sing katon ing lapangan pandang ora katon tambah sawise pangiriman. Persiapan loro konfigurasi magnet ganda iku tantangan amarga kekuatan medan magnet sing dhuwur sing narik utawa ndorong magnet. Persiapan kasebut banjur diganti dadi magnet tunggal sing sejajar karo saluran napas nanging ngliwati saluran napas kanthi sudut 90 derajat supaya garis medan nyabrang dinding trakea kanthi ortogonal (Gambar 3d), orientasi sing dirancang kanggo nemtokake manawa agregasi partikel ing dinding samping bisa diamati. Nanging, ing konfigurasi iki, ora ana gerakan akumulasi MP utawa gerakan magnet sing bisa diidentifikasi. Adhedhasar kabeh asil iki, konfigurasi orientasi 30 derajat magnet tunggal (Gambar 3a) dipilih kanggo studi pembawa gen in vivo.
Nalika kéwan kasebut dicitra bola-bali langsung sawisé dipatèni kanthi cara sing manusiawi, ora anané gerakan jaringan sing ngganggu tegesé garis partikel sing luwih alus lan luwih cendhek bisa dideleng ing lapangan interkondral sing jelas, "goyang" salaras karo gerakan translasi magnet. Nanging, isih ora bisa ndeleng kanthi jelas anané lan gerakan partikel MP6.
Titer LV-LacZ yaiku 1,8 × 108 TU/ml, lan sawise dicampur 1:1 karo CombiMag MP (MP6), kewan nampa dosis trakea 50 μl 9 × 107 TU/ml kendaraan LV (yaiku 4,5 × 106 TU/tikus). Ing panliten kasebut, tinimbang nerjemahake magnet sajrone persalinan, kita ndandani magnet ing sak posisi kanggo nemtokake manawa transduksi LV (a) bisa ditingkatake dibandhingake karo pangiriman vektor tanpa medan magnet, lan (b) bisa difokusake Sel saluran napas ditransduksi menyang wilayah target magnetik ing saluran napas ndhuwur.
Anane magnet lan panggunaan CombiMag sing digabungake karo vektor LV katon ora duwe efek sing ala kanggo kesehatan kewan, kaya protokol pangiriman vektor LV standar kita. Gambar ngarep wilayah trakea sing kena gangguan mekanik (Gambar Tambahan 1) nuduhake manawa ana tingkat transduksi sing luwih dhuwur ing klompok kewan sing diobati nganggo LV-MP nalika magnet ana (Gambar 9a). Mung sithik pewarnaan LacZ biru sing ana ing klompok kontrol (Gambar 9b). Kuantifikasi area sing diwarnai X-Gal sing dinormalisasi nuduhake manawa administrasi LV-MP ing ngarsane medan magnet ngasilake perbaikan kira-kira 6 kali lipat (Gambar 9c).
Conto gambar komposit sing nuduhake transduksi trakea dening LV-MP (a) nalika ana medan magnet lan (b) nalika ora ana magnet. (c) Peningkatan sing signifikan sacara statistik ing area transduksi LacZ sing normal ing trakea nalika nggunakake magnet (*p = 0,029, uji-t, n = 3 saben klompok, rata-rata ± SEM).
Bagean sing diwarnai abang cepet netral (tuladha sing dituduhake ing Gambar Tambahan 2) nuduhake sel sing diwarnai LacZ ana ing pola lan lokasi sing padha kaya sing dilapurake sadurunge.
Tantangan utama kanggo terapi gen saluran napas tetep lokalisasi partikel pembawa sing akurat menyang wilayah sing diminati lan entuk tingkat efisiensi transduksi sing dhuwur ing paru-paru sing obah nalika ana aliran udara lan pembersihan lendir aktif. Kanggo operator LV sing dirancang kanggo nambani penyakit saluran napas CF, nambah wektu residensi partikel pembawa ing saluran napas penghantar wis dadi tujuan sing angel ditemokake. Kaya sing dituduhake dening Castellani et al., panggunaan medan magnet kanggo nambah transduksi nduweni kaluwihan dibandhingake karo metode pangiriman gen liyane kayata elektroporasi, amarga bisa nggabungake kesederhanaan, efektifitas biaya, lokalisasi pangiriman, peningkatan efisiensi, lan wektu inkubasi sing luwih cendhek, lan bisa uga dosis pembawa sing luwih cilik10. Nanging, deposisi in vivo lan prilaku partikel magnetik ing saluran napas ing sangisore pengaruh gaya magnetik eksternal durung nate diterangake, lan uga durung nate dibuktekake kelayakan metode iki in vivo kanggo nambah tingkat ekspresi gen ing saluran napas urip sing utuh.
Eksperimen PCXI sinkrotron in vitro nuduhake yen kabeh partikel sing dites, kajaba polistirena MP, katon ing persiyapan pencitraan sing digunakake. Ing ngarsane medan magnet, MP mbentuk senar sing dawane ana gandhengane karo jinis partikel lan kekuatan medan magnet (yaiku jarak lan gerakan magnet). Kaya sing dituduhake ing Gambar 10, senar sing diamati dibentuk amarga saben partikel individu dimagnetisasi lan nyebabake medan magnet lokal dhewe. Medan sing kapisah iki nyebabake partikel liyane sing padha nglumpuk lan nyambung, kanthi gerakan kaya senar klompok amarga gaya lokal saka gaya tarik lan tolak lokal partikel liyane.
Skema sing nuduhake (a,b) sepur partikel sing diasilake ing njero kapiler sing kebak cairan lan (c,d) trakea sing kebak udara. Elinga yen kapiler lan trakea ora digambar miturut skala. Panel (a) uga ngemot katrangan babagan MP, sing ngemot partikel Fe3O4 sing disusun ing senar.
Nalika magnet dipindhah ing ndhuwur kapiler, sudut senar partikel tekan ambang kritis kanggo MP3-5 sing ngemot Fe3O4, sawise iku senar partikel ora tetep ing posisi asline, nanging pindhah ing sadawane permukaan menyang posisi anyar. Efek iki kamungkinan kedadeyan amarga permukaan kapiler kaca cukup alus kanggo ngidini gerakan iki kedadeyan. Menarik, MP6 (CombiMag) ora tumindak kaya iki, bisa uga amarga partikel luwih cilik, duwe lapisan utawa muatan permukaan sing beda, utawa cairan pembawa sing dipatenake mengaruhi kemampuane kanggo obah. Kontras gambar partikel CombiMag uga luwih lemah, nuduhake yen cairan lan partikel bisa uga duwe kapadhetan sing padha lan mula ora gampang obah menyang siji liyane. Partikel uga bisa macet yen magnet obah kanthi cepet banget, nuduhake yen kekuatan medan magnet ora mesthi bisa ngatasi gesekan antarane partikel ing cairan, nuduhake yen mungkin ora nggumunake yen kekuatan medan magnet lan jarak antarane magnet lan area target Penting banget. Dijupuk bebarengan, asil kasebut uga nuduhake yen, nalika magnet bisa nangkep akeh MP sing mili liwat area target, ora mungkin magnet bisa diandelake. kanggo mindhah partikel CombiMag ing sadawane permukaan trakea. Mulane, kita nyimpulake yen panliten LV-MP in vivo kudu nggunakake medan magnet statis kanggo nargetake sacara fisik wilayah tartamtu saka wit saluran napas.
Nalika partikel dikirim menyang awak, partikel kasebut angel diidentifikasi ing konteks jaringan awak sing obah kanthi kompleks, nanging kemampuan kanggo ndeteksi kasebut ditingkatake kanthi nerjemahake magnet kanthi horisontal ing ndhuwur trakea kanggo "ngobahake" senar MP. Sanajan pencitraan langsung bisa ditindakake, luwih gampang kanggo mbedakake gerakan partikel sawise kewan kasebut dipateni kanthi manusiawi. Konsentrasi MP umume paling dhuwur ing lokasi iki nalika magnet diselehake ing ndhuwur area pencitraan, sanajan sawetara partikel biasane ditemokake luwih adoh ing sadawane trakea. Beda karo studi in vitro, partikel ora bisa diseret ing sadawane trakea kanthi nerjemahake magnet. Temuan iki konsisten karo kepiye lendir sing nutupi permukaan trakea biasane ngolah partikel sing dihirup, njebak ing lendir lan banjur diresiki dening mekanisme pembersihan mukosiliar.
Kita duwe hipotesis manawa panggunaan magnet kanggo narik kawigaten ing ndhuwur lan ngisor trakea (Gambar 3b) bisa nyebabake medan magnet sing luwih seragam, tinimbang medan magnet sing terkonsentrasi banget ing sak titik, sing bisa nyebabake distribusi partikel sing luwih seragam. Nanging, panliten awal kita ora nemokake bukti sing jelas kanggo ndhukung hipotesis iki. Kajaba iku, konfigurasi sepasang magnet kanggo nolak (Gambar 3c) ora nyebabake luwih akeh deposisi partikel ing area sing dicitra. Rong temuan iki nuduhake manawa persiyapan magnet ganda ora nambah kontrol lokal penargetan MP kanthi signifikan, lan gaya magnet sing kuwat sing diasilake angel dikonfigurasi, saengga pendekatan iki kurang praktis. Kajaba iku, orientasi magnet ing ndhuwur lan liwat trakea (Gambar 3d) uga ora nambah jumlah partikel sing ditahan ing area sing dicitra. Sawetara konfigurasi alternatif iki bisa uga ora sukses amarga nyebabake kekuatan medan magnet sing luwih murah ing area deposisi. Mulane, konfigurasi magnet sudut 30 derajat tunggal (Gambar 3a) dianggep minangka metode sing paling gampang lan paling efisien kanggo uji coba in vivo.
Panliten LV-MP nuduhake yen nalika vektor LV digabungake karo CombiMag lan dikirim sawise gangguan fisik nalika ana medan magnet, tingkat transduksi mundhak sacara signifikan ing trakea dibandhingake karo kontrol. Adhedhasar panliten pencitraan sinkrotron lan asil LacZ, medan magnet kasebut ketoke bisa njaga LV ing njero trakea lan nyuda jumlah partikel vektor sing langsung nembus jero menyang paru-paru. Peningkatan target kasebut bisa nyebabake efektifitas sing luwih dhuwur nalika nyuda titer sing dikirim, transduksi sing ora cocog karo target, efek samping inflamasi lan kekebalan, lan biaya pembawa gen. Sing penting, miturut pabrikan, CombiMag bisa digunakake bebarengan karo metode transfer gen liyane, kalebu karo vektor virus liyane (kayata AAV) lan asam nukleat.