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Os vetores gênicos para o tratamento da fibrose cística pulmonar devem ter como alvo as vias aéreas condutoras, pois a transdução pulmonar periférica não proporciona benefício terapêutico. A eficiência da transdução viral está diretamente relacionada ao tempo de permanência do vetor. No entanto, fluidos de administração, como os vetores gênicos, difundem-se naturalmente nos alvéolos durante a inspiração, e partículas terapêuticas de qualquer forma são rapidamente eliminadas pelo transporte mucociliar. Prolongar o tempo de permanência dos vetores gênicos nas vias aéreas é importante, mas difícil de alcançar. Partículas magnéticas conjugadas a vetores gênicos, que podem ser direcionadas à superfície das vias aéreas, podem melhorar o direcionamento regional. Devido aos desafios da visualização in vivo, o comportamento de partículas magnéticas tão pequenas na superfície das vias aéreas, na presença de um campo magnético aplicado, é pouco compreendido. O objetivo deste estudo foi utilizar imagens de sincrotron para visualizar o movimento in vivo de uma série de partículas magnéticas na traqueia de ratos anestesiados, a fim de examinar a dinâmica e os padrões de comportamento de partículas individuais e em massa in vivo. Avaliamos também se a administração de partículas magnéticas lentivirais na presença de um campo magnético aumentaria a eficiência da transdução em ratos. A imagem por raios X de sincrotron revela o comportamento de partículas magnéticas em campos magnéticos estacionários e em movimento in vitro e in vivo. As partículas não podem ser facilmente arrastadas ao longo da superfície das vias aéreas vivas com ímãs, mas durante o transporte, os depósitos se concentram no campo de visão onde o campo magnético é mais forte. A eficiência de transdução também aumentou seis vezes quando partículas magnéticas lentivirais foram administradas na presença de um campo magnético. Em conjunto, esses resultados sugerem que partículas magnéticas lentivirais e campos magnéticos podem ser abordagens valiosas para melhorar o direcionamento de vetores gênicos e aumentar os níveis de transdução em vias aéreas condutoras in vivo.
A fibrose cística (FC) é causada pela variação em um único gene chamado regulador da condutância transmembrana da FC (CFTR). A proteína CFTR é um canal iônico presente em muitas células epiteliais por todo o corpo, incluindo as vias aéreas condutoras, um dos principais locais de patogênese da FC. Defeitos no CFTR levam ao transporte anormal de água, desidratando a superfície das vias aéreas e reduzindo a profundidade da camada de líquido da superfície das vias aéreas (ASL). Isso também prejudica a capacidade do sistema de transporte mucociliar (MCT) de remover partículas e patógenos inalados das vias aéreas. Nosso objetivo é desenvolver uma terapia gênica lentiviral (LV) para fornecer a cópia correta do gene CFTR e melhorar a ASL, o MCT e a saúde pulmonar, além de continuar desenvolvendo novas tecnologias capazes de medir esses parâmetros in vivo¹.
Os vetores lentivirais (LV) são um dos principais candidatos para a terapia gênica das vias aéreas na fibrose cística (FC), principalmente porque podem integrar permanentemente o gene terapêutico nas células basais das vias aéreas (células-tronco das vias aéreas). Isso é importante porque podem restaurar a hidratação normal e a eliminação do muco, diferenciando-se em células funcionais da superfície das vias aéreas associadas à FC e geneticamente corrigidas, resultando em benefícios para toda a vida. Os vetores LV devem ser direcionados para as vias aéreas condutoras, pois é aí que a doença pulmonar da FC começa. A administração do vetor mais profundamente no pulmão pode resultar em transdução alveolar, mas isso não tem benefício terapêutico na FC. No entanto, fluidos como os vetores gênicos migram naturalmente para os alvéolos durante a inspiração após a administração^3,4 e as partículas terapêuticas são rapidamente eliminadas na cavidade oral pelo transporte mucocutâneo (TMC). A eficiência da transdução por LV está diretamente relacionada ao tempo que o vetor permanece próximo às células-alvo para permitir a captação celular – o “tempo de residência”⁵ – que é facilmente reduzido pelo fluxo de ar regional típico, bem como pela captura coordenada de partículas pelo muco e pelo TMC. Para a FC, a capacidade de prolongar o tempo de residência do LV nas vias aéreas é importante para atingir altos níveis de eficácia. de transdução nesta região, mas até agora tem sido um desafio.
Para superar esse obstáculo, sugerimos que as partículas magnéticas (PMs) podem ajudar de duas maneiras complementares. Primeiro, elas podem ser guiadas magneticamente até a superfície das vias aéreas para melhorar o direcionamento e ajudar as partículas transportadoras de genes a se posicionarem na região desejada das vias aéreas; e no fluido da superfície das vias aéreas (ASL), para se moverem até a camada celular 6. As PMs têm sido amplamente utilizadas como veículos de administração de fármacos direcionados, quando se ligam a anticorpos, fármacos quimioterápicos ou outras pequenas moléculas que se fixam às membranas celulares ou se ligam a receptores relevantes na superfície celular e se acumulam em locais tumorais na presença de eletricidade estática. Campos Magnéticos para Tratamento do Câncer 7. Outras técnicas “hipertermais” visam aquecer micropartículas (MPs) quando expostas a campos magnéticos oscilantes, destruindo assim as células tumorais. O princípio da transfecção magnética, em que um campo magnético é usado como agente de transfecção para aumentar a transferência de DNA para as células, é comumente utilizado in vitro com uma variedade de vetores gênicos virais e não virais para linhagens celulares de difícil transdução. A eficácia da magnetotransfecção com lentivírus (LV) foi estabelecida, com a administração in vitro de MPs contendo LV a uma linhagem de células epiteliais brônquicas humanas na presença de um campo magnético estático, aumentando a eficiência da transdução em 186 vezes em comparação com o vetor LV isolado. O LV-MP também foi aplicado a um modelo in vitro de fibrose cística (FC), onde a transfecção magnética aumentou a transdução de LV em culturas de interface ar-líquido em 20 vezes na presença de escarro de FC10. No entanto, a magnetotransfecção in vivo de órgãos recebeu relativamente pouca atenção e foi avaliada apenas em alguns animais. estudos11,12,13,14,15, especialmente nos pulmões16,17. No entanto, as oportunidades para transfecção magnética na terapia pulmonar da FC são claras. Tan et al. (2020) afirmaram que “um estudo de prova de conceito de administração pulmonar eficiente de nanopartículas magnéticas abrirá caminho para futuras estratégias de inalação de CFTR para melhorar os resultados clínicos em pacientes com FC”6.
O comportamento de pequenas partículas magnéticas nas superfícies das vias aéreas na presença de um campo magnético aplicado é difícil de visualizar e estudar, sendo, portanto, pouco compreendido. Em outros estudos, desenvolvemos um método de imagem de raios X por contraste de fase baseado em propagação de síncrotron (PB-PCXI) para visualizar e quantificar, de forma não invasiva, pequenas alterações in vivo na profundidade da camada de fluido da superfície das vias aéreas (ASL)¹⁸ e no comportamento das micropartículas magnéticas (MCT)¹⁹,²⁰, para medir diretamente a hidratação da superfície do canal de gás e utilizá-la como um indicador precoce da eficácia do tratamento. Além disso, nosso método de avaliação de MCT utiliza partículas de 10 a 35 µm de diâmetro, compostas de alumina ou vidro de alto índice de refração, como marcadores de MCT visíveis por meio de PB-PCXI²¹. Ambas as técnicas são adequadas para a visualização de diversos tipos de partículas, incluindo micropartículas.
Devido à sua alta resolução espacial e temporal, nossas técnicas de análise ASL e MCT baseadas em PB-PCXI são adequadas para examinar a dinâmica e os padrões de comportamento de partículas individuais e em massa in vivo para nos ajudar a entender e otimizar as técnicas de administração de genes por micropartículas. A abordagem que empregamos aqui deriva de nossos estudos usando a linha de luz BL20B2 do SPring-8, na qual visualizamos o movimento do fluido após a administração de dose simulada do vetor nas vias aéreas nasais e pulmonares de camundongos para ajudar a explicar nossos padrões de expressão gênica não uniformes observados em nossos estudos com animais com dose de vetor gênico 3,4 .
O objetivo deste estudo foi utilizar o sincrotron PB-PCXI para visualizar os movimentos in vivo de uma série de micropartículas (MPs) na traqueia de ratos vivos. Esses estudos de imagem com PB-PCXI foram projetados para testar uma variedade de MPs, intensidades de campo magnético e localizações, a fim de determinar seu efeito no movimento das MPs. Nossa hipótese era de que um campo magnético aplicado externamente ajudaria a MP administrada a permanecer ou se mover para a área alvo. Esses estudos também nos permitiram identificar configurações de ímãs que maximizam o número de partículas retidas na traqueia após a deposição. Em uma segunda série de estudos, buscamos utilizar essa configuração ideal para demonstrar o padrão de transdução resultante da administração in vivo de MPs de baixa voltagem (LV-MPs) nas vias aéreas de ratos, partindo do pressuposto de que a administração de LV-MPs no contexto de direcionamento às vias aéreas resultaria em uma melhoria na eficiência de transdução de LV.
Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pela Universidade de Adelaide (M-2019-060 e M-2020-022) e pelo Comitê de Ética Animal do Síncrotron SPring-8. Os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes ARRIVE.
Todas as imagens de raios X foram obtidas na linha de luz BL20XU do síncrotron SPring-8, no Japão, utilizando uma configuração semelhante à descrita anteriormente21,22. Resumidamente, a caixa experimental estava localizada a 245 m do anel de armazenamento do síncrotron. Uma distância de 0,6 m entre a amostra e o detector foi utilizada para estudos de imagem de partículas e de 0,3 m para estudos de imagem in vivo, a fim de gerar efeitos de contraste de fase. Foi utilizada uma energia de feixe monocromático de 25 keV. As imagens foram capturadas utilizando um conversor de raios X de alta resolução (SPring-8 BM3) acoplado a um detector sCMOS. O conversor converte raios X em luz visível utilizando um cintilador de 10 µm de espessura (Gd3Al2Ga3O12), que é então direcionado para um sensor sCMOS utilizando uma objetiva de microscópio de ×10 (NA 0,3). O detector sCMOS utilizado foi o Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japão). A matriz possui um tamanho de 2048 × 2048 pixels e um tamanho de pixel bruto de 6,5 × 6,5 µm. Essa configuração resulta em um tamanho de pixel isotrópico efetivo de 0,51 µm e um campo de visão de aproximadamente 1,1 mm × 1,1 mm. Um tempo de exposição de 100 ms foi escolhido para maximizar a relação sinal-ruído das partículas magnéticas dentro e fora das vias aéreas, minimizando artefatos de movimento induzidos pela respiração. Para os estudos in vivo, um obturador de raios X rápido foi posicionado no trajeto do feixe de raios X para limitar a dose de radiação, bloqueando o feixe entre as exposições.
O suporte LV não foi utilizado em nenhum estudo de imagem SPring-8 PB-PCXI porque a câmara de imagem BL20XU não possui certificação de Nível de Biossegurança 2. Em vez disso, selecionamos uma gama de micropartículas (MPs) bem caracterizadas de dois fornecedores comerciais — abrangendo uma variedade de tamanhos, materiais, concentrações de ferro e aplicações — primeiro para entender como os campos magnéticos afetam o movimento das MPs dentro de capilares de vidro e, em seguida, em vias aéreas vivas. Na superfície, as micropartículas (MPs) variam em tamanho de 0,25 a 18 μm e são feitas de diversos materiais (ver Tabela 1), mas a composição de cada amostra, incluindo o tamanho das partículas magnéticas dentro da MP, é desconhecida. Com base em nossos extensos estudos de tomografia computadorizada multicavidade (MCT) 19, 20, 21, 23, 24, esperamos que MPs tão pequenas quanto 5 μm possam ser visualizadas na superfície da via aérea traqueal, por exemplo, subtraindo quadros consecutivos para obter uma melhor visibilidade do movimento da MP. Uma única MP de 0,25 μm é menor que a resolução do dispositivo de imagem, mas espera-se que a técnica PB-PCXI detecte seu contraste de volume e o movimento do fluido superficial sobre o qual elas são depositadas após a deposição.
As amostras para cada micropartícula (MP) na Tabela 1 foram preparadas em capilares de vidro de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EUA) com diâmetro interno de 0,63 mm. As partículas corpusculares estão disponíveis em água, enquanto as partículas CombiMag estão disponíveis no fluido proprietário do fabricante. Cada tubo foi preenchido até a metade com líquido (aproximadamente 11 μl) e colocado no suporte de amostras (ver Figura 1). Os capilares de vidro foram posicionados horizontalmente na plataforma de amostras dentro da caixa de imagem, respectivamente, e as bordas do fluido foram posicionadas. Um ímã de neodímio-ferro-boro (NdFeB) de terras raras com revestimento de níquel, de 19 mm de diâmetro (28 mm de comprimento) (N35, nº de catálogo LM1652, Jaycar Electronics, Austrália), com magnetização residual de 1,17 Tesla, foi acoplado a uma plataforma de translação separada para permitir o ajuste remoto de sua posição durante a aquisição de imagens. A aquisição de imagens de raios X inicia-se quando o ímã é posicionado a aproximadamente 30 mm acima da amostra, e as imagens são adquiridas a uma taxa de 4 quadros. por segundo. Durante a aquisição de imagens, o ímã foi aproximado do tubo capilar de vidro (a cerca de 1 mm de distância) e então transladado ao longo do tubo para avaliar os efeitos da intensidade do campo magnético e da posição.
Configuração de imagem in vitro contendo amostras de micropartículas em capilares de vidro sobre uma plataforma de translação xy da amostra. O trajeto do feixe de raios X está marcado com uma linha tracejada vermelha.
Uma vez estabelecida a visibilidade in vitro das MPs, um subconjunto delas foi testado in vivo em ratas Wistar albinas selvagens (~12 semanas de idade, ~200 g). 0,24 mg/kg de medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Japão), 3,2 mg/kg de midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japão) e 4 mg/kg de butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma, Japão) foram administrados. As ratas foram anestesiadas com uma mistura dos medicamentos por injeção intraperitoneal. Após a anestesia, foram preparadas para a obtenção de imagens com a remoção dos pelos ao redor da traqueia, a inserção de um tubo endotraqueal (ET; cânula intravenosa de 16 Ga, Terumo BCT) e a imobilização em decúbito dorsal sobre uma placa de imagem personalizada contendo uma bolsa térmica para manter a temperatura corporal. A placa de imagem foi então fixada à plataforma de translação da amostra na caixa de imagem em um leve ângulo para alinhar a traqueia horizontalmente no raio-X. imagem, conforme mostrado na Figura 2a.
(a) Configuração de imagem in vivo na caixa de imagem SPring-8; o trajeto do feixe de raios X está marcado com uma linha tracejada vermelha. (b, c) A localização do ímã na traqueia foi realizada remotamente usando duas câmeras IP montadas ortogonalmente. No lado esquerdo da imagem da tela, pode-se ver o laço de fio que segura a cabeça e a cânula de administração posicionada dentro do tubo endotraqueal.
Um sistema de bomba de seringa controlado remotamente (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) usando uma seringa de vidro de 100 μl foi conectado a um tubo PE10 (diâmetro externo de 0,61 mm, diâmetro interno de 0,28 mm) através de uma agulha de calibre 30. Marque o tubo para garantir que a ponta esteja na posição correta na traqueia ao inserir o tubo endotraqueal. Usando a microbomba, o êmbolo da seringa foi retirado enquanto a ponta do tubo era imersa na amostra de micropartículas a ser administrada. O tubo de administração carregado foi então inserido no tubo endotraqueal, posicionando a ponta na parte mais forte do campo magnético aplicado esperado. A aquisição de imagens foi controlada usando um detector de respiração conectado à nossa caixa de temporização baseada em Arduino, e todos os sinais (por exemplo, temperatura, respiração, abertura/fechamento do obturador e aquisição de imagens) foram registrados usando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Austrália) 22. Quando o recinto estava inacessível, duas câmeras IP (Panasonic BB-SC382) foram utilizadas para a aquisição de imagens. posicionadas a aproximadamente 90° uma da outra, foram utilizadas para monitorar a posição do ímã em relação à traqueia durante a aquisição de imagens (Fig. 2b,c). Para minimizar artefatos de movimento, uma imagem foi adquirida por respiração durante o platô do fluxo expiratório final.
Um ímã é acoplado a um segundo estágio que pode ser localizado remotamente, fora da estrutura de imagem. Diversas posições e configurações do ímã foram testadas, incluindo: montado em um ângulo de aproximadamente 30° acima da traqueia (configurações mostradas nas Figuras 2a e 3a); um ímã acima do animal e o outro abaixo, com os polos ajustados para se atraírem (Figura 3b); um ímã acima do animal e o outro abaixo, com os polos ajustados para se repelirem (Figura 3c); e um ímã acima e perpendicular à traqueia (Figura 3d). Após o animal e o ímã serem posicionados e a micropartícula (MP) a ser testada ser carregada na bomba de seringa, administra-se uma dose de 50 μl a uma taxa de 4 μl/s enquanto as imagens são adquiridas. O ímã é então movido para frente e para trás ao longo ou lateralmente através da traqueia, enquanto as imagens continuam sendo adquiridas.
Configuração do ímã para imagem in vivo: (a) um único ímã acima da traqueia em um ângulo de aproximadamente 30°, (b) dois ímãs configurados para se atraírem, (c) dois ímãs configurados para se repelirem, (d) um único ímã acima e perpendicular à traqueia. O observador olhava da boca para os pulmões através da traqueia, e o feixe de raios X passava pelo lado esquerdo do rato e saía pelo lado direito. O ímã é movido ao longo do comprimento da via aérea ou para a esquerda e para a direita acima da traqueia na direção do feixe de raios X.
Também buscamos determinar a visibilidade e o comportamento de partículas nas vias aéreas na ausência de interferências da respiração e dos movimentos cardíacos. Portanto, ao final do período de aquisição de imagens, os animais foram sacrificados humanitariamente por overdose de pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, EUA; ~65 mg/kg ip). Alguns animais permaneceram na plataforma de imagem e, após a cessação da respiração e dos batimentos cardíacos, o processo de aquisição de imagens foi repetido, adicionando-se uma dose adicional de micropartículas (MP) caso nenhuma MP fosse visível na superfície das vias aéreas.
As imagens adquiridas foram corrigidas para campo plano e campo escuro e, em seguida, montadas em um vídeo (20 quadros por segundo; 15-25 vezes a velocidade normal, dependendo da frequência respiratória) usando um script personalizado escrito em MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Todos os estudos de administração do vetor gênico LV foram conduzidos no Laboratório de Pesquisa Animal da Universidade de Adelaide e tiveram como objetivo utilizar os resultados do experimento SPring-8 para avaliar se a administração de LV-MP na presença de um campo magnético poderia aumentar a transferência gênica in vivo. Para avaliar os efeitos do campo magnético e do campo magnético, dois grupos de animais foram tratados: um grupo recebeu LV-MP com um ímã posicionado, e o outro grupo controle recebeu LV-MP sem o ímã.
Os vetores gênicos LV foram gerados utilizando métodos previamente descritos 25, 26 . O vetor LacZ expressa o gene da beta-galactosidase localizado no núcleo, sob o controle do promotor constitutivo MPSV (LV-LacZ), que produz um produto de reação azul em células transduzidas, visível nas frentes do tecido pulmonar e em cortes de tecido. A titulação foi realizada em culturas de células pela contagem manual do número de células positivas para LacZ com um hemocitômetro para calcular o título em TU/ml. Os carreadores são criopreservados a -80 °C, descongelados antes do uso e ligados ao CombiMag por mistura na proporção de 1:1 e incubação em gelo por pelo menos 30 minutos antes da administração.
Ratos Sprague Dawley normais (n = 3/grupo, ~2-3 foram anestesiados intraperitonealmente com uma mistura de 0,4 mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Austrália) e 60 mg/kg de cetamina (Ilium, Austrália) por via intraperitoneal) e canulação oral não cirúrgica com uma cânula intravenosa de calibre 16. Para garantir que o tecido da via aérea traqueal recebesse transdução de LV, ele foi condicionado usando nosso protocolo de perturbação mecânica descrito anteriormente, no qual a superfície da via aérea traqueal foi friccionada axialmente com uma cesta de arame (N-Circle, Extrator de Pedras sem Ponta de Nitinol NTSE-022115 - UDH, Cook Medical, EUA) por 30 s28. A administração traqueal de LV-MP foi então realizada em uma cabine de segurança biológica aproximadamente 10 minutos após a perturbação.
O campo magnético utilizado neste experimento foi configurado de maneira semelhante ao estudo de imagem por raios X in vivo, com os mesmos ímãs posicionados acima da traqueia utilizando clipes de stent de destilação (Figura 4). Um volume de 50 μl (2 alíquotas de 25 μl) de LV-MP foi administrado na traqueia (n = 3 animais) utilizando uma pipeta com ponta de gel, conforme descrito anteriormente. Um grupo controle (n = 3 animais) recebeu as mesmas LV-MPs sem o uso de um ímã. Após a infusão, a cânula foi removida do tubo endotraqueal e o animal foi extubado. O ímã permaneceu no local por 10 minutos e, em seguida, foi removido. Os ratos receberam uma dose subcutânea de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Austrália), seguida da reversão da anestesia por injeção intraperitoneal de 1 mg/kg de cloridrato de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Austrália). Os ratos foram mantidos aquecidos e monitorados até a completa recuperação da anestesia.
Dispositivo de administração de LV-MP em uma cabine de segurança biológica. O conector Luer cinza claro do tubo endotraqueal pode ser visto saindo da boca e a ponta de gel da pipeta mostrada na imagem é inserida através do tubo endotraqueal até a profundidade desejada na traqueia.
Uma semana após o procedimento de administração de LV-MP, os animais foram sacrificados humanitariamente por inalação de 100% de CO2 e a expressão de LacZ foi avaliada utilizando nosso tratamento padrão com X-gal. Os três anéis cartilaginosos mais caudais foram removidos para garantir que quaisquer danos mecânicos ou retenção de fluidos decorrentes da colocação do tubo endotraqueal não fossem incluídos na análise. Cada traqueia foi cortada longitudinalmente para criar duas metades para análise, e estas foram montadas em uma placa contendo borracha de silicone (Sylgard, Dow Inc.) utilizando uma agulha Minutien (Fine Science Tools) para visualizar a superfície luminal. A distribuição e o padrão das células transduzidas foram confirmados por fotografia frontal utilizando um microscópio Nikon (SMZ1500) com uma câmera DigiLite e o software TCapture (Tucsen Photonics, China). As imagens foram adquiridas com ampliação de 20x (incluindo a configuração mais alta para toda a largura da traqueia), com todo o comprimento da traqueia sendo imageado passo a passo, garantindo sobreposição suficiente entre cada imagem para permitir a “costura” das imagens. Imagens de cada As traqueias foram então reunidas em uma única imagem composta usando o Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research), empregando um algoritmo de movimento planar. As áreas de expressão de LacZ nas imagens compostas da traqueia de cada animal foram quantificadas usando um script automatizado em MATLAB (R2020a, MathWorks), conforme descrito anteriormente, com as seguintes configurações: 0,35 < Matiz < 0,58, Saturação > 0,15 e Valor < 0,7. Ao traçar os contornos do tecido, uma máscara foi gerada manualmente no GIMP v2.10.24 para cada imagem composta, a fim de identificar a área do tecido e evitar detecções falsas fora do tecido traqueal. As áreas coradas de todas as imagens compostas de cada animal foram somadas para gerar a área total corada para aquele animal. A área corada foi então dividida pela área total da máscara para gerar a área normalizada.
Cada traqueia foi incluída em parafina e seções de 5 μm foram cortadas. As seções foram contracoradas com vermelho rápido neutro por 5 minutos e as imagens foram adquiridas usando um microscópio Nikon Eclipse E400, câmera DS-Fi3 e software de captura NIS element (versão 5.20.00).
Todas as análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). A significância estatística foi definida como p ≤ 0,05. A normalidade foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk e as diferenças na coloração de LacZ foram avaliadas pelo teste t de Student para amostras independentes.
As seis micropartículas (MPs) descritas na Tabela 1 foram examinadas usando PCXI, e a visibilidade é descrita na Tabela 2. Duas MPs de poliestireno (MP1 e MP2; 18 μm e 0,25 μm, respectivamente) não foram visíveis sob PCXI, mas o restante das amostras foi identificável (exemplos são mostrados na Figura 5). MP3 e MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm e 0,9 μm, respectivamente) são fracamente visíveis. Embora contenha algumas das menores partículas testadas, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) foi a mais pronunciada. O produto CombiMag MP6 é difícil de detectar. Em todos os casos, nossa capacidade de detectar MPs foi significativamente aprimorada pela translação do ímã para frente e para trás paralelamente ao capilar. Quando os ímãs se afastavam do capilar, as partículas se estendiam em longas cadeias, mas à medida que os ímãs se aproximavam e a intensidade do campo magnético aumentava, as cadeias de partículas... O comprimento das partículas diminui à medida que migram em direção à superfície superior do capilar (ver Vídeo Suplementar S1: MP4), aumentando a densidade de partículas na superfície. Por outro lado, quando o ímã é removido do capilar, a intensidade do campo diminui e as micropartículas se reorganizam em longas cadeias que se estendem da superfície superior do capilar (ver Vídeo Suplementar S2: MP4). Após o ímã parar de se mover, as partículas continuam a se mover por um curto período após atingirem a posição de equilíbrio. À medida que a micropartícula se move em direção à superfície superior do capilar e se afasta dela, as partículas magnéticas geralmente arrastam os detritos através do fluido.
A visibilidade do MP sob PCXI varia significativamente entre as amostras. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. Todas as imagens mostradas aqui foram obtidas com um ímã localizado aproximadamente 10 mm diretamente acima do capilar. Os círculos aparentemente grandes são bolhas de ar presas nos capilares, mostrando claramente as características das bordas em preto e branco da imagem de contraste de fase. A caixa vermelha contém a ampliação para aprimoramento do contraste. Observe que os diâmetros dos esquemas do ímã em todas as figuras não estão em escala e são aproximadamente 100 vezes maiores do que mostrados.
À medida que o ímã é transladado para a esquerda e para a direita ao longo da parte superior do capilar, o ângulo da cadeia de micropartículas (MP) muda para se alinhar com o ímã (ver Figura 6), delineando assim as linhas do campo magnético. Para MP3-5, após a cadeia atingir um ângulo limite, as partículas são arrastadas ao longo da superfície superior do capilar. Isso frequentemente resulta no agrupamento das MPs em grupos maiores próximos a onde o campo magnético é mais forte (ver Vídeo Suplementar S3:MP5). Isso também é particularmente evidente ao se obter imagens próximas à extremidade do capilar, o que faz com que as MPs se agreguem e se concentrem na interface fluido-ar. As partículas em MP6, que foram mais difíceis de discernir do que MP3-5, não foram arrastadas conforme o ímã se movia ao longo do capilar, mas as cadeias de MPs se dissociaram, deixando as partículas no campo de visão (ver Vídeo Suplementar S4:MP6). Em alguns casos, quando o campo magnético aplicado foi reduzido movendo-se o ímã a uma grande distância do local de imagem, quaisquer MPs restantes desceram lentamente para a superfície inferior do tubo por gravidade, enquanto permaneciam na cadeia (ver Vídeo Suplementar S5:MP3).
O ângulo da cadeia MP muda conforme o ímã é transladado para a direita acima do capilar. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. A caixa vermelha contém a ampliação para realçar o contraste. Observe que os vídeos suplementares são informativos, pois revelam informações importantes sobre a estrutura e a dinâmica das partículas que não podem ser visualizadas nessas imagens estáticas.
Nossos testes mostraram que mover o ímã lentamente para frente e para trás ao longo da traqueia facilita a visualização de micropartículas (MPs) no contexto de movimentos complexos in vivo. Os testes in vivo não foram realizados, pois as microesferas de poliestireno (MP1 e MP2) não eram visíveis no capilar. Cada uma das quatro MPs restantes foi testada in vivo com o eixo longitudinal do ímã configurado acima da traqueia em um ângulo de aproximadamente 30° em relação à vertical (ver Figuras 2b e 3a), pois isso resultou em cadeias de MP mais longas e foi mais eficaz do que a configuração com o ímã na posição final. As MP3, MP4 e MP6 não foram detectadas na traqueia de nenhum animal vivo. Quando as vias aéreas dos ratos foram examinadas por imagem após o sacrifício humanitário dos animais, as partículas permaneceram invisíveis mesmo com a adição de volume adicional por meio de uma bomba de seringa. A MP5 apresentou o maior teor de óxido de ferro e foi a única partícula visível, sendo, portanto, utilizada para avaliar e caracterizar o comportamento in vivo das MPs.
Ao posicionar o ímã sobre a traqueia durante a administração de micropartículas (MPs), observou-se a concentração de muitas, mas não todas, as MPs no campo de visão. A entrada de partículas na traqueia é melhor observada em animais sacrificados humanitariamente. A Figura 7 e o Vídeo Suplementar S6 mostram que a MP5 apresenta captura magnética rápida e alinhamento de partículas na superfície da traqueia ventral, indicando que as MPs podem ser direcionadas para as regiões desejadas da traqueia. Ao examinar a região mais distal da traqueia após a administração das MPs, algumas foram encontradas mais próximas da carina, sugerindo que a intensidade do campo magnético foi insuficiente para coletar e reter todas as MPs, visto que foram administradas na região de máxima intensidade do campo magnético durante o processo de fluido. Mesmo assim, as concentrações de MPs no pós-parto foram maiores ao redor da área imageada, sugerindo que muitas MPs permaneceram nas regiões das vias aéreas onde a intensidade do campo magnético aplicado era mais alta.
Imagens de (a) antes e (b) depois da administração de MP5 na traqueia de um rato recentemente eutanasiado, com o ímã posicionado diretamente acima da área de imagem. A área imageada está localizada entre os dois anéis de cartilagem. Antes da administração de MP, há algum fluido nas vias aéreas. A caixa vermelha contém a ampliação para realçar o contraste. Essas imagens são do vídeo apresentado no Vídeo Suplementar S6:MP5.
Ao deslocar o ímã ao longo da traqueia in vivo, a cadeia de micropartículas (MPs) mudou de ângulo na superfície das vias aéreas de maneira semelhante à observada nos capilares (ver Figura 8 e Vídeo Suplementar S7:MP5). No entanto, em nosso estudo, as MPs não puderam ser arrastadas ao longo da superfície das vias aéreas vivas como ocorre nos capilares. Em alguns casos, a cadeia de MPs se alonga à medida que o ímã se move para a esquerda e para a direita. Curiosamente, também descobrimos que a cadeia de partículas parece alterar a profundidade da camada de fluido superficial quando o ímã é movido longitudinalmente ao longo da traqueia e se expande quando o ímã é movido diretamente acima e a cadeia de partículas é girada para uma posição vertical (ver Vídeo Suplementar S7). : MP5 em 0:09, canto inferior direito). O padrão característico de movimento mudou quando o ímã foi transladado lateralmente pela parte superior da traqueia (ou seja, para a esquerda ou para a direita do animal, em vez de ao longo do comprimento da traqueia). As partículas ainda eram claramente visíveis enquanto se moviam, mas quando o ímã foi removido da traqueia, as pontas dos filamentos de partículas tornaram-se visíveis (ver Vídeo Suplementar S8:MP5, a partir de 0:08). Isso é consistente com o comportamento das partículas magnéticas que observamos sob um campo magnético aplicado em um capilar de vidro.
Exemplos de imagens mostrando MP5 na traqueia de um rato anestesiado vivo. (a) O ímã é usado para adquirir imagens acima e à esquerda da traqueia e, em seguida, (b) após o ímã ser movido para a direita. A caixa vermelha contém a ampliação para realçar o contraste. Essas imagens são do vídeo mostrado no Vídeo Suplementar S7:MP5.
Quando os dois polos foram configurados em uma orientação norte-sul acima e abaixo da traqueia (ou seja, atraindo-se; Fig. 3b), as cordas das micropartículas (MP) pareceram mais longas e localizadas na parede lateral da traqueia, em vez de na superfície dorsal da traqueia (ver Vídeo Suplementar S9:MP5). No entanto, altas concentrações de partículas em um único local (ou seja, a superfície dorsal da traqueia) não foram detectadas após a administração do fluido quando um dispositivo de ímã duplo foi usado, o que normalmente ocorre quando um dispositivo de ímã único é usado. Então, quando um ímã foi configurado para repelir os polos invertidos (Fig. 3c), o número de partículas visíveis no campo de visão não pareceu aumentar após a administração. A configuração de ambos os sistemas de ímã duplo é desafiadora devido às altas intensidades do campo magnético que atraem ou repelem os ímãs, respectivamente. A configuração foi então alterada para um único ímã paralelo às vias aéreas, mas passando por elas a 90 graus, de modo que as linhas de campo cruzassem a parede traqueal ortogonalmente (Fig. 3d), uma orientação projetada para determinar se Observou-se a agregação de partículas na parede lateral. No entanto, nessa configuração, não houve movimento identificável de acúmulo de micropartículas nem movimento do ímã. Com base em todos esses resultados, uma configuração com um único ímã e orientação de 30 graus (Figura 3a) foi escolhida para estudos in vivo de vetores gênicos.
Quando o animal foi repetidamente imagiado imediatamente após o eutanásio, a ausência de movimento tecidual que pudesse interferir permitiu discernir linhas de partículas mais finas e curtas no campo intercondral nítido, "oscilantes" em consonância com o movimento translacional do magneto. No entanto, ainda não é possível observar claramente a presença e o movimento das partículas MP6.
O título de LV-LacZ foi de 1,8 × 10⁸ TU/ml e, após mistura 1:1 com CombiMag MP (MP6), os animais receberam uma dose traqueal de 50 μl de veículo LV de 9 × 10⁷ TU/ml (ou seja, 4,5 × 10⁶ TU/rato). Nestes estudos, em vez de mover o ímã durante o trabalho de parto, fixamos o ímã em uma posição para determinar se a transdução por LV (a) poderia ser melhorada em comparação com a administração do vetor na ausência de um campo magnético e (b) poderia ser focalizada. As células das vias aéreas são transduzidas para regiões-alvo magnéticas das vias aéreas superiores.
A presença de ímãs e o uso do CombiMag combinado com vetores LV não pareceram ter efeitos adversos na saúde dos animais, assim como nosso protocolo padrão de administração de vetores LV. Imagens frontais da região traqueal submetida à perturbação mecânica (Figura Suplementar 1) indicaram níveis significativamente maiores de transdução no grupo de animais tratados com LV-MP quando o ímã estava presente (Figura 9a). Apenas uma pequena quantidade de coloração azul LacZ foi observada no grupo controle (Figura 9b). A quantificação das áreas coradas com X-Gal normalizadas mostrou que a administração de LV-MP na presença de um campo magnético produziu uma melhora de aproximadamente 6 vezes (Figura 9c).
Exemplos de imagens compostas mostrando a transdução traqueal por LV-MP (a) na presença de um campo magnético e (b) na ausência de um ímã. (c) Melhora estatisticamente significativa na área de transdução LacZ normalizada dentro da traqueia ao usar o ímã (*p = 0,029, teste t, n = 3 por grupo, média ± erro padrão da média).
Secções coradas com vermelho rápido neutro (exemplo mostrado na Figura Suplementar 2) mostraram células coradas com LacZ presentes em um padrão e localização semelhantes aos relatados anteriormente.
Um desafio fundamental para a terapia gênica das vias aéreas continua sendo a localização precisa das partículas transportadoras nas regiões de interesse e a obtenção de altos níveis de eficiência de transdução no pulmão em movimento, na presença de fluxo de ar e eliminação ativa de muco. Para vetores de lentivírus (LV) projetados para tratar a doença das vias aéreas na fibrose cística (FC), aumentar o tempo de permanência das partículas transportadoras nas vias aéreas condutoras tem sido um objetivo até então difícil de alcançar. Como apontado por Castellani et al., o uso de campos magnéticos para melhorar a transdução apresenta vantagens em comparação com outros métodos de administração de genes, como a eletroporação, pois pode combinar simplicidade, custo-benefício, localização precisa da administração, maior eficiência e tempos de incubação mais curtos, e possivelmente uma dose menor de vetor. No entanto, a deposição e o comportamento in vivo de partículas magnéticas nas vias aéreas sob a influência de forças magnéticas externas nunca foram descritos, nem a viabilidade desse método foi demonstrada in vivo para aumentar os níveis de expressão gênica em vias aéreas intactas e vivas.
Nossos experimentos in vitro com radiação síncrotron PCXI mostraram que todas as partículas testadas, com exceção das micropartículas de poliestireno, eram visíveis na configuração de imagem utilizada. Na presença de um campo magnético, as micropartículas formam filamentos cujos comprimentos estão relacionados ao tipo de partícula e à intensidade do campo magnético (ou seja, à proximidade e ao movimento do ímã). Como mostrado na Figura 10, os filamentos observados são formados devido à magnetização de cada partícula individual, que induz seu próprio campo magnético local. Esses campos distintos fazem com que outras partículas semelhantes se agreguem e se conectem, com movimentos em grupo semelhantes a filamentos, devido às forças locais de atração e repulsão entre as partículas.
Esquema mostrando (a,b) trens de partículas gerados dentro de capilares preenchidos com fluido e (c,d) traqueia preenchida com ar. Observe que os capilares e a traqueia não estão desenhados em escala. O painel (a) também contém uma descrição do MP, que contém partículas de Fe3O4 dispostas em cadeias.
Quando o ímã foi movido sobre o capilar, o ângulo do filamento de partículas atingiu um limiar crítico para MP3-5 contendo Fe3O4, após o qual o filamento de partículas deixou de permanecer na posição original, movendo-se ao longo da superfície para uma nova posição. Esse efeito provavelmente ocorre porque a superfície do capilar de vidro é lisa o suficiente para permitir esse movimento. Curiosamente, MP6 (CombiMag) não se comportou dessa maneira, possivelmente porque as partículas eram menores, possuíam revestimentos ou cargas superficiais diferentes, ou um fluido transportador proprietário afetou sua capacidade de movimento. O contraste da imagem das partículas CombiMag também é mais fraco, sugerindo que o fluido e as partículas podem ter densidades semelhantes e, portanto, não se movem facilmente um em direção ao outro. As partículas também podem ficar presas se o ímã se mover muito rápido, indicando que a intensidade do campo magnético nem sempre consegue superar o atrito entre as partículas no fluido, sugerindo que talvez não seja surpreendente que a intensidade do campo magnético e a distância entre o ímã e a área alvo sejam muito importantes. Em conjunto, esses resultados também sugerem que, embora os ímãs possam capturar muitas micropartículas que fluem pela área alvo, é improvável que os ímãs possam Portanto, concluímos que os estudos in vivo de LV-MP devem utilizar campos magnéticos estáticos para atingir fisicamente regiões específicas da árvore brônquica.
Quando as partículas são introduzidas no corpo, são difíceis de identificar no contexto do tecido corporal complexo e em movimento, mas a capacidade de detectá-las foi aprimorada ao deslocar o ímã horizontalmente acima da traqueia para "oscilar" os filamentos de micropartículas. Embora seja possível obter imagens de animais vivos, é mais fácil discernir o movimento das partículas após o sacrifício humanitário do animal. As concentrações de micropartículas foram geralmente mais altas nessa localização quando o ímã estava posicionado acima da área de imagem, embora algumas partículas fossem geralmente encontradas mais adiante na traqueia. Ao contrário dos estudos in vitro, as partículas não podem ser arrastadas ao longo da traqueia pelo deslocamento do ímã. Essa descoberta é consistente com a forma como o muco que reveste a superfície da traqueia normalmente processa as partículas inaladas, aprisionando-as no muco e, posteriormente, eliminando-as pelo mecanismo de depuração mucociliar.
Nossa hipótese era de que o uso de ímãs para atração acima e abaixo da traqueia (Fig. 3b) poderia resultar em um campo magnético mais uniforme, em vez de um campo magnético altamente concentrado em um ponto, levando potencialmente a uma distribuição mais uniforme de partículas. No entanto, nosso estudo preliminar não encontrou evidências claras para apoiar essa hipótese. Da mesma forma, configurar um par de ímãs para se repelirem (Fig. 3c) não resultou em maior deposição de partículas na área imageada. Essas duas descobertas demonstram que a configuração com dois ímãs não melhora significativamente o controle local do direcionamento de micropartículas e que as fortes forças magnéticas resultantes são difíceis de configurar, tornando essa abordagem menos prática. Similarmente, orientar o ímã acima e através da traqueia (Fig. 3d) também não aumentou o número de partículas retidas na área imageada. Algumas dessas configurações alternativas podem não ser bem-sucedidas porque resultam em intensidades de campo magnético mais baixas dentro da área de deposição. Portanto, a configuração com um único ímã em ângulo de 30 graus (Figura 3a) é considerada o método mais fácil e eficiente para testes in vivo.
O estudo LV-MP demonstrou que, quando vetores LV foram combinados com CombiMag e administrados após perturbação física na presença de um campo magnético, os níveis de transdução aumentaram significativamente na traqueia em comparação com os controles. Com base nos estudos de imagem por sincrotron e nos resultados do LacZ, o campo magnético foi aparentemente capaz de preservar o LV dentro da traqueia e reduzir o número de partículas do vetor que penetraram imediatamente nas camadas mais profundas do pulmão. Essas melhorias no direcionamento podem levar a uma maior eficácia, reduzindo os títulos administrados, a transdução fora do alvo, os efeitos colaterais inflamatórios e imunológicos e os custos do vetor gênico. É importante ressaltar que, de acordo com o fabricante, o CombiMag pode ser usado em conjunto com outros métodos de transferência gênica, incluindo outros vetores virais (como o AAV) e ácidos nucleicos.