Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta para sa CSS. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang mga gene vector para sa paggamot ng cystic fibrosis lung disease ay dapat na i-target ang conducting airways dahil hindi nagbibigay ng therapeutic benefit ang peripheral lung transduction. ay mahalaga ngunit mahirap makamit.Gene carrier-conjugated magnetic particles na maaaring idirekta sa ibabaw ng mga daanan ng hangin ay maaaring mapabuti ang rehiyonal na pag-target.Dahil sa mga hamon ng in vivo visualization, ang pag-uugali ng naturang maliliit na magnetic particle sa ibabaw ng daanan ng hangin sa pagkakaroon ng isang inilapat na magnetic field ay hindi gaanong nauunawaan.Ang layunin ng pag-aaral na ito ay ang paggamit ng synchrotron imaging sa serye ng magnetic na imaging ng isang in vivo. Ang mga anesthetized na daga upang suriin ang dynamics at pattern ng indibidwal at bulk particle na pag-uugali sa vivo. Pagkatapos ay tinasa din namin kung ang paghahatid ng mga lentiviral magnetic particle sa presensya ng magnetic field ay magpapataas ng transduction efficiency sa rat trachea. Synchrotron X-ray imaging ay nagpapakita ng pag-uugali ng magnetic particle sa nakatigil at gumagalaw na magnetic field sa vitro at in vivo na hindi maaaring madaling mabuhay kasama ang mga nabubuhay na magnetic field sa vitro at in vivo. magnet, ngunit sa panahon ng transportasyon, ang mga deposito ay puro sa larangan ng view kung saan ang magnetic field ay pinakamalakas. Ang transduction efficiency ay tumaas din ng anim na beses kapag ang lentiviral magnetic particle ay naihatid sa presensya ng isang magnetic field. Sama-sama, ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang lentiviral magnetic particle at magnetic field ay maaaring maging mahalagang mga diskarte upang mapabuti ang pag-target ng vector ng gene at pataasin ang mga antas ng transduction sa pagsasagawa ng mga daanan ng hangin sa vivo.
Ang cystic fibrosis (CF) ay sanhi ng pagkakaiba-iba sa isang gene na tinatawag na CF transmembrane conductance regulator (CFTR). pinipigilan ang kakayahan ng mucociliary transport (MCT) system na alisin ang mga inhaled particle at pathogen mula sa mga daanan ng hangin. Ang aming layunin ay bumuo ng lentiviral (LV) gene therapy upang maihatid ang tamang kopya ng CFTR gene at mapabuti ang kalusugan ng ASL, MCT, at baga, at upang magpatuloy sa pagbuo ng mga bagong teknolohiyang may kakayahang sukatin ang mga parameter na ito sa vivo1.
Ang mga LV vectors ay isa sa mga nangungunang kandidato para sa CF airway gene therapy, pangunahin dahil maaari nilang permanenteng isama ang therapeutic gene sa mga basal cell ng daanan ng hangin (airway stem cells). nagsisimula.Ang paghahatid ng vector na mas malalim sa baga ay maaaring magresulta sa alveolar transduction, ngunit wala itong therapeutic benefit sa CF.Gayunpaman, ang mga likido tulad ng mga gene carrier ay natural na lumilipat sa alveoli kapag may inspirasyon pagkatapos ng paghahatid3,4 at ang mga therapeutic particle ay mabilis na na-clear sa oral cavity ng MCT.LV transduction sa mga cell na may direktang kaugnayan sa pag-target ng mga cell sa susunod na oras. time”5 – na madaling nababawasan ng tipikal na regional airflow pati na rin ang coordinated particle mucus capture at MCT. Para sa CF, ang kakayahang pahabain ang tagal ng paninirahan ng LV sa loob ng daanan ng hangin ay mahalaga upang makamit ang mataas na antas ng transduction sa rehiyong ito, ngunit sa ngayon ay naging hamon.
Upang malampasan ang balakid na ito, iminumungkahi namin na ang mga LV magnetic particle (MPs) ay maaaring makatulong sa dalawang pantulong na paraan. Una, maaari silang magnetically guided sa airway surface upang mapabuti ang pag-target at tulungan ang mga gene carrier particle na manirahan sa nais na rehiyon ng daanan ng hangin; at ASL) upang lumipat sa cell layer 6. Ang mga MP ay malawakang ginagamit bilang mga naka-target na sasakyan sa paghahatid ng gamot kapag sila ay nagbubuklod sa mga antibodies, chemotherapeutic na gamot, o iba pang maliliit na molekula na nakakabit sa mga lamad ng cell o nagbubuklod sa mga nauugnay na cell surface receptor at naipon sa mga site ng tumor sa pagkakaroon ng static na kuryente. Mga Magnetic Field para sa Paggamot sa Kanser 7. Ang ibang "hyperthermal" na pamamaraan ay naglalayong painitin ang mga MP kapag sila ay nalantad sa oscillating magnetic field, at sa gayon ay sinisira ang mga selula ng tumor. naitatag ang magnetotransfection, na may in vitro na paghahatid ng LV-MPs sa isang human bronchial epithelial cell line sa pagkakaroon ng isang static magnetic field, na nagpapataas ng transduction efficiency ng 186-fold kumpara sa LV vector lamang. Ang LV-MP ay inilapat din sa isang in vitro CF model, kung saan ang magnetic transfection ay nagpapataas ng LV transduction sa air-liquid-fold na kultura sa presensya ng 20, CFHoever na interface culture sa pamamagitan ng 20, CFuver interface culture. vivo magnetotransfection ng mga organo ay nakatanggap ng medyo maliit na atensyon at nasuri lamang sa ilang mga pag-aaral ng hayop11,12,13,14,15, lalo na sa baga16,17. Gayunpaman, ang mga pagkakataon para sa magnetic transfection sa CF lung therapy ay nagsasaad na "isang proof-of-pulmonary concepticle ay pag-aaralan ang isang proof-of-concepticle sa hinaharap na paraan ng paghahatid ng magnetic. Mga diskarte sa paglanghap ng CFTR upang mapabuti ang mga klinikal na resulta sa mga pasyente ng CF”6.
Ang pag-uugali ng maliliit na magnetic particle sa mga ibabaw ng daanan ng hangin sa pagkakaroon ng isang inilapat na magnetic field ay mahirap ilarawan at pag-aralan, at sa gayon ay hindi gaanong nauunawaan. Sa ibang mga pag-aaral, bumuo kami ng isang synchrotron-propagation-based phase-contrast X-ray imaging (PB-PCXI) na pamamaraan upang hindi invasive na mailarawan at mabibilang ang minuto sa mga pagbabago sa vivo sa lalim ng ASL0 at tuwirang pagsukat ng lalim ng ASL19, Can2 gashy18. at ginamit bilang isang maagang tagapagpahiwatig ng pagiging epektibo ng paggamot. Bilang karagdagan, ang aming paraan ng pagsusuri sa MCT ay gumagamit ng 10–35 µm diameter na mga particle na binubuo ng alumina o mataas na refractive index glass bilang MCT marker na nakikita gamit ang PB-PCXI21. Ang parehong mga diskarte ay angkop para sa visualization ng isang hanay ng mga uri ng particle, kabilang ang MP.
Dahil sa mataas na spatial at temporal na resolusyon nito, ang aming mga diskarte sa pagsusuri ng ASL at MCT na nakabatay sa PB-PCXI ay angkop para sa pagsusuri sa dynamics at pattern ng single at bulk particle na pag-uugali sa vivo upang matulungan kaming maunawaan at ma-optimize ang mga diskarte sa paghahatid ng gene ng MP. Ang diskarte na ginagamit namin dito ay nagmula sa aming mga pag-aaral gamit ang SPring-8 BL20B2 kung saan namin na-beamline ang paghahatid ng vector at paggalaw ng vector, kung saan namin na-beamline ang paghahatid ng vector. pulmonary airways ng mga daga upang makatulong na ipaliwanag ang aming Hindi pare-parehong mga pattern ng expression ng gene na naobserbahan sa aming gene carrier dose animal studies 3,4 .
Ang layunin ng pag-aaral na ito ay gamitin ang synchrotron PB-PCXI upang mailarawan ang in vivo na mga galaw ng isang serye ng mga MP sa trachea ng mga buhay na daga. Ang mga pag-aaral ng imaging ng PB-PCXI na ito ay idinisenyo upang subukan ang isang hanay ng mga MP, lakas ng magnetic field, at mga lokasyon upang matukoy ang kanilang epekto sa paggalaw ng MP. Ipinagpalagay namin na ang mga pag-aaral na ito ay makakatulong sa panlabas na inilapat na magnetic field upang mapanatili ang magnetic field. sa amin upang matukoy ang mga kumpigurasyon ng magnet na nag-maximize sa bilang ng mga particle na nananatili sa trachea pagkatapos ng pag-deposition. Sa pangalawang serye ng mga pag-aaral, hinangad naming gamitin ang pinakamainam na configuration na ito upang ipakita ang transduction pattern na nagreresulta mula sa in vivo na paghahatid ng LV-MPs sa rat airway, batay sa pag-aakalang ang paghahatid ng LV-MPs sa konteksto ng pag-target sa daanan ng hangin ay magreresulta sa mas mahusay na transduction ng LV.
Isinagawa ang lahat ng pag-aaral sa hayop ayon sa mga protocol na inaprubahan ng University of Adelaide (M-2019-060 at M-2020-022) at ng SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Isinagawa ang mga eksperimento ayon sa mga alituntunin ng ARRIVE.
Ang lahat ng X-ray imaging ay isinagawa sa BL20XU beamline sa SPring-8 synchrotron sa Japan, gamit ang isang setup na katulad ng inilarawan dati21,22. Sa madaling sabi, ang experimental box ay matatagpuan 245 m mula sa synchrotron storage ring. Ang isang sample-to-detector na distansya na 0.6 m ay ginagamit para sa vivo imaging na pag-aaral para sa mga pag-aaral ng phase imaging ng vivo. effect. Ginamit ang isang monochromatic beam energy na 25 keV. Nakuha ang mga larawan gamit ang high-resolution na X-ray converter (SPring-8 BM3) na isinama sa isang sCMOS detector. Kino-convert ng converter ang mga X-ray sa nakikitang liwanag gamit ang 10 µm thick scintillator (Gd3Al2Ga3O12) na nakadirekta sa isang skopyo (Gd3Al2Ga3O12). (NA 0.3).Ang sCMOS detector ay Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) na may array size na 2048 × 2048 pixels at isang raw pixel size na 6.5 × 6.5 µm. Ang setup na ito ay nagbubunga ng epektibong isotropic pixel size na 0.51 µm × 1 na exposure na humigit-kumulang na 0.51 µm × 1 na patlang. Pinili ang 100 ms upang i-maximize ang ratio ng signal-to-noise ng mga magnetic particle sa loob at labas ng daanan ng hangin habang pinapaliit ang mga artifact na dulot ng paghinga. Para sa mga pag-aaral sa vivo, isang mabilis na X-ray shutter ang inilagay sa X-ray path upang limitahan ang dosis ng radiation sa pamamagitan ng pagharang sa X-ray beam sa pagitan ng mga exposure.
Ang LV carrier ay hindi ginamit sa anumang SPring-8 PB-PCXI imaging studies dahil ang BL20XU imaging chamber ay hindi Biosafety Level 2 certified. Sa halip, pumili kami ng isang hanay ng mahusay na characterized na mga MP mula sa dalawang komersyal na supplier—na sumasaklaw sa iba't ibang laki, materyales, iron concentrations, at applications—una na maunawaan kung paano nakakaapekto ang mga MP air motion sa loob ng mga magnetic field at pagkatapos ay ang mga MP air motion sa loob ng mga magnetic field. sa ibabaw.Ang mga MP ay may sukat mula 0.25 hanggang 18 μm at ginawa mula sa iba't ibang materyales (tingnan ang Talahanayan 1), ngunit ang komposisyon ng bawat sample, kasama ang laki ng mga magnetic particle sa loob ng MP, ay hindi alam. pagbabawas ng magkakasunod na mga frame upang makita ang pinahusay na visibility ng MP motion. Ang isang solong 0.25 μm-sized na MP ay mas maliit kaysa sa resolution ng imaging device, ngunit inaasahang matutuklasan ng PB-PCXI ang contrast ng volume ng mga ito at ang paggalaw ng surface fluid kung saan idineposito ang mga ito pagkatapos ng deposition.
Ang mga sample para sa bawat MP sa Talahanayan 1 ay inihanda sa 20 μl glass capillaries (Drummond Microcaps, PA, USA) na may inner diameter na 0.63 mm. Ang mga corpuscular particle ay makukuha sa tubig, habang ang CombiMag particle ay available sa proprietary fluid ng manufacturer. Ang bawat tube ay kalahating puno ng likido (humigit-kumulang 11 μl na glass holder) at (tingnan ang sample capries). inilagay nang pahalang sa sample stage sa imaging box, ayon sa pagkakasunod-sunod, at nakaposisyon ang mga gilid ng fluid. Isang 19 mm diameter (28 mm ang haba) nickel shell rare earth neodymium iron boron (NdFeB) magnet (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) na may natitirang posisyong translate na nakakabit sa 1.17 na Tesla sa panahon ng hiwalay na posisyon ng pagsasalin. imaging.Nagsisimula ang pagkuha ng larawan ng X-ray kapag ang magnet ay nakaposisyon nang humigit-kumulang 30 mm sa itaas ng sample, at ang mga larawan ay nakuha sa bilis na 4 na mga frame bawat segundo. Sa panahon ng imaging, ang magnet ay inilapit sa glass capillary tube (mga 1 mm ang layo) at pagkatapos ay isinalin sa kahabaan ng tubo upang masuri ang mga epekto ng lakas at posisyon ng field.
In vitro imaging setup na naglalaman ng mga sample ng MP sa mga glass capillaries sa sample xy translation stage. Ang landas ng X-ray beam ay minarkahan ng pulang linyang putol-putol.
Kapag naitatag na ang in vitro visibility ng mga MP, isang subset ng mga ito ang nasubok sa vivo sa wild-type na babaeng albino Wistar na daga (~12 linggong gulang, ~200 g).0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas phanol Pharma, Japan) atji. Seika) Ang mga daga ay na-anesthetize na may pinaghalong Pharma), Japan) sa pamamagitan ng intraperitoneal injection. Pagkatapos ng anesthesia, sila ay inihanda para sa imaging sa pamamagitan ng pag-alis ng balahibo sa paligid ng trachea, pagpasok ng isang endotracheal tube (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) at i-immobilize ang mga ito nang nakadapa sa isang custom-made na imaging plate na may temperaturang body2 noon. naka-attach sa sample na yugto ng pagsasalin sa kahon ng imaging sa isang bahagyang anggulo upang ihanay ang trachea nang pahalang sa X-ray na imahe, tulad ng ipinapakita sa Figure 2a.
(a) In vivo imaging setup sa SPring-8 imaging box, ang daanan ng X-ray beam ay minarkahan ng isang pulang linyang putol-putol.(b,c) Ang pag-localize ng magnet sa trachea ay isinagawa nang malayuan gamit ang dalawang orthogonally mounted na IP camera. Sa kaliwang bahagi ng screen image, makikita ang wire loop na humahawak sa ulo sa lugar, at ang paghahatid ng cannula ay makikita sa loob ng cannula.
Isang remote-controlled na syringe pump system (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) gamit ang 100 μl glass syringe ay ikinonekta sa PE10 tubing (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) sa pamamagitan ng 30 Ga needle. Markahan ang tubo upang matiyak na ang tip ay nasa tamang posisyon sa trachea kapag ipinapasok ang ET tube. Inalis habang ang dulo ng tubo ay inilubog sa MP sample na ihahatid. Ang load na delivery tube ay ipinasok sa endotracheal tube, na inilagay ang dulo sa pinakamalakas na bahagi ng aming inaasahang inilapat na magnetic field. Ang pagkuha ng larawan ay kinokontrol gamit ang respiration detector na konektado sa aming Arduino based na timing box, at lahat ng signal (hal. temperatura, respiration, at shutter opening ay record ng Lab. (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Kapag nag-i-imaging Kapag hindi naa-access ang enclosure, dalawang IP camera (Panasonic BB-SC382) ay nakaposisyon sa humigit-kumulang 90° sa isa't isa at ginamit upang subaybayan ang posisyon ng magnet na may kaugnayan sa trachea sa panahon ng imaging (Fig. 2b, c). Upang mabawasan ang motion plateau ng mga artifact sa bawat dulo ng paghinga, nakuha ang isang motion plateau artifacts.
Ang isang magnet ay nakakabit sa isang pangalawang yugto na maaaring matatagpuan nang malayuan mula sa labas ng imaging housing. Iba't ibang mga posisyon at configuration ng magnet ang sinubukan, kabilang ang: Naka-mount sa isang anggulo na humigit-kumulang 30° sa itaas ng trachea (mga configuration na ipinapakita sa Mga Figure 2a at 3a); isang magnet sa itaas ng hayop at ang isa sa ibaba, na may mga poste na nakatakdang akitin (Figure 3b ); isang magnet sa itaas ng hayop at ang isa sa ibaba, na ang mga poste ay nakatakdang itaboy (Larawan 3c); at isang magnet sa itaas at patayo sa trachea (Figure 3d). Kapag na-configure na ang hayop at magnet at ang MP na susuriin ay na-load sa syringe pump, maghatid ng 50 μl na dosis sa bilis na 4 μl/sec habang kumukuha ng mga larawan. Ang magnet ay ginagalaw pabalik-balik kasama o nagpapatuloy sa tapat ng trachea.
Configuration ng magnet para sa in vivo imaging (a) isang magnet sa itaas ng trachea sa isang anggulo na humigit-kumulang 30°, (b) dalawang magnet na nakatakdang akitin, (c) dalawang magnet na nakatakdang itaboy, (d) isang magnet sa itaas at patayo sa trachea. Ang nagmamasid ay tumingin pababa mula sa bibig hanggang sa baga sa pamamagitan ng trachea, at ang X-ray na beam ay dumaan sa kanan sa gilid ng erya. Ang magnet ay maaaring ilipat sa kahabaan ng daanan ng hangin o kaliwa at kanan sa itaas ng trachea sa direksyon ng X-ray beam.
Hinahangad din naming matukoy ang visibility at pag-uugali ng mga particle sa mga daanan ng hangin sa kawalan ng nakakalito na paghinga at paggalaw ng puso. Samakatuwid, sa pagtatapos ng panahon ng imaging, ang mga hayop ay makataong pinatay para sa pentobarbital overdose (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip, at naiwan ang ilang mga hayop sa pag-imag na humihinga at humihinga sa puso sa sandaling imag. ang proseso ay paulit-ulit, nagdaragdag ng karagdagang dosis ng MP kung walang MP na nakikita sa ibabaw ng daanan ng hangin.
Ang mga nakuhang larawan ay flat-field at dark-field na itinama at pagkatapos ay na-assemble sa isang pelikula (20 frames per second; 15-25 × normal na bilis depende sa respiratory rate) gamit ang custom na script na nakasulat sa MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ang lahat ng pag-aaral ng paghahatid ng LV gene vector ay isinagawa sa Laboratory Animal Research Facility sa University of Adelaide at naglalayong gamitin ang mga resulta ng eksperimento sa SPring-8 upang masuri kung ang paghahatid ng LV-MP sa pagkakaroon ng magnetic field ay maaaring mapahusay ang paglipat ng gene sa vivo.
Ang mga LV gene vector ay nabuo gamit ang mga naunang inilarawan na pamamaraan 25, 26 . Ang LacZ vector ay nagpapahayag ng nuclear-localized beta-galactosidase gene na hinimok ng constitutive MPSV promoter (LV-LacZ), na gumagawa ng isang produkto ng asul na reaksyon sa mga transduced na mga cell, na nakikita sa mga harapan ng tissue ng baga at mga seksyon ng tissue. Ang titration ay isinagawa sa pagkalkula ng mga cell culture sa pamamagitan ng manu-manong bilang ng mga cell culture ng Laccy. titer sa TU/ml. Ang mga carrier ay cryopreserved sa -80 °C, lasaw bago gamitin, at itinatali sa CombiMag sa pamamagitan ng paghahalo sa isang 1:1 ratio at pag-incubate sa yelo nang hindi bababa sa 30 minuto bago ang paghahatid.
Ang mga normal na daga ng Sprague Dawley (n = 3/grupo, ~2-3 ay na-anesthetize sa intraperitoneal na may pinaghalong 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) at 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australia) buwanang gulang) ip) na iniksyon at non-surgical na oral cannulation na may 16 Ga ivduction ng tissue. ito ay nakondisyon gamit ang aming naunang inilarawan na mechanical perturbation protocol, kung saan ang ibabaw ng tracheal airway ay kinuskos ng axially gamit ang wire basket (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Ang Tracheal administration ng LV-MP ay isinagawa pagkatapos ng humigit-kumulang na 10 minutong kaligtasan pagkatapos ng biological na cabinet.
Ang magnetic field na ginamit sa eksperimentong ito ay na-configure sa katulad na paraan sa in vivo X-ray imaging study, na may parehong mga magnet na hawak sa itaas ng trachea gamit ang distillation stent clips (Figure 4). Isang 50 μl volume (2 × 25 μl aliquots) ng LV-MP ang inihatid sa trachea (n = 3 na nakaraang mga hayop) na inilarawan sa isang pipette na naglalaman ng mga hayop. 3 hayop) ay nakatanggap ng parehong LV-MPs nang walang paggamit ng magnet. Pagkatapos makumpleto ang pagbubuhos, ang cannula ay tinanggal mula sa ET tube at ang hayop ay pinalabas. Ang magnet ay nananatili sa lugar sa loob ng 10 minuto, pagkatapos ay tinanggal ito. Ang mga daga ay nakatanggap ng subcutaneous na dosis ng meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) na sinusundan ng pagbabalik ng ip chloride ng anesthesia sa pamamagitan ng hydropamazole at mgchloride. (Antisedan, Zoetis, Australia). Ang mga daga ay pinananatiling mainit at sinusubaybayan hanggang sa ganap na gumaling mula sa kawalan ng pakiramdam.
LV-MP delivery device sa isang biological safety cabinet. Ang light gray na Luer hub ng ET tube ay makikitang nakausli mula sa bibig at ang gel tip ng pipette na ipinapakita sa larawan ay ipinasok sa pamamagitan ng ET tube sa nais na lalim sa trachea.
Isang linggo pagkatapos ng LV-MP dosing procedure, ang mga hayop ay makataong pinatay sa pamamagitan ng 100% CO2 inhalation at ang LacZ expression ay tinasa gamit ang aming karaniwang X-gal treatment. Ang tatlong caudal most cartilaginous rings ay inalis upang matiyak na ang anumang mekanikal na pinsala o fluid retention mula sa endotracheal tube placement ay hindi kasama sa pagsusuri. Ang bawat trachea ay pinutol nang pahaba para sa pagtatasa, at ang mga ito ay pinutol nang pahaba para sa pagsusuri ng dalawang goma. (Sylgard, Dow Inc) gamit ang isang Minutien needle (Fine Science Tools) upang mailarawan ang luminal surface. Ang distribusyon at pattern ng transduced na mga cell ay kinumpirma ng frontal photography gamit ang isang Nikon microscope (SMZ1500) na may isang DigiLite camera at TCapture software (Tucsen Photonics, China). Ang mga larawan ay nakuha sa pinakamataas na setting ng 20x (kasama ang buong pag-magnify) ang haba ng trachea na kino-image nang sunud-sunod, na tinitiyak ang sapat na overlap sa pagitan ng bawat imahe upang bigyang-daan ang "pag-stitching" ng larawan. Ang mga larawan mula sa bawat trachea ay pinagsama-sama sa isang solong composite na imahe gamit ang Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) na gumagamit ng planar motion algorithm. Ang mga lugar ng expression ng LacZ sa mga composite na larawan ng isang hayop ay na-trachea mula sa MAT script ng bawat hayop. (R2020a, MathWorks) gaya ng naunang inilarawan, gamit ang mga setting na 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, at Value < 0.7. Sa pamamagitan ng pagsubaybay sa mga contour ng tissue, manu-manong nabuo ang mask sa GIMP v2.10.24 para sa bawat composite na imahe upang maiwasan ang lahat ng natukoy na lugar ng tissue mula sa labas. pinagsama-samang mga imahe mula sa bawat hayop ay summed upang makabuo ng kabuuang stained area para sa hayop na iyon.
Ang bawat trachea ay naka-embed sa paraffin at 5 μm na mga seksyon ay pinutol. Ang mga seksyon ay na-counterstain na may neutral na mabilis na pula para sa 5 min at ang mga imahe ay nakuha gamit ang isang Nikon Eclipse E400 microscope, DS-Fi3 camera at NIS element capture software (bersyon 5.20.00).
Ang lahat ng istatistikal na pagsusuri ay isinagawa sa GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Ang kahalagahan ng istatistika ay itinakda sa p ≤ 0.05. Na-verify ang normality gamit ang Shapiro-Wilk test, at ang mga pagkakaiba sa paglamlam ng LacZ ay nasuri gamit ang hindi paired t-test.
Ang anim na MP na inilarawan sa Talahanayan 1 ay napagmasdan gamit ang PCXI, at ang kakayahang makita ay inilarawan sa Talahanayan 2. Dalawang polystyrene MPs (MP1 at MP2; 18 μm at 0.25 μm, ayon sa pagkakabanggit) ay hindi nakikita sa ilalim ng PCXI, ngunit ang natitirang mga sample ay nakikilala (mga halimbawa ay ipinapakita sa Female Figure 4 5). Ang 0.25 μm at 0.9 μm, ayon sa pagkakabanggit) ay mahinang nakikita. Bagama't naglalaman ng ilan sa pinakamaliit na particle na nasubok, ang MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) ay ang pinaka-binibigkas. Ang produkto ng CombiMag na MP6 ay mahirap makita. Sa lahat ng kaso, ang aming kakayahang makita ang MP ay makabuluhang pinahusay ang parating pabalik sa pamamagitan ng transW. ang mga magnet ay lumayo mula sa capillary, ang mga particle ay pinahaba sa mahabang mga string, ngunit habang ang mga magnet ay lumalapit at ang lakas ng magnetic field ay tumaas, ang mga particle ng mga string ay umikli habang ang mga particle ay lumipat patungo sa tuktok na ibabaw ng capillary (tingnan ang Karagdagang Video S1: MP4), na tumataas Ang particle density ng ibabaw. Sa kabaligtaran, kapag ang magnet ay inalis mula sa mga capillary at ang mga string ng MP ay bumababa sa ibabaw ng rerange sa ibabaw ng mahabang field, ang mahabang field ng lakas ay bumababa sa pang-ibabaw na ibabaw. capillary (tingnan ang Karagdagang Video S2:MP4).Pagkatapos huminto sa paggalaw ang magnet, ang mga particle ay patuloy na gumagalaw sa loob ng maikling panahon pagkatapos maabot ang posisyon ng equilibrium.Habang ang MP ay gumagalaw patungo at palayo mula sa tuktok na ibabaw ng capillary, kadalasang hinihila ng mga magnetic particle ang mga labi sa fluid.
Malaki ang pagkakaiba ng visibility ng MP sa ilalim ng PCXI sa pagitan ng mga sample.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 at (d) MP6. Ang lahat ng mga larawang ipinakita dito ay kinuha gamit ang magnet na matatagpuan humigit-kumulang 10 mm sa itaas ng capillary. magnification.Tandaan na ang mga diameter ng magnet schematics sa lahat ng figure ay hindi sukat at humigit-kumulang 100 beses na mas malaki kaysa sa ipinapakita.
Habang isinasalin ang magnet sa kaliwa at kanan sa tuktok ng capillary, ang anggulo ng string ng MP ay nagbabago upang ihanay sa magnet (tingnan ang Figure 6), kaya nagde-deline ng mga linya ng magnetic field. Para sa MP3-5, pagkatapos maabot ng chord ang isang threshold angle, ang mga particle ay kinakaladkad sa tuktok na ibabaw ng capillary. Madalas itong nagreresulta sa pagkumpol ng mga MP sa mas malalaking grupo ng Supplement. S3:MP5). Partikular din itong nakikita kapag nag-i-imaging malapit sa dulo ng capillary, na nagiging sanhi ng pagsasama-sama at pag-concentrate ng mga MP sa fluid-air interface. Ang mga partikulo sa MP6, na mas mahirap matukoy kaysa sa MP3-5, ay hindi na-drag habang gumagalaw ang magnet sa kahabaan ng capillary, ngunit ang mga string ng MP ay naghiwalay sa mga Supplement na patlang ng Video, na nag-iiwan sa mga Supplement ng Video 6. kaso, kapag ang inilapat na magnetic field ay nabawasan sa pamamagitan ng paglipat ng magnet sa isang malaking distansya mula sa lokasyon ng imaging, anumang natitirang mga MP ay dahan-dahang bumaba sa ilalim na ibabaw ng tubo sa pamamagitan ng gravity habang nananatili sa string (tingnan ang Karagdagang Video S5: MP3).
Ang anggulo ng MP string ay nagbabago habang ang magnet ay isinalin sa kanan sa itaas ng capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 at (d) MP6. Ang pulang kahon ay naglalaman ng contrast-enhancing magnification.
Ipinakita ng aming mga pagsusuri na ang paggalaw ng magnet nang dahan-dahan sa kahabaan ng trachea ay nagpapadali sa visualization ng MP sa konteksto ng kumplikadong paggalaw sa vivo. Sa vivo testing ay hindi isinagawa dahil ang polystyrene beads (MP1 at MP2) ay hindi nakikita sa capillary. Ang bawat isa sa natitirang apat na MP ay nasubok sa vivo gamit ang magnet na mahabang axis na na-configure sa itaas ng trachea na naka-configure sa isang ° Figure sa itaas ng trachea. 3a), dahil nagresulta ito sa mas mahabang chain ng MP at mas epektibo kaysa sa pagwawakas ng magnet configuration. Ang MP3, MP4 at MP6 ay hindi nakita sa trachea ng anumang buhay na hayop. Kapag ang mga daanan ng daga ay nakunan ng larawan pagkatapos patayin ang mga hayop, ang mga particle ay nanatiling hindi nakikita kahit na ang karagdagang volume ay idinagdag gamit ang isang syringe pump. Ang MP5 ay may pinakamataas na nilalaman at ang tanging nilalaman ay ang iron oxide. vivo pag-uugali ng MP.
Ang paglalagay ng magnet sa ibabaw ng trachea sa panahon ng paghahatid ng MP ay nagresulta sa marami, ngunit hindi lahat, ang mga MP ay nakakonsentra sa larangan ng pagtingin. Ang mga partikulo na pumapasok sa trachea ay pinakamahusay na naobserbahan sa makataong mga hayop na isinakripisyo. Figure 7 at Karagdagang Video S6: Ang MP5 ay nagpapakita ng mabilis na magnetic capture at pagkakahanay ng mga particle sa ibabaw ng ventral trachea, na nagpapahiwatig na ang rehiyon ng trachea ay maaaring idirekta ng trachea. naghahanap ng mas malayo sa kahabaan ng trachea pagkatapos ng paghahatid ng MP, ang ilang mga MP ay natagpuang mas malapit sa carina, na nagmumungkahi na ang lakas ng magnetic field ay hindi sapat upang kolektahin at mapanatili ang lahat ng mga MP, dahil sila ay inihatid sa pamamagitan ng rehiyon na may pinakamataas na lakas ng magnetic field sa panahon ng proseso ng likido. Gayunpaman, ang mga postpartum na konsentrasyon ng MP ay mas mataas sa paligid ng nakalarawang lugar, na nagmumungkahi na maraming mga MP ang nanatili sa pinakamataas na lakas ng magnetic field sa daanan ng hangin.
Mga larawan mula sa (a) bago at (b) pagkatapos ihatid ang MP5 sa trachea ng isang kamakailang na-euthanized na daga na may magnet na nakaposisyon nang direkta sa itaas ng lugar ng imaging. Ang imaheng lugar ay matatagpuan sa pagitan ng dalawang cartilage ring.
Ang pagsasalin ng magnet sa kahabaan ng trachea sa vivo ay nagdulot ng pagbabago ng anggulo ng chain ng MP sa loob ng ibabaw ng daanan ng hangin sa paraang katulad ng nakikita sa mga capillary (tingnan ang Figure 8 at Karagdagang Video S7:MP5). Gayunpaman, sa aming pag-aaral, ang mga MP ay hindi maaaring i-drag sa ibabaw ng buhay na daanan ng hangin gaya ng magagawa nila sa mga capillary. Sa ilang mga kaso, ang mga kadena ng MP ay mas mahahaba din habang ang mga kadena ng MP. Lumilitaw na binabago ng particle string ang lalim ng surface fluid layer kapag ang magnet ay inilipat nang pahaba sa kahabaan ng trachea, at lumalawak kapag ang magnet ay direktang inilipat sa itaas at ang particle string ay iniikot sa isang patayong posisyon (tingnan ang Karagdagang Video S7). : MP5 sa 0:09, ibabang kanan). Nagbago ang katangiang pattern ng paggalaw nang ang magnet ay isinalin sa ibabaw ng trachea sa gilid (iyon ay, sa kaliwa o kanan ng hayop sa halip na sa haba ng trachea). Ang mga particle ay malinaw pa ring nakikita habang sila ay gumagalaw, ngunit nang ang magnet ay tinanggal mula sa trachea, ang mga dulo ng mga string ng particle ay makikita simula S:8MP5 ito. pare-pareho sa pag-uugali ng MP na naobserbahan namin sa ilalim ng isang inilapat na magnetic field sa isang glass capillary.
Mga halimbawang larawan na nagpapakita ng MP5 sa trachea ng isang live na anesthetized na daga.(a) Ang magnet ay ginagamit upang kumuha ng mga larawan sa itaas at sa kaliwa ng trachea, pagkatapos ay (b) pagkatapos ilipat ang magnet sa kanan. Ang pulang kahon ay naglalaman ng contrast-enhancing magnification. Ang mga larawang ito ay mula sa video na ipinapakita sa Karagdagang Video S7:MP5.
Kapag ang dalawang pole ay na-configure sa isang hilaga-timog na oryentasyon sa itaas at ibaba ng trachea (ibig sabihin, pag-akit; Fig. 3b), ang mga MP chords ay lumitaw nang mas mahaba at matatagpuan sa sidewall ng trachea sa halip na sa ibabaw ng dorsal tracheal (tingnan ang Karagdagang Video S9:MP5). ginamit ang isang dual-magnet device, na kadalasang nangyayari kapag ginagamit ang isang single-magnet device. Pagkatapos ay kapag ang isang magnet ay na-configure upang itaboy ang mga pole na nabaligtad (Fig. 3c), ang bilang ng mga particle na nakikita sa larangan ng view ay hindi lumalabas na tumaas pagkatapos ng paghahatid. Ang pag-setup ng parehong dual-magnet na mga configuration ay mahirap dahil sa mataas na lakas ng magnetic field, pagkatapos ay binago ang isang magnetic field na lakas, pagkatapos ay binago ang iisang magnetic field. papunta sa daanan ng hangin ngunit dumadaan sa daanan ng hangin sa 90 degrees upang ang mga linya ng field ay tumawid sa tracheal wall nang orthogonal (Fig. 3d), isang orientation na idinisenyo upang matukoy kung ang particle aggregation sa side wall ay maaaring maobserbahan. Gayunpaman, sa configuration na ito, walang makikilalang paggalaw ng MP accumulation o magnet movement. 3a) ay pinili para sa mga pag-aaral sa vivo gene carrier.
Kapag ang hayop ay paulit-ulit na kinunan ng larawan kaagad pagkatapos ng makataong pagpatay, ang kawalan ng nakakalito na paggalaw ng tissue ay nangangahulugan na ang mas pino at mas maiikling mga linya ng particle ay maaaring matukoy sa malinaw na interchondral field, "wobbly" alinsunod sa translational motion ng magnet. Gayunpaman, hindi pa rin malinaw na nakikita ang presensya at paggalaw ng mga partikulo ng MP6.
Ang titer ng LV-LacZ ay 1.8 × 108 TU / ml, at pagkatapos ng 1: 1 na paghahalo sa CombiMag MP (MP6), ang mga hayop ay nakatanggap ng 50 μl tracheal na dosis ng 9 × 107 TU / ml LV na sasakyan (ibig sabihin 4.5 × 106 TU / daga). ).Sa mga pag-aaral na ito, sa halip na isalin ang magnet sa panahon ng paggawa, inayos namin ang magnet sa isang posisyon upang matukoy kung ang LV transduction (a) ay maaaring mapabuti kumpara sa paghahatid ng vector sa kawalan ng magnetic field, at (b) ay maaaring nakatutok Ang mga selula ng Airway ay nailipat sa magnetic target na mga rehiyon ng itaas na daanan ng hangin.
Ang pagkakaroon ng mga magnet at ang paggamit ng CombiMag na sinamahan ng mga LV vectors ay hindi lumilitaw na magkaroon ng masamang epekto sa kalusugan ng hayop, tulad ng aming karaniwang LV vector delivery protocol. Ang mga harapang larawan ng tracheal region na sumailalim sa mechanical perturbation (Karagdagang Fig. 1) ay nagpahiwatig na mayroong makabuluhang mas mataas na antas ng transduction sa pangkat ng mga hayop na ginagamot sa LV-MP na may maliit na halaga (Fig. staining ay naroroon sa control group (Larawan 9b). Ang dami ng normalized X-Gal stained area ay nagpakita na ang pangangasiwa ng LV-MP sa pagkakaroon ng magnetic field ay gumawa ng humigit-kumulang 6 na beses na pagpapabuti (Fig. 9c).
Halimbawa ng mga composite na larawan na nagpapakita ng tracheal transduction ng LV-MP (a) sa pagkakaroon ng magnetic field at (b) sa kawalan ng magnet.(c) Statistically makabuluhang improvement sa normalized LacZ transduction area sa loob ng trachea kapag ginagamit ang magnet (*p = 0.029, t-test, n = 3 bawat grupo, mean ± SEM).
Ang mga neutral na mabilis na red-stained na seksyon (halimbawa na ipinakita sa Karagdagang Fig. 2) ay nagpakita ng mga cell na may mantsa ng LacZ sa isang katulad na pattern at lokasyon tulad ng naunang naiulat.
Ang isang pangunahing hamon para sa airway gene therapy ay nananatiling tumpak na lokalisasyon ng mga particle ng carrier sa mga rehiyon na kinaiinteresan at pagkamit ng mataas na antas ng transduction efficiency sa gumagalaw na baga sa pagkakaroon ng airflow at aktibong mucus clearance. Para sa mga LV carrier na idinisenyo upang gamutin ang CF airway disease, ang pagtaas ng tagal ng paninirahan ng mga carrier particle sa loob ng conducting airways ay isang hanggang sa ngayon ay mailap na gamitin ng magnetic field, As the magnetic field. Ang transduction ay may mga pakinabang kumpara sa iba pang paraan ng paghahatid ng gene tulad ng electroporation, dahil maaari nitong pagsamahin ang pagiging simple, cost-effectiveness, delivery localization, dagdag na kahusayan, at mas maiikling oras ng incubation , at posibleng mas maliit na carrier dose10. Gayunpaman, ang in vivo deposition at pag-uugali ng mga magnetic particle sa mga daanan ng hangin sa ilalim ng impluwensya ng panlabas na magnetic forces ng vi ay hindi kailanman nailarawan ang pagiging epektibo ng gene expression na ito sa pamamaraang ito. sa buo buhay na daanan ng hangin.
Ang aming in vitro synchrotron PCXI na mga eksperimento ay nagpakita na ang lahat ng mga particle na sinubukan namin, maliban sa polystyrene MP, ay makikita sa imaging setup na ginamit namin. Sa pagkakaroon ng magnetic field, ang mga MP ay bumubuo ng mga string na ang mga haba ay nauugnay sa uri ng particle at lakas ng magnetic field (ibig sabihin, ang proximity at motion ng magnet). field.Ang mga hiwalay na field na ito ay nagdudulot ng pagsasama-sama at pagkonekta ng iba pang katulad na mga particle, na may pangkat na parang string na mga galaw dahil sa mga lokal na puwersa mula sa lokal na kaakit-akit at nakakasuklam na pwersa ng iba pang mga particle.
Ang eskematiko na nagpapakita ng (a,b) mga particle na tren na nabuo sa loob ng fluid-filled capillaries at (c,d) air-filled trachea.Tandaan na ang mga capillary at trachea ay hindi iginuhit sa sukat. Ang panel (a) ay naglalaman din ng paglalarawan ng MP, na naglalaman ng mga Fe3O4 na particle na nakaayos sa mga string.
Kapag ang magnet ay inilipat sa itaas ng capillary, ang anggulo ng particle string ay umabot sa isang kritikal na threshold para sa MP3-5 na naglalaman ng Fe3O4, pagkatapos nito ang particle string ay hindi na nanatili sa orihinal na posisyon, ngunit inilipat kasama ang ibabaw sa isang bagong posisyon.magnet.Ang epekto na ito ay malamang na mangyari dahil ang glass capillary surface ay sapat na makinis upang payagan ang paggalaw na ito na mangyari.Kapansin-pansin, ang paraan na ito ay hindi, MP6Combib. mas maliit, may iba't ibang coatings o surface charges, o isang proprietary carrier fluid ang nakaapekto sa kanilang kakayahang gumalaw. Ang contrast ng imahe ng CombiMag particle ay mas mahina rin, na nagmumungkahi na ang fluid at particle ay maaaring may magkaparehong densidad at samakatuwid ay hindi madaling gumalaw patungo sa isa't isa. Ang mga particle ay maaari ding makaalis kung ang magnet ay gumagalaw nang masyadong mabilis, na nagpapahiwatig na ang mga particle ng magnetic field ay hindi palaging nagtagumpay sa pagitan ng lakas ng magnetic field, na nagmumungkahi na ang mga particle ay hindi palaging nagtagumpay sa pagitan ng lakas ng magnetic field, na nagmumungkahi na ito ay hindi palaging nagtagumpay sa pagitan ng lakas ng magnetic field. ang lakas ng magnetic field at ang distansya sa pagitan ng magnet at ang target na lugar Napakahalaga. Kung pinagsama-sama, ang mga resultang ito ay nagmumungkahi din na, habang ang mga magnet ay nakakakuha ng maraming mga MP na dumadaloy sa target na lugar, hindi malamang na ang mga magnet ay maaaring umasa sa paglipat ng mga particle ng CombiMag sa ibabaw ng trachea. Samakatuwid, napagpasyahan namin na sa vivo LV-MP na mga pag-aaral ay dapat gumamit ng pisikal na target na magnetic field na rehiyon.
Kapag ang mga particle ay inihatid sa katawan, mahirap matukoy ang mga ito sa konteksto ng kumplikadong gumagalaw na tissue ng katawan, ngunit ang kakayahang makita ang mga ito ay pinahusay sa pamamagitan ng pagsasalin ng magnet nang pahalang sa itaas ng trachea upang "i-wiggle" ang MP string. trachea.Kabaligtaran sa mga pag-aaral sa vitro, ang mga particle ay hindi maaaring i-drag kasama ang trachea sa pamamagitan ng pagsasalin ng magnet. Ang paghahanap na ito ay pare-pareho sa kung paano ang mucus na bumabalot sa ibabaw ng trachea ay karaniwang nagpoproseso ng mga nilalanghap na particle, na nakulong ang mga ito sa mucus at pagkatapos ay na-clear ng mucociliary clearance mechanism.
Ipinagpalagay namin na ang paggamit ng mga magnet para sa pang-akit sa itaas at sa ibaba ng trachea (Larawan 3b) ay maaaring magresulta sa isang mas pare-parehong magnetic field, sa halip na isang magnetic field na mataas ang konsentrasyon sa isang punto, na posibleng humahantong sa isang mas pare-parehong pamamahagi ng mga particle. Gayunpaman, ang aming paunang pag-aaral ay walang nakitang malinaw na ebidensya upang suportahan ang hypothesis na ito. Gayundin, ang pag-configure sa isang pares ng particle ay hindi nagreresulta ng higit pang pares ng magnet. deposition sa imaged area.Ipinapakita ng dalawang natuklasang ito na ang dual-magnet setup ay hindi makabuluhang nagpapabuti sa lokal na kontrol ng MP targeting, at ang nagreresultang malakas na magnetic forces ay mahirap i-configure, na ginagawang mas praktikal ang diskarteng ito. Katulad nito, ang pag-orient sa magnet sa itaas at sa pamamagitan ng trachea (Fig. 3d) ay hindi rin nagpapataas ng bilang ng mga particle na napanatili sa mga magnetic field na ito ay maaaring hindi matagumpay na magreresulta sa mga alternatibong magnetic field na ito. sa loob ng deposition area.Samakatuwid, ang nag-iisang 30-degree na anggulo na configuration ng magnet (Figure 3a) ay itinuturing na pinakamadali at pinakamabisang paraan para sa in vivo testing.
Ang pag-aaral ng LV-MP ay nagpakita na kapag ang mga LV vectors ay pinagsama sa CombiMag at naihatid pagkatapos ng pisikal na perturbation sa pagkakaroon ng magnetic field, ang mga antas ng transduction ay makabuluhang tumaas sa trachea kumpara sa mga kontrol. humahantong sa mas mataas na efficacy habang binabawasan ang mga naihatid na titers, off-target transduction, nagpapasiklab at immune side effect, at mga gastos sa carrier ng gene.Mahalaga, ayon sa manufacturer, maaaring gamitin ang CombiMag kasabay ng iba pang paraan ng paglilipat ng gene, kasama ang iba pang viral vectors (gaya ng AAV) at nucleic acid.