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Genvektoren zur Behandlung der Mukoviszidose-Lungenerkrankung sollten auf die Atemwege abzielen, da die periphere Lungentransduktion keinen therapeutischen Nutzen bietet. Die Effizienz der viralen Transduktion hängt direkt mit der Verweilzeit des Vektors zusammen. Allerdings diffundieren Verabreichungsflüssigkeiten wie Genträger während der Inspiration auf natürliche Weise in die Alveolen, und therapeutische Partikel jeglicher Form werden durch mukoziliären Transport schnell entfernt. Die Verlängerung der Verweilzeit von Genträgern in den Atemwegen ist wichtig, aber schwer zu erreichen. Genträger-konjugierte magnetische Partikel, die auf die Oberfläche der Atemwege gerichtet werden können, können die regionale Zielausrichtung verbessern. Aufgrund der Herausforderungen der In-vivo-Visualisierung ist das Verhalten solch kleiner magnetischer Partikel auf der Atemwegsoberfläche in Gegenwart eines angelegten Magnetfelds noch wenig verstanden. Ziel dieser Studie war es, mithilfe von Synchrotron-Bildgebung die In-vivo-Bewegung einer Reihe magnetischer Partikel in der Trachea anästhesierter Ratten zu visualisieren, um die Dynamik und Muster des Verhaltens einzelner und massiver Partikel in vivo zu untersuchen. Anschließend untersuchten wir, ob die Verabreichung lentiviraler magnetischer Partikel in Gegenwart eines Ein Magnetfeld würde die Transduktionseffizienz in der Rattentrachea erhöhen. Synchrotron-Röntgenbildgebung zeigt das Verhalten magnetischer Partikel in stationären und bewegten Magnetfeldern in vitro und in vivo. Partikel können nicht einfach mit Magneten über die Oberfläche der lebenden Atemwege gezogen werden, aber während des Transports konzentrieren sich die Ablagerungen im Sichtfeld, wo das Magnetfeld am stärksten ist. Die Transduktionseffizienz wurde außerdem um das Sechsfache erhöht, wenn lentivirale magnetische Partikel in Gegenwart eines Magnetfelds abgegeben wurden. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass lentivirale magnetische Partikel und Magnetfelder wertvolle Ansätze sein könnten, um das Targeting von Genvektoren zu verbessern und die Transduktionsniveaus in den leitenden Atemwegen in vivo zu erhöhen.
Mukoviszidose (CF) wird durch eine Variation eines einzelnen Gens namens CF-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR) verursacht. Das CFTR-Protein ist ein Ionenkanal, der in vielen Epithelzellen im gesamten Körper vorkommt, einschließlich der Atemwege, einem Hauptort der CF-Pathogenese. CFTR-Defekte führen zu einem abnormalen Wassertransport, wodurch die Oberfläche der Atemwege dehydriert und die Tiefe der Flüssigkeitsschicht auf der Atemwegsoberfläche (ASL) verringert wird. Dies beeinträchtigt auch die Fähigkeit des mukoziliären Transportsystems (MCT), eingeatmete Partikel und Krankheitserreger aus den Atemwegen zu entfernen. Unser Ziel ist die Entwicklung einer lentiviralen (LV) Gentherapie, um die richtige Kopie des CFTR-Gens zu liefern und die Gesundheit von ASL, MCT und Lunge zu verbessern, sowie die Entwicklung neuer Technologien zur Messung dieser Parameter in vivo1.
LV-Vektoren zählen zu den führenden Kandidaten für die Gentherapie der Atemwege bei CF, vor allem weil sie das therapeutische Gen dauerhaft in die Basalzellen der Atemwege (Atemwegsstammzellen) integrieren können. Dies ist wichtig, da sie durch Differenzierung in funktionelle, genkorrigierte CF-assoziierte Atemwegsoberflächenzellen die normale Hydratation und Schleimentfernung wiederherstellen können, was zu lebenslangem Nutzen führt. LV-Vektoren sollten gegen die leitenden Atemwege gerichtet sein, da hier die CF-Lungenerkrankung beginnt. Die Einbringung des Vektors tiefer in die Lunge kann zu einer alveolären Transduktion führen, die jedoch bei CF keinen therapeutischen Nutzen hat. Flüssigkeiten wie Genträger wandern jedoch nach der Einatmung auf natürliche Weise in die Alveolen, und therapeutische Partikel werden durch die MCT schnell in die Mundhöhle abtransportiert. Die Effizienz der LV-Transduktion hängt direkt von der Verweildauer des Vektors in der Nähe der Zielzellen ab, um eine zelluläre Aufnahme zu ermöglichen – der „Verweilzeit“5 –, die durch einen typischen regionalen Luftstrom sowie eine koordinierte Aufnahme von Partikelschleim und MCT leicht verkürzt werden kann. Bei CF ist die Fähigkeit, die Verweilzeit des LV zu verlängern, innerhalb der Atemwege ist wichtig, um in dieser Region ein hohes Maß an Transduktion zu erreichen, war bisher jedoch eine Herausforderung.
Um dieses Hindernis zu überwinden, schlagen wir vor, dass LV-Magnetpartikel (MPs) auf zwei sich ergänzende Weisen hilfreich sein können. Erstens können sie magnetisch an die Atemwegsoberfläche geleitet werden, um die Zielausrichtung zu verbessern und den Genträgerpartikeln dabei zu helfen, sich im gewünschten Atemwegsbereich aufzuhalten; und zweitens können sie (ASL) dazu dienen, sich zur Zellschicht 6 zu bewegen. MPs werden häufig als zielgerichtete Arzneimittelverabreichungsvehikel verwendet, wenn sie an Antikörper, Chemotherapeutika oder andere kleine Moleküle binden, die sich an Zellmembranen anheften oder an relevante Zelloberflächenrezeptoren binden und sich in Gegenwart statischer Elektrizität an Tumorstellen ansammeln. Magnetfelder in der Krebsbehandlung 7. Andere „hyperthermische“ Techniken zielen darauf ab, MPs zu erhitzen, wenn sie oszillierenden Magnetfeldern ausgesetzt werden, und so Tumorzellen zu zerstören. Das Prinzip der magnetischen Transfektion, bei dem ein Magnetfeld als Transfektionsmittel verwendet wird, um den DNA-Transfer auf Zellen zu beschleunigen, wird häufig in vitro mit einer Reihe von nicht-viralen und viralen Genvektoren für schwer transduzierbare Zelllinien angewendet. Die Wirksamkeit der LV-Magnetotransfektion wurde durch die In-vitro-Übertragung von LV-MPs auf eine menschliche Bronchialepithelzelllinie in Gegenwart eines statischen Magnetfelds nachgewiesen, wodurch die Transduktionseffizienz im Vergleich zur alleinigen Verwendung eines LV-Vektors um das 186-fache gesteigert wurde. LV-MP wurde auch in einem In-vitro-CF-Modell angewendet, wo die magnetische Transfektion die LV-Transduktion in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen in Gegenwart von CF-Sputum um das 20-fache erhöhte10. Die In-vivo-Magnetotransfektion von Organen hat jedoch relativ wenig Beachtung gefunden und wurde nur Studien11,12,13,14,15, insbesondere in der Lunge16,17. Dennoch sind die Möglichkeiten der magnetischen Transfektion in der CF-Lungentherapie klar. Tan et al. (2020) gaben an, dass „eine Proof-of-Concept-Studie zur effizienten pulmonalen Verabreichung magnetischer Nanopartikel den Weg für zukünftige CFTR-Inhalationsstrategien ebnen wird, um die klinischen Ergebnisse bei CF-Patienten zu verbessern“6.
Das Verhalten kleiner magnetischer Partikel auf Atemwegsoberflächen in Gegenwart eines angelegten Magnetfelds ist schwer zu visualisieren und zu untersuchen und daher nur unzureichend verstanden. In anderen Studien haben wir eine auf Synchrotron-Ausbreitung basierende Phasenkontrast-Röntgenbildgebungsmethode (PB-PCXI) entwickelt, um winzige Änderungen der ASL-Tiefe18 und des MCT-Verhaltens19,20 in vivo nichtinvasiv zu visualisieren und zu quantifizieren, um die Hydratisierung der Gaskanaloberfläche direkt zu messen und als frühen Indikator für die Wirksamkeit der Behandlung zu verwenden. Darüber hinaus verwendet unsere MCT-Auswertungsmethode Partikel mit einem Durchmesser von 10 bis 35 µm, die aus Aluminiumoxid oder Glas mit hohem Brechungsindex bestehen, als MCT-Marker, die mit PB-PCXI21 sichtbar sind. Beide Techniken eignen sich zur Visualisierung einer Reihe von Partikeltypen, einschließlich MP.
Aufgrund ihrer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung eignen sich unsere auf PB-PCXI basierenden ASL- und MCT-Analysetechniken gut zur Untersuchung der Dynamik und Muster des Verhaltens einzelner und großer Partikel in vivo und helfen uns so, die Techniken zur MP-Genabgabe zu verstehen und zu optimieren. Der hier verwendete Ansatz leitet sich aus unseren Studien mit der Strahllinie SPring-8 BL20B2 ab, bei der wir die Flüssigkeitsbewegung nach der Verabreichung einer Scheinvektordosis in die Nasen- und Lungenluftwege von Mäusen visualisierten, um die ungleichmäßigen Genexpressionsmuster zu erklären, die wir in unseren Tierstudien mit Genträgerdosen beobachtet hatten 3,4 .
Ziel dieser Studie war es, mithilfe des Synchrotrons PB-PCXI die In-vivo-Bewegungen einer Reihe von MPs in der Trachea lebender Ratten zu visualisieren. Diese PB-PCXI-Bildgebungsstudien wurden konzipiert, um eine Reihe von MPs, Magnetfeldstärken und Positionen zu testen und deren Auswirkungen auf die MP-Bewegung zu bestimmen. Wir gingen von der Hypothese aus, dass ein extern angelegtes Magnetfeld dazu beitragen würde, dass die abgegebenen MPs im Zielbereich bleiben oder sich dorthin bewegen. Diese Studien ermöglichten es uns auch, Magnetkonfigurationen zu identifizieren, die die Anzahl der nach der Ablagerung in der Trachea zurückbleibenden Partikel maximieren. In einer zweiten Studienreihe versuchten wir, diese optimale Konfiguration zu nutzen, um das Transduktionsmuster zu demonstrieren, das sich aus der In-vivo-Abgabe von LV-MPs an die Atemwege der Ratte ergibt, basierend auf der Annahme, dass die Abgabe von LV-MPs im Rahmen der gezielten Ausrichtung auf die Atemwege zu einer verbesserten LV-Transduktionseffizienz führen würde.
Alle Tierstudien wurden gemäß den von der University of Adelaide (M-2019-060 und M-2020-022) und dem SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee genehmigten Protokollen durchgeführt. Die Experimente wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.
Alle Röntgenaufnahmen wurden an der BL20XU-Strahllinie des SPring-8-Synchrotrons in Japan durchgeführt, wobei ein ähnlicher Aufbau wie der zuvor beschriebene verwendet wurde21,22. Kurz gesagt befand sich die Experimentierbox 245 m vom Synchrotron-Speicherring entfernt. Ein Abstand zwischen Probe und Detektor von 0,6 m wird für Partikelbildgebungsstudien und 0,3 m für In-vivo-Bildgebungsstudien verwendet, um Phasenkontrasteffekte zu erzeugen. Es wurde eine monochromatische Strahlenergie von 25 keV verwendet. Die Bilder wurden mit einem hochauflösenden Röntgenkonverter (SPring-8 BM3) aufgenommen, der an einen sCMOS-Detektor gekoppelt war. Der Konverter wandelt Röntgenstrahlen mithilfe eines 10 µm dicken Szintillators (Gd3Al2Ga3O12) in sichtbares Licht um, das dann mit einem 10-fachen Mikroskopobjektiv (NA 0,3) auf einen sCMOS-Sensor geleitet wird. Der sCMOS-Detektor war ein Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) mit einem Array Größe von 2048 × 2048 Pixeln und eine Rohpixelgröße von 6,5 × 6,5 µm. Dieser Aufbau ergibt eine effektive isotrope Pixelgröße von 0,51 µm und ein Sichtfeld von ungefähr 1,1 mm × 1,1 mm. Eine Belichtungsdauer von 100 ms wurde gewählt, um das Signal-Rausch-Verhältnis magnetischer Partikel innerhalb und außerhalb der Atemwege zu maximieren und gleichzeitig atmungsbedingte Bewegungsartefakte zu minimieren. Für In-vivo-Studien wurde ein schneller Röntgenverschluss in den Röntgenstrahlpfad eingefügt, um die Strahlendosis zu begrenzen, indem der Röntgenstrahl zwischen den Belichtungen blockiert wird.
Der LV-Träger wurde in keiner SPring-8 PB-PCXI-Bildgebungsstudie verwendet, da die BL20XU-Bildgebungskammer nicht für die Biosicherheitsstufe 2 zertifiziert ist. Stattdessen haben wir eine Reihe gut charakterisierter MPs von zwei kommerziellen Anbietern ausgewählt – die ein Spektrum an Größen, Materialien, Eisenkonzentrationen und Anwendungen abdecken –, um zunächst zu verstehen, wie Magnetfelder die MP-Bewegung in Glaskapillaren und dann in lebenden Atemwegen beeinflussen. auf der Oberfläche. MPs haben eine Größe von 0,25 bis 18 μm und bestehen aus einer Vielzahl von Materialien (siehe Tabelle 1), aber die Zusammensetzung jeder Probe, einschließlich der Größe der magnetischen Partikel innerhalb des MP, ist unbekannt. Basierend auf unseren umfassenden MCT-Studien 19, 20, 21, 23, 24 erwarten wir, dass MPs mit einer Größe von nur 5 μm auf der Oberfläche der Trachea sichtbar sind, beispielsweise durch Subtraktion aufeinanderfolgender Frames, um eine verbesserte Sichtbarkeit der MP-Bewegung zu erzielen. Ein einzelnes 0,25 μm großes MP ist kleiner als die Auflösung des Bildgebungsgeräts, aber PB-PCXI soll ihren Volumenkontrast und die Bewegung der Oberflächenflüssigkeit, auf der sie nach der Ablagerung abgelagert werden, erkennen.
Proben für jedes MP in Tabelle 1 wurden in 20 μl Glaskapillaren (Drummond Microcaps, PA, USA) mit einem Innendurchmesser von 0,63 mm vorbereitet. Korpuskulare Partikel sind in Wasser erhältlich, während CombiMag-Partikel in der proprietären Flüssigkeit des Herstellers erhältlich sind. Jedes Röhrchen ist zur Hälfte mit Flüssigkeit gefüllt (ca. 11 μl) und auf dem Probenhalter platziert (siehe Abbildung 1). Die Glaskapillaren wurden jeweils horizontal auf dem Probentisch in der Bildgebungsbox platziert und an den Rändern der Flüssigkeit positioniert. Ein 19 mm Durchmesser (28 mm lang) Nickel-Seltenerd-Neodym-Eisen-Bor-Magnet (NdFeB) (N35, Kat.-Nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) mit einer Restmagnetisierung von 1,17 Tesla wurde an einem separaten Translationstisch befestigt, um seine Position während der Bildgebung ferngesteuert ändern zu können. Die Röntgenbildaufnahme beginnt, wenn der Magnet ca. 30 mm über der Probe positioniert ist, und die Bilder werden mit einer Rate von 4 Bildern pro Sekunde. Während der Bildgebung wurde der Magnet nahe an das Glaskapillarröhrchen gebracht (etwa 1 mm entfernt) und dann entlang des Röhrchens verschoben, um die Auswirkungen der Feldstärke und Position zu beurteilen.
In-vitro-Bildgebungsaufbau mit MP-Proben in Glaskapillaren auf dem Proben-xy-Translationstisch. Der Weg des Röntgenstrahls ist mit einer roten gestrichelten Linie markiert.
Nachdem die In-vitro-Sichtbarkeit von MPs festgestellt war, wurde eine Teilmenge davon in vivo an Wildtyp-weiblichen Albino-Wistar-Ratten (~12 Wochen alt, ~200 g) getestet. 0,24 mg/kg Medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg Midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) und 4 mg/kg Butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Die Ratten wurden mit einer Mischung aus Pharma), Japan) durch intraperitoneale Injektion anästhesiert. Nach der Anästhesie wurden sie für die Bildgebung vorbereitet, indem das Fell um die Luftröhre entfernt, ein Endotrachealtubus (ET; 16 Ga iv Kanüle, Terumo BCT) eingeführt und sie in Rückenlage auf einer speziell angefertigten Bildplatte mit einem Wärmebeutel zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur immobilisiert wurden 22. Die Bildplatte wurde dann leicht angewinkelt an der Probenverschiebungsstufe in der Bildgebungsbox befestigt, um die Luftröhre horizontal auszurichten das Röntgenbild, wie in Abbildung 2a dargestellt.
(a) In-vivo-Bildgebungsaufbau in der SPring-8-Bildgebungsbox, der Weg des Röntgenstrahls ist mit einer roten gestrichelten Linie markiert. (b,c) Die Magnetlokalisierung auf der Luftröhre wurde aus der Ferne mithilfe von zwei orthogonal montierten IP-Kameras durchgeführt. Auf der linken Seite des Bildschirmbildes sind die Drahtschlaufe zu sehen, die den Kopf hält, und die Einführungskanüle an ihrem Platz im ET-Tubus.
Ein ferngesteuertes Spritzenpumpensystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mit einer 100-μl-Glasspritze wurde über eine 30-Ga-Nadel mit einem PE10-Schlauch (AD 0,61 mm, ID 0,28 mm) verbunden. Markieren Sie den Schlauch, um sicherzustellen, dass sich die Spitze beim Einführen des Endotrachealtubus in der richtigen Position in der Trachea befindet. Mithilfe der Mikropumpe wurde der Spritzenkolben zurückgezogen, während die Spitze des Schlauchs in die zu verabreichende MP-Probe eingetaucht wurde. Der beladene Verabreichungsschlauch wurde dann in den Endotrachealtubus eingeführt, wobei sich die Spitze im stärksten Teil des erwarteten angelegten Magnetfelds befand. Die Bildaufnahme wurde über einen Atmungsdetektor gesteuert, der an unsere Arduino-basierte Timing-Box angeschlossen war, und alle Signale (z. B. Temperatur, Atmung, Öffnen/Schließen des Verschlusses und Bildaufnahme) wurden mit Powerlab und LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) aufgezeichnet 22. Bei der Bildgebung Wenn das Gehäuse nicht zugänglich war, wurden zwei IP-Kameras (Panasonic BB-SC382) in ca. 90° zueinander und wurden verwendet, um die Position des Magneten relativ zur Trachea während der Bildgebung zu überwachen (Abb. 2b,c). Um Bewegungsartefakte zu minimieren, wurde während des endtidalen Flow-Plateaus ein Bild pro Atemzug aufgenommen.
Ein Magnet ist an einer zweiten Stufe angebracht, die von außerhalb des Bildgebungsgehäuses entfernt platziert werden kann. Es wurden verschiedene Magnetpositionen und -konfigurationen getestet, darunter: Montage in einem Winkel von etwa 30° über der Luftröhre (Konfigurationen dargestellt in Abbildung 2a und 3a); ein Magnet über dem Tier und der andere darunter, mit auf Anziehung eingestellten Polen (Abbildung 3b); ein Magnet über dem Tier und der andere darunter, mit auf Abstoßung eingestellten Polen (Abbildung 3c); und ein Magnet über und senkrecht zur Luftröhre (Abbildung 3d). Sobald Tier und Magnet konfiguriert sind und das zu testende MP in die Spritzenpumpe geladen ist, verabreichen Sie eine 50-μl-Dosis mit einer Rate von 4 μl/s, während Sie Bilder aufnehmen. Der Magnet wird dann entlang der Luftröhre oder seitlich darüber hin- und herbewegt, während Sie weiterhin Bilder aufnehmen.
Magnetkonfiguration für In-vivo-Bildgebung (a) ein einzelner Magnet über der Luftröhre in einem Winkel von etwa 30°, (b) zwei auf Anziehung eingestellte Magnete, (c) zwei auf Abstoßung eingestellte Magnete, (d) ein einzelner Magnet über und senkrecht in der Luftröhre. Der Beobachter blickte vom Mund durch die Luftröhre auf die Lunge, und der Röntgenstrahl durchquerte die linke Seite der Ratte und trat auf der rechten Seite aus. Der Magnet wird entweder entlang der Atemwege oder links und rechts über der Luftröhre in Richtung des Röntgenstrahls bewegt.
Wir wollten außerdem die Sichtbarkeit und das Verhalten von Partikeln in den Atemwegen ohne störende Atmung und Herzbewegungen bestimmen. Daher wurden die Tiere am Ende des Bildgebungszeitraums aufgrund einer Überdosis Pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip) auf humane Weise getötet. Einige Tiere blieben auf der Bildgebungsplattform, und sobald Atmung und Herzschlag aufhörten, wurde der Bildgebungsprozess wiederholt, wobei eine zusätzliche Dosis MP hinzugefügt wurde, wenn auf der Oberfläche der Atemwege kein MP sichtbar war.
Die aufgenommenen Bilder wurden flachfeld- und dunkelfeldkorrigiert und dann mithilfe eines benutzerdefinierten, in MATLAB (R2020a, The Mathworks) geschriebenen Skripts zu einem Film zusammengesetzt (20 Bilder pro Sekunde; 15-25 × normale Geschwindigkeit, abhängig von der Atemfrequenz).
Alle Studien zur LV-Genvektorübertragung wurden in der Einrichtung für Tierforschung an der Universität Adelaide durchgeführt. Ziel war es, anhand der Ergebnisse des SPring-8-Experiments zu beurteilen, ob die Übertragung von LV-MP in Gegenwart eines Magnetfelds den Gentransfer in vivo verbessern kann. Um die Auswirkungen von MP und Magnetfeld zu beurteilen, wurden zwei Tiergruppen behandelt: Eine Gruppe erhielt LV-MP mit einem platzierten Magneten, die andere Gruppe erhielt eine Kontrollgruppe mit LV-MP ohne Magneten.
LV-Genvektoren wurden unter Verwendung zuvor beschriebener Methoden 25, 26 erzeugt. Der LacZ-Vektor exprimiert das im Zellkern lokalisierte Beta-Galaktosidase-Gen, das vom konstitutiven MPSV-Promoter (LV-LacZ) gesteuert wird, der in transduzierten Zellen ein blaues Reaktionsprodukt erzeugt, das in Lungengewebefronten und Gewebeschnitten sichtbar ist. Die Titration wurde in Zellkulturen durchgeführt, indem die Anzahl der LacZ-positiven Zellen manuell mit einem Hämozytometer gezählt wurde, um den Titer in TU/ml zu berechnen. Träger werden bei -80 °C kryokonserviert, vor der Verwendung aufgetaut und durch Mischen im Verhältnis 1:1 und Inkubation auf Eis für mindestens 30 Minuten vor der Verabreichung an CombiMag gebunden.
Normale Sprague-Dawley-Ratten (n = 3/Gruppe, ~2-3 wurden intraperitoneal mit einer Mischung aus 0,4 mg/kg Medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) und 60 mg/kg Ketamin (Ilium, Australien) anästhesiert. Die Tiere erhielten eine intraperitoneale Injektion und eine nicht-chirurgische orale Kanülierung mit einer 16-Ga-iv-Kanüle. Um sicherzustellen, dass das Gewebe der Trachealluftwege eine LV-Transduktion erhält, wurde es mit unserem zuvor beschriebenen mechanischen Störungsprotokoll konditioniert, bei dem die Oberfläche der Trachealluftwege 30 s lang axial mit einem Drahtkorb (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115 – UDH, Cook Medical, USA) gerieben wurde. Die tracheale Verabreichung von LV-MP erfolgte dann etwa 10 Minuten nach der Störung in einer biologischen Sicherheitswerkbank.
Das in diesem Experiment verwendete Magnetfeld wurde ähnlich wie in der In-vivo-Röntgenbildgebungsstudie konfiguriert, wobei dieselben Magnete mithilfe von Destillationsstentclips über der Trachea gehalten wurden (Abbildung 4). Ein Volumen von 50 μl (2 × 25 μl Aliquots) LV-MP wurde mithilfe einer Pipette mit einer Gelspitze, wie zuvor beschrieben, in die Trachea (n = 3 Tiere) injiziert. Eine Kontrollgruppe (n = 3 Tiere) erhielt dieselben LV-MPs ohne Verwendung eines Magneten. Nach Abschluss der Infusion wird die Kanüle aus dem Endotheltubus entfernt und das Tier extubiert. Der Magnet verbleibt 10 Minuten an Ort und Stelle und wird dann entfernt. Ratten erhielten eine subkutane Dosis Meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australien), gefolgt von einer Aufhebung der Narkose durch intraperitoneale Injektion von 1 mg/kg Atipamazolhydrochlorid (Antisedan, Zoetis, Australien). Die Ratten wurden warm gehalten und bis zur vollständigen Erholung von der Narkose überwacht.
LV-MP-Abgabegerät in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Der hellgraue Luer-Ansatz des ET-Tubus ragt aus der Öffnung heraus und die Gelspitze der abgebildeten Pipette wird durch den ET-Tubus bis zur gewünschten Tiefe in die Luftröhre eingeführt.
Eine Woche nach der LV-MP-Dosierung wurden die Tiere durch Inhalation von 100 % CO2 human getötet und die LacZ-Expression mittels unserer Standard-X-Gal-Behandlung untersucht. Die drei kaudalsten Knorpelringe wurden entfernt, um sicherzustellen, dass mechanische Schäden oder Flüssigkeitsansammlungen durch die Platzierung des Endotrachealtubus nicht in die Analyse einbezogen wurden. Jede Trachea wurde längs durchgeschnitten, um zwei Hälften für die Analyse zu erhalten. Diese wurden in einer Schale mit Silikonkautschuk (Sylgard, Dow Inc.) mithilfe einer Minutien-Nadel (Fine Science Tools) fixiert, um die luminale Oberfläche zu visualisieren. Die Verteilung und das Muster der transduzierten Zellen wurden durch Frontalfotografie mit einem Nikon-Mikroskop (SMZ1500) mit einer DigiLite-Kamera und der Software TCapture (Tucsen Photonics, China) bestätigt. Die Bilder wurden mit 20-facher Vergrößerung (einschließlich der höchsten Einstellung für die gesamte Breite der Trachea) aufgenommen, wobei die gesamte Länge der Trachea schrittweise abgebildet wurde, wobei eine ausreichende Überlappung zwischen den Bildern gewährleistet war „Stitching“. Bilder von jeder Trachea wurden dann mit dem Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) unter Verwendung eines planaren Bewegungsalgorithmus zu einem einzigen zusammengesetzten Bild zusammengesetzt. LacZ-Expressionsbereiche in zusammengesetzten Bildern der Trachea von jedem Tier wurden mit einem automatisierten MATLAB-Skript (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben quantifiziert, mit Einstellungen von 0,35 < Farbton < 0,58, Sättigung > 0,15 und Wert < 0,7. Durch Nachzeichnen der Konturen des Gewebes wurde in GIMP v2.10.24 manuell eine Maske für jedes zusammengesetzte Bild erstellt, um den Gewebebereich zu identifizieren und Fehlerkennungen von außerhalb des Trachealgewebes zu vermeiden. Die gefärbten Bereiche aller zusammengesetzten Bilder von jedem Tier wurden summiert, um den gesamten gefärbten Bereich für das jeweilige Tier zu ermitteln. Der gefärbte Bereich wurde dann durch den gesamten Maskenbereich geteilt, um den normalisierten Bereich zu ermitteln.
Jede Trachea wurde in Paraffin eingebettet und es wurden 5 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden 5 Minuten lang mit neutralem Echtrot gegengefärbt und die Bilder wurden mit einem Nikon Eclipse E400-Mikroskop, einer DS-Fi3-Kamera und der NIS-Elementerfassungssoftware (Version 5.20.00) aufgenommen.
Alle statistischen Analysen wurden in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt. Die Normalität wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test überprüft und Unterschiede in der LacZ-Färbung wurden mit dem ungepaarten t-Test bewertet.
Die sechs in Tabelle 1 beschriebenen MPs wurden mit PCXI untersucht, und die Sichtbarkeit ist in Tabelle 2 beschrieben. Zwei Polystyrol-MPs (MP1 und MP2; 18 μm bzw. 0,25 μm) waren unter PCXI nicht sichtbar, die übrigen Proben waren jedoch identifizierbar (Beispiele sind in Abbildung 5 dargestellt). MP3 und MP4 (10–15 % Fe3O4; 0,25 μm bzw. 0,9 μm) sind schwach sichtbar. Obwohl MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 μm) einige der kleinsten getesteten Partikel enthielt, war es am ausgeprägtesten. Das CombiMag-Produkt MP6 ist schwer zu erkennen. In allen Fällen konnte unsere Fähigkeit, MP zu erkennen, deutlich verbessert werden, indem der Magnet parallel zur Kapillare hin und her verschoben wurde. Wenn sich die Magnete von der Kapillare entfernten, dehnten sich die Partikel in langen Ketten aus, aber wenn sich die Magnete näherten und die Magnetfeldstärke zunahm, verkürzten sich die Partikelketten während die Partikel zur oberen Oberfläche der Kapillare wandern (siehe Zusatzvideo S1: MP4), erhöht sich die Partikeldichte auf der Oberfläche. Umgekehrt verringert sich die Feldstärke, wenn der Magnet von der Kapillare entfernt wird, und die MPs ordnen sich in langen Ketten neu an, die sich von der oberen Oberfläche der Kapillare aus erstrecken (siehe Zusatzvideo S2: MP4). Nachdem der Magnet aufhört, sich zu bewegen, bewegen sich die Partikel nach Erreichen der Gleichgewichtsposition noch eine kurze Zeit weiter. Während sich der MP zur oberen Oberfläche der Kapillare hin und von ihr weg bewegt, ziehen die magnetischen Partikel die Trümmer normalerweise durch die Flüssigkeit.
Die Sichtbarkeit von MP unter PCXI variiert erheblich zwischen den Proben. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6. Alle hier gezeigten Bilder wurden mit einem Magneten aufgenommen, der sich etwa 10 mm direkt über der Kapillare befindet. Die scheinbar großen Kreise sind in den Kapillaren eingeschlossene Luftblasen und zeigen deutlich die schwarz-weißen Randmerkmale der Phasenkontrastbildgebung. Das rote Kästchen enthält die kontrastverstärkende Vergrößerung. Beachten Sie, dass die Durchmesser der Magnetschemata in allen Abbildungen nicht maßstabsgetreu sind und etwa 100-mal größer sind als gezeigt.
Wenn der Magnet entlang der Kapillare nach links und rechts verschoben wird, ändert sich der Winkel der MP-Kette, um sich mit dem Magneten auszurichten (siehe Abbildung 6), wodurch die magnetischen Feldlinien dargestellt werden. Bei MP3-5 werden die Partikel, nachdem die Kette einen Grenzwinkel erreicht hat, entlang der Kapillaroberfläche gezogen. Dies führt häufig dazu, dass sich MPs in der Nähe des stärksten Magnetfelds zu größeren Gruppen zusammenballen (siehe Zusatzvideo S3: MP5). Dies ist besonders deutlich bei der Abbildung nahe dem Kapillarende zu sehen, da sich MPs an der Flüssigkeits-Luft-Grenzfläche aggregieren und konzentrieren. Partikel in MP6, die schwieriger zu erkennen waren als MP3-5, wurden nicht mitgezogen, als sich der Magnet entlang der Kapillare bewegte, aber die MP-Ketten dissoziierten, sodass die Partikel im Sichtfeld blieben (siehe Zusatzvideo S4: MP6). In einigen Fällen, wenn das angelegte Magnetfeld durch Bewegen des Magneten über eine große Entfernung vom Abbildungsort reduziert wurde, sanken alle verbleibenden MPs durch die Schwerkraft langsam auf die Bodenfläche des Röhrchens, während sie in der Kette blieben (siehe Zusatzvideo S5: MP3).
Der Winkel der MP-Saite ändert sich, wenn der Magnet über der Kapillare nach rechts verschoben wird. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6. Das rote Kästchen enthält die kontrastverstärkende Vergrößerung. Beachten Sie, dass die ergänzenden Videos informativ sind, da sie wichtige Informationen zur Partikelstruktur und Dynamik offenbaren, die in diesen statischen Bildern nicht visualisiert werden können.
Unsere Tests zeigten, dass das langsame Hin- und Herbewegen des Magneten entlang der Trachea die Visualisierung von MP im Kontext komplexer Bewegungen in vivo erleichtert. In-vivo-Tests wurden nicht durchgeführt, da die Polystyrolkügelchen (MP1 und MP2) in der Kapillare nicht sichtbar waren. Jedes der verbleibenden vier MPs wurde in vivo getestet, wobei die Längsachse des Magneten in einem Winkel von etwa 30° zur Vertikalen über der Trachea angeordnet war (siehe Abbildungen 2b und 3a), da dies zu längeren MP-Ketten führte und effektiver war als die Konfiguration mit abgebrochenem Magneten. MP3, MP4 und MP6 wurden in der Trachea keiner lebenden Tiere nachgewiesen. Als die Atemwege der Ratten nach der humanen Tötung abgebildet wurden, blieben die Partikel selbst dann unsichtbar, wenn mit einer Spritzenpumpe zusätzliches Volumen hinzugefügt wurde. MP5 hatte den höchsten Eisenoxidgehalt und war das einzige sichtbare Partikel. Es wurde daher zur Beurteilung und Charakterisierung des In-vivo-Verhaltens von MP verwendet.
Das Platzieren des Magneten über der Trachea während der MP-Abgabe führte dazu, dass viele, aber nicht alle MPs im Sichtfeld konzentriert waren. In die Trachea eindringende Partikel lassen sich am besten bei human getöteten Tieren beobachten. Abbildung 7 und ergänzendes Video S6: MP5 zeigt eine schnelle magnetische Erfassung und Ausrichtung von Partikeln auf der Oberfläche der ventralen Trachea, was darauf hindeutet, dass MPs in die gewünschten Bereiche der Trachea gelenkt werden können. Bei der Suche weiter distal entlang der Trachea nach der MP-Abgabe wurden einige MPs näher an der Carina gefunden, was darauf hindeutet, dass die magnetische Feldstärke nicht ausreichte, um alle MPs zu erfassen und zurückzuhalten, da sie während des Flüssigkeitsprozesses durch den Bereich mit der maximalen magnetischen Feldstärke abgegeben wurden. Dennoch waren die MP-Konzentrationen nach der Geburt um den abgebildeten Bereich herum höher, was darauf hindeutet, dass viele MPs in den Atemwegsbereichen verblieben, in denen die angewandte magnetische Feldstärke am höchsten war.
Bilder (a) vor und (b) nach der Verabreichung von MP5 in die Luftröhre einer kürzlich eingeschläferten Ratte, wobei der Magnet direkt über dem abgebildeten Bereich positioniert ist. Der abgebildete Bereich befindet sich zwischen den beiden Knorpelringen. Vor der Verabreichung von MP befindet sich etwas Flüssigkeit in den Atemwegen. Das rote Kästchen enthält die kontrastverstärkende Vergrößerung. Diese Bilder stammen aus dem Video, das im Zusatzvideo S6:MP5 gezeigt wird.
Das Verschieben des Magneten entlang der Luftröhre in vivo führte dazu, dass die MP-Kette ihren Winkel innerhalb der Atemwegsoberfläche auf eine Weise änderte, die der bei Kapillaren beobachteten ähnelte (siehe Abbildung 8 und Zusatzvideo S7:MP5). In unserer Studie konnten MPs jedoch nicht entlang der Oberfläche der lebenden Atemwege gezogen werden, wie dies bei Kapillaren der Fall war. In einigen Fällen wird die MP-Kette länger, wenn der Magnet nach links und rechts bewegt wird. Interessanterweise stellten wir auch fest, dass die Partikelkette die Tiefe der oberflächlichen Flüssigkeitsschicht zu verändern scheint, wenn der Magnet längs entlang der Luftröhre bewegt wird, und sich ausdehnt, wenn der Magnet direkt darüber bewegt und die Partikelkette in eine vertikale Position gedreht wird (siehe Zusatzvideo S7). : MP5 bei 0:09, unten rechts). Das charakteristische Bewegungsmuster änderte sich, als der Magnet seitlich über die Oberseite der Luftröhre bewegt wurde (d. h. nach links oder rechts vom Tier und nicht entlang der Länge der Luftröhre). Die Partikel waren während ihrer Bewegung noch deutlich sichtbar, aber als der Magnet von der Luftröhre entfernt wurde, wurden die Spitzen der Partikelketten sichtbar (siehe Zusatzvideo S8:MP5, ab 0:08). Dies steht im Einklang mit dem MP-Verhalten, das wir unter einem angelegten Magnetfeld in einer Glaskapillare beobachtet haben.
Beispielbilder, die MP5 in der Luftröhre einer lebenden, anästhesierten Ratte zeigen. (a) Mit dem Magneten werden Bilder oberhalb und links von der Luftröhre aufgenommen, dann (b) nachdem der Magnet nach rechts bewegt wurde. Das rote Kästchen enthält die kontrastverstärkende Vergrößerung. Diese Bilder stammen aus dem Video, das im Zusatzvideo S7:MP5 gezeigt wird.
Wenn die beiden Pole in Nord-Süd-Ausrichtung oberhalb und unterhalb der Trachea angeordnet waren (d. h. anziehend; Abb. 3b), erschienen die MP-Sehnen länger und befanden sich an der Seitenwand der Trachea und nicht auf der dorsalen Tracheaoberfläche (siehe Zusatzvideo S9:MP5). Bei Verwendung eines Geräts mit zwei Magneten wurden jedoch nach der Flüssigkeitsabgabe keine hohen Partikelkonzentrationen an einer einzelnen Stelle (d. h. der dorsalen Oberfläche der Trachea) festgestellt, was typischerweise bei Verwendung eines Geräts mit einem Magneten der Fall ist. Als dann ein Magnet so konfiguriert wurde, dass er die Pole umgekehrt abstößt (Abb. 3c), schien die Anzahl der im Sichtfeld sichtbaren Partikel nach der Abgabe nicht zuzunehmen. Der Aufbau beider Doppelmagnetkonfigurationen ist aufgrund der hohen magnetischen Feldstärken, die die Magnete ziehen bzw. drücken, eine Herausforderung. Der Aufbau wurde dann auf einen einzelnen Magneten geändert, der parallel zu den Atemwegen verläuft, aber im 90-Grad-Winkel durch die Atemwege verläuft, sodass die Feldlinien die Tracheawand orthogonal kreuzen (Abb. 3d), eine Ausrichtung, mit der ermittelt werden soll, ob eine Partikelaggregation an der Seitenwand beobachtet werden kann. In dieser Konfiguration war jedoch keine Bewegung der MP-Akkumulation oder Magnetbewegung erkennbar. Auf Grundlage all dieser Ergebnisse wurde für In-vivo-Genträgerstudien eine Konfiguration mit einem einzelnen Magneten und einer Ausrichtung von 30 Grad (Abbildung 3a) gewählt.
Als das Tier unmittelbar nach der humanen Tötung wiederholt fotografiert wurde, ließen sich aufgrund der fehlenden störenden Gewebebewegung feinere und kürzere Partikellinien im klaren interchondralen Feld erkennen, die im Einklang mit der Translationsbewegung des Magneten „wackelten“. Dennoch sind weder das Vorhandensein noch die Bewegung von MP6-Partikeln deutlich erkennbar.
Der LV-LacZ-Titer betrug 1,8 × 108 TU/ml, und nach 1:1-Mischung mit CombiMag MP (MP6) erhielten die Tiere eine 50 μl tracheale Dosis von 9 × 107 TU/ml LV-Vehikel (d. h. 4,5 × 106 TU/Ratte). In diesen Studien haben wir den Magneten während der Wehen nicht verschoben, sondern an einer Stelle fixiert, um festzustellen, ob die LV-Transduktion (a) im Vergleich zur Vektorabgabe ohne Magnetfeld verbessert werden konnte und (b) die Transduktion von Atemwegszellen auf magnetische Zielregionen der oberen Atemwege fokussiert werden konnte.
Die Anwesenheit von Magneten und die Verwendung von CombiMag in Kombination mit LV-Vektoren schienen keine negativen Auswirkungen auf die Gesundheit der Tiere zu haben, im Gegensatz zu unserem Standardprotokoll zur LV-Vektorverabreichung. Frontalaufnahmen der mechanisch gestörten Trachealregion (Ergänzende Abb. 1) zeigten, dass in der Gruppe der mit LV-MP behandelten Tiere bei Vorhandensein des Magneten signifikant höhere Transduktionsgrade auftraten (Abb. 9a). In der Kontrollgruppe war nur eine geringe Menge an blauer LacZ-Färbung vorhanden (Abb. 9b). Die Quantifizierung der normalisierten X-Gal-gefärbten Bereiche zeigte, dass die Verabreichung von LV-MP in Gegenwart eines Magnetfelds eine etwa sechsfache Verbesserung bewirkte (Abb. 9c).
Beispielhafte zusammengesetzte Bilder, die die Trachealtransduktion durch LV-MP (a) in Gegenwart eines Magnetfelds und (b) in Abwesenheit eines Magneten zeigen. (c) Statistisch signifikante Verbesserung des normalisierten LacZ-Transduktionsbereichs innerhalb der Trachea bei Verwendung des Magneten (*p = 0,029, t-Test, n = 3 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM).
Mit Neutral Fast Red gefärbte Schnitte (Beispiel in der ergänzenden Abbildung 2) zeigten LacZ-gefärbte Zellen in einem ähnlichen Muster und an einer ähnlichen Stelle wie zuvor berichtet.
Eine zentrale Herausforderung für die Gentherapie der Atemwege bleibt die genaue Lokalisierung der Trägerpartikel in den gewünschten Regionen und das Erreichen einer hohen Transduktionseffizienz in der sich bewegenden Lunge bei vorhandenem Luftstrom und aktiver Schleimbeseitigung. Für LV-Träger, die zur Behandlung der Atemwegserkrankung CF entwickelt wurden, war die Verlängerung der Verweilzeit der Trägerpartikel in den leitenden Atemwegen bisher ein schwer erreichbares Ziel. Wie Castellani et al. hervorheben, bietet die Verwendung von Magnetfeldern zur Verbesserung der Transduktion Vorteile gegenüber anderen Methoden der Genübertragung, z. B. der Elektroporation, da sie Einfachheit, Kosteneffizienz, Übertragungslokalisierung, erhöhte Effizienz und kürzere Inkubationszeiten sowie möglicherweise eine geringere Trägerdosis kombinieren kann10. Die Ablagerung und das Verhalten magnetischer Partikel in vivo in den Atemwegen unter dem Einfluss externer magnetischer Kräfte wurden jedoch nie beschrieben, noch wurde die Durchführbarkeit dieser Methode zur Steigerung des Genexpressionsniveaus in intakten lebenden Atemwegen in vivo nachgewiesen.
Unsere In-vitro-Synchrotron-PCXI-Experimente zeigten, dass alle von uns getesteten Partikel, mit Ausnahme von Polystyrol-MP, in dem von uns verwendeten Bildgebungsaufbau sichtbar waren. In Gegenwart eines Magnetfelds bilden MPs Saiten, deren Länge von der Partikelart und der magnetischen Feldstärke abhängt (d. h. von der Nähe und Bewegung des Magneten). Wie in Abbildung 10 gezeigt, entstehen die von uns beobachteten Saiten dadurch, dass jedes einzelne Partikel magnetisiert wird und sein eigenes lokales Magnetfeld induziert. Diese separaten Felder bewirken, dass andere ähnliche Partikel sich aggregieren und verbinden, wobei sich die Gruppen aufgrund lokaler Kräfte, die von den lokalen Anziehungs- und Abstoßungskräften anderer Partikel herrühren, strangähnliche Bewegungen ausführen.
Schematische Darstellung (a,b) der in flüssigkeitsgefüllten Kapillaren erzeugten Partikelzüge und (c,d) der luftgefüllten Luftröhre. Beachten Sie, dass die Kapillaren und die Luftröhre nicht maßstabsgetreu dargestellt sind. Feld (a) enthält außerdem eine Beschreibung des MP, das in Ketten angeordnete Fe3O4-Partikel enthält.
Als der Magnet über die Kapillare bewegt wurde, erreichte der Winkel der Partikelkette einen kritischen Schwellenwert für MP3-5 mit Fe3O4. Danach blieb die Partikelkette nicht mehr an ihrer ursprünglichen Position, sondern bewegte sich entlang der Oberfläche zu einer neuen Position. Dieser Effekt tritt wahrscheinlich auf, weil die Oberfläche der Glaskapillare glatt genug ist, um diese Bewegung zu ermöglichen. Interessanterweise verhielt sich MP6 (CombiMag) nicht so, möglicherweise weil die Partikel kleiner waren, unterschiedliche Beschichtungen oder Oberflächenladungen aufwiesen oder eine proprietäre Trägerflüssigkeit ihre Bewegungsfähigkeit beeinträchtigte. Der Bildkontrast der CombiMag-Partikel ist ebenfalls schwächer, was darauf hindeutet, dass Flüssigkeit und Partikel ähnliche Dichten aufweisen und sich daher nicht leicht aufeinander zubewegen. Partikel können auch stecken bleiben, wenn sich der Magnet zu schnell bewegt, was darauf hindeutet, dass die magnetische Feldstärke die Reibung zwischen den Partikeln in der Flüssigkeit nicht immer überwinden kann. Dies legt nahe, dass es vielleicht nicht überraschend ist, dass die magnetische Feldstärke und der Abstand zwischen Magnet und Zielbereich sehr wichtig sind. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auch darauf hin, dass Magnete zwar viele MPs einfangen können, die durch den Zielbereich fließen, es aber unwahrscheinlich ist, dass Magnete kann sich darauf verlassen, dass CombiMag-Partikel entlang der Oberfläche der Luftröhre bewegt werden. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass in In-vivo-LV-MP-Studien statische Magnetfelder verwendet werden sollten, um bestimmte Bereiche des Atemwegsbaums physisch anzuvisieren.
Wenn Partikel in den Körper gelangen, sind sie im Kontext des komplexen, sich bewegenden Körpergewebes schwer zu identifizieren. Die Fähigkeit, sie zu erkennen, wurde jedoch verbessert, indem der Magnet horizontal über der Luftröhre verschoben wurde, um die MP-Fäden zu „wackeln“. Obwohl eine Bildgebung bei Live-Aufnahmen möglich ist, ist es einfacher, die Partikelbewegung zu erkennen, nachdem das Tier auf humane Weise getötet wurde. Die MP-Konzentrationen waren im Allgemeinen an dieser Stelle am höchsten, wenn der Magnet über dem Bildgebungsbereich positioniert war, obwohl einige Partikel normalerweise weiter entlang der Luftröhre gefunden wurden. Im Gegensatz zu In-vitro-Studien können Partikel durch die Verschiebung des Magneten nicht entlang der Luftröhre gezogen werden. Dieser Befund steht im Einklang damit, wie der Schleim, der die Oberfläche der Luftröhre bedeckt, eingeatmete Partikel normalerweise verarbeitet, indem er sie im Schleim einfängt und anschließend durch den mukoziliären Clearance-Mechanismus beseitigt.
Wir vermuteten, dass die Verwendung von Magneten zur Anziehung oberhalb und unterhalb der Trachea (Abb. 3b) zu einem gleichmäßigeren Magnetfeld führen könnte als ein an einem Punkt konzentriertes Magnetfeld, was möglicherweise zu einer gleichmäßigeren Partikelverteilung führt. Unsere vorläufige Studie lieferte jedoch keine eindeutigen Belege für diese Hypothese. Ebenso führte die Konfiguration eines Magnetpaars zur Abstoßung (Abb. 3c) nicht zu einer erhöhten Partikelablagerung im abgebildeten Bereich. Diese beiden Ergebnisse zeigen, dass der Aufbau mit zwei Magneten die lokale Kontrolle der MP-Zielerfassung nicht signifikant verbessert und dass die resultierenden starken Magnetkräfte schwierig zu konfigurieren sind, was diesen Ansatz weniger praktikabel macht. Ebenso führte die Ausrichtung des Magneten oberhalb und durch die Trachea (Abb. 3d) nicht zu einer erhöhten Anzahl der im abgebildeten Bereich zurückgehaltenen Partikel. Einige dieser alternativen Konfigurationen sind möglicherweise nicht erfolgreich, da sie zu geringeren Magnetfeldstärken im Ablagerungsbereich führen. Daher gilt die Konfiguration mit einem einzelnen 30-Grad-Winkelmagneten (Abbildung 3a) als die einfachste und effektivste effiziente Methode für In-vivo-Tests.
Die LV-MP-Studie zeigte, dass bei Kombination von LV-Vektoren mit CombiMag und Verabreichung nach physikalischer Störung in Gegenwart eines Magnetfelds die Transduktionsniveaus in der Trachea im Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöht waren. Basierend auf den Synchrotron-Bildgebungsstudien und den LacZ-Ergebnissen war das Magnetfeld offenbar in der Lage, den LV in der Trachea zu erhalten und die Anzahl der Vektorpartikel zu reduzieren, die sofort tief in die Lunge eindrangen. Solche Verbesserungen der Zielausrichtung können zu einer höheren Wirksamkeit führen und gleichzeitig die verabreichten Titer, die Off-Target-Transduktion, entzündliche und immunologische Nebenwirkungen sowie die Kosten für Genträger reduzieren. Wichtig ist, dass CombiMag laut Hersteller in Verbindung mit anderen Gentransfermethoden verwendet werden kann, darunter mit anderen viralen Vektoren (wie AAV) und Nukleinsäuren.