Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta para sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga estilo at JavaScript.
Ang mga gene vector para sa paggamot ng cystic fibrosis lung disease ay dapat tumutok sa mga conducting airways dahil ang peripheral lung transduction ay hindi nagbibigay ng therapeutic benefit. Ang kahusayan ng viral transduction ay direktang nauugnay sa vector residence time. Gayunpaman, ang mga delivery fluid tulad ng mga gene carrier ay natural na kumakalat sa alveoli habang inspiration, at ang mga therapeutic particle ng anumang anyo ay mabilis na nalilinis ng mucociliary transport. Ang pagpapahaba ng residence time ng mga gene carrier sa mga airway ay mahalaga ngunit mahirap makamit. Ang mga gene carrier-conjugated magnetic particle na maaaring idirekta sa ibabaw ng mga airway ay maaaring mapabuti ang regional targeting. Dahil sa mga hamon ng in vivo visualization, ang pag-uugali ng maliliit na magnetic particle sa ibabaw ng airway sa presensya ng isang inilapat na magnetic field ay hindi gaanong nauunawaan. Ang layunin ng pag-aaral na ito ay gamitin ang synchrotron imaging upang mailarawan ang in vivo motion ng isang serye ng magnetic particle sa trachea ng mga anesthetized na daga upang suriin ang dynamics at pattern ng indibidwal at bulk particle behavior in vivo. Pagkatapos ay tinasa rin namin kung ang paghahatid ng lentiviral magnetic particles sa presensya ng isang magnetic field ay magpapataas ng transduction efficiency sa trachea ng daga. Synchrotron X-ray Ipinapakita ng imaging ang pag-uugali ng mga magnetic particle sa mga nakatigil at gumagalaw na magnetic field in vitro at in vivo. Ang mga particle ay hindi madaling mahila sa ibabaw ng buhay na daanan ng hangin gamit ang mga magnet, ngunit habang dinadala, ang mga deposito ay nakapokus sa larangan ng paningin kung saan pinakamalakas ang magnetic field. Ang kahusayan ng transduction ay tumaas din ng anim na beses nang ang mga lentiviral magnetic particle ay inihatid sa presensya ng isang magnetic field. Sama-sama, iminumungkahi ng mga resultang ito na ang mga lentiviral magnetic particle at magnetic field ay maaaring maging mahahalagang pamamaraan upang mapabuti ang pag-target ng gene vector at mapataas ang mga antas ng transduction sa pagkokondukta ng mga daanan ng hangin in vivo.
Ang cystic fibrosis (CF) ay sanhi ng pagkakaiba-iba sa isang gene na tinatawag na CF transmembrane conductance regulator (CFTR). Ang protina ng CFTR ay isang ion channel na matatagpuan sa maraming epithelial cells sa buong katawan, kabilang ang mga conducting airways, isang pangunahing lugar ng pathogenesis ng CF. Ang mga depekto ng CFTR ay humahantong sa abnormal na transportasyon ng tubig, na nagpapatuyo sa ibabaw ng daanan ng hangin at binabawasan ang lalim ng airway surface liquid (ASL) layer. Pinipigilan din nito ang kakayahan ng mucociliary transport (MCT) system na linisin ang mga inhaled particle at pathogens mula sa mga daanan ng hangin. Ang aming layunin ay bumuo ng lentiviral (LV) gene therapy upang maihatid ang tamang kopya ng CFTR gene at mapabuti ang ASL, MCT, at kalusugan ng baga, at patuloy na bumuo ng mga bagong teknolohiya na may kakayahang sukatin ang mga parameter na ito in vivo1.
Ang mga LV vector ay isa sa mga nangungunang kandidato para sa CF airway gene therapy, pangunahin dahil maaari nilang permanenteng isama ang therapeutic gene sa mga airway basal cell (airway stem cell). Mahalaga ito dahil maaari nilang ibalik ang normal na hydration at mucus clearance sa pamamagitan ng pag-differentiate sa mga functional gene-corrected CF-associated airway surface cells, na nagreresulta sa panghabambuhay na benepisyo. Ang mga LV vector ay dapat na nakadirekta laban sa conducting airway, dahil dito nagsisimula ang sakit sa baga ng CF. Ang paghahatid ng vector na mas malalim sa baga ay maaaring magresulta sa alveolar transduction, ngunit wala itong therapeutic benefit sa CF. Gayunpaman, ang mga likido tulad ng mga gene carrier ay natural na lumilipat sa alveoli sa paglanghap pagkatapos ng panganganak3,4 at ang mga therapeutic particle ay mabilis na nalilinis sa oral cavity ng MCT. Ang kahusayan ng LV transduction ay direktang nauugnay sa haba ng oras na nananatili ang vector sa tabi ng mga target na cell upang payagan ang cellular uptake – ang "residence time"5 – na madaling mabawasan ng karaniwang regional airflow pati na rin ang coordinated particle mucus capture at MCT. Para sa CF, ang kakayahang pahabain ang residence time ng LV sa loob ng airway ay mahalaga upang makamit ang mataas na antas ng transduction sa rehiyong ito, ngunit sa ngayon ay naging mahirap.
Upang malampasan ang balakid na ito, iminumungkahi namin na ang mga LV magnetic particle (MP) ay maaaring makatulong sa dalawang komplementaryong paraan. Una, maaari silang gabayan ng magnet patungo sa ibabaw ng daanan ng hangin upang mapabuti ang pag-target at tulungan ang mga gene carrier particle na manirahan sa nais na rehiyon ng daanan ng hangin; at ASL) upang lumipat sa cell layer 6. Ang mga MP ay malawakang ginagamit bilang mga targeted na sasakyan sa paghahatid ng gamot kapag nagbubuklod sila sa mga antibodies, chemotherapeutic na gamot, o iba pang maliliit na molekula na kumakapit sa mga lamad ng cell o nagbubuklod sa mga kaugnay na receptor sa ibabaw ng cell at naiipon sa mga lugar ng tumor sa presensya ng static electricity. Mga Magnetic Field para sa Paggamot sa Kanser 7. Ang iba pang mga pamamaraan na "hyperthermal" ay naglalayong painitin ang mga MP kapag nalantad sila sa mga nag-oscillating na magnetic field, sa gayon ay sinisira ang mga selula ng tumor. Ang prinsipyo ng magnetic transfection, kung saan ang isang magnetic field ay ginagamit bilang isang transfection agent upang mapahusay ang paglipat ng DNA sa mga selula, ay karaniwang ginagamit in vitro gamit ang isang hanay ng mga non-viral at viral gene vectors para sa mga mahirap i-transduce na cell lines. Ang pagiging epektibo ng LV magnetotransfection ay naitatag na, sa pamamagitan ng in vitro na paghahatid ng LV-MPs sa isang human bronchial epithelial cell line sa presensya ng isang static magnetic field, na nagpapataas ng transduction efficiency ng 186-fold kumpara sa LV vector lamang. Ang LV-MP ay inilapat din sa isang in vitro CF model, kung saan ang magnetic transfection ay nagpataas ng LV transduction sa air-liquid interface cultures ng 20-fold sa presensya ng CF sputum10. Gayunpaman, ang in vivo magnetotransfection ng mga organ ay nakatanggap ng medyo kaunting atensyon at nasuri lamang sa ilang pag-aaral sa hayop11,12,13,14,15, lalo na sa baga16,17. Gayunpaman, malinaw ang mga pagkakataon para sa magnetic transfection sa CF lung therapy. Sinabi ni Tan et al.(2020) na "ang isang proof-of-concept na pag-aaral ng mahusay na magnetic nanoparticle pulmonary delivery ay magbubukas ng daan para sa mga estratehiya sa paglanghap ng CFTR sa hinaharap upang mapabuti ang mga klinikal na resulta sa mga pasyenteng may CF"6.
Ang pag-uugali ng maliliit na magnetic particle sa mga ibabaw ng daanan ng hangin sa presensya ng isang inilapat na magnetic field ay mahirap mailarawan at pag-aralan, at sa gayon ay hindi gaanong nauunawaan. Sa iba pang mga pag-aaral, bumuo kami ng isang synchrotron-propagation-based phase-contrast X-ray imaging (PB-PCXI) na pamamaraan upang hindi invasive na mailarawan at masukat ang maliliit na pagbabago sa ASL depth18 at MCT behavior19,20 upang direktang masukat ang hydration sa ibabaw ng gas Canal at ginamit bilang isang maagang tagapagpahiwatig ng bisa ng paggamot. Bilang karagdagan, ang aming paraan ng pagsusuri ng MCT ay gumagamit ng mga particle na may diameter na 10–35 µm na binubuo ng alumina o high refractive index glass bilang mga MCT marker na nakikita gamit ang PB-PCXI21. Ang parehong mga pamamaraan ay angkop para sa visualization ng iba't ibang uri ng particle, kabilang ang MP.
Dahil sa mataas na spatial at temporal resolution nito, ang aming mga pamamaraan sa pagsusuri ng PB-PCXI-based ASL at MCT ay angkop para sa pagsusuri ng mga dinamika at pattern ng single at bulk particle behavior in vivo upang matulungan kaming maunawaan at ma-optimize ang mga pamamaraan sa paghahatid ng MP gene. Ang pamamaraang ginagamit namin dito ay nagmula sa aming mga pag-aaral gamit ang SPring-8 BL20B2 beamline, kung saan isinalarawan namin ang paggalaw ng fluid kasunod ng sham vector dose delivery sa nasal at pulmonary airways ng mga daga upang makatulong na ipaliwanag ang aming mga Non-uniform gene expression pattern na naobserbahan sa aming mga pag-aaral sa gene carrier dose animal 3,4.
Ang layunin ng pag-aaral na ito ay gamitin ang synchrotron PB-PCXI upang mailarawan ang mga paggalaw in vivo ng isang serye ng mga MP sa trachea ng mga buhay na daga. Ang mga pag-aaral sa imaging na PB-PCXI na ito ay idinisenyo upang subukan ang iba't ibang MP, lakas ng magnetic field, at mga lokasyon upang matukoy ang kanilang epekto sa paggalaw ng MP. Nagpalagay kami na ang isang panlabas na inilapat na magnetic field ay makakatulong sa naihatid na MP na manatili o lumipat sa target na lugar. Ang mga pag-aaral na ito ay nagbigay-daan din sa amin upang matukoy ang mga configuration ng magnet na nagpapakinabang sa bilang ng mga particle na napanatili sa trachea pagkatapos ng deposition. Sa isang pangalawang serye ng mga pag-aaral, hinangad naming gamitin ang pinakamainam na configuration na ito upang ipakita ang transduction pattern na nagreresulta mula sa in vivo na paghahatid ng mga LV-MP sa daanan ng hangin ng daga, batay sa palagay na ang paghahatid ng mga LV-MP sa konteksto ng pag-target sa daanan ng hangin ay magreresulta sa pinahusay na kahusayan sa transduction ng LV.
Ang lahat ng pag-aaral sa hayop ay isinagawa ayon sa mga protokol na inaprubahan ng University of Adelaide (M-2019-060 at M-2020-022) at ng SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Ang mga eksperimento ay isinagawa ayon sa mga alituntunin ng ARRIVE.
Ang lahat ng X-ray imaging ay isinagawa sa BL20XU beamline sa SPring-8 synchrotron sa Japan, gamit ang isang setup na katulad ng inilarawan dati21,22. Sa madaling salita, ang experimental box ay matatagpuan 245 m mula sa synchrotron storage ring. Isang sample-to-detector distance na 0.6 m ang ginagamit para sa particle imaging studies at 0.3 m para sa in vivo imaging studies upang makabuo ng phase contrast effects. Isang monochromatic beam energy na 25 keV ang ginamit. Ang mga imahe ay nakuha gamit ang isang high-resolution X-ray converter (SPring-8 BM3) na nakakabit sa isang sCMOS detector. Kino-convert ng converter ang X-ray sa visible light gamit ang isang 10 µm thick scintillator (Gd3Al2Ga3O12), na pagkatapos ay idinidirekta sa isang sCMOS sensor gamit ang isang × 10 microscope objective (NA 0.3). Ang sCMOS detector ay Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) na may array size na 2048 × 2048 pixels at isang raw pixel size na 6.5 × 6.5 µm. Ang setup na ito ay nagbubunga ng isang epektibong isotropic pixel size na 0.51 µm at isang field of view na humigit-kumulang 1.1 mm × 1.1 mm. Isang exposure length na 100 ms ang pinili upang ma-maximize ang signal-to-noise ratio ng mga magnetic particle sa loob at labas ng daanan ng hangin habang binabawasan ang mga motion artifact na dulot ng paghinga. Para sa mga in vivo na pag-aaral, isang mabilis na X-ray shutter ang inilagay sa X-ray path upang limitahan ang radiation dose sa pamamagitan ng pagharang sa X-ray beam sa pagitan ng mga exposure.
Ang LV carrier ay hindi ginamit sa anumang SPring-8 PB-PCXI imaging studies dahil ang BL20XU imaging chamber ay walang sertipikasyon ng Biosafety Level 2. Sa halip, pumili kami ng hanay ng mga MP na mahusay ang pagkakakilala mula sa dalawang komersyal na supplier—na sumasaklaw sa iba't ibang laki, materyales, konsentrasyon ng iron, at aplikasyon—una upang maunawaan kung paano nakakaapekto ang mga magnetic field sa paggalaw ng MP sa loob ng mga glass capillary, at pagkatapos ay sa mga buhay na daanan ng hangin. sa ibabaw. Ang mga MP ay may sukat mula 0.25 hanggang 18 μm at gawa sa iba't ibang materyales (tingnan ang Talahanayan 1), ngunit ang komposisyon ng bawat sample, kabilang ang laki ng mga magnetic particle sa loob ng MP, ay hindi alam. Batay sa aming malawak na pag-aaral ng MCT 19, 20, 21, 23, 24, inaasahan namin na ang mga MP na kasing liit ng 5 μm ay makikita sa ibabaw ng daanan ng hangin ng trachea, halimbawa sa pamamagitan ng pagbabawas ng magkakasunod na mga frame upang makita ang pinahusay na visibility ng paggalaw ng MP. Ang isang MP na may sukat na 0.25 μm ay mas maliit kaysa sa resolution ng imaging device, ngunit inaasahang matutukoy ng PB-PCXI ang kanilang volume contrast at ang paggalaw ng surface fluid kung saan idineposito ang mga ito pagkatapos ng deposition.
Ang mga sample para sa bawat MP sa Table 1 ay inihanda sa 20 μl glass capillaries (Drummond Microcaps, PA, USA) na may panloob na diyametro na 0.63 mm. Ang mga corpuscular particle ay makukuha sa tubig, habang ang mga CombiMag particle ay makukuha sa proprietary fluid ng tagagawa. Ang bawat tubo ay kalahati na puno ng likido (humigit-kumulang 11 μl) at inilagay sa sample holder (tingnan ang Figure 1). Ang mga glass capillary ay inilagay nang pahalang sa sample stage sa imaging box, ayon sa pagkakabanggit, at inilagay ang mga gilid ng fluid. Isang 19 mm diameter (28 mm ang haba) nickel shell rare earth neodymium iron boron (NdFeB) magnet (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) na may residual magnetization na 1.17 Tesla ang ikinabit sa isang hiwalay na translation stage upang makamit ang pagbabago ng posisyon nito nang malayuan habang nag-i-imaging. Nagsisimula ang pagkuha ng X-ray image kapag ang magnet ay nakaposisyon nang humigit-kumulang 30 mm sa itaas ng sample, at ang mga imahe ay nakukuha sa rate na 4 na frame bawat segundo. Habang nag-i-imaging, ang magnet ay inilapit sa glass capillary tube. (mga 1 mm ang layo) at pagkatapos ay isinalin sa kahabaan ng tubo upang masuri ang mga epekto ng lakas at posisyon ng field.
In vitro imaging setup na naglalaman ng mga MP sample sa mga glass capillary sa sample xy translation stage. Ang landas ng X-ray beam ay minarkahan ng pulang putol-putol na linya.
Nang maitatag ang in vitro visibility ng mga MP, isang subset ng mga ito ang sinubukan in vivo sa mga wild-type na babaeng albino na Wistar rats (~12 linggo ang edad, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) at 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Ang mga daga ay binigyan ng anesthesia gamit ang pinaghalong Pharma), Japan) sa pamamagitan ng intraperitoneal injection. Pagkatapos ng anesthesia, inihanda sila para sa imaging sa pamamagitan ng pag-alis ng balahibo sa paligid ng trachea, pagpasok ng endotracheal tube (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) at pag-immobilize sa kanila nang nakahiga sa isang custom-made na imaging plate na naglalaman ng thermal bag upang mapanatili ang temperatura ng katawan 22. Ang imaging plate ay ikinabit sa sample translation stage sa imaging box sa isang bahagyang anggulo upang ihanay ang trachea nang pahalang sa X-ray image, tulad ng ipinapakita sa Pigura 2a.
(a) In vivo imaging setup sa SPring-8 imaging box, ang landas ng X-ray beam ay minarkahan ng pulang putol-putol na linya. (b,c) Ang magnet localization sa trachea ay isinagawa nang malayuan gamit ang dalawang orthogonally mounted IP camera. Sa kaliwang bahagi ng imahe sa screen, makikita ang wire loop na humahawak sa ulo, at ang delivery cannula ay nasa lugar sa loob ng ET tube.
Isang remote-controlled syringe pump system (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) gamit ang 100 μl glass syringe ang ikinonekta sa PE10 tubing (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) sa pamamagitan ng 30 Ga needle. Markahan ang tubo upang matiyak na ang dulo ay nasa tamang posisyon sa trachea kapag ipinapasok ang ET tube. Gamit ang micropump, ang syringe plunger ay binawi habang ang dulo ng tubo ay nakalubog sa MP sample na ibibigay. Ang loaded delivery tube ay ipinasok sa endotracheal tube, inilalagay ang dulo sa loob ng pinakamalakas na bahagi ng aming inaasahang inilapat na magnetic field. Ang pagkuha ng imahe ay kinokontrol gamit ang isang respiration detector na nakakonekta sa aming Arduino based timing box, at lahat ng signal (hal. temperatura, respiration, pagbukas/pagsasara ng shutter at pagkuha ng imahe) ay naitala gamit ang Powerlab at LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia). 22. Kapag nag-i-imaging Nang hindi ma-access ang enclosure, dalawang IP camera (Panasonic BB-SC382) ang nakaposisyon nang humigit-kumulang 90° sa isa't isa at ginamit upang subaybayan ang posisyon. ng magnet kaugnay ng trachea habang nag-i-imaging (Fig. 2b,c). Upang mabawasan ang mga artifact ng paggalaw, isang imahe ang nakuha bawat paghinga sa panahon ng end-tidal flow plateau.
Isang magnet ang nakakabit sa pangalawang yugto na maaaring mailagay nang malayuan mula sa labas ng imaging housing. Sinubukan ang iba't ibang posisyon at configuration ng magnet, kabilang ang: Naka-mount sa anggulong humigit-kumulang 30° sa itaas ng trachea (mga configuration na ipinapakita sa Figures 2a at 3a); isang magnet sa itaas ng hayop at ang isa naman sa ibaba, na may mga pole na nakatakdang mag-attract (Figure 3b); isang magnet sa itaas ng hayop at ang isa naman sa ibaba, na may mga pole na nakatakdang magtaboy (Figure 3c); at isang magnet sa itaas at patayo sa trachea (Figure 3d). Kapag na-configure na ang hayop at magnet at ang MP na susubukan ay nai-load na sa syringe pump, magbigay ng 50 μl na dosis sa bilis na 4 μl/seg habang kumukuha ng mga imahe. Pagkatapos, ang magnet ay inililipat pabalik-balik o pahilig sa trachea habang patuloy na kumukuha ng mga imahe.
Konpigurasyon ng magnet para sa in vivo imaging (a) isang magnet sa itaas ng trachea sa anggulong humigit-kumulang 30°, (b) dalawang magnet na nakatakdang umakit, (c) dalawang magnet na nakatakdang magtaboy, (d) isang magnet sa itaas at patayo sa trachea. Tumingin pababa ang tagamasid mula sa bibig patungo sa baga sa pamamagitan ng trachea, at ang sinag ng X-ray ay dumaan sa kaliwang bahagi ng daga at lumabas sa kanang bahagi. Ang magnet ay maaaring igalaw sa kahabaan ng daanan ng hangin o pakaliwa at pakanan sa itaas ng trachea sa direksyon ng sinag ng X-ray.
Sinubukan din naming matukoy ang kakayahang makita at kilos ng mga particle sa mga daanan ng hangin nang walang nakakagambalang paghinga at paggalaw ng puso. Samakatuwid, sa pagtatapos ng panahon ng imaging, ang mga hayop ay makataong pinatay dahil sa pentobarbital overdose (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Ang ilang mga hayop ay iniwan sa imaging platform, at nang tumigil ang paghinga at tibok ng puso, ang proseso ng imaging ay inulit, na nagdaragdag ng karagdagang dosis ng MP kung walang MP na nakikita sa ibabaw ng daanan ng hangin.
Ang mga nakuhang imahe ay kinorekta sa flat-field at dark-field at pagkatapos ay pinagsama-sama sa isang pelikula (20 frames per second; 15-25 × normal na bilis depende sa respiratory rate) gamit ang isang custom na script na isinulat sa MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ang lahat ng mga pag-aaral sa paghahatid ng LV gene vector ay isinagawa sa Laboratory Animal Research Facility sa University of Adelaide at naglalayong gamitin ang mga resulta ng eksperimentong SPring-8 upang masuri kung ang paghahatid ng LV-MP sa presensya ng magnetic field ay maaaring mapahusay ang paglilipat ng gene in vivo. Upang masuri ang mga epekto ng MP at magnetic field, dalawang grupo ng mga hayop ang ginamot: ang isang grupo ay binigyan ng LV-MP na may nakalagay na magnet, at ang isa pang grupo ay nakatanggap ng control group na may LV-MP na walang magnet.
Ang mga vector ng LV gene ay nabuo gamit ang mga naunang inilarawang pamamaraan 25, 26. Ang LacZ vector ay nagpapahayag ng nuclear-localized beta-galactosidase gene na pinapagana ng constitutive MPSV promoter (LV-LacZ), na nagbubunga ng isang asul na produkto ng reaksyon sa mga transduced cell, na nakikita sa mga front ng tissue ng baga at mga seksyon ng tissue. Ang titration ay isinagawa sa mga cell culture sa pamamagitan ng manu-manong pagbibilang ng bilang ng mga LacZ positive cell gamit ang isang hemocytometer upang kalkulahin ang titer sa TU/ml. Ang mga carrier ay cryopreserved sa -80 °C, tinunaw bago gamitin, at itinatali sa CombiMag sa pamamagitan ng paghahalo sa 1:1 ratio at pag-incubate sa yelo nang hindi bababa sa 30 minuto bago ihatid.
Ang mga normal na daga na Sprague Dawley (n = 3/grupo, ~2-3 ay binigyan ng anesthesia intraperitoneally gamit ang pinaghalong 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) at 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australia) na isang buwang gulang) ip) injection at non-surgical oral cannulation gamit ang 16 Ga iv cannula. Upang matiyak na ang tracheal airway tissue ay makakatanggap ng LV transduction, ito ay kinondisyon gamit ang aming naunang inilarawan na mechanical perturbation protocol, kung saan ang tracheal airway surface ay kinuskos nang pa-axial gamit ang wire basket (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Ang pagbibigay ng LV-MP sa tracheal ay isinagawa sa isang biological safety cabinet humigit-kumulang 10 minuto pagkatapos ng perturbation.
Ang magnetic field na ginamit sa eksperimentong ito ay kinopya sa katulad na paraan sa in vivo X-ray imaging study, kung saan ang parehong mga magnet ay nakalagay sa itaas ng trachea gamit ang mga distillation stent clip (Larawan 4). Isang 50 μl na volume (2 × 25 μl aliquots) ng LV-MP ang ipinasok sa trachea (n = 3 hayop) gamit ang isang pipette na naglalaman ng gel tip gaya ng naunang inilarawan. Isang control group (n = 3 hayop) ang nakatanggap ng parehong LV-MP nang hindi gumagamit ng magnet. Pagkatapos makumpleto ang infusion, ang cannula ay tinatanggal mula sa ET tube at ang hayop ay ini-extubate. Ang magnet ay nananatili sa lugar sa loob ng 10 minuto, pagkatapos ay tinatanggal ito. Ang mga daga ay nakatanggap ng subcutaneous dose ng meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) na sinundan ng reversal ng anesthesia sa pamamagitan ng ip injection na 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia). Ang mga daga ay pinananatiling mainit at minomonitor hanggang sa ganap na paggaling mula sa anesthesia.
Kagamitan sa paghahatid ng LV-MP sa isang biological safety cabinet. Ang mapusyaw na abuhing Luer hub ng ET tube ay makikitang nakausli mula sa bibig at ang gel tip ng pipette na ipinapakita sa larawan ay ipinapasok sa pamamagitan ng ET tube hanggang sa nais na lalim papasok sa trachea.
Isang linggo pagkatapos ng pamamaraan ng pagbibigay ng dosis sa LV-MP, ang mga hayop ay makataong pinatay sa pamamagitan ng 100% na paglanghap ng CO2 at ang ekspresyon ng LacZ ay tinasa gamit ang aming karaniwang paggamot na X-gal. Ang tatlong singsing na pinaka-cartilaginous sa caudal ay tinanggal upang matiyak na ang anumang mekanikal na pinsala o pagpapanatili ng likido mula sa paglalagay ng endotracheal tube ay hindi kasama sa pagsusuri. Ang bawat trachea ay pinutol nang pahaba upang lumikha ng dalawang kalahati para sa pagsusuri, at ang mga ito ay inilagay sa isang dish na naglalaman ng silicone rubber (Sylgard, Dow Inc) gamit ang isang Minutien needle (Fine Science Tools) upang mailarawan ang luminal surface. Ang distribusyon at pattern ng mga transduced cell ay kinumpirma sa pamamagitan ng frontal photography gamit ang isang Nikon microscope (SMZ1500) na may DigiLite camera at TCapture software (Tucsen Photonics, China). Ang mga imahe ay nakuha sa 20x magnification (kabilang ang pinakamataas na setting para sa buong lapad ng trachea), kung saan ang buong haba ng trachea ay kinunan ng imahe nang sunud-sunod, na tinitiyak ang sapat na overlap sa pagitan ng bawat imahe upang payagan ang "pagtahi" ng imahe. Ang mga imahe mula sa bawat trachea ay pagkatapos ay pinagsama-sama sa isang composite na imahe gamit ang Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) gamit ang isang planar motion algorithm. Ang mga lugar ng ekspresyon ng LacZ sa mga composite na imahe ng trachea mula sa bawat hayop ay tinantiya gamit ang isang awtomatikong MATLAB script (R2020a, MathWorks) gaya ng naunang inilarawan, gamit ang mga setting na 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, at Value < 0.7. Sa pamamagitan ng pagsubaybay sa mga contour ng tissue, isang mask ang manu-manong nabuo sa GIMP v2.10.24 para sa bawat composite na imahe upang matukoy ang lugar ng tissue at maiwasan ang anumang maling pagtuklas mula sa labas ng tracheal tissue. Ang mga stained area mula sa lahat ng composite na imahe mula sa bawat hayop ay pinagsama-sama upang makabuo ng kabuuang stained area para sa hayop na iyon. Ang stained area ay hinati sa kabuuang mask area upang makabuo ng normalized area.
Ang bawat trachea ay inilagay sa paraffin at ang 5 μm na mga seksyon ay pinutol. Ang mga seksyon ay kinulayan ng neutral fast red sa loob ng 5 minuto at ang mga imahe ay kinuha gamit ang isang Nikon Eclipse E400 microscope, DS-Fi3 camera at NIS element capture software (bersyon 5.20.00).
Ang lahat ng pagsusuring pang-estadistika ay isinagawa sa GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Ang kahalagahang pang-estadistika ay itinakda sa p ≤ 0.05. Ang normalidad ay napatunayan gamit ang Shapiro-Wilk test, at ang mga pagkakaiba sa paglamlam ng LacZ ay tinasa gamit ang unpaired t-test.
Ang anim na MP na inilarawan sa Talahanayan 1 ay sinuri gamit ang PCXI, at ang visibility ay inilarawan sa Talahanayan 2. Dalawang polystyrene MP (MP1 at MP2; 18 μm at 0.25 μm, ayon sa pagkakabanggit) ay hindi nakikita sa ilalim ng PCXI, ngunit ang iba pang mga sample ay natukoy (ang mga halimbawa ay ipinapakita sa Figure 5). Ang MP3 at MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm at 0.9 μm, ayon sa pagkakabanggit) ay bahagyang nakikita. Bagama't naglalaman ng ilan sa pinakamaliit na particle na sinubukan, ang MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) ang pinakakapansin-pansin. Ang produktong CombiMag na MP6 ay mahirap makita. Sa lahat ng mga kaso, ang aming kakayahang matukoy ang MP ay lubos na pinahusay sa pamamagitan ng pagsasalin ng magnet pabalik-balik na parallel sa capillary. Nang lumayo ang mga magnet mula sa capillary, ang mga particle ay humaba sa mahahabang string, ngunit habang papalapit ang mga magnet at tumataas ang lakas ng magnetic field, ang mga string ng particle ay umiikli habang ang mga particle ay lumipat patungo sa itaas na ibabaw ng capillary (tingnan ang Supplementary Video S1: MP4), na nagpapataas ng The densidad ng partikulo ng ibabaw. Sa kabaligtaran, kapag ang magnet ay tinanggal mula sa capillary, ang lakas ng field ay bumababa at ang mga MP ay muling nag-aayos sa mahahabang string na umaabot mula sa itaas na ibabaw ng capillary (tingnan ang Supplementary Video S2:MP4). Matapos tumigil sa paggalaw ang magnet, ang mga partikulo ay patuloy na gumagalaw nang maikling panahon pagkatapos maabot ang posisyon ng equilibrium. Habang ang MP ay gumagalaw patungo at palayo sa itaas na ibabaw ng capillary, ang mga magnetic particle ay karaniwang hinihila ang mga debris sa pamamagitan ng fluid.
Ang visibility ng MP sa ilalim ng PCXI ay lubhang nag-iiba sa pagitan ng mga sample. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 at (d) MP6. Lahat ng mga larawang ipinapakita rito ay kinunan gamit ang isang magnet na matatagpuan humigit-kumulang 10 mm direkta sa itaas ng capillary. Ang maliwanag na malalaking bilog ay mga bula ng hangin na nakulong sa mga capillary, na malinaw na nagpapakita ng itim at puting mga tampok sa gilid ng phase contrast imaging. Ang pulang kahon ay naglalaman ng contrast-enhancing magnification. Tandaan na ang mga diametro ng magnet schematics sa lahat ng mga pigura ay hindi ayon sa sukat at humigit-kumulang 100 beses na mas malaki kaysa sa ipinapakita.
Habang ang magnet ay inililipat pakaliwa at pakanan sa tuktok ng capillary, ang anggulo ng MP string ay nagbabago upang ihanay sa magnet (tingnan ang Figure 6), kaya inilalarawan ang mga linya ng magnetic field. Para sa MP3-5, pagkatapos maabot ng chord ang isang threshold angle, ang mga particle ay kinakaladkad sa itaas na ibabaw ng capillary. Kadalasan itong nagreresulta sa pagkumpol-kumpol ng mga MP sa mas malalaking grupo malapit sa kung saan pinakamalakas ang magnetic field (tingnan ang Supplementary Video S3:MP5). Ito rin ay partikular na kitang-kita kapag ang pag-imaging ay malapit sa dulo ng capillary, na nagiging sanhi ng pag-iipon at pag-concentrate ng mga MP sa fluid-air interface. Ang mga particle sa MP6, na mas mahirap matukoy kaysa sa MP3-5, ay hindi kinaladkad habang ang magnet ay gumagalaw sa capillary, ngunit ang mga MP string ay naghiwalay, na iniiwan ang mga particle sa field of view (tingnan ang Supplementary Video S4:MP6). Sa ilang mga kaso, kapag ang inilapat na magnetic field ay nabawasan sa pamamagitan ng paggalaw ng magnet sa isang malaking distansya mula sa lokasyon ng pag-imaging, ang anumang natitirang mga MP ay dahan-dahang bumababa sa ilalim na ibabaw ng tubo sa pamamagitan ng gravity habang nananatili sa string (tingnan ang Supplementary Video S5: MP3).
Nagbabago ang anggulo ng MP string habang ang magnet ay inililipat sa kanan sa itaas ng capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 at (d) MP6. Ang pulang kahon ay naglalaman ng contrast-enhancing magnification. Tandaan na ang mga karagdagang video ay nagbibigay-kaalaman dahil ipinapakita nito ang mahahalagang istruktura ng particle at dynamic na impormasyon na hindi maaaring mailarawan sa mga static na imaheng ito.
Ipinakita ng aming mga pagsusuri na ang mabagal na paggalaw ng magnet pabalik-balik sa trachea ay nagpapadali sa pagpapakita ng MP sa konteksto ng kumplikadong paggalaw in vivo. Hindi isinagawa ang in vivo testing dahil ang mga polystyrene beads (MP1 at MP2) ay hindi nakikita sa capillary. Ang bawat isa sa natitirang apat na MP ay sinubukan in vivo na ang mahabang axis ng magnet ay nakaayos sa itaas ng trachea sa anggulong humigit-kumulang 30° hanggang patayo (tingnan ang Mga Larawan 2b at 3a), dahil nagresulta ito sa mas mahahabang MP chain at mas epektibo kaysa sa pagtatapos ng magnet configuration. Ang MP3, MP4 at MP6 ay hindi nakita sa trachea ng anumang buhay na hayop. Nang ang mga daanan ng hangin ng daga ay kinunan ng imahe pagkatapos makataong patayin ang mga hayop, ang mga particle ay nanatiling hindi nakikita kahit na nagdagdag ng karagdagang volume gamit ang isang syringe pump. Ang MP5 ay may pinakamataas na nilalaman ng iron oxide at ito lamang ang nakikitang particle, at samakatuwid ay ginamit upang masuri at makilala ang in vivo na pag-uugali ng MP.
Ang paglalagay ng magnet sa ibabaw ng trachea habang ipinapanganak ang MP ay nagresulta sa marami, ngunit hindi lahat, ng mga MP na nakonsentra sa larangan ng paningin. Ang mga particle na pumapasok sa trachea ay pinakamahusay na naoobserbahan sa mga hayop na isinakripisyo nang makataong-tao. Figure 7 at Supplementary Video S6: Ipinapakita ng MP5 ang mabilis na magnetic capture at pagkakahanay ng mga particle sa ibabaw ng ventral trachea, na nagpapahiwatig na ang mga MP ay maaaring idirekta sa mga ninanais na rehiyon ng trachea. Kapag naghahanap nang mas malayo sa trachea pagkatapos ng paghahatid ng MP, ang ilang mga MP ay natagpuang mas malapit sa carina, na nagmumungkahi na ang lakas ng magnetic field ay hindi sapat upang kolektahin at panatilihin ang lahat ng MP, dahil ang mga ito ay naihatid sa pamamagitan ng rehiyon ng pinakamataas na lakas ng magnetic field sa panahon ng proseso ng fluid. Gayunpaman, ang mga konsentrasyon ng postpartum MP ay mas mataas sa paligid ng nakuhanan ng imahe, na nagmumungkahi na maraming MP ang nanatili sa mga rehiyon ng daanan ng hangin kung saan pinakamataas ang inilapat na lakas ng magnetic field.
Mga larawan mula sa (a) bago at (b) pagkatapos ng paghahatid ng MP5 sa trachea ng isang daga na kamakailan lamang pinatay nang patay na may magnet na nakaposisyon nang direkta sa itaas ng lugar ng imaging. Ang lugar na nakuhanan ng larawan ay matatagpuan sa pagitan ng dalawang singsing ng cartilage. Bago ang paghahatid ng MP, mayroong ilang likido sa daanan ng hangin. Ang pulang kahon ay naglalaman ng magnification na nagpapahusay ng contrast. Ang mga larawang ito ay mula sa video na ipinapakita sa Supplementary Video S6:MP5.
Ang pagsasalin ng magnet sa trachea in vivo ay naging sanhi ng pagbabago ng anggulo ng MP chain sa loob ng ibabaw ng daanan ng hangin sa paraang katulad ng nakikita sa mga capillary (tingnan ang Figure 8 at Supplementary Video S7:MP5). Gayunpaman, sa aming pag-aaral, ang mga MP ay hindi maaaring hilahin sa ibabaw ng buhay na daanan ng hangin gaya ng magagawa nila sa mga capillary. Sa ilang mga kaso, ang MP chain ay humahaba habang ang magnet ay gumagalaw pakaliwa at pakanan. Kapansin-pansin, natuklasan din namin na ang string ng particle ay tila nagbabago sa lalim ng layer ng surface fluid kapag ang magnet ay inilipat nang pahaba sa trachea, at lumalawak kapag ang magnet ay direktang inilipat sa itaas at ang string ng particle ay iniikot sa isang patayong posisyon (tingnan ang Supplementary Video S7). : MP5 sa 0:09, kanang ibaba). Nagbago ang katangiang padron ng paggalaw nang ang magnet ay ilipat sa itaas ng trachea nang pahalang (ibig sabihin, sa kaliwa o kanan ng hayop sa halip na sa kahabaan ng trachea). Malinaw pa ring nakikita ang mga particle habang gumagalaw ang mga ito, ngunit nang alisin ang magnet mula sa trachea, naging nakikita ang mga dulo ng mga string ng particle (tingnan ang Supplementary Video S8:MP5, simula sa 0:08). Ito ay naaayon sa pag-uugali ng MP na aming naobserbahan sa ilalim ng isang inilapat na magnetic field sa isang glass capillary.
Mga halimbawang larawan na nagpapakita ng MP5 sa trachea ng isang buhay na daga na binigyan ng anestesya. (a) Ang magnet ay ginagamit upang kumuha ng mga larawan sa itaas at sa kaliwa ng trachea, pagkatapos (b) pagkatapos ilipat ang magnet sa kanan. Ang pulang kahon ay naglalaman ng magnification na nagpapahusay ng contrast. Ang mga larawang ito ay mula sa video na ipinapakita sa Supplementary Video S7:MP5.
Nang ang dalawang polo ay isinaayos sa oryentasyong hilaga-timog sa itaas at ibaba ng trachea (ibig sabihin, umaakit; Fig. 3b), ang mga MP chords ay lumitaw na mas mahaba at matatagpuan sa sidewall ng trachea sa halip na sa dorsal tracheal surface (tingnan ang Supplementary Video S9:MP5). Gayunpaman, ang mataas na konsentrasyon ng mga particle sa iisang lokasyon (ibig sabihin, ang dorsal surface ng trachea) ay hindi nakita pagkatapos ng paghahatid ng fluid nang gumamit ng dual-magnet device, na karaniwang nangyayari kapag gumamit ng single-magnet device. Pagkatapos, nang ang isang magnet ay isinaayos upang itaboy ang mga pole na nakabaligtad (Fig. 3c), ang bilang ng mga particle na nakikita sa field of view ay tila hindi tumaas pagkatapos ng paghahatid. Ang setup ng parehong dual-magnet configuration ay mahirap dahil sa mataas na lakas ng magnetic field na humihila o nagtutulak sa mga magnet, ayon sa pagkakabanggit. Ang setup ay pagkatapos ay binago sa isang magnet na parallel sa airway ngunit dumadaan sa airway sa 90 degrees upang ang mga field lines ay tumawid sa tracheal wall nang orthogonally (Fig. 3d), isang oryentasyong idinisenyo upang matukoy kung ang particle aggregation sa side wall ay maaaring maobserbahan. Gayunpaman, sa Sa ganitong konpigurasyon, walang natukoy na paggalaw ng akumulasyon ng MP o paggalaw ng magnet. Batay sa lahat ng mga resultang ito, isang single-magnet, 30-degree na konpigurasyon ng oryentasyon (Larawan 3a) ang pinili para sa mga pag-aaral ng in vivo gene carrier.
Nang paulit-ulit na kinunan ng larawan ang hayop pagkatapos ng makataong pagpatay, ang kawalan ng nakakalitong paggalaw ng tisyu ay nangangahulugan na ang mas pino at mas maiikling linya ng partikulo ay maaaring makita sa malinaw na interchondral field, "nanginginig" kasabay ng translational motion ng magnet. Gayunpaman, hindi pa rin malinaw na makita ang presensya at paggalaw ng mga partikulo ng MP6.
Ang titer ng LV-LacZ ay 1.8 × 108 TU/ml, at pagkatapos ng 1:1 na paghahalo sa CombiMag MP (MP6), ang mga hayop ay nakatanggap ng 50 μl na dosis ng trachea na 9 × 107 TU/ml LV vehicle (ibig sabihin, 4.5 × 106 TU/daga). Sa mga pag-aaral na ito, sa halip na isalin ang magnet habang nanganganak, inayos namin ang magnet sa isang posisyon upang matukoy kung ang LV transduction (a) ay maaaring mapabuti kumpara sa vector delivery nang walang magnetic field, at (b) maaaring itutok. Ang mga airway cell ay naita-transduce sa mga magnetic target na rehiyon ng upper airway.
Ang presensya ng mga magnet at ang paggamit ng CombiMag kasama ng mga LV vector ay tila walang masamang epekto sa kalusugan ng hayop, gayundin ang aming karaniwang protocol sa paghahatid ng LV vector. Ang mga larawan sa harap ng rehiyon ng tracheal na sumailalim sa mekanikal na pagkagambala (Karagdagang Larawan 1) ay nagpapahiwatig na mayroong mas mataas na antas ng transduction sa grupo ng mga hayop na ginamot gamit ang LV-MP nang naroroon ang magnet (Larawan 9a). Kaunting asul na paglamlam ng LacZ lamang ang naroroon sa control group (Larawan 9b). Ang pagkuwantipika ng mga normalized na lugar na may kulay na X-Gal ay nagpakita na ang pagbibigay ng LV-MP sa presensya ng isang magnetic field ay nagdulot ng humigit-kumulang 6 na beses na pagpapabuti (Larawan 9c).
Mga halimbawa ng pinagsama-samang larawan na nagpapakita ng tracheal transduction sa pamamagitan ng LV-MP (a) sa presensya ng magnetic field at (b) sa kawalan ng magnet.(c) Makabuluhang pagbuti sa istatistika sa normalized LacZ transduction area sa loob ng trachea kapag ginagamit ang magnet (*p = 0.029, t-test, n = 3 bawat grupo, mean ± SEM).
Ang mga neutral fast red-stained section (halimbawang ipinapakita sa Karagdagang Larawan 2) ay nagpakita ng mga selulang may LacZ na nasa katulad na pattern at lokasyon gaya ng naunang iniulat.
Isang pangunahing hamon para sa airway gene therapy ang nananatiling tumpak na lokalisasyon ng mga carrier particle sa mga rehiyong pinag-aaralan at pagkamit ng mataas na antas ng transduction efficiency sa gumagalaw na baga sa presensya ng airflow at aktibong mucus clearance. Para sa mga LV carrier na idinisenyo upang gamutin ang CF airway disease, ang pagpapataas ng residence time ng mga carrier particle sa loob ng conducting airways ay isang mahirap unawaing layunin noon pa man. Gaya ng itinuro nina Castellani et al., ang paggamit ng mga magnetic field upang mapabuti ang transduction ay may mga bentahe kumpara sa iba pang mga paraan ng paghahatid ng gene tulad ng electroporation, dahil maaari nitong pagsamahin ang pagiging simple, cost-effectiveness, delivery localization, mas mataas na kahusayan, at mas maikling oras ng incubation, at posibleng mas maliit na carrier dose10. Gayunpaman, ang in vivo deposition at pag-uugali ng mga magnetic particle sa mga airway sa ilalim ng impluwensya ng mga panlabas na magnetic forces ay hindi pa nailarawan, ni hindi pa talaga naipakita ang posibilidad ng pamamaraang ito in vivo upang mapahusay ang mga antas ng ekspresyon ng gene sa mga buo at buhay na airways.
Ipinakita ng aming mga eksperimento sa in vitro synchrotron PCXI na lahat ng mga particle na sinubukan namin, maliban sa polystyrene MP, ay nakikita sa imaging setup na ginamit namin. Sa presensya ng isang magnetic field, ang mga MP ay bumubuo ng mga string na ang haba ay nauugnay sa uri ng particle at lakas ng magnetic field (ibig sabihin, kalapitan at paggalaw ng magnet). Gaya ng ipinapakita sa Figure 10, ang mga string na aming naoobserbahan ay nabubuo dahil sa bawat indibidwal na particle na na-magnetize at nagdudulot ng sarili nitong lokal na magnetic field. Ang mga magkakahiwalay na field na ito ay nagiging sanhi ng iba pang katulad na mga particle na magsama-sama at magkonekta, na may mga grupo ng mga galaw na parang string dahil sa mga lokal na puwersa mula sa mga lokal na puwersang pang-akit at pang-urong ng iba pang mga particle.
Eskematikong nagpapakita ng (a,b) mga tren ng partikulo na nabuo sa loob ng mga capillary na puno ng pluido at (c,d) trachea na puno ng hangin. Tandaan na ang mga capillary at trachea ay hindi iginuhit ayon sa sukat. Ang panel (a) ay naglalaman din ng isang paglalarawan ng MP, na naglalaman ng mga partikulo ng Fe3O4 na nakaayos sa mga tali.
Nang igalaw ang magnet sa itaas ng capillary, ang anggulo ng string ng particle ay umabot sa isang kritikal na threshold para sa MP3-5 na naglalaman ng Fe3O4, pagkatapos nito ay hindi na nanatili ang string ng particle sa orihinal na posisyon, ngunit gumalaw sa ibabaw patungo sa isang bagong posisyon. magnet. Malamang na mangyari ang epektong ito dahil ang ibabaw ng glass capillary ay sapat na makinis upang pahintulutan ang paggalaw na ito. Kapansin-pansin, ang MP6 (CombiMag) ay hindi kumilos nang ganito, posibleng dahil ang mga particle ay mas maliit, may iba't ibang patong o karga sa ibabaw, o ang isang proprietary carrier fluid ay nakaapekto sa kanilang kakayahang gumalaw. Ang image contrast ng mga particle ng CombiMag ay mas mahina rin, na nagmumungkahi na ang fluid at mga particle ay maaaring may magkatulad na densidad at samakatuwid ay hindi madaling gumalaw patungo sa isa't isa. Maaari ring ma-stuck ang mga particle kung ang magnet ay gumagalaw nang masyadong mabilis, na nagpapahiwatig na ang lakas ng magnetic field ay hindi laging malalampasan ang friction sa pagitan ng mga particle sa fluid, na nagmumungkahi na marahil ay hindi nakakagulat na ang lakas ng magnetic field at ang distansya sa pagitan ng magnet at ng target na lugar ay napakahalaga. Kung pagsasama-samahin, ang mga resultang ito ay nagmumungkahi din na, habang ang mga magnet ay maaaring makakuha ng maraming MP na dumadaloy sa target na lugar, malamang na hindi maaasahan ang mga magnet. upang igalaw ang mga particle ng CombiMag sa ibabaw ng trachea. Samakatuwid, napagpasyahan namin na ang mga in vivo na pag-aaral ng LV-MP ay dapat gumamit ng mga static magnetic field upang pisikal na i-target ang mga partikular na rehiyon ng airway tree.
Kapag ang mga particle ay ipinapasok sa katawan, mahirap silang matukoy sa konteksto ng masalimuot na gumagalaw na tisyu ng katawan, ngunit ang kakayahang matukoy ang mga ito ay pinahusay sa pamamagitan ng pagsasalin ng magnet nang pahalang sa itaas ng trachea upang "iwagwag" ang mga MP string. Bagama't posible ang live imaging, mas madaling matukoy ang paggalaw ng particle kapag ang hayop ay napatay nang makataong-tao. Ang mga konsentrasyon ng MP ay karaniwang pinakamataas sa lokasyong ito kapag ang magnet ay nakaposisyon sa itaas ng lugar ng imaging, bagaman ang ilang mga particle ay karaniwang matatagpuan sa mas malayo sa trachea. Kabaligtaran sa mga in vitro na pag-aaral, ang mga particle ay hindi maaaring hilahin sa trachea sa pamamagitan ng pagsasalin ng magnet. Ang natuklasang ito ay naaayon sa kung paano karaniwang pinoproseso ng mucus na bumabalot sa ibabaw ng trachea ang mga nilalanghap na particle, na kinukuha ang mga ito sa mucus at kasunod na nililinis ng mekanismo ng mucociliary clearance.
Naghipotesis kami na ang paggamit ng mga magnet para sa pag-akit sa itaas at ibaba ng trachea (Fig. 3b) ay maaaring magresulta sa mas pare-parehong magnetic field, sa halip na isang magnetic field na lubos na puro sa isang punto, na posibleng humahantong sa mas pare-parehong distribusyon ng mga particle. Gayunpaman, ang aming paunang pag-aaral ay hindi nakahanap ng malinaw na ebidensya upang suportahan ang hypothesis na ito. Gayundin, ang pag-configure ng isang pares ng mga magnet upang maitaboy (Fig. 3c) ay hindi nagresulta sa mas maraming deposition ng particle sa nakuhanan ng imahe. Ipinapakita ng dalawang natuklasang ito na ang dual-magnet setup ay hindi makabuluhang nagpapabuti sa lokal na kontrol ng MP targeting, at ang nagreresultang malakas na magnetic forces ay mahirap i-configure, na ginagawang hindi gaanong praktikal ang pamamaraang ito. Katulad nito, ang pag-orient ng magnet sa itaas at sa pamamagitan ng trachea (Fig. 3d) ay hindi rin nagpataas ng bilang ng mga particle na napanatili sa nakuhanan ng imahe. Ang ilan sa mga alternatibong configuration na ito ay maaaring hindi maging matagumpay dahil nagreresulta ito sa mas mababang lakas ng magnetic field sa loob ng deposition area. Samakatuwid, ang single 30-degree angle magnet configuration (Figure 3a) ay itinuturing na pinakamadali at pinaka-epektibong paraan para sa in vivo testing.
Ipinakita ng pag-aaral ng LV-MP na nang ang mga LV vector ay pinagsama sa CombiMag at inilabas pagkatapos ng pisikal na pagkagambala sa presensya ng magnetic field, ang mga antas ng transduction ay tumaas nang malaki sa trachea kumpara sa mga kontrol. Batay sa mga pag-aaral ng synchrotron imaging at mga resulta ng LacZ, tila nagawa ng magnetic field na mapanatili ang LV sa loob ng trachea at mabawasan ang bilang ng mga vector particle na agad na tumagos nang malalim sa baga. Ang ganitong mga pagpapabuti sa pag-target ay maaaring humantong sa mas mataas na efficacy habang binabawasan ang mga naihatid na titer, off-target transduction, mga epekto ng pamamaga at immune system, at mga gastos sa gene carrier. Mahalaga, ayon sa tagagawa, ang CombiMag ay maaaring gamitin kasabay ng iba pang mga pamamaraan ng paglilipat ng gene, kabilang ang iba pang mga viral vector (tulad ng AAV) at mga nucleic acid.