Nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS-এর সীমিত সমর্থন রয়েছে। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি হালনাগাদ ব্রাউজার ব্যবহার করার (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড বন্ধ করার) পরামর্শ দিচ্ছি। আপাতত, নিরবচ্ছিন্ন সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি প্রদর্শন করব।
সিস্টিক ফাইব্রোসিস ফুসফুসের রোগের চিকিৎসার জন্য জিন ভেক্টরগুলোকে অবশ্যই পরিবাহী শ্বাসনালীকে লক্ষ্য করে পাঠানো উচিত, কারণ ফুসফুসের প্রান্তীয় অংশে জিন সঞ্চালন কোনো চিকিৎসাগত সুবিধা প্রদান করে না। ভাইরাল ট্রান্সডাকশনের কার্যকারিতা ভেক্টরের অবস্থানকালের সাথে সরাসরি সম্পর্কিত। তবে, জিন বাহকের মতো ডেলিভারি ফ্লুইডগুলো শ্বাসগ্রহণের সময় স্বাভাবিকভাবেই অ্যালভিওলিতে ছড়িয়ে পড়ে এবং যেকোনো ধরনের থেরাপিউটিক কণা মিউকোসিলিয়ারি ট্রান্সপোর্টের মাধ্যমে দ্রুত অপসারিত হয়। শ্বাসনালীতে জিন বাহকের অবস্থানকাল দীর্ঘায়িত করা গুরুত্বপূর্ণ, কিন্তু তা অর্জন করা কঠিন। জিন বাহক-সংযুক্ত চৌম্বকীয় কণা, যা শ্বাসনালীর পৃষ্ঠে পরিচালিত হতে পারে, তা আঞ্চলিক লক্ষ্য নির্ধারণ উন্নত করতে পারে। ইন ভিভো ভিজ্যুয়ালাইজেশনের চ্যালেঞ্জের কারণে, প্রয়োগকৃত চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে শ্বাসনালীর পৃষ্ঠে এই ধরনের ছোট চৌম্বকীয় কণার আচরণ সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়। এই গবেষণার উদ্দেশ্য ছিল সিনক্রোট্রন ইমেজিং ব্যবহার করে চেতনানাশক প্রয়োগ করা ইঁদুরের শ্বাসনালীতে এক সারি চৌম্বকীয় কণার ইন ভিভো গতিবিধি পর্যবেক্ষণ করা, যাতে ইন ভিভোতে একক এবং সমষ্টিগত কণার আচরণের গতিবিদ্যা ও ধরণ পরীক্ষা করা যায়। এরপর আমরা আরও মূল্যায়ন করেছি যে, চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে লেন্টিভাইরাল চৌম্বকীয় কণার ডেলিভারি কার্যকারিতা বৃদ্ধি করবে কিনা। ইঁদুরের শ্বাসনালীতে ট্রান্সডাকশন দক্ষতা। সিনক্রোট্রন এক্স-রে ইমেজিং ইন ভিট্রো এবং ইন ভিভোতে স্থির ও চলমান চৌম্বক ক্ষেত্রে চৌম্বক কণার আচরণ প্রকাশ করে। চুম্বকের সাহায্যে কণাগুলোকে জীবন্ত শ্বাসনালীর পৃষ্ঠ বরাবর সহজে টেনে নিয়ে যাওয়া যায় না, কিন্তু পরিবহনের সময়, জমা হওয়া কণাগুলো সেই দৃশ্যমান ক্ষেত্রে কেন্দ্রীভূত হয় যেখানে চৌম্বক ক্ষেত্র সবচেয়ে শক্তিশালী। চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে লেন্টিভাইরাল চৌম্বক কণা সরবরাহ করা হলে ট্রান্সডাকশন দক্ষতাও ছয়গুণ বৃদ্ধি পেয়েছিল। সম্মিলিতভাবে, এই ফলাফলগুলো ইঙ্গিত দেয় যে লেন্টিভাইরাল চৌম্বক কণা এবং চৌম্বক ক্ষেত্র ইন ভিভোতে পরিবাহী শ্বাসনালীতে জিন ভেক্টর টার্গেটিং উন্নত করতে এবং ট্রান্সডাকশনের মাত্রা বাড়ানোর জন্য মূল্যবান পদ্ধতি হতে পারে।
সিস্টিক ফাইব্রোসিস (CF) রোগটি সিএফ ট্রান্সমেমব্রেন কন্ডাকট্যান্স রেগুলেটর (CFTR) নামক একটি জিনের ভিন্নতার কারণে হয়ে থাকে। CFTR প্রোটিন হলো একটি আয়ন চ্যানেল যা সারা শরীরের অনেক এপিথেলিয়াল কোষে উপস্থিত থাকে, যার মধ্যে রয়েছে পরিবাহী শ্বাসনালী, যা CF রোগের উৎপত্তির একটি প্রধান স্থান। CFTR-এর ত্রুটির ফলে পানি পরিবহনে অস্বাভাবিকতা দেখা দেয়, যা শ্বাসনালীর পৃষ্ঠকে পানিশূন্য করে তোলে এবং শ্বাসনালীর পৃষ্ঠের তরল (ASL) স্তরের গভীরতা কমিয়ে দেয়। এটি শ্বাসনালী থেকে শ্বাস-প্রশ্বাসের মাধ্যমে প্রবেশ করা কণা এবং রোগজীবাণু পরিষ্কার করার জন্য মিউকোসিলিয়ারি ট্রান্সপোর্ট (MCT) সিস্টেমের ক্ষমতাকেও ব্যাহত করে। আমাদের লক্ষ্য হলো CFTR জিনের সঠিক অনুলিপি সরবরাহ করার জন্য একটি লেন্টিভাইরাল (LV) জিন থেরাপি তৈরি করা, যা ASL, MCT এবং ফুসফুসের স্বাস্থ্যের উন্নতি ঘটাবে এবং ইন ভিভো (জীবন্ত প্রাণীর দেহে) এই প্যারামিটারগুলো পরিমাপ করতে সক্ষম নতুন প্রযুক্তি উদ্ভাবন চালিয়ে যাওয়া।
এলভি ভেক্টরগুলি সিএফ শ্বাসনালীর জিন থেরাপির জন্য অন্যতম প্রধান প্রার্থী, মূলত কারণ তারা থেরাপিউটিক জিনকে শ্বাসনালীর বেসাল কোষে (শ্বাসনালীর স্টেম সেল) স্থায়ীভাবে একীভূত করতে পারে। এটি গুরুত্বপূর্ণ কারণ তারা কার্যকরী জিন-সংশোধিত সিএফ-সম্পর্কিত শ্বাসনালীর পৃষ্ঠ কোষে রূপান্তরিত হয়ে স্বাভাবিক হাইড্রেশন এবং শ্লেষ্মা নিষ্কাশন পুনরুদ্ধার করতে পারে, যার ফলে আজীবন সুবিধা পাওয়া যায়। এলভি ভেক্টরগুলিকে পরিবাহী শ্বাসনালীর দিকে পরিচালিত করা উচিত, কারণ এখানেই সিএফ ফুসফুসের রোগ শুরু হয়। ফুসফুসের গভীরে ভেক্টর পৌঁছে দিলে অ্যালভিওলার ট্রান্সডাকশন হতে পারে, কিন্তু সিএফ-এর ক্ষেত্রে এর কোনো থেরাপিউটিক সুবিধা নেই। যাইহোক, জিন বাহকের মতো তরল পদার্থগুলি পৌঁছে দেওয়ার পরে শ্বাসগ্রহণের সময় স্বাভাবিকভাবেই অ্যালভিওলিতে চলে যায়³,⁴ এবং থেরাপিউটিক কণাগুলি এমসিটি দ্বারা দ্রুত মুখগহ্বরে নিষ্কাশিত হয়। এলভি ট্রান্সডাকশনের কার্যকারিতা সরাসরি লক্ষ্য কোষের পাশে ভেক্টরের অবস্থানের সময়কালের সাথে সম্পর্কিত, যা কোষীয় শোষণের সুযোগ দেয় – এই সময়কালকে "রেসিডেন্স টাইম" বলা হয় – যা সাধারণ আঞ্চলিক বায়ুপ্রবাহ এবং সমন্বিত কণা শ্লেষ্মা শোষণ ও এমসিটি দ্বারা সহজেই হ্রাস পায়। সিএফ-এর জন্য, শ্বাসনালীর মধ্যে এলভি-র অবস্থানকাল দীর্ঘায়িত করার ক্ষমতা গুরুত্বপূর্ণ। এই অঞ্চলে উচ্চ মাত্রার সংকেত সংকেত অর্জন করা সম্ভব, কিন্তু এখন পর্যন্ত তা বেশ কঠিন।
এই বাধা অতিক্রম করার জন্য, আমরা পরামর্শ দিচ্ছি যে এলভি ম্যাগনেটিক পার্টিকেল (এমপি) দুটি পরিপূরক উপায়ে সাহায্য করতে পারে। প্রথমত, টার্গেটিং উন্নত করতে এবং জিন বাহক কণাগুলোকে কাঙ্ক্ষিত শ্বাসনালী অঞ্চলে অবস্থান করতে সাহায্য করার জন্য এগুলোকে চৌম্বকীয়ভাবে শ্বাসনালীর পৃষ্ঠে পরিচালিত করা যেতে পারে; এবং কোষ স্তরে স্থানান্তরিত হতে সাহায্য করতে পারে। এমপি-গুলোকে টার্গেটেড ড্রাগ ডেলিভারি ভেহিকেল হিসেবে ব্যাপকভাবে ব্যবহার করা হয়েছে, যখন এগুলো অ্যান্টিবডি, কেমোথেরাপিউটিক ড্রাগ বা অন্যান্য ছোট অণুর সাথে আবদ্ধ হয়, যেগুলো কোষ ঝিল্লিতে সংযুক্ত থাকে অথবা প্রাসঙ্গিক কোষ পৃষ্ঠের রিসেপ্টরগুলোর সাথে যুক্ত হয় এবং স্থির বিদ্যুতের উপস্থিতিতে টিউমারের স্থানে জমা হয়। ক্যান্সার চিকিৎসায় চৌম্বক ক্ষেত্র ৭. অন্যান্য “হাইপারথার্মাল” কৌশলগুলোর লক্ষ্য হলো স্পন্দিত চৌম্বক ক্ষেত্রের সংস্পর্শে এনে মাইক্রোপার্টিকল (এমপি) উত্তপ্ত করা, যার ফলে টিউমার কোষ ধ্বংস হয়। ম্যাগনেটিক ট্রান্সফেকশনের মূলনীতি, যেখানে কোষে ডিএনএ স্থানান্তর বাড়ানোর জন্য একটি চৌম্বক ক্ষেত্রকে ট্রান্সফেকশন এজেন্ট হিসেবে ব্যবহার করা হয়, তা সাধারণত ইন ভিট্রোতে কঠিন-ট্রান্সডিউসযোগ্য সেল লাইনের জন্য বিভিন্ন নন-ভাইরাল এবং ভাইরাল জিন ভেক্টর ব্যবহার করে প্রয়োগ করা হয়। এলভি ম্যাগনেটোট্রান্সফেকশনের কার্যকারিতা প্রতিষ্ঠিত হয়েছে, যেখানে একটি স্থির চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে একটি মানব ব্রঙ্কিয়াল এপিথেলিয়াল সেল লাইনে ইন ভিট্রোতে এলভি-এমপি সরবরাহ করা হলে, শুধুমাত্র এলভি ভেক্টরের তুলনায় ট্রান্সডাকশন দক্ষতা ১৮৬ গুণ বৃদ্ধি পায়। এলভি-এমপি একটি ইন ভিট্রো সিএফ মডেলেও প্রয়োগ করা হয়েছে, যেখানে ম্যাগনেটিক ট্রান্সফেকশন সিএফ স্পুটামের উপস্থিতিতে এয়ার-লিকুইড ইন্টারফেস কালচারে এলভি ট্রান্সডাকশন ২০ গুণ বৃদ্ধি করেছে¹⁰। তবে, অঙ্গপ্রত্যঙ্গের ইন ভিভো ম্যাগনেটোট্রান্সফেকশন তুলনামূলকভাবে কম মনোযোগ পেয়েছে এবং শুধুমাত্র কয়েকটি প্রাণীর উপর এর মূল্যায়ন করা হয়েছে। গবেষণা¹¹,¹²,¹³,¹⁴,¹⁵, বিশেষ করে ফুসফুসে¹⁶,¹⁷। তা সত্ত্বেও, সিএফ ফুসফুস চিকিৎসায় ম্যাগনেটিক ট্রান্সফেকশনের সুযোগ স্পষ্ট। ট্যান এট আল. (২০২০) বলেছেন যে, “কার্যকরী ম্যাগনেটিক ন্যানোপার্টিকেল ফুসফুসীয় সরবরাহের একটি প্রুফ-অফ-কনসেপ্ট গবেষণা সিএফ রোগীদের ক্লিনিকাল ফলাফল উন্নত করার জন্য ভবিষ্যতের সিএফটিআর ইনহেলেশন কৌশলগুলির পথ প্রশস্ত করবে”⁶।
প্রয়োগকৃত চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে শ্বাসনালীর পৃষ্ঠে ক্ষুদ্র চৌম্বক কণার আচরণ দেখা ও অধ্যয়ন করা কঠিন, এবং তাই এটি সম্পর্কে ভালোভাবে বোঝা যায় না। অন্যান্য গবেষণায়, আমরা ASL গভীরতা¹⁸ এবং MCT আচরণের¹⁹,²⁰ সূক্ষ্ম ইন ভিভো পরিবর্তনগুলিকে নন-ইনভেসিভভাবে দেখার ও পরিমাণ নির্ধারণ করার জন্য একটি সিনক্রোট্রন-প্রোপাগেশন-ভিত্তিক ফেজ-কন্ট্রাস্ট এক্স-রে ইমেজিং (PB-PCXI) পদ্ধতি তৈরি করেছি, যা সরাসরি গ্যাস ক্যানাল পৃষ্ঠের হাইড্রেশন পরিমাপ করে এবং চিকিৎসার কার্যকারিতার প্রাথমিক সূচক হিসাবে ব্যবহৃত হয়। এছাড়াও, আমাদের MCT মূল্যায়ন পদ্ধতিতে অ্যালুমিনা বা উচ্চ প্রতিসরাঙ্কের কাচ দিয়ে তৈরি ১০-৩৫ µm ব্যাসের কণা MCT মার্কার হিসাবে ব্যবহৃত হয়, যা PB-PCXI²¹ ব্যবহার করে দেখা যায়। উভয় কৌশলই MP সহ বিভিন্ন ধরণের কণা দেখার জন্য উপযুক্ত।
এর উচ্চ স্থানিক এবং কালিক রেজোলিউশনের কারণে, আমাদের PB-PCXI-ভিত্তিক ASL এবং MCT বিশ্লেষণ কৌশলগুলি ইন ভিভোতে একক এবং সমষ্টিগত কণার আচরণের গতিবিদ্যা এবং ধরণ পরীক্ষা করার জন্য বিশেষভাবে উপযুক্ত, যা আমাদের MP জিন ডেলিভারি কৌশলগুলি বুঝতে এবং অপ্টিমাইজ করতে সহায়তা করে। আমরা এখানে যে পদ্ধতিটি ব্যবহার করছি তা SPring-8 BL20B2 বিমলাইন ব্যবহার করে আমাদের গবেষণা থেকে উদ্ভূত, যেখানে আমরা ইঁদুরের নাসিকা এবং ফুসফুসের শ্বাসনালীতে শ্যাম ভেক্টর ডোজ ডেলিভারির পরে তরল চলাচল পর্যবেক্ষণ করেছি, যা আমাদের জিন ক্যারিয়ার ডোজ প্রাণী গবেষণায় 3,4 পরিলক্ষিত অসম জিন এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন ব্যাখ্যা করতে সাহায্য করে।
এই গবেষণার উদ্দেশ্য ছিল সিনক্রোট্রন পিবি-পিসিএক্সআই ব্যবহার করে জীবিত ইঁদুরের শ্বাসনালীতে একাধিক মাইক্রোপার্টিকলের (এমপি) ইন ভিভো গতিবিধি পর্যবেক্ষণ করা। এই পিবি-পিসিএক্সআই ইমেজিং গবেষণাগুলো বিভিন্ন ধরনের এমপি, চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তি এবং অবস্থানের প্রভাব পরীক্ষা করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল। আমরা অনুমান করেছিলাম যে, বাইরে থেকে প্রয়োগ করা একটি চৌম্বক ক্ষেত্র সরবরাহকৃত এমপি-কে লক্ষ্যস্থলে থাকতে বা সেখানে যেতে সাহায্য করবে। এই গবেষণাগুলো আমাদের এমন চুম্বক বিন্যাস শনাক্ত করতেও সাহায্য করেছিল যা জমা হওয়ার পর শ্বাসনালীতে ধরে রাখা কণার সংখ্যা সর্বাধিক করে তোলে। দ্বিতীয় একটি ধারাবাহিক গবেষণায়, আমরা এই সর্বোত্তম বিন্যাসটি ব্যবহার করে ইঁদুরের শ্বাসনালীতে এলভি-এমপি-র ইন ভিভো সরবরাহের ফলে সৃষ্ট ট্রান্সডাকশন প্যাটার্ন প্রদর্শন করতে চেয়েছিলাম। এর ভিত্তি ছিল এই অনুমান যে, শ্বাসনালীকে লক্ষ্য করে এলভি-এমপি সরবরাহ করলে এলভি ট্রান্সডাকশন দক্ষতা উন্নত হবে।
অ্যাডিলেড বিশ্ববিদ্যালয় (M-2019-060 এবং M-2020-022) এবং SPring-8 সিনক্রোট্রন অ্যানিমেল এথিক্স কমিটি কর্তৃক অনুমোদিত প্রোটোকল অনুসারে সমস্ত প্রাণী গবেষণা পরিচালিত হয়েছিল। ARRIVE নির্দেশিকা অনুসারে পরীক্ষাগুলি সম্পন্ন করা হয়েছিল।
সমস্ত এক্স-রে ইমেজিং জাপানের স্প্রিং-৮ সিনক্রোট্রনের BL20XU বিমলাইনে করা হয়েছিল, যা পূর্বে বর্ণিত²¹,²²-এর অনুরূপ একটি সেটআপ ব্যবহার করে করা হয়। সংক্ষেপে, পরীক্ষামূলক বাক্সটি সিনক্রোট্রন স্টোরেজ রিং থেকে ২৪৫ মিটার দূরে অবস্থিত ছিল। কণা ইমেজিং গবেষণার জন্য নমুনা থেকে ডিটেক্টরের দূরত্ব ০.৬ মিটার এবং ফেজ কনট্রাস্ট প্রভাব তৈরি করার জন্য ইন ভিভো ইমেজিং গবেষণার জন্য ০.৩ মিটার ব্যবহার করা হয়। ২৫ keV-এর একটি মনোক্রোম্যাটিক বিম শক্তি ব্যবহার করা হয়েছিল। একটি sCMOS ডিটেক্টরের সাথে সংযুক্ত একটি উচ্চ-রেজোলিউশন এক্স-রে কনভার্টার (SPring-8 BM3) ব্যবহার করে ছবিগুলো তোলা হয়েছিল। কনভার্টারটি একটি ১০ µm পুরু সিন্টিলেটর (Gd₃Al₂Ga₃O₁₂) ব্যবহার করে এক্স-রে-কে দৃশ্যমান আলোতে রূপান্তরিত করে, যা পরবর্তীতে একটি ×১০ মাইক্রোস্কোপ অবজেক্টিভ (NA ০.৩) ব্যবহার করে একটি sCMOS সেন্সরে পাঠানো হয়। sCMOS ডিটেক্টরটি ছিল Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan)। ২০৪৮ × ২০৪৮ পিক্সেলের একটি অ্যারে সাইজ এবং ৬.৫ × ৬.৫ µm-এর একটি র পিক্সেল সাইজ সহ। এই সেটআপটি ০.৫১ µm-এর একটি কার্যকর আইসোট্রপিক পিক্সেল সাইজ এবং প্রায় ১.১ মিমি × ১.১ মিমি-এর একটি ফিল্ড অফ ভিউ প্রদান করে। শ্বাসনালীর ভিতরে এবং বাইরে চৌম্বক কণার সিগন্যাল-টু-নয়েজ অনুপাত সর্বাধিক করার জন্য এবং শ্বাস-প্রশ্বাসজনিত মোশন আর্টিফ্যাক্ট সর্বনিম্ন করার জন্য ১০০ মিলিসেকেন্ডের একটি এক্সপোজার দৈর্ঘ্য নির্বাচন করা হয়েছিল। ইন ভিভো গবেষণার জন্য, এক্সপোজারের মধ্যে এক্স-রে রশ্মিকে ব্লক করে বিকিরণের মাত্রা সীমিত করার জন্য এক্স-রে পথে একটি দ্রুত এক্স-রে শাটার স্থাপন করা হয়েছিল।
কোনো SPring-8 PB-PCXI ইমেজিং স্টাডিতে LV ক্যারিয়ারটি ব্যবহার করা হয়নি, কারণ BL20XU ইমেজিং চেম্বারটি বায়োসেফটি লেভেল ২ সনদপ্রাপ্ত নয়। এর পরিবর্তে, আমরা দুটি বাণিজ্যিক সরবরাহকারীর কাছ থেকে বিভিন্ন আকার, উপাদান, লোহার ঘনত্ব এবং প্রয়োগের সু-বৈশিষ্ট্যপূর্ণ মাইক্রোপ্লাস্টিক (MP) নির্বাচন করেছি—প্রথমে কাচের কৈশিকনালীর মধ্যে এবং তারপর জীবন্ত শ্বাসনালীতে চৌম্বক ক্ষেত্র কীভাবে মাইক্রোপ্লাস্টিকের গতিকে প্রভাবিত করে তা বোঝার জন্য। পৃষ্ঠতলে। এমপি-গুলির আকার ০.২৫ থেকে ১৮ μm পর্যন্ত হয় এবং এগুলি বিভিন্ন উপকরণ দিয়ে তৈরি (সারণী ১ দেখুন), কিন্তু প্রতিটি নমুনার গঠন, যার মধ্যে এমপি-র ভেতরের চৌম্বক কণার আকারও অন্তর্ভুক্ত, তা অজানা। আমাদের বিস্তৃত এমসিটি গবেষণা ১৯, ২০, ২১, ২৩, ২৪-এর উপর ভিত্তি করে, আমরা আশা করি যে শ্বাসনালীর বায়ুপথের পৃষ্ঠে ৫ μm-এর মতো ছোট এমপি-ও দেখা যেতে পারে, উদাহরণস্বরূপ, এমপি-র গতি আরও ভালোভাবে দেখার জন্য পরপর ফ্রেম বিয়োগ করে। একটি একক ০.২৫ μm আকারের এমপি ইমেজিং ডিভাইসের রেজোলিউশনের চেয়ে ছোট, কিন্তু আশা করা যায় যে পিবি-পিসিএক্সআই তাদের আয়তন বৈসাদৃশ্য এবং জমা হওয়ার পরে যে পৃষ্ঠ তরলের উপর তারা জমা হয় তার গতি শনাক্ত করতে পারবে।
সারণি ১-এ উল্লিখিত প্রতিটি এমপি-র জন্য নমুনা ০.৬৩ মিমি অভ্যন্তরীণ ব্যাসযুক্ত ২০ μl কাচের কৈশিক নলে (ড্রামন্ড মাইক্রোক্যাপস, পিএ, ইউএসএ) প্রস্তুত করা হয়েছিল। কর্পাসকুলার কণাগুলো জলে পাওয়া যায়, অন্যদিকে কম্বিম্যাগ কণাগুলো প্রস্তুতকারকের নিজস্ব তরলে পাওয়া যায়। প্রতিটি নল তরল দিয়ে অর্ধেক (প্রায় ১১ μl) পূর্ণ করে নমুনা ধারকের উপর রাখা হয় (চিত্র ১ দেখুন)। কাচের কৈশিক নলগুলো ইমেজিং বাক্সের নমুনা স্টেজের উপর যথাক্রমে অনুভূমিকভাবে রাখা হয়েছিল এবং তরলের প্রান্তগুলো স্থাপন করা হয়েছিল। ইমেজিংয়ের সময় দূর থেকে এর অবস্থান পরিবর্তন করার জন্য, ১.১৭ টেসলা অবশিষ্ট চৌম্বকায়নসহ একটি ১৯ মিমি ব্যাসের (২৮ মিমি লম্বা) নিকেল শেলযুক্ত বিরল মৃত্তিকা নিওডাইমিয়াম আয়রন বোরন (NdFeB) চুম্বক (N35, ক্যাট. নং LM1652, জেকার ইলেকট্রনিক্স, অস্ট্রেলিয়া) একটি পৃথক ট্রান্সলেশন স্টেজের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল। চুম্বকটি নমুনার প্রায় ৩০ মিমি উপরে অবস্থান করলে এক্স-রে চিত্র ধারণ শুরু হয় এবং প্রতি ৪টি করে চিত্র ধারণ করা হয়। প্রতি সেকেন্ডে ফ্রেম। ইমেজিংয়ের সময়, ক্ষেত্র প্রাবল্য এবং অবস্থানের প্রভাব মূল্যায়ন করার জন্য চুম্বকটিকে কাচের কৈশিক নলের কাছে (প্রায় ১ মিমি দূরে) আনা হয়েছিল এবং তারপরে নল বরাবর সরানো হয়েছিল।
স্যাম্পল এক্সওয়াই ট্রান্সলেশন স্টেজের উপর কাচের কৈশিক নলে এমপি নমুনা সহ ইন ভিট্রো ইমেজিং সেটআপ। এক্স-রে রশ্মির পথটি একটি লাল ড্যাশযুক্ত রেখা দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে।
একবার এমপি-গুলির ইন ভিট্রো দৃশ্যমানতা প্রতিষ্ঠিত হয়ে গেলে, তাদের একটি উপসেটকে ওয়াইল্ড-টাইপ স্ত্রী অ্যালবিনো উইস্টার ইঁদুরের (~১২ সপ্তাহ বয়সী, ~২০০ গ্রাম) উপর ইন ভিভো পরীক্ষা করা হয়েছিল। ইঁদুরগুলিকে ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশনের মাধ্যমে ০.২৪ মিলিগ্রাম/কেজি মেডেটোমিডিন (ডমিটর®, জেনোয়াক, জাপান), ৩.২ মিলিগ্রাম/কেজি মিডাজোলাম (ডরমিকাম®, অ্যাস্টেলাস ফার্মা, জাপান) এবং ৪ মিলিগ্রাম/কেজি বিউটোরফেনল (ভেটরফেল®, মেইজি সেইকা ফার্মা), জাপান)-এর একটি মিশ্রণ দিয়ে অ্যানেস্থেটাইজ করা হয়েছিল। অ্যানেস্থেসিয়ার পরে, শ্বাসনালীর চারপাশের লোম সরিয়ে, একটি এন্ডোট্রাকিয়াল টিউব (ET; ১৬ গেজ আইভি ক্যানুলা, টেরুমো বিসিটি) প্রবেশ করিয়ে এবং শরীরের তাপমাত্রা বজায় রাখার জন্য একটি থার্মাল ব্যাগযুক্ত বিশেষভাবে তৈরি ইমেজিং প্লেটে চিৎ করে শুইয়ে তাদের ইমেজিংয়ের জন্য প্রস্তুত করা হয়েছিল। এরপর ইমেজিং প্লেটটিকে ইমেজিং বক্সের স্যাম্পল ট্রান্সলেশন স্টেজের সাথে সামান্য কোণে সংযুক্ত করা হয়েছিল যাতে শ্বাসনালীটি অনুভূমিকভাবে সারিবদ্ধ থাকে। এক্স-রে চিত্র, যেমনটি চিত্র ২ক-তে দেখানো হয়েছে।
(ক) SPring-8 ইমেজিং বক্সে ইন ভিভো ইমেজিং সেটআপ, এক্স-রে রশ্মির পথটি একটি লাল ড্যাশযুক্ত রেখা দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে। (খ, গ) দুটি লম্বভাবে স্থাপিত আইপি ক্যামেরা ব্যবহার করে দূর থেকে শ্বাসনালীতে চুম্বকের অবস্থান নির্ণয় করা হয়েছিল। স্ক্রিন চিত্রের বাম দিকে, মাথা ধরে রাখা তারের লুপটি এবং ইটি টিউবের মধ্যে যথাস্থানে থাকা ডেলিভারি ক্যানুলাটি দেখা যাচ্ছে।
একটি রিমোট-কন্ট্রোলড সিরিঞ্জ পাম্প সিস্টেম (UMP2, ওয়ার্ল্ড প্রিসিশন ইন্সট্রুমেন্টস, সারাসোটা, FL) ব্যবহার করে একটি ১০০ μl কাচের সিরিঞ্জকে একটি ৩০ গেজ সূঁচের মাধ্যমে PE10 টিউবিং (OD ০.৬১ মিমি, ID ০.২৮ মিমি)-এর সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল। ET টিউব ঢোকানোর সময় শ্বাসনালীতে এর অগ্রভাগটি সঠিক অবস্থানে আছে কিনা তা নিশ্চিত করার জন্য টিউবটিতে চিহ্ন দিন। মাইক্রোপাম্প ব্যবহার করে, সিরিঞ্জের প্লাঞ্জারটি বের করে আনা হয়েছিল এবং একই সাথে টিউবের অগ্রভাগটি সরবরাহযোগ্য MP নমুনায় ডুবিয়ে রাখা হয়েছিল। এরপর লোড করা ডেলিভারি টিউবটি এন্ডোট্রাকিয়াল টিউবের মধ্যে প্রবেশ করানো হয়েছিল, এবং এর অগ্রভাগটি আমাদের প্রত্যাশিত প্রয়োগকৃত চৌম্বক ক্ষেত্রের সবচেয়ে শক্তিশালী অংশের মধ্যে স্থাপন করা হয়েছিল। আমাদের আরডুইনো-ভিত্তিক টাইমিং বক্সের সাথে সংযুক্ত একটি রেসপিরেশন ডিটেক্টর ব্যবহার করে চিত্র ধারণ নিয়ন্ত্রণ করা হয়েছিল, এবং সমস্ত সংকেত (যেমন তাপমাত্রা, শ্বাস-প্রশ্বাস, শাটার খোলা/বন্ধ এবং চিত্র ধারণ) পাওয়ারল্যাব এবং ল্যাবচার্ট (AD ইন্সট্রুমেন্টস, সিডনি, অস্ট্রেলিয়া) ব্যবহার করে রেকর্ড করা হয়েছিল। যখন আবদ্ধ স্থানটি নাগালের বাইরে ছিল, তখন দুটি আইপি ক্যামেরা ব্যবহার করা হয়েছিল। (প্যানাসনিক বিবি-এসসি৩৮২) একে অপরের সাথে প্রায় ৯০° কোণে স্থাপন করা হয়েছিল এবং ইমেজিংয়ের সময় শ্বাসনালীর সাপেক্ষে চুম্বকের অবস্থান পর্যবেক্ষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল (চিত্র ২খ,গ)। গতিজনিত ত্রুটি (মোশন আর্টিফ্যাক্ট) কমানোর জন্য, শ্বাস-প্রশ্বাসের শেষ প্রান্তের প্রবাহের স্থিতাবস্থায় (এন্ড-টাইডাল ফ্লো প্লেটো) প্রতি শ্বাসে একটি করে ছবি তোলা হয়েছিল।
একটি চুম্বক একটি দ্বিতীয় পর্যায়ের সাথে সংযুক্ত থাকে, যা ইমেজিং হাউজিংয়ের বাইরে থেকে দূরবর্তী স্থানে স্থাপন করা যায়। চুম্বকের বিভিন্ন অবস্থান এবং বিন্যাস পরীক্ষা করা হয়েছিল, যার মধ্যে রয়েছে: শ্বাসনালীর উপরে প্রায় ৩০° কোণে স্থাপন করা (চিত্র ২ক এবং ৩ক-তে দেখানো বিন্যাস); একটি চুম্বক প্রাণীর উপরে এবং অন্যটি নিচে, যেখানে মেরুগুলো আকর্ষণ করার জন্য সেট করা থাকে (চিত্র ৩খ); একটি চুম্বক প্রাণীর উপরে এবং অন্যটি নিচে, যেখানে মেরুগুলো বিকর্ষণ করার জন্য সেট করা থাকে (চিত্র ৩গ); এবং একটি চুম্বক শ্বাসনালীর উপরে এবং এর সাথে লম্বভাবে স্থাপন করা (চিত্র ৩ঘ)। প্রাণী এবং চুম্বককে বিন্যস্ত করার পর এবং পরীক্ষাধীন এমপি-কে সিরিঞ্জ পাম্পে লোড করার পরে, ছবি তোলার সময় প্রতি সেকেন্ডে ৪ মাইক্রোলিটার হারে ৫০ মাইক্রোলিটার ডোজ সরবরাহ করা হয়। এরপর ছবি তোলা অব্যাহত রেখে চুম্বকটিকে শ্বাসনালী বরাবর সামনে-পিছনে অথবা আড়াআড়িভাবে সরানো হয়।
ইন ভিভো ইমেজিং-এর জন্য চুম্বকের বিন্যাস (ক) শ্বাসনালীর উপরে প্রায় ৩০° কোণে একটি একক চুম্বক, (খ) আকর্ষণ করার জন্য সেট করা দুটি চুম্বক, (গ) বিকর্ষণ করার জন্য সেট করা দুটি চুম্বক, (ঘ) শ্বাসনালীর উপরে এবং লম্বভাবে একটি একক চুম্বক। পর্যবেক্ষক মুখ থেকে শ্বাসনালীর মধ্য দিয়ে ফুসফুসের দিকে তাকিয়েছিলেন এবং এক্স-রে রশ্মিটি ইঁদুরের বাম পাশ দিয়ে গিয়ে ডান পাশ দিয়ে বেরিয়ে গিয়েছিল। চুম্বকটিকে হয় শ্বাসনালীর দৈর্ঘ্য বরাবর অথবা এক্স-রে রশ্মির দিকে শ্বাসনালীর উপরে বামে ও ডানে সরানো হয়।
আমরা শ্বাস-প্রশ্বাস এবং হৃদস্পন্দনের বিভ্রান্তিকর প্রভাব ছাড়া শ্বাসনালীতে কণার দৃশ্যমানতা এবং আচরণও নির্ধারণ করতে চেয়েছিলাম। এজন্য, ইমেজিং পর্বের শেষে, পেন্টোবার্বিটালের অতিরিক্ত মাত্রা (সোমনোপেন্টিল, পিটম্যান-মুর, ওয়াশিংটন ক্রসিং, ইউএসএ; ~৬৫ মিগ্রা/কেজি আইপি) প্রয়োগ করে প্রাণীগুলোকে মানবিক উপায়ে হত্যা করা হয়েছিল। কিছু প্রাণীকে ইমেজিং প্ল্যাটফর্মে রেখে দেওয়া হয়েছিল, এবং শ্বাস-প্রশ্বাস ও হৃদস্পন্দন বন্ধ হয়ে গেলে, ইমেজিং প্রক্রিয়াটি পুনরায় করা হয়েছিল; যদি শ্বাসনালীর পৃষ্ঠে কোনো এমপি (মাইক্রোপার্টিকল) দৃশ্যমান না হয়, তবে এমপির একটি অতিরিক্ত ডোজ যোগ করা হয়েছিল।
সংগৃহীত ছবিগুলোকে ফ্ল্যাট-ফিল্ড ও ডার্ক-ফিল্ড কারেকশন করার পর, ম্যাটল্যাবে (R2020a, The Mathworks) লেখা একটি কাস্টম স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে সেগুলোকে একটি মুভিতে (প্রতি সেকেন্ডে ২০ ফ্রেম; শ্বাস-প্রশ্বাসের হারের উপর নির্ভর করে স্বাভাবিক গতির ১৫-২৫ গুণ) একত্রিত করা হয়েছিল।
সমস্ত এলভি জিন ভেক্টর ডেলিভারি গবেষণা অ্যাডিলেড বিশ্ববিদ্যালয়ের ল্যাবরেটরি অ্যানিমেল রিসার্চ ফ্যাসিলিটিতে পরিচালিত হয়েছিল এবং এর উদ্দেশ্য ছিল স্প্রিং-৮ পরীক্ষার ফলাফল ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা যে, চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে এলভি-এমপি ডেলিভারি ইন ভিভো জিন ট্রান্সফারকে উন্নত করতে পারে কিনা। এমপি এবং চৌম্বক ক্ষেত্রের প্রভাব মূল্যায়ন করার জন্য, প্রাণীদের দুটি দলের উপর পরীক্ষা চালানো হয়েছিল: একটি দলকে চুম্বকসহ এলভি-এমপি দেওয়া হয়েছিল, এবং অন্য দলটি (নিয়ন্ত্রক দল) চুম্বক ছাড়া এলভি-এমপি পেয়েছিল।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি 25, 26 ব্যবহার করে LV জিন ভেক্টর তৈরি করা হয়েছিল। LacZ ভেক্টরটি কনস্টিটিউটিভ MPSV প্রোমোটার (LV-LacZ) দ্বারা চালিত নিউক্লিয়াস-অবস্থিত বিটা-গ্যালাক্টোসিডেজ জিন প্রকাশ করে, যা ট্রান্সডিউসড কোষগুলিতে একটি নীল বিক্রিয়া পণ্য তৈরি করে, যা ফুসফুসের টিস্যু ফ্রন্ট এবং টিস্যু সেকশনে দৃশ্যমান। কোষ কালচারে হেমোসাইটোমিটার দিয়ে LacZ পজিটিভ কোষের সংখ্যা ম্যানুয়ালি গণনা করে TU/ml-এ টাইটার গণনা করার মাধ্যমে টাইট্রেশন করা হয়েছিল। ক্যারিয়ারগুলিকে -80 °C তাপমাত্রায় ক্রায়োপ্রিজার্ভ করা হয়, ব্যবহারের আগে গলানো হয় এবং ডেলিভারির আগে কমপক্ষে 30 মিনিটের জন্য বরফের উপর রেখে 1:1 অনুপাতে মিশিয়ে CombiMag-এর সাথে আবদ্ধ করা হয়।
সাধারণ স্প্রাগ ডাওলি ইঁদুর (প্রতি গ্রুপে ৩টি, প্রায় ২-৩ মাস বয়সী) -কে ০.৪ মিগ্রা/কেজি মেডেটোমিডিন (ডোমিটর, ইলিয়াম, অস্ট্রেলিয়া) এবং ৬০ মিগ্রা/কেজি কেটামিন (ইলিয়াম, অস্ট্রেলিয়া)-এর মিশ্রণ দিয়ে ইন্ট্রাপেরিটোনিয়ালি অ্যানেস্থেটাইজ করা হয়েছিল) -কে আইপি ইনজেকশন এবং একটি ১৬ গেজ আইভি ক্যানুলা দিয়ে নন-সার্জিক্যাল ওরাল ক্যানুলেশন করা হয়েছিল। শ্বাসনালীর বায়ুপথের টিস্যু যাতে এলভি ট্রান্সডাকশন পায় তা নিশ্চিত করার জন্য, এটিকে আমাদের পূর্বে বর্ণিত মেকানিক্যাল পার্টারবেশন প্রোটোকল ব্যবহার করে কন্ডিশন করা হয়েছিল, যেখানে শ্বাসনালীর বায়ুপথের পৃষ্ঠকে একটি তারের ঝুড়ি (এন-সার্কেল, নিটিনল টিপলেস স্টোন এক্সট্র্যাক্টর NTSE-022115 - ইউডিএইচ, কুক মেডিকেল, ইউএসএ) দিয়ে ৩০ সেকেন্ড ধরে অক্ষীয়ভাবে ঘষা হয়েছিল। এরপর পার্টারবেশনের প্রায় ১০ মিনিট পরে একটি বায়োলজিক্যাল সেফটি ক্যাবিনেটে শ্বাসনালীতে এলভি-এমপি প্রয়োগ করা হয়েছিল।
এই পরীক্ষায় ব্যবহৃত চৌম্বক ক্ষেত্রটি ইন ভিভো এক্স-রে ইমেজিং স্টাডির অনুরূপ পদ্ধতিতে কনফিগার করা হয়েছিল, যেখানে ডিস্টিলেশন স্টেন্ট ক্লিপ ব্যবহার করে শ্বাসনালীর উপরে একই চুম্বকগুলি ধরে রাখা হয়েছিল (চিত্র ৪)। পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে, জেল টিপযুক্ত একটি পিপেট ব্যবহার করে শ্বাসনালীতে ৫০ মাইক্রোলিটার আয়তনের (২ × ২৫ মাইক্রোলিটার অ্যালিকোট) এলভি-এমপি প্রবেশ করানো হয়েছিল (n = ৩টি প্রাণী)। একটি নিয়ন্ত্রণ গ্রুপকে (n = ৩টি প্রাণী) চুম্বক ব্যবহার না করে একই এলভি-এমপি দেওয়া হয়েছিল। ইনফিউশন সম্পূর্ণ হওয়ার পর, ইটি টিউব থেকে ক্যানুলাটি সরিয়ে ফেলা হয় এবং প্রাণীটির এক্সটিউবেশন করা হয়। চুম্বকটি ১০ মিনিটের জন্য যথাস্থানে থাকে, তারপর এটি সরিয়ে ফেলা হয়। ইঁদুরদের ত্বকের নিচে মেলোক্সিকামের (১ মিলি/কেজি) (ইলিয়াম, অস্ট্রেলিয়া) একটি ডোজ দেওয়া হয়েছিল এবং এরপর আইপি ইনজেকশনের মাধ্যমে ১ মিলিগ্রাম/কেজি অ্যাটিপামাজোল হাইড্রোক্লোরাইড (অ্যান্টিসেডান, জোয়েটিস, অস্ট্রেলিয়া) প্রয়োগ করে অ্যানাস্থেসিয়ার প্রভাব দূর করা হয়েছিল। ইঁদুরদের উষ্ণ রাখা হয়েছিল এবং সম্পূর্ণ সুস্থ না হওয়া পর্যন্ত পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। অ্যানেস্থেসিয়া।
একটি বায়োলজিক্যাল সেফটি ক্যাবিনেটের মধ্যে এলভি-এমপি ডেলিভারি ডিভাইস। ইটি টিউবের হালকা ধূসর রঙের লুয়ের হাবটি মুখ থেকে বেরিয়ে থাকতে দেখা যাচ্ছে এবং ছবিতে দেখানো পিপেটের জেল টিপটি ইটি টিউবের মধ্য দিয়ে শ্বাসনালীর কাঙ্ক্ষিত গভীরতায় প্রবেশ করানো হয়।
এলভি-এমপি ডোজিং পদ্ধতির এক সপ্তাহ পরে, প্রাণীগুলোকে ১০০% CO2 শ্বাসগ্রহণের মাধ্যমে মানবিক উপায়ে হত্যা করা হয় এবং আমাদের স্ট্যান্ডার্ড এক্স-গ্যাল ট্রিটমেন্ট ব্যবহার করে LacZ এক্সপ্রেশন মূল্যায়ন করা হয়। এন্ডোট্রাকিয়াল টিউব স্থাপনের ফলে সৃষ্ট কোনো যান্ত্রিক ক্ষতি বা তরল জমা হওয়া যাতে বিশ্লেষণে অন্তর্ভুক্ত না হয়, তা নিশ্চিত করার জন্য সবচেয়ে পেছনের তিনটি তরুণাস্থি বলয় অপসারণ করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের জন্য প্রতিটি শ্বাসনালীকে লম্বালম্বিভাবে কেটে দুটি অর্ধেকে বিভক্ত করা হয় এবং লুমিনাল পৃষ্ঠ দেখার জন্য সেগুলোকে একটি মিনুটিয়েন নিডল (ফাইন সায়েন্স টুলস) ব্যবহার করে সিলিকন রাবার (সিলগার্ড, ডাও ইনকর্পোরেটেড) যুক্ত একটি ডিশে স্থাপন করা হয়। একটি ডিজিলাইট ক্যামেরা এবং টিক্যাপচার সফটওয়্যার (টুকসেন ফটোনিক্স, চীন) সহ একটি নিকন মাইক্রোস্কোপ (SMZ1500) ব্যবহার করে সম্মুখ ফটোগ্রাফির মাধ্যমে ট্রান্সডিউসড কোষের বিতরণ এবং প্যাটার্ন নিশ্চিত করা হয়। ছবিগুলো ২০x বিবর্ধনে (শ্বাসনালীর সম্পূর্ণ প্রস্থের জন্য সর্বোচ্চ সেটিং সহ) তোলা হয়েছিল, যেখানে শ্বাসনালীর সম্পূর্ণ দৈর্ঘ্য ধাপে ধাপে চিত্রিত করা হয় এবং প্রতিটি ছবির মধ্যে পর্যাপ্ত ওভারল্যাপ নিশ্চিত করা হয়। প্রতিটি শ্বাসনালীর ছবিগুলোকে একটি প্ল্যানার মোশন অ্যালগরিদম ব্যবহার করে ইমেজ কম্পোজিট এডিটর v2.0.3 (মাইক্রোসফট রিসার্চ) দিয়ে একত্রিত করে একটি একক কম্পোজিট ছবিতে পরিণত করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে, প্রতিটি প্রাণীর শ্বাসনালীর কম্পোজিট ছবিগুলোতে LacZ এক্সপ্রেশন এলাকাগুলোকে একটি স্বয়ংক্রিয় MATLAB স্ক্রিপ্ট (R2020a, MathWorks) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল, যেখানে সেটিংস ছিল 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, এবং Value < 0.7। টিস্যুর কনট্যুরগুলো ট্রেস করে, প্রতিটি কম্পোজিট ছবির জন্য GIMP v2.10.24-এ ম্যানুয়ালি একটি মাস্ক তৈরি করা হয়েছিল, যাতে টিস্যুর এলাকা শনাক্ত করা যায় এবং শ্বাসনালীর টিস্যুর বাইরে থেকে কোনো ভুল শনাক্তকরণ প্রতিরোধ করা যায়। প্রতিটি প্রাণীর সমস্ত কম্পোজিট ছবির স্টেইন করা এলাকাগুলোকে যোগ করে সেই প্রাণীর মোট স্টেইন করা এলাকা বের করা হয়েছিল। এরপর স্টেইন করা এলাকাটিকে মোট মাস্ক এলাকা দিয়ে ভাগ করে নর্মালাইজড এলাকা বের করা হয়েছিল।
প্রতিটি শ্বাসনালী প্যারাফিনে স্থাপন করে ৫ মাইক্রোমিটার পুরু সেকশন কাটা হয়েছিল। সেকশনগুলোকে ৫ মিনিটের জন্য নিউট্রাল ফাস্ট রেড দিয়ে কাউন্টারস্টেইন করা হয়েছিল এবং একটি নিকন এক্লিপ্স E400 মাইক্রোস্কোপ, DS-Fi3 ক্যামেরা ও NIS এলিমেন্ট ক্যাপচার সফটওয়্যার (ভার্সন 5.20.00) ব্যবহার করে ছবিগুলো তোলা হয়েছিল।
সমস্ত পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ গ্রাফপ্যাড প্রিজম ভি৯ (গ্রাফপ্যাড সফটওয়্যার, ইনকর্পোরেটেড)-এ সম্পন্ন করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য পি ≤ ০.০৫ এ নির্ধারণ করা হয়েছিল। শাপিরো-উইল্ক পরীক্ষার মাধ্যমে স্বাভাবিকতা যাচাই করা হয়েছিল এবং আনপেয়ার্ড টি-টেস্ট ব্যবহার করে ল্যাকজেড (LacZ) স্টেইনিং-এর পার্থক্য মূল্যায়ন করা হয়েছিল।
সারণি ১-এ বর্ণিত ছয়টি এমপি PCXI ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল, এবং তাদের দৃশ্যমানতা সারণি ২-এ বর্ণনা করা হয়েছে। দুটি পলিস্টাইরিন এমপি (MP1 এবং MP2; যথাক্রমে ১৮ μm এবং ০.২৫ μm) PCXI-এর অধীনে দৃশ্যমান ছিল না, কিন্তু বাকি নমুনাগুলো শনাক্তযোগ্য ছিল (উদাহরণ চিত্র ৫-এ দেখানো হয়েছে)। MP3 এবং MP4 (১০-১৫% Fe3O4; যথাক্রমে ০.২৫ μm এবং ০.৯ μm) ক্ষীণভাবে দৃশ্যমান। পরীক্ষিত ক্ষুদ্রতম কণাগুলোর কয়েকটি থাকা সত্ত্বেও, MP5 (৯৮% Fe3O4; ০.২৫ μm) ছিল সবচেয়ে সুস্পষ্ট। CombiMag পণ্য MP6 খুঁজে পাওয়া কঠিন। সব ক্ষেত্রেই, কৈশিক নলের সমান্তরালে চুম্বকটিকে সামনে-পিছনে সরানোর মাধ্যমে এমপি শনাক্ত করার আমাদের ক্ষমতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল। যখন চুম্বকগুলো কৈশিক নল থেকে দূরে সরে যাচ্ছিল, তখন কণাগুলো লম্বা সুতোর মতো প্রসারিত হচ্ছিল, কিন্তু যখন চুম্বকগুলো কাছে আসছিল এবং চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তি বাড়ছিল, তখন কণার সুতোগুলো... কৈশিক নলের উপরের পৃষ্ঠের দিকে কণাগুলো স্থানান্তরিত হওয়ার সাথে সাথে এটি সংক্ষিপ্ত হয়ে যায় (দেখুন পরিপূরক ভিডিও S1: MP4), যা পৃষ্ঠের কণার ঘনত্ব বাড়িয়ে দেয়। বিপরীতভাবে, যখন চুম্বকটি কৈশিক নল থেকে সরানো হয়, তখন ক্ষেত্রের শক্তি হ্রাস পায় এবং MP-গুলো কৈশিক নলের উপরের পৃষ্ঠ থেকে প্রসারিত দীর্ঘ সারিতে পুনরায় সজ্জিত হয় (দেখুন পরিপূরক ভিডিও S2: MP4)। চুম্বকের চলাচল থেমে যাওয়ার পরেও, কণাগুলো সাম্যাবস্থায় পৌঁছানোর পর অল্প সময়ের জন্য চলতে থাকে। যখন MP কৈশিক নলের উপরের পৃষ্ঠের দিকে এবং সেখান থেকে দূরে সরে যায়, তখন চৌম্বকীয় কণাগুলো সাধারণত তরলের মধ্য দিয়ে আবর্জনা টেনে নিয়ে যায়।
PCXI-এর অধীনে MP-এর দৃশ্যমানতা নমুনাভেদে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়। (ক) MP3, (খ) MP4, (গ) MP5 এবং (ঘ) MP6। এখানে দেখানো সমস্ত ছবি কৈশিক নলের প্রায় ১০ মিমি সরাসরি উপরে অবস্থিত একটি চুম্বক দিয়ে তোলা হয়েছে। দৃশ্যমান বড় বৃত্তগুলি হল কৈশিক নলের মধ্যে আটকে থাকা বায়ু বুদবুদ, যা ফেজ কনট্রাস্ট ইমেজিংয়ের সাদা-কালো প্রান্তের বৈশিষ্ট্যগুলি স্পষ্টভাবে দেখাচ্ছে। লাল বাক্সটিতে কনট্রাস্ট-বর্ধক বিবর্ধন রয়েছে। উল্লেখ্য যে, সমস্ত চিত্রে চুম্বকের নকশাগুলির ব্যাস মাপ অনুযায়ী নয় এবং দেখানো আকারের চেয়ে প্রায় ১০০ গুণ বড়।
যখন চুম্বকটিকে কৈশিক নলের উপর দিয়ে ডানে-বামে সরানো হয়, তখন MP স্ট্রিং-এর কোণ চুম্বকের সাথে সারিবদ্ধ হওয়ার জন্য পরিবর্তিত হয় (চিত্র ৬ দেখুন), ফলে চৌম্বক ক্ষেত্র রেখাগুলো স্পষ্ট হয়ে ওঠে। MP3-5 এর ক্ষেত্রে, কর্ডটি একটি প্রান্তিক কোণে পৌঁছানোর পর, কণাগুলো কৈশিক নলের উপরের পৃষ্ঠ বরাবর টেনে নিয়ে যাওয়া হয়। এর ফলে প্রায়শই MP-গুলো সবচেয়ে শক্তিশালী চৌম্বক ক্ষেত্রের কাছাকাছি বড় দলে একত্রিত হয় (পরিপূরক ভিডিও S3:MP5 দেখুন)। এটি কৈশিক নলের প্রান্তের কাছাকাছি চিত্রগ্রহণের সময়ও বিশেষভাবে স্পষ্ট হয়, যা MP-গুলোকে তরল-বায়ু সংযোগস্থলে একত্রিত ও ঘনীভূত করে। MP6-এর কণাগুলো, যা MP3-5 এর চেয়ে শনাক্ত করা আরও কঠিন ছিল, চুম্বকটি কৈশিক নল বরাবর চলার সময় টেনে নিয়ে যাওয়া হয়নি, কিন্তু MP স্ট্রিংগুলো বিচ্ছিন্ন হয়ে গিয়েছিল, ফলে কণাগুলো দৃশ্যক্ষেত্রে থেকে যায় (পরিপূরক ভিডিও S4:MP6 দেখুন)। কিছু ক্ষেত্রে, যখন চুম্বকটিকে চিত্রগ্রহণের স্থান থেকে অনেক দূরে সরিয়ে প্রয়োগকৃত চৌম্বক ক্ষেত্র কমানো হয়েছিল, তখন অবশিষ্ট MP-গুলো স্ট্রিং-এর মধ্যেই থেকে মাধ্যাকর্ষণের প্রভাবে ধীরে ধীরে নলের নিচের পৃষ্ঠে নেমে আসে (পরিপূরক ভিডিও দেখুন)। S5: MP3)।
কৈশিক নলের উপরে চুম্বকটিকে ডানদিকে সরানোর ফলে MP স্ট্রিং-এর কোণ পরিবর্তিত হয়। (ক) MP3, (খ) MP4, (গ) MP5 এবং (ঘ) MP6। লাল বাক্সটিতে বৈসাদৃশ্য-বর্ধক বিবর্ধন রয়েছে। উল্লেখ্য যে, পরিপূরক ভিডিওগুলি তথ্যপূর্ণ, কারণ সেগুলি কণার গুরুত্বপূর্ণ গঠন এবং গতিশীল তথ্য প্রকাশ করে যা এই স্থির চিত্রগুলিতে দেখা যায় না।
আমাদের পরীক্ষাগুলি দেখিয়েছে যে শ্বাসনালী বরাবর চুম্বকটিকে ধীরে ধীরে সামনে-পিছনে নাড়ালে তা জীবন্ত অবস্থায় জটিল গতিবিধির প্রেক্ষাপটে MP-কে দৃশ্যমান করতে সাহায্য করে। জীবন্ত অবস্থায় পরীক্ষা করা হয়নি কারণ পলিস্টাইরিন বিডস (MP1 এবং MP2) কৈশিক নালীতে দৃশ্যমান ছিল না। বাকি চারটি MP-এর প্রত্যেকটিকে জীবন্ত অবস্থায় পরীক্ষা করা হয়েছিল, যেখানে চুম্বকের দীর্ঘ অক্ষটি শ্বাসনালীর উপরে উল্লম্বের সাথে প্রায় ৩০° কোণে স্থাপন করা হয়েছিল (চিত্র ২খ এবং ৩ক দেখুন), কারণ এর ফলে MP-এর দীর্ঘতর শৃঙ্খল তৈরি হয়েছিল এবং চুম্বকের প্রান্তীয় অবস্থানের চেয়ে এটি বেশি কার্যকর ছিল। MP3, MP4 এবং MP6 কোনো জীবিত প্রাণীর শ্বাসনালীতে শনাক্ত করা যায়নি। প্রাণীগুলিকে মানবিক উপায়ে হত্যা করার পর যখন ইঁদুরের শ্বাসনালীর চিত্র গ্রহণ করা হয়েছিল, তখন সিরিঞ্জ পাম্প ব্যবহার করে অতিরিক্ত পরিমাণ যোগ করার পরেও কণাগুলি অদৃশ্য ছিল। MP5-এ আয়রন অক্সাইডের পরিমাণ সবচেয়ে বেশি ছিল এবং এটিই ছিল একমাত্র দৃশ্যমান কণা, এবং তাই MP-এর জীবন্ত অবস্থার আচরণ মূল্যায়ন ও বৈশিষ্ট্যায়নের জন্য এটি ব্যবহার করা হয়েছিল।
এমপি ডেলিভারির সময় শ্বাসনালীর উপর চুম্বক স্থাপন করার ফলে অনেক, কিন্তু সব নয়, এমপি দৃশ্যমান ক্ষেত্রে কেন্দ্রীভূত হয়েছিল। শ্বাসনালীতে প্রবেশকারী কণাগুলি মানবিক উপায়ে বলিদান করা প্রাণীদের মধ্যে সবচেয়ে ভালোভাবে পর্যবেক্ষণ করা যায়। চিত্র ৭ এবং পরিপূরক ভিডিও S6: MP5 ভেন্ট্রাল শ্বাসনালীর পৃষ্ঠে কণাগুলির দ্রুত চৌম্বকীয় আকর্ষণ এবং সারিবদ্ধকরণ দেখায়, যা ইঙ্গিত করে যে এমপিগুলিকে শ্বাসনালীর কাঙ্ক্ষিত অঞ্চলে পরিচালিত করা যেতে পারে। এমপি ডেলিভারির পরে শ্বাসনালী বরাবর আরও দূরবর্তী স্থানে অনুসন্ধান করার সময়, কিছু এমপি ক্যারিনার কাছাকাছি পাওয়া গিয়েছিল, যা থেকে বোঝা যায় যে চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তি সমস্ত এমপি সংগ্রহ এবং ধরে রাখার জন্য অপর্যাপ্ত ছিল, কারণ তরল প্রক্রিয়ার সময় সেগুলি সর্বোচ্চ চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তির অঞ্চলের মধ্য দিয়ে সরবরাহ করা হয়েছিল। তা সত্ত্বেও, চিত্রিত এলাকার চারপাশে প্রসবোত্তর এমপির ঘনত্ব বেশি ছিল, যা থেকে বোঝা যায় যে অনেক এমপি শ্বাসনালীর সেই অঞ্চলগুলিতে থেকে গিয়েছিল যেখানে প্রয়োগকৃত চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তি সর্বোচ্চ ছিল।
সম্প্রতি ইউথানাইজ করা একটি ইঁদুরের শ্বাসনালীতে MP5 প্রবেশ করানোর (ক) আগে এবং (খ) পরের ছবি, যেখানে চুম্বকটি সরাসরি ইমেজিং এলাকার উপরে স্থাপন করা হয়েছে। ইমেজিং এলাকাটি দুটি তরুণাস্থি বলয়ের মাঝখানে অবস্থিত। MP প্রবেশ করানোর আগে শ্বাসনালীতে কিছু তরল ছিল। লাল বাক্সটিতে কনট্রাস্ট-বর্ধক বিবর্ধন রয়েছে। এই ছবিগুলো সাপ্লিমেন্টারি ভিডিও S6:MP5-এ দেখানো ভিডিও থেকে নেওয়া হয়েছে।
জীবন্ত অবস্থায় শ্বাসনালী বরাবর চুম্বকটি চালনা করার ফলে শ্বাসনালীর পৃষ্ঠের মধ্যে MP শৃঙ্খলটির কোণ এমনভাবে পরিবর্তিত হয়, যা কৈশিক নালীতে দেখা যায় (চিত্র ৮ এবং পরিপূরক ভিডিও S7:MP5 দেখুন)। তবে, আমাদের গবেষণায়, কৈশিক নালীর মতো জীবন্ত শ্বাসনালীর পৃষ্ঠ বরাবর MP-গুলোকে টেনে নিয়ে যাওয়া যায়নি। কিছু ক্ষেত্রে, চুম্বকটি ডানে ও বামে সরানোর সাথে সাথে MP শৃঙ্খলটি দীর্ঘতর হয়। মজার বিষয় হলো, আমরা আরও দেখেছি যে, যখন চুম্বকটিকে শ্বাসনালী বরাবর অনুদৈর্ঘ্যভাবে সরানো হয়, তখন কণা শৃঙ্খলটি পৃষ্ঠের তরল স্তরের গভীরতা পরিবর্তন করে বলে মনে হয়, এবং যখন চুম্বকটিকে সরাসরি মাথার উপরে সরানো হয় ও কণা শৃঙ্খলটিকে উল্লম্ব অবস্থানে ঘোরানো হয়, তখন এটি প্রসারিত হয় (পরিপূরক ভিডিও S7 দেখুন)। : MP5 ০:০৯-এ, নীচে ডানদিকে)। যখন চুম্বকটিকে শ্বাসনালীর উপর দিয়ে আড়াআড়িভাবে (অর্থাৎ, শ্বাসনালীর দৈর্ঘ্য বরাবর না সরিয়ে প্রাণীটির বামে বা ডানে) সরানো হচ্ছিল, তখন গতির বৈশিষ্ট্যপূর্ণ ধরণটি পরিবর্তিত হয়ে যায়। কণাগুলো চলার সময়ও স্পষ্টভাবে দৃশ্যমান ছিল, কিন্তু যখন চুম্বকটিকে শ্বাসনালী থেকে সরিয়ে নেওয়া হয়, তখন কণার সারিগুলোর অগ্রভাগ দৃশ্যমান হয়ে ওঠে (দেখুন পরিপূরক ভিডিও S8:MP5, ০:০৮ থেকে শুরু)। এটি একটি কাচের কৈশিক নলে প্রয়োগকৃত চৌম্বক ক্ষেত্রের অধীনে আমাদের পর্যবেক্ষণ করা MP আচরণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।
একটি জীবন্ত চেতনানাশক ইঁদুরের শ্বাসনালীতে MP5-এর উদাহরণমূলক ছবি। (ক) শ্বাসনালীর উপরে এবং বাম দিকের ছবি তোলার জন্য চুম্বকটি ব্যবহার করা হয়েছে, তারপর (খ) চুম্বকটিকে ডানদিকে সরানোর পর। লাল বাক্সটিতে কনট্রাস্ট-বর্ধক বিবর্ধন রয়েছে। এই ছবিগুলো পরিপূরক ভিডিও S7:MP5-এ দেখানো ভিডিও থেকে নেওয়া হয়েছে।
যখন দুটি মেরু শ্বাসনালীর উপরে এবং নীচে উত্তর-দক্ষিণ অভিমুখীকরণে বিন্যস্ত করা হয়েছিল (অর্থাৎ আকর্ষণকারী; চিত্র 3b), তখন MP কর্ডগুলিকে দীর্ঘতর বলে মনে হয়েছিল এবং সেগুলি শ্বাসনালীর পৃষ্ঠভাগের পরিবর্তে শ্বাসনালীর পার্শ্বদেয়ালে অবস্থিত ছিল (পরিপূরক ভিডিও S9:MP5 দেখুন)। যাইহোক, যখন একটি দ্বৈত-চুম্বক ডিভাইস ব্যবহার করা হয়েছিল, তখন তরল সরবরাহের পরে একটি নির্দিষ্ট স্থানে (অর্থাৎ, শ্বাসনালীর পৃষ্ঠভাগে) কণার উচ্চ ঘনত্ব সনাক্ত করা যায়নি, যা সাধারণত একটি একক-চুম্বক ডিভাইস ব্যবহার করার সময় ঘটে থাকে। তারপর যখন একটি চুম্বককে বিপরীত মেরুগুলিকে বিকর্ষণ করার জন্য বিন্যস্ত করা হয়েছিল (চিত্র 3c), তখন সরবরাহের পরে দৃশ্যমান ক্ষেত্রে কণার সংখ্যা বৃদ্ধি পায়নি বলে মনে হয়েছিল। উভয় দ্বৈত-চুম্বক বিন্যাসের সেটআপই চ্যালেঞ্জিং, কারণ উচ্চ চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তি যথাক্রমে চুম্বকগুলিকে আকর্ষণ বা বিকর্ষণ করে। এরপর সেটআপটি পরিবর্তন করে একটি একক চুম্বক স্থাপন করা হয় যা শ্বাসনালীর সমান্তরালে কিন্তু শ্বাসনালীর মধ্য দিয়ে 90 ডিগ্রি কোণে অতিক্রম করে, যাতে ক্ষেত্র রেখাগুলি শ্বাসনালীর প্রাচীরকে লম্বভাবে ছেদ করে (চিত্র 3d), যা একটি পরিকল্পিত অভিমুখ। পার্শ্ব দেয়ালে কণার পুঞ্জীভবন পর্যবেক্ষণ করা যায় কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য। তবে, এই বিন্যাসে, এমপি জমার বা চুম্বকের কোনো শনাক্তযোগ্য নড়াচড়া ছিল না। এই সমস্ত ফলাফলের উপর ভিত্তি করে, ইন ভিভো জিন বাহক গবেষণার জন্য একটি একক-চুম্বক, ৩০-ডিগ্রি অভিমুখী বিন্যাস (চিত্র ৩ক) নির্বাচন করা হয়েছিল।
মানবিক উপায়ে হত্যার পরপরই প্রাণীটির বারবার চিত্র গ্রহণ করা হলে, বিভ্রান্তিকর টিস্যু গতির অনুপস্থিতির কারণে স্পষ্ট আন্তঃকন্ড্রাল ক্ষেত্রে আরও সূক্ষ্ম ও ছোট কণার রেখা শনাক্ত করা সম্ভব হয়েছিল, যা চুম্বকের স্থানান্তরণ গতির সাথে সামঞ্জস্য রেখে "টলোমলো" ছিল। তা সত্ত্বেও, এখনও MP6 কণার উপস্থিতি এবং গতি স্পষ্টভাবে দেখা যায় না।
LV-LacZ টাইটার ছিল 1.8 × 108 TU/ml, এবং CombiMag MP (MP6)-এর সাথে 1:1 অনুপাতে মেশানোর পর, প্রাণীগুলোকে 9 × 107 TU/ml LV ভেহিকলের (অর্থাৎ 4.5 × 106 TU/rat) 50 μl শ্বাসনালীর ডোজ দেওয়া হয়েছিল। এই গবেষণাগুলোতে, প্রসবের সময় চুম্বকটিকে স্থানান্তরিত করার পরিবর্তে, আমরা চুম্বকটিকে একটি নির্দিষ্ট অবস্থানে স্থির রেখেছিলাম এটা নির্ধারণ করার জন্য যে LV ট্রান্সডাকশন (ক) চৌম্বক ক্ষেত্রের অনুপস্থিতিতে ভেক্টর ডেলিভারির তুলনায় উন্নত করা যায় কিনা, এবং (খ) কেন্দ্রীভূত করা যায় কিনা। শ্বাসনালীর কোষগুলো ঊর্ধ্ব শ্বাসনালীর চৌম্বকীয় লক্ষ্য অঞ্চলে ট্রান্সডিউসড হয়।
চুম্বকের উপস্থিতি এবং এলভি ভেক্টরের সাথে কম্বিম্যাগ-এর ব্যবহার প্রাণীর স্বাস্থ্যের উপর কোনো প্রতিকূল প্রভাব ফেলেনি, যেমনটি আমাদের স্ট্যান্ডার্ড এলভি ভেক্টর ডেলিভারি প্রোটোকলের ক্ষেত্রে দেখা গিয়েছিল। যান্ত্রিক আলোড়নের শিকার হওয়া শ্বাসনালী অঞ্চলের সম্মুখ চিত্র (পরিপূরক চিত্র ১) থেকে দেখা যায় যে, চুম্বকের উপস্থিতিতে এলভি-এমপি দিয়ে চিকিৎসা করা প্রাণীদের দলে ট্রান্সডাকশনের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (চিত্র ৯ক)। কন্ট্রোল গ্রুপে শুধুমাত্র অল্প পরিমাণে নীল LacZ স্টেইনিং উপস্থিত ছিল (চিত্র ৯খ)। স্বাভাবিককৃত X-Gal স্টেইন করা এলাকার পরিমাণ নির্ধারণ করে দেখা যায় যে, চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে এলভি-এমপি প্রয়োগ প্রায় ৬-গুণ উন্নতি সাধন করেছে (চিত্র ৯গ)।
LV-MP দ্বারা শ্বাসনালীর সংকেত সঞ্চালনের উদাহরণমূলক যৌগিক চিত্র (ক) চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে এবং (খ) চুম্বকের অনুপস্থিতিতে। (গ) চুম্বক ব্যবহার করার ফলে শ্বাসনালীর অভ্যন্তরে স্বাভাবিককৃত LacZ সংকেত সঞ্চালন ক্ষেত্রে পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ উন্নতি (*p = ০.০২৯, টি-টেস্ট, প্রতি গ্রুপে n = ৩, গড় ± SEM)।
নিউট্রাল ফাস্ট রেড-রঞ্জিত সেকশনগুলিতে (উদাহরণ পরিশিষ্ট চিত্র ২-এ দেখানো হয়েছে) দেখা গেছে যে, LacZ-রঞ্জিত কোষগুলি পূর্বে প্রতিবেদিত বিন্যাস ও অবস্থানের অনুরূপভাবে উপস্থিত ছিল।
শ্বাসনালীর জিন থেরাপির জন্য একটি প্রধান চ্যালেঞ্জ হলো বাহক কণাগুলোকে কাঙ্ক্ষিত অঞ্চলে নির্ভুলভাবে স্থাপন করা এবং বায়ুপ্রবাহ ও সক্রিয় শ্লেষ্মা নিষ্কাশনের উপস্থিতিতে সচল ফুসফুসে উচ্চ মাত্রার ট্রান্সডাকশন দক্ষতা অর্জন করা। সিএফ শ্বাসনালীর রোগের চিকিৎসার জন্য ডিজাইন করা এলভি বাহকগুলোর ক্ষেত্রে, পরিবাহী শ্বাসনালীর মধ্যে বাহক কণাগুলোর অবস্থানকাল বৃদ্ধি করা এখন পর্যন্ত একটি অধরা লক্ষ্য হয়ে রয়েছে। ক্যাস্টেলানি প্রমুখের মতে, ট্রান্সডাকশন উন্নত করার জন্য চৌম্বক ক্ষেত্র ব্যবহারের সুবিধা হলো, এটি ইলেকট্রোপোরেশনের মতো অন্যান্য জিন সরবরাহ পদ্ধতির তুলনায় সরলতা, ব্যয়-সাশ্রয়, নির্দিষ্ট স্থানে সরবরাহ, বর্ধিত দক্ষতা, স্বল্প ইনকিউবেশন সময় এবং সম্ভবত কম বাহক ডোজের সমন্বয় ঘটাতে পারে। তবে, বাহ্যিক চৌম্বকীয় শক্তির প্রভাবে শ্বাসনালীতে চৌম্বকীয় কণাগুলোর ইন ভিভো জমা এবং আচরণ কখনও বর্ণনা করা হয়নি, এমনকি অক্ষত জীবন্ত শ্বাসনালীতে জিন প্রকাশের মাত্রা বাড়ানোর জন্য এই পদ্ধতির কার্যকারিতাও ইন ভিভোতে প্রদর্শন করা হয়নি।
আমাদের ইন ভিট্রো সিনক্রোট্রন PCXI পরীক্ষায় দেখা গেছে যে, পলিস্টাইরিন মাইক্রোপার্টিকল (MP) ছাড়া আমরা যে সমস্ত কণা পরীক্ষা করেছিলাম, তার সবই আমাদের ব্যবহৃত ইমেজিং সেটআপে দৃশ্যমান ছিল। চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে, মাইক্রোপার্টিকলগুলো স্ট্রিং বা শৃঙ্খল গঠন করে, যার দৈর্ঘ্য কণার ধরন এবং চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তির (অর্থাৎ চুম্বকের নৈকট্য ও গতি) উপর নির্ভর করে। চিত্র ১০-এ যেমন দেখানো হয়েছে, আমরা যে স্ট্রিংগুলো পর্যবেক্ষণ করি, তা প্রতিটি স্বতন্ত্র কণার চৌম্বকায়িত হওয়ার এবং তার নিজস্ব স্থানীয় চৌম্বক ক্ষেত্র আবেশন করার ফলে গঠিত হয়। এই পৃথক ক্ষেত্রগুলো অন্যান্য অনুরূপ কণাকে একত্রিত ও সংযুক্ত হতে উৎসাহিত করে এবং অন্যান্য কণার স্থানীয় আকর্ষণ ও বিকর্ষণ বলের প্রভাবে তারা দলবদ্ধভাবে স্ট্রিং-এর মতো গতি প্রদর্শন করে।
(ক,খ) তরল-পূর্ণ কৈশিকনালীর ভিতরে উৎপন্ন কণা সারি এবং (গ,ঘ) বায়ু-পূর্ণ শ্বাসনালীর রেখাচিত্র দেখানো হয়েছে। উল্লেখ্য যে, কৈশিকনালী এবং শ্বাসনালী মাপ অনুযায়ী আঁকা হয়নি। (ক) প্যানেলে MP-এর একটি বর্ণনাও রয়েছে, যেখানে Fe3O4 কণাগুলি স্ট্রিং আকারে সাজানো থাকে।
যখন চুম্বকটিকে কৈশিক নলের উপরে সরানো হয়েছিল, তখন Fe3O4 ধারণকারী MP3-5 এর ক্ষেত্রে কণা শৃঙ্খলের কোণ একটি সংকটপূর্ণ সীমায় পৌঁছেছিল, যার পরে কণা শৃঙ্খলটি আর তার মূল অবস্থানে থাকেনি, বরং পৃষ্ঠ বরাবর চুম্বকের একটি নতুন অবস্থানে চলে গিয়েছিল। এই প্রভাবটি সম্ভবত ঘটে কারণ কাচের কৈশিক নলের পৃষ্ঠটি এই চলাচল ঘটার জন্য যথেষ্ট মসৃণ। মজার বিষয় হলো, MP6 (CombiMag) এইভাবে আচরণ করেনি, সম্ভবত কারণ কণাগুলো ছোট ছিল, তাদের আবরণ বা পৃষ্ঠের চার্জ ভিন্ন ছিল, অথবা একটি বিশেষ বাহক তরল তাদের চলাচলের ক্ষমতাকে প্রভাবিত করেছিল। CombiMag কণাগুলোর ছবির কনট্রাস্টও দুর্বল, যা থেকে বোঝা যায় যে তরল এবং কণাগুলোর ঘনত্ব প্রায় একই রকম হতে পারে এবং তাই তারা সহজে একে অপরের দিকে যেতে পারে না। চুম্বক খুব দ্রুত চললে কণাগুলো আটকেও যেতে পারে, যা ইঙ্গিত দেয় যে চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তি সবসময় তরলের মধ্যে থাকা কণাগুলোর মধ্যকার ঘর্ষণকে অতিক্রম করতে পারে না। এটি থেকে বোঝা যায় যে চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তি এবং চুম্বক ও লক্ষ্য এলাকার মধ্যকার দূরত্ব যে খুব গুরুত্বপূর্ণ, তাতে অবাক হওয়ার কিছু নেই। সব মিলিয়ে, এই ফলাফলগুলো আরও ইঙ্গিত দেয় যে, যদিও চুম্বকগুলো লক্ষ্য এলাকার মধ্য দিয়ে প্রবাহিত অনেক MP-কে ধরতে পারে, তবে এটি অসম্ভাব্য। শ্বাসনালীর পৃষ্ঠ বরাবর কম্বিম্যাগ কণাগুলিকে সরাতে চুম্বকের উপর নির্ভর করা যায়। অতএব, আমরা এই সিদ্ধান্তে উপনীত হয়েছি যে, ইন ভিভো এলভি-এমপি গবেষণায় শ্বাসনালী বৃক্ষের নির্দিষ্ট অঞ্চলগুলিকে ভৌতভাবে লক্ষ্যবস্তু করার জন্য স্থির চৌম্বক ক্ষেত্র ব্যবহার করা উচিত।
যখন কণাগুলো দেহে প্রবেশ করে, তখন জটিল ও চলমান দেহকলার প্রেক্ষাপটে সেগুলোকে শনাক্ত করা কঠিন হয়ে পড়ে, কিন্তু শ্বাসনালীর উপরে চুম্বকটিকে আনুভূমিকভাবে চালনা করে মাইক্রোপ্লাস্টিকের (এমপি) সুতাগুলোকে "নাড়িয়ে" দেওয়ার মাধ্যমে সেগুলোকে শনাক্ত করার ক্ষমতা বৃদ্ধি পায়। যদিও জীবন্ত অবস্থায় চিত্রগ্রহণ সম্ভব, প্রাণীটিকে মানবিক উপায়ে হত্যা করার পর কণার গতিবিধি বোঝা সহজতর হয়। যখন চুম্বকটিকে চিত্রগ্রহণ এলাকার উপরে স্থাপন করা হয়েছিল, তখন এই স্থানে সাধারণত এমপির ঘনত্ব সর্বোচ্চ ছিল, যদিও কিছু কণা সাধারণত শ্বাসনালীর আরও ভেতরের দিকেও পাওয়া গিয়েছিল। ইন ভিট্রো গবেষণার বিপরীতে, চুম্বক চালনা করে কণাগুলোকে শ্বাসনালী বরাবর টেনে নিয়ে যাওয়া যায় না। এই পর্যবেক্ষণটি শ্বাসনালীর পৃষ্ঠকে আবৃতকারী শ্লেষ্মা যেভাবে সাধারণত শ্বাসের মাধ্যমে গৃহীত কণাগুলোকে প্রক্রিয়াজাত করে, অর্থাৎ সেগুলোকে শ্লেষ্মার মধ্যে আটকে ফেলে এবং পরবর্তীতে মিউকোসিলিয়ারি ক্লিয়ারেন্স প্রক্রিয়ার মাধ্যমে শরীর থেকে বের করে দেয়, তার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।
আমরা অনুমান করেছিলাম যে শ্বাসনালীর উপরে এবং নীচে আকর্ষণের জন্য চুম্বকের ব্যবহার (চিত্র 3b) একটি বিন্দুতে অত্যন্ত কেন্দ্রীভূত চৌম্বক ক্ষেত্রের পরিবর্তে আরও সুষম চৌম্বক ক্ষেত্র তৈরি করতে পারে, যা সম্ভবত কণাগুলির আরও সুষম বিতরণের দিকে পরিচালিত করবে। তবে, আমাদের প্রাথমিক গবেষণায় এই অনুমানকে সমর্থন করার মতো স্পষ্ট প্রমাণ পাওয়া যায়নি। একইভাবে, বিকর্ষণের জন্য একজোড়া চুম্বকের বিন্যাস (চিত্র 3c) চিত্রিত এলাকায় আরও বেশি কণা জমা হওয়ার কারণ হয়নি। এই দুটি ফলাফল প্রমাণ করে যে দ্বৈত-চুম্বক ব্যবস্থা এমপি টার্গেটিং-এর স্থানীয় নিয়ন্ত্রণকে উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করে না, এবং এর ফলে সৃষ্ট শক্তিশালী চৌম্বকীয় শক্তি বিন্যাস করা কঠিন, যা এই পদ্ধতিটিকে কম ব্যবহারিক করে তোলে। একইভাবে, চুম্বকটিকে শ্বাসনালীর উপরে এবং এর মধ্য দিয়ে স্থাপন করাও (চিত্র 3d) চিত্রিত এলাকায় ধরে রাখা কণার সংখ্যা বাড়ায়নি। এই বিকল্প বিন্যাসগুলির মধ্যে কিছু সফল নাও হতে পারে কারণ এগুলি জমা হওয়ার এলাকার মধ্যে কম চৌম্বক ক্ষেত্রের শক্তি তৈরি করে। অতএব, একক ৩০-ডিগ্রি কোণের চুম্বক বিন্যাস (চিত্র 3a) ইন ভিভো পরীক্ষার জন্য সবচেয়ে সহজ এবং সবচেয়ে কার্যকর পদ্ধতি হিসাবে বিবেচিত হয়।
এলভি-এমপি গবেষণায় দেখা গেছে যে, যখন এলভি ভেক্টরগুলোকে কম্বিম্যাগের সাথে একত্রিত করে চৌম্বক ক্ষেত্রের উপস্থিতিতে ভৌত আলোড়নের পর সরবরাহ করা হয়, তখন কন্ট্রোলের তুলনায় শ্বাসনালীতে ট্রান্সডাকশনের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায়। সিনক্রোট্রন ইমেজিং গবেষণা এবং ল্যাকজেড ফলাফলের উপর ভিত্তি করে, চৌম্বক ক্ষেত্রটি দৃশ্যত শ্বাসনালীর মধ্যে এলভি-কে সংরক্ষণ করতে এবং ফুসফুসের গভীরে তাৎক্ষণিকভাবে প্রবেশকারী ভেক্টর কণার সংখ্যা কমাতে সক্ষম হয়েছিল। এই ধরনের টার্গেটিং-এর উন্নতি উচ্চতর কার্যকারিতা আনতে পারে এবং একই সাথে সরবরাহকৃত টাইটার, অফ-টার্গেট ট্রান্সডাকশন, প্রদাহজনিত ও রোগ প্রতিরোধক পার্শ্বপ্রতিক্রিয়া এবং জিন ক্যারিয়ারের খরচ কমাতে পারে। গুরুত্বপূর্ণভাবে, প্রস্তুতকারকের মতে, কম্বিম্যাগ অন্যান্য জিন স্থানান্তর পদ্ধতির সাথে একত্রে ব্যবহার করা যেতে পারে, যার মধ্যে অন্যান্য ভাইরাল ভেক্টর (যেমন এএভি) এবং নিউক্লিক অ্যাসিড অন্তর্ভুক্ত।