Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Генні вектори для лікування муковісцидозу легень повинні бути спрямовані на провідні дихальні шляхи, оскільки периферична трансдукція легень не забезпечує терапевтичної користі. Ефективність вірусної трансдукції безпосередньо пов'язана з часом перебування вектора. Однак рідини для доставки, такі як носії генів, природним чином дифундують в альвеоли під час вдиху, а терапевтичні частинки будь-якої форми швидко очищаються мукоциліарним транспортом. Продовження часу перебування носіїв генів у дихальних шляхах є важливим, але важкодосяжним. Кон'юговані з носієм генів магнітні частинки, які можна направити на поверхню дихальних шляхів, можуть покращити регіональне таргетування. Через труднощі візуалізації in vivo, поведінка таких малих магнітних частинок на поверхні дихальних шляхів у присутності прикладеного магнітного поля погано вивчена. Метою цього дослідження було використання синхротронної візуалізації для візуалізації руху серії магнітних частинок in vivo у трахеї анестезованих щурів, щоб дослідити динаміку та закономірності поведінки окремих та масових частинок in vivo. Потім ми також оцінили, чи доставка лентивірусних магнітних частинок у присутності магнітного поля збільшить ефективність трансдукції в трахеї щурів. Синхротронна рентгенівська візуалізація показує... Поведінка магнітних частинок у стаціонарних та рухомих магнітних полях in vitro та in vivo. Частинки не можуть бути легко перенесені по поверхні живих дихальних шляхів магнітами, але під час транспортування відкладення концентруються в полі зору, де магнітне поле найсильніше. Ефективність трансдукції також збільшилася в шість разів, коли лентивірусні магнітні частинки доставлялися в присутності магнітного поля. Разом ці результати свідчать про те, що лентивірусні магнітні частинки та магнітні поля можуть бути цінними підходами для покращення таргетування генних векторів та підвищення рівня трансдукції в провідних дихальних шляхах in vivo.
Муковісцидоз (МВ) спричинений варіацією в одному гені, який називається трансмембранним регулятором провідності МВ (CFTR). Білок CFTR – це іонний канал, присутній у багатьох епітеліальних клітинах по всьому тілу, включаючи провідні дихальні шляхи, основне місце патогенезу МВ. Дефекти CFTR призводять до порушення транспорту води, зневоднення поверхні дихальних шляхів та зменшення глибини шару рідини на поверхні дихальних шляхів (ASL). Це також погіршує здатність системи мукоциліарного транспорту (MCT) видаляти вдихувані частинки та патогени з дихальних шляхів. Наша мета – розробити генну терапію на основі лентивірусу (LV) для доставки правильної копії гена CFTR та покращення здоров'я ASL, MCT та легень, а також продовжувати розробку нових технологій, здатних вимірювати ці параметри in vivo1.
ЛШ-вектори є одними з провідних кандидатів для генної терапії дихальних шляхів при МВ, головним чином тому, що вони можуть постійно інтегрувати терапевтичний ген у базальні клітини дихальних шляхів (стовбурові клітини дихальних шляхів). Це важливо, оскільки вони можуть відновити нормальну гідратацію та очищення слизу шляхом диференціації у функціональні генно-скориговані клітини поверхні дихальних шляхів, пов'язані з МВ, що призводить до довічних переваг. ЛШ-вектори повинні бути спрямовані проти провідних дихальних шляхів, оскільки саме тут починається захворювання легень, спричинене МВ. Доставка вектора глибше в легені може призвести до альвеолярної трансдукції, але це не має терапевтичної користі при МВ. Однак рідини, такі як носії генів, природним чином мігрують до альвеол при вдиху після доставки3,4, і терапевтичні частинки швидко виводяться в ротову порожнину за допомогою MCT. Ефективність ЛШ-трансдукції безпосередньо пов'язана з тривалістю часу, протягом якого вектор залишається поруч із клітинами-мішенями, щоб забезпечити клітинне поглинання – «час перебування»5 – який легко зменшується типовим регіональним потоком повітря, а також скоординованим захопленням частинок слизу та MCT. При МВ здатність продовжувати час перебування ЛШ у дихальних шляхах є важливою для досягнення високого рівня трансдукції в цій області, але досі це було складно.
Щоб подолати цю перешкоду, ми припускаємо, що магнітні частинки (МЧ) ЛШ можуть допомогти двома взаємодоповнюючими способами. По-перше, їх можна магнітно направляти до поверхні дихальних шляхів для покращення та допомоги частинкам-носіям генів у бажаній області дихальних шляхів; та (за допомогою ASL) для переміщення до клітинного шару 6. МЧ широко використовуються як засоби цільової доставки ліків, коли вони зв'язуються з антитілами, хіміотерапевтичними препаратами або іншими малими молекулами, які прикріплюються до клітинних мембран або зв'язуються з відповідними рецепторами на поверхні клітин та накопичуються в місцях пухлини за наявності статичної електрики. Магнітні поля для лікування раку 7. Інші «гіпертермічні» методи спрямовані на нагрівання мікроплазматічних клітин (МП), коли вони піддаються впливу коливальних магнітних полів, тим самим руйнуючи пухлинні клітини. Принцип магнітної трансфекції, в якому магнітне поле використовується як трансфекційний агент для посилення перенесення ДНК до клітин, зазвичай використовується in vitro з використанням ряду невірусних та вірусних генних векторів для важкотрансдукованих клітинних ліній. Ефективність магнітотрансфекції лівого шлуночка (ЛШ) була встановлена ​​шляхом доставки МП ЛШ in vitro до лінії клітин бронхіального епітелію людини в присутності статичного магнітного поля, що збільшує ефективність трансдукції в 186 разів порівняно з використанням лише вектора ЛШ. МП ЛШ також застосовувався до моделі муковісцидозу in vitro, де магнітна трансфекція збільшила трансдукцію ЛШ у культурах на межі повітря-рідина в 20 разів у присутності мокротиння хворих на МВ10. Однак магнітотрансфекція органів in vivo отримала відносно мало уваги та була оцінена лише в кількох дослідженнях на тваринах11,12,13,14,15, особливо в легені16,17. Тим не менш, можливості магнітної трансфекції в терапії легень при муковісцидозі очевидні. Тан та ін. (2020) заявили, що «дослідження концепції ефективної доставки магнітних наночастинок у легені прокладе шлях для майбутніх стратегій інгаляції CFTR для покращення клінічних результатів у пацієнтів з муковісцидозом»6.
Поведінку малих магнітних частинок на поверхнях дихальних шляхів у присутності прикладеного магнітного поля важко візуалізувати та вивчати, і тому вона погано вивчена. В інших дослідженнях ми розробили метод фазово-контрастної рентгенівської візуалізації на основі синхротронного поширення (PB-PCXI) для неінвазивної візуалізації та кількісної оцінки незначних змін глибини ASL18 та поведінки MCT19,20 in vivo для безпосереднього вимірювання гідратації поверхні газового каналу та використання як раннього показника ефективності лікування. Крім того, наш метод оцінки MCT використовує частинки діаметром 10–35 мкм, що складаються з оксиду алюмінію або скла з високим показником заломлення, як маркери MCT, видимі за допомогою PB-PCXI21. Обидва методи підходять для візуалізації ряду типів частинок, включаючи MP.
Завдяки високій просторовій та часовій роздільній здатності, наші методи аналізу ASL та MCT на основі PB-PCXI добре підходять для вивчення динаміки та закономірностей поведінки окремих та об'ємних частинок in vivo, що допомагає нам зрозуміти та оптимізувати методи доставки генів MP. Підхід, який ми використовуємо тут, походить з наших досліджень з використанням лінії променів SPring-8 BL20B2, в яких ми візуалізували рух рідини після доставки дози фіктивного вектора в носові та легеневі дихальні шляхи мишей, щоб пояснити наші неоднорідні патерни експресії генів, що спостерігалися в наших дослідженнях на тваринах з дозами носіїв генів 3,4.
Метою цього дослідження було використання синхротрона PB-PCXI для візуалізації рухів in vivo серії мікрочастинок (МП) у трахеї живих щурів. Ці дослідження візуалізації PB-PCXI були розроблені для тестування ряду МП, напруженості магнітного поля та розташування, щоб визначити їх вплив на рух МП. Ми висунули гіпотезу, що зовнішнє магнітне поле допоможе доставленому МП залишатися або рухатися до цільової області. Ці дослідження також дозволили нам визначити конфігурації магнітів, які максимізують кількість частинок, що затримуються в трахеї після осадження. У другій серії досліджень ми прагнули використовувати цю оптимальну конфігурацію для демонстрації картини трансдукції, що виникає в результаті доставки МП ЛШ у дихальні шляхи щурів in vivo, виходячи з припущення, що доставка МП ЛШ у контексті таргетування дихальних шляхів призведе до покращення ефективності трансдукції ЛШ.
Усі дослідження на тваринах проводили відповідно до протоколів, затверджених Університетом Аделаїди (M-2019-060 та M-2020-022) та Комітетом з етики синхротронного дослідження тварин SPring-8. Експерименти проводили відповідно до рекомендацій ARRIVE.
Вся рентгенівська візуалізація проводилася на лінії променя BL20XU синхротрона SPring-8 у Японії з використанням установки, подібної до описаної раніше21,22. Коротко кажучи, експериментальний бокс був розташований за 245 м від кільця зберігання синхротрона. Відстань від зразка до детектора 0,6 м використовується для досліджень візуалізації частинок та 0,3 м для досліджень візуалізації in vivo для створення ефектів фазового контрасту. Використовувалась енергія монохроматичного променя 25 кеВ. Зображення були отримані за допомогою рентгенівського перетворювача високої роздільної здатності (SPring-8 BM3), з'єднаного з sCMOS-детектором. Перетворювач перетворює рентгенівські промені у видиме світло за допомогою сцинтилятора (Gd3Al2Ga3O12) товщиною 10 мкм, який потім спрямовується на sCMOS-датчик за допомогою мікроскопічного об'єктива × 10 (NA 0,3). Як sCMOS-детектор використовувався Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Японія) з розміром матриці 2048 × 2048 пікселів та розмір пікселя 6,5 × 6,5 мкм. Ця установка забезпечує ефективний ізотропний розмір пікселя 0,51 мкм та поле зору приблизно 1,1 мм × 1,1 мм. Тривалість експозиції 100 мс була обрана для максимізації співвідношення сигнал/шум магнітних частинок всередині та зовні дихальних шляхів, мінімізуючи при цьому артефакти руху, викликані диханням. Для досліджень in vivo на шляху рентгенівського випромінювання було розміщено швидкий рентгенівський затвор для обмеження дози опромінення шляхом блокування рентгенівського променя між експозиціями.
Носій LV не використовувався в жодних дослідженнях візуалізації SPring-8 PB-PCXI, оскільки камера візуалізації BL20XU не сертифікована за рівнем біобезпеки 2. Натомість ми вибрали ряд добре охарактеризованих мікрочастинок (МП) від двох комерційних постачальників, що охоплюють діапазон розмірів, матеріалів, концентрацій заліза та застосувань, спочатку для того, щоб зрозуміти, як магнітні поля впливають на рух МП у скляних капілярах, а потім у живих дихальних шляхах. на поверхні. Розміри мікрочастинок (МП) варіюються від 0,25 до 18 мкм і виготовляються з різних матеріалів (див. Таблицю 1), але склад кожного зразка, включаючи розмір магнітних частинок усередині МП, невідомий. Виходячи з наших обширних досліджень MCT 19, 20, 21, 23, 24, ми очікуємо, що МП розміром до 5 мкм можна буде побачити на поверхні трахеальних дихальних шляхів, наприклад, шляхом віднімання послідовних кадрів, щоб побачити покращену видимість руху МП. Один МП розміром 0,25 мкм менший за роздільну здатність пристрою візуалізації, але очікується, що PB-PCXI виявить їх об'ємний контраст і рух поверхневої рідини, на якій вони осідають після осадження.
Зразки для кожного MP у Таблиці 1 були підготовлені у скляних капілярах об'ємом 20 мкл (Drummond Microcaps, Пенсільванія, США) з внутрішнім діаметром 0,63 мм. Корпускулярні частинки доступні у воді, тоді як частинки CombiMag доступні у фірмовій рідині виробника. Кожна пробірка наполовину заповнена рідиною (приблизно 11 мкл) та розміщена на тримачі зразків (див. Рисунок 1). Скляні капіляри були розміщені горизонтально на столику для зразків у коробці для візуалізації відповідно та розташовані по краях рідини. Магніт діаметром 19 мм (довжиною 28 мм) з нікелевою оболонкою, рідкісноземельними неодимовими залізом, бором (NdFeB) (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралія) із залишковою намагніченістю 1,17 Тесла був приєднаний до окремого столика для переміщення для дистанційної зміни його положення під час візуалізації. Отримання рентгенівських зображень починається, коли магніт розташований приблизно на 30 мм вище зразка, а зображення отримують зі швидкістю 4 кадри на секунду. Під час візуалізації магніт підносили близько до... скляну капілярну трубку (на відстані приблизно 1 мм), а потім переміщували вздовж трубки для оцінки впливу напруженості поля та положення.
Установка для візуалізації in vitro, що містить зразки мікроскопічного полімера у скляних капілярах на етапі xy-трансляції зразка. Шлях рентгенівського променя позначено червоною пунктирною лінією.
Після встановлення видимості мікроплазматических клітин in vitro, підгрупу з них було протестовано in vivo на самках альбіносних щурів Вістар дикого типу (віком ~12 тижнів, ~200 г). 0,24 мг/кг медетомідину (Domitor®, Zenoaq, Японія), 3,2 мг/кг мідазоламу (Dormicum®, Astellas Pharma, Японія) та 4 мг/кг буторфанолу (Vetorphale®, Meiji Seika). Щурів анестезували сумішшю (Pharma), Японія) шляхом внутрішньочеревної ін'єкції. Після анестезії їх підготували до візуалізації, видаливши хутро навколо трахеї, вставивши ендотрахеальну трубку (ET; 16 Ga в/в канюля, Terumo BCT) та іммобілізувавши їх у положенні лежачи на спині на спеціально виготовленій пластині для візуалізації, що містила термосумку для підтримки температури тіла 22. Потім пластину для візуалізації прикріпили до столу для переміщення зразка в коробці для візуалізації під невеликим кутом, щоб вирівняти трахею горизонтально на рентгенівському зображенні, як показано на рисунку. 2а.
(a) Установка для візуалізації in vivo у візуалізаційному боксі SPring-8, шлях рентгенівського променя позначено червоною пунктирною лінією. (b,c) Локалізація магніту на трахеї проводилася дистанційно за допомогою двох ортогонально встановлених IP-камер. У лівій частині зображення на екрані видно дротяну петлю, що утримує головку, та канюлю доставки, встановлену всередині ЕТ-трубки.
Дистанційно керована система шприцевого насоса (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) з використанням скляного шприца об'ємом 100 мкл була підключена до трубки PE10 (зовнішній діаметр 0,61 мм, внутрішній діаметр 0,28 мм) за допомогою голки 30 Ga. Позначте трубку, щоб переконатися, що кінчик знаходиться в правильному положенні в трахеї під час введення ендотрахеальної трубки. За допомогою мікронасоса поршень шприца витягували, а кінчик трубки занурювали у зразок MP, який потрібно було ввести. Потім завантажену трубку доставки вставляли в ендотрахеальну трубку, розміщуючи кінчик у найсильнішій частині очікуваного прикладеного магнітного поля. Отримання зображення контролювалося за допомогою детектора дихання, підключеного до нашого таймеру на базі Arduino, а всі сигнали (наприклад, температура, дихання, відкриття/закриття затвора та отримання зображення) записувалися за допомогою Powerlab та LabChart (AD Instruments, Сідней, Австралія) 22. Під час візуалізації, коли корпус був недоступний, дві IP-камери (Panasonic BB-SC382) були розташовані приблизно під кутом 90° одна до одної та використовувалися для контролю положення магніту відносно... до трахеї під час візуалізації (рис. 2b,c). Щоб мінімізувати артефакти руху, під час плато потоку в кінці дихання отримувалося одне зображення на один вдих.
Магніт прикріплений до другої платформи, яку можна розташувати віддалено ззовні корпусу візуалізації. Були протестовані різні положення та конфігурації магніту, зокрема: встановлений під кутом приблизно 30° над трахеєю (конфігурації показані на рисунках 2a та 3a); один магніт над твариною, а інший під нею, з полюсами, встановленими на притягання (рисунок 3b); один магніт над твариною, а інший під нею, з полюсами, встановленими на відштовхування (рисунок 3c); та один магніт над трахеєю та перпендикулярно до неї (рисунок 3d). Після того, як тварина та магніт налаштовані, а мікроскопічний препарат, що тестується, завантажено у шприцевий насос, подайте дозу 50 мкл зі швидкістю 4 мкл/с під час отримання зображень. Потім магніт переміщують вперед і назад вздовж або латерально поперек трахеї, продовжуючи отримання зображень.
Конфігурація магніту для візуалізації in vivo: (a) один магніт над трахеєю під кутом приблизно 30°, (b) два магніти, налаштовані на притягання, (c) два магніти, налаштовані на відштовхування, (d) один магніт над трахеєю та перпендикулярно до неї. Спостерігач дивився вниз від рота до легень через трахею, і рентгенівський промінь проходив через лівий бік щура та виходив з правого боку. Магніт переміщували або вздовж дихальних шляхів, або ліворуч і праворуч над трахеєю в напрямку рентгенівського променя.
Ми також прагнули визначити видимість та поведінку частинок у дихальних шляхах за відсутності спотворюючого дихання та серцевого ритму. Тому наприкінці періоду візуалізації тварин гуманно умертвили через передозування пентобарбіталом (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, США; ~65 мг/кг внутрішньоочеревинно). Деяких тварин залишали на платформі для візуалізації, і після зупинки дихання та серцебиття процес візуалізації повторювали, додаючи додаткову дозу MP, якщо MP на поверхні дихальних шляхів не було видно.
Отримані зображення були скориговані для плоского та темного поля, а потім зібрані у фільм (20 кадрів на секунду; 15-25 × нормальна швидкість залежно від частоти дихання) за допомогою спеціального сценарію, написаного в MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Усі дослідження доставки генів LV за допомогою вектора проводилися в Центрі досліджень лабораторних тварин при Університеті Аделаїди та мали на меті використати результати експерименту SPring-8 для оцінки того, чи може доставка LV-MP у присутності магнітного поля посилити перенесення генів in vivo. Для оцінки впливу MP та магнітного поля було проведено лікування двох груп тварин: одній групі давали LV-MP з розміщеним магнітом, а іншій групі вводили контрольну групу з LV-MP без магніту.
Генні вектори LV були створені за допомогою раніше описаних методів 25, 26. Вектор LacZ експресує ядерно-локалізований ген бета-галактозидази, керований конститутивним промотором MPSV (LV-LacZ), який утворює синій продукт реакції в трансдукованих клітинах, видимий на фронтах тканини легень та зрізах тканин. Титрування проводили в клітинних культурах шляхом ручного підрахунку кількості LacZ-позитивних клітин за допомогою гемоцитометра для розрахунку титру в TU/мл. Носії кріоконсервують при -80 °C, розморожують перед використанням та зв'язують з CombiMag шляхом змішування у співвідношенні 1:1 та інкубації на льоду протягом щонайменше 30 хвилин перед доставкою.
Звичайних щурів лінії Sprague Dawley (n = 3/група, ~2-3) анестезували внутрішньочеревно сумішшю 0,4 мг/кг медетомідину (Domitor, Ilium, Австралія) та 60 мг/кг кетаміну (Ilium, Австралія) (місячного віку) шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції та нехірургічної пероральної канюляції за допомогою 16 Ga внутрішньовенної канюлі. Щоб забезпечити отримання тканиною трахеальних дихальних шляхів лівого шлуночка трансдукції, її кондиціонували з використанням нашого раніше описаного протоколу механічного збурення, в якому поверхню трахеальних дихальних шляхів аксіально розтирали дротяним кошиком (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, США) 30 s28. Трахеальне введення LV-MP потім проводили в шафі біологічної безпеки приблизно через 10 хвилин після збурення.
Магнітне поле, що використовувалося в цьому експерименті, було налаштоване аналогічно до дослідження рентгенівської візуалізації in vivo, з тими ж магнітами, що трималися над трахеєю за допомогою дистиляційних стент-кліпс (Рисунок 4). Об'єм 50 мкл (2 × 25 мкл аліквоти) LV-MP було доставлено в трахею (n = 3 тварини) за допомогою піпетки з гелевим наконечником, як описано раніше. Контрольна група (n = 3 тварини) отримувала ті ж LV-MP без використання магніту. Після завершення інфузії канюлю видаляли з ET-трубки, і тварину екстубували. Магніт залишали на місці протягом 10 хвилин, потім його видаляли. Щури отримували підшкірну дозу мелоксикаму (1 мл/кг) (Ilium, Австралія) з подальшим скасуванням анестезії шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції 1 мг/кг атипамазолу гідрохлориду (Antisedan, Zoetis, Австралія). Щурів тримали в теплі та спостерігали за ними до повного відновлення після анестезії.
Пристрій доставки LV-MP у шафі біологічної безпеки. Світло-сірий люерівський наконечник позапрохідницької трубки виступає з отвору, а гелевий кінчик піпетки, зображеної на зображенні, вводиться через позапрохідну трубку на потрібну глибину в трахею.
Через тиждень після процедури дозування LV-MP тварин гуманно умертвили шляхом інгаляції 100% CO2, а експресію LacZ оцінили за допомогою нашого стандартного лікування X-gal. Три каудальні найбільш хрящові кільця видалили, щоб переконатися, що будь-які механічні пошкодження або затримка рідини внаслідок встановлення ендотрахеальної трубки не були включені до аналізу. Кожну трахею розрізали поздовжньо, щоб створити дві половини для аналізу, і їх помістили в чашку, що містить силіконову гуму (Sylgard, Dow Inc), використовуючи голку Minutien (Fine Science Tools) для візуалізації поверхні просвіту. Розподіл і характер трансдукованих клітин підтвердили фронтальною фотографією за допомогою мікроскопа Nikon (SMZ1500) з камерою DigiLite та програмним забезпеченням TCapture (Tucsen Photonics, Китай). Зображення отримували при 20-кратному збільшенні (включаючи найвище налаштування для повної ширини трахеї), при цьому вся довжина трахеї зображувалася крок за кроком, забезпечуючи достатнє перекриття між кожним зображенням, щоб забезпечити «зшивання» зображень. Зображення з кожної трахеї потім зібрали в одне. композитне зображення за допомогою редактора Image Composite Editor версії 2.0.3 (Microsoft Research) з використанням алгоритму планарного руху. Області експресії LacZ у композитних зображеннях трахеї кожної тварини були кількісно визначені за допомогою автоматизованого скрипта MATLAB (R2020a, MathWorks), як описано раніше, з використанням налаштувань 0,35 < Відтінок < 0,58, Насиченість > 0,15 та Значення < 0,7. Шляхом трасування контурів тканини, маска була вручну згенерована в GIMP версії 2.10.24 для кожного композитного зображення, щоб ідентифікувати область тканини та запобігти будь-яким хибним виявленням ззовні тканини трахеї. Забарвлені області з усіх композитних зображень кожної тварини були підсумовані для отримання загальної забарвленої площі для цієї тварини. Потім забарвлену площу поділили на загальну площу маски для отримання нормалізованої площі.
Кожну трахею заливали парафіном і вирізали зрізи товщиною 5 мкм. Зрізи контрастно фарбували нейтральним червоним барвником протягом 5 хвилин, а зображення отримували за допомогою мікроскопа Nikon Eclipse E400, камери DS-Fi3 та програмного забезпечення для захоплення елементів NIS (версія 5.20.00).
Усі статистичні аналізи виконували у GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Статистичну значущість встановлювали на рівні p ≤ 0,05. Нормальність перевіряли за допомогою тесту Шапіро-Уілка, а відмінності у фарбуванні LacZ оцінювали за допомогою непарного t-тесту.
Шість МП, описаних у Таблиці 1, були досліджені за допомогою PCXI, а їхня видимість описана в Таблиці 2. Два полістирольні МП (MP1 та MP2; 18 мкм та 0,25 мкм відповідно) не були видимі під PCXI, але решту зразків можна було ідентифікувати (приклади показано на Рисунку 5). MP3 та MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 мкм та 0,9 мкм відповідно) ледь помітні. Хоча MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) містить одні з найменших протестованих частинок, він був найбільш вираженим. Продукт CombiMag MP6 важко помітити. У всіх випадках наша здатність виявляти МП значно покращилася шляхом переміщення магніту вперед і назад паралельно капіляру. Коли магніти віддалялися від капіляра, частинки витягувалися довгими струнами, але коли магніти наближалися, а напруженість магнітного поля збільшувалася, струни частинок скорочувалися, коли частинки мігрували до верхньої поверхні капіляра (див. Додаткове відео S1: MP4), збільшуючи... Густина частинок поверхні. І навпаки, коли магніт видаляється з капіляра, напруженість поля зменшується, і мікрочастинки перегруповуються в довгі струни, що тягнуться від верхньої поверхні капіляра (див. Додаткове відео S2:MP4). Після того, як магніт припиняє рух, частинки продовжують рухатися протягом короткого часу після досягнення рівноважного положення. Коли мікрочастинка рухається до верхньої поверхні капіляра та від неї, магнітні частинки зазвичай перетягують уламки через рідину.
Видимість MP під PCXI значно варіюється між зразками. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 та (d) MP6. Усі зображення, показані тут, були зроблені за допомогою магніту, розташованого приблизно на 10 мм безпосередньо над капіляром. Видимі великі кола – це бульбашки повітря, захоплені в капілярах, що чітко показує чорно-білі крайові особливості фазово-контрастного зображення. Червона рамка містить збільшення, що посилює контраст. Зверніть увагу, що діаметри схем магнітів на всіх рисунках не відповідають масштабу та приблизно в 100 разів більші, ніж показано.
Коли магніт переміщується ліворуч і праворуч вздовж верхньої частини капіляра, кут струни МП змінюється, щоб вирівнятися з магнітом (див. Рисунок 6), таким чином окреслюючи лінії магнітного поля. У MP3-5, після того, як хорда досягає порогового кута, частинки тягнуться вздовж верхньої поверхні капіляра. Це часто призводить до того, що МП скупчуються у більші групи поблизу місця, де магнітне поле найсильніше (див. Додаткове відео S3:MP5). Це також особливо помітно під час візуалізації поблизу кінця капіляра, що призводить до агрегації та концентрації МП на межі розділу рідина-повітря. Частинки в MP6, які було важче розрізнити, ніж у MP3-5, не тягнулися, коли магніт рухався вздовж капіляра, але струни МП дисоціювалися, залишаючи частинки в полі зору (див. Додаткове відео S4:MP6). У деяких випадках, коли прикладене магнітне поле зменшували шляхом переміщення магніту на велику відстань від місця візуалізації, будь-які залишки МП повільно опускалися на нижню поверхню трубки під дією сили тяжіння, залишаючись у струні (див. Додаткове відео S5: MP3).
Кут нахилу струни MP змінюється, коли магніт переміщується праворуч над капіляром. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 та (d) MP6. Червона рамка містить зображення збільшення, що підсилює контраст. Зверніть увагу, що додаткові відео є інформативними, оскільки вони розкривають важливу інформацію про структуру частинок та динаміку, яку неможливо візуалізувати на цих статичних зображеннях.
Наші тести показали, що повільне переміщення магніту вперед і назад вздовж трахеї полегшує візуалізацію мікроплазматичного полімеру (МП) у контексті складного руху in vivo. Тестування in vivo не проводилося, оскільки полістирольні кульки (МП1 та МП2) не були видимі в капілярі. Кожен з решти чотирьох МП був протестований in vivo з довгою віссю магніту, сконфігурованою над трахеєю під кутом приблизно 30° до вертикалі (див. Рисунки 2b та 3a), оскільки це призвело до довших ланцюгів МП і було ефективнішим, ніж конфігурація з терміналом магніту. МП3, МП4 та МП6 не були виявлені в трахеї жодної живої тварини. Коли дихальні шляхи щурів були візуалізовані після гуманного умертвлення тварин, частинки залишалися невидимими навіть після додавання додаткового об'єму за допомогою шприцевого насоса. МП5 мав найвищий вміст оксиду заліза і був єдиною видимою частинкою, тому його використовували для оцінки та характеристики поведінки МП in vivo.
Розміщення магніту над трахеєю під час доставки мікрочастинок (МП) призвело до концентрації багатьох, але не всіх, МП у полі зору. Частинки, що потрапляють у трахею, найкраще спостерігаються у тварин, загиблих у жертву. Рисунок 7 та додаткове відео S6: МП5 показує швидке магнітне захоплення та вирівнювання частинок на поверхні вентральної трахеї, що вказує на те, що МП можна спрямувати до потрібних ділянок трахеї. Під час пошуку більш дистально вздовж трахеї після доставки МП деякі МП були виявлені ближче до карини, що свідчить про те, що напруженість магнітного поля була недостатньою для збору та утримання всіх МП, оскільки вони доставлялися через область максимальної напруженості магнітного поля під час рідинного процесу. Тим не менш, післяпологові концентрації МП були вищими навколо візуалізованої області, що свідчить про те, що багато МП залишалися в ділянках дихальних шляхів, де напруженість прикладеного магнітного поля була найвищою.
Зображення (a) до та (b) після введення MP5 у трахею нещодавно евтаназованого щура з магнітом, розташованим безпосередньо над областю візуалізації. Зображена область розташована між двома хрящовими кільцями. Перед введенням MP у дихальних шляхах є певна рідина. Червона рамка містить зображення з посиленням контрасту. Ці зображення взяті з відео, показаного в Додатковому відео S6:MP5.
Переміщення магніту вздовж трахеї in vivo призвело до зміни кута ланцюга мікрочастинок (МП) на поверхні дихальних шляхів подібним чином до того, як це спостерігається в капілярах (див. Рисунок 8 та Додаткове відео S7:MP5). Однак у нашому дослідженні МП не могли перетягуватися вздовж поверхні живих дихальних шляхів, як це було можливо з капілярами. У деяких випадках ланцюг МП подовжується, коли магніт рухається вліво та вправо. Цікаво, що ми також виявили, що струна частинок, здається, змінює глибину поверхневого шару рідини, коли магніт рухається поздовжньо вздовж трахеї, і розширюється, коли магніт рухається безпосередньо над головою, а струна частинок повертається у вертикальне положення (див. Додаткове відео S7). : MP5 о 0:09, внизу праворуч). Характерна картина руху змінювалася, коли магніт переміщували вздовж верхньої частини трахеї латерально (тобто ліворуч або праворуч від тварини, а не вздовж довжини трахеї). Частинки все ще були чітко видимі під час руху, але коли магніт видаляли з трахеї, ставали видимими кінчики ниток частинок (див. Додаткове відео S8:MP5, починаючи з 0:08). Це узгоджується з поведінкою MP, яку ми спостерігали під дією прикладеного магнітного поля у скляному капілярі.
Приклади зображень, що показують MP5 у трахеї живого анестезованого щура. (a) Магніт використовується для отримання зображень вище та ліворуч від трахеї, потім (b) після того, як магніт переміщено праворуч. Червона рамка містить збільшення, що підсилює контраст. Ці зображення взяті з відео, показаного в Додатковому відео S7:MP5.
Коли два полюси були налаштовані в орієнтації північ-південь над і під трахеєю (тобто притягувалися; рис. 3b), хорди MP виглядали довшими та розташовувалися на бічній стінці трахеї, а не на дорсальній поверхні трахеї (див. Додаткове відео S9:MP5). Однак високі концентрації частинок в одному місці (тобто на дорсальній поверхні трахеї) не виявлялися після подачі рідини при використанні пристрою з двомагнітним магнітом, що зазвичай відбувається при використанні пристрою з одним магнітом. Потім, коли один магніт був налаштований на відштовхування полюсів у зворотному порядку (рис. 3c), кількість частинок, видимих ​​у полі зору, не збільшувалася після подачі. Налаштування обох конфігурацій з двомагнітним магнітом є складним через високу напруженість магнітного поля, яке відповідно притягує або штовхає магніти. Потім налаштування було змінено на один магніт, паралельний дихальним шляхам, але що проходить через дихальні шляхи під кутом 90 градусів, так що лінії поля перетинають стінку трахеї ортогонально (рис. 3d), орієнтація, призначена для визначення того, чи можна спостерігати агрегацію частинок на бічній стінці. Однак у цій конфігурації, не було виявлено жодного помітного руху накопичення MP або руху магніту. На основі всіх цих результатів для досліджень генних носіїв in vivo була обрана конфігурація з одним магнітом та 30-градусною орієнтацією (Рисунок 3a).
Коли тварину неодноразово фотографували одразу після гуманного вбивства, відсутність супутнього руху тканин означала, що в чіткому міжхондральному полі можна було розрізнити тонші та коротші лінії частинок, які «коливалися» відповідно до поступального руху магніту. Тим не менш, досі неможливо чітко побачити присутність та рух частинок MP6.
Титр LV-LacZ становив 1,8 × 10⁻ ТУ/мл, і після змішування 1:1 з CombiMag MP (MP6) тварини отримували 50 мкл трахеальної дози 9 × 10⁻ ТУ/мл розчину LV (тобто 4,5 × 10⁻ ТУ/щур). У цих дослідженнях замість того, щоб переміщувати магніт під час пологів, ми фіксували магніт в одному положенні, щоб визначити, чи можна покращити трансдукцію LV (a) порівняно з векторною доставкою за відсутності магнітного поля, і чи можна сфокусувати (b). Клітини дихальних шляхів трансдукуються до магнітних цільових ділянок верхніх дихальних шляхів.
Наявність магнітів та використання CombiMag у поєднанні з LV-векторами, схоже, не мали негативного впливу на здоров'я тварин, як і наш стандартний протокол доставки LV-векторів. Фронтальні зображення трахеальної області, що піддавалася механічному впливу (Додатковий рис. 1), показали, що в групі тварин, які отримували LV-MP, спостерігалися значно вищі рівні трансдукції, коли магніт був присутній (рис. 9a). У контрольній групі була присутня лише невелика кількість синього забарвлення LacZ (рис. 9b). Кількісна оцінка нормалізованих ділянок, забарвлених X-Gal, показала, що введення LV-MP у присутності магнітного поля призвело до приблизно 6-кратного покращення (рис. 9c).
Приклади складених зображень, що показують трахеальну трансдукцію за допомогою LV-MP (a) за наявності магнітного поля та (b) за відсутності магніту. (c) Статистично значуще покращення нормалізованої площі LacZ-трансдукції в трахеї при використанні магніту (*p = 0,029, t-тест, n = 3 на групу, середнє ± SEM).
Нейтрально швидкі червоні зрізи (приклад показаний на Додатковому рис. 2) показали клітини, забарвлені LacZ, присутні в подібній схемі та розташуванні, як повідомлялося раніше.
Ключовим завданням генної терапії дихальних шляхів залишається точна локалізація частинок-носіїв у досліджуваних ділянках та досягнення високого рівня ефективності трансдукції в рухомій легені за наявності потоку повітря та активного очищення від слизу. Для носіїв ЛШ, призначених для лікування захворювань дихальних шляхів, спричинених муковісцидозом, збільшення часу перебування частинок-носіїв у провідних дихальних шляхах досі було недосяжною метою. Як зазначають Кастеллані та ін., використання магнітних полів для покращення трансдукції має переваги порівняно з іншими методами доставки генів, такими як електропорація, оскільки воно може поєднувати простоту, економічну ефективність, локалізацію доставки, підвищену ефективність та коротший час інкубації, а можливо, і меншу дозу носія10. Однак, осадження та поведінка магнітних частинок у дихальних шляхах in vivo під впливом зовнішніх магнітних сил ніколи не були описані, а також фактично не була продемонстрована доцільність цього методу in vivo для підвищення рівня експресії генів у неушкоджених живих дихальних шляхах.
Наші синхротронні експерименти PCXI in vitro показали, що всі протестовані нами частинки, за винятком полістирольного MP, були видимі в використаній нами установці візуалізації. У присутності магнітного поля MP утворюють струни, довжина яких залежить від типу частинок та сили магнітного поля (тобто близькості та руху магніту). Як показано на рисунку 10, струни, які ми спостерігаємо, утворюються внаслідок того, що кожна окрема частинка намагнічується та індукує власне локальне магнітне поле. Ці окремі поля змушують інші подібні частинки агрегуватися та з'єднуватися з груповими струноподібними рухами через локальні сили від локальних сил тяжіння та відштовхування інших частинок.
Схематичне зображення (a, b) цугів частинок, що утворюються всередині капілярів, заповнених рідиною, та (c, d) трахеї, заповненої повітрям. Зверніть увагу, що капіляри та трахея намальовані не в масштабі. Панель (a) також містить опис мікроскопічного простору (MP), який містить частинки Fe3O4, розташовані в струни.
Коли магніт переміщували над капіляром, кут струни частинок досяг критичного порогу для MP3-5, що містить Fe3O4, після чого струна частинок більше не залишалася у вихідному положенні, а рухалася вздовж поверхні до нового положення. магніт. Цей ефект, ймовірно, виникає тому, що поверхня скляного капіляра достатньо гладка, щоб дозволити цей рух. Цікаво, що MP6 (CombiMag) не поводився таким чином, можливо тому, що частинки були меншими, мали різні покриття або поверхневі заряди, або запатентована рідина-носій впливала на їхню здатність рухатися. Контраст зображення частинок CombiMag також слабший, що свідчить про те, що рідина та частинки можуть мати подібну щільність і тому нелегко рухатися одна до одної. Частинки також можуть застрягати, якщо магніт рухається занадто швидко, що вказує на те, що сила магнітного поля не завжди може подолати тертя між частинками в рідині, що свідчить про те, що, можливо, не дивно, що сила магнітного поля та відстань між магнітом та цільовою областю дуже важливі. Взяті разом, ці результати також свідчать про те, що, хоча магніти можуть захоплювати багато MP, які протікають через цільову область, малоймовірно, що на магніти можна покладатися для руху. Частинки CombiMag вздовж поверхні трахеї. Таким чином, ми робимо висновок, що дослідження LV-MP in vivo повинні використовувати статичні магнітні поля для фізичного впливу на певні ділянки дихального дерева.
Коли частинки потрапляють в організм, їх важко ідентифікувати в контексті складних рухомих тканин тіла, але здатність їх виявляти була покращена шляхом горизонтального переміщення магніту над трахеєю для «ворушіння» струн мікроплазматичного міокарда. Хоча візуалізація в реальному часі можлива, рух частинок легше розпізнати після гуманного вбивства тварини. Концентрації мікроплазматичного міокарда зазвичай були найвищими в цьому місці, коли магніт розташовувався над областю візуалізації, хоча деякі частинки зазвичай знаходилися далі вздовж трахеї. На відміну від досліджень in vitro, частинки неможливо перенести вздовж трахеї шляхом переміщення магніту. Цей висновок узгоджується з тим, як слиз, що покриває поверхню трахеї, зазвичай обробляє вдихувані частинки, захоплюючи їх у слиз і згодом виводячи за допомогою механізму мукоциліарного очищення.
Ми висунули гіпотезу, що використання магнітів для притягання над і під трахеєю (рис. 3b) може призвести до більш однорідного магнітного поля, а не до магнітного поля, яке є високо концентрованим в одній точці, що потенційно може призвести до більш рівномірного розподілу частинок. Однак наше попереднє дослідження не знайшло чітких доказів на підтвердження цієї гіпотези. Аналогічно, конфігурація пари магнітів для відштовхування (рис. 3c) не призвела до більшого осадження частинок у зображуваній області. Ці два результати демонструють, що установка з двома магнітами не покращує суттєво локальний контроль націлювання на мікрочастинки, і що результуючі сильні магнітні сили важко налаштувати, що робить цей підхід менш практичним. Аналогічно, орієнтація магніту над і через трахею (рис. 3d) також не збільшила кількість частинок, що утримуються у зображуваній області. Деякі з цих альтернативних конфігурацій можуть бути невдалими, оскільки вони призводять до зниження напруженості магнітного поля в області осадження. Тому конфігурація з одним магнітом під кутом 30 градусів (рис. 3a) вважається найпростішим і найефективнішим методом для тестування in vivo.
Дослідження LV-MP показало, що коли вектори LV поєднували з CombiMag та доставляли після фізичного збурення в присутності магнітного поля, рівні трансдукції значно підвищувалися в трахеї порівняно з контрольною групою. Виходячи з досліджень синхротронної візуалізації та результатів LacZ, магнітне поле, очевидно, змогло зберегти лівий шлуночок (ЛШ) у трахеї та зменшити кількість частинок вектора, які негайно проникали глибоко в легені. Такі покращення таргетування можуть призвести до вищої ефективності, одночасно зменшуючи титри доставки, трансдукцію поза цільовою зоною, запальні та імунні побічні ефекти, а також витрати на носіїв генів. Важливо, що, за словами виробника, CombiMag можна використовувати разом з іншими методами переносу генів, включаючи інші вірусні вектори (такі як AAV) та нуклеїнові кислоти.