Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiks attēlota bez stiliem un JavaScript.
Gēnu vektoriem cistiskās fibrozes plaušu slimības ārstēšanai jābūt vērstiem uz vadošajiem elpceļiem, jo ​​perifērā plaušu transdukcija nesniedz terapeitisku labumu. Vīrusu transdukcijas efektivitāte ir tieši saistīta ar vektora uzturēšanās laiku. Tomēr piegādes šķidrumi, piemēram, gēnu nesēji, iedvesmas laikā dabiski difundējas alveolās, un jebkuras formas terapeitiskās daļiņas ātri izvadās ar mukociliāru transportu. Gēnu nesēju uzturēšanās laika pagarināšana elpceļos ir svarīga, bet grūti sasniedzama. Ar gēnu nesējiem konjugētas magnētiskās daļiņas, kuras var novirzīt uz elpceļu virsmu, var uzlabot reģionālo mērķēšanu. In vivo vizualizācijas izaicinājumu dēļ šādu mazu magnētisko daļiņu uzvedība uz elpceļu virsmas pielietota magnētiskā lauka klātbūtnē ir vāji izprasta. Šī pētījuma mērķis bija izmantot sinhrotrona attēlveidošanu, lai vizualizētu virknes magnētisko daļiņu kustību in vivo anestēzētu žurku trahejā, lai pārbaudītu atsevišķu un kopējo daļiņu uzvedības dinamiku un modeļus in vivo. Pēc tam mēs arī novērtējām, vai lentivīrusu magnētisko daļiņu piegāde magnētiskā lauka klātbūtnē palielinātu transdukcijas efektivitāti žurku trahejā. Sinhrotrona rentgena attēlveidošana atklāj magnētisko uzvedību. daļiņas stacionāros un kustīgos magnētiskajos laukos in vitro un in vivo. Daļiņas nevar viegli vilkt pa dzīvo elpceļu virsmu ar magnētiem, bet transportēšanas laikā nogulsnes koncentrējas redzes laukā, kur magnētiskais lauks ir spēcīgākais. Transdukcijas efektivitāte palielinājās arī sešas reizes, kad lentivirālās magnētiskās daļiņas tika piegādātas magnētiskā lauka klātbūtnē. Kopā šie rezultāti liecina, ka lentivirālās magnētiskās daļiņas un magnētiskie lauki var būt vērtīgas pieejas, lai uzlabotu gēnu vektoru mērķēšanu un palielinātu transdukcijas līmeni vadošos elpceļos in vivo.
Cistisko fibrozi (CF) izraisa viena gēna, ko sauc par CF transmembrānas vadītspējas regulatoru (CFTR), variācija. CFTR proteīns ir jonu kanāls, kas atrodas daudzās epitēlija šūnās visā ķermenī, tostarp vadošajos elpceļos, kas ir galvenā CF patogenēzes vieta. CFTR defekti izraisa patoloģisku ūdens transportu, dehidratējot elpceļu virsmu un samazinot elpceļu virsmas šķidruma (ASL) slāņa dziļumu. Tas arī pasliktina mukociliārā transporta (MCT) sistēmas spēju attīrīt elpceļus no ieelpotajām daļiņām un patogēniem. Mūsu mērķis ir izstrādāt lentivirālu (LV) gēnu terapiju, lai piegādātu pareizo CFTR gēna kopiju un uzlabotu ASL, MCT un plaušu veselību, kā arī turpināt izstrādāt jaunas tehnoloģijas, kas spēj izmērīt šos parametrus in vivo1.
Kreisā kambara (KK) vektori ir vieni no vadošajiem kandidātiem CF elpceļu gēnu terapijai, galvenokārt tāpēc, ka tie var neatgriezeniski integrēt terapeitisko gēnu elpceļu bazālajās šūnās (elpceļu cilmes šūnās). Tas ir svarīgi, jo tie var atjaunot normālu hidratāciju un gļotu izvadīšanu, diferencējoties funkcionālās, ar gēnu koriģētās CF saistītās elpceļu virsmas šūnās, kā rezultātā rodas ieguvumi mūža garumā. KK vektori jāvirza pret vadošajiem elpceļiem, jo ​​tieši tur sākas CF plaušu slimība. Vektora ievadīšana dziļāk plaušās var izraisīt alveolāru transdukciju, taču tam nav terapeitiska ieguvuma CF gadījumā. Tomēr šķidrumi, piemēram, gēnu nesēji, dabiski migrē uz alveolām pēc ievadīšanas3,4, un terapeitiskās daļiņas ātri nonāk mutes dobumā ar MCT palīdzību. KK transdukcijas efektivitāte ir tieši saistīta ar laiku, cik ilgi vektors paliek blakus mērķa šūnām, lai nodrošinātu šūnu uzņemšanu, – "uzturēšanās laiku"5 –, ko viegli samazina tipiska reģionālā gaisa plūsma, kā arī koordinēta daļiņu gļotu uztveršana un MCT. CF gadījumā spēja pagarināt KK uzturēšanās laiku elpceļos ir svarīga, lai sasniegtu augstu transdukcijas līmeni šajā reģionā, taču līdz šim tas ir bijis izaicinājums.
Lai pārvarētu šo šķērsli, mēs iesakām, ka kreisā kambara magnētiskās daļiņas (MP) varētu palīdzēt divos savstarpēji papildinošos veidos. Pirmkārt, tās var magnētiski vadīt uz elpceļu virsmu, lai uzlabotu mērķēšanu un palīdzētu gēnu nesējdaļiņām atrasties vēlamajā elpceļu reģionā; un ASL) pārvietoties uz 6. šūnu slāni. MP ir plaši izmantotas kā mērķtiecīgi zāļu piegādes nesēji, kad tās saistās ar antivielām, ķīmijterapijas līdzekļiem vai citām mazām molekulām, kas piesaistās šūnu membrānām vai saistās ar atbilstošiem šūnu virsmas receptoriem un uzkrājas audzēja vietās statiskās elektrības klātbūtnē. Magnētiskie lauki vēža ārstēšanā 7. Citu "hipertermālu" metožu mērķis ir uzsildīt MP, kad tie tiek pakļauti svārstīgiem magnētiskajiem laukiem, tādējādi iznīcinot audzēja šūnas. Magnētiskās transfekcijas princips, kurā magnētiskais lauks tiek izmantots kā transfekcijas līdzeklis, lai uzlabotu DNS pārnesi uz šūnām, parasti tiek izmantots in vitro, izmantojot dažādus nevīrusu un vīrusu gēnu vektorus grūti transducējamām šūnu līnijām. LV magnetotransfekcijas efektivitāte ir pierādīta, in vitro piegādājot LV-MP cilvēka bronhu epitēlija šūnu līnijai statiskā magnētiskā lauka klātbūtnē, palielinot transdukcijas efektivitāti 186 reizes, salīdzinot ar tikai LV vektoru. LV-MP ir pielietots arī in vitro CF modelī, kur magnētiskā transfekcija palielināja LV transdukciju gaisa-šķidruma saskarnes kultūrās 20 reizes CF krēpu klātbūtnē10. Tomēr orgānu magnetotransfekcijai in vivo ir pievērsta relatīvi maza uzmanība, un tā ir novērtēta tikai dažos pētījumos ar dzīvniekiem11,12,13,14,15, īpaši plaušās16,17. Tomēr magnētiskās transfekcijas iespējas CF plaušu terapijas rezultāti ir skaidri. Tan et al. (2020) apgalvoja, ka "efektīvas magnētisko nanodaļiņu plaušu piegādes koncepcijas pierādījuma pētījums pavērs ceļu turpmākām CFTR inhalācijas stratēģijām, lai uzlabotu klīniskos rezultātus CF pacientiem"6.
Mazu magnētisko daļiņu uzvedību uz elpceļu virsmām pielietota magnētiskā lauka klātbūtnē ir grūti vizualizēt un pētīt, un tāpēc tā ir slikti izprasta. Citos pētījumos mēs izstrādājām uz sinhrotrona izplatīšanos balstītu fāzes kontrasta rentgena attēlveidošanas (PB-PCXI) metodi, lai neinvazīvi vizualizētu un kvantitatīvi noteiktu nelielas ASL dziļuma18 un MCT uzvedības19,20 izmaiņas in vivo, lai tieši mērītu gāzes kanāla virsmas hidratāciju un izmantotu kā agrīnu ārstēšanas efektivitātes indikatoru. Turklāt mūsu MCT novērtēšanas metode izmanto 10–35 µm diametra daļiņas, kas sastāv no alumīnija oksīda vai augsta refrakcijas indeksa stikla, kā MCT marķierus, kas redzami, izmantojot PB-PCXI21. Abas metodes ir piemērotas dažādu daļiņu veidu, tostarp MP, vizualizācijai.
Pateicoties augstajai telpiskajai un laika izšķirtspējai, mūsu uz PB-PCXI balstītās ASL un MCT analīzes metodes ir labi piemērotas atsevišķu un masveida daļiņu uzvedības dinamikas un modeļu izpētei in vivo, lai palīdzētu mums izprast un optimizēt MP gēnu piegādes metodes. Šeit izmantotā pieeja ir iegūta no mūsu pētījumiem, izmantojot SPring-8 BL20B2 staru līniju, kurā mēs vizualizējām šķidruma kustību pēc neobjektīva vektora devas piegādes peļu deguna un plaušu elpceļos, lai palīdzētu izskaidrot mūsu nevienmērīgos gēnu ekspresijas modeļus, kas novēroti mūsu gēnu nesēju devas dzīvnieku pētījumos3,4.
Šī pētījuma mērķis bija izmantot sinhrotronu PB-PCXI, lai vizualizētu virknes MP kustības in vivo dzīvu žurku trahejā. Šie PB-PCXI attēlveidošanas pētījumi bija paredzēti, lai pārbaudītu dažādus MP, magnētiskā lauka stiprumus un atrašanās vietas, lai noteiktu to ietekmi uz MP kustību. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka ārēji pielietots magnētiskais lauks palīdzētu piegādātajam MP palikt vai pārvietoties uz mērķa zonu. Šie pētījumi arī ļāva mums noteikt magnētu konfigurācijas, kas maksimāli palielina daļiņu skaitu, kas saglabājas trahejā pēc nogulsnēšanās. Otrajā pētījumu sērijā mēs centāmies izmantot šo optimālo konfigurāciju, lai demonstrētu transdukcijas modeli, kas rodas, in vivo piegādājot LV-MP žurku elpceļos, pamatojoties uz pieņēmumu, ka LV-MP piegāde elpceļu mērķtiecīgas ievadīšanas kontekstā uzlabos LV transdukcijas efektivitāti.
Visi pētījumi ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Adelaidas Universitātes (M-2019-060 un M-2020-022) un SPring-8 sinhrotrona dzīvnieku ētikas komitejas apstiprinātiem protokoliem. Eksperimenti tika veikti saskaņā ar ARRIVE vadlīnijām.
Visa rentgenstaru attēlveidošana tika veikta BL20XU staru līnijā SPring-8 sinhrotronā Japānā, izmantojot līdzīgu iepriekš aprakstītajai iekārtai21,22. Īsumā, eksperimentālā kaste atradās 245 m attālumā no sinhrotrona uzglabāšanas gredzena. Daļiņu attēlveidošanas pētījumiem tiek izmantots 0,6 m attālums no parauga līdz detektoram, bet in vivo attēlveidošanas pētījumiem - 0,3 m, lai radītu fāzes kontrasta efektus. Tika izmantota monohromatiska staru enerģija 25 keV. Attēli tika uzņemti, izmantojot augstas izšķirtspējas rentgenstaru pārveidotāju (SPring-8 BM3), kas savienots ar sCMOS detektoru. Pārveidotājs pārveido rentgenstarus redzamā gaismā, izmantojot 10 µm biezu scintilatoru (Gd3Al2Ga3O12), kas pēc tam tiek novirzīts uz sCMOS sensoru, izmantojot × 10 mikroskopa objektīvu (NA 0,3). sCMOS detektors bija Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japāna) ar masīva izmēru 2048 × 2048 pikseļi un neapstrādāta pikseļa izmērs 6,5 × 6,5 µm. Šī iestatīšana nodrošina efektīvu izotropisku pikseļa izmēru 0,51 µm un redzes lauku aptuveni 1,1 mm × 1,1 mm. Ekspozīcijas ilgums 100 ms tika izvēlēts, lai maksimāli palielinātu magnētisko daļiņu signāla un trokšņa attiecību elpceļos un ārpus tiem, vienlaikus samazinot elpošanas izraisītos kustību artefaktus. In vivo pētījumos rentgena ceļā tika ievietots ātrs rentgena slēdzis, lai ierobežotu starojuma devu, bloķējot rentgena staru kūli starp ekspozīcijām.
LV nesējs netika izmantots nevienā SPring-8 PB-PCXI attēlveidošanas pētījumā, jo BL20XU attēlveidošanas kamera nav sertificēta atbilstoši 2. biodrošības līmenim. Tā vietā mēs izvēlējāmies virkni labi raksturotu MP no diviem komerciāliem piegādātājiem, kas aptver dažādus izmērus, materiālus, dzelzs koncentrācijas un pielietojumus, vispirms, lai saprastu, kā magnētiskie lauki ietekmē MP kustību stikla kapilāros un pēc tam dzīvos elpceļos. uz virsmas. MP izmēri svārstās no 0,25 līdz 18 μm un ir izgatavoti no dažādiem materiāliem (sk. 1. tabulu), taču katra parauga sastāvs, tostarp MP esošo magnētisko daļiņu izmērs, nav zināms. Pamatojoties uz mūsu plašajiem MCT pētījumiem 19, 20, 21, 23, 24, mēs sagaidām, ka uz trahejas elpceļu virsmas var redzēt MP, kuru izmērs ir pat 5 μm, piemēram, atņemot secīgus kadrus, lai uzlabotu MP kustības redzamību. Viens 0,25 μm izmēra MP ir mazāks par attēlveidošanas ierīces izšķirtspēju, taču paredzams, ka PB-PCXI noteiks to tilpuma kontrastu un virsmas šķidruma kustību, uz kura tie ir nogulsnēti pēc nogulsnēšanās.
Katra 1. tabulā norādītā MP paraugi tika sagatavoti 20 μl stikla kapilāros (Drummond Microcaps, PA, ASV) ar iekšējo diametru 0,63 mm. Korpuskulārās daļiņas ir pieejamas ūdenī, savukārt CombiMag daļiņas ir pieejamas ražotāja patentētā šķidrumā. Katra mēģene ir līdz pusei piepildīta ar šķidrumu (aptuveni 11 μl) un novietota uz parauga turētāja (sk. 1. attēlu). Stikla kapilāri tika novietoti horizontāli uz parauga statīva attēlveidošanas kastē un novietoti šķidruma malās. Atsevišķam translācijas statīvam tika piestiprināts 19 mm diametra (28 mm garš) niķeļa apvalka retzemju neodīma dzelzs bora (NdFeB) magnēts (N35, kat. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Austrālija) ar atlikušo magnetizāciju 1,17 Tesla tika piestiprināts, lai attēlveidošanas laikā attālināti mainītu tā pozīciju. Rentgena attēla iegūšana sākas, kad magnēts ir novietots aptuveni 30 mm virs parauga, un attēli tiek iegūti ar ātrumu 4 kadri sekundē. Attēlveidošanas laikā magnēts tika pietuvināts stikla kapilāram. caurulē (apmēram 1 mm attālumā) un pēc tam pārvietota pa cauruli, lai novērtētu lauka stipruma un pozīcijas ietekmi.
In vitro attēlveidošanas iekārta, kas satur MP paraugus stikla kapilāros uz parauga xy translācijas platformas. Rentgenstaru ceļš ir atzīmēts ar sarkanu pārtrauktu līniju.
Kad bija noteikta MP redzamība in vitro, daļa no tiem tika testēta in vivo savvaļas tipa sieviešu dzimuma albīnu Wistar žurkām (~12 nedēļas vecas, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidīna (Domitor®, Zenoaq, Japāna), 3,2 mg/kg midazolāma (Dormicum®, Astellas Pharma, Japāna) un 4 mg/kg butorfanola (Vetorphale®, Meiji Seika). Žurkas tika anestēzētas ar Pharma, Japānas) maisījumu, veicot intraperitoneālu injekciju. Pēc anestēzijas tās tika sagatavotas attēlveidošanai, noņemot apmatojumu ap traheju, ievietojot endotraheālu caurulīti (ET; 16 Ga iv kanulu, Terumo BCT) un imobilizējot tās guļus stāvoklī uz speciāli izgatavotas attēlveidošanas plāksnes, kas saturēja termomaisu ķermeņa temperatūras uzturēšanai. 22. Pēc tam attēlveidošanas plāksne tika piestiprināta pie parauga translācijas platformas attēlveidošanas kastē nelielā leņķī, lai traheja rentgena attēlā būtu horizontāli izlīdzināta, kā parādīts attēlā. 2.a.
(a) In vivo attēlveidošanas iestatījums SPring-8 attēlveidošanas kastē, rentgena stara ceļš ir atzīmēts ar sarkanu pārtrauktu līniju. (b, c) Magnēta lokalizācija uz trahejas tika veikta attālināti, izmantojot divas ortogonāli uzstādītas IP kameras. Ekrāna attēla kreisajā pusē var redzēt stieples cilpu, kas tur galvu, un piegādes kanulu, kas atrodas ET caurulē.
Tālvadības šļirces sūkņa sistēma (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), izmantojot 100 μl stikla šļirci, tika savienota ar PE10 caurulīti (ārējais diametrs 0,61 mm, iekšējais diametrs 0,28 mm) ar 30 Ga adatu. Atzīmējiet caurulīti, lai pārliecinātos, ka, ievietojot ET caurulīti, tās gals atrodas pareizajā pozīcijā trahejā. Izmantojot mikrosūkni, šļirces virzulis tika izvilkts, kamēr caurulītes gals bija iegremdēts ievadāmajā MP paraugā. Pēc tam piepildītā ievades caurule tika ievietota endotraheālajā caurulē, novietojot galu mūsu paredzētā pielietotā magnētiskā lauka spēcīgākajā daļā. Attēla iegūšana tika kontrolēta, izmantojot elpošanas detektoru, kas savienots ar mūsu Arduino bāzes laika kārbu, un visi signāli (piemēram, temperatūra, elpošana, slēdža atvēršana/aizvēršana un attēla iegūšana) tika reģistrēti, izmantojot Powerlab un LabChart (AD Instruments, Sidneja, Austrālija) 22. Attēlveidošanas laikā, kad korpuss nebija pieejams, divas IP kameras (Panasonic BB-SC382) tika novietotas aptuveni 90° leņķī viena pret otru un tika izmantotas, lai uzraudzītu magnēta pozīciju attiecībā pret traheju. attēlveidošanas laikā (2.b, c att.). Lai samazinātu kustību artefaktus, paisuma-plūsmas beigu plato laikā katrā elpas vilcienā tika iegūts viens attēls.
Pie otrā posma ir piestiprināts magnēts, ko var novietot attālināti no attēlveidošanas korpusa ārpuses. Tika pārbaudītas dažādas magnētu pozīcijas un konfigurācijas, tostarp: uzstādīts aptuveni 30° leņķī virs trahejas (konfigurācijas parādītas 2.a un 3.a attēlā); viens magnēts virs dzīvnieka un otrs zem tā, ar poliem, kas iestatīti pievilkšanas virzienā (3.b attēls); viens magnēts virs dzīvnieka un otrs zem tā, ar poliem, kas iestatīti atgrūšanas virzienā (3.c attēls); un viens magnēts virs trahejas un perpendikulāri tai (3.d attēls). Kad dzīvnieks un magnēts ir konfigurēti un testējamais MP ir ielādēts šļirces sūknī, attēlu iegūšanas laikā ievadiet 50 μl devu ar ātrumu 4 μl/s. Pēc tam magnēts tiek pārvietots uz priekšu un atpakaļ gar vai sāniski pāri trahejai, vienlaikus turpinot attēlu iegūšanu.
Magnēta konfigurācija in vivo attēlveidošanai (a) viens magnēts virs trahejas aptuveni 30° leņķī, (b) divi magnēti, kas iestatīti pievilkšanai, (c) divi magnēti, kas iestatīti atgrūšanai, (d) viens magnēts virs trahejas un perpendikulāri tai. Novērotājs skatījās uz leju no mutes uz plaušām caur traheju, un rentgena stars izgāja cauri žurkas kreisajai pusei un izgāja no labās puses. Magnēts tiek pārvietots vai nu pa elpceļu garumu, vai pa kreisi un pa labi virs trahejas rentgena stara virzienā.
Mēs arī centāmies noteikt daļiņu redzamību un uzvedību elpceļos, ja nav traucējošas elpošanas un sirdsdarbības. Tāpēc attēlveidošanas perioda beigās dzīvnieki tika humāni nogalināti pentobarbitāla pārdozēšanas gadījumā (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ASV; ~65 mg/kg i.p.). Daži dzīvnieki tika atstāti uz attēlveidošanas platformas, un, tiklīdz elpošana un sirdsdarbība apstājās, attēlveidošanas process tika atkārtots, pievienojot papildu MP devu, ja MP nebija redzams uz elpceļu virsmas.
Iegūtie attēli tika koriģēti plakanā un tumšā lauka apstākļos un pēc tam, izmantojot pielāgotu skriptu, kas rakstīts MATLAB (R2020a, The Mathworks), tika salikti filmā (20 kadri sekundē; 15–25 × normāls ātrums atkarībā no elpošanas ātruma).
Visi LV gēnu vektoru piegādes pētījumi tika veikti Adelaidas Universitātes Laboratorijas dzīvnieku pētniecības centrā, un to mērķis bija izmantot SPring-8 eksperimenta rezultātus, lai novērtētu, vai LV-MP piegāde magnētiskā lauka klātbūtnē varētu uzlabot gēnu pārnesi in vivo. Lai novērtētu MP un magnētiskā lauka ietekmi, tika apstrādātas divas dzīvnieku grupas: vienai grupai ievadīja LV-MP ar ievietotu magnētu, bet otra grupa saņēma kontroles grupu ar LV-MP bez magnēta.
LV gēnu vektori tika ģenerēti, izmantojot iepriekš aprakstītās metodes25, 26. LacZ vektors ekspresē kodolā lokalizētu beta-galaktozidāzes gēnu, ko virza konstitutīvais MPSV promoters (LV-LacZ), kas transducētajās šūnās rada zilu reakcijas produktu, kas ir redzams plaušu audu frontēs un audu griezumos. Titrēšana tika veikta šūnu kultūrās, manuāli saskaitot LacZ pozitīvo šūnu skaitu ar hemocitometru, lai aprēķinātu titru TU/ml. Nesējvielas tiek kriokonservētas -80 °C temperatūrā, pirms lietošanas atkausētas un piesaistītas CombiMag, sajaucot attiecībā 1:1 un inkubējot uz ledus vismaz 30 minūtes pirms piegādes.
Normālas Sprague Dawley žurkas (n = 3/grupa, ~2-3) tika anestēzētas intraperitoneāli ar 0,4 mg/kg medetomidīna (Domitor, Ilium, Austrālija) un 60 mg/kg ketamīna (Ilium, Austrālija) maisījumu (ip) (mēneša vecums) un neķirurģiska perorāla kanulācija ar 16 Ga iv kanulu. Lai nodrošinātu, ka trahejas elpceļu audi saņem kreisā kambara transdukciju, tie tika kondicionēti, izmantojot mūsu iepriekš aprakstīto mehāniskās perturbācijas protokolu, kurā trahejas elpceļu virsma tika aksiāli berzēta ar stiepļu grozu (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ASV) 30 s28. Pēc tam aptuveni 10 minūtes pēc perturbācijas trahejā tika ievadīts kreisā kambara-MP bioloģiskās drošības skapī.
Šajā eksperimentā izmantotais magnētiskais lauks tika konfigurēts līdzīgi kā in vivo rentgena attēlveidošanas pētījumā, ar tiem pašiem magnētiem, kas tika turēti virs trahejas, izmantojot destilācijas stenta klipšus (4. attēls). 50 μl tilpums (2 × 25 μl alikvotas) LV-MP tika ievadīts trahejā (n = 3 dzīvnieki), izmantojot pipeti ar gēla uzgali, kā aprakstīts iepriekš. Kontroles grupa (n = 3 dzīvnieki) saņēma tos pašus LV-MP, neizmantojot magnētu. Pēc infūzijas pabeigšanas kanulu izņem no ET caurulītes, un dzīvnieku ekstubē. Magnēts paliek vietā 10 minūtes, pēc tam to izņem. Žurkas saņēma subkutānu meloksikāma devu (1 ml/kg) (Ilium, Austrālija), kam sekoja anestēzijas pārtraukšana, intraperitoneāli injicējot 1 mg/kg atipamazola hidrohlorīda (Antisedan, Zoetis, Austrālija). Žurkas tika turētas siltumā un novērotas līdz pilnīgai atveseļošanai no anestēzijas.
LV-MP piegādes ierīce bioloģiskās drošības skapī. ET caurulītes gaiši pelēkais Luer uzmava ir redzama izvirzāmies no mutes, un attēlā redzamās pipetes gēla gals tiek ievietots caur ET caurulīti trahejā vēlamajā dziļumā.
Vienu nedēļu pēc LV-MP dozēšanas procedūras dzīvnieki tika humāni nogalināti, ieelpojot 100% CO2, un LacZ ekspresija tika novērtēta, izmantojot mūsu standarta X-gal apstrādi. Trīs kaudāli visvairāk skrimšļainie gredzeni tika noņemti, lai pārliecinātos, ka analīzē netiek iekļauti jebkādi mehāniski bojājumi vai šķidruma aizture no endotraheālās caurulītes ievietošanas. Katra traheja tika pārgriezta gareniski, lai izveidotu divas pusītes analīzei, un tās tika ievietotas traukā ar silikona gumiju (Sylgard, Dow Inc), izmantojot Minutien adatu (Fine Science Tools), lai vizualizētu lūmena virsmu. Transducēto šūnu sadalījums un modelis tika apstiprināts ar frontālu fotografēšanu, izmantojot Nikon mikroskopu (SMZ1500) ar DigiLite kameru un TCapture programmatūru (Tucsen Photonics, Ķīna). Attēli tika iegūti ar 20x palielinājumu (ieskaitot augstāko iestatījumu pilnam trahejas platumam), pakāpeniski attēlojot visu trahejas garumu, nodrošinot pietiekamu pārklāšanos starp katru attēlu, lai varētu veikt attēlu "savienošanu". Pēc tam attēli no katras trahejas tika salikti vienā viens salikts attēls, izmantojot Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) un plaknes kustības algoritmu. LacZ ekspresijas laukumi katra dzīvnieka trahejas saliktajos attēlos tika kvantificēti, izmantojot automatizētu MATLAB skriptu (R2020a, MathWorks), kā aprakstīts iepriekš, izmantojot iestatījumus 0,35 < Nokrāsa < 0,58, Piesātinājums > 0,15 un Vērtība < 0,7. Izsekojot audu kontūras, katram saliktajam attēlam GIMP v2.10.24 tika manuāli ģenerēta maska, lai identificētu audu laukumu un novērstu jebkādu kļūdainu noteikšanu ārpus trahejas audiem. Visu salikto attēlu iekrāsotie laukumi no katra dzīvnieka tika summēti, lai ģenerētu kopējo iekrāsoto laukumu šim dzīvniekam. Pēc tam iekrāsotais laukums tika dalīts ar kopējo maskas laukumu, lai ģenerētu normalizēto laukumu.
Katra traheja tika iestrādāta parafīnā, un tika izgriezti 5 μm biezi griezumi. Griezumi 5 minūtes tika iekrāsoti ar neitrālu spilgti sarkanu krāsu, un attēli tika iegūti, izmantojot Nikon Eclipse E400 mikroskopu, DS-Fi3 kameru un NIS elementu uztveršanas programmatūru (5.20.00 versija).
Visas statistiskās analīzes tika veiktas programmā GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistiskā nozīmība tika noteikta kā p ≤ 0,05. Normalitāte tika pārbaudīta, izmantojot Šapiro-Vilka testu, un LacZ krāsojuma atšķirības tika novērtētas, izmantojot nepāra t-testu.
Seši 1. tabulā aprakstītie MP tika pārbaudīti, izmantojot PCXI, un redzamība ir aprakstīta 2. tabulā. Divi polistirola MP (MP1 un MP2; attiecīgi 18 μm un 0,25 μm) nebija redzami zem PCXI, bet pārējie paraugi bija identificējami (piemēri parādīti 5. attēlā). MP3 un MP4 (attiecīgi 10–15 % Fe3O4; 0,25 μm un 0,9 μm) ir vāji redzami. Lai gan satur dažas no mazākajām testētajām daļiņām, MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 μm) bija visizteiktākā. CombiMag produktu MP6 ir grūti pamanīt. Visos gadījumos mūsu spēja noteikt MP tika ievērojami uzlabota, pārvietojot magnētu uz priekšu un atpakaļ paralēli kapilāram. Kad magnēti attālinājās no kapilāra, daļiņas izstiepās garās virknēs, bet, magnētiem tuvojoties un palielinoties magnētiskā lauka stiprumam, daļiņu virknes saīsinājās, daļiņām migrējot uz kapilāra augšējo virsmu (skatiet 1. papildvideo: MP4), palielinot daļiņu blīvumu. virsmas. Turpretī, kad magnēts tiek noņemts no kapilāra, lauka stiprums samazinās un MP pārkārtojas garās stīgās, kas stiepjas no kapilāra augšējās virsmas (skatiet papildu video S2:MP4). Pēc tam, kad magnēts apstājas, daļiņas turpina kustēties vēl īsu brīdi pēc līdzsvara stāvokļa sasniegšanas. MP virzoties uz kapilāra augšējo virsmu un prom no tās, magnētiskās daļiņas parasti velk gružus caur šķidrumu.
MP redzamība PCXI vidē dažādos paraugos ievērojami atšķiras. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 un (d) MP6. Visi šeit redzamie attēli tika uzņemti ar magnētu, kas novietots aptuveni 10 mm tieši virs kapilāra. Redzamie lielie apļi ir gaisa burbuļi, kas iesprostoti kapilāros, skaidri parādot fāzes kontrasta attēlveidošanas melnbaltās malas. Sarkanajā lodziņā ir redzams kontrastu pastiprinošais palielinājums. Ņemiet vērā, ka magnētu shēmu diametri visos attēlos nav mērogā un ir aptuveni 100 reizes lielāki nekā parādīti.
Kad magnēts tiek pārvietots pa kreisi un pa labi gar kapilāra augšdaļu, MP virknes leņķis mainās, lai tas izlīdzinātos ar magnētu (sk. 6. attēlu), tādējādi iezīmējot magnētiskā lauka līnijas. MP3-5 gadījumā pēc tam, kad horda sasniedz robežleņķa leņķi, daļiņas tiek vilktas gar kapilāra augšējo virsmu. Tas bieži noved pie MP grupēšanās lielākās grupās tuvu vietai, kur magnētiskais lauks ir spēcīgākais (sk. Papildu video S3:MP5). Tas ir īpaši redzams arī attēlveidojot tuvu kapilāra galam, kas izraisa MP agregāciju un koncentrēšanos šķidruma un gaisa saskarnē. MP6 daļiņas, kuras bija grūtāk atšķirt nekā MP3-5, netika vilktas, magnētam pārvietojoties pa kapilāru, bet MP virknes disociējās, atstājot daļiņas redzes laukā (sk. Papildu video S4:MP6). Dažos gadījumos, kad pielietotais magnētiskais lauks tika samazināts, pārvietojot magnētu lielā attālumā no attēlveidošanas vietas, visi atlikušie MP gravitācijas ietekmē lēnām nolaidās uz caurules apakšējo virsmu, paliekot virknē (sk. Papildu video S5:MP3).
MP virknes leņķis mainās, magnētam pārvietojoties pa labi virs kapilāra. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 un (d) MP6. Sarkanajā lodziņā ir kontrastu pastiprinošs palielinājums. Ņemiet vērā, ka papildu video ir informatīvi, jo tie atklāj svarīgu daļiņu struktūru un dinamisko informāciju, ko nevar vizualizēt šajos statiskajos attēlos.
Mūsu testi parādīja, ka magnēta lēna kustināšana uz priekšu un atpakaļ pa traheju atvieglo MP vizualizāciju sarežģītas kustības kontekstā in vivo. In vivo testi netika veikti, jo kapilārā nebija redzamas polistirola lodītes (MP1 un MP2). Katrs no atlikušajiem četriem MP tika testēts in vivo ar magnēta garo asi, kas konfigurēta virs trahejas aptuveni 30° leņķī pret vertikāli (sk. 2.b un 3.a attēlu), jo tas radīja garākas MP ķēdes un bija efektīvāks nekā magnēta konfigurācijas pārtraukšana. MP3, MP4 un MP6 netika konstatēti neviena dzīva dzīvnieka trahejā. Kad žurku elpceļi tika attēloti pēc dzīvnieku humānas nonāvēšanas, daļiņas palika neredzamas pat tad, ja, izmantojot šļirces sūkni, tika pievienots papildu tilpums. MP5 bija visaugstākais dzelzs oksīda saturs, un tā bija vienīgā redzamā daļiņa, tāpēc tā tika izmantota, lai novērtētu un raksturotu MP uzvedību in vivo.
Novietojot magnētu virs trahejas MP piegādes laikā, daudzi, bet ne visi MP tika koncentrēti redzes laukā. Daļiņas, kas nonāk trahejā, vislabāk novērojamas humāni upurētiem dzīvniekiem. 7. attēls un papildu video S6: MP5 parāda ātru magnētisko daļiņu uztveršanu un izlīdzināšanu uz ventrālās trahejas virsmas, kas norāda, ka MP var novirzīt uz vēlamajiem trahejas apgabaliem. Meklējot distālāk gar traheju pēc MP piegādes, daži MP tika atrasti tuvāk velvei, kas liecina, ka magnētiskā lauka stiprums nebija pietiekams, lai savāktu un saglabātu visus MP, jo tie tika piegādāti caur maksimālā magnētiskā lauka stipruma apgabalu šķidruma procesa laikā. Tomēr pēcdzemdību MP koncentrācija bija augstāka ap attēloto zonu, kas liecina, ka daudzi MP palika elpceļu apgabalos, kur pielietotā magnētiskā lauka stiprums bija visaugstākais.
Attēli no (a) pirms un (b) pēc MP5 ievadīšanas nesen eitanizētas žurkas trahejā, magnētam atrodoties tieši virs attēlveidošanas zonas. Attēlotā zona atrodas starp diviem skrimšļa gredzeniem. Pirms MP ievadīšanas elpceļos ir nedaudz šķidruma. Sarkanajā lodziņā ir redzams kontrastu pastiprinošs palielinājums. Šie attēli ir no video, kas redzams papildu video S6:MP5.
Magnēta pārvietošana gar traheju in vivo izraisīja MP ķēdes leņķa maiņu elpceļu virsmā līdzīgi kā kapilāros (sk. 8. attēlu un papildu video S7:MP5). Tomēr mūsu pētījumā MP nevarēja tikt vilkti pa dzīvo elpceļu virsmu, kā tas bija iespējams ar kapilāriem. Dažos gadījumos MP ķēde kļūs garāka, magnētam pārvietojoties pa kreisi un pa labi. Interesanti, ka mēs arī atklājām, ka daļiņu virkne, šķiet, maina virsmas šķidruma slāņa dziļumu, kad magnēts tiek pārvietots gareniski pa traheju, un izplešas, kad magnēts tiek pārvietots tieši virs galvas un daļiņu virkne tiek pagriezta vertikālā stāvoklī (sk. papildu video S7). MP5 pie 0:09, apakšējā labajā stūrī). Raksturīgais kustības modelis mainījās, kad magnēts tika pārvietots pāri trahejas augšdaļai laterāli (tas ir, pa kreisi vai pa labi no dzīvnieka, nevis gar trahejas garumu). Daļiņas joprojām bija skaidri redzamas, tām pārvietojoties, bet, kad magnēts tika noņemts no trahejas, daļiņu virkņu gali kļuva redzami (skatiet papildu video S8:MP5, sākot no 0:08). Tas atbilst MP uzvedībai, ko novērojām stikla kapilārā pielietotā magnētiskā lauka ietekmē.
Attēlu piemēri, kuros redzams MP5 dzīvas anestēzijas skartas žurkas trahejā. (a) Magnēts tiek izmantots attēlu iegūšanai virs un pa kreisi no trahejas, pēc tam (b) pēc tam, kad magnēts ir pārvietots pa labi. Sarkanajā lodziņā ir redzams kontrastu uzlabojošs palielinājums. Šie attēli ir no video, kas redzams papildu video S7:MP5.
Kad divi poli bija konfigurēti ziemeļu-dienvidu orientācijā virs un zem trahejas (t. i., pievilkšanas virzienā; 3. att.), MP hordas parādījās garākas un atradās uz trahejas sānu sienas, nevis uz trahejas dorsālās virsmas (skatiet papildu video S9:MP5). Tomēr, izmantojot divu magnētu ierīci, pēc šķidruma piegādes netika konstatētas augstas daļiņu koncentrācijas vienā vietā (t. i., trahejas dorsālajā virsmā), kas parasti notiek, ja tiek izmantota viena magnēta ierīce. Pēc tam, kad viens magnēts tika konfigurēts tā, lai atgrūstu apgrieztus polus (3. att.), redzes laukā redzamo daļiņu skaits pēc piegādes nepalielinājās. Abu divu magnētu konfigurāciju iestatīšana ir sarežģīta, jo magnēti attiecīgi velk vai stumj lielos magnētiskā lauka stiprumus. Pēc tam iestatīšana tika mainīta uz vienu magnētu, kas ir paralēls elpceļam, bet iet caur elpceļu 90 grādu leņķī, lai lauka līnijas šķērsotu trahejas sienu ortogonāli (3. att.), orientācija, kas paredzēta, lai noteiktu, vai var novērot daļiņu agregāciju uz sānu sienas. Tomēr šajā konfigurācijā tur... nebija identificējamas MP uzkrāšanās kustības vai magnēta kustības. Pamatojoties uz visiem šiem rezultātiem, in vivo gēnu nesēju pētījumiem tika izvēlēta viena magnēta, 30 grādu orientācijas konfigurācija (3.a attēls).
Kad dzīvnieks tika atkārtoti attēlots tūlīt pēc humānas nonāvēšanas, traucējošas audu kustības neesamība nozīmēja, ka skaidrā starphondrālajā laukā varēja saskatīt smalkākas un īsākas daļiņu līnijas, kas “šūpojās” atbilstoši magnēta translācijas kustībai. Tomēr joprojām nevar skaidri saskatīt MP6 daļiņu klātbūtni un kustību.
LV-LacZ titrs bija 1,8 × 108 TU/ml, un pēc 1:1 sajaukšanas ar CombiMag MP (MP6) dzīvnieki saņēma 50 μl trahejas devu 9 × 107 TU/ml LV nesējvielas (t. i., 4,5 × 106 TU/žurka). Šajos pētījumos magnēta transdukcija dzemdību laikā netika veikta, bet gan tika fiksēta vienā pozīcijā, lai noteiktu, vai kreisā kambara transdukciju (a) varētu uzlabot, salīdzinot ar vektora piegādi bez magnētiskā lauka, un (b) to varētu fokusēt. Elpceļu šūnas tiek transducētas uz augšējo elpceļu magnētiskajiem mērķa reģioniem.
Magnētu klātbūtne un CombiMag lietošana kombinācijā ar LV vektoriem, šķiet, neietekmēja dzīvnieku veselību negatīvi, tāpat kā mūsu standarta LV vektoru piegādes protokols. Trahejas reģiona frontālie attēli, kas pakļauti mehāniskai perturbācijai (1. papildattēls), liecināja, ka dzīvnieku grupā, kas tika ārstēta ar LV-MP, bija ievērojami augstāks transdukcijas līmenis, kad magnēts bija klāt (9.a att.). Kontroles grupā bija tikai neliels daudzums zilā LacZ krāsojuma (9.b att.). Normalizēto X-Gal krāsoto laukumu kvantitatīvā noteikšana parādīja, ka LV-MP ievadīšana magnētiskā lauka klātbūtnē radīja aptuveni 6 reizes lielāku uzlabojumu (9.c att.).
Salikto attēlu piemēri, kuros parādīta trahejas transdukcija ar LV-MP (a) magnētiskā lauka klātbūtnē un (b) bez magnēta. (c) Statistiski nozīmīgs normalizētās LacZ transdukcijas zonas uzlabojums trahejā, izmantojot magnētu (*p = 0,029, t-tests, n = 3 katrā grupā, vidējais ± SEM).
Neitrālas, ātri sarkanas krāsas sekcijas (piemērs parādīts 2. attēlā) parādīja LacZ krāsotas šūnas līdzīgā veidā un vietā, kā ziņots iepriekš.
Galvenais elpceļu gēnu terapijas izaicinājums joprojām ir precīza nesējdaļiņu lokalizācija interesējošajos reģionos un augsta transdukcijas efektivitātes līmeņa sasniegšana kustīgās plaušās gaisa plūsmas un aktīvas gļotu attīrīšanas klātbūtnē. LV nesējiem, kas paredzēti CF elpceļu slimības ārstēšanai, nesējdaļiņu uzturēšanās laika palielināšana vadošajos elpceļos līdz šim ir bijis nesasniedzams mērķis. Kā norādīja Castellani et al., magnētisko lauku izmantošanai transdukcijas uzlabošanai ir priekšrocības salīdzinājumā ar citām gēnu piegādes metodēm, piemēram, elektroporāciju, jo tā var apvienot vienkāršību, rentabilitāti, piegādes lokalizāciju, paaugstinātu efektivitāti un īsāku inkubācijas laiku, kā arī, iespējams, mazāku nesējdevu10. Tomēr magnētisko daļiņu nogulsnēšanās un uzvedība elpceļos ārēju magnētisko spēku ietekmē in vivo nekad nav aprakstīta, un faktiski nav pierādīta šīs metodes iespējamība in vivo, lai uzlabotu gēnu ekspresijas līmeni neskartos dzīvos elpceļos.
Mūsu in vitro sinhrotrona PCXI eksperimenti parādīja, ka visas mūsu testētās daļiņas, izņemot polistirola MP, bija redzamas mūsu izmantotajā attēlveidošanas iestatījumā. Magnētiskā lauka klātbūtnē MP veido stīgas, kuru garums ir saistīts ar daļiņu tipu un magnētiskā lauka stiprumu (t. i., magnēta tuvumu un kustību). Kā parādīts 10. attēlā, mūsu novērotās stīgas veidojas, katrai atsevišķai daļiņai magnetizējoties un inducējot savu lokālo magnētisko lauku. Šie atsevišķie lauki izraisa citu līdzīgu daļiņu agregāciju un savienošanos, veicot grupas stīgām līdzīgas kustības lokālu spēku ietekmē, ko rada citu daļiņu lokālie pievilkšanās un atgrūšanās spēki.
Shēmā parādītas (a, b) daļiņu virknes, kas ģenerētas ar šķidrumu pildītos kapilāros, un (c, d) ar gaisu pildīta traheja. Ņemiet vērā, ka kapilāri un traheja nav attēloti mērogā. (a) panelī ir arī MP apraksts, kurā ir virknēs sakārtotas Fe3O4 daļiņas.
Kad magnēts tika pārvietots virs kapilāra, daļiņu virknes leņķis sasniedza kritisko slieksni MP3-5, kas satur Fe3O4, pēc kura daļiņu virkne vairs nepalika sākotnējā pozīcijā, bet gan pārvietojās pa virsmu uz jaunu pozīciju.magnēts.Šis efekts, visticamāk, rodas tāpēc, ka stikla kapilāra virsma ir pietiekami gluda, lai šī kustība varētu notikt.Interesanti, ka MP6 (CombiMag) neuzvedās šādi, iespējams, tāpēc, ka daļiņas bija mazākas, tām bija atšķirīgi pārklājumi vai virsmas lādiņi, vai arī patentēts nesējšķidrums ietekmēja to spēju pārvietoties.Arī CombiMag daļiņu attēla kontrasts ir vājāks, kas liecina, ka šķidrumam un daļiņām var būt līdzīgs blīvums un tāpēc tās nevar viegli pārvietoties viena pret otru.Daļiņas var arī iesprūst, ja magnēts pārvietojas pārāk ātri, kas norāda, ka magnētiskā lauka stiprums ne vienmēr var pārvarēt berzi starp daļiņām šķidrumā, kas liek domāt, ka, iespējams, nav pārsteidzoši, ka magnētiskā lauka stiprums un attālums starp magnētu un mērķa zonu ir ļoti svarīgi.Kopumā šie rezultāti arī liecina, ka, lai gan magnēti var uztvert daudzus MP, kas plūst caur mērķa zonu, maz ticams, ka magnētiem var paļauties, ka CombiMag daļiņas pārvietojas pa trahejas virsmu. Tādēļ mēs secinām, ka in vivo LV-MP pētījumos jāizmanto statiskie magnētiskie lauki, lai fiziski iedarbotos uz noteiktiem elpceļu koka reģioniem.
Kad daļiņas tiek piegādātas ķermenī, tās ir grūti identificēt sarežģītu kustīgu ķermeņa audu kontekstā, taču spēja tās noteikt tika uzlabota, pārvietojot magnētu horizontāli virs trahejas, lai "kustinātu" MP stīgas. Lai gan tiešraides attēlveidošana ir iespējama, daļiņu kustību ir vieglāk noteikt pēc tam, kad dzīvnieks ir humāni nogalināts. MP koncentrācija šajā vietā parasti bija visaugstākā, kad magnēts tika novietots virs attēlveidošanas zonas, lai gan dažas daļiņas parasti tika atrastas tālāk gar traheju. Atšķirībā no in vitro pētījumiem, daļiņas nevar tikt vilktas pa traheju, pārvietojot magnētu. Šis atklājums atbilst tam, kā gļotas, kas pārklāj trahejas virsmu, parasti apstrādā ieelpotās daļiņas, aizturot tās gļotās un pēc tam izvadot tās ar mukociliāro klīrensa mehānismu.
Mēs izvirzījām hipotēzi, ka magnētu izmantošana pievilkšanai virs un zem trahejas (3.b att.) varētu radīt vienmērīgāku magnētisko lauku, nevis magnētisko lauku, kas ir ļoti koncentrēts vienā punktā, potenciāli novedot pie vienmērīgāka daļiņu sadalījuma. Tomēr mūsu sākotnējā pētījumā netika atrasti skaidri pierādījumi, kas apstiprinātu šo hipotēzi. Tāpat, konfigurējot magnētu pāri atgrūšanai (3.c att.), netika panākta lielāka daļiņu nogulsnēšanās attēlotajā zonā. Šie divi atklājumi liecina, ka divu magnētu iestatīšana būtiski neuzlabo MP mērķēšanas lokālo kontroli un ka iegūtos spēcīgos magnētiskos spēkus ir grūti konfigurēt, padarot šo pieeju mazāk praktisku. Līdzīgi, magnēta orientēšana virs un caur traheju (3.d att.) arī nepalielināja attēlotajā zonā aizturēto daļiņu skaitu. Dažas no šīm alternatīvajām konfigurācijām var nebūt veiksmīgas, jo tās rada zemāku magnētiskā lauka stiprumu nogulsnēšanās zonā. Tāpēc viena 30 grādu leņķa magnēta konfigurācija (3.a att.) tiek uzskatīta par vienkāršāko un efektīvāko metodi in vivo testēšanai.
LV-MP pētījums parādīja, ka, kombinējot LV vektorus ar CombiMag un piegādājot tos pēc fiziskas perturbācijas magnētiskā lauka klātbūtnē, transdukcijas līmenis trahejā bija ievērojami lielāks, salīdzinot ar kontroles grupu. Pamatojoties uz sinhrotrona attēlveidošanas pētījumiem un LacZ rezultātiem, magnētiskais lauks acīmredzot spēja saglabāt LV trahejā un samazināt vektoru daļiņu skaitu, kas nekavējoties iekļuva dziļi plaušās. Šādi mērķēšanas uzlabojumi var palielināt efektivitāti, vienlaikus samazinot piegādāto titru skaitu, transdukciju ārpus mērķa, iekaisuma un imūnsistēmas blakusparādības, kā arī gēnu nesēju izmaksas. Svarīgi ir tas, ka, pēc ražotāja teiktā, CombiMag var lietot kopā ar citām gēnu pārneses metodēm, tostarp ar citiem vīrusu vektoriem (piemēram, AAV) un nukleīnskābēm.