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Os vetores gênicos para o tratamento da doença pulmonar da fibrose cística devem ter como alvo as vias aéreas condutoras, pois a transdução pulmonar periférica não proporciona benefício terapêutico. A eficiência da transdução viral está diretamente relacionada ao tempo de residência do vetor. No entanto, fluidos de administração, como os portadores de genes, difundem-se naturalmente para os alvéolos durante a inspiração, e partículas terapêuticas de qualquer forma são rapidamente eliminadas pelo transporte mucociliar. Prolongar o tempo de residência dos portadores de genes nas vias aéreas é importante, mas difícil de alcançar. Partículas magnéticas conjugadas a portadores de genes que podem ser direcionadas à superfície das vias aéreas podem melhorar o direcionamento regional. Devido aos desafios da visualização in vivo, o comportamento dessas pequenas partículas magnéticas na superfície das vias aéreas na presença de um campo magnético aplicado é pouco compreendido. O objetivo deste estudo foi usar imagens síncrotron para visualizar o movimento in vivo de uma série de partículas magnéticas na traqueia de ratos anestesiados para examinar a dinâmica e os padrões de comportamento de partículas individuais e em massa in vivo. Em seguida, também avaliamos se a administração de partículas magnéticas lentivirais na presença de um campo magnético aumentaria a eficiência da transdução no traqueia de rato. Imagens de raios X síncrotron revelam o comportamento de partículas magnéticas em campos magnéticos estacionários e móveis in vitro e in vivo. As partículas não podem ser facilmente arrastadas ao longo da superfície das vias aéreas vivas com ímãs, mas durante o transporte, os depósitos são concentrados no campo de visão onde o campo magnético é mais forte. A eficiência da transdução também aumentou seis vezes quando partículas magnéticas lentivirais foram entregues na presença de um campo magnético. Juntos, esses resultados sugerem que partículas magnéticas lentivirais e campos magnéticos podem ser abordagens valiosas para melhorar o direcionamento do vetor genético e aumentar os níveis de transdução nas vias aéreas condutoras in vivo.
A fibrose cística (FC) é causada pela variação em um único gene chamado regulador de condutância transmembrana da FC (CFTR). A proteína CFTR é um canal iônico presente em muitas células epiteliais do corpo, incluindo as vias aéreas condutoras, um importante local de patogênese da FC. Defeitos no CFTR levam ao transporte anormal de água, desidratando a superfície das vias aéreas e reduzindo a profundidade da camada de líquido da superfície das vias aéreas (ASL). Isso também prejudica a capacidade do sistema de transporte mucociliar (MCT) de limpar partículas inaladas e patógenos das vias aéreas. Nosso objetivo é desenvolver uma terapia genética lentiviral (LV) para fornecer a cópia correta do gene CFTR e melhorar o ASL, o MCT e a saúde pulmonar, e continuar desenvolvendo novas tecnologias capazes de medir esses parâmetros in vivo1.
Os vetores LV são um dos principais candidatos à terapia gênica das vias aéreas na FC, principalmente porque podem integrar permanentemente o gene terapêutico às células basais das vias aéreas (células-tronco das vias aéreas). Isso é importante porque eles podem restaurar a hidratação normal e a depuração do muco, diferenciando-se em células funcionais da superfície das vias aéreas associadas à FC corrigidas por genes, resultando em benefícios ao longo da vida. Os vetores LV devem ser direcionados contra as vias aéreas condutoras, pois é onde a doença pulmonar da FC se inicia. A administração do vetor mais profundamente no pulmão pode resultar em transdução alveolar, mas isso não tem benefício terapêutico na FC. No entanto, fluidos como os portadores do gene migram naturalmente para os alvéolos após a inspiração3,4 e as partículas terapêuticas são rapidamente eliminadas na cavidade oral pelo TCM. A eficiência da transdução do LV está diretamente relacionada ao tempo que o vetor permanece próximo às células-alvo para permitir a captação celular – o “tempo de residência”5 – que é facilmente reduzido pelo fluxo aéreo regional típico, bem como pela captura coordenada de muco por partículas e TCM. Para a FC, a capacidade de prolongar o tempo de residência do LV dentro das vias aéreas é importante para atingir altos níveis de transdução nesta região, mas até agora tem sido desafiador.
Para superar esse obstáculo, sugerimos que as partículas magnéticas (MPs) do VE podem ajudar de duas maneiras complementares. Primeiro, elas podem ser guiadas magneticamente até a superfície das vias aéreas para melhorar o direcionamento e ajudar as partículas transportadoras do gene a residirem na região desejada das vias aéreas; e ASL) a se moverem para a camada celular 6. As MPs têm sido amplamente utilizadas como veículos de administração direcionada de medicamentos quando se ligam a anticorpos, medicamentos quimioterápicos ou outras moléculas pequenas que se ligam às membranas celulares ou se ligam a receptores relevantes da superfície celular e se acumulam em locais de tumores na presença de eletricidade estática. Campos Magnéticos para Tratamento do Câncer 7. Outras técnicas “hipertérmicas” visam aquecer os MPs quando eles são expostos a campos magnéticos oscilantes, destruindo assim as células tumorais. O princípio da transfecção magnética, no qual um campo magnético é usado como agente de transfecção para aumentar a transferência de DNA para as células, é comumente usado in vitro usando uma variedade de vetores de genes virais e não virais para linhagens celulares difíceis de transduzir. A eficácia da magnetotransfecção do VE foi estabelecida, com a administração in vitro de MPs do VE a uma linhagem de células epiteliais brônquicas humanas na presença de um campo magnético estático, aumentando a eficiência da transdução em 186 vezes em comparação com o vetor VE sozinho. A MP do VE também foi aplicada a um modelo in vitro de FC, onde a transfecção magnética aumentou a transdução do VE em culturas de interface ar-líquido em 20 vezes na presença de escarro de FC10. No entanto, a magnetotransfecção in vivo de órgãos recebeu relativamente pouca atenção e só foi avaliada em alguns animais estudos11,12,13,14,15, especialmente nos pulmões16,17. No entanto, as oportunidades para transfecção magnética na terapia pulmonar de FC são claras. Tan et al. (2020) afirmaram que “um estudo de prova de conceito de administração pulmonar eficiente de nanopartículas magnéticas abrirá caminho para futuras estratégias de inalação de CFTR para melhorar os resultados clínicos em pacientes com FC”6.
O comportamento de pequenas partículas magnéticas nas superfícies das vias aéreas na presença de um campo magnético aplicado é difícil de visualizar e estudar e, portanto, mal compreendido. Em outros estudos, desenvolvemos um método de imagem de raios X de contraste de fase baseado em propagação de síncrotron (PB-PCXI) para visualizar e quantificar de forma não invasiva pequenas alterações in vivo na profundidade do ASL18 e no comportamento do MCT19,20 para medir diretamente a hidratação da superfície do canal gasoso e ser usado como um indicador precoce da eficácia do tratamento. Além disso, nosso método de avaliação do MCT usa partículas de 10–35 µm de diâmetro compostas de alumina ou vidro de alto índice de refração como marcadores de MCT visíveis usando PB-PCXI21. Ambas as técnicas são adequadas para visualização de uma variedade de tipos de partículas, incluindo MP.
Devido à sua alta resolução espacial e temporal, nossas técnicas de análise ASL e MCT baseadas em PB-PCXI são adequadas para examinar a dinâmica e os padrões de comportamento de partículas únicas e em massa in vivo para nos ajudar a entender e otimizar as técnicas de entrega de genes MP. A abordagem que empregamos aqui deriva de nossos estudos usando a linha de luz SPring-8 BL20B2, na qual visualizamos o movimento do fluido após a entrega de dose de vetor simulado nas vias aéreas nasais e pulmonares de camundongos para ajudar a explicar nossos padrões de expressão gênica não uniformes observados em nossos estudos com animais portadores de doses de genes 3,4.
O objetivo deste estudo foi usar o síncrotron PB-PCXI para visualizar os movimentos in vivo de uma série de MPs na traqueia de ratos vivos. Esses estudos de imagem PB-PCXI foram projetados para testar uma variedade de MPs, intensidades de campo magnético e locais para determinar seu efeito no movimento do MP. Nossa hipótese é que um campo magnético aplicado externamente ajudaria o MP entregue a permanecer ou se mover para a área alvo. Esses estudos também nos permitiram identificar configurações magnéticas que maximizam o número de partículas retidas na traqueia após a deposição. Em uma segunda série de estudos, buscamos usar essa configuração ideal para demonstrar o padrão de transdução resultante da entrega in vivo de LV-MPs às vias aéreas do rato, com base na suposição de que a entrega de LV-MPs no contexto de direcionamento das vias aéreas resultaria em melhor eficiência de transdução do VE.
Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pela Universidade de Adelaide (M-2019-060 e M-2020-022) e pelo Comitê de Ética em Animais Síncrotron SPring-8. Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes ARRIVE.
Todas as imagens de raios X foram realizadas na linha de luz BL20XU no síncrotron SPring-8 no Japão, usando uma configuração semelhante à descrita anteriormente21,22. Resumidamente, a caixa experimental estava localizada a 245 m do anel de armazenamento do síncrotron. Uma distância de amostra ao detector de 0,6 m é usada para estudos de imagens de partículas e 0,3 m para estudos de imagens in vivo para gerar efeitos de contraste de fase. Uma energia de feixe monocromática de 25 keV foi usada. As imagens foram capturadas usando um conversor de raios X de alta resolução (SPring-8 BM3) acoplado a um detector sCMOS. O conversor converte raios X em luz visível usando um cintilador de 10 µm de espessura (Gd3Al2Ga3O12), que é então direcionado a um sensor sCMOS usando uma objetiva de microscópio × 10 (NA 0,3). O detector sCMOS foi o Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japão) com um tamanho de matriz de 2048 × 2048 pixels e um tamanho de pixel bruto de 6,5 × 6,5 µm. Essa configuração produz um tamanho de pixel isotrópico efetivo de 0,51 µm e um campo de visão de aproximadamente 1,1 mm × 1,1 mm. Um comprimento de exposição de 100 ms foi escolhido para maximizar a relação sinal-ruído de partículas magnéticas dentro e fora das vias aéreas, minimizando os artefatos de movimento induzidos pela respiração. Para estudos in vivo, um obturador rápido de raios X foi colocado no caminho do raio X para limitar a dose de radiação, bloqueando o feixe de raios X entre as exposições.
O transportador LV não foi usado em nenhum estudo de imagem SPring-8 PB-PCXI porque a câmara de imagem BL20XU não possui certificação de Nível de Biossegurança 2. Em vez disso, selecionamos uma variedade de MPs bem caracterizados de dois fornecedores comerciais, abrangendo uma variedade de tamanhos, materiais, concentrações de ferro e aplicações, primeiro para entender como os campos magnéticos afetam o movimento do MP dentro dos capilares de vidro e, depois, nas vias aéreas vivas. na superfície. Os MPs variam em tamanho de 0,25 a 18 μm e são feitos de uma variedade de materiais (consulte a Tabela 1), mas a composição de cada amostra, incluindo o tamanho das partículas magnéticas dentro do MP, é desconhecida. Com base em nossos extensos estudos de MCT 19, 20, 21, 23, 24, esperamos que MPs tão pequenos quanto 5 μm possam ser vistos na superfície da via aérea traqueal, por exemplo, subtraindo quadros consecutivos para ver uma visibilidade aprimorada do movimento do MP. Um único MP de tamanho 0,25 μm é menor do que a resolução do dispositivo de imagem, mas espera-se que o PB-PCXI detecte seu contraste de volume e o movimento do fluido de superfície no qual eles são depositados após a deposição.
Amostras para cada MP na Tabela 1 foram preparadas em capilares de vidro de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EUA) com um diâmetro interno de 0,63 mm. Partículas corpusculares estão disponíveis em água, enquanto partículas CombiMag estão disponíveis no fluido proprietário do fabricante. Cada tubo é preenchido pela metade com líquido (aproximadamente 11 μl) e colocado no suporte de amostra (veja a Figura 1). Os capilares de vidro foram colocados horizontalmente no estágio de amostra na caixa de imagem, respectivamente, e posicionados nas bordas do fluido. Um ímã de boro de neodímio de terras raras de níquel de 19 mm de diâmetro (28 mm de comprimento) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Austrália) com uma magnetização residual de 1,17 Tesla foi conectado a um estágio de translação separado para obter Alterar sua posição remotamente durante a geração de imagens. A aquisição de imagens de raios X começa quando o ímã é posicionado aproximadamente 30 mm acima da amostra e as imagens são adquiridas a uma taxa de 4 quadros por segundo. Durante a geração de imagens, o ímã foi aproximado do tubo capilar de vidro (cerca de 1 mm de distância) e então transladado ao longo do tubo para avaliar os efeitos da intensidade do campo e da posição.
Configuração de imagem in vitro contendo amostras de MP em capilares de vidro no estágio de translação xy da amostra. O caminho do feixe de raios X é marcado com uma linha tracejada vermelha.
Uma vez estabelecida a visibilidade in vitro dos MPs, um subconjunto deles foi testado in vivo em ratos Wistar albinos fêmeas selvagens (~12 semanas de idade, ~200 g).0,24 mg/kg medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Japão), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japão) e 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Os ratos foram anestesiados com uma mistura de Pharma), Japão) por injeção intraperitoneal. Após a anestesia, eles foram preparados para a imagem removendo os pelos ao redor da traqueia, inserindo um tubo endotraqueal (ET; cânula intravenosa de 16 Ga, Terumo BCT) e imobilizando-os em decúbito dorsal em uma placa de imagem feita sob medida contendo uma bolsa térmica para manter a temperatura corporal 22 . A placa de imagem foi então fixada ao estágio de translação da amostra na caixa de imagem em um leve ângulo para alinhar a traqueia horizontalmente no Imagem de raio X, conforme mostrado na Figura 2a.
(a) Configuração de imagem in vivo na caixa de imagem SPring-8, o caminho do feixe de raios X é marcado com uma linha tracejada vermelha. (b, c) A localização do ímã na traqueia foi realizada remotamente usando duas câmeras IP montadas ortogonalmente. No lado esquerdo da imagem da tela, o laço de fio segurando a cabeça pode ser visto e a cânula de entrega no lugar dentro do tubo ET.
Um sistema de bomba de seringa controlado remotamente (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) usando uma seringa de vidro de 100 μl foi conectado ao tubo PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) por meio de uma agulha de 30 Ga. Marque o tubo para garantir que a ponta esteja na posição correta na traqueia ao inserir o tubo ET. Usando a microbomba, o êmbolo da seringa foi retirado enquanto a ponta do tubo estava imersa na amostra de MP a ser entregue. O tubo de entrega carregado foi então inserido no tubo endotraqueal, colocando a ponta dentro da parte mais forte do nosso campo magnético aplicado esperado. A aquisição de imagens foi controlada usando um detector de respiração conectado à nossa caixa de temporização baseada em Arduino, e todos os sinais (por exemplo, temperatura, respiração, abertura/fechamento do obturador e aquisição de imagem) foram registrados usando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Austrália) 22. Ao gerar imagens Quando o gabinete estava inacessível, duas câmeras IP (Panasonic BB-SC382) foram posicionados a aproximadamente 90° um do outro e foram usados ​​para monitorar a posição do ímã em relação à traqueia durante a obtenção de imagens (Fig. 2b,c). Para minimizar artefatos de movimento, uma imagem foi adquirida por respiração durante o platô do fluxo expiratório.
Um ímã é conectado a um segundo estágio que pode ser localizado remotamente de fora do alojamento de imagens. Várias posições e configurações de ímã foram testadas, incluindo: montado em um ângulo de aproximadamente 30° acima da traqueia (configurações mostradas nas Figuras 2a e 3a); um ímã acima do animal e o outro abaixo, com os polos ajustados para atrair (Figura 3b); um ímã acima do animal e o outro abaixo, com os polos ajustados para repelir (Figura 3c); e um ímã acima e perpendicular à traqueia (Figura 3d). Assim que o animal e o ímã estiverem configurados e o MP a ser testado estiver carregado na bomba de seringa, administre uma dose de 50 μl a uma taxa de 4 μl/seg enquanto adquire imagens. O ímã é então movido para frente e para trás ao longo ou lateralmente através da traqueia enquanto continua a adquirir imagens.
Configuração do ímã para imagens in vivo (a) um único ímã acima da traqueia em um ângulo de aproximadamente 30°, (b) dois ímãs ajustados para atrair, (c) dois ímãs ajustados para repelir, (d) um único ímã acima e perpendicular na traqueia. O observador olhou da boca para os pulmões através da traqueia, e o feixe de raios X passou pelo lado esquerdo do rato e saiu pelo lado direito. O ímã é movido ao longo do comprimento das vias aéreas ou para a esquerda e direita acima da traqueia na direção do feixe de raios X.
Também buscamos determinar a visibilidade e o comportamento de partículas nas vias aéreas na ausência de confusão entre respiração e movimento cardíaco. Portanto, no final do período de geração de imagens, os animais foram sacrificados humanamente por overdose de pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, EUA; ~65 mg/kg ip). Alguns animais foram deixados na plataforma de geração de imagens e, assim que a respiração e os batimentos cardíacos pararam, o processo de geração de imagens foi repetido, adicionando uma dose adicional de MP se nenhum MP estivesse visível na superfície das vias aéreas.
As imagens adquiridas foram corrigidas em campo plano e campo escuro e então montadas em um filme (20 quadros por segundo; velocidade normal de 15-25 ×, dependendo da frequência respiratória) usando um script personalizado escrito em MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Todos os estudos de entrega de vetores de genes LV foram conduzidos no Laboratory Animal Research Facility da Universidade de Adelaide e tiveram como objetivo usar os resultados do experimento SPring-8 para avaliar se a entrega de LV-MP na presença de um campo magnético poderia melhorar a transferência de genes in vivo. Para avaliar os efeitos do MP e do campo magnético, dois grupos de animais foram tratados: um grupo recebeu LV-MP com um ímã colocado, e o outro grupo recebeu um grupo de controle com LV-MP sem ímã.
Os vetores do gene LV foram gerados usando métodos descritos anteriormente 25, 26. O vetor LacZ expressa o gene da beta-galactosidase localizado no núcleo, acionado pelo promotor constitutivo do MPSV (LV-LacZ), que produz um produto de reação azul em células transduzidas, visível em frentes de tecido pulmonar e seções de tecido. A titulação foi realizada em culturas de células pela contagem manual do número de células positivas para LacZ com um hemocitômetro para calcular o título em TU/ml. Os transportadores são criopreservados a -80 °C, descongelados antes do uso e ligados ao CombiMag pela mistura em uma proporção de 1:1 e incubação no gelo por pelo menos 30 minutos antes da entrega.
Ratos Sprague Dawley normais (n = 3/grupo, ~2-3 foram anestesiados intraperitonealmente com uma mistura de 0,4 mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Austrália) e 60 mg/kg de cetamina (Ilium, Austrália) com um mês de idade) por injeção ip e canulação oral não cirúrgica com uma cânula intravenosa de 16 Ga. Para garantir que o tecido da via aérea traqueal recebesse a transdução do VE, ele foi condicionado usando nosso protocolo de perturbação mecânica descrito anteriormente, no qual a superfície da via aérea traqueal foi friccionada axialmente com uma cesta de arame (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, EUA) 30 s28. A administração traqueal de LV-MP foi então realizada em uma cabine de segurança biológica aproximadamente 10 minutos após a perturbação.
O campo magnético usado neste experimento foi configurado de maneira semelhante ao estudo de imagem de raio-X in vivo, com os mesmos ímãs mantidos acima da traqueia usando clipes de stent de destilação (Figura 4). Um volume de 50 μl (2 alíquotas de 25 μl) de LV-MP foi administrado na traqueia (n = 3 animais) usando uma pipeta contendo uma ponta de gel, conforme descrito anteriormente. Um grupo controle (n = 3 animais) recebeu as mesmas LV-MPs sem o uso de um ímã. Após a infusão ser concluída, a cânula é removida do tubo ET e o animal é extubado. O ímã permanece no local por 10 minutos e, em seguida, é removido. Os ratos receberam uma dose subcutânea de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Austrália), seguida pela reversão da anestesia por injeção ip de 1 mg/kg de cloridrato de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Austrália). Os ratos foram mantidos aquecidos e monitorados até a recuperação completa da anestesia.
Dispositivo de administração LV-MP em uma cabine de segurança biológica. O cubo Luer cinza claro do tubo ET pode ser visto saindo da boca e a ponta de gel da pipeta mostrada na imagem é inserida através do tubo ET até a profundidade desejada na traqueia.
Uma semana após o procedimento de dosagem de LV-MP, os animais foram sacrificados humanamente por inalação de 100% de CO2 e a expressão de LacZ foi avaliada usando nosso tratamento padrão X-gal. Os três anéis cartilaginosos mais caudais foram removidos para garantir que qualquer dano mecânico ou retenção de fluido da colocação do tubo endotraqueal não fosse incluído na análise. Cada traqueia foi cortada longitudinalmente para criar duas metades para análise, e elas foram montadas em uma placa contendo borracha de silicone (Sylgard, Dow Inc) usando uma agulha Minutien (Fine Science Tools) para visualizar a superfície luminal. A distribuição e o padrão das células transduzidas foram confirmados por fotografia frontal usando um microscópio Nikon (SMZ1500) com uma câmera DigiLite e software TCapture (Tucsen Photonics, China). As imagens foram adquiridas com ampliação de 20x (incluindo a configuração mais alta para toda a largura da traqueia), com todo o comprimento da traqueia imageado passo a passo, garantindo sobreposição suficiente entre cada imagem para permitir a imagem “costura”. Imagens de cada traqueia foram então montadas em uma única imagem composta usando o Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) utilizando um algoritmo de movimento planar. Áreas de expressão LacZ em imagens compostas da traqueia de cada animal foram quantificadas usando um script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como descrito anteriormente, usando configurações de 0,35 < Matiz < 0,58, Saturação > 0,15 e Valor < 0,7. Ao traçar os contornos do tecido, uma máscara foi gerada manualmente no GIMP v2.10.24 para cada imagem composta a fim de identificar a área do tecido e evitar quaisquer detecções falsas de fora do tecido traqueal. As áreas coradas de todas as imagens compostas de cada animal foram somadas para gerar a área total corada para aquele animal. A área corada foi então dividida pela área total da máscara para gerar a área normalizada.
Cada traqueia foi incluída em parafina e secções de 5 μm foram cortadas. As secções foram contra-coradas com vermelho neutro rápido durante 5 minutos e as imagens foram adquiridas usando um microscópio Nikon Eclipse E400, uma câmara DS-Fi3 e um software de captura de elementos NIS (versão 5.20.00).
Todas as análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). A significância estatística foi estabelecida em p ≤ 0,05. A normalidade foi verificada usando o teste de Shapiro-Wilk, e as diferenças na coloração de LacZ foram avaliadas usando o teste t não pareado.
Os seis MPs descritos na Tabela 1 foram examinados usando PCXI, e a visibilidade é descrita na Tabela 2. Dois MPs de poliestireno (MP1 e MP2; 18 μm e 0,25 μm, respectivamente) não foram visíveis sob PCXI, mas o restante das amostras foi identificável (exemplos são mostrados na Figura 5). MP3 e MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm e 0,9 μm, respectivamente) são fracamente visíveis. Embora contenha algumas das menores partículas testadas, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) foi o mais pronunciado. O produto CombiMag MP6 é difícil de detectar. Em todos os casos, nossa capacidade de detectar MP foi significativamente aprimorada pela translação do ímã para frente e para trás paralelamente ao capilar. Quando os ímãs se afastaram do capilar, as partículas se estenderam em longas sequências, mas à medida que os ímãs se aproximaram e a intensidade do campo magnético aumentou, o As cordas de partículas encurtaram conforme as partículas migraram em direção à superfície superior do capilar (veja o Vídeo Suplementar S1: MP4), aumentando a densidade de partículas da superfície. Por outro lado, quando o ímã é removido do capilar, a intensidade do campo diminui e os MPs se reorganizam em longas cordas que se estendem da superfície superior do capilar (veja o Vídeo Suplementar S2: MP4). Depois que o ímã para de se mover, as partículas continuam a se mover por um curto período após atingir a posição de equilíbrio. À medida que o MP se move em direção e para longe da superfície superior do capilar, as partículas magnéticas normalmente arrastam os detritos pelo fluido.
A visibilidade do MP sob PCXI varia significativamente entre as amostras. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. Todas as imagens mostradas aqui foram tiradas com um ímã localizado aproximadamente 10 mm diretamente acima do capilar. Os círculos grandes aparentes são bolhas de ar presas nos capilares, mostrando claramente as características das bordas pretas e brancas da imagem de contraste de fase. A caixa vermelha contém a ampliação de realce do contraste. Observe que os diâmetros dos esquemas do ímã em todas as figuras não estão em escala e são aproximadamente 100 vezes maiores do que os mostrados.
À medida que o ímã é transladado para a esquerda e para a direita ao longo da parte superior do capilar, o ângulo da corda de MP muda para se alinhar com o ímã (ver Figura 6), delineando assim as linhas do campo magnético. Para MP3-5, após a corda atingir um ângulo limite, as partículas são arrastadas ao longo da superfície superior do capilar. Isso frequentemente resulta no agrupamento de MPs em grupos maiores perto de onde o campo magnético é mais forte (ver Vídeo Suplementar S3:MP5). Isso também é particularmente evidente ao obter imagens perto da extremidade capilar, o que faz com que os MPs se agreguem e se concentrem na interface fluido-ar. As partículas no MP6, que eram mais difíceis de discernir do que no MP3-5, não foram arrastadas conforme o ímã se movia ao longo do capilar, mas as cordas de MP se dissociaram, deixando as partículas no campo de visão (ver Vídeo Suplementar S4:MP6). Em alguns casos, quando o campo magnético aplicado foi reduzido movendo o ímã a uma grande distância do local da imagem, quaisquer MPs restantes desceram lentamente para a superfície inferior do tubo por gravidade enquanto permaneciam na corda (ver Vídeo Suplementar S5: MP3).
O ângulo da corda MP muda conforme o ímã é transladado para a direita acima do capilar. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. A caixa vermelha contém a ampliação de contraste. Observe que os vídeos suplementares são informativos, pois revelam informações importantes sobre a estrutura das partículas e informações dinâmicas que não podem ser visualizadas nessas imagens estáticas.
Nossos testes mostraram que mover o ímã lentamente para frente e para trás ao longo da traqueia facilita a visualização do MP no contexto de movimento complexo in vivo. Os testes in vivo não foram realizados, pois as esferas de poliestireno (MP1 e MP2) não eram visíveis no capilar. Cada um dos quatro MPs restantes foi testado in vivo com o eixo longo do ímã configurado acima da traqueia em um ângulo de cerca de 30° em relação à vertical (consulte as Figuras 2b e 3a), pois isso resultou em cadeias de MP mais longas e foi mais eficaz do que a configuração do ímã terminada. MP3, MP4 e MP6 não foram detectados na traqueia de nenhum animal vivo. Quando as vias aéreas dos ratos foram fotografadas após os animais serem sacrificados humanamente, as partículas permaneceram invisíveis mesmo quando um volume adicional foi adicionado usando uma bomba de seringa. O MP5 tinha o maior teor de óxido de ferro e era a única partícula visível e, portanto, foi usado para avaliar e caracterizar o comportamento in vivo do MP.
Colocar o ímã sobre a traqueia durante a administração de MP resultou em muitos, mas não todos, MPs sendo concentrados no campo de visão. Partículas que entram na traqueia são melhor observadas em animais sacrificados humanamente. Figura 7 e Vídeo Suplementar S6: MP5 mostram captura magnética rápida e alinhamento de partículas na superfície da traqueia ventral, indicando que MPs podem ser direcionados para regiões desejadas da traqueia. Ao procurar mais distalmente ao longo da traqueia após a administração de MP, alguns MPs foram encontrados mais próximos da carina, sugerindo que a intensidade do campo magnético foi insuficiente para coletar e reter todos os MPs, pois eles foram administrados através da região de intensidade máxima do campo magnético durante o processo de fluido. No entanto, as concentrações de MP pós-parto foram maiores ao redor da área da imagem, sugerindo que muitos MPs permaneceram nas regiões das vias aéreas onde a intensidade do campo magnético aplicado foi maior.
Imagens de (a) antes e (b) depois da administração de MP5 na traqueia de um rato recentemente sacrificado com o ímã posicionado diretamente acima da área de imagem. A área da imagem está localizada entre os dois anéis de cartilagem. Antes da administração de MP, há algum fluido nas vias aéreas. A caixa vermelha contém a ampliação de contraste. Essas imagens são do vídeo mostrado no Vídeo Suplementar S6:MP5.
A translação do ímã ao longo da traqueia in vivo fez com que a cadeia de MP mudasse o ângulo dentro da superfície das vias aéreas de maneira semelhante à observada nos capilares (veja a Figura 8 e o Vídeo Suplementar S7:MP5). No entanto, em nosso estudo, os MPs não puderam ser arrastados ao longo da superfície das vias aéreas vivas como poderiam com os capilares. Em alguns casos, a cadeia de MP ficará mais longa conforme o ímã se move para a esquerda e para a direita. Curiosamente, também descobrimos que a cadeia de partículas parece mudar a profundidade da camada de fluido da superfície quando o ímã é movido longitudinalmente ao longo da traqueia e se expande quando o ímã é movido diretamente acima da cabeça e a cadeia de partículas é girada para uma posição vertical (veja o Vídeo Suplementar S7). : MP5 em 0:09, canto inferior direito). O padrão característico de movimento mudou quando o ímã foi transladado lateralmente pela parte superior da traqueia (ou seja, para a esquerda ou direita do animal, em vez de ao longo do comprimento da traqueia). As partículas ainda estavam claramente visíveis enquanto se moviam, mas quando o ímã foi removido da traqueia, as pontas das cordas de partículas se tornaram visíveis (veja o Vídeo Suplementar S8:MP5, começando em 0:08). Isso é consistente com o comportamento do MP que observamos sob um campo magnético aplicado em um capilar de vidro.
Imagens de exemplo mostrando MP5 na traqueia de um rato anestesiado vivo. (a) O ímã é usado para adquirir imagens acima e à esquerda da traqueia, depois (b) o ímã é movido para a direita. A caixa vermelha contém a ampliação de contraste. Essas imagens são do vídeo mostrado no Vídeo Suplementar S7:MP5.
Quando os dois polos foram configurados em uma orientação norte-sul acima e abaixo da traqueia (ou seja, atraindo; Fig. 3b), as cordas MP pareceram mais longas e estavam localizadas na parede lateral da traqueia em vez de na superfície dorsal da traqueia (veja o Vídeo Suplementar S9:MP5). No entanto, altas concentrações de partículas em um único local (ou seja, a superfície dorsal da traqueia) não foram detectadas após a administração de fluido quando um dispositivo de ímã duplo foi usado, o que normalmente ocorre quando um dispositivo de ímã único é usado. Então, quando um ímã foi configurado para repelir os polos invertidos (Fig. 3c), o número de partículas visíveis no campo de visão não pareceu aumentar após a administração. A configuração de ambas as configurações de ímã duplo é desafiadora devido às altas intensidades do campo magnético que puxam ou empurram os ímãs, respectivamente. A configuração foi então alterada para um único ímã paralelo à via aérea, mas passando pela via aérea a 90 graus para que as linhas de campo cruzassem a parede traqueal ortogonalmente (Fig. 3d), uma orientação projetada para determinar se a agregação de partículas na parede lateral poderia ser observada. No entanto, nessa configuração, não houve movimento identificável de acumulação de MP ou movimento do ímã. Com base em todos esses resultados, uma configuração de orientação de 30 graus com ímã único (Figura 3a) foi escolhida para estudos de portadores de genes in vivo.
Quando o animal foi repetidamente fotografado imediatamente após o abate humanitário, a ausência de movimento tecidual que pudesse causar confusão permitiu que linhas de partículas mais finas e curtas fossem discernidas no campo intercondral claro, "instáveis" em linha com o movimento translacional do ímã. No entanto, ainda não é possível ver claramente a presença e o movimento das partículas de MP6.
O título LV-LacZ foi de 1,8 × 108 TU/ml e, após a mistura 1:1 com CombiMag MP (MP6), os animais receberam uma dose traqueal de 50 μl de 9 × 107 TU/ml de veículo LV (ou seja, 4,5 × 106 TU/rato). Nesses estudos, em vez de transladar o ímã durante o trabalho de parto, fixamos o ímã em uma posição para determinar se a transdução LV (a) poderia ser melhorada em comparação à administração vetorial na ausência de um campo magnético e (b) poderia ser focada As células das vias aéreas são transduzidas para regiões-alvo magnéticas das vias aéreas superiores.
A presença de ímãs e o uso de CombiMag combinado com vetores LV não pareceram ter efeitos adversos na saúde animal, assim como nosso protocolo padrão de administração de vetores LV. Imagens frontais da região traqueal submetida à perturbação mecânica (Fig. Suplementar 1) indicaram que houve níveis significativamente maiores de transdução no grupo de animais tratados com LV-MP quando o ímã estava presente (Fig. 9a). Apenas uma pequena quantidade de coloração azul LacZ estava presente no grupo controle (Fig. 9b). A quantificação de áreas coradas com X-Gal normalizadas mostrou que a administração de LV-MP na presença de um campo magnético produziu uma melhora de aproximadamente 6 vezes (Fig. 9c).
Exemplo de imagens compostas mostrando transdução traqueal por LV-MP (a) na presença de um campo magnético e (b) na ausência de um ímã. (c) Melhora estatisticamente significativa na área de transdução LacZ normalizada dentro da traqueia ao usar o ímã (*p = 0,029, teste t, n = 3 por grupo, média ± SEM).
Seções coradas com vermelho rápido neutro (exemplo mostrado na Fig. Suplementar 2) mostraram células coradas com LacZ presentes em um padrão e localização semelhantes aos relatados anteriormente.
Um desafio fundamental para a terapia genética das vias aéreas continua sendo a localização precisa de partículas transportadoras em regiões de interesse e a obtenção de altos níveis de eficiência de transdução no pulmão em movimento na presença de fluxo de ar e eliminação ativa de muco. Para transportadores de VE projetados para tratar a doença das vias aéreas da FC, aumentar o tempo de residência das partículas transportadoras dentro das vias aéreas condutoras tem sido uma meta até então ilusória. Conforme apontado por Castellani et al., o uso de campos magnéticos para melhorar a transdução tem vantagens em comparação a outros métodos de entrega de genes, como a eletroporação, pois pode combinar simplicidade, custo-benefício, localização da entrega, maior eficiência e tempos de incubação mais curtos e, possivelmente, uma dose menor de transportador10. No entanto, a deposição e o comportamento in vivo de partículas magnéticas nas vias aéreas sob a influência de forças magnéticas externas nunca foram descritos, nem a viabilidade desse método foi demonstrada in vivo para aumentar os níveis de expressão gênica em vias aéreas vivas intactas.
Nossos experimentos in vitro com síncrotron PCXI mostraram que todas as partículas que testamos, com exceção do poliestireno MP, eram visíveis na configuração de imagem que usamos. Na presença de um campo magnético, os MPs formam cordas cujos comprimentos estão relacionados ao tipo de partícula e à intensidade do campo magnético (ou seja, proximidade e movimento do ímã). Conforme mostrado na Figura 10, as cordas que observamos são formadas devido a cada partícula individual ser magnetizada e induzir seu próprio campo magnético local. Esses campos separados fazem com que outras partículas semelhantes se agreguem e se conectem, com movimentos semelhantes aos de cordas de grupo devido às forças locais de atração e repulsão de outras partículas.
Esquema mostrando (a,b) trens de partículas gerados dentro de capilares cheios de fluido e (c,d) traqueia cheia de ar. Observe que os capilares e a traqueia não estão desenhados em escala. O painel (a) também contém uma descrição do MP, que contém partículas de Fe3O4 organizadas em cordas.
Quando o ímã foi movido acima do capilar, o ângulo da sequência de partículas atingiu um limite crítico para MP3-5 contendo Fe3O4, após o qual a sequência de partículas não permaneceu mais na posição original, mas se moveu ao longo da superfície para uma nova posição. Ímã. É provável que esse efeito ocorra porque a superfície do capilar de vidro é lisa o suficiente para permitir que esse movimento ocorra. Curiosamente, o MP6 (CombiMag) não se comportou dessa maneira, possivelmente porque as partículas eram menores, tinham revestimentos ou cargas superficiais diferentes, ou um fluido transportador proprietário afetou sua capacidade de se mover. O contraste da imagem das partículas CombiMag também é mais fraco, sugerindo que o fluido e as partículas podem ter densidades semelhantes e, portanto, não se movem facilmente um em direção ao outro. As partículas também podem ficar presas se o ímã se mover muito rápido, indicando que a intensidade do campo magnético nem sempre pode superar o atrito entre as partículas no fluido, sugerindo que talvez não seja surpreendente que a intensidade do campo magnético e a distância entre o ímã e a área alvo sejam muito importantes. Tomados em conjunto, esses resultados também sugerem que, embora os ímãs possam capturar muitos MPs que fluem através da área alvo, é improvável que pode-se confiar nos ímãs para mover partículas CombiMag ao longo da superfície da traqueia. Portanto, concluímos que os estudos de LV-MP in vivo devem utilizar campos magnéticos estáticos para atingir fisicamente regiões específicas da árvore das vias aéreas.
Quando as partículas são entregues no corpo, elas são difíceis de identificar no contexto de tecido corporal complexo em movimento, mas a capacidade de detectá-las foi melhorada pela translação do ímã horizontalmente acima da traqueia para "mexer" as cordas de MP. Embora a imagem ao vivo seja possível, é mais fácil discernir o movimento das partículas depois que o animal foi sacrificado humanamente. As concentrações de MP foram geralmente mais altas neste local quando o ímã foi posicionado acima da área de imagem, embora algumas partículas fossem geralmente encontradas mais ao longo da traqueia. Em contraste com estudos in vitro, as partículas não podem ser arrastadas ao longo da traqueia pela translação do ímã. Esta descoberta é consistente com a forma como o muco que reveste a superfície da traqueia normalmente processa partículas inaladas, prendendo-as no muco e posteriormente eliminadas pelo mecanismo de depuração mucociliar.
Nossa hipótese é que o uso de ímãs para atração acima e abaixo da traqueia (Fig. 3b) pode resultar em um campo magnético mais uniforme, em vez de um campo magnético altamente concentrado em um ponto, potencialmente levando a uma distribuição mais uniforme de partículas. No entanto, nosso estudo preliminar não encontrou evidências claras para apoiar essa hipótese. Da mesma forma, a configuração de um par de ímãs para repelir (Fig. 3c) não resultou em maior deposição de partículas na área da imagem. Essas duas descobertas demonstram que a configuração de ímã duplo não melhora significativamente o controle local do direcionamento de MP e que as fortes forças magnéticas resultantes são difíceis de configurar, tornando essa abordagem menos prática. Da mesma forma, orientar o ímã acima e através da traqueia (Fig. 3d) também não aumentou o número de partículas retidas na área da imagem. Algumas dessas configurações alternativas podem não ser bem-sucedidas porque resultam em intensidades de campo magnético mais baixas dentro da área de deposição. Portanto, a configuração de ímã com ângulo único de 30 graus (Figura 3a) é considerada o método mais fácil e eficiente para in vivo testes.
O estudo LV-MP mostrou que quando os vetores LV foram combinados com CombiMag e administrados após perturbação física na presença de um campo magnético, os níveis de transdução foram significativamente aumentados na traqueia em comparação aos controles. Com base nos estudos de imagem síncrotron e nos resultados do LacZ, o campo magnético foi aparentemente capaz de preservar o LV dentro da traqueia e reduzir o número de partículas do vetor que penetraram imediatamente profundamente no pulmão. Essas melhorias no direcionamento podem levar a uma maior eficácia, ao mesmo tempo que reduzem os títulos administrados, a transdução fora do alvo, os efeitos colaterais inflamatórios e imunológicos e os custos do transportador de genes. Importante, de acordo com o fabricante, o CombiMag pode ser usado em conjunto com outros métodos de transferência de genes, incluindo outros vetores virais (como AAV) e ácidos nucleicos.