Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá tacaíocht theoranta do CSS sa leagan brabhsálaí atá in úsáid agat. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó mód comhoiriúnachta a mhúchadh in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánfaimid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Ba chóir do veicteoirí géine le haghaidh cóireáil galar scamhógach fibróis chisteach díriú ar na haerbhealaí seolta toisc nach soláthraíonn trasduchtú imeallach scamhógach sochar teiripeach. Tá éifeachtúlacht trasduchtú víreasach bainteach go díreach le ham cónaithe veicteora. Mar sin féin, scaipeann sreabháin seachadta amhail iompróirí géine go nádúrtha isteach sna hailveoli le linn ionanálaithe, agus glantar cáithníní teiripeacha d'aon fhoirm go tapa trí iompar múcasach. Tá sé tábhachtach am cónaithe iompróirí géine sna haerbhealaí a fhadú ach tá sé deacair é a bhaint amach. Is féidir le cáithníní maighnéadacha comhchuingithe iompróra géine is féidir a threorú chuig dromchla na n-aerbhealaí díriú réigiúnach a fheabhsú. Mar gheall ar dhúshláin na léirshamhlú in vivo, níl tuiscint mhaith ar iompar cáithníní maighnéadacha beaga den sórt sin ar dhromchla an aerbhealaigh i láthair réimse maighnéadaigh feidhmeach. Ba é aidhm an staidéir seo íomháú sioncrótrón a úsáid chun gluaiseacht in vivo sraith cáithníní maighnéadacha i dtraicé francaigh ainéistéisithe a léirshamhlú chun dinimic agus patrúin iompair cáithníní aonair agus mórchóir in vivo a scrúdú. Ansin rinneamar measúnú freisin an méadódh seachadadh cáithníní maighnéadacha lentivíreasacha i láthair réimse maighnéadaigh éifeachtúlacht trasduchtú sa francach. traicé. Nochtann íomháú X-gha sioncrótrón iompar cáithníní maighnéadacha i réimsí maighnéadacha seasta agus gluaisteacha in vitro agus in vivo. Ní féidir cáithníní a tharraingt go héasca feadh dhromchla an aerbhealaigh bheo le maighnéid, ach le linn iompair, bíonn na taiscí comhchruinnithe sa réimse radhairc ina bhfuil an réimse maighnéadach is láidre. Méadaíodh éifeachtúlacht trasduchtaithe sé oiread freisin nuair a seachadadh cáithníní maighnéadacha lionsacha i láthair réimse maighnéadaigh. Le chéile, tugann na torthaí seo le fios gur féidir le cáithníní maighnéadacha lionsacha agus réimsí maighnéadacha a bheith ina gcur chuige luachmhar chun spriocdhíriú veicteoir géine a fheabhsú agus leibhéil trasduchtaithe a mhéadú in aerbhealaí seolta in vivo.
Is é is cúis le fibróis chisteach (CF) ná athrú i ngéin aonair ar a dtugtar an rialtóir seoltachta trasmembrane CF (CFTR). Is cainéal ian é an próitéin CFTR atá i láthair i go leor cealla eipitéiliacha ar fud an choirp, lena n-áirítear na haerbhealaí seoltacha, príomhláithreán pataiginéis CF. Bíonn iompar uisce neamhghnácha mar thoradh ar lochtanna CFTR, rud a dhíhiodráitíonn dromchla an aerbhealaigh agus a laghdaíonn doimhneacht shraith leachta dromchla an aerbhealaigh (ASL). Cuireann sé seo isteach freisin ar chumas an chórais iompair mhúcóisilí (MCT) cáithníní agus pataiginí ionanálaithe a ghlanadh ó na haerbhealaí. Is é an sprioc atá againn teiripe géine lentivíreasach (LV) a fhorbairt chun an chóip cheart den ghéin CFTR a sheachadadh agus sláinte ASL, MCT, agus scamhóg a fheabhsú, agus leanúint de theicneolaíochtaí nua a fhorbairt atá in ann na paraiméadair seo a thomhas in vivo1.
Tá veicteoirí LV ar cheann de na príomhiarrthóirí le haghaidh teiripe géine aerbhealaigh CF, go príomha toisc gur féidir leo an géin teiripeach a chomhtháthú go buan i gcealla bonn an aerbhealaigh (gaschealla aerbhealaigh). Tá sé seo tábhachtach toisc gur féidir leo hiodráitiú agus imréiteach múcas gnáth a athbhunú trí dhifreáil i gcealla dromchla aerbhealaigh a bhaineann le CF atá ceartaithe ag géin feidhmiúla, rud a fhágann sochair ar feadh an tsaoil. Ba chóir veicteoirí LV a dhíriú i gcoinne an aerbhealaigh sheolta, mar is anseo a thosaíonn galar scamhógach CF. D’fhéadfadh seachadadh an veicteora níos doimhne isteach sa scamhóg a bheith ina chúis le trasduchtú ailbheolach, ach níl aon tairbhe teiripeach aige seo i CF. Mar sin féin, imirceann sreabháin cosúil le hiompróirí géine go nádúrtha chuig na hailveoli nuair a ionanálú tar éis seachadta3,4 agus glantar cáithníní teiripeacha go tapa isteach sa chuas béil trí MCT. Tá éifeachtúlacht trasduchtú LV bainteach go díreach leis an bhfad ama a fhanann an veicteoir in aice le cealla sprice chun ligean do iontógáil cheallach - an "am cónaithe"5 - a laghdaítear go héasca trí shreabhadh aeir réigiúnach tipiciúil chomh maith le gabháil múcas cáithníní comhordaithe agus MCT. I gcás CF, tá an cumas am cónaithe an LV laistigh den aerbhealach a fhadú tábhachtach chun leibhéil arda trasduchtú a bhaint amach sa réigiún seo, ach go dtí seo bhí sé dúshlánach.
Chun an chonstaic seo a shárú, molaimid go bhféadfadh cáithníní maighnéadacha LV (MPs) cabhrú ar dhá bhealach chomhlántacha. Ar dtús, is féidir iad a threorú go maighnéadach chuig dromchla an aerbhealaigh chun díriú a fheabhsú agus chun cabhrú leis na cáithníní iompróra géine fanacht sa réigiún aerbhealaigh atá ag teastáil; agus ASL) chun bogadh go dtí ciseal cealla 6. Úsáidtear MPs go forleathan mar fheithiclí seachadta drugaí spriocdhírithe nuair a cheanglaíonn siad le hantashubstaintí, drugaí ceimiteiripeacha, nó móilíní beaga eile a cheanglaíonn le seicní cealla nó a cheanglaíonn le gabhdóirí dromchla cealla ábhartha agus a charnaíonn ag láithreáin meall i láthair leictreachais stataigh. Réimsí Maighnéadacha le haghaidh Cóireála Ailse 7. Tá sé mar aidhm ag teicnící “hipirtheirmeacha” eile MPanna a théamh nuair a bhíonn siad nochtaithe do réimsí maighnéadacha luaineacha, rud a scriosann cealla meall. Úsáidtear prionsabal an trasfheictiú maighnéadaigh, ina n-úsáidtear réimse maighnéadach mar ghníomhaire trasfheictiú chun aistriú DNA chuig cealla a fheabhsú, go coitianta in vitro ag baint úsáide as raon veicteoirí géine neamhvíreasacha agus víreasacha le haghaidh línte cille atá deacair a thrasduchtú. Tá éifeachtacht maighnéadtrasfheictiú LV bunaithe, le seachadadh in vitro LV-MPanna chuig líne cille eipitéiliach bronchial daonna i láthair réimse maighnéadaigh statach, rud a mhéadaíonn éifeachtúlacht trasduchtaithe 186 oiread i gcomparáid le veicteoir LV amháin. Tá LV-MP curtha i bhfeidhm freisin ar mhúnla CF in vitro, áit ar mhéadaigh trasfheictiú maighnéadach trasduchtú LV i gcultúir chomhéadain aer-leachta 20 oiread i láthair sputum CF10. Mar sin féin, níor tugadh mórán airde ar mhaighnéadtrasfheictiú orgán in vivo agus níor measúnaíodh é ach i gcúpla ainmhí. staidéir11,12,13,14,15, go háirithe sna scamhóga16,17. Mar sin féin, tá na deiseanna maidir le trasfheistiú maighnéadach i dteiripe scamhóg CF soiléir. Dúirt Tan et al.(2020) go “réiteoidh staidéar cruthúnais choincheapa ar sheachadadh scamhógach nana-cháithníní maighnéadacha éifeachtach an bealach do straitéisí ionanálaithe CFTR amach anseo chun torthaí cliniciúla a fheabhsú in othair CF”6.
Is deacair iompar cáithníní beaga maighnéadacha ar dhromchlaí an aerbhealaigh i láthair réimse maighnéadaigh feidhmeach a shamhlú agus a staidéar, agus dá bhrí sin níl mórán tuisceana air. I staidéir eile, d'fhorbraíomar modh íomháithe X-gha codarsnachta céime bunaithe ar iomadú sioncrótrón (PB-PCXI) chun athruithe beaga in vivo i ndoimhneacht ASL18 agus iompar MCT19,20 a shamhlú agus a chainníochtú go neamh-ionrach chun hiodráitiú dromchla Chanáil gháis a thomhas go díreach agus a úsáid mar tháscaire luath ar éifeachtúlacht na cóireála. Ina theannta sin, úsáideann ár modh meastóireachta MCT cáithníní 10–35 µm ar trastomhas atá comhdhéanta d'alúmana nó de ghloine innéacs athraonta ard mar mharcóirí MCT atá infheicthe ag baint úsáide as PB-PCXI21. Tá an dá theicníc oiriúnach chun raon cineálacha cáithníní a shamhlú, lena n-áirítear MP.
Mar gheall ar a réiteach ard spásúil agus ama, tá ár dteicnící anailíse ASL agus MCT bunaithe ar PB-PCXI oiriúnach go maith chun dinimic agus patrúin iompair cáithníní aonair agus mórcháithníní in vivo a scrúdú chun cabhrú linn teicnící seachadta géine MP a thuiscint agus a bharrfheabhsú. Tagann an cur chuige a úsáidimid anseo ónár staidéir ag baint úsáide as líne bhíoma SPring-8 BL20B2, inar léirigh muid gluaiseacht sreabhach tar éis seachadadh dáileog veicteora bréige isteach sna haerbhealaí sróine agus scamhógacha i lucha chun cabhrú lenár bpatrúin neamh-aonfhoirmeacha léirithe géine a breathnaíodh inár staidéir ainmhithe ar dháileog iompróra géine 3,4 a mhíniú.
Ba é aidhm an staidéir seo an sioncrótrón PB-PCXI a úsáid chun gluaiseachtaí in vivo sraith MPanna i dtraicé francach beo a shamhlú. Dearadh na staidéir íomháithe PB-PCXI seo chun raon MPanna, neart réimse maighnéadach, agus suíomhanna a thástáil chun a n-éifeacht ar ghluaiseacht MP a chinneadh. Rinneamar hipitéis go gcuideodh réimse maighnéadach seachtrach leis an MP seachadta fanacht nó bogadh go dtí an limistéar sprice. Chuir na staidéir seo ar ár gcumas freisin cumraíochtaí maighnéad a aithint a uasmhéadaíonn líon na gcáithníní a choinnítear sa traicé tar éis taiscthe. I ndara sraith staidéar, rinneamar iarracht an chumraíocht is fearr seo a úsáid chun an patrún trasduchtaithe a eascraíonn as seachadadh in vivo LV-MPanna chuig aerbhealach na francach a léiriú, bunaithe ar an toimhde go mbeadh feabhas ar éifeachtúlacht trasduchtaithe LV mar thoradh ar sheachadadh LV-MPanna i gcomhthéacs spriocdhíriú aerbhealaigh.
Rinneadh na staidéir ar ainmhithe go léir de réir phrótacail arna gceadú ag Ollscoil Adelaide (M-2019-060 agus M-2020-022) agus ag Coiste Eitice Ainmhithe Sioncrótrón SPring-8. Rinneadh na turgnaimh de réir threoirlínte ARRIVE.
Rinneadh an íomháú X-ghathach go léir ag líne bhíoma BL20XU ag an sioncrotrón SPring-8 sa tSeapáin, ag baint úsáide as socrú cosúil leis an gceann a thuairiscíodh roimhe seo21,22. Go hachomair, bhí an bosca turgnamhach suite 245 m ón bhfáinne stórála sioncrotrón. Úsáidtear achar 0.6 m ón sampla go dtí an brathadóir le haghaidh staidéir íomháithe cáithníní agus 0.3 m le haghaidh staidéir íomháithe in vivo chun éifeachtaí codarsnachta céime a ghiniúint. Baineadh úsáid as fuinneamh bhíoma monacrómatach de 25 keV. Gabhadh íomhánna ag baint úsáide as tiontaire X-ghathach ardtaifigh (SPring-8 BM3) atá cúpláilte le brathadóir sCMOS. Déanann an tiontaire X-ghathanna a thiontú go solas infheicthe ag baint úsáide as scintillator 10 µm tiubh (Gd3Al2Ga3O12), a dhírítear ansin chuig braiteoir sCMOS ag baint úsáide as cuspóir micreascóip × 10 (NA 0.3). Ba é Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, an tSeapáin) an brathadóir sCMOS le méid eagar de 2048 × 2048 picteilín agus méid picteilín amh de 6.5 × 6.5 µm. Tugann an socrú seo méid picteilín iseatrópach éifeachtach de 0.51 µm agus réimse radhairc de thart ar 1.1 mm × 1.1 mm. Roghnaíodh fad nochta de 100 ms chun an cóimheas comhartha-le-torann de cháithníní maighnéadacha laistigh agus lasmuigh den aerbhealach a uasmhéadú agus na hearraí gluaiseachta a spreagann análú a íoslaghdú. I gcás staidéir in vivo, cuireadh comhla X-ghathach tapa sa chonair X-ghathach chun an dáileog radaíochta a theorannú tríd an bhíoma X-ghathach a bhlocáil idir nochtadh.
Níor úsáideadh an t-iompróir LV in aon staidéir íomháithe SPring-8 PB-PCXI toisc nach bhfuil deimhniú Leibhéal Bithshábháilteachta 2 ag an seomra íomháithe BL20XU. Ina áit sin, roghnaíomar raon MPanna dea-thréithrithe ó dhá sholáthraí tráchtála - a chlúdaíonn raon méideanna, ábhar, tiúchan iarainn agus feidhmeanna - ar dtús chun tuiscint a fháil ar an gcaoi a mbíonn tionchar ag réimsí maighnéadacha ar ghluaiseacht MP laistigh de ribeadáin ghloine, agus ansin in aerbhealaí beo. ar an dromchla. Tá raon méide na n-MPanna idir 0.25 agus 18 μm agus tá siad déanta as réimse ábhar (féach Tábla 1), ach níl comhdhéanamh gach sampla, lena n-áirítear méid na gcáithníní maighnéadacha laistigh den MP, ar eolas.Bunaithe ar ár staidéir MCT fairsinge 19, 20, 21, 23, 24, táimid ag súil gur féidir MPanna chomh beag le 5 μm a fheiceáil ar dhromchla an aerbhealaigh tracheal, mar shampla trí fhrámaí comhleanúnacha a bhaint chun infheictheacht fheabhsaithe ar ghluaiseacht MP a fheiceáil.Tá MP aonair de mhéid 0.25 μm níos lú ná taifeach an fheiste íomháithe, ach meastar go mbraithfidh PB-PCXI a gcodarsnacht toirte agus gluaiseacht an tsreabháin dromchla ar a dtaisctear iad tar éis an taiscthe.
Ullmhaíodh samplaí do gach MP i dTábla 1 i ribeadáin ghloine 20 μl (Drummond Microcaps, PA, SAM) le trastomhas istigh de 0.63 mm. Tá cáithníní corpuscular ar fáil in uisce, agus tá cáithníní CombiMag ar fáil i sreabhán dílseánaigh an mhonaróra. Tá gach feadán leathlíonta le leacht (thart ar 11 μl) agus curtha ar an sealbhóir samplach (féach Fíor 1). Cuireadh na ribeadáin ghloine go cothrománach ar an stáitse samplach sa bhosca íomháithe, faoi seach, agus suiteáladh imill an tsreabháin. Ceanglaíodh maighnéad nicil-bhlaosc cré neamhchoitianta neoidimiam iarainn bórón (NdFeB) 19 mm ar trastomhas (28 mm ar fhad) (N35, uimh. cat. LM1652, Jaycar Electronics, an Astráil) le maighnéadú iarmharach de 1.17 Tesla le stáitse aistriúcháin ar leith chun a shuíomh a athrú go cianda le linn íomháithe. Tosaíonn fáil íomhá X-gha nuair a bhíonn an maighnéad suite thart ar 30 mm os cionn an tsampla, agus faightear íomhánna ag ráta 4 fhráma in aghaidh an tsoicind. Le linn íomháithe, rinneadh an maighnéad a... tugtha gar don fheadán ribeach gloine (thart ar 1 mm ar shiúl) agus ansin aistrithe feadh an fheadáin chun éifeachtaí neart agus suíomh an réimse a mheas.
Socrú íomháithe in vitro ina bhfuil samplaí MP i ribeadáin ghloine ar chéim aistriúcháin xy an tsampla. Tá cosán an bhíoma X-ghathaithe marcáilte le líne poncaithe dearg.
Nuair a bunaíodh infheictheacht in vitro na MPanna, rinneadh tástáil ar fho-thacar díobh in vivo i bhfrancaigh Wistar baineann albino fiáin (~12 sheachtain d'aois, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, an tSeapáin), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, an tSeapáin) agus 4 mg/kg bútórfánól (Vetorphale®, Meiji Seika). Rinneadh na francaigh a ainéistéisiú le meascán de Pharma (an tSeapáin) trí instealladh infhearannach. Tar éis ainéistéise, ullmhaíodh iad le haghaidh íomháithe tríd an bhfionnadh timpeall an traicé a bhaint, feadán intreacheach (ET; cannula iv 16 Ga, Terumo BCT) a chur isteach agus iad a choinneáil ina luí ar phláta íomháithe saincheaptha ina raibh mála teirmeach chun teocht an choirp 22 a choinneáil. Ansin, ceanglaíodh an pláta íomháithe leis an gcéim aistriúcháin samplach sa bhosca íomháithe ag uillinn bheag chun an traicé a ailíniú go cothrománach san íomhá X-gha, mar a thaispeántar i bhFíor. 2a.
(a) Socrú íomháithe in vivo sa bhosca íomháithe SPring-8, tá cosán an bhíoma X-gha marcáilte le líne poncaithe dearg. (b,c) Rinneadh suíomh maighnéad ar an traicé go cianda ag baint úsáide as dhá cheamara IP atá suite go horthagónach. Ar thaobh na láimhe clé den íomhá scáileáin, is féidir an lúb sreinge a shealbhaíonn an ceann a fheiceáil, agus an cannula seachadta ina áit laistigh den fheadán ET.
Ceanglaíodh córas caidéil steallaire rialaithe go cianda (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) ag baint úsáide as steallaire gloine 100 μl le feadánra PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) trí shnáthaid 30 Ga. Marcáil an feadán chun a chinntiú go bhfuil an barr sa suíomh ceart sa traicé agus an feadán ET á chur isteach. Ag baint úsáide as an micreachaidéal, tarraingíodh siar loine an steallaire agus barr an fheadáin tumtha sa sampla MP a bhí le seachadadh. Ansin cuireadh an feadán seachadta luchtaithe isteach sa fheadán inchrínteach, ag cur an bharr laistigh den chuid is láidre dár réimse maighnéadach feidhmeach ionchais. Rialaíodh fáil íomhá ag baint úsáide as brathadóir riospráide ceangailte lenár mbosca ama bunaithe ar Arduino, agus taifeadadh na comharthaí go léir (m.sh. teocht, riospráid, oscailt/dúnadh comhla agus fáil íomhá) ag baint úsáide as Powerlab agus LabChart (AD Instruments, Sydney, an Astráil) 22. Agus íomháú á dhéanamh Nuair nach raibh rochtain ar an imfhálú, suiteáladh dhá cheamara IP (Panasonic BB-SC382) ag thart ar 90° lena chéile agus úsáideadh iad chun suíomh an... maighnéad i gcoibhneas leis an traicé le linn íomháithe (Fíor 2b, c). Chun artifachtaí gluaisne a íoslaghdú, fuarthas íomhá amháin in aghaidh an anála le linn ardchlár an tsreafa taoide deiridh.
Tá maighnéad ceangailte le dara céim ar féidir é a lonnú go cianda ó lasmuigh den tithíocht íomháithe. Rinneadh tástáil ar shuíomhanna agus chumraíochtaí éagsúla maighnéad, lena n-áirítear: Suite ag uillinn thart ar 30° os cionn na traicé (tá na cumraíochtaí a thaispeántar i bhFíor 2a agus 3a); maighnéad amháin os cionn an ainmhí agus an ceann eile thíos, agus na cuaillí socraithe chun a mhealladh (Fíor 3b); maighnéad amháin os cionn an ainmhí agus an ceann eile thíos, agus na cuaillí socraithe chun a dhíbirt (Fíor 3c); agus maighnéad amháin os cionn agus ingearach leis an traicé (Fíor 3d). Nuair a bheidh an t-ainmhí agus an maighnéad cumraithe agus an MP atá le tástáil luchtaithe isteach sa chaidéal steallaire, seachad dáileog 50 μl ag ráta 4 μl/soic agus íomhánna á bhfáil. Ansin bogtar an maighnéad ar ais agus amach feadh nó go cliathánach trasna na traicé agus íomhánna á bhfáil fós.
Cumraíocht maighnéad le haghaidh íomháú in vivo (a) maighnéad aonair os cionn na traicé ag uillinn de thart ar 30°, (b) dhá mhaighnéad socraithe chun a mhealladh, (c) dhá mhaighnéad socraithe chun a dhíbirt, (d) maighnéad aonair os cionn agus ingearach sa traicé. D’fhéach an breathnóir síos ón mbéal go dtí na scamhóga tríd an traicé, agus chuaigh an bhíoma X-ghathaithe trí thaobh clé an fhrancaigh agus d’imigh sé amach as an taobh deas. Bogtar an maighnéad feadh fhad an aerbhealaigh nó ar chlé agus ar dheis os cionn na traicé i dtreo an bhíoma X-ghathaithe.
Chomh maith leis sin, rinneamar iarracht infheictheacht agus iompar cáithníní sna haerbhealaí a chinneadh in éagmais análaithe agus gluaiseachta cairdiach mearbhall. Dá bhrí sin, ag deireadh na tréimhse íomháithe, maraíodh ainmhithe go daonnachtúil i gcás ródháileog pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, SAM; ~65 mg/kg ip). Fágadh roinnt ainmhithe ar an ardán íomháithe, agus nuair a stop an análú agus an buille croí, rinneadh an próiseas íomháithe arís, ag cur dáileog bhreise de MP leis mura raibh aon MP le feiceáil ar dhromchla an aerbhealaigh.
Rinneadh ceartúcháin ar na híomhánna a fuarthas maidir le réimse comhréidh agus réimse dorcha agus ansin cuireadh le chéile iad i scannán (20 fráma in aghaidh an tsoicind; 15-25 × gnáthluas ag brath ar an ráta riospráide) ag baint úsáide as script saincheaptha scríofa i MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Rinneadh na staidéir seachadta veicteoir géine LV go léir ag an tSaoráid Taighde Ainmhithe Saotharlainne in Ollscoil Adelaide agus bhí sé mar aidhm acu torthaí turgnamh SPring-8 a úsáid chun a mheas an bhféadfadh seachadadh LV-MP i láthair réimse maighnéadaigh aistriú géine in vivo a fheabhsú. Chun éifeachtaí MP agus réimse maighnéadaigh a mheas, rinneadh cóireáil ar dhá ghrúpa ainmhithe: tugadh LV-MP le maighnéad curtha i ngrúpa amháin, agus fuair an grúpa eile grúpa rialaithe le LV-MP gan mhaighnéad.
Gineadh veicteoirí géine LV ag baint úsáide as modhanna a thuairiscíodh roimhe seo 25, 26. Léiríonn an veicteoir LacZ an géin béite-galactosidase núicléach-áitithe atá á thiomáint ag an bpromotóir MPSV comhréireach (LV-LacZ), a tháirgeann táirge imoibrithe gorm i gcealla trasduchtaithe, atá le feiceáil i dtosaigh fíocháin scamhógacha agus i rannóga fíocháin. Rinneadh an títreáil i gcultúir chealla trí líon na gcealla LacZ-dearfacha a chomhaireamh de láimh le hemocytometer chun an títrear a ríomh i TU/ml. Déantar iompróirí a chrio-chaomhnú ag -80 °C, a dhíreoite roimh úsáid, agus a cheangal le CombiMag trí mheascadh ag cóimheas 1:1 agus goradh ar oighear ar feadh 30 nóiméad ar a laghad roimh sheachadadh.
Rinneadh francaigh Sprague Dawley gnáth (n = 3/grúpa, ~2-3 a ainéistéisiú go hinpheireatóinéil le meascán de 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, an Astráil) agus 60 mg/kg ketamine (Ilium, an Astráil) instealladh (ip) agus cannúlú béil neamh-mháinliachta le cannula iv 16 Ga. Chun a chinntiú go bhfaigheann fíochán an aerbhealaigh tracheal trasduchtú LV, rinneadh é a choinníollú ag baint úsáide as ár bprótacal suaitheadh ​​meicniúil a thuairiscíodh roimhe seo, ina gcuimlíodh dromchla an aerbhealaigh tracheal go haiseach le cliabh sreinge (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, SAM) 30 s28. Ansin rinneadh riarachán tracheal LV-MP i gcomh-aireachta sábháilteachta bitheolaíche thart ar 10 nóiméad tar éis an suaitheadh.
Cumraíodh an réimse maighnéadach a úsáideadh sa turgnamh seo ar bhealach cosúil leis an staidéar íomháithe X-gha in vivo, leis na maighnéid chéanna á gcoinneáil os cionn na traicé ag baint úsáide as gearrthóga stent driogtha (Fíor 4). Seachadadh toirt 50 μl (2 × 25 μl aliquots) de LV-MP isteach sa traicé (n = 3 ainmhí) ​​ag baint úsáide as pipéad ina raibh barr glóthach mar a thuairiscíodh roimhe seo. Fuair ​​grúpa rialaithe (n = 3 ainmhí) ​​na LV-MPanna céanna gan úsáid a bhaint as maighnéad. Tar éis an instealladh a bheith críochnaithe, baintear an cannula as an bhfeadán ET agus baintear an t-ainmhí as an bhfeadán. Fanann an maighnéad ina áit ar feadh 10 nóiméad, ansin baintear é. Fuair ​​francaigh dáileog fhochraicneach de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, an Astráil) agus ina dhiaidh sin aisiompaíodh an ainéistéise trí instealladh ip de 1 mg/kg hidreaclóiríd atipamazole (Antisedan, Zoetis, an Astráil). Coinníodh francaigh te agus rinneadh monatóireacht orthu go dtí go raibh siad tar éis téarnamh go hiomlán ón ainéistéise.
Gléas seachadta LV-MP i gcomh-aireachta sábháilteachta bitheolaíche. Is féidir mol Luer liathghlas an fheadáin ET a fheiceáil ag gobadh amach as an mbéal agus cuirtear barr glóthach an phípéid a thaispeántar sa phictiúr tríd an bhfeadán ET go dtí an doimhneacht atá ag teastáil isteach sa traicé.
Seachtain amháin tar éis an nós imeachta dáileoige LV-MP, maraíodh na hainmhithe go daonnachtúil trí ionanálú 100% CO2 agus rinneadh measúnú ar léiriú LacZ ag baint úsáide as ár gcóireáil chaighdeánach X-gal. Baineadh na trí fháinne is cartlaigeacha eireaballacha chun a chinntiú nach raibh aon damáiste meicniúil nó coinneáil sreabhán ó shuíomh feadán intreacheach san áireamh san anailís. Gearradh gach traicé go fadaimseartha chun dhá leath a chruthú le haghaidh anailíse, agus cuireadh iad i mias ina raibh rubar silicone (Sylgard, Dow Inc) ag baint úsáide as snáthaid Minutien (Fine Science Tools) chun an dromchla luminal a shamhlú. Deimhníodh dáileadh agus patrún na gcealla trasduchtaithe trí ghrianghrafadóireacht tosaigh ag baint úsáide as micreascóp Nikon (SMZ1500) le ceamara DigiLite agus bogearraí TCapture (Tucsen Photonics, an tSín). Fuarthas íomhánna ag formhéadú 20x (lena n-áirítear an socrú is airde do leithead iomlán na traicé), agus fad iomlán na traicé á íomháú céim ar chéim, ag cinntiú go raibh forluí leordhóthanach idir gach íomhá chun ligean do "fuáil" íomhá. Ansin cuireadh íomhánna ó gach traicé le chéile i... íomhá ilchodach aonair ag baint úsáide as an Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ag baint úsáide as algartam gluaisne plánach. Rinneadh cainníochtú ar limistéir léirithe LacZ in íomhánna ilchodacha den traicé ó gach ainmhí ag baint úsáide as script MATLAB uathoibrithe (R2020a, MathWorks) mar a thuairiscíodh roimhe seo, ag baint úsáide as socruithe 0.35 < Lí < 0.58, Sáithiú > 0.15, agus Luach < 0.7. Trí imlínte an fhíocháin a rianú, gineadh masc de láimh i GIMP v2.10.24 do gach íomhá ilchodach chun an limistéar fíocháin a aithint agus aon bhrath bréagach ón taobh amuigh den fhíochán traicé a chosc. Suimíodh na limistéir dhaite ó na híomhánna ilchodacha go léir ó gach ainmhí chun an limistéar daite iomlán don ainmhí sin a ghiniúint. Roinneadh an limistéar daite ansin ar an limistéar maisc iomlán chun an limistéar normalaithe a ghiniúint.
Cuireadh gach traicé i leabú i paraifín agus gearradh codanna 5 μm. Rinneadh na codanna a fhrithdhaiteadh le dearg neodrach mear ar feadh 5 nóiméad agus fuarthas íomhánna ag baint úsáide as micreascóp Nikon Eclipse E400, ceamara DS-Fi3 agus bogearraí gabhála eilimintí NIS (leagan 5.20.00).
Rinneadh na hanailísí staitistiúla go léir i GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Socraíodh an tábhacht staitistiúil ag p ≤ 0.05. Fíoraíodh an gnáthacht ag baint úsáide as an tástáil Shapiro-Wilk, agus rinneadh measúnú ar na difríochtaí i ndathú LacZ ag baint úsáide as an tástáil t neamhphéireáilte.
Rinneadh scrúdú ar na sé MP a bhfuil cur síos orthu i dTábla 1 ag baint úsáide as PCXI, agus tá cur síos ar an infheictheacht i dTábla 2. Ní raibh dhá MP polaistiréine (MP1 agus MP2; 18 μm agus 0.25 μm, faoi seach) le feiceáil faoi PCXI, ach bhí an chuid eile de na samplaí inaitheanta (tá samplaí le feiceáil i bhFíor 5). Tá MP3 agus MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm agus 0.9 μm, faoi seach) le feiceáil go lag. Cé go raibh cuid de na cáithníní is lú a tástáladh ann, ba é MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) an ceann ba mhó a shoiléire. Tá sé deacair an táirge CombiMag MP6 a fheiceáil. I ngach cás, feabhsaíodh ár gcumas MP a bhrath go suntasach tríd an maighnéad a aistriú ar ais agus amach comhthreomhar leis an ribeadán. Nuair a bhog na maighnéid ar shiúl ón ribeadán, shín na cáithníní i sreanga fada, ach de réir mar a tháinig na maighnéid níos gaire agus a mhéadaigh neart an réimse mhaighnéadaigh, ghiorraigh sreanga na gcáithníní de réir mar a d’imirce na cáithníní i dtreo dhromchla uachtarach an ribeadáin (féach Físeán Forlíontach S1: MP4), ag méadú An dlús na gcáithníní ar an dromchla. Os a choinne sin, nuair a bhaintear an maighnéad as an ribeadán, laghdaíonn neart an réimse agus athraíonn na MPanna i sreanga fada ag síneadh ó dhromchla uachtarach an ribeadáin (féach Físeán Forlíontach S2:MP4). Tar éis don mhaighnéad stopadh ag bogadh, leanann na cáithníní ag bogadh ar feadh tamaill ghairid tar éis dóibh an suíomh cothromaíochta a bhaint amach. De réir mar a ghluaiseann an MP i dtreo agus ar shiúl ó dhromchla uachtarach an ribeadáin, tarraingíonn na cáithníní maighnéadacha an smionagar tríd an sreabhán de ghnáth.
Athraíonn infheictheacht MP faoi PCXI go suntasach idir samplaí. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 agus (d) MP6. Tógadh na híomhánna uile a thaispeántar anseo le maighnéad suite thart ar 10 mm díreach os cionn an ribeadáin. Is boilgeoga aeir atá gafa sna ribeadáin na ciorcail mhóra dealraitheacha, rud a léiríonn go soiléir gnéithe imeall dubh agus bán íomháithe codarsnachta céime. Tá an formhéadú feabhsaithe codarsnachta sa bhosca dearg. Tabhair faoi deara nach bhfuil trastomhais sceitseacha na maighnéad sna figiúirí uile de réir scála agus go bhfuil siad thart ar 100 uair níos mó ná mar a thaispeántar.
De réir mar a aistrítear an maighnéad ar chlé agus ar dheis feadh bharr an ribeadáin, athraíonn uillinn an tsreang MP chun ailíniú leis an maighnéad (féach Fíor 6), rud a léiríonn línte an réimse mhaighnéadaigh. I gcás MP3-5, tar éis don chorda uillinn tairsí a bhaint amach, tarraingítear na cáithníní feadh dhromchla uachtarach an ribeadáin. Is minic a bhíonn MPanna ag bailiú i ngrúpaí níos mó gar don áit a bhfuil an réimse maighnéadach is láidre (féach Físeán Forlíontach S3:MP5). Tá sé seo soiléir go háirithe freisin nuair a dhéantar íomháú gar do cheann an ribeadáin, rud a fhágann go gcomhiomlánaíonn agus go dtiúchann MPanna ag an gcomhéadan sreabhach-aeir. Níor tarraingíodh cáithníní in MP6, a bhí níos deacra a aithint ná MP3-5, agus an maighnéad ag bogadh feadh an ribeadáin, ach dhealaigh na sreanga MP, ag fágáil na gcáithníní sa réimse radhairc (féach Físeán Forlíontach S4:MP6). I gcásanna áirithe, nuair a laghdaíodh an réimse maighnéadach feidhmeach tríd an maighnéad a bhogadh achar mór ón suíomh íomháithe, chuaigh aon MPanna a bhí fágtha síos go mall go dtí dromchla bun an fheadáin de bharr domhantarraingthe agus iad ag fanacht sa tsreang (féach Físeán Forlíontach S5: MP3).
Athraíonn uillinn an tsreang MP de réir mar a aistrítear an maighnéad ar dheis os cionn an ribeadáin. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 agus (d) MP6. Tá an formhéadú feabhsaithe codarsnachta sa bhosca dearg. Tabhair faoi deara go bhfuil na físeáin fhorlíontacha faisnéiseach mar go nochtann siad struchtúr cáithníní tábhachtach agus faisnéis dhinimiciúil nach féidir a shamhlú sna híomhánna statach seo.
Léirigh ár dtástálacha go n-éascaíonn bogadh mall an mhaighnéid ar ais agus ar aghaidh feadh an traicé léirshamhlú MP i gcomhthéacs gluaiseachta casta in vivo.Níor deineadh tástáil in vivo mar nach raibh coirníní polaistiréine (MP1 agus MP2) le feiceáil sa ribeadán.Rinneadh tástáil in vivo ar gach ceann de na ceithre MP eile agus ais fhada an mhaighnéid cumraithe os cionn an traicé ag uillinn thart ar 30° leis an ingearach (féach Fíor 2b agus 3a), toisc gur eascair slabhraí MP níos faide as seo agus gur éifeachtaí é ná cumraíocht an mhaighnéid a foirceannadh.Níor braitheadh ​​MP3, MP4 agus MP6 i dtraicé aon ainmhithe beo.Nuair a rinneadh íomháú ar aerbhealaí francach tar éis na hainmhithe a mharú go daonna, d'fhan na cáithníní dofheicthe fiú nuair a cuireadh toirt bhreise leis ag baint úsáide as caidéal steallaire.Bhí an cion ocsaíd iarainn is airde ag MP5 agus ba é an t-aon cháithnín le feiceáil é, agus dá bhrí sin úsáideadh é chun iompar in vivo MP a mheas agus a thréithriú.
Mar thoradh ar an maighnéad a chur thar an traicé le linn seachadadh MP, bhí go leor MPanna, ach ní iad uile, comhchruinnithe i réimse an radhairc. Is fearr a fheictear cáithníní a théann isteach sa traicé in ainmhithe a íobairtíodh go daonna.Fíor 7 agus Físeán Forlíontach S6: Taispeánann MP5 gabháil agus ailíniú maighnéadach tapa cáithníní ar dhromchla na traicé ventral, rud a léiríonn gur féidir MPanna a threorú chuig réigiúin inmhianaithe den traicé.Nuair a bhíothas ag cuardach níos distal feadh na traicé tar éis seachadadh MP, fuarthas roinnt MPanna níos gaire don carina, rud a thugann le fios nach raibh neart an réimse maighnéadaigh leordhóthanach chun na MPanna go léir a bhailiú agus a choinneáil, toisc gur seachadadh iad tríd an réigiún a raibh an neart réimse maighnéadaigh uasta aige le linn an phróisis sreabhach.Mar sin féin, bhí tiúchain MP iar-bhreithe níos airde timpeall an limistéir íomháithe, rud a thugann le fios gur fhan go leor MPanna i réigiúin an aerbhealaigh inarb airde an neart réimse maighnéadaigh feidhmeach.
Íomhánna ó (a) roimh agus (b) tar éis seachadadh MP5 isteach i dtraicé francaigh a ndearnadh eotanáis orthu le déanaí agus an maighnéad suite díreach os cionn an limistéir íomháithe. Tá an limistéar íomháithe suite idir an dá fháinne cartlaige. Roimh sheachadadh MP, bíonn roinnt sreabhán san aerbhealach. Tá an formhéadú feabhsaithe codarsnachta sa bhosca dearg. Is ón bhfíseán a thaispeántar i bhFíseán Forlíontach S6:MP5 na híomhánna seo.
Mar thoradh ar aistriú an mhaighnéid feadh an traicé in vivo, d’athraigh an slabhra MP uillinn laistigh de dhromchla an aerbhealaigh ar bhealach cosúil leis an méid a fheictear i ribeadáin (féach Fíor 8 agus Físeán Forlíontach S7:MP5). Mar sin féin, inár staidéar, ní fhéadfaí MPanna a tharraingt feadh dhromchla an aerbhealaigh bheo mar a d’fhéadfaí le ribeadáin. I gcásanna áirithe, rachaidh an slabhra MP níos faide de réir mar a ghluaiseann an maighnéad ar chlé agus ar dheis. Is suimiúil an rud é gur aimsigh muid freisin go n-athraíonn an tslabhra cáithníní doimhneacht an tsraith sreabhach dromchla nuair a bhogtar an maighnéad go fadaimseartha feadh an traicé, agus go leathnaíonn sé nuair a bhogtar an maighnéad go díreach os a chionn agus nuair a rothlaítear an tslabhra cáithníní go suíomh ingearach (féach Físeán Forlíontach S7). : MP5 ag 0:09, bun ar dheis). D'athraigh an patrún gluaiseachta tréith nuair a aistríodh an maighnéad trasna barr an traicé go cliathánach (is é sin, ar chlé nó ar dheis an ainmhí seachas feadh fhad an traicé). Bhí na cáithníní fós le feiceáil go soiléir agus iad ag bogadh, ach nuair a baineadh an maighnéad as an traicé, bhí barr na sreinge cáithníní le feiceáil (féach Físeán Forlíontach S8:MP5, ag tosú ag 0:08). Tá sé seo ag teacht leis an iompar MP a breathnaíodh againn faoi réimse maighnéadach feidhmeach i ribeadán gloine.
Íomhánna samplacha a thaispeánann MP5 i dtraicé francaigh bheo ainéistéisithe. (a) Úsáidtear an maighnéad chun íomhánna a fháil os cionn agus ar chlé na traicé, ansin (b) tar éis an maighnéad a bhogadh ar dheis. Tá an formhéadú feabhsaithe codarsnachta sa bhosca dearg. Is ón bhfíseán a thaispeántar i bhFíseán Forlíontach S7:MP5 na híomhánna seo.
Nuair a bhí an dá phol cumraithe i dtreoshuíomh thuaidh-theas os cionn agus faoi bhun na traicé (i.e. ag mealladh; Fíor 3b), bhí na cordaí MP níos faide agus bhí siad suite ar bhalla taobh na traicé seachas ar dhromchla droma na traicé (féach Físeán Forlíontach S9:MP5). Mar sin féin, níor braitheadh ​​tiúchain arda cáithníní ag suíomh amháin (i.e., dromchla droma na traicé) tar éis seachadadh sreabhán nuair a úsáideadh gléas dé-mhaighnéadach, rud a tharlaíonn de ghnáth nuair a úsáidtear gléas aon-mhaighnéadach. Ansin nuair a bhí maighnéad amháin cumraithe chun na cuaillí a dhíbirt droim ar ais (Fíor 3c), níor chosúil go raibh méadú tagtha ar líon na gcáithníní a bhí le feiceáil sa réimse radhairc tar éis seachadta. Tá socrú an dá chumraíocht dé-mhaighnéadach dúshlánach mar gheall ar na neart ard réimse maighnéadach a tharraingíonn nó a bhrúnn na maighnéid, faoi seach. Ansin athraíodh an socrú go maighnéad aonair comhthreomhar leis an aerbhealach ach ag dul tríd an aerbhealach ag 90 céim ionas go dtrasnódh na línte réimse balla na traicé go horthogonach (Fíor 3d), treoshuíomh atá deartha chun a chinneadh an bhféadfaí comhiomlánú cáithníní ar an mballa taobh a fheiceáil. Mar sin féin, i Sa chumraíocht seo, ní raibh aon ghluaiseacht inaitheanta de charnadh MP ná gluaiseacht maighnéad ann. Bunaithe ar na torthaí seo go léir, roghnaíodh cumraíocht aon-mhaighnéid, treoshuíomh 30 céim (Fíor 3a) le haghaidh staidéir iompróirí géine in vivo.
Nuair a rinneadh íomháú arís agus arís eile den ainmhí díreach tar éis marú daonna, chiallaigh easpa gluaiseachta mearbhall fíocháin go bhféadfaí línte cáithníní níos míne agus níos giorra a aithint sa réimse idirchondral soiléir, "crithchruthach" i gcomhréir le gluaiseacht aistriúcháin an mhaighnéid. Mar sin féin, ní féidir láithreacht agus gluaiseacht cáithníní MP6 a fheiceáil go soiléir fós.
Ba é 1.8 × 108 TU/ml an teideal LV-LacZ, agus tar éis meascadh 1:1 le CombiMag MP (MP6), fuair na hainmhithe dáileog tracheal 50 μl de fheithicil LV 9 × 107 TU/ml (i.e. 4.5 × 106 TU/francach). Sna staidéir seo, in ionad an maighnéad a aistriú le linn saothair, shocraíomar an maighnéad in aon áit amháin chun a fháil amach an bhféadfaí (a) trasduchtú LV a fheabhsú i gcomparáid le seachadadh veicteoir in éagmais réimse maighnéadaigh, agus (b) an bhféadfaí é a dhíriú. Déantar cealla aerbhealaigh a thrasduchtú chuig réigiúin sprice maighnéadacha an aerbhealaigh uachtaraigh.
Níor chosúil go raibh drochthionchar ag láithreacht maighnéid agus úsáid CombiMag i dteannta veicteoirí LV ar shláinte ainmhithe, mar a bhí ag ár bprótacal seachadta veicteoir LV caighdeánach. Léirigh íomhánna tosaigh den réigiún tracheal a ndearnadh suaitheadh ​​meicniúil air (Fíor Forlíontach 1) go raibh leibhéil trasduchtúcháin i bhfad níos airde sa ghrúpa ainmhithe a ndearnadh cóireáil orthu le LV-MP nuair a bhí an maighnéad i láthair (Fíor 9a). Ní ​​raibh ach méid beag de dhaite LacZ gorm i láthair sa ghrúpa rialaithe (Fíor 9b). Léirigh cainníochtú na limistéar dhaite X-Gal normalaithe gur tháirg riarachán LV-MP i láthair réimse maighnéadaigh feabhas thart ar 6 huaire (Fíor 9c).
Samplaí d’íomhánna ilchodacha a thaispeánann trasduchtú traicéach ag LV-MP (a) i láthair réimse maighnéadaigh agus (b) in éagmais maighnéid. (c) Feabhsú suntasach ó thaobh staitisticí de i limistéar trasduchtú LacZ normalaithe laistigh den traicé agus an maighnéad á úsáid (*p = 0.029, tástáil-t, n = 3 in aghaidh an ghrúpa, meán ± SEM).
Léirigh rannóga ruaimnithe neodracha gasta (sampla a thaispeántar i bhFíor Fhorlíontach 2) cealla ruaimnithe le LacZ i láthair i bpatrún agus i suíomh cosúil leis an méid a tuairiscíodh roimhe seo.
Is dúshlán mór é fós do theiripe géine an aerbhealaigh ná suíomh cruinn na gcáithníní iompróra chuig réigiúin spéise agus ardleibhéil éifeachtúlachta trasduchtaithe a bhaint amach sa scamhóg ghluaiste i láthair sreabhadh aeir agus imréiteach gníomhach múcas. I gcás iompróirí LV atá deartha chun galar aerbhealaigh CF a chóireáil, bhí méadú ar am cónaithe na gcáithníní iompróra laistigh de na haerbhealaí seolta ina sprioc deacair go dtí seo. Mar a léirigh Castellani et al., tá buntáistí ag baint le húsáid réimsí maighnéadacha chun trasduchtú a fheabhsú i gcomparáid le modhanna seachadta géine eile amhail leictreaphórú, toisc gur féidir leis simplíocht, cost-éifeachtúlacht, suíomh seachadta, éifeachtúlacht mhéadaithe, agus amanna goradáin níos giorra, agus b'fhéidir dáileog iompróra níos lú10, a chomhcheangal. Mar sin féin, níor cuireadh síos riamh ar thaisceadh in vivo agus ar iompar cáithníní maighnéadacha sna haerbhealaí faoi thionchar fórsaí maighnéadacha seachtracha, agus níor léiríodh indéantacht an mhodha seo in vivo chun leibhéil léirithe géine a fheabhsú in aerbhealaí beo slána.
Léirigh ár dturgnaimh sioncrótrón PCXI in vitro go raibh na cáithníní uile a ndearnamar tástáil orthu, seachas MP polaistiréin, le feiceáil sa socrú íomháithe a d'úsáideamar. I láthair réimse maighnéadaigh, cruthaíonn MPanna sreinge a bhfuil a bhfaid bainteach le cineál cáithníní agus neart an réimse mhaighnéadaigh (i.e. gaireacht agus gluaiseacht an mhaighnéid). Mar a thaispeántar i bhFíor 10, cruthaítear na sreinge a bhreathnaímid mar gheall ar gach cáithnín aonair a bheith maighnéadaithe agus a réimse maighnéadach áitiúil féin a spreagadh. Fágann na réimsí ar leithligh seo go gcomhiomlánaíonn agus go gceanglaíonn cáithníní comhchosúla eile, le gluaiseachtaí grúpa cosúil le sreinge mar gheall ar fhórsaí áitiúla ó fhórsaí tarraingteacha agus athfhillteacha áitiúla cáithníní eile.
Sceitse a thaispeánann (a,b) traenacha cáithníní a ghintear taobh istigh de ribeadáin líonta le sreabhán agus (c,d) traicé líonta le haer. Tabhair faoi deara nach bhfuil na ribeadáin agus an traicé tarraingthe de réir scála. Tá cur síos ar an MP i bPainéal (a) freisin, ina bhfuil cáithníní Fe3O4 eagraithe i sreinge.
Nuair a bogadh an maighnéad os cionn an ribeadáin, shroich uillinn an tsreang cháithníní tairseach chriticiúil do MP3-5 ina raibh Fe3O4, agus ina dhiaidh sin níor fhan an tsreang cháithníní sa suíomh bunaidh a thuilleadh, ach bhog sí feadh an dromchla go suíomh nua. maighnéad. Is dócha go dtarlóidh an éifeacht seo toisc go bhfuil dromchla an ribeadáin ghloine réidh go leor chun an ghluaiseacht seo a cheadú. Is suimiúil nár iompraigh MP6 (CombiMag) ar an mbealach seo, b'fhéidir toisc go raibh na cáithníní níos lú, go raibh bratuithe nó muirir dhromchla éagsúla orthu, nó gur chuir sreabhán iompróra dílseánaigh isteach ar a gcumas bogadh. Tá codarsnacht íomhá na gcáithníní CombiMag níos laige freisin, rud a thugann le fios go bhféadfadh dlúis chomhchosúla a bheith ag an sreabhán agus na cáithníní agus dá bhrí sin nach mbogann siad go héasca i dtreo a chéile. Is féidir le cáithníní dul i bhfostú freisin má ghluaiseann an maighnéad ró-thapa, rud a thugann le fios nach féidir le neart an réimse mhaighnéadaigh an fhrithchuimilt idir cáithníní sa sreabhán a shárú i gcónaí, rud a thugann le fios nach ionadh é b'fhéidir go bhfuil neart an réimse mhaighnéadaigh agus an fad idir an maighnéad agus an limistéar sprice an-tábhachtach. Le chéile, tugann na torthaí seo le fios freisin, cé gur féidir le maighnéid go leor MPanna a ghabháil a shreabhann tríd an limistéar sprice, nach dócha gur féidir brath ar mhaighnéid chun bogadh. Cáithníní CombiMag feadh dhromchla an traicé. Dá bhrí sin, táimid den tuairim gur cheart do staidéir LV-MP in vivo réimsí maighnéadacha statach a úsáid chun díriú go fisiciúil ar réigiúin shonracha den chrann aerbhealaigh.
Nuair a sheachadtar cáithníní isteach sa chorp, is deacair iad a aithint i gcomhthéacs fíochán coirp casta atá ag gluaiseacht, ach feabhsaíodh an cumas iad a bhrath tríd an maighnéad a aistriú go cothrománach os cionn an traicé chun na sreanga MP a “luascadh”. Cé gur féidir íomháú beo a dhéanamh, is fusa gluaiseacht na gcáithníní a aithint a luaithe a bheidh an t-ainmhí maraithe go daonna. Go ginearálta, bhí tiúchan MP is airde ag an suíomh seo nuair a bhí an maighnéad suite os cionn an limistéir íomháithe, cé gur aimsíodh roinnt cáithníní níos faide feadh an traicé de ghnáth. I gcodarsnacht le staidéir in vitro, ní féidir cáithníní a tharraingt feadh an traicé tríd an maighnéad a aistriú. Tá an fhionnachtain seo comhsheasmhach leis an gcaoi a bpróiseálann an múcas a chlúdaíonn dromchla na traicé cáithníní ionanálaithe de ghnáth, ag gaisteáil iad sa mhúcas agus ag glanadh iad ina dhiaidh sin tríd an meicníocht imréitigh múcasiliach.
Rinneamar hipitéis go bhféadfadh úsáid maighnéid le haghaidh a mhealladh os cionn agus faoi bhun na traicé (Fíor 3b) réimse maighnéadach níos aonfhoirmí a bheith mar thoradh air, seachas réimse maighnéadach atá an-tiubhaithe ag pointe amháin, rud a d’fhéadfadh dáileadh níos aonfhoirmí cáithníní a bheith mar thoradh air. Mar sin féin, ní bhfuaireamar fianaise shoiléir inár staidéar réamhchéime chun tacú leis an hipitéis seo. Mar an gcéanna, níor tharla níos mó taiscthe cáithníní sa limistéar íomháithe mar thoradh ar phéire maighnéad a chumrú chun iad a dhíbirt (Fíor 3c). Léiríonn an dá thoradh seo nach bhfeabhsaíonn an socrú dé-mhaighnéad rialú áitiúil ar spriocdhíriú MP go suntasach, agus go bhfuil sé deacair na fórsaí maighnéadacha láidre a eascraíonn as sin a chumrú, rud a fhágann go bhfuil an cur chuige seo níos lú praiticiúil. Ar an gcaoi chéanna, níor mhéadaigh treoshuíomh an mhaighnéid os cionn agus tríd an traicé (Fíor 3d) líon na gcáithníní a coinníodh sa limistéar íomháithe ach an oiread. B’fhéidir nach n-éireoidh le cuid de na cumraíochtaí malartacha seo toisc go mbíonn neart réimse maighnéadach níos ísle laistigh den limistéar taiscthe mar thoradh orthu. Dá bhrí sin, meastar gurb é an chumraíocht maighnéad uillinn 30 céim aonair (Fíor 3a) an modh is éasca agus is éifeachtaí le haghaidh tástála in vivo.
Léirigh an staidéar LV-MP nuair a comhcheanglaíodh veicteoirí LV le CombiMag agus a seachadadh tar éis suaitheadh ​​fisiceach i láthair réimse maighnéadaigh, gur mhéadaigh leibhéil trasduchtaithe sa traicé go suntasach i gcomparáid leis na rialuithe. Bunaithe ar na staidéir íomháithe sioncrótrón agus ar thorthaí LacZ, is cosúil gur éirigh leis an réimse maighnéadach an LV a chaomhnú laistigh den traicé agus líon na gcáithníní veicteora a chuaigh isteach go domhain isteach sa scamhóg láithreach a laghdú. D’fhéadfadh feabhsuithe spriocdhírithe den sórt sin éifeachtúlacht níos airde a bheith mar thoradh orthu agus teidil sheachadadh, trasduchtú lasmuigh den sprioc, fo-iarsmaí athlastacha agus imdhíonachta, agus costais iompróra géine á laghdú. Rud tábhachtach, de réir an mhonaróra, is féidir CombiMag a úsáid i gcomhar le modhanna eile aistrithe géine, lena n-áirítear le veicteoirí víreasacha eile (mar shampla AAV) agus aigéid núicléasacha.