Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir una assistència continuada, mostrarem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Els vectors gènics per al tractament de la malaltia pulmonar amb fibrosi quística s'han de dirigir a les vies respiratòries conductores, ja que la transducció pulmonar perifèrica no proporciona beneficis terapèutics. L'eficiència de la transducció viral està directament relacionada amb el temps de residència del vector. Tanmateix, els fluids d'administració, com ara els portadors de gens, es difonen naturalment als alvèols durant la inspiració i les partícules terapèutiques de qualsevol forma s'eliminen ràpidament mitjançant el transport mucociliar. Prolongar el temps de residència dels portadors de gens a les vies respiratòries és important però difícil d'aconseguir. Les partícules magnètiques conjugades amb portadors de gens que es poden dirigir a la superfície de les vies respiratòries poden millorar la focalització regional. A causa dels reptes de la visualització in vivo, el comportament d'aquestes petites partícules magnètiques a la superfície de les vies respiratòries en presència d'un camp magnètic aplicat no es coneix bé. L'objectiu d'aquest estudi va ser utilitzar imatges de sincrotró per visualitzar el moviment in vivo d'una sèrie de partícules magnètiques a la tràquea de rates anestesiades per examinar la dinàmica i els patrons del comportament de les partícules individuals i massives in vivo. També vam avaluar si l'administració de partícules magnètiques lentivirals en presència d'un camp magnètic augmentaria l'eficiència de la transducció a la tràquea de la rata. Sincrotró Les imatges de raigs X revelen el comportament de les partícules magnètiques en camps magnètics estacionaris i en moviment in vitro i in vivo. Les partícules no es poden arrossegar fàcilment per la superfície de les vies respiratòries vives amb imants, però durant el transport, els dipòsits es concentren al camp de visió on el camp magnètic és més fort. L'eficiència de la transducció també es va multiplicar per sis quan es van administrar partícules magnètiques lentivirals en presència d'un camp magnètic. En conjunt, aquests resultats suggereixen que les partícules magnètiques lentivirals i els camps magnètics poden ser enfocaments valuosos per millorar la focalització dels vectors gènics i augmentar els nivells de transducció en les vies respiratòries conductores in vivo.
La fibrosi quística (FQ) està causada per la variació d'un únic gen anomenat regulador de la conductància transmembrana de la FQ (CFTR). La proteïna CFTR és un canal iònic present en moltes cèl·lules epitelials de tot el cos, incloses les vies respiratòries conductores, un lloc important de la patogènesi de la FQ. Els defectes del CFTR provoquen un transport anormal d'aigua, deshidratant la superfície de les vies respiratòries i reduint la profunditat de la capa líquida de la superfície de les vies respiratòries (ASL). Això també afecta la capacitat del sistema de transport mucociliar (MCT) per eliminar partícules i patògens inhalats de les vies respiratòries. El nostre objectiu és desenvolupar una teràpia gènica lentiviral (LV) per proporcionar la còpia correcta del gen CFTR i millorar la salut ASL, MCT i pulmonar, i continuar desenvolupant noves tecnologies capaces de mesurar aquests paràmetres in vivo1.
Els vectors de veïns esquerre (VE) són un dels principals candidats per a la teràpia gènica de les vies respiratòries en la fibrosi quística (FQ), principalment perquè poden integrar permanentment el gen terapèutic a les cèl·lules basals de les vies respiratòries (cèl·lules mare de les vies respiratòries). Això és important perquè poden restaurar la hidratació normal i l'eliminació de moc diferenciant-se en cèl·lules superficials de les vies respiratòries associades a la FQ corregides per gens funcionals, la qual cosa resulta en beneficis de per vida. Els vectors de VE s'han de dirigir contra la via respiratòria conductora, ja que és aquí on comença la malaltia pulmonar amb FQ. L'administració del vector més profundament al pulmó pot provocar una transducció alveolar, però això no té cap benefici terapèutic en la FQ. Tanmateix, els fluids com els portadors de gens migren naturalment als alvèols després de la inspiració després de l'administració3,4 i les partícules terapèutiques s'eliminen ràpidament a la cavitat oral mitjançant la TCM. L'eficiència de la transducció del VE està directament relacionada amb el temps que el vector roman al costat de les cèl·lules diana per permetre l'absorció cel·lular, el "temps de residència"5, que es redueix fàcilment mitjançant el flux d'aire regional típic, així com la captura coordinada de moc de partícules i la TCM. Per a la FQ, la capacitat de prolongar el temps de residència del VE dins de la via respiratòria és important per aconseguir alts nivells de transducció en aquesta regió, però fins ara ha estat un repte.
Per superar aquest obstacle, suggerim que les partícules magnètiques (MP) de les vies respiratòries inferiors (LV) poden ajudar de dues maneres complementàries. En primer lloc, poden ser guiades magnèticament cap a la superfície de les vies respiratòries per millorar la focalització i ajudar les partícules portadores de gens a residir a la regió desitjada de les vies respiratòries; i (ASL) per moure's a la capa cel·lular 6. Les MP s'han utilitzat àmpliament com a vehicles d'administració de fàrmacs dirigits quan s'uneixen a anticossos, fàrmacs quimioterapèutics o altres molècules petites que s'uneixen a les membranes cel·lulars o s'uneixen a receptors rellevants de la superfície cel·lular i s'acumulen en llocs tumorals en presència d'electricitat estàtica. Camps magnètics per al tractament del càncer 7. Altres tècniques "hipertèrmiques" tenen com a objectiu escalfar els MP quan s'exposen a camps magnètics oscil·lants, destruint així les cèl·lules tumorals. El principi de la transfecció magnètica, en què un camp magnètic s'utilitza com a agent de transfecció per millorar la transferència d'ADN a les cèl·lules, s'utilitza habitualment in vitro utilitzant una gamma de vectors gènics no virals i virals per a línies cel·lulars difícils de transduir. S'ha establert l'eficàcia de la magnetotransfecció de LV, amb l'administració in vitro de MP-LV a una línia cel·lular epitelial bronquial humana en presència d'un camp magnètic estàtic, augmentant l'eficiència de la transducció en 186 vegades en comparació amb el vector LV sol. Els MP-LV també s'han aplicat a un model de fibrosi quística in vitro, on la transfecció magnètica va augmentar la transducció de LV en cultius d'interfície aire-líquid en 20 vegades en presència d'esput de fibrosi quística10. Tanmateix, la magnetotransfecció in vivo d'òrgans ha rebut relativament poca atenció i només s'ha avaluat en uns quants estudis amb animals11,12,13,14,15, especialment en el pulmons16,17. No obstant això, les oportunitats per a la transfecció magnètica en la teràpia pulmonar amb fibrosi quística són clares. Tan et al. (2020) van afirmar que "un estudi de prova de concepte de l'administració pulmonar eficient de nanopartícules magnètiques obrirà el camí per a futures estratègies d'inhalació de CFTR per millorar els resultats clínics en pacients amb fibrosi quística"6.
El comportament de petites partícules magnètiques a les superfícies de les vies respiratòries en presència d'un camp magnètic aplicat és difícil de visualitzar i estudiar, i per tant s'entén poc. En altres estudis, vam desenvolupar un mètode d'imatge de raigs X de contrast de fase basat en la propagació de sincrotró (PB-PCXI) per visualitzar i quantificar de manera no invasiva canvis minúsculs in vivo en la profunditat de l'ASL18 i el comportament de l'MCT19,20 per mesurar directament la hidratació de la superfície del canal de gas i utilitzar-lo com a indicador precoç de l'eficàcia del tractament. A més, el nostre mètode d'avaluació MCT utilitza partícules de 10-35 µm de diàmetre compostes d'alúmina o vidre d'alt índex de refracció com a marcadors MCT visibles mitjançant PB-PCXI21. Ambdues tècniques són adequades per a la visualització d'una gamma de tipus de partícules, incloses les MP.
A causa de la seva alta resolució espacial i temporal, les nostres tècniques d'anàlisi ASL i MCT basades en PB-PCXI són adequades per examinar la dinàmica i els patrons del comportament de partícules individuals i massives in vivo per ajudar-nos a comprendre i optimitzar les tècniques d'administració de gens MP. L'enfocament que emprem aquí deriva dels nostres estudis utilitzant la línia de llum SPring-8 BL20B2, en què vam visualitzar el moviment de fluids després de l'administració de dosis vectorials simulades a les vies respiratòries nasals i pulmonars de ratolins per ajudar a explicar els nostres patrons d'expressió gènica no uniformes observats en els nostres estudis amb animals amb dosis de portadors de gens 3,4.
L'objectiu d'aquest estudi era utilitzar el sincrotró PB-PCXI per visualitzar els moviments in vivo d'una sèrie de MP a la tràquea de rates vives. Aquests estudis d'imatge PB-PCXI van ser dissenyats per provar una gamma de MP, intensitats de camp magnètic i ubicacions per determinar el seu efecte sobre el moviment dels MP. Vam plantejar la hipòtesi que un camp magnètic aplicat externament ajudaria el MP administrat a mantenir-se o moure's a la zona objectiu. Aquests estudis també ens van permetre identificar configuracions d'imants que maximitzen el nombre de partícules retingudes a la tràquea després de la deposició. En una segona sèrie d'estudis, vam intentar utilitzar aquesta configuració òptima per demostrar el patró de transducció resultant de l'administració in vivo de LV-MP a les vies respiratòries de la rata, basant-nos en la suposició que l'administració de LV-MP en el context de la focalització de les vies respiratòries donaria lloc a una millora de l'eficiència de transducció del LV.
Tots els estudis amb animals es van dur a terme d'acord amb els protocols aprovats per la Universitat d'Adelaida (M-2019-060 i M-2020-022) i el Comitè d'Ètica Animal del Sincrotró SPring-8. Els experiments es van dur a terme d'acord amb les directrius d'ARRIVE.
Totes les imatges de raigs X es van realitzar a la línia de llum BL20XU del sincrotró SPring-8 al Japó, utilitzant una configuració similar a la descrita anteriorment21,22. Breument, la caixa experimental estava situada a 245 m de l'anell d'emmagatzematge del sincrotró. Es fa servir una distància mostra-detector de 0,6 m per a estudis d'imatges de partícules i de 0,3 m per a estudis d'imatges in vivo per generar efectes de contrast de fase. Es va utilitzar una energia de feix monocromàtica de 25 keV. Les imatges es van capturar mitjançant un convertidor de raigs X d'alta resolució (SPring-8 BM3) acoblat a un detector sCMOS. El convertidor converteix els raigs X en llum visible mitjançant un centellejador de 10 µm de gruix (Gd3Al2Ga3O12), que després es dirigeix ​​a un sensor sCMOS mitjançant un objectiu de microscopi × 10 (NA 0,3). El detector sCMOS va ser Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japó) amb una mida de matriu de 2048 × 2048 píxels i una mida de píxel en brut de 6,5 × 6,5 µm. Aquesta configuració produeix una mida de píxel isotròpic efectiva de 0,51 µm i un camp de visió d'aproximadament 1,1 mm × 1,1 mm. Es va triar una longitud d'exposició de 100 ms per maximitzar la relació senyal-soroll de les partícules magnètiques dins i fora de les vies respiratòries i minimitzar els artefactes de moviment induïts per la respiració. Per a estudis in vivo, es va col·locar un obturador ràpid de raigs X a la trajectòria dels raigs X per limitar la dosi de radiació bloquejant el feix de raigs X entre exposicions.
El portador de LV no es va utilitzar en cap estudi d'imatge SPring-8 PB-PCXI perquè la cambra d'imatge BL20XU no té la certificació de Nivell 2 de Bioseguretat. En canvi, vam seleccionar una gamma de micromembranes ben caracteritzades de dos proveïdors comercials, que cobreixen una gamma de mides, materials, concentracions de ferro i aplicacions, primer per entendre com els camps magnètics afecten el moviment dels micromembranes dins dels capil·lars de vidre i després a les vies respiratòries vives. a la superfície. Els MP varien en mida de 0,25 a 18 μm i estan fets d'una varietat de materials (vegeu la Taula 1), però la composició de cada mostra, inclosa la mida de les partícules magnètiques dins del MP, és desconeguda. Basant-nos en els nostres extensos estudis MCT 19, 20, 21, 23, 24, esperem que es puguin veure MP tan petits com 5 μm a la superfície de les vies respiratòries traqueals, per exemple, restant fotogrames consecutius per veure una visibilitat millorada del moviment del MP. Un únic MP de 0,25 μm és més petit que la resolució del dispositiu d'imatges, però s'espera que el PB-PCXI detecti el seu contrast de volum i el moviment del fluid superficial sobre el qual es dipositen després de la deposició.
Les mostres per a cada MP de la Taula 1 es van preparar en capil·lars de vidre de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EUA) amb un diàmetre interior de 0,63 mm. Les partícules corpusculars estan disponibles en aigua, mentre que les partícules CombiMag estan disponibles en el fluid patentat pel fabricant. Cada tub s'omple fins a la meitat amb líquid (aproximadament 11 μl) i es col·loca al portamostres (vegeu la Figura 1). Els capil·lars de vidre es van col·locar horitzontalment a la platina de mostra a la caixa d'imatges, respectivament, i es van posicionar a les vores del fluid. Un imant de níquel, neodimi, ferro i bor (NdFeB) de terres rares amb closca de 19 mm de diàmetre (28 mm de llarg) (N35, núm. cat. LM1652, Jaycar Electronics, Austràlia) amb una magnetització residual d'1,17 Tesla es va connectar a una platina de translació separada per aconseguir canviar la seva posició de forma remota durant la imatge. L'adquisició d'imatges de raigs X comença quan l'imant es posiciona aproximadament 30 mm per sobre de la mostra i les imatges s'adquireixen a una velocitat de 4 fotogrames per segon. Durant la imatge, l'imant es va portar a prop del tub capil·lar de vidre (a aproximadament 1 mm de distància) i després es va traslladar al llarg del tub per avaluar els efectes de la intensitat del camp i la posició.
Configuració d'imatges in vitro que conté mostres MP en capil·lars de vidre a l'etapa de translació xy de la mostra. La trajectòria del feix de raigs X està marcada amb una línia vermella discontínua.
Un cop establerta la visibilitat in vitro dels MP, es va provar un subconjunt d'ells in vivo en rates Wistar albines femelles de tipus salvatge (~12 setmanes d'edat, ~200 g). 0,24 mg/kg de medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Japó), 3,2 mg/kg de midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japó) i 4 mg/kg de butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Les rates van ser anestesiades amb una barreja de Pharma), Japó) mitjançant injecció intraperitoneal. Després de l'anestèsia, es van preparar per a la imatge eliminant el pèl al voltant de la tràquea, inserint un tub endotraqueal (ET; cànula iv de 16 Ga, Terumo BCT) i immobilitzant-les en decúbit supí sobre una placa d'imatge feta a mida que contenia una bossa tèrmica per mantenir la temperatura corporal 22. A continuació, la placa d'imatge es va fixar a la platina de translació de la mostra a la caixa d'imatge amb un lleuger angle per alinear la tràquea horitzontalment a la imatge de raigs X, tal com es mostra a la figura. 2a.
(a) Configuració d'imatges in vivo a la caixa d'imatges SPring-8, la trajectòria del feix de raigs X està marcada amb una línia vermella discontínua. (b, c) La localització de l'imant a la tràquea es va realitzar de forma remota mitjançant dues càmeres IP muntades ortogonalment. A la part esquerra de la imatge de la pantalla, es pot veure el bucle de filferro que subjecta el cap i la cànula d'administració al seu lloc dins del tub ET.
Un sistema de bomba de xeringa amb control remot (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) que utilitza una xeringa de vidre de 100 μl es va connectar a un tub de PE10 (diàmetre exterior 0,61 mm, diàmetre interior 0,28 mm) mitjançant una agulla de 30 Ga. Marqueu el tub per assegurar-vos que la punta estigui en la posició correcta a la tràquea en inserir el tub endotraqueal. Mitjançant la microbomba, es va retirar l'èmbol de la xeringa mentre la punta del tub s'immergia a la mostra MP que s'havia d'administrar. A continuació, es va inserir el tub d'administració carregat al tub endotraqueal, col·locant la punta dins de la part més forta del nostre camp magnètic aplicat previst. L'adquisició d'imatges es va controlar mitjançant un detector de respiració connectat a la nostra caixa de sincronització basada en Arduino, i tots els senyals (per exemple, temperatura, respiració, obertura/tancament de l'obturador i adquisició d'imatges) es van registrar mitjançant Powerlab i LabChart (AD Instruments, Sydney, Austràlia) 22. Durant la presa d'imatges, quan el recinte era inaccessible, es van posicionar dues càmeres IP (Panasonic BB-SC382) aproximadament a 90° entre si i es van utilitzar per controlar la posició de l'imant en relació amb... a la tràquea durant la imatge (Fig. 2b, c). Per minimitzar els artefactes de moviment, es va adquirir una imatge per respiració durant l'altiplà del flux de final de marea.
Un imant està connectat a una segona etapa que es pot ubicar remotament des de fora de la carcassa d'imatges. Es van provar diverses posicions i configuracions de l'imant, incloent-hi: muntat en un angle d'aproximadament 30° per sobre de la tràquea (configuracions que es mostren a les figures 2a i 3a); un imant per sobre de l'animal i l'altre per sota, amb els pols configurats per atraure (figura 3b); un imant per sobre de l'animal i l'altre per sota, amb els pols configurats per repel·lir (figura 3c); i un imant per sobre i perpendicular a la tràquea (figura 3d). Un cop configurats l'animal i l'imant i carregat el MP que s'ha de provar a la bomba de xeringa, administreu una dosi de 50 μl a una velocitat de 4 μl/s mentre adquireix imatges. A continuació, l'imant es mou endavant i endarrere al llarg o lateralment a través de la tràquea mentre continueu adquirint imatges.
Configuració de l'imant per a la imatge in vivo (a) un únic imant per sobre de la tràquea en un angle d'aproximadament 30°, (b) dos imants configurats per atraure, (c) dos imants configurats per repel·lir, (d) un únic imant per sobre i perpendicular a la tràquea. L'observador mirava cap avall des de la boca fins als pulmons a través de la tràquea, i el feix de raigs X passava pel costat esquerre de la rata i sortia pel costat dret. L'imant es mou al llarg de la via aèria o cap a l'esquerra i la dreta per sobre de la tràquea en la direcció del feix de raigs X.
També vam intentar determinar la visibilitat i el comportament de les partícules a les vies respiratòries en absència de confusió respiratòria i cardíaca. Per tant, al final del període d'imatge, els animals van ser sacrificats de manera humanitària per sobredosi de pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, EUA; ~65 mg/kg ip). Alguns animals es van deixar a la plataforma d'imatge i, un cop la respiració i el batec del cor es van aturar, es va repetir el procés d'imatge, afegint una dosi addicional de MP si no es veia MP a la superfície de les vies respiratòries.
Les imatges adquirides es van corregir en camp pla i camp fosc i després es van muntar en una pel·lícula (20 fotogrames per segon; 15-25 × velocitat normal depenent de la freqüència respiratòria) utilitzant un script personalitzat escrit a MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tots els estudis d'administració de vectors de gens de veïns lentivirals (LV) es van dur a terme al Centre de Recerca en Animals de Laboratori de la Universitat d'Adelaida i tenien com a objectiu utilitzar els resultats de l'experiment SPring-8 per avaluar si l'administració de LV-MP en presència d'un camp magnètic podia millorar la transferència de gens in vivo. Per avaluar els efectes de la MP i el camp magnètic, es van tractar dos grups d'animals: un grup va rebre LV-MP amb un imant col·locat, i l'altre grup va rebre un grup de control amb LV-MP sense imant.
Els vectors del gen LV es van generar mitjançant mètodes descrits anteriorment 25, 26. El vector LacZ expressa el gen de la beta-galactosidasa localitzat al nucli impulsat pel promotor constitutiu del MPSV (LV-LacZ), que produeix un producte de reacció blau en cèl·lules transduïdes, visible en fronts de teixit pulmonar i seccions de teixit. La titració es va realitzar en cultius cel·lulars comptant manualment el nombre de cèl·lules LacZ positives amb un hemocitòmetre per calcular el títol en TU/ml. Els transportadors es criopreserven a -80 °C, es descongelen abans del seu ús i s'uneixen a CombiMag barrejant-lo en una proporció 1:1 i incubant-lo en gel durant almenys 30 minuts abans del lliurament.
Es van anestesiar rates Sprague Dawley normals (n = 3/grup, ~2-3 van ser anestesiades intraperitonealment amb una barreja de 0,4 mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Austràlia) i 60 mg/kg de ketamina (Ilium, Austràlia) (mesos d'edat) ip) i canulació oral no quirúrgica amb una cànula iv de 16 Ga. Per assegurar-se que el teixit de les vies respiratòries traqueals rebés la transducció del ventricle esquerre (VE), es va condicionar mitjançant el nostre protocol de pertorbació mecànica descrit anteriorment, en el qual la superfície de les vies respiratòries traqueals es fregava axialment amb una cistella de filferro (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, EUA) durant 30 minuts i 28 minuts. L'administració traqueal de VE-MP es va realitzar en una cabina de seguretat biològica aproximadament 10 minuts després de la pertorbació.
El camp magnètic utilitzat en aquest experiment es va configurar de manera similar a l'estudi d'imatges de raigs X in vivo, amb els mateixos imants mantinguts per sobre de la tràquea mitjançant clips de stent de destil·lació (Figura 4). Es va administrar un volum de 50 μl (2 alíquotes de 25 μl) de LV-MP a la tràquea (n = 3 animals) mitjançant una pipeta que contenia una punta de gel, tal com s'ha descrit anteriorment. Un grup de control (n = 3 animals) va rebre els mateixos LV-MP sense l'ús d'un imant. Un cop finalitzada la infusió, es retira la cànula del tub ET i s'extuba l'animal. L'imant roman al seu lloc durant 10 minuts i després es retira. Les rates van rebre una dosi subcutània de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Austràlia) seguida de la inversió de l'anestèsia mitjançant injecció intraperitoneal d'1 mg/kg de clorhidrat d'atipamazol (Antisedan, Zoetis, Austràlia). Les rates es van mantenir calentes i es van controlar fins a la recuperació completa de l'anestèsia.
Dispositiu d'administració LV-MP en una cabina de seguretat biològica. Es pot veure el conector Luer gris clar del tub ET que sobresurt de la boca i la punta de gel de la pipeta que es mostra a la imatge s'insereix a través del tub ET fins a la profunditat desitjada a la tràquea.
Una setmana després del procediment de dosificació de LV-MP, els animals van ser sacrificats de manera humanitària mitjançant inhalació de CO2 al 100% i l'expressió de LacZ es va avaluar mitjançant el nostre tractament estàndard X-gal. Es van eliminar els tres anells caudals més cartilaginosos per assegurar-se que no s'inclogués a l'anàlisi cap dany mecànic o retenció de líquids derivat de la col·locació del tub endotraqueal. Cada tràquea es va tallar longitudinalment per crear dues meitats per a l'anàlisi i es van muntar en una placa que contenia cautxú de silicona (Sylgard, Dow Inc) utilitzant una agulla Minutien (Fine Science Tools) per visualitzar la superfície luminal. La distribució i el patró de les cèl·lules transduïdes es van confirmar mitjançant fotografia frontal amb un microscopi Nikon (SMZ1500) amb una càmera DigiLite i el programari TCapture (Tucsen Photonics, Xina). Les imatges es van adquirir amb un augment de 20x (inclosa la configuració més alta per a l'amplada completa de la tràquea), amb tota la longitud de la tràquea fotografiada pas a pas, assegurant una superposició suficient entre cada imatge per permetre la "costura" de les imatges. A continuació, es van muntar les imatges de cada tràquea. en una sola imatge composta utilitzant l'Editor Compost d'Imatges v2.0.3 (Microsoft Research) utilitzant un algorisme de moviment planar. Les àrees d'expressió de LacZ en imatges compostes de la tràquea de cada animal es van quantificar mitjançant un script MATLAB automatitzat (R2020a, MathWorks) tal com s'ha descrit anteriorment, utilitzant configuracions de 0,35 < Ton < 0,58, Saturació > 0,15 i Valor < 0,7. Traçant els contorns del teixit, es va generar manualment una màscara a GIMP v2.10.24 per a cada imatge composta per tal d'identificar l'àrea del teixit i evitar qualsevol detecció falsa des de fora del teixit traqueal. Les àrees tenyides de totes les imatges compostes de cada animal es van sumar per generar l'àrea tenyida total per a aquest animal. L'àrea tenyida es va dividir per l'àrea total de la màscara per generar l'àrea normalitzada.
Cada tràquea es va incrustar en parafina i es van tallar seccions de 5 μm. Les seccions es van contratenyir amb vermell ràpid neutre durant 5 minuts i les imatges es van adquirir mitjançant un microscopi Nikon Eclipse E400, una càmera DS-Fi3 i el programari de captura d'elements NIS (versió 5.20.00).
Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar amb GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). La significació estadística es va establir a p ≤ 0,05. La normalitat es va verificar mitjançant la prova de Shapiro-Wilk i les diferències en la tinció de LacZ es van avaluar mitjançant la prova t no aparellada.
Els sis MP descrits a la Taula 1 es van examinar mitjançant PCXI, i la visibilitat es descriu a la Taula 2. Dos MP de poliestirè (MP1 i MP2; 18 μm i 0,25 μm, respectivament) no eren visibles sota PCXI, però la resta de mostres eren identificables (es mostren exemples a la Figura 5). MP3 i MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm i 0,9 μm, respectivament) són lleugerament visibles. Tot i que conté algunes de les partícules més petites provades, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) va ser la més pronunciada. El producte CombiMag MP6 és difícil de detectar. En tots els casos, la nostra capacitat per detectar MP es va millorar significativament traslladant l'imant endavant i enrere paral·lelament al capil·lar. Quan els imants s'allunyaven del capil·lar, les partícules s'estenien en llargues cadenes, però a mesura que els imants s'acostaven i la intensitat del camp magnètic augmentava, les cadenes de partícules s'escurçaven a mesura que les partícules migraven cap a la superfície superior del capil·lar (vegeu el vídeo suplementari). S1: MP4), augmentant la densitat de partícules de la superfície. Per contra, quan l'imant es retira del capil·lar, la intensitat del camp disminueix i els MP es reorganitzen en llargues cadenes que s'estenen des de la superfície superior del capil·lar (vegeu el vídeo suplementari S2: MP4). Després que l'imant deixi de moure's, les partícules continuen movent-se durant un curt període de temps després d'arribar a la posició d'equilibri. A mesura que el MP s'acosta i s'allunya de la superfície superior del capil·lar, les partícules magnètiques normalment arrosseguen les restes a través del fluid.
La visibilitat de MP sota PCXI varia significativament entre mostres. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6. Totes les imatges que es mostren aquí es van prendre amb un imant situat aproximadament a 10 mm directament per sobre del capil·lar. Els cercles grans aparents són bombolles d'aire atrapades als capil·lars, que mostren clarament les característiques de les vores en blanc i negre de les imatges de contrast de fase. El quadre vermell conté l'augment de contrast. Tingueu en compte que els diàmetres dels esquemes dels imants a totes les figures no estan a escala i són aproximadament 100 vegades més grans que els que es mostren.
A mesura que l'imant es trasllada a l'esquerra i a la dreta al llarg de la part superior del capil·lar, l'angle de la corda MP canvia per alinear-se amb l'imant (vegeu la Figura 6), delineant així les línies del camp magnètic. Per a MP3-5, després que la corda arribi a un angle llindar, les partícules s'arrosseguen al llarg de la superfície superior del capil·lar. Això sovint fa que els MP s'agrupin en grups més grans a prop d'on el camp magnètic és més fort (vegeu el Vídeo Suplementari S3:MP5). Això també és particularment evident quan es fan imatges a prop de l'extrem del capil·lar, cosa que fa que els MP s'agreguin i es concentrin a la interfície fluid-aire. Les partícules de MP6, que eren més difícils de discernir que les de MP3-5, no es van arrossegar a mesura que l'imant es movia al llarg del capil·lar, però les cordes MP es van dissociar, deixant les partícules al camp de visió (vegeu el Vídeo Suplementari S4:MP6). En alguns casos, quan el camp magnètic aplicat es va reduir movent l'imant una gran distància de la ubicació de la imatge, els MP restants van descendir lentament a la superfície inferior del tub per gravetat mentre romanien a la corda (vegeu el Vídeo Suplementari S5: MP3).
L'angle de la cadena MP canvia a mesura que l'imant es desplaça cap a la dreta per sobre del capil·lar. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6. El requadre vermell conté l'ampliació que millora el contrast. Cal tenir en compte que els vídeos suplementaris són informatius, ja que revelen informació important sobre l'estructura de les partícules i la dinàmica que no es pot visualitzar en aquestes imatges estàtiques.
Les nostres proves van mostrar que moure l'imant lentament endavant i endarrere al llarg de la tràquea facilita la visualització de MP en el context de moviment complex in vivo. No es van realitzar proves in vivo, ja que les perles de poliestirè (MP1 i MP2) no eren visibles al capil·lar. Cadascun dels quatre MP restants es va provar in vivo amb l'eix longitudinal de l'imant configurat per sobre de la tràquea en un angle d'uns 30° respecte a la vertical (vegeu les figures 2b i 3a), ja que això va resultar en cadenes de MP més llargues i va ser més eficaç que la configuració de l'imant acabada. MP3, MP4 i MP6 no es van detectar a la tràquea de cap animal viu. Quan es van obtenir imatges de les vies respiratòries de les rates després que els animals fossin sacrificats de manera humanitària, les partícules van romandre invisibles fins i tot quan es va afegir un volum addicional mitjançant una bomba de xeringa. MP5 tenia el contingut més alt d'òxid de ferro i era l'única partícula visible, i per tant es va utilitzar per avaluar i caracteritzar el comportament in vivo de MP.
En col·locar l'imant sobre la tràquea durant l'administració de MP, es va aconseguir que molts MP, però no tots, es concentressin en el camp de visió. Les partícules que entren a la tràquea s'observen millor en animals sacrificats de manera humana. La figura 7 i el vídeo suplementari S6: MP5 mostren una captura magnètica ràpida i l'alineació de partícules a la superfície de la tràquea ventral, cosa que indica que els MP es poden dirigir a les regions desitjades de la tràquea. En buscar més distalment al llarg de la tràquea després de l'administració de MP, es van trobar alguns MP més a prop de la carina, cosa que suggereix que la intensitat del camp magnètic era insuficient per recollir i retenir tots els MP, ja que es van administrar a través de la regió de màxima intensitat del camp magnètic durant el procés del fluid. No obstant això, les concentracions de MP postpart van ser més altes al voltant de l'àrea fotografiada, cosa que suggereix que molts MP van romandre a les regions de les vies respiratòries on la intensitat del camp magnètic aplicat era més alta.
Imatges de (a) abans i (b) després del lliurament de MP5 a la tràquea d'una rata recentment sacrificada amb l'imant posicionat directament a sobre de l'àrea d'imatge. L'àrea d'imatge es troba entre els dos anells de cartílag. Abans del lliurament de MP, hi ha una mica de líquid a les vies respiratòries. El quadre vermell conté l'ampliació que millora el contrast. Aquestes imatges són del vídeo que es mostra al vídeo suplementari S6:MP5.
La translació de l'imant al llarg de la tràquea in vivo va fer que la cadena de MP canviés d'angle dins de la superfície de la via aèria d'una manera similar a la que s'observa en els capil·lars (vegeu la Figura 8 i el Vídeo Suplementari S7:MP5). Tanmateix, en el nostre estudi, els MP no es podien arrossegar per la superfície de la via aèria viva com sí que ho farien amb els capil·lars. En alguns casos, la cadena de MP s'allargarà a mesura que l'imant es mou cap a l'esquerra i la dreta. Curiosament, també vam descobrir que la cadena de partícules sembla canviar la profunditat de la capa de fluid superficial quan l'imant es mou longitudinalment al llarg de la tràquea, i s'expandeix quan l'imant es mou directament per sobre i la cadena de partícules es gira a una posició vertical (vegeu el Vídeo Suplementari S7). : MP5 a les 0:09, a baix a la dreta). El patró característic de moviment canviava quan l'imant es traslladava lateralment a través de la part superior de la tràquea (és a dir, a l'esquerra o a la dreta de l'animal en lloc de fer-ho al llarg de la tràquea). Les partícules encara eren clarament visibles a mesura que es movien, però quan es retirava l'imant de la tràquea, les puntes de les cadenes de partícules es feien visibles (vegeu el vídeo suplementari S8:MP5, a partir de les 0:08). Això és coherent amb el comportament MP que vam observar sota un camp magnètic aplicat en un capil·lar de vidre.
Imatges d'exemple que mostren MP5 a la tràquea d'una rata anestesiada viva. (a) L'imant s'utilitza per adquirir imatges a sobre i a l'esquerra de la tràquea, i després (b) després que l'imant es mogui cap a la dreta. El quadre vermell conté l'ampliació que millora el contrast. Aquestes imatges són del vídeo que es mostra al vídeo suplementari S7:MP5.
Quan els dos pols es van configurar en una orientació nord-sud per sobre i per sota de la tràquea (és a dir, atraient; Fig. 3b), les cordes MP semblaven més llargues i es trobaven a la paret lateral de la tràquea en lloc de a la superfície dorsal de la tràquea (vegeu el vídeo suplementari S9:MP5). Tanmateix, no es van detectar altes concentracions de partícules en una sola ubicació (és a dir, la superfície dorsal de la tràquea) després de l'administració de fluids quan es va utilitzar un dispositiu de doble imant, cosa que normalment passa quan s'utilitza un dispositiu d'un sol imant. Aleshores, quan es va configurar un imant per repel·lir els pols invertits (Fig. 3c), el nombre de partícules visibles al camp de visió no semblava augmentar després de l'administració. La configuració d'ambdues configuracions de doble imant és difícil a causa de les altes intensitats del camp magnètic que estiren o empenyen els imants, respectivament. A continuació, es va canviar la configuració a un sol imant paral·lel a la via aèria però que passava per la via aèria a 90 graus de manera que les línies de camp creuaven la paret traqueal ortogonalment (Fig. 3d), una orientació dissenyada per determinar si es podia observar agregació de partícules a la paret lateral. Tanmateix, en aquest configuració, no hi va haver cap moviment identificable d'acumulació de MP ni de moviment de l'imant. A partir de tots aquests resultats, es va triar una configuració d'orientació de 30 graus amb un sol imant (Figura 3a) per als estudis de portadors de gens in vivo.
Quan es van fotografiar repetidament l'animal immediatament després de la matança humanitària, l'absència de moviment tissular confús va significar que es podien discernir línies de partícules més fines i curtes en el camp intercondral clar, "vacil·lants" en línia amb el moviment de translació de l'imant. No obstant això, encara no es pot veure clarament la presència i el moviment de les partícules de MP6.
El títol de LV-LacZ va ser d'1,8 × 108 TU/ml, i després de la barreja 1:1 amb CombiMag MP (MP6), els animals van rebre una dosi traqueal de 50 μl de 9 × 107 TU/ml de vehicle LV (és a dir, 4,5 × 106 TU/rata). En aquests estudis, en lloc de traslladar l'imant durant el part, vam fixar l'imant en una posició per determinar si la transducció del ventricle esquerre (a) es podia millorar en comparació amb l'administració vectorial en absència d'un camp magnètic, i (b) es podia enfocar. Les cèl·lules de les vies respiratòries es transdueixen a les regions diana magnètiques de les vies respiratòries superiors.
La presència d'imants i l'ús de CombiMag combinat amb vectors LV no semblaven tenir efectes adversos sobre la salut animal, igual que el nostre protocol estàndard d'administració de vectors LV. Les imatges frontals de la regió traqueal sotmesa a pertorbació mecànica (Fig. suplementària 1) van indicar que hi havia nivells significativament més alts de transducció en el grup d'animals tractats amb LV-MP quan l'imant era present (Fig. 9a). Només una petita quantitat de tinció blava de LacZ era present en el grup de control (Fig. 9b). La quantificació de les àrees tenyides de X-Gal normalitzades va mostrar que l'administració de LV-MP en presència d'un camp magnètic va produir una millora aproximadament 6 vegades (Fig. 9c).
Exemples d'imatges compostes que mostren la transducció traqueal per LV-MP (a) en presència d'un camp magnètic i (b) en absència d'un imant. (c) Millora estadísticament significativa en l'àrea de transducció de LacZ normalitzada dins de la tràquea quan s'utilitza l'imant (*p = 0,029, prova t, n = 3 per grup, mitjana ± SEM).
Les seccions tenyides de vermell ràpid i neutre (exemple mostrat a la figura suplementària 2) van mostrar cèl·lules tenyides de LacZ presents en un patró i una ubicació similars als informats anteriorment.
Un repte clau per a la teràpia gènica de les vies respiratòries continua sent la localització precisa de les partícules portadores a les regions d'interès i aconseguir alts nivells d'eficiència de transducció en el pulmó en moviment en presència de flux d'aire i eliminació activa de moc. Per als portadors de ventricles esquerres dissenyats per tractar la malaltia de les vies respiratòries amb fibrosi quística, augmentar el temps de residència de les partícules portadores dins de les vies respiratòries conductores ha estat un objectiu fins ara difícil d'aconseguir. Com van assenyalar Castellani et al., l'ús de camps magnètics per millorar la transducció té avantatges en comparació amb altres mètodes d'administració de gens com l'electroporació, ja que pot combinar simplicitat, rendibilitat, localització de l'administració, major eficiència i temps d'incubació més curts, i possiblement una dosi de portador més petita10. Tanmateix, la deposició in vivo i el comportament de partícules magnètiques a les vies respiratòries sota la influència de forces magnètiques externes mai s'han descrit, ni tampoc s'ha demostrat la viabilitat d'aquest mètode in vivo per millorar els nivells d'expressió gènica en vies respiratòries vives intactes.
Els nostres experiments in vitro de sincrotró PCXI van mostrar que totes les partícules que vam provar, amb l'excepció del MP de poliestirè, eren visibles en la configuració d'imatge que vam utilitzar. En presència d'un camp magnètic, els MP formen cordes les longituds de les quals estan relacionades amb el tipus de partícula i la intensitat del camp magnètic (és a dir, la proximitat i el moviment de l'imant). Com es mostra a la Figura 10, les cordes que observem es formen a causa que cada partícula individual es magnetitza i indueix el seu propi camp magnètic local. Aquests camps separats fan que altres partícules similars s'agreguin i es connectin, amb moviments semblants a cordes de grup a causa de les forces locals de les forces atractives i repulsives locals d'altres partícules.
Esquema que mostra (a, b) trens de partícules generats dins dels capil·lars plens de fluid i (c, d) tràquea plena d'aire. Cal tenir en compte que els capil·lars i la tràquea no estan dibuixats a escala. El panell (a) també conté una descripció del MP, que conté partícules de Fe3O4 disposades en cadenes.
Quan l'imant es movia per sobre del capil·lar, l'angle de la cadena de partícules arribava a un llindar crític per a MP3-5 que conté Fe3O4, després del qual la cadena de partícules ja no es mantenia a la posició original, sinó que es movia al llarg de la superfície fins a una nova posició. Aquest efecte és probable que es produeixi perquè la superfície del capil·lar de vidre és prou llisa per permetre que es produeixi aquest moviment. Curiosament, MP6 (CombiMag) no es va comportar d'aquesta manera, possiblement perquè les partícules eren més petites, tenien recobriments o càrregues superficials diferents, o un fluid portador patentat afectava la seva capacitat de moviment. El contrast de la imatge de les partícules de CombiMag també és més feble, cosa que suggereix que el fluid i les partícules poden tenir densitats similars i, per tant, no moure's fàcilment l'una cap a l'altra. Les partícules també es poden enganxar si l'imant es mou massa ràpid, cosa que indica que la força del camp magnètic no sempre pot superar la fricció entre les partícules del fluid, cosa que suggereix que potser no és sorprenent que la força del camp magnètic i la distància entre l'imant i l'àrea objectiu siguin molt importants. En conjunt, aquests resultats també suggereixen que, si bé els imants poden capturar molts MP que flueixen a través de l'àrea objectiu, és poc probable que es pugui confiar en els imants per moure's. Partícules de CombiMag al llarg de la superfície de la tràquea. Per tant, concloem que els estudis in vivo de MP-LV haurien d'utilitzar camps magnètics estàtics per dirigir-se físicament a regions específiques de l'arbre de les vies respiratòries.
Quan les partícules s'introdueixen al cos, són difícils d'identificar en el context de teixits corporals complexos en moviment, però la capacitat de detectar-les es va millorar traslladant l'imant horitzontalment per sobre de la tràquea per "moure" les cordes de MP. Tot i que és possible obtenir imatges en directe, és més fàcil discernir el moviment de les partícules un cop l'animal ha estat sacrificat de manera humanitària. Les concentracions de MP eren generalment més altes en aquesta ubicació quan l'imant es col·locava per sobre de l'àrea d'imatge, tot i que algunes partícules es trobaven normalment més al llarg de la tràquea. A diferència dels estudis in vitro, les partícules no es poden arrossegar per la tràquea traslladant l'imant. Aquesta troballa és coherent amb la manera com el moc que recobreix la superfície de la tràquea processa normalment les partícules inhalades, atrapant-les al moc i posteriorment eliminant-les mitjançant el mecanisme d'aclariment mucociliar.
Vam plantejar la hipòtesi que l'ús d'imants per a l'atracció per sobre i per sota de la tràquea (Fig. 3b) podria resultar en un camp magnètic més uniforme, en lloc d'un camp magnètic altament concentrat en un punt, cosa que podria conduir a una distribució més uniforme de les partícules. Tanmateix, el nostre estudi preliminar no va trobar proves clares que donessin suport a aquesta hipòtesi. De la mateixa manera, configurar un parell d'imants per repel·lir (Fig. 3c) no va resultar en una major deposició de partícules a l'àrea fotografiada. Aquestes dues troballes demostren que la configuració de doble imant no millora significativament el control local de la focalització de MP, i que les fortes forces magnètiques resultants són difícils de configurar, cosa que fa que aquest enfocament sigui menys pràctic. De la mateixa manera, orientar l'imant per sobre i a través de la tràquea (Fig. 3d) tampoc va augmentar el nombre de partícules retingudes a l'àrea fotografiada. Algunes d'aquestes configuracions alternatives poden no tenir èxit perquè donen lloc a intensitats de camp magnètic més baixes dins de l'àrea de deposició. Per tant, la configuració d'un únic imant d'angle de 30 graus (Figura 3a) es considera el mètode més fàcil i eficient per a proves in vivo.
L'estudi LV-MP va mostrar que quan els vectors LV es combinaven amb CombiMag i es lliuraven després d'una pertorbació física en presència d'un camp magnètic, els nivells de transducció augmentaven significativament a la tràquea en comparació amb els controls. Segons els estudis d'imatges de sincrotró i els resultats de LacZ, el camp magnètic aparentment va ser capaç de preservar el LV dins de la tràquea i reduir el nombre de partícules vectorials que penetraven immediatament profundament al pulmó. Aquestes millores en la focalització poden conduir a una major eficàcia alhora que redueixen els títols lliurats, la transducció fora de l'objectiu, els efectes secundaris inflamatoris i immunitaris i els costos del portador de gens. És important destacar que, segons el fabricant, CombiMag es pot utilitzar juntament amb altres mètodes de transferència de gens, inclosos altres vectors virals (com ara AAV) i àcids nucleics.