Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Ko te putanga tirotiro e whakamahia ana e koe he iti te tautoko mo te CSS.Mo te wheako pai, ka tūtohu kia whakamahia e koe he tirotiro kua whakahoutia (whakawetohia ranei te aratau hototahi ki Internet Explorer).
Ko nga ira ira mo te maimoatanga o te mate pukupuku cystic fibrosis me aro ki nga huarahi rererangi na te mea karekau te whakawhitinga o te pukahukahu peripheral e whai hua whakaora.Ko te pai o te whakawhiti viral e hono tika ana ki te wa noho vector.Heoi, ko nga wai tuku penei i nga kaikawe ira ka rere ke ki roto i te alveoli i te wa o te faauru, me nga matūriki rongoa o tetahi ahua ka tere te whakakorehia e te mucociliary te kawe i te wa ira. He mea nui engari he uaua ki te whakatutuki.Ka taea e nga matūriki autō-whakawhitinga ira ka taea te toro atu ki te mata o nga huarahi rererangi te whakapai ake i te whainga a rohe. Ko nga kiore kua whakahiatohia hei tirotiro i te hihiri me nga tauira o te whanonga matūriki takitahi me te nuinga o te matūriki i roto i te vivo.Katahi ano ka aromatawaihia mena ka tukuna atu nga matūriki autō lentiviral i te aroaro o te papa autō ka piki ake te pai o te whakawhiti i roto i te trachea kiore. aukume, engari i te wa o te kawe, ka noho nga putunga ki te waahi tirohanga kei te kaha te papa autō. I piki ake ano te pai o te whakawhiti i te wa e tukuna ana nga matūriki autō lentiviral i te aroaro o te papa autō.Together, ko enei hua e whakaatu ana ko nga matūriki autō lentiviral me nga papa autō he huarahi whai hua hei whakapai ake i te whainga ira ira me te whakanui ake i nga taumata whakawhiti i roto i nga huarahi rererangi i roto i te vivo.
Ko te Cystic fibrosis (CF) ka puta mai i te rereketanga o te ira kotahi e kiia nei ko te CF transmembrane conductance regulator (CFTR). ka whakararu i te kaha o te punaha kawe mucociliary (MCT) ki te whakakore i nga matūriki me nga pathogens mai i nga huarahi rererangi.Ko ta matou whainga ko te whakawhanake i te maimoatanga ira lentiviral (LV) ki te tuku i te kape tika o te ira CFTR me te whakapai ake i te hauora ASL, MCT, me te huhu, me te whakawhanake tonu i nga hangarau hou e kaha ana ki te ine i enei tawhā i roto i te vivo1.
Ko nga vectors LV tetahi o nga tino kaitono mo te whakamaarama ira ira rererangi CF, na te mea ka taea e ratou te whakauru tuturu i te ira rongoa ki roto i nga ruma o te ararere (rerenga kakau o te hau). Ka timata.Ko te tukunga o te vector hohonu ki roto i te pukahukahu ka hua pea te whakawhitinga pukoro, engari karekau he painga rongoa i roto i te CF.Heoi, ko nga wai penei i nga kawe ira ka heke maori ki te alveoli i runga i te faauru i muri i te tuku3,4 me nga matūriki rongoa ka tere haere ki roto i te waha waha e te MCT.LV whakawhiti i te kaha o te whakawhiti i te wa e tika ana kia mau tonu te roa o te noho o nga pūtau. te wa”5 – he mea ngawari ki te whakaheke i te rere o te hau a-rohe tae atu ki te hopu matūriki matūriki me te MCT.Mo te CF, he mea nui te kaha ki te whakaroa i te wa noho o te LV i roto i te huarahi rererangi ki te whakatutuki i nga taumata teitei o te whakawhiti i tenei rohe, engari he uaua tonu.
Ki te hinga i tenei arai, ko ta matou whakaaro ka awhina pea nga matūriki aukume LV (MP) i roto i nga huarahi taapiri e rua. me te ASL) ki te neke ki te paparanga pūtau 6. Kua whakamahia whānuitia nga MP hei waka tuku tarukino i te wa e herea ana ki nga paturopi, ki nga raau taero chemotherapeutic, ki etahi atu ngota ngota iti e piri ana ki nga kiriuhi pūtau, ka herea ranei ki nga kaiwhakawhiwhi o te mata pūtau e tika ana, ka whakaemihia ki nga waahi pukupuku i te aroaro o te hiko pateko. Ko nga Maara Aukume mo te maimoatanga mate pukupuku 7. Ko etahi atu tikanga "hyperthermal" e whai ana ki te whakamahana i nga mema paremata i te wa e pa ana ki nga waahi oscillating autō, na reira ka whakangaro i nga pūtau puku. kua whakapumautia te magnetotransfection, me te tuku in vitro o LV-MPs ki te raina pūtau epithelial bronchial tangata i te aroaro o te papa autō pateko, te whakanui ake i te pai o te whakawhiti i te 186-fold ka whakaritea ki te LV vector alone.LV-MP kua whakamahia ano ki te tauira in vitro CF, i reira ka nui ake te whakawhitinga LV i roto i te hau-wai-atanga ahurea i roto i te aroaro o te 20.CF.CFu. vivo magnetotransfection o whēkau he iti te aro, a kua arotakehia i roto i te torutoru rangahau kararehe11,12,13,14,15, rawa i roto i te pūkahukahu16,17. Ahakoa, he mārama nga whai wāhitanga mo te whakawhiti autō i roto i te CF pūkahukahu therapy. Tan et al. Nga rautaki CFTR inhalation hei whakapai ake i nga hua haumanu i nga turoro CF”6.
Ko te whanonga o nga matūriki aukume iti i runga i te mata o te ara rererangi i te aroaro o te papa autō tono he uaua ki te tiro me te ako, na reira ka kore e tino marama.I etahi atu rangahau, i hangaia e matou he tikanga whakamaarama X-ray (PB-PCXI) e ahu mai ana i te tukutahi-whakatōpūtanga-whakatairanga (PB-PCXI) ki te whakaata me te ine i te meneti i roto i nga huringa vivo i roto i nga huringa o te ASL18 me te ASL hohonu o te hau. ka whakamahia hei tohu moata mo te kaha o te maimoatanga.I tua atu, ka whakamahia e ta maatau tikanga arotakenga MCT nga matūriki diameter 10-35 µm i hangaia he konumohe, he karaehe tohu tohu teitei ranei hei tohu MCT e kitea ana ma te whakamahi i te PB-PCXI21. He pai nga tikanga e rua mo te tirohanga o te whānuitanga o nga momo matūriki, tae atu ki te MP.
Na te nui o te whakataunga mokowā me te waahi, he pai a maatau tikanga tātari ASL me te MCT i runga i te PB-PCXI mo te tirotiro i nga hihiko me nga tauira o te whanonga matūriki kotahi me te nuinga i roto i te vivo hei awhina i a maatau ki te mohio me te arotau i nga tikanga tuku ira MP. pulmonary Airways of kiore to help explain our Kore-uniform tauira whakaputanga ira kitea i roto i to tatou ira kawe ira horopeta rangahau kararehe 3,4.
Ko te whainga o tenei rangahau ko te whakamahi i te synchrotron PB-PCXI ki te whakaata i nga nekehanga in vivo o te raupapa o nga mema MP i roto i te pukoro o nga kiore ora. ki te tautuhi i nga whirihoranga aukume e whakanui ana i te maha o nga matūriki e mau ana i roto i te trachea i muri i te tuunga.I roto i te raupapa tuarua o nga rangahau, i rapu matou ki te whakamahi i tenei whirihoranga tino pai ki te whakaatu i te tauira whakawhiti i puta mai i roto i te tukunga o nga LV-MPs ki te ara rererangi kiore, i runga i te whakaaro ko te tukunga o nga LV-MPs i roto i te horopaki o te whaainga rererangi ka pai ake te whakawhiti i te LV.
Ko nga rangahau kararehe katoa i mahia i runga i nga tikanga kua whakaaetia e te Whare Wananga o Adelaide (M-2019-060 me M-2020-022) me te SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. I mahia nga whakamatautau i runga i nga aratohu ARRIVE.
Ko nga whakaahua X-ray katoa i mahia i te BL20XU beamline i te SPring-8 synchrotron i Japan, ma te whakamahi i te tatūnga rite ki tera i whakaahuahia i mua21,22. He poto, ko te pouaka whakamatautau kei te 245 m mai i te mowhiti rokiroki synchrotron.He tauira-ki-te-kitenga te tawhiti o te 0.6 m ka whakamahia mo nga rangahau whakaata matūriki m 0.6 m mo nga rangahau whakaata matūriki m. I whakamahia he kaha kurupae monochromatic o te 25 keV. I hopukina nga whakaahua ma te whakamahi i te kaitahuri X-ray taumira teitei (SPring-8 BM3) i honoa ki te kaitahuri sCMOS. Ka huri te kaitahuri i nga hihi-X ki te marama ka kitea ma te whakamahi i te scintillator 10 µm matotoru (Gd3Al2Ga3O12) te whakamahi i te moroiti whainga x012, ko te whakamahi i te moroiti whainga x012. (NA 0.3).Ko Orca-Flash4.0 te kaitirotiro sCMOS (Hamamatsu Photonics, Japan) me te rahi o te raupapa o te 2048 × 2048 pika me te rahi pika mata o 6.5 × 6.5 µm. Ko tenei tatūnga ka whakaputa i te rahi o te pika isotropic whai hua o te 0.51 µm te roa o te 1 mm me te mara. I whiriwhiria te 100 ms ki te whakanui ake i te owehenga tohu-ki-haruru o nga matūriki autō i roto, i waho hoki o te huarahi rererangi i te whakaiti i nga mahi toi motini i te manawa.
Kaore i whakamahia te kaikawe LV i roto i nga rangahau whakaahua SPring-8 PB-PCXI na te mea ko te ruuma whakaahua BL20XU kaore i whakamanahia te Biosafety Taumata 2. Engari, i whiriwhiria e matou he maha o nga mema paremata kua tino tohuhia mai i nga kaiwhakarato hokohoko e rua—e hipoki ana i te whānuitanga o te rahi, rauemi, kukū rino, me nga tono—ko te tuatahi ki te mohio ki te paheketanga o te MP i roto i nga karaehe o te rangi me te karaehe autō. i runga i te mata.Ko te rahi o nga MP mai i te 0.25 ki te 18 μm he mea hanga mai i nga momo rawa (tirohia te Ripanga 1), engari ko te hanganga o ia tauira, tae atu ki te rahi o nga matūriki autō i roto i te MP, kaore i te mohiotia. te tango i nga papa karapīpiti kia kite i te whakakitenga ake o te nekehanga MP. Ko te MP kotahi 0.25 μm te rahi he iti ake i te taumira o te taputapu atahanga, engari ko te PB-PCXI e tika ana kia kitea te rereke o te rōrahi me te nekehanga o te wai mata e takoto ana i muri i te tukunga.
Ko nga tauira mo ia MP i te Ripanga 1 i whakaritea i roto i te 20 μl capillaries karaihe (Drummond Microcaps, PA, USA) me te diameter o roto o te 0.63 mm. Kei te waatea nga matūriki corpuscular i roto i te wai, i te wa e waatea ana nga matūriki CombiMag i roto i te wai rangatira o te kaihanga. Ko ia ngongo he haurua ki te wai (tirohia te 11 μl te kaata) me te (tirohia te 11 μl tauira). whakanohoia whakapae i runga i te atamira tauira i roto i te pouaka atahanga, aua, ka tuu nga taha o te fluid.A 19 mm diameter (28 mm roa) nickel anga onge whenua neodymium rino boron (NdFeB) aukume (N35, ngeru. No. LM1652, Jaycar Electronics, Ahitereiria) ki te toenga aukumetanga o te wahi whakamaoritanga i piri ki te 1.17 a Tesla wahi whakamaoritanga i piri ki a Hurihia te wahanga o Tesla. atahanga.Ka timata te tango atahanga X-ray ina tuu te aukume tata ki te 30 mm ki runga ake i te tauira, ka riro mai nga whakaahua i te tere o te 4 papa mo ia hekona. I te wa e whakaahua ana, ka tatahia te aukume ki te ngongo capillary karaihe (tata ki te 1 mm te tawhiti) katahi ka whakamaoritia ma te ngongo hei aromatawai i nga paanga o te kaha o te mara me te waahi.
I roto i vitro imaging tatūnga kei roto tauira MP i capillaries karaihe i runga i te tauira xy translation stage.Ko te ara o te X-ray kurupae kua tohua ki te raina taia whero.
I te wa i whakapumautia ai te tirohanga in vitro o nga MP, ka whakamatauria he wahanga o ratou i roto i te vivo i roto i te momo mohoao wahine albino Wistar kiore (~ 12 wiki te pakeke, ~ 200 g). Seika) I whakanekehia nga kiore ki te ranunga o Pharma), Japan) na roto i te werohanga intraperitoneal.I muri i te whakamohoatanga, ka rite ratou mo te atahanga ma te tango i te huruhuru huri noa i te trachea, me te whakauru i te ngongo endotracheal (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) me te whakakorikori i a ratou ki runga i te pereti whakamaarama whakamaarama2 ka mau ki te pereti whakamaarama whakamaarama2. ka piri ki te tauira whakamaoritanga i roto i te pouaka whakaahua i te koki paku hei whakaroa i te pukoro i te taha whakapae i te ahua X-ray, penei i te Whakaaturanga 2a.
(a) In vivo imaging setup in the SPring-8 imaging box, the path of the X-ray beam is marked with a red dashed line.(b,c) Ko te whakawhanaunga aukume i runga i te trachea i mahia mamao ma te whakamahi i nga kamera IP e rua kua mau.
I honoa he punaha papu syringe mamao (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) ma te whakamahi i te syringe karaihe 100 μl ki te ngongo PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) ma te ngira 30 Ga. Tohua te ngongo kia tika te tuunga o te pito ki roto i te putunga moroiti, ka kuhu te ngongo ngongo. ka tangohia i te wa i rukuhia te pito o te ngongo ki roto i te tauira MP hei tuku.Katahi ka whakauruhia te ngongo tuku utaina ki roto i te ngongo endotracheal, ka waiho te pito ki roto i te waahanga kaha rawa atu o to maatau waahi autō e tumanakohia ana. I whakahaeretia te tangohanga whakaahua ma te whakamahi i te kaitao manawa e hono ana ki to maatau pouaka taima i runga i te Arduino, me nga tohu katoa (hei tauira, te whakamahana, te respiration, me te rekoata o te Lab. (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. I te wa e whakaahua ana I te wa e kore e taea te uru atu, e rua nga kaamera IP (Panasonic BB-SC382) i noho tata ki te 90° tetahi ki tetahi, ka whakamahia ki te aro turuki i te waahi o te aukume e pa ana ki te trachea i te wa e whakaahuahia ana (Fig. 2b,c).
Ka honoa he aukume ki te waahanga tuarua ka taea te noho mamao mai i waho o te whare whakaahua. I whakamatauria te maha o nga tuunga aukume me nga whirihoranga, tae atu ki: Whakanohoia ki te koki tata ki te 30° ki runga ake o te trachea (nga whirihoranga e whakaatuhia ana i te Whakaahua 2a me te 3a); kotahi aukume kei runga ake i te kararehe me tetahi ki raro, me nga pou kua whakatakotoria hei kukume (Whakaahua 3b ); ko tetahi aukume kei runga ake i te kararehe me tetahi ki raro, me nga pou kua whakatakotoria hei pehi (Whakaahua 3c); me te kotahi aukume kei runga ake, e tu tika ana ki te pukoro (Whakaahua 3d). Kia whirihorahia te kararehe me te aukume ka utaina te MP hei whakamatautau ki roto i te papu syringe, tukuna he horopeta 50 μl i te tere o te 4 μl/s i te wa e whiwhi whakaahua ana. Ka nekehia te aukume ki te taha ki te taha ranei ki te taha o te pukoro ka haere tonu ki te tango whakaahua.
Te whirihoranga aukume mo te atahanga in vivo (a) he aukume kotahi kei runga ake i te trachea i te koki tata ki te 30°, (b) e rua nga aukume kua whakaritea hei kukume, (c) e rua nga aukume i whakatakotoria hei peia, (d) he aukume kotahi kei runga ake me te noho tika i roto i te trachea.Ka titiro iho te kaitirotiro mai i te waha ki te ngongo ma roto i te trachea, ka haere te taha maui ki te taha maui me te hihi X-ray. ka nekehia te aukume ki te roa o te ara rererangi, ki te taha maui me te taha matau ranei i runga ake o te trachea ki te ahunga o te kurupae X-ray.
I rapu ano matou ki te whakatau i te tirohanga me te whanonga o nga matūriki i roto i nga huarahi rererangi i te kore o te whakapouri manawa me te nekehanga o te ngakau.Na reira, i te mutunga o te wa atahanga, ka mate tangata nga kararehe mo te pentobarbital overdose (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip i mahue i te waahi o te manawa imag, me te manawa imaging i te wa kotahi). ka tukuruatia te tukanga, me te taapiri atu i te horopeta MP mena karekau he mema paremata i kitea i runga i te mata o te huarahi rererangi.
Ko nga whakaahua i riro mai he papa papatahi me te mara pouri kua whakatikahia, katahi ka whakaemihia ki te kiriata (20 papa mo ia hekona; 15-25 × tere noa i runga i te reanga manawa) ma te whakamahi i te tuhinga ritenga kua tuhia ki MATLAB (R2020a, The Mathworks).
I whakahaerehia nga rangahau tuku ira ira LV katoa i te Whare Rangahau Kararehe Taiwhanga i te Whare Wananga o Adelaide me te whai ki te whakamahi i nga hua o te whakamatautau SPring-8 ki te aromatawai mehemea ka taea e te tuku LV-MP i te aroaro o te papa autō te whakarei ake i te whakawhiti ira i roto i te vivo.
I hangaia nga ira ira LV ma te whakamahi i nga tikanga kua whakaahuatia i mua 25, 26. Ko te vector LacZ e whakaatu ana i te ira beta-galactosidase karihi-rohe i peia e te kaiwhakatairanga MPSV constitutive (LV-LacZ), e whakaputa ana i te hua tauhohenga kikorangi i roto i nga pūtau whakawhiti, ka kitea i mua o te kiko pūkahukahu me nga waahanga kiko. titer i roto i te TU/ml.Ka tiakina nga kaikawe ki te -80 °C, ka whakamarokehia i mua i te whakamahi, ka herea ki CombiMag ma te ranu i te 1:1 ōwehenga me te incubating ki runga tio mo te iti rawa 30 meneti i mua i te tuku.
Ko nga kiore Sprague Dawley noa (n = 3 / roopu, ~ 2-3 i whakahiatohia intraperitoneally me te ranunga o te 0.4 mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Ahitereiria) me te 60 mg / kg ketamine (Ilium, Ahitereiria) marama-marama) ip) werohia me te kore-surgical oral cannulation me te 16 Ga iv kia taea ai e te 16 Ga iv te tango i te kiko o te kiri o te kiri. i whakatauirahia ma te whakamahi i ta maatau kawa whakapouri miihini i whakaahuahia i mua ake nei, i pania axially te mata o te ara o te arai ki te kete waea (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28.Tracheal administration of LV-MP katahi ka mahia i roto i te rūnanga haumaru koiora.
Ko te papa aukume i whakamahia i roto i tenei whakamatautau i whirihorahia i roto i te ahua rite ki te in vivo X-ray imaging ako, me nga aukume rite i mau ki runga ake o te trachea ma te whakamahi i nga topenga stent distillation (Whakaahua 4). He 50 μl rōrahi (2 × 25 μl aliquots) o LV-MP i tukuna ki roto i te trachea (n = 3 nga kararehe o mua i whakaahuatia) 3 nga kararehe) i whiwhi i nga LV-MP ano me te kore whakamahi i te aukume. I muri i te otinga o te whaowhia, ka tangohia te cannula mai i te ngongo ET ka tukuna te kararehe. Ka noho tonu te aukume mo te 10 meneti, katahi ka tangohia. Ka whiwhi nga kiore i te horopeta subcutaneous o meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Ahitereiria) ka whai i te whakahuritanga o te iripa o te atipam1zol i roto i te mg/kg hydrochloride. (Antisedan, Zoetis, Ahitereiria).I whakamahanahia nga kiore me te aro turuki tae noa ki te ora tonu mai i te rewharewha.
Ko te taputapu tuku LV-MP i roto i te rūnanga haumaru koiora.Ka kitea te hupa Luer hina hina o te ngongo ET e puta mai ana i te waha, ka kuhuhia te pito reera o te pipette e whakaatuhia ana i te pikitia i roto i te ngongo ET ki te hohonutanga e hiahiatia ana ki roto i te trachea.
Kotahi wiki i muri mai i te LV-MP dosing tukanga, ka mate tangata nga kararehe i te 100% CO2 inhalation me te LacZ whakaaturanga i aromatawaihia ma te whakamahi i to maatau maimoatanga X-gal paerewa. Ko nga mowhiti e toru te nuinga o nga mowhiti cartilaginous i tangohia ki te whakarite kia kore e whakauruhia nga pakaru miihini me te pupuri wai mai i te tuunga ngongo endotracheal ki roto i te tātari. (Sylgard, Dow Inc) e whakamahi ana i te ngira Minutien (Fine Science Tools) ki te tiro i te mata maramara. Ko te tohatoha me te tauira o nga pūtau whakawhiti i whakapumautia e te whakaahua o mua ma te whakamahi i te miihini Nikon (SMZ1500) me te kamera DigiLite me te rorohiko TCapture (Tucsen Photonics, Haina). Ko te roa o te pukoro i whakaahuahia i ia taahiraa, me te whakarite kia nui te inaki i waenga i ia ahua kia taea ai te "tuinga" whakaahua. Katahi ka whakahiatohia nga whakaahua mai i ia trachea ki te ahua hiato kotahi ma te whakamahi i te Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) e whakamahi ana i te mahere nekehanga algorithm. Ko nga waahanga whakaaturanga LacZ i roto i nga whakaahua hiato o te kararehe i taraihia ma te whakamahi i te LAB ki te tuhi aunoa. (R2020a, MathWorks) pera i te korero i mua, ma te whakamahi i nga tautuhinga 0.35
I mauhia ia trachea ki roto i te paraffin ka tapahia nga waahanga 5 μm. Ko nga waahanga ka parea ki te whero tere kore mo te 5 min, ka riro nga whakaahua ma te whakamahi i te miihini Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 me te punaha hopu huānga NIS (putanga 5.20.00).
Ko nga tātaritanga tatauranga katoa i mahia i roto i te GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).I whakatauhia te hiranga o te tatauranga ki te p ≤ 0.05. I whakamanahia te tikanga ma te whakamahi i te whakamatautau Shapiro-Wilk, a, i aromatawaihia nga rereketanga o te taatai LacZ ma te whakamahi i te whakamatautau-t kore takirua.
Ko nga mema MP e ono i whakaahuahia i te Ripanga 1 i tirotirohia ma te whakamahi i te PCXI, a, ko te whakaatu i te Ripanga 2. E rua nga mema polystyrene (MP1 me te MP2; 18 μm me te 0.25 μm, ia) kaore i kitea i raro i te PCXI, engari ko te toenga o nga tauira i tautuhia (kei te whakaatuhia nga tauira ki te 1MP3-O MP5% 5). Ko te 0.25 μm me te 0.9 μm ka tino kitea. Ahakoa kei roto etahi o nga matūriki iti i whakamatauria, ko te MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) te tino whakahua. Ko te hua CombiMag MP6 he uaua ki te kitea. ka neke atu nga aukume i te kapi, ka toro atu nga matūriki i roto i nga aho roa, engari i te mea ka tata mai nga aukume me te kaha ake o te kaha o te papa aukume, ka poto nga aho matūriki i te hekenga o nga matūriki ki te mata o runga o te capillary (tirohia te Ataata Tāpiri S1: MP4), ka piki ake Te kiato matūriki o te mata. capillary (tirohia te Ataata Tāpiri S2:MP4).Ka mutu te neke o te aukume, ka neke tonu nga matūriki mo te wa poto i muri i te ekenga ki te tuunga taurite.I te wa e neke haere ana te MP i te mata o runga o te capillary, ka toia e nga matūriki autō te otaota ki roto i te wai.
He rerekee te kitea o te MP i raro i te PCXI i waenga i nga tauira.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 me (d) MP6. Ko nga whakaahua katoa e whakaatuhia ana i konei i tangohia me te aukume kei te tata ki te 10 mm kei runga ake i te kapi. whakanuia.Kia mahara ko nga diameter o nga hoahoa aukume i roto i nga whika katoa kaore i te tauine, he tata ki te 100 te rahi ake i te whakaaturanga.
I te wa e whakamaoritia ana te aukume ki te taha maui me te taha matau ki te taha o runga o te kapi, ka huri te koki o te aho MP ki te hono ki te aukume (tirohia te Whakaahua 6), na reira ka whakatauhia nga raina papa autō. S3:MP5).Ka tino kitea ano tenei i te wa e tata ana te whakaahua ki te pito kapi, na te mea ka whakahiato, ka aro nga MP ki te atanga wai-rangi.Ko nga matūriki i roto i te MP6, he uaua ake ki te mohio atu i te MP3-5, kaore i toia i te wa e neke ana te aukume ki te taha o te kapi, engari ka wehe nga aho MP i roto i te waahanga MP6 (tirohia etahi matūriki o te Ataata: S4). Ko nga keehi, i te whakahekenga o te papa aukume i whakamahia ma te neke i te aukume kia tawhiti mai i te waahi whakaahua, ka heke haere nga toenga o nga mema paremata ki te mata o raro o te ngongo ma te kaha i te wa e noho ana i roto i te aho (tirohia te Ataata Tāpiri S5: MP3).
Ka huri te koki o te aho MP i te wa e whakamaoritia ana te aukume ki te taha matau i runga ake i te kapi.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 me (d) MP6. Kei roto i te pouaka whero te whakanui-whakarei rereke.Kia mahara he korero korero nga ataata taapiri i te mea e whakaatu ana i te hanganga matūriki nui me nga korero hihiri e kore e taea te kite i enei whakaahua pateko.
I whakaatuhia e o maatau whakamatautau ko te neke haere i te aukume whakamuri me te ahu whakamua i te taha o te trachea ka ngawari te tirohanga o te MP i roto i te horopaki o te nekehanga uaua i roto i te vivo.Kaore i mahia te whakamatautau i roto i te vivo i te mea kaore i kitea nga pirepire polystyrene (MP1 me te MP2) i roto i te kapi. 3a), na te mea ka roa ake nga mekameka MP me te whai hua ake i te whirihoranga aukume i whakamutua.Kare a MP3, MP4 me MP6 i kitea i roto i te trachea o tetahi kararehe ora. I te wa i whakaahuahia nga huarahi rererangi kiore i muri i te whakamatenga o nga kararehe, ka noho kore kitea nga matūriki ahakoa ka taapirihia he rōrahi ma te whakamahi i te papu syringe. vivo whanonga o MP.
Ko te whakanoho i te aukume ki runga i te pukoro i te tukunga o te MP i hua he maha, engari ehara i te katoa, ko nga mema paremata i aro ki te waahi tirohanga.Ko nga matūriki e uru ana ki roto i te trachea ka tino kitea i roto i nga kararehe e patua ana e te tangata.Whakaahua 7 me te Ataata Tāpiri S6: E whakaatu ana te MP5 i te hopu tere autō me te whakahāngaitanga o nga matūriki ki runga i te mata o te puwharewharewharewha e tohu ana ko te rohe o te puwharewha e tohu ana ko te rohe o te puwharewha e tohu ana ko te rohe o te puwharewha e tohu ana ki te rohe o te puwha. I te rapu tawhiti atu i te pukoro i muri i te tukunga o te MP, ka kitea etahi o nga mema paremata e tata ana ki te carina, e kii ana he iti rawa te kaha o te papa aukume ki te kohikohi me te pupuri i nga mema katoa, i te mea i tukuna mai i roto i te rohe e kaha ana te kaha o te papa autō i te wa o te wai.
Ko nga whakaahua mai i te (a) i mua me te (b) i muri i te tuku MP5 ki roto i te pukoro o te kiore katahi ano ka whakakorehia me te aukume i tu tika ki runga ake o te waahi whakaahua. Kei waenganui i nga mowhiti cartilage e rua te waahi whakaahua.
Ko te whakamaoritanga o te aukume i te taha o te trachea in vivo i huri ai te mekameka MP i te koki i roto i te mata o te ara rererangi kia rite ki tera i kitea i roto i nga capillaries (tirohia te Whakaahua 8 me te Ataata Tāpiri S7:MP5). Ka huri te aho matūriki i te hōhonutanga o te paparanga wai mata ina nekehia te aukume kia roa i te taha o te trachea, ka whakaroa ake ina neke tika te aukume ki runga ka huri te aho matūriki ki te tuunga poutū (tirohia te Ataata Tāpiri S7). : MP5 i te 0:09, raro matau).I rereke te ahua o te nekehanga i te wa i whakamaoritia ai te aukume ki runga o te pukoro (ara, ki te taha maui, ki te matau ranei o te kararehe, kaua ki te roa o te trachea).I kitea tonu nga matūriki i a ratou e neke ana, engari i te wa i tangohia ai te aukume i te pukoro, ka kitea nga pito o nga aho matūriki, S80. e rite ana ki te whanonga MP i kitea e matou i raro i te papa autō i whakamahia i roto i te kaapene karaihe.
He tauira whakaahua e whakaatu ana i te MP5 i roto i te pukoro o te kiore kua ora.(a) Ka whakamahia te aukume ki te tiki whakaahua i runga ake me te taha maui o te pukoro, ka (b) i muri i te nekenga o te aukume ki te taha matau. Kei roto i te pouaka whero te whakanui-whakanui.
I te wa i whirihorahia ai nga pou e rua ki te taha raki-te-tonga i runga ake, i raro hoki i te trachea (arā, te kukume; Fig. 3b), ka roa ake te ahua o nga chord MP, ka noho ki te pakitara taha o te trachea, kaua ki runga i te mata o muri (tirohia te Ataata Tāpiri S9:MP5). I whakamahia he taputapu aukume-rua, ka puta ina whakamahia he taputapu aukume kotahi. Katahi ka whirihorahia tetahi aukume hei turaki i nga pou ka huri (Whakaahua 3c), karekau te maha o nga matūriki e kitea ana i te tirohanga tirohanga karekau i te piki ake i muri i te tukunga. Ko te tatūnga o nga whirihoranga rua-aukume e rua he wero na te kaha o te kaha o te pana aukume i te kaha o te papa aukume, ka huri i te kaha o te papa aukume. ki te huarahi rererangi engari ka haere i te ara rererangi i te 90 nga nekehanga kia whiti ai nga raina mara i te pakitara o te tracheal orthogonally (Fig. 3d), he whakatakotoranga i hangaia hei whakatau mena ka kitea te whakahiatotanga matūriki i runga i te pakitara taha .Heoi, i roto i tenei whirihoranga, karekau he nekehanga e mohiotia ana o te whakaemi MP, te nekehanga aukume ranei. 3a) i whiriwhiria mo nga rangahau kawe ira ira.
I te wa i ata whakaahuahia te kararehe i muri tonu i te kohurutanga tangata, na te korenga o te nekehanga o te kiko whakararuraru ka kitea nga rarangi matūriki iti me te poto ake i roto i te mara interchondral maamaa, "wobbly" i runga i te nekehanga whakawhiti o te aukume. Heoi ano, kaore e taea te kite i te ahua me te neke o nga matūriki MP6.
Ko te titer LV-LacZ ko 1.8 × 108 TU / ml, a, i muri i te 1: 1 te ranu ki te CombiMag MP (MP6), ka whiwhi nga kararehe i te horopeta 50 μl tracheal o 9 × 107 TU / ml LV waka (arā 4.5 × 106 TU / kiore). ).I roto i enei rangahau, hei utu mo te whakamaori i te aukume i te wa e mahi ana, ka whakatikahia e matou te aukume ki te waahi kotahi ki te whakatau mehemea ka taea te whakapai ake te whakawhiti LV (a) ki te tuku vector i te kore o te papa aukume, a (b) ka taea te arotahi Ko nga pūtau Airway ka whakawhitia ki nga rohe taumata autō o te ara rererangi o runga.
Ko te noho mai o nga aukume me te whakamahi i te CombiMag me nga LV vectors kaore i puta he paanga kino ki te hauora o te kararehe, pera ano me ta maatau kawa tuku LV vector. ko te whakapouri i roto i te roopu whakahaere (Fig. 9b). Ko te inenga o nga waahi kua whakapourihia e X-Gal i whakaatu ko te whakahaeretanga o te LV-MP i te aroaro o te papa autō i puta he tata ki te 6-fold te whakapai ake (Fig. 9c).
He tauira whakaahua hiato e whakaatu ana i te whakawhiti a-whare na te LV-MP (a) i te aroaro o te papa aukume me te (b) i te kore o te aukume.(c) He tino pai ake te tatauranga i roto i te waahi whakawhiti LacZ i roto i te pukoro ina whakamahi i te aukume (*p = 0.029, t-whakamatautau, n = 3 mo ia roopu, te tikanga ± SEM).
Ko nga waahanga whakaheke-whero tere tere (tauira e whakaatuhia ana i te Whakaaturanga Tāpiri 2) i whakaatu nga pūtau kua pokea-LacZ i roto i te tauira me te waahi rite ki te korero i mua.
Ko te wero nui mo te whakamaarama ira ira rererangi ko te waahi tika o nga matūriki kawe kawe ki nga rohe e aro nui ana me te whakatutuki i nga taumata tiketike o te pai o te whakawhiti i roto i te pukahukahu neke i te aroaro o te rere o te hau me te maatanga mucus kaha. He pai nga painga o te whakawhiti ki etahi atu tikanga tuku ira penei i te electroporation, na te mea ka taea e ia te whakakotahi i te ngawari, te utu-whai hua, te tuku rohenga, te kaha ake, me te poto ake o te wa inkubasi, me te iti ake pea te horopeta kawe10. Heoi, ko te whakahekenga me te whanonga o nga matūriki autō i roto i nga huarahi rererangi i raro i te awe o te kaha o te kaha o waho o tenei tikanga kaore ano kia tino whakaahuatia, karekau i tino whakaatuhia te kaha o te kaha o te ira o waho. i roto i nga huarahi rererangi ora.
I kitea e a maatau whakamatautau in vitro synchrotron PCXI ko nga matūriki katoa i whakamatauria e matou, haunga te polystyrene MP, i kitea i roto i te tatūnga atahanga i whakamahia e matou. I te aroaro o te papa autō, ka hangaia e nga MP nga aho aho e hono ana te roa ki te momo matūriki me te kaha o te papa aukume (ara te tata me te nekehanga o te aukume). mara.Ko enei mara motuhake ka whakahiato me te hono atu etahi atu matūriki rite, me nga nekehanga rite-ahoa-roopu na te kaha o te rohe mai i nga mana ataahua me nga mana whakakeke o etahi atu matūriki.
Te whakaatu (a,b) nga tereina matūriki i hangaia i roto i nga kapi kapi-wai me te (c,d) te hikoi kapi-a-rangi.Kia mahara kaore i te kumea nga kapi me te trachea ki te tauine.Kei roto hoki i te Paepae (a) he whakaahuatanga mo te MP, kei roto nga matūriki Fe3O4 kua whakaritea ki nga aho.
I te nekehia o te aukume ki runga ake o te kapi, ka eke te koki o te aho matūriki ki te paepae nui mo te MP3-5 kei roto Fe3O4, i muri iho ka kore te aho matūriki i noho ki te turanga taketake, engari ka neke haere i runga i te mata ki te waahi hou.magnet.Ka puta pea tenei paanga na te mea he maeneene te mata o te karaehe kia taea ai tenei nekehanga kia puta.He mea whakamiharo, he korekore te MP6Combib he iti ake, he rereke nga paninga, he utu mata ranei, he wai kawe kawe ranei i pa te kaha ki te neke. Ko te rereke o te ahua o nga matūriki CombiMag he ngoikore ano, e tohu ana he rite te ahua o te wai me nga matūriki, na reira kare e ngawari te neke ki tetahi. Ko te kaha o te papa aukume me te tawhiti i waenga i te aukume me te waahi whainga He mea nui. Ka huihuia, ko enei hua e kii ana, ahakoa ka taea e nga aukume te hopu i te maha o nga mema e rere ana i roto i te rohe kua tohua, kaore pea e taea te whakawhirinaki nga aukume ki te neke matūriki CombiMag i te mata o te trachea.
Ina tukuna nga matūriki ki roto i te tinana, he uaua ki te tautuhi i roto i te horopaki o te kiko o te tinana neke, engari i whakanuia te kaha ki te kite i aua mea ma te whakamaori i te aukume ki runga ake o te pukoro hei "wiri" i nga aho MP. trachea.He rereke ki nga rangahau in vitro, kaore e taea te toia nga matūriki i te taha o te trachea ma te whakamaori i te aukume. E rite ana tenei kitenga ki te ahua o te hūpē e whakakakahu ana i te mata o te trachea i te nuinga o te wa ki te mahi i nga matūriki kua mauhia, ka mau ki roto i te hūpē ka whakawāteahia e te tikanga whakawātea mucociliary.
I whakapae matou ko te whakamahi aukume mo te kukume i runga ake me raro i te trachea (Fig. 3b) ka hua ake he papa aukume tino rite, kaua ki te papa aukume e tino aro ana ki tetahi waahi, tera pea ka puta te tohatoha matūriki. Ko enei kitenga e rua e whakaatu ana kaore te tatūnga aukume-rua e tino whakapai ake i te mana o te rohe o te whainga MP, a he uaua ki te whirihora i nga hoia aukume kaha, ka iti ake te mahi o tenei huarahi. i roto i te waahi tuku.Na reira, ko te whirihoranga aukume koki 30-tohu kotahi (Whakaahua 3a) ka kiia ko te huarahi ngawari me te tino pai mo te whakamatautau i roto i te vivo.
I kitea e te rangahau LV-MP i te wa i honoa ai nga vectors LV ki a CombiMag ka tukuna i muri i te raru o te tinana i te aroaro o te papa autō, ka tino piki ake nga taumata whakawhiti i roto i te trachea ka whakaritea ki nga whakahaere. ka arahi ki te kaha ake i te wa e whakahekehia ana nga tohu kua tukuna, te whakawhitinga atu i te whaainga, te mumura me nga paanga o te taha aukati, me nga utu kawe ira.Ko te mea nui, e ai ki te kaihanga, ka taea te whakamahi a CombiMag me etahi atu tikanga whakawhiti ira, tae atu ki etahi atu vectors viral (penei i te AAV) me te waikawa nucleic.
Wā tuku: Hūrae-16-2022
