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Genvektoren zur Behandlung der Mukoviszidose-bedingten Lungenerkrankung sollten die leitenden Atemwege gezielt erreichen, da eine Transduktion in der peripheren Lunge keinen therapeutischen Nutzen bringt. Die Effizienz der viralen Transduktion korreliert direkt mit der Verweildauer des Vektors. Allerdings diffundieren Applikationsflüssigkeiten wie Genträger während der Inspiration natürlicherweise in die Alveolen, und therapeutische Partikel jeglicher Form werden rasch durch mukoziliäre Clearance entfernt. Eine Verlängerung der Verweildauer von Genträgern in den Atemwegen ist wichtig, aber schwer zu erreichen. Mit Genträgern konjugierte Magnetpartikel, die gezielt an die Oberfläche der Atemwege gerichtet werden können, können die regionale Zielgenauigkeit verbessern. Aufgrund der Herausforderungen der In-vivo-Visualisierung ist das Verhalten solch kleiner Magnetpartikel auf der Atemwegsoberfläche in Gegenwart eines angelegten Magnetfelds nur unzureichend erforscht. Ziel dieser Studie war es, die In-vivo-Bewegung einer Reihe von Magnetpartikeln in der Trachea anästhesierter Ratten mittels Synchrotron-Bildgebung zu visualisieren, um die Dynamik und Muster des Verhaltens einzelner und mehrerer Partikel in vivo zu untersuchen. Anschließend wurde auch untersucht, ob die Applikation lentiviraler Magnetpartikel in Gegenwart eines Magnetfelds die Wirksamkeit der Behandlung verbessert. Magnetfelder erhöhen die Transduktionseffizienz in der Rattentrachea. Synchrotron-Röntgenbildgebung zeigt das Verhalten magnetischer Partikel in stationären und bewegten Magnetfeldern in vitro und in vivo. Partikel lassen sich mit Magneten nicht ohne Weiteres über die Oberfläche der lebenden Atemwege ziehen; während des Transports konzentrieren sich die Ablagerungen jedoch im Sichtfeld, wo das Magnetfeld am stärksten ist. Die Transduktionseffizienz wurde zudem versechsfacht, wenn lentivirale Magnetpartikel in Gegenwart eines Magnetfelds verabreicht wurden. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass lentivirale Magnetpartikel und Magnetfelder vielversprechende Ansätze zur Verbesserung des Gen-Targetings und zur Steigerung der Transduktionsrate in den Atemwegen in vivo darstellen könnten.
Zystische Fibrose (CF) wird durch eine Variation in einem einzigen Gen, dem CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), verursacht. Das CFTR-Protein ist ein Ionenkanal, der in vielen Epithelzellen des Körpers vorkommt, darunter auch in den Atemwegen, einem Hauptort der CF-Pathogenese. CFTR-Defekte führen zu einem gestörten Wassertransport, wodurch die Atemwegsoberfläche austrocknet und die Tiefe der Atemwegsoberflächenflüssigkeit (ASL) abnimmt. Dies beeinträchtigt auch die Fähigkeit des mukoziliären Transportsystems (MCT), eingeatmete Partikel und Krankheitserreger aus den Atemwegen zu entfernen. Unser Ziel ist die Entwicklung einer lentiviralen (LV) Gentherapie, die die korrekte Kopie des CFTR-Gens einbringt und die ASL, das MCT und die Lungengesundheit verbessert. Zudem entwickeln wir kontinuierlich neue Technologien, die diese Parameter in vivo messen können.
LV-Vektoren zählen zu den vielversprechendsten Kandidaten für die Gentherapie der Atemwege bei Mukoviszidose, vor allem weil sie das therapeutische Gen dauerhaft in die basalen Zellen der Atemwege (Stammzellen der Atemwege) integrieren können. Dies ist wichtig, da diese Zellen durch Differenzierung in funktionelle, genkorrigierte, Mukoviszidose-assoziierte Oberflächenzellen der Atemwege die normale Hydratation und Schleimclearance wiederherstellen und so lebenslange Vorteile bieten können. LV-Vektoren sollten auf die leitenden Atemwege gerichtet werden, da dort die Mukoviszidose-bedingte Lungenerkrankung beginnt. Eine tiefere Applikation des Vektors in die Lunge kann zwar zu einer alveolären Transduktion führen, hat aber bei Mukoviszidose keinen therapeutischen Nutzen. Flüssigkeiten wie Genträger wandern jedoch nach der Applikation beim Einatmen auf natürliche Weise in die Alveolen^3,4, und therapeutische Partikel werden durch die mukokutane Clearance (MCT) schnell in die Mundhöhle entfernt. Die Transduktionseffizienz von LV-Vektoren hängt direkt mit der Verweildauer des Vektors in der Nähe der Zielzellen zusammen, die für die zelluläre Aufnahme notwendig ist – der sogenannten „Verweildauer“⁵. Diese wird durch den typischen regionalen Luftstrom sowie die koordinierte Partikelaufnahme durch Schleim und MCT leicht verkürzt. Für Mukoviszidose ist die Fähigkeit, die Verweildauer der LV-Vektoren zu verlängern, daher von entscheidender Bedeutung. Die Erzeugung einer hohen Transduktionsrate innerhalb der Atemwege ist wichtig, hat sich aber bisher als schwierig erwiesen.
Um dieses Hindernis zu überwinden, schlagen wir vor, dass LV-Magnetpartikel (MPs) auf zwei sich ergänzende Weisen helfen können. Erstens können sie magnetisch zur Oberfläche der Atemwege geleitet werden, um die Zielgenauigkeit zu verbessern und den Genträgerpartikeln zu helfen, sich im gewünschten Atemwegsbereich aufzuhalten; und zweitens können sie sich in die ASL (Atemwegsschleimhautschicht) bewegen, um in die Zellschicht 6 zu gelangen. MPs werden häufig als gezielte Wirkstoffträger eingesetzt, wenn sie an Antikörper, Chemotherapeutika oder andere kleine Moleküle binden, die sich an Zellmembranen anlagern oder an relevante Zelloberflächenrezeptoren binden und sich in Gegenwart statischer Elektrizität an Tumorstellen anreichern. Magnetfelder zur Krebsbehandlung 7. Andere „hyperthermische“ Techniken zielen darauf ab, Mikropartikel (MPs) durch Einwirkung oszillierender Magnetfelder zu erhitzen und dadurch Tumorzellen zu zerstören. Das Prinzip der magnetischen Transfektion, bei der ein Magnetfeld als Transfektionsmittel zur Verbesserung des DNA-Transfers in Zellen eingesetzt wird, wird häufig in vitro mit einer Reihe nicht-viraler und viraler Genvektoren für schwer transduzierbare Zelllinien angewendet. Die Wirksamkeit der LV-Magnetotransfektion wurde nachgewiesen: Die In-vitro-Übertragung von LV-MPs in eine humane Bronchialepithelzelllinie in Gegenwart eines statischen Magnetfelds steigerte die Transduktionseffizienz um das 186-Fache im Vergleich zum LV-Vektor allein. LV-MP wurde auch in einem In-vitro-CF-Modell eingesetzt, wo die magnetische Transfektion die LV-Transduktion in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen in Gegenwart von CF-Sputum um das 20-Fache erhöhte. Die In-vivo-Magnetotransfektion von Organen hat jedoch relativ wenig Beachtung gefunden und wurde nur in wenigen Tiermodellen untersucht. Studien11,12,13,14,15, insbesondere in der Lunge16,17. Dennoch sind die Möglichkeiten der magnetischen Transfektion in der CF-Lungentherapie klar. Tan et al. (2020) stellten fest, dass „eine Machbarkeitsstudie zur effizienten pulmonalen Verabreichung magnetischer Nanopartikel den Weg für zukünftige CFTR-Inhalationsstrategien ebnen wird, um die klinischen Ergebnisse bei CF-Patienten zu verbessern“6.
Das Verhalten kleiner magnetischer Partikel auf Atemwegsoberflächen in einem angelegten Magnetfeld ist schwer zu visualisieren und zu untersuchen und daher nur unzureichend verstanden. In anderen Studien entwickelten wir eine auf Synchrotronstrahlung basierende Phasenkontrast-Röntgenbildgebungsmethode (PB-PCXI), um minimale Veränderungen der ASL-Tiefe¹⁸ und des MCT-Verhaltens^19,20 in vivo nichtinvasiv zu visualisieren und zu quantifizieren. Dadurch lässt sich die Hydratation der Atemwegsoberfläche direkt messen und als Frühindikator für die Wirksamkeit einer Behandlung nutzen. Unsere MCT-Evaluierungsmethode verwendet zudem Partikel mit einem Durchmesser von 10–35 µm aus Aluminiumoxid oder hochbrechendem Glas als MCT-Marker, die mit PB-PCXI sichtbar gemacht werden können.²¹ Beide Techniken eignen sich zur Visualisierung verschiedener Partikeltypen, einschließlich Mikropartikeln.
Aufgrund ihrer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung eignen sich unsere PB-PCXI-basierten ASL- und MCT-Analysetechniken hervorragend zur Untersuchung der Dynamik und der Verhaltensmuster einzelner und mehrerer Partikel in vivo. Dies trägt zum Verständnis und zur Optimierung von MP-Gentransfertechniken bei. Der hier angewandte Ansatz basiert auf unseren Studien an der SPring-8 BL20B2-Beamline, in denen wir die Flüssigkeitsbewegung nach der Verabreichung einer Scheinvektordosis in die nasalen und pulmonalen Atemwege von Mäusen visualisierten. Dies hilft, die in unseren Tierstudien mit Genträgerdosen beobachteten uneinheitlichen Genexpressionsmuster zu erklären.
Ziel dieser Studie war es, mithilfe des Synchrotrons PB-PCXI die Bewegungen verschiedener Mikropartikel (MPs) in der Trachea lebender Ratten in vivo zu visualisieren. Die PB-PCXI-Bildgebungsstudien dienten dazu, unterschiedliche MPs, Magnetfeldstärken und Applikationsorte zu testen und deren Einfluss auf die MP-Bewegung zu bestimmen. Wir nahmen an, dass ein extern angelegtes Magnetfeld die applizierten MPs im Zielgebiet halten oder dorthin bewegen würde. Die Studien ermöglichten es uns außerdem, Magnetkonfigurationen zu identifizieren, die die Anzahl der nach der Deposition in der Trachea verbleibenden Partikel maximieren. In einer zweiten Studienreihe sollte diese optimale Konfiguration genutzt werden, um das Transduktionsmuster nach in-vivo-Applikation von LV-MPs in die Atemwege der Ratte zu demonstrieren. Dabei gingen wir davon aus, dass die gezielte Applikation von LV-MPs in den Atemwegen die LV-Transduktionseffizienz verbessern würde.
Alle Tierversuche wurden gemäß den von der Universität Adelaide (M-2019-060 und M-2020-022) und dem Ethikausschuss für Tierversuche des SPring-8 Synchrotrons genehmigten Protokollen durchgeführt. Die Experimente wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.
Alle Röntgenaufnahmen wurden an der Strahlführung BL20XU des Synchrotrons SPring-8 in Japan mit einem ähnlichen Aufbau wie zuvor beschrieben^21,22 durchgeführt. Kurz gesagt, befand sich die Experimentierbox 245 m vom Speicherring des Synchrotrons entfernt. Für Partikelbildgebungsstudien wurde ein Proben-Detektor-Abstand von 0,6 m und für In-vivo-Bildgebungsstudien zur Erzeugung von Phasenkontrasteffekten ein Abstand von 0,3 m verwendet. Es wurde eine monochromatische Strahlenergie von 25 keV eingesetzt. Die Bilder wurden mit einem hochauflösenden Röntgenkonverter (SPring-8 BM3) aufgenommen, der an einen sCMOS-Detektor gekoppelt war. Der Konverter wandelt Röntgenstrahlen mithilfe eines 10 µm dicken Szintillators (Gd₃Al₂Ga₃O₁₂) in sichtbares Licht um, das anschließend mit einem 10-fach vergrößernden Mikroskopobjektiv (NA 0,3) auf einen sCMOS-Sensor gerichtet wird. Der sCMOS-Detektor war ein Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) mit einem Array. Die Bildauflösung beträgt 2048 × 2048 Pixel, die Rohpixelgröße 6,5 × 6,5 µm. Diese Konfiguration ergibt eine effektive isotrope Pixelgröße von 0,51 µm und ein Sichtfeld von ca. 1,1 mm × 1,1 mm. Eine Belichtungszeit von 100 ms wurde gewählt, um das Signal-Rausch-Verhältnis magnetischer Partikel innerhalb und außerhalb der Atemwege zu maximieren und gleichzeitig atembedingte Bewegungsartefakte zu minimieren. Für In-vivo-Studien wurde ein schneller Röntgenverschluss im Strahlengang platziert, um die Strahlendosis durch Blockieren des Röntgenstrahls zwischen den Aufnahmen zu begrenzen.
Der LV-Träger wurde in keiner der SPring-8 PB-PCXI-Bildgebungsstudien verwendet, da die BL20XU-Bildgebungskammer nicht nach Biosicherheitsstufe 2 zertifiziert ist. Stattdessen wählten wir eine Reihe gut charakterisierter Mikropartikel (MPs) von zwei kommerziellen Anbietern aus – mit unterschiedlichen Größen, Materialien, Eisenkonzentrationen und Anwendungsbereichen –, um zunächst zu verstehen, wie Magnetfelder die Bewegung von MPs in Glaskapillaren und anschließend in lebenden Atemwegen beeinflussen. Auf der Oberfläche befinden sich Mikropartikel (MPs) mit einer Größe von 0,25 bis 18 μm. Sie bestehen aus verschiedenen Materialien (siehe Tabelle 1), wobei die genaue Zusammensetzung der einzelnen Proben, einschließlich der Größe der magnetischen Partikel innerhalb der MPs, unbekannt ist. Basierend auf unseren umfangreichen MCT-Studien^{19, 20, 21, 23, 24} gehen wir davon aus, dass MPs mit einer Größe von nur 5 μm auf der Oberfläche der Trachea sichtbar sind, beispielsweise durch Subtraktion aufeinanderfolgender Bilder, um die Bewegung der MPs besser sichtbar zu machen. Ein einzelnes 0,25 μm großes MP ist kleiner als die Auflösung des Bildgebungsgeräts. Es wird jedoch erwartet, dass PB-PCXI den Volumenkontrast dieser Partikel sowie die Bewegung der Oberflächenflüssigkeit, auf der sie sich abgelagert haben, nach der Ablagerung erfassen kann.
Die Proben für jedes in Tabelle 1 aufgeführte Mikropartikel (MP) wurden in 20 µl Glaskapillaren (Drummond Microcaps, PA, USA) mit einem Innendurchmesser von 0,63 mm präpariert. Korpuskulare Partikel sind in Wasser, CombiMag-Partikel in der herstellereigenen Flüssigkeit erhältlich. Jedes Röhrchen wurde zur Hälfte mit Flüssigkeit (ca. 11 µl) gefüllt und auf den Probenhalter gesetzt (siehe Abbildung 1). Die Glaskapillaren wurden horizontal auf dem Probentisch im Bildgebungsraum platziert, wobei die Flüssigkeitsränder ausgerichtet wurden. Ein 19 mm durchmessender (28 mm langer) Nickel-Neodym-Eisen-Bor-Magnet (NdFeB) (N35, Kat.-Nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) mit einer Remanenzmagnetisierung von 1,17 Tesla wurde an einem separaten Translationstisch befestigt, um seine Position während der Bildgebung ferngesteuert zu verändern. Die Röntgenbildaufnahme begann, sobald sich der Magnet ca. 30 mm über der Probe befand. Es wurden 4 Bilder pro Sekunde aufgenommen. zweitens wurde während der Bildgebung der Magnet nahe an das Glaskapillarröhrchen herangeführt (etwa 1 mm Abstand) und dann entlang des Röhrchens verschoben, um die Auswirkungen der Feldstärke und der Position zu beurteilen.
In-vitro-Bildgebungsaufbau mit MP-Proben in Glaskapillaren auf dem xy-Translationstisch der Probe. Der Pfad des Röntgenstrahls ist mit einer roten gestrichelten Linie markiert.
Nachdem die Sichtbarkeit von Mikropartikeln (MPs) in vitro nachgewiesen war, wurde eine Untergruppe davon in vivo an weiblichen, etwa 12 Wochen alten, etwa 200 g schweren, albinotischen Wistar-Ratten vom Wildtyp getestet. Die Ratten wurden mit einer Mischung aus 0,24 mg/kg Medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg Midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) und 4 mg/kg Butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma, Japan) intraperitoneal anästhesiert. Nach der Anästhesie wurden die Tiere für die Bildgebung vorbereitet, indem das Fell um die Trachea entfernt, ein Endotrachealtubus (ET; 16Ga-i.v.-Kanüle, Terumo BCT) eingeführt und die Tiere in Rückenlage auf einer speziell angefertigten Bildgebungsplatte mit einem Wärmekissen zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur fixiert wurden. Die Bildgebungsplatte wurde anschließend in einem leichten Winkel an der Probenpositionierplattform der Bildgebungsbox befestigt, um die Trachea horizontal auszurichten. das Röntgenbild, wie in Abbildung 2a dargestellt.
(a) In-vivo-Bildgebungsaufbau in der SPring-8-Bildgebungsbox; der Strahlengang des Röntgenstrahls ist mit einer roten gestrichelten Linie markiert. (b, c) Die Magnetpositionierung an der Trachea erfolgte ferngesteuert mithilfe zweier orthogonal montierter IP-Kameras. Auf der linken Seite des Bildschirmbildes sind die Drahtschlinge zur Fixierung des Kopfes und die im Endotrachealtubus positionierte Applikationskanüle zu sehen.
Ein ferngesteuertes Spritzenpumpensystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mit einer 100-µl-Glasspritze wurde über eine 30-G-Kanüle an einen PE10-Schlauch (Außendurchmesser 0,61 mm, Innendurchmesser 0,28 mm) angeschlossen. Der Schlauch wurde markiert, um sicherzustellen, dass sich die Spitze beim Einführen des Endotrachealtubus in der korrekten Position in der Trachea befindet. Mithilfe der Mikropumpe wurde der Spritzenkolben zurückgezogen, während die Schlauchspitze in die zu verabreichende Mikropartikelprobe eingetaucht war. Der beladene Applikationsschlauch wurde anschließend in den Endotrachealtubus eingeführt, wobei sich die Spitze im stärksten Bereich des erwarteten Magnetfelds befand. Die Bildaufnahme wurde mithilfe eines an unsere Arduino-basierte Zeitschaltuhr angeschlossenen Atmungsdetektors gesteuert. Alle Signale (z. B. Temperatur, Atmung, Öffnen/Schließen des Verschlusses und Bildaufnahme) wurden mit Powerlab und LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) aufgezeichnet. Bei unzugänglicher Umgebung wurden zwei IP-Kameras (Panasonic BB-SC382) in einem Abstand von ca. 2,5 Metern positioniert. Die Magnete standen in einem Winkel von 90° zueinander und dienten dazu, die Position des Magneten relativ zur Trachea während der Bildgebung zu überwachen (Abb. 2b,c). Um Bewegungsartefakte zu minimieren, wurde während des endexspiratorischen Flussplateaus pro Atemzug ein Bild aufgenommen.
Ein Magnet ist an einer zweiten Stufe befestigt, die außerhalb des Bildgebungsgehäuses positioniert werden kann. Verschiedene Magnetpositionen und -konfigurationen wurden getestet, darunter: Montage in einem Winkel von ca. 30° über der Trachea (Konfigurationen in Abb. 2a und 3a); ein Magnet oberhalb und der andere unterhalb des Tieres, wobei sich die Pole anziehen (Abb. 3b); ein Magnet oberhalb und der andere unterhalb des Tieres, wobei sich die Pole abstoßen (Abb. 3c); und ein Magnet oberhalb und senkrecht zur Trachea (Abb. 3d). Sobald Tier und Magnet positioniert und das zu testende Mikropartikel (MP) in die Spritzenpumpe geladen ist, wird eine Dosis von 50 μl mit einer Flussrate von 4 μl/s verabreicht, während gleichzeitig Bilder aufgenommen werden. Der Magnet wird dann entlang oder seitlich über die Trachea hin und her bewegt, während weiterhin Bilder aufgenommen werden.
Magnetkonfiguration für die In-vivo-Bildgebung: (a) ein einzelner Magnet oberhalb der Trachea in einem Winkel von ca. 30°, (b) zwei anziehende Magnete, (c) zwei abstoßende Magnete, (d) ein einzelner Magnet oberhalb und senkrecht zur Trachea. Der Beobachter blickte vom Mund durch die Trachea in die Lunge, wobei der Röntgenstrahl die linke Seite der Ratte durchdrang und auf der rechten Seite wieder austrat. Der Magnet wurde entweder entlang der Atemwege oder links und rechts oberhalb der Trachea in Richtung des Röntgenstrahls bewegt.
Wir wollten außerdem die Sichtbarkeit und das Verhalten von Partikeln in den Atemwegen ohne störende Atem- und Herzbewegungen bestimmen. Daher wurden die Tiere am Ende der Bildgebungsphase aufgrund einer Pentobarbital-Überdosis (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg i.p.) tierschutzgerecht getötet. Einige Tiere verblieben auf der Bildgebungsplattform. Sobald Atmung und Herzschlag aussetzten, wurde die Bildgebung wiederholt und eine zusätzliche Dosis Mikroplastik (MP) hinzugefügt, falls keine MP auf der Atemwegsoberfläche sichtbar waren.
Die aufgenommenen Bilder wurden einer Flat-Field- und Dark-Field-Korrektur unterzogen und anschließend mithilfe eines eigens in MATLAB (R2020a, The Mathworks) geschriebenen Skripts zu einem Film zusammengesetzt (20 Bilder pro Sekunde; 15-25 × normale Geschwindigkeit abhängig von der Atemfrequenz).
Alle Studien zur LV-Genvektor-Übertragung wurden in der Versuchstierhaltung der Universität Adelaide durchgeführt und zielten darauf ab, anhand der Ergebnisse des SPring-8-Experiments zu beurteilen, ob die LV-MP-Übertragung in Gegenwart eines Magnetfelds den Gentransfer in vivo verbessern kann. Um die Effekte von MP und Magnetfeld zu untersuchen, wurden zwei Tiergruppen behandelt: Einer Gruppe wurde LV-MP mit einem platzierten Magneten verabreicht, die andere Gruppe erhielt als Kontrollgruppe LV-MP ohne Magneten.
LV-Genvektoren wurden nach zuvor beschriebenen Methoden^25,26 hergestellt. Der LacZ-Vektor exprimiert das nukleär lokalisierte β-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle des konstitutiven MPSV-Promotors (LV-LacZ). In transduzierten Zellen entsteht dadurch ein blaues Reaktionsprodukt, das in Lungengewebefronten und -schnitten sichtbar ist. Die Titration erfolgte in Zellkulturen durch manuelles Auszählen der LacZ-positiven Zellen mit einer Zählkammer, um den Titer in TU/ml zu berechnen. Die Vektoren werden bei -80 °C kryokonserviert, vor Gebrauch aufgetaut und durch Mischen im Verhältnis 1:1 und Inkubation auf Eis für mindestens 30 Minuten vor der Applikation an CombiMag gebunden.
Normale Sprague-Dawley-Ratten (n = 3/Gruppe, ca. 2–3 Tiere im Alter von einem Monat) wurden intraperitoneal mit einer Mischung aus 0,4 mg/kg Medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) und 60 mg/kg Ketamin (Ilium, Australien) anästhesiert und erhielten eine nicht-chirurgische orale Kanülierung mit einer 16-Ga-i.v.-Kanüle. Um sicherzustellen, dass das Trachealgewebe die LV-Transduktion empfängt, wurde es mit unserem zuvor beschriebenen mechanischen Perturbationsprotokoll konditioniert. Dabei wurde die Trachealoberfläche axial mit einem Drahtkorb (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115 – UDH, Cook Medical, USA) 30 Sekunden lang abgerieben. Die tracheale Verabreichung von LV-MP erfolgte dann in einer Sicherheitswerkbank etwa 10 Minuten nach der Perturbation.
Das in diesem Experiment verwendete Magnetfeld wurde analog zur In-vivo-Röntgenbildgebungsstudie konfiguriert, wobei dieselben Magnete mithilfe von Destillationsstent-Clips über der Trachea fixiert wurden (Abbildung 4). Ein Volumen von 50 μl (2 × 25 μl-Aliquote) LV-MP wurde, wie bereits beschrieben, mit einer Pipette mit Gelspitze in die Trachea (n = 3 Tiere) injiziert. Eine Kontrollgruppe (n = 3 Tiere) erhielt die gleichen LV-MP ohne Magnet. Nach Abschluss der Infusion wurde die Kanüle aus dem Endotrachealtubus entfernt und das Tier extubiert. Der Magnet verblieb 10 Minuten lang in situ und wurde anschließend entfernt. Ratten erhielten eine subkutane Dosis Meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australien), gefolgt von der Aufhebung der Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von 1 mg/kg Atipamazolhydrochlorid (Antisedan, Zoetis, Australien). Die Ratten wurden warmgehalten und Überwachung bis zur vollständigen Erholung von der Narkose.
LV-MP-Applikationsgerät in einer Sicherheitswerkbank. Der hellgraue Luer-Anschluss des Endotrachealtubus ist zu sehen, wie er aus dem Mund herausragt, und die Gelspitze der abgebildeten Pipette wird durch den Endotrachealtubus bis zur gewünschten Tiefe in die Trachea eingeführt.
Eine Woche nach der LV-MP-Gabe wurden die Tiere tierschutzgerecht durch 100%ige CO₂-Inhalation getötet. Die LacZ-Expression wurde mittels unserer Standard-X-Gal-Behandlung analysiert. Die drei kaudalsten Knorpelringe wurden entfernt, um mechanische Schäden oder Flüssigkeitsretention durch die endotracheale Tubusplatzierung auszuschließen. Jede Trachea wurde längs halbiert und in einer mit Silikonkautschuk (Sylgard, Dow Inc.) gefüllten Schale fixiert. Zur Visualisierung der Luminaloberfläche wurde eine Minutien-Nadel (Fine Science Tools) verwendet. Verteilung und Muster der transduzierten Zellen wurden frontal mit einem Nikon-Mikroskop (SMZ1500) mit DigiLite-Kamera und TCapture-Software (Tucsen Photonics, China) fotografiert. Die Aufnahmen erfolgten mit 20-facher Vergrößerung (maximale Vergrößerung über die gesamte Tracheenbreite). Die gesamte Trachea wurde schrittweise abgebildet, wobei eine ausreichende Überlappung der einzelnen Bilder gewährleistet war. Die Bilder jeder Trachea wurden anschließend mithilfe des Image Composite Editors v2.0.3 (Microsoft Research) und eines Planarbewegungsalgorithmus zu einem einzigen Bild zusammengefügt. Die LacZ-Expressionsbereiche in den zusammengesetzten Bildern der Trachea jedes Tieres wurden, wie bereits beschrieben, mithilfe eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) quantifiziert. Dabei wurden die Einstellungen 0,35 < Farbton < 0,58, Sättigung > 0,15 und Helligkeit < 0,7 verwendet. Durch Nachzeichnen der Gewebekonturen wurde in GIMP v2.10.24 für jedes zusammengesetzte Bild manuell eine Maske erstellt, um den Gewebebereich zu identifizieren und Fehldetektionen außerhalb des Trachealgewebes zu vermeiden. Die gefärbten Bereiche aller zusammengesetzten Bilder jedes Tieres wurden summiert, um die gesamte gefärbte Fläche für dieses Tier zu ermitteln. Die gefärbte Fläche wurde anschließend durch die Gesamtfläche der Maske dividiert, um die normalisierte Fläche zu erhalten.
Jede Trachea wurde in Paraffin eingebettet und in 5 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden 5 Minuten lang mit Neutral Fast Red gegengefärbt und die Bilder mit einem Nikon Eclipse E400 Mikroskop, einer DS-Fi3 Kamera und der NIS Element Capture Software (Version 5.20.00) aufgenommen.
Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt. Die Normalverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test überprüft, und Unterschiede in der LacZ-Färbung wurden mit dem ungepaarten t-Test untersucht.
Die sechs in Tabelle 1 beschriebenen Mikropartikel (MP) wurden mit PCXI untersucht, die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Zwei Polystyrol-MP (MP1 und MP2; 18 μm bzw. 0,25 μm) waren unter PCXI nicht sichtbar, die übrigen Proben jedoch identifizierbar (Beispiele siehe Abbildung 5). MP3 und MP4 (10–15 % Fe₃O₄; 0,25 μm bzw. 0,9 μm) waren schwach sichtbar. Obwohl MP5 (98 % Fe₃O₄; 0,25 μm) einige der kleinsten getesteten Partikel enthielt, war es am deutlichsten sichtbar. Das CombiMag-Produkt MP6 war schwer zu erkennen. In allen Fällen verbesserte sich unsere Fähigkeit, die MP zu detektieren, deutlich durch Hin- und Herbewegen des Magneten parallel zur Kapillare. Bei Entfernung des Magneten von der Kapillare bildeten die Partikel lange Ketten, bei Annäherung des Magneten und zunehmender Magnetfeldstärke verkürzten sich diese Ketten. Während die Partikel zur Oberfläche der Kapillare wanderten (siehe ergänzendes Video S1: MP4), erhöhte sich die Partikeldichte an der Oberfläche. Umgekehrt verringerte sich die Feldstärke, als der Magnet aus der Kapillare entfernt wurde, und die Magnetpartikel ordneten sich zu langen Ketten an, die von der Oberseite der Kapillare ausgingen (siehe ergänzendes Video S2: MP4). Nachdem der Magnet zum Stillstand gekommen war, bewegten sich die Partikel noch kurze Zeit weiter, nachdem sie ihre Gleichgewichtsposition erreicht hatten. Während sich die Magnetpartikel zur Oberfläche der Kapillare hin und von ihr weg bewegten, zogen sie typischerweise die Ablagerungen durch die Flüssigkeit.
Die Sichtbarkeit von MP unter PCXI variiert deutlich zwischen den Proben. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6. Alle hier gezeigten Bilder wurden mit einem Magneten aufgenommen, der sich ca. 10 mm direkt über der Kapillare befand. Die scheinbar großen Kreise stellen in den Kapillaren eingeschlossene Luftblasen dar, die die Schwarz-Weiß-Konturen der Phasenkontrastbildgebung deutlich zeigen. Der rote Rahmen markiert die kontrastverstärkende Vergrößerung. Die Durchmesser der Magneten in allen Abbildungen sind nicht maßstabsgetreu und etwa 100-mal größer als dargestellt.
Während der Magnet entlang der Oberseite der Kapillare nach links und rechts bewegt wird, ändert sich der Winkel der Mikropartikelkette (MP-Kette) entsprechend dem Magneten (siehe Abbildung 6), wodurch die Magnetfeldlinien sichtbar werden. Bei MP3-5 werden die Partikel, sobald die Kette einen Schwellenwert erreicht, entlang der Kapillaroberfläche mitgezogen. Dies führt häufig dazu, dass sich die Mikropartikel in größeren Gruppen in der Nähe der stärksten Magnetfelder zusammenballen (siehe ergänzendes Video S3:MP5). Dieser Effekt ist besonders deutlich bei Aufnahmen nahe dem Kapillarende zu beobachten, da sich die Mikropartikel dort an der Flüssigkeits-Luft-Grenzfläche ansammeln und konzentrieren. Die Partikel in MP6, die schwieriger zu erkennen waren als MP3-5, wurden nicht mitgezogen, als der Magnet entlang der Kapillare bewegt wurde. Stattdessen lösten sich die Mikropartikelketten auf, sodass die Partikel im Sichtfeld verblieben (siehe ergänzendes Video S4:MP6). In einigen Fällen, wenn das angelegte Magnetfeld durch Verschieben des Magneten in größere Entfernung vom Aufnahmeort reduziert wurde, sanken die verbleibenden Mikropartikel langsam durch die Schwerkraft auf den Boden des Röhrchens, blieben aber in der Kette erhalten (siehe ergänzendes Video). S5: MP3).
Der Winkel der MP-Fassung ändert sich, wenn der Magnet oberhalb der Kapillare nach rechts bewegt wird. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6. Der rote Rahmen enthält die kontrastverstärkende Vergrößerung. Die ergänzenden Videos sind aufschlussreich, da sie wichtige Informationen zur Partikelstruktur und -dynamik liefern, die in diesen statischen Bildern nicht sichtbar sind.
Unsere Tests zeigten, dass die langsame Vor- und Zurückbewegung des Magneten entlang der Trachea die Visualisierung von Mikropartikeln (MP) im Kontext komplexer Bewegungen in vivo erleichtert. In-vivo-Tests wurden nicht durchgeführt, da Polystyrolkügelchen (MP1 und MP2) in den Kapillaren nicht sichtbar waren. Die verbleibenden vier MP wurden in vivo getestet, wobei die Längsachse des Magneten oberhalb der Trachea in einem Winkel von ca. 30° zur Vertikalen positioniert war (siehe Abbildungen 2b und 3a). Dies führte zu längeren MP-Ketten und war effektiver als die Konfiguration mit dem Magneten am Ende der Trachea. MP3, MP4 und MP6 wurden in der Trachea von keinem lebenden Tier nachgewiesen. Bei der Bildgebung der Atemwege von Ratten nach deren Tötung blieben die Partikel selbst nach Zugabe von Flüssigkeit mittels einer Spritzenpumpe unsichtbar. MP5 wies den höchsten Eisenoxidgehalt auf und war das einzige sichtbare Partikel. Daher wurde es zur Beurteilung und Charakterisierung des In-vivo-Verhaltens von MP verwendet.
Die Platzierung des Magneten über der Trachea während der Mikropartikel-Applikation führte dazu, dass viele, aber nicht alle Mikropartikel im Sichtfeld konzentriert wurden. Partikel, die in die Trachea gelangen, lassen sich am besten an human getöteten Tieren beobachten. Abbildung 7 und ergänzendes Video S6: MP5 zeigen die schnelle magnetische Erfassung und Ausrichtung von Partikeln auf der Oberfläche der ventralen Trachea, was darauf hindeutet, dass Mikropartikel gezielt in die gewünschten Bereiche der Trachea gelenkt werden können. Bei der Untersuchung distalerer Abschnitte der Trachea nach der Mikropartikel-Applikation wurden einige Mikropartikel näher an der Carina gefunden. Dies lässt vermuten, dass die Magnetfeldstärke nicht ausreichte, um alle Mikropartikel zu erfassen und zurückzuhalten, da diese während des Flüssigkeitstransports durch den Bereich maximaler Magnetfeldstärke transportiert wurden. Dennoch waren die Mikropartikelkonzentrationen postpartal im Bereich der Abbildung höher, was darauf schließen lässt, dass viele Mikropartikel in den Atemwegsbereichen verblieben, in denen die angelegte Magnetfeldstärke am höchsten war.
Abbildungen (a) vor und (b) nach der Applikation von MP5 in die Trachea einer kürzlich euthanasierten Ratte. Der Magnet befand sich direkt über dem Bildgebungsbereich. Der abgebildete Bereich liegt zwischen den beiden Knorpelringen. Vor der MP-Applikation befand sich etwas Flüssigkeit in den Atemwegen. Der rote Rahmen markiert die kontrastverstärkende Vergrößerung. Diese Bilder stammen aus dem Video im Zusatzmaterial S6:MP5.
Die Bewegung des Magneten entlang der Trachea in vivo führte zu einer Winkeländerung der Mikropartikelkette (MP-Kette) an der Atemwegsoberfläche, ähnlich wie in Kapillaren (siehe Abbildung 8 und ergänzendes Video S7:MP5). In unserer Studie konnten die Mikropartikel jedoch nicht wie in Kapillaren über die Oberfläche der lebenden Atemwege gezogen werden. In einigen Fällen verlängerte sich die MP-Kette bei seitlicher Bewegung des Magneten. Interessanterweise stellten wir außerdem fest, dass die Partikelkette die Tiefe der Oberflächenflüssigkeitsschicht zu verändern scheint, wenn der Magnet längs entlang der Trachea bewegt wird, und sich ausdehnt, wenn der Magnet direkt über dem Patienten positioniert und die Partikelkette in eine vertikale Position gedreht wird (siehe ergänzendes Video S7). (MP5 bei 0:09, unten rechts). Das charakteristische Bewegungsmuster änderte sich, als der Magnet seitlich über die Trachea geführt wurde (d. h. links oder rechts vom Tier und nicht längs der Trachea). Die Partikel waren während ihrer Bewegung weiterhin deutlich sichtbar, doch als der Magnet von der Trachea entfernt wurde, wurden die Spitzen der Partikelstränge sichtbar (siehe ergänzendes Video S8:MP5, ab 0:08). Dies stimmt mit dem MP-Verhalten überein, das wir in einer Glaskapillare unter einem angelegten Magnetfeld beobachtet haben.
Beispielbilder zeigen MP5 in der Trachea einer lebenden, narkotisierten Ratte. (a) Der Magnet wird verwendet, um Bilder oberhalb und links der Trachea aufzunehmen, (b) nachdem der Magnet nach rechts bewegt wurde. Der rote Rahmen markiert die kontrastverstärkende Vergrößerung. Diese Bilder stammen aus dem Video im Zusatzvideo S7:MP5.
Wenn die beiden Pole in Nord-Süd-Richtung ober- und unterhalb der Trachea angeordnet waren (d. h. anziehend; Abb. 3b), erschienen die MP-Sehnen länger und befanden sich an der Seitenwand der Trachea anstatt auf der dorsalen Trachealoberfläche (siehe ergänzendes Video S9:MP5). Hohe Partikelkonzentrationen an einem einzelnen Ort (d. h. auf der dorsalen Oberfläche der Trachea) wurden jedoch nach der Flüssigkeitsapplikation nicht beobachtet, wenn ein Zwei-Magnet-Gerät verwendet wurde, was typischerweise bei Verwendung eines Ein-Magnet-Geräts auftritt. Wurde dann ein Magnet so konfiguriert, dass er die Pole abstieß, wobei die Pole umgekehrt waren (Abb. 3c), schien die Anzahl der im Sichtfeld sichtbaren Partikel nach der Applikation nicht zuzunehmen. Der Aufbau beider Zwei-Magnet-Konfigurationen ist aufgrund der hohen Magnetfeldstärken, die die Magnete anziehen bzw. abstoßen, anspruchsvoll. Der Aufbau wurde dann auf einen einzelnen Magneten geändert, der parallel zu den Atemwegen verlief, diese jedoch im 90°-Winkel durchquerte, sodass die Feldlinien die Trachealwand orthogonal kreuzten (Abb. 3). 3d) wurde eine Ausrichtung gewählt, um festzustellen, ob eine Partikelaggregation an der Seitenwand beobachtet werden kann. In dieser Konfiguration war jedoch keine Bewegung der MP-Ansammlung oder des Magneten erkennbar. Basierend auf all diesen Ergebnissen wurde für In-vivo-Studien mit Genträgern eine Konfiguration mit einem einzelnen Magneten und einer 30-Grad-Ausrichtung (Abbildung 3a) gewählt.
Als das Tier unmittelbar nach der tierschutzgerechten Tötung wiederholt bildgebend untersucht wurde, ermöglichte das Fehlen störender Gewebebewegungen die Erkennung feinerer und kürzerer Partikellinien im klaren interchondralen Feld, die sich in Richtung der translatorischen Bewegung des Magneten „zitternd“ bewegten. Dennoch lassen sich die Anwesenheit und Bewegung von MP6-Partikeln weiterhin nicht eindeutig feststellen.
Der LV-LacZ-Titer betrug 1,8 × 10⁸ TU/ml. Nach 1:1-Mischung mit CombiMag MP (MP6) erhielten die Tiere eine tracheale Dosis von 50 μl LV-Vehikel (9 × 10⁷ TU/ml; d. h. 4,5 × 10⁶ TU/Ratte). In diesen Studien wurde der Magnet während der Wehen nicht bewegt, sondern fixiert, um zu bestimmen, ob die LV-Transduktion (a) im Vergleich zur Vektorapplikation ohne Magnetfeld verbessert und (b) auf magnetische Zielregionen der oberen Atemwege fokussiert werden kann.
Die Anwesenheit von Magneten und die Verwendung von CombiMag in Kombination mit LV-Vektoren schienen, ebenso wie unser Standardprotokoll zur LV-Vektor-Applikation, keine negativen Auswirkungen auf die Tiergesundheit zu haben. Frontale Aufnahmen der mechanisch belasteten Trachealregion (Ergänzende Abb. 1) zeigten signifikant höhere Transduktionsraten in der mit LV-MP behandelten Tiergruppe in Anwesenheit eines Magneten (Abb. 9a). In der Kontrollgruppe war lediglich eine geringe blaue LacZ-Färbung zu beobachten (Abb. 9b). Die Quantifizierung der normalisierten X-Gal-gefärbten Bereiche ergab, dass die Verabreichung von LV-MP in einem Magnetfeld eine etwa sechsfache Verbesserung bewirkte (Abb. 9c).
Beispielhafte zusammengesetzte Bilder, die die tracheale Transduktion mittels LV-MP zeigen (a) in Gegenwart eines Magnetfelds und (b) in Abwesenheit eines Magneten. (c) Statistisch signifikante Verbesserung der normalisierten LacZ-Transduktionsfläche innerhalb der Trachea bei Verwendung des Magneten (*p = 0,029, t-Test, n = 3 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM).
In mit Neutral Fast Red gefärbten Schnitten (Beispiel siehe Ergänzungsabbildung 2) waren LacZ-gefärbte Zellen in einem ähnlichen Muster und an einer ähnlichen Stelle wie zuvor berichtet zu sehen.
Eine zentrale Herausforderung für die Gentherapie der Atemwege ist nach wie vor die präzise Lokalisierung von Trägerpartikeln in den Zielregionen und die Erzielung einer hohen Transduktionseffizienz in der sich bewegenden Lunge unter Berücksichtigung des Luftstroms und der aktiven Schleimclearance. Für LV-Träger, die zur Behandlung der Atemwegserkrankung bei Mukoviszidose entwickelt wurden, war die Verlängerung der Verweildauer der Trägerpartikel in den Atemwegen bisher ein schwer erreichbares Ziel. Wie Castellani et al. zeigten, bietet die Verwendung von Magnetfeldern zur Verbesserung der Transduktion Vorteile gegenüber anderen Gentransfermethoden wie der Elektroporation, da sie Einfachheit, Kosteneffizienz, gezielte Applikation, erhöhte Effizienz und kürzere Inkubationszeiten sowie möglicherweise eine geringere Trägerdosis ermöglicht.¹⁰ Die In-vivo-Ablagerung und das Verhalten magnetischer Partikel in den Atemwegen unter dem Einfluss externer Magnetfelder wurden jedoch bisher nicht beschrieben, und die Machbarkeit dieser Methode zur Steigerung der Genexpression in intakten, lebenden Atemwegen wurde in vivo noch nicht nachgewiesen.
Unsere In-vitro-Synchrotron-PCXI-Experimente zeigten, dass alle getesteten Partikel, mit Ausnahme von Polystyrol-Mikropartikeln, in dem verwendeten Bildgebungsaufbau sichtbar waren. In einem Magnetfeld bilden die Mikropartikel Ketten, deren Länge vom Partikeltyp und der Magnetfeldstärke (d. h. der Nähe und Bewegung des Magneten) abhängt. Wie in Abbildung 10 dargestellt, entstehen die beobachteten Ketten dadurch, dass jedes einzelne Partikel magnetisiert wird und ein eigenes lokales Magnetfeld induziert. Diese einzelnen Felder bewirken, dass sich andere ähnliche Partikel aggregieren und verbinden, wodurch gruppenartige, kettenartige Bewegungen aufgrund lokaler Anziehungs- und Abstoßungskräfte zwischen den Partikeln entstehen.
Schematische Darstellung von (a, b) Partikelketten in flüssigkeitsgefüllten Kapillaren und (c, d) luftgefüllter Trachea. Die Kapillaren und die Trachea sind nicht maßstabsgetreu dargestellt. Abbildung (a) enthält außerdem eine Beschreibung des Partikelkomplexes (MP), der aus kettenförmig angeordneten Fe3O4-Partikeln besteht.
Als der Magnet über die Kapillare bewegt wurde, erreichte der Winkel der Partikelkette für MP3-5 mit Fe3O4 einen kritischen Schwellenwert. Danach blieb die Partikelkette nicht mehr an ihrer ursprünglichen Position, sondern bewegte sich entlang der Oberfläche zu einer neuen Position. Dieser Effekt tritt wahrscheinlich auf, weil die Oberfläche der Glaskapillare glatt genug ist, um diese Bewegung zu ermöglichen. Interessanterweise verhielt sich MP6 (CombiMag) nicht so, möglicherweise weil die Partikel kleiner waren, andere Beschichtungen oder Oberflächenladungen aufwiesen oder eine spezielle Trägerflüssigkeit ihre Beweglichkeit beeinträchtigte. Der Bildkontrast der CombiMag-Partikel ist ebenfalls schwächer, was darauf hindeutet, dass Flüssigkeit und Partikel ähnliche Dichten aufweisen und sich daher nicht so leicht aufeinander zubewegen. Partikel können auch haften bleiben, wenn sich der Magnet zu schnell bewegt. Dies zeigt, dass die Magnetfeldstärke nicht immer die Reibung zwischen den Partikeln in der Flüssigkeit überwinden kann. Daher ist es vielleicht nicht überraschend, dass die Magnetfeldstärke und der Abstand zwischen Magnet und Zielbereich von großer Bedeutung sind. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auch darauf hin, dass Magnete zwar viele Mikropartikel einfangen können, die durch den Zielbereich strömen, es aber unwahrscheinlich ist, dass Magnete … kann als zuverlässig angesehen werden, um CombiMag-Partikel entlang der Oberfläche der Trachea zu bewegen. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass in vivo LV-MP-Studien statische Magnetfelder verwenden sollten, um bestimmte Bereiche der Atemwege gezielt anzusteuern.
Gelangen Partikel in den Körper, sind sie im Kontext des komplexen, sich bewegenden Gewebes schwer zu identifizieren. Die Detektion konnte jedoch verbessert werden, indem der Magnet horizontal über der Trachea bewegt wurde, um die Mikropartikelstränge in Bewegung zu versetzen. Obwohl Live-Bildgebung möglich ist, lässt sich die Partikelbewegung nach der humanen Tötung des Tieres leichter erkennen. Die Mikropartikelkonzentrationen waren an dieser Stelle im Allgemeinen am höchsten, wenn der Magnet über dem Bildgebungsbereich positioniert war, obwohl sich einige Partikel meist weiter entlang der Trachea befanden. Im Gegensatz zu In-vitro-Studien können Partikel durch die Bewegung des Magneten nicht entlang der Trachea gezogen werden. Dieser Befund stimmt mit der üblichen Verarbeitung eingeatmeter Partikel durch den Schleim auf der Tracheaoberfläche überein: Die Partikel werden im Schleim eingeschlossen und anschließend durch die mukoziliäre Clearance abtransportiert.
Wir vermuteten, dass die Verwendung von Magneten zur Anziehung ober- und unterhalb der Trachea (Abb. 3b) zu einem gleichmäßigeren Magnetfeld führen könnte, anstatt zu einem punktuell stark konzentrierten Magnetfeld, was potenziell eine gleichmäßigere Partikelverteilung zur Folge hätte. Unsere Vorstudie lieferte jedoch keine eindeutigen Belege für diese Hypothese. Ebenso führte die Anordnung zweier Magnete zur Abstoßung (Abb. 3c) nicht zu einer erhöhten Partikelablagerung im Bildbereich. Diese beiden Ergebnisse zeigen, dass die Anordnung mit zwei Magneten die lokale Kontrolle der MP-Zielsteuerung nicht signifikant verbessert und dass die resultierenden starken Magnetkräfte schwer zu konfigurieren sind, was diesen Ansatz weniger praktikabel macht. Auch die Ausrichtung des Magneten oberhalb und durch die Trachea (Abb. 3d) erhöhte die Anzahl der im Bildbereich zurückgehaltenen Partikel nicht. Einige dieser alternativen Konfigurationen sind möglicherweise nicht erfolgreich, da sie zu geringeren Magnetfeldstärken im Ablagerungsbereich führen. Daher gilt die Konfiguration mit einem einzelnen Magneten im 30°-Winkel (Abb. 3a) als die einfachste und effektivste. effiziente Methode für In-vivo-Tests.
Die LV-MP-Studie zeigte, dass die Transduktionsrate in der Trachea signifikant erhöht war, wenn LV-Vektoren mit CombiMag kombiniert und nach physikalischer Störung in einem Magnetfeld appliziert wurden. Basierend auf Synchrotron-Bildgebungsstudien und LacZ-Ergebnissen konnte das Magnetfeld die LV-Vektoren offenbar in der Trachea stabilisieren und die Anzahl der Vektorpartikel reduzieren, die unmittelbar tief in die Lunge eindrangen. Diese Verbesserungen des Targetings könnten zu einer höheren Wirksamkeit bei gleichzeitiger Reduzierung der applizierten Titer, der Off-Target-Transduktion, entzündlicher und immunologischer Nebenwirkungen sowie der Kosten für Genträger führen. Laut Herstellerangaben ist CombiMag mit anderen Gentransfermethoden, einschließlich anderer viraler Vektoren (wie AAV) und Nukleinsäuren, kompatibel.