Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat stöd för CSS. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller stänger av kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att visa webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Genvektorer för behandling av cystisk fibros i lungorna bör rikta in sig på de ledande luftvägarna eftersom perifer lungtransduktion inte ger terapeutisk nytta. Viral transduktionseffektivitet är direkt relaterad till vektorns uppehållstid. Emellertid diffunderar tillförselvätskor som genbärare naturligt in i alveolerna under inandning, och terapeutiska partiklar av vilken form som helst elimineras snabbt genom mukociliär transport. Att förlänga uppehållstiden för genbärare i luftvägarna är viktigt men svårt att uppnå. Genbärarkonjugerade magnetiska partiklar som kan riktas mot luftvägarnas yta kan förbättra regional inriktning. På grund av utmaningarna med in vivo-visualisering är beteendet hos sådana små magnetiska partiklar på luftvägsytan i närvaro av ett applicerat magnetfält dåligt förstådd. Syftet med denna studie var att använda synkrotronavbildning för att visualisera in vivo-rörelsen hos en serie magnetiska partiklar i luftstrupen hos sövda råttor för att undersöka dynamiken och mönstren för individuella och bulkopartiklars beteende in vivo. Vi bedömde sedan också om tillförsel av lentivirala magnetiska partiklar i närvaro av ett magnetfält skulle öka transduktionseffektiviteten hos råttan. luftstrupe. Synkrotronröntgenavbildning avslöjar magnetiska partiklars beteende i stationära och rörliga magnetfält in vitro och in vivo. Partiklar kan inte lätt dras längs ytan av den levande luftvägen med magneter, men under transport koncentreras avlagringarna i synfältet där magnetfältet är starkast. Transduktionseffektiviteten ökade också sexfaldigt när lentivirala magnetiska partiklar levererades i närvaro av ett magnetfält. Tillsammans tyder dessa resultat på att lentivirala magnetiska partiklar och magnetfält kan vara värdefulla metoder för att förbättra genvektorinriktning och öka transduktionsnivåerna i ledande luftvägar in vivo.
Cystisk fibros (CF) orsakas av variation i en enda gen som kallas CF-transmembrankonduktansregulatorn (CFTR). CFTR-proteinet är en jonkanal som finns i många epitelceller i hela kroppen, inklusive de ledande luftvägarna, en viktig plats för CF-patogenes. CFTR-defekter leder till onormal vattentransport, vilket uttorkar luftvägsytan och minskar djupet av luftvägsytans vätskeskikt (ASL). Detta försämrar också förmågan hos det mukociliära transportsystemet (MCT) att rensa inandade partiklar och patogener från luftvägarna. Vårt mål är att utveckla en lentiviral (LV) genterapi för att leverera rätt kopia av CFTR-genen och förbättra ASL-, MCT- och lunghälsan, och att fortsätta utveckla nya tekniker som kan mäta dessa parametrar in vivo1.
LV-vektorer är en av de ledande kandidaterna för genterapi för CF-luftvägar, främst för att de permanent kan integrera den terapeutiska genen i luftvägarnas basalceller (luftvägsstamceller). Detta är viktigt eftersom de kan återställa normal hydrering och slemrening genom att differentiera till funktionella genkorrigerade CF-associerade luftvägsytceller, vilket resulterar i livslånga fördelar. LV-vektorer bör riktas mot den ledande luftvägen, eftersom det är här CF-lungsjukdom börjar. Leverans av vektorn djupare in i lungan kan resultera i alveolär transduktion, men detta har ingen terapeutisk fördel vid CF. Vätskor som genbärare migrerar dock naturligt till alveolerna vid inandning efter leverans3,4 och terapeutiska partiklar rensas snabbt in i munhålan genom MCT. LV-transduktionseffektiviteten är direkt relaterad till hur länge vektorn förblir bredvid målcellerna för att möjliggöra cellulärt upptag – "uppehållstiden"5 – som lätt minskas genom typiskt regionalt luftflöde samt koordinerad partikelslemuppfångning och MCT. För CF är förmågan att förlänga LV:s uppehållstid i luftvägarna viktig för att uppnå höga transduktionsnivåer i denna region, men har hittills varit utmanande.
För att övervinna detta hinder föreslår vi att LV-magnetiska partiklar (MP) kan hjälpa till på två kompletterande sätt. För det första kan de magnetiskt styras till luftvägsytan för att förbättra målinriktningen och hjälpa genbärarpartiklarna att befinna sig i den önskade luftvägsregionen; och ASL) att förflytta sig till celllager 6. MP har använts i stor utsträckning som riktade läkemedelsleveransvehiklar när de binder till antikroppar, kemoterapeutiska läkemedel eller andra små molekyler som fäster vid cellmembran eller binder till relevanta cellytereceptorer och ackumuleras på tumörställen i närvaro av statisk elektricitet. Magnetiska fält för cancerbehandling 7. Andra "hypertermiska" tekniker syftar till att värma upp mikroplaster när de utsätts för oscillerande magnetfält, och därigenom förstöra tumörceller. Principen för magnetisk transfektion, där ett magnetfält används som ett transfektionsmedel för att förbättra överföringen av DNA till celler, används vanligtvis in vitro med hjälp av en rad icke-virala och virala genvektorer för svårtransducerade cellinjer. Effektiviteten av LV-magnetotransfektion har fastställts, med in vitro-leverans av LV-MP till en human bronkial epitelcellinje i närvaro av ett statiskt magnetfält, vilket ökar transduktionseffektiviteten med 186 gånger jämfört med enbart LV-vektor. LV-MP har också tillämpats på en in vitro CF-modell, där magnetisk transfektion ökade LV-transduktion i luft-vätske-gränssnittskulturer med 20 gånger i närvaro av CF-sputum10. Emellertid har in vivo-magnetotransfektion av organ fått relativt lite uppmärksamhet och har endast utvärderats i ett fåtal djurförsök. studier11,12,13,14,15, särskilt i lungorna16,17. Icke desto mindre är möjligheterna för magnetisk transfektion vid CF-lungterapi tydliga. Tan et al. (2020) uppgav att "en proof-of-concept-studie av effektiv pulmonell leverans av magnetiska nanopartiklar kommer att bana väg för framtida CFTR-inhalationsstrategier för att förbättra kliniska resultat hos CF-patienter"6.
Beteendet hos små magnetiska partiklar på luftvägsytor i närvaro av ett applicerat magnetfält är svårt att visualisera och studera, och därför dåligt förstått. I andra studier utvecklade vi en synkrotronutbredningsbaserad faskontraströntgenavbildningsmetod (PB-PCXI) för att icke-invasivt visualisera och kvantifiera små in vivo-förändringar i ASL-djup18 och MCT-beteende19,20 för att direkt mäta gaskanalytans hydrering och användas som en tidig indikator på behandlingseffektivitet. Dessutom använder vår MCT-utvärderingsmetod partiklar med en diameter på 10–35 µm bestående av aluminiumoxid eller glas med högt brytningsindex som MCT-markörer synliga med PB-PCXI21. Båda teknikerna är lämpliga för visualisering av en rad olika partikeltyper, inklusive MP.
På grund av dess höga rumsliga och tidsmässiga upplösning är våra PB-PCXI-baserade ASL- och MCT-analystekniker väl lämpade för att undersöka dynamiken och mönstren hos enskilda och bulkopartiklars beteende in vivo för att hjälpa oss att förstå och optimera MP-genleveranstekniker. Den metod vi använder här härstammar från våra studier med SPring-8 BL20B2-strålröret, där vi visualiserade vätskerörelser efter placebovektordosleverans i de nasala och pulmonella luftvägarna hos möss för att hjälpa till att förklara våra icke-enhetliga genuttrycksmönster som observerats i våra djurstudier med genbärardoser 3,4.
Syftet med denna studie var att använda synkrotronen PB-PCXI för att visualisera in vivo-rörelserna hos en serie MP i luftstrupen hos levande råttor. Dessa PB-PCXI-avbildningsstudier utformades för att testa en rad MP, magnetfältstyrkor och platser för att bestämma deras effekt på MP-rörelsen. Vi antog att ett externt applicerat magnetfält skulle hjälpa den levererade MP att stanna kvar eller röra sig till målområdet. Dessa studier gjorde det också möjligt för oss att identifiera magnetkonfigurationer som maximerar antalet partiklar som kvarhålls i luftstrupen efter avsättning. I en andra serie studier försökte vi använda denna optimala konfiguration för att demonstrera transduktionsmönstret som resulterar från in vivo-leverans av LV-MP till råttans luftvägar, baserat på antagandet att leveransen av LV-MP i samband med luftvägsinriktning skulle resultera i förbättrad LV-transduktionseffektivitet.
Alla djurstudier utfördes enligt protokoll godkända av University of Adelaide (M-2019-060 och M-2020-022) och SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Experimenten utfördes enligt ARRIVE-riktlinjer.
All röntgenavbildning utfördes vid BL20XU-strållinjen vid SPring-8-synkrotronen i Japan, med en uppställning liknande den som beskrivits tidigare21,22. Kortfattat placerades experimentlådan 245 m från synkrotronlagringsringen. Ett avstånd mellan prov och detektor på 0,6 m används för partikelavbildningsstudier och 0,3 m för in vivo-avbildningsstudier för att generera faskontrasteffekter. En monokromatisk strålenergi på 25 keV användes. Bilder togs med en högupplöst röntgenomvandlare (SPring-8 BM3) kopplad till en sCMOS-detektor. Omvandlaren omvandlar röntgenstrålar till synligt ljus med en 10 µm tjock scintillator (Gd3Al2Ga3O12), som sedan riktas till en sCMOS-sensor med ett × 10 mikroskopobjektiv (NA 0.3). sCMOS-detektorn var Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) med en arraystorlek på 2048 × 2048 pixlar och en rå pixelstorlek på 6,5 × 6,5 µm. Denna uppställning ger en effektiv isotrop pixelstorlek på 0,51 µm och ett synfält på cirka 1,1 mm × 1,1 mm. En exponeringslängd på 100 ms valdes för att maximera signal-brusförhållandet för magnetiska partiklar inuti och utanför luftvägarna samtidigt som andningsinducerade rörelseartefakter minimerades. För in vivo-studier placerades en snabb röntgenslutare i röntgenbanan för att begränsa stråldosen genom att blockera röntgenstrålen mellan exponeringarna.
LV-bäraren användes inte i några SPring-8 PB-PCXI-avbildningsstudier eftersom BL20XU-avbildningskammaren inte är certifierad enligt biosäkerhetsnivå 2. Istället valde vi ett antal välkarakteriserade mikroplaster från två kommersiella leverantörer – som täckte en rad olika storlekar, material, järnkoncentrationer och tillämpningar – först för att förstå hur magnetfält påverkar mikroplasternas rörelse i glaskapillärer och sedan i levande luftvägar. på ytan. MP:er varierar i storlek från 0,25 till 18 μm och är tillverkade av en mängd olika material (se tabell 1), men sammansättningen av varje prov, inklusive storleken på de magnetiska partiklarna i MP:en, är okänd. Baserat på våra omfattande MCT-studier 19, 20, 21, 23, 24 förväntar vi oss att MP:er så små som 5 μm kan ses på luftstrupens yta, till exempel genom att subtrahera på varandra följande bildrutor för att se förbättrad synlighet av MP:ens rörelse. En enda MP av 0,25 μm storlek är mindre än upplösningen hos avbildningsenheten, men PB-PCXI förväntas detektera deras volymkontrast och rörelsen hos ytvätskan på vilken de deponeras efter deponering.
Prover för varje MP i tabell 1 framställdes i 20 μl glaskapillärer (Drummond Microcaps, PA, USA) med en innerdiameter på 0,63 mm. Korpuskulära partiklar finns tillgängliga i vatten, medan CombiMag-partiklar finns tillgängliga i tillverkarens egenutvecklade vätska. Varje rör fylls till hälften med vätska (cirka 11 μl) och placeras på provhållaren (se figur 1). Glaskapillärerna placerades horisontellt på provbordet i avbildningslådan och positionerade vätskans kanter. En magnet av nickelskal, sällsynt jordartsmetall, neodymjärnbor (NdFeB) (N35, kat.nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) med en restmagnetisering på 1,17 Tesla fästes på ett separat translationsbord för att uppnå positionsändring på distans under avbildning. Röntgenbildtagning börjar när magneten är placerad cirka 30 mm ovanför provet, och bilder tas med en hastighet av 4 bilder per sekund. Under avbildningen togs magneten... fördes nära glaskapillärröret (cirka 1 mm bort) och sedan förflyttades längs röret för att bedöma effekterna av fältstyrka och position.
In vitro-avbildningsuppsättning innehållande MP-prover i glaskapillärer på provets xy-translationssteg. Röntgenstrålens bana är markerad med en röd streckad linje.
När in vitro-synligheten för MP hade fastställts testades en delmängd av dem in vivo på vildtyps albino Wistar-honråttor (~12 veckor gamla, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) och 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Råttorna sövdes med en blandning av Pharma (Pharma), Japan) genom intraperitoneal injektion. Efter anestesi förbereddes de för avbildning genom att ta bort pälsen runt luftstrupen, sätta in en endotrakealtub (ET; 16 Ga iv-kanyl, Terumo BCT) och immobilisera dem liggande på en specialtillverkad bildplatta innehållande en termisk påse för att bibehålla kroppstemperaturen 22. Bildplattan fästes sedan på provtranslationsbordet i avbildningslådan i en liten vinkel för att justera luftstrupen horisontellt i röntgenbilden, såsom visas i figur 2a.
(a) In vivo-avbildningsuppställning i SPring-8-avbildningsboxen, röntgenstrålens bana är markerad med en röd streckad linje. (b, c) Magnetlokalisering på luftstrupen utfördes på distans med två ortogonalt monterade IP-kameror. På vänster sida av skärmbilden kan trådöglan som håller huvudet ses och leveranskanylen på plats i ET-röret.
Ett fjärrstyrt sprutpumpsystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) med en 100 μl glasspruta anslöts till en PE10-slang (ytterdiameter 0,61 mm, innerdiameter 0,28 mm) via en 30 Ga nål. Markera röret för att säkerställa att spetsen är i rätt position i luftstrupen när ET-röret förs in. Med hjälp av mikropumpen drogs sprutkolven tillbaka medan rörets spets var nedsänkt i MP-provet som skulle levereras. Det laddade leveransröret fördes sedan in i endotrakealtuben, varvid spetsen placerades inom den starkaste delen av vårt förväntade applicerade magnetfält. Bildinsamling styrdes med en respirationsdetektor ansluten till vår Arduino-baserade timingbox, och alla signaler (t.ex. temperatur, respiration, lucköppning/stängning och bildinsamling) registrerades med Powerlab och LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien) 22. Vid avbildning När höljet var oåtkomligt placerades två IP-kameror (Panasonic BB-SC382) i cirka 90° vinkel mot varandra och användes för att övervaka positionen för magneten i förhållande till luftstrupen under avbildning (Fig. 2b, c). För att minimera rörelseartefakter togs en bild per andetag under platån i slutet av tidalflödet.
En magnet är fäst vid ett andra steg som kan placeras på avstånd från utsidan av avbildningshöljet. Olika magnetpositioner och konfigurationer testades, inklusive: Monterad i en vinkel på cirka 30° ovanför luftstrupen (konfigurationer visas i figur 2a och 3a); en magnet ovanför djuret och den andra nedanför, med polerna inställda för att attrahera (figur 3b); en magnet ovanför djuret och den andra nedanför, med polerna inställda för att repellera (figur 3c); och en magnet ovanför och vinkelrätt mot luftstrupen (figur 3d). När djuret och magneten är konfigurerade och den MP som ska testas är laddad i sprutpumpen, avge en dos på 50 μl med en hastighet av 4 μl/sek medan bilder tas. Magneten flyttas sedan fram och tillbaka längs eller i sidled över luftstrupen medan bilderna fortsätter att tas.
Magnetkonfiguration för in vivo-avbildning (a) en enda magnet ovanför luftstrupen i en vinkel på cirka 30°, (b) två magneter inställda för att attrahera, (c) två magneter inställda för att repellera, (d) en enda magnet ovanför och vinkelrätt i luftstrupen. Observatören tittade ner från munnen till lungorna genom luftstrupen, och röntgenstrålen passerade genom råttans vänstra sida och lämnade höger sida. Magneten flyttas antingen längs luftvägarnas längd eller åt vänster och höger ovanför luftstrupen i röntgenstrålens riktning.
Vi försökte också fastställa partiklarnas synlighet och beteende i luftvägarna i frånvaro av störande andning och hjärtrörelser. Därför avlivades djuren humant i slutet av avbildningsperioden för överdosering av pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Vissa djur lämnades kvar på avbildningsplattformen, och när andning och hjärtslag upphörde upprepades avbildningsprocessen, med tillsats av ytterligare en dos MP om ingen MP syntes på luftvägsytan.
De erhållna bilderna korrigerades för både plattfält och mörkfält och sattes sedan samman till en film (20 bilder per sekund; 15–25 × normal hastighet beroende på andningsfrekvens) med hjälp av ett anpassat skript skrivet i MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alla studier av LV-genvektorleverans genomfördes vid Laboratory Animal Research Facility vid University of Adelaide och syftade till att använda resultaten från SPring-8-experimentet för att bedöma om LV-MP-leverans i närvaro av ett magnetfält kunde förbättra genöverföring in vivo. För att bedöma effekterna av MP och magnetfält behandlades två grupper av djur: en grupp fick LV-MP med en magnet placerad, och den andra gruppen fick en kontrollgrupp med LV-MP utan magnet.
LV-genvektorer genererades med hjälp av tidigare beskrivna metoder 25, 26. LacZ-vektorn uttrycker den nukleärt lokaliserade beta-galaktosidasgenen som drivs av den konstitutiva MPSV-promotorn (LV-LacZ), vilken producerar en blå reaktionsprodukt i transducerade celler, synlig i lungvävnadsfronter och vävnadssektioner. Titrering utfördes i cellkulturer genom att manuellt räkna antalet LacZ-positiva celler med en hemocytometer för att beräkna titern i TU/ml. Bärarna kryokonserveras vid -80 °C, tinas före användning och binds till CombiMag genom blandning i förhållandet 1:1 och inkubering på is i minst 30 minuter före leverans.
Normala Sprague Dawley-råttor (n = 3/grupp, ~2-3 sövdes intraperitonealt med en blandning av 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) och 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australien) (i.p.) injektion (månaders gamla) och icke-kirurgisk oral kanylering med en 16 Ga iv-kanyl. För att säkerställa att den trakeala luftvägsvävnaden får LV-transduktion konditionerades den med vårt tidigare beskrivna mekaniska perturbationsprotokoll, där den trakeala luftvägsytan gnuggades axiellt med en trådkorg (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s-28. Trakeal administrering av LV-MP utfördes sedan i ett biologiskt säkerhetsskåp cirka 10 minuter efter perturbationen.
Magnetfältet som användes i detta experiment konfigurerades på ett liknande sätt som in vivo-röntgenavbildningsstudien, med samma magneter hållna ovanför luftstrupen med hjälp av destillationsstentklämmor (Figur 4). En volym på 50 μl (2 × 25 μl alikvoter) LV-MP administrerades i luftstrupen (n = 3 djur) med hjälp av en pipett innehållande en gelspets som tidigare beskrivits. En kontrollgrupp (n = 3 djur) fick samma LV-MP utan användning av en magnet. Efter att infusionen är avslutad avlägsnas kanylen från ET-röret och djuret extuberas. Magneten sitter kvar i 10 minuter, sedan avlägsnas den. Råttorna fick en subkutan dos meloxikam (1 ml/kg) (Ilium, Australien) följt av reversering av anestesin genom ip-injektion av 1 mg/kg atipamazolhydroklorid (Antisedan, Zoetis, Australien). Råttorna hölls varma och övervakades tills de hade återhämtat sig helt från anestesin.
LV-MP-administreringsanordning i ett biologiskt säkerhetsskåp. Den ljusgrå Luer-hubben på ET-röret kan ses sticka ut från munnen och pipettens gelspets som visas på bilden förs in genom ET-röret till önskat djup i luftstrupen.
En vecka efter LV-MP-doseringsproceduren avlivades djuren humant genom 100 % CO2-inhalation och LacZ-uttrycket bedömdes med vår standardbehandling av X-gal. De tre kaudala, mest broskiga ringarna avlägsnades för att säkerställa att eventuell mekanisk skada eller vätskeretention från placering av endotrakealtub inte inkluderades i analysen. Varje luftstrupe skars längsgående för att skapa två halvor för analys, och de monterades i en skål innehållande silikongummi (Sylgard, Dow Inc) med hjälp av en Minutien-nål (Fine Science Tools) för att visualisera luminalytan. Distributionen och mönstret av transducerade celler bekräftades genom frontalfotografering med ett Nikon-mikroskop (SMZ1500) med en DigiLite-kamera och TCapture-programvara (Tucsen Photonics, Kina). Bilder togs med 20x förstoring (inklusive den högsta inställningen för luftstrupens fulla bredd), med hela luftstrupens längd avbildad steg för steg, vilket säkerställde tillräcklig överlappning mellan varje bild för att möjliggöra bild-"sammanfogning". Bilder från varje luftstrupe sattes sedan ihop till en enda sammansatt bild med hjälp av Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) som använder en plan rörelsealgoritm. LacZ-uttrycksområden i sammansatta bilder av luftstrupen från varje djur kvantifierades med hjälp av ett automatiserat MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidigare beskrivits, med inställningar på 0,35 < nyans < 0,58, mättnad > 0,15 och värde < 0,7. Genom att spåra vävnadens konturer genererades en mask manuellt i GIMP v2.10.24 för varje sammansatt bild för att identifiera vävnadsområdet och förhindra falska detektioner utifrån luftstrupsvävnaden. De färgade områdena från alla sammansatta bilder från varje djur summerades för att generera det totala färgade området för det djuret. Det färgade området dividerades sedan med det totala maskområdet för att generera det normaliserade området.
Varje luftstrupe inbäddades i paraffin och 5 μm-snitt skars ut. Snitten motfärgades med neutralt fast rött i 5 minuter och bilder erhölls med ett Nikon Eclipse E400-mikroskop, DS-Fi3-kamera och NIS-elementinspelningsprogramvara (version 5.20.00).
Alla statistiska analyser utfördes i GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistisk signifikans sattes till p ≤ 0,05. Normaliteten verifierades med Shapiro-Wilk-testet, och skillnader i LacZ-färgning bedömdes med det oparade t-testet.
De sex MP-partiklarna som beskrivs i tabell 1 undersöktes med PCXI, och synligheten beskrivs i tabell 2. Två polystyren-MP-partiklar (MP1 och MP2; 18 μm respektive 0,25 μm) var inte synliga under PCXI, men resten av proverna var identifierbara (exempel visas i figur 5). MP3 och MP4 (10–15 % Fe3O4; 0,25 μm respektive 0,9 μm) är svagt synliga. Även om de innehöll några av de minsta testade partiklarna, var MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 μm) den mest uttalade. CombiMag-produkten MP6 är svår att upptäcka. I samtliga fall förbättrades vår förmåga att detektera MP avsevärt genom att magneten förflyttades fram och tillbaka parallellt med kapillären. När magneterna rörde sig bort från kapillären sträckte sig partiklarna i långa strängar, men när magneterna kom närmare och magnetfältstyrkan ökade förkortades partikelsträngarna när partiklarna migrerade mot kapillärens övre yta (se kompletterande video S1: MP4), vilket ökade... partikeldensiteten på ytan. Omvänt, när magneten avlägsnas från kapillären, minskar fältstyrkan och mikroskopiska partiklar omorganiseras till långa strängar som sträcker sig från kapillärens övre yta (se kompletterande video S2: MP4). Efter att magneten slutat röra sig fortsätter partiklarna att röra sig en kort tid efter att de nått jämviktspositionen. När mikroskopiska partiklarna rör sig mot och bort från kapillärens övre yta drar de magnetiska partiklarna vanligtvis skräpet genom vätskan.
Synligheten av MP under PCXI varierar avsevärt mellan proverna. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 och (d) MP6. Alla bilder som visas här togs med en magnet placerad cirka 10 mm direkt ovanför kapillärröret. De synliga stora cirklarna är luftbubblor instängda i kapillärerna, vilket tydligt visar de svartvita kantfunktionerna i faskontrastavbildning. Den röda rutan innehåller den kontrastförstärkande förstoringen. Observera att diametrarna på magnetschemat i alla figurer inte är skalenliga och är cirka 100 gånger större än vad som visas.
När magneten förflyttas åt vänster och höger längs kapillärrörets topp ändras vinkeln på MP-strängen för att passa in med magneten (se figur 6), vilket avgränsar magnetfältslinjerna. För MP3-5, efter att kordan når en tröskelvinkel, släpas partiklarna längs kapillärrörets övre yta. Detta resulterar ofta i att MP:er klustrar i större grupper nära där magnetfältet är starkast (se kompletterande video S3:MP5). Detta är också särskilt tydligt vid avbildning nära kapilläränden, vilket får MP:er att aggregera och koncentrera sig vid gränssnittet mellan vätska och luft. Partiklar i MP6, som var svårare att urskilja än MP3-5, släpades inte när magneten rörde sig längs kapillärröret, men MP-strängarna dissocierade, vilket lämnade partiklarna i synfältet (se kompletterande video S4:MP6). I vissa fall, när det applicerade magnetfältet reducerades genom att flytta magneten ett stort avstånd från avbildningsplatsen, sjönk eventuella återstående MP:er långsamt ner till rörets bottenyta av gravitationen medan de stannade kvar i strängen (se kompletterande video S5: MP3).
MP-strängens vinkel ändras när magneten förflyttas åt höger ovanför kapillärröret. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 och (d) MP6. Den röda rutan innehåller den kontrastförstärkande förstoringsgraden. Observera att de kompletterande videorna är informativa eftersom de avslöjar viktig partikelstruktur och dynamisk information som inte kan visualiseras i dessa statiska bilder.
Våra tester visade att långsam förflyttning av magneten fram och tillbaka längs luftstrupen underlättar visualiseringen av MP i samband med komplex rörelse in vivo. In vivo-testning utfördes inte eftersom polystyrenkulor (MP1 och MP2) inte var synliga i kapillärröret. Var och en av de återstående fyra MP:erna testades in vivo med magnetens långa axel konfigurerad ovanför luftstrupen i en vinkel på cirka 30° mot vertikalen (se figur 2b och 3a), eftersom detta resulterade i längre MP-kedjor och var mer effektivt än magnetkonfigurationen avslutad. MP3, MP4 och MP6 detekterades inte i luftstrupen hos några levande djur. När råttans luftvägar avbildades efter att djuren hade avlivats humant förblev partiklarna osynliga även när ytterligare volym tillsattes med en sprutpump. MP5 hade den högsta järnoxidhalten och var den enda synliga partikeln, och användes därför för att bedöma och karakterisera MP:s beteende in vivo.
Att placera magneten över luftstrupen under MP-leverans resulterade i att många, men inte alla, MP koncentrerades i synfältet. Partiklar som kommer in i luftstrupen observeras bäst hos djur som avlivats humant. Figur 7 och kompletterande video S6: MP5 visar snabb magnetisk infångning och inriktning av partiklar på ytan av den ventrala luftstrupen, vilket indikerar att MP kan riktas till önskade områden i luftstrupen. Vid sökning mer distalt längs luftstrupen efter MP-leverans hittades vissa MP närmare carina, vilket tyder på att magnetfältstyrkan var otillräcklig för att samla in och behålla alla MP, eftersom de levererades genom området med maximal magnetfältstyrka under vätskeprocessen. Trots detta var MP-koncentrationerna efter förlossningen högre runt det avbildade området, vilket tyder på att många MP stannade kvar i luftvägsområdena där den applicerade magnetfältstyrkan var högst.
Bilder från (a) före och (b) efter tillförsel av MP5 i luftstrupen hos en nyligen avlivad råtta med magneten placerad direkt ovanför avbildningsområdet. Det avbildade området är beläget mellan de två broskringarna. Före tillförsel av MP finns det vätska i luftvägarna. Den röda rutan innehåller den kontrastförstärkande förstoringsglaset. Dessa bilder är från videon som visas i tilläggsvideo S6:MP5.
Att förflytta magneten längs luftstrupen in vivo fick MP-kedjan att ändra vinkel inom luftvägsytan på ett sätt som liknar det som ses i kapillärer (se figur 8 och kompletterande video S7:MP5). I vår studie kunde dock inte MP:er dras längs ytan av den levande luftvägen som de kunde med kapillärer. I vissa fall blir MP-kedjan längre när magneten rör sig åt vänster och höger. Intressant nog fann vi också att partikelsträngen verkar ändra djupet på ytvätskelagret när magneten förflyttas i längdriktningen längs luftstrupen, och expanderar när magneten förflyttas direkt ovanför och partikelsträngen roteras till ett vertikalt läge (se kompletterande video S7). : MP5 vid 0:09, längst ner till höger). Det karakteristiska rörelsemönstret förändrades när magneten förflyttades lateralt över luftstrupens topp (det vill säga till vänster eller höger om djuret snarare än längs luftstrupens längd). Partiklarna var fortfarande tydligt synliga när de rörde sig, men när magneten togs bort från luftstrupen blev spetsarna på partikelsträngarna synliga (se kompletterande video S8:MP5, med början vid 0:08). Detta överensstämmer med MP-beteendet vi observerade under ett applicerat magnetfält i en glaskapillär.
Exempelbilder som visar MP5 i luftstrupen hos en levande, sövd råtta. (a) Magneten används för att ta bilder ovanför och till vänster om luftstrupen, sedan (b) efter att magneten flyttats till höger. Den röda rutan innehåller den kontrastförstärkande förstoringsgraden. Dessa bilder är från videon som visas i tilläggsvideo S7:MP5.
När de två polerna konfigurerades i en nord-sydlig orientering ovanför och under luftstrupen (dvs. attraherande; Fig. 3b), verkade MP-kordorna längre och var belägna på luftstrupens sidovägg snarare än på den dorsala luftstrupens yta (se kompletterande video S9:MP5). Emellertid detekterades inte höga koncentrationer av partiklar på en enda plats (dvs. luftstrupens dorsala yta) efter vätsketillförsel när en dubbelmagnetanordning användes, vilket vanligtvis inträffar när en enkelmagnetanordning används. När sedan en magnet konfigurerades för att stöta bort polerna i omvänd ordning (Fig. 3c), verkade antalet synliga partiklar i synfältet inte öka efter tillförseln. Installationen av båda dubbelmagnetkonfigurationerna är utmanande på grund av de höga magnetfältstyrkorna som drar respektive trycker på magneterna. Installationen ändrades sedan till en enda magnet parallellt med luftvägen men som passerade genom luftvägen i 90 grader så att fältlinjerna korsade luftstrupens vägg ortogonalt (Fig. 3d), en orientering utformad för att avgöra om partikelaggregation på sidoväggen kunde observeras. Emellertid, i I denna konfiguration fanns ingen identifierbar rörelse av MP-ackumulering eller magnetrörelse. Baserat på alla dessa resultat valdes en konfiguration med en enda magnet och 30-graders orientering (Figur 3a) för in vivo-genbärarstudier.
När djuret avbildades upprepade gånger omedelbart efter human avlivning, innebar avsaknaden av störande vävnadsrörelser att finare och kortare partikellinjer kunde urskiljas i det tydliga interkondrala fältet, "vingliga" i linje med magnetens translationsrörelse. Trots detta kan man fortfarande inte tydligt se närvaron och rörelsen av MP6-partiklar.
LV-LacZ-titern var 1,8 × 108 TU/ml, och efter 1:1-blandning med CombiMag MP (MP6) fick djuren en 50 μl trakeal dos av 9 × 107 TU/ml LV-vehikel (dvs. 4,5 × 106 TU/råtta). I dessa studier fixerade vi magneten i en position istället för att translatera den under förlossningen för att avgöra om LV-transduktion (a) kunde förbättras jämfört med vektortillförsel i frånvaro av ett magnetfält, och (b) kunde fokuseras. Luftvägsceller transduceras till magnetiska målområden i de övre luftvägarna.
Närvaron av magneter och användningen av CombiMag i kombination med LV-vektorer verkade inte ha några negativa effekter på djurens hälsa, liksom vårt standardprotokoll för leverans av LV-vektorer. Frontala bilder av trakealregionen som utsattes för mekanisk störning (kompletterande figur 1) indikerade att det fanns signifikant högre transduktionsnivåer i gruppen djur som behandlades med LV-MP när magneten var närvarande (figur 9a). Endast en liten mängd blå LacZ-färgning fanns i kontrollgruppen (figur 9b). Kvantifiering av normaliserade X-Gal-färgade områden visade att administrering av LV-MP i närvaro av ett magnetfält gav en ungefär 6-faldig förbättring (figur 9c).
Exempel på sammansatta bilder som visar trakealtransduktion med LV-MP (a) i närvaro av ett magnetfält och (b) i frånvaro av en magnet. (c) Statistiskt signifikant förbättring av normaliserat LacZ-transduktionsarean i luftstrupen vid användning av magnet (*p = 0,029, t-test, n = 3 per grupp, medelvärde ± SEM).
Neutrala snabba rödfärgade sektioner (exempel visas i kompletterande figur 2) visade LacZ-färgade celler närvarande i ett liknande mönster och på en liknande plats som tidigare rapporterats.
En viktig utmaning för genterapi för luftvägarna är fortfarande att korrekt lokalisera bärarpartiklar till intressanta regioner och uppnå hög transduktionseffektivitet i den rörliga lungan i närvaro av luftflöde och aktiv slemrening. För vänsterkammarbärare utformade för att behandla CF-luftvägssjukdom har det hittills varit ett svårfångat mål att öka uppehållstiden för bärarpartiklar i de ledande luftvägarna. Som påpekats av Castellani et al. har användningen av magnetfält för att förbättra transduktion fördelar jämfört med andra genleveransmetoder såsom elektroporation, eftersom det kan kombinera enkelhet, kostnadseffektivitet, leveranslokalisering, ökad effektivitet och kortare inkubationstider, och möjligen en mindre bärardos10. Emellertid har in vivo-deponering och beteende hos magnetiska partiklar i luftvägarna under påverkan av externa magnetiska krafter aldrig beskrivits, och inte heller har genomförbarheten av denna metod demonstrerats in vivo för att förbättra genuttrycksnivåerna i intakta levande luftvägar.
Våra in vitro-synkrotron-PCXI-experiment visade att alla partiklar vi testade, med undantag för polystyren-MP, var synliga i den avbildningsuppsättning vi använde. I närvaro av ett magnetfält bildar MP:er strängar vars längder är relaterade till partikeltyp och magnetfältstyrka (dvs. närhet och rörelse hos magneten). Som visas i figur 10 bildas de strängar vi observerar på grund av att varje enskild partikel magnetiseras och inducerar sitt eget lokala magnetfält. Dessa separata fält får andra liknande partiklar att aggregera och sammankopplas, med gruppsträngliknande rörelser på grund av lokala krafter från de lokala attraktiva och repulsiva krafterna hos andra partiklar.
Schematisk bild som visar (a, b) partikeltåg genererade inuti vätskefyllda kapillärer och (c, d) luftfylld luftstrupe. Observera att kapillärerna och luftstrupen inte är ritade i skala. Panel (a) innehåller också en beskrivning av MP, som innehåller Fe3O4-partiklar arrangerade i strängar.
När magneten flyttades ovanför kapillärröret nådde partikelsträngens vinkel ett kritiskt tröskelvärde för MP3-5 innehållande Fe3O4, varefter partikelsträngen inte längre stannade kvar i sin ursprungliga position, utan rörde sig längs ytan till en ny position.magnet.Denna effekt uppstår sannolikt eftersom glaskapillärytan är tillräckligt slät för att tillåta denna rörelse.Intressant nog betedde sig MP6 (CombiMag) inte på detta sätt, möjligen för att partiklarna var mindre, hade olika beläggningar eller ytladdningar, eller för att en patentskyddad bärarvätska påverkade deras förmåga att röra sig.Bildkontrasten för CombiMag-partiklar är också svagare, vilket tyder på att vätskan och partiklarna kan ha liknande densiteter och därför inte lätt röra sig mot varandra.Partiklar kan också fastna om magneten rör sig för snabbt, vilket indikerar att magnetfältstyrkan inte alltid kan övervinna friktionen mellan partiklar i vätskan, vilket tyder på att det kanske inte är förvånande att magnetfältstyrkan och avståndet mellan magneten och målområdet är mycket viktigt.Sammantaget tyder dessa resultat också på att även om magneter kan fånga många MP som flödar genom målområdet, är det osannolikt att magneter kan litas på att de rör sig. CombiMag-partiklar längs luftstrupens yta. Därför drar vi slutsatsen att in vivo LV-MP-studier bör använda statiska magnetfält för att fysiskt rikta in sig på specifika regioner i luftvägsträdet.
När partiklar levereras i kroppen är de svåra att identifiera i samband med komplex rörlig kroppsvävnad, men förmågan att detektera dem förbättrades genom att magneten förflyttades horisontellt ovanför luftstrupen för att "vifta" med MP-strängarna. Även om live-avbildning är möjlig är det lättare att urskilja partikelrörelser när djuret har avlivats humant. MP-koncentrationerna var generellt högst på denna plats när magneten placerades ovanför avbildningsområdet, även om vissa partiklar vanligtvis hittades längre längs luftstrupen. Till skillnad från in vitro-studier kan partiklar inte dras längs luftstrupen genom att magneten förflyttas. Detta fynd överensstämmer med hur slemmet som täcker luftstrupens yta vanligtvis bearbetar inandade partiklar, fångar dem i slemmet och sedan rensas ut av den mukociliära clearance-mekanismen.
Vi antog att användningen av magneter för attraktion ovanför och under luftstrupen (Fig. 3b) skulle kunna resultera i ett mer enhetligt magnetfält, snarare än ett magnetfält som är starkt koncentrerat vid en punkt, vilket potentiellt kan leda till en mer enhetlig fördelning av partiklar. Vår preliminära studie fann dock inga tydliga bevis som stöder denna hypotes. Likaså resulterade konfigurationen av ett par magneter för att stöta bort (Fig. 3c) inte i mer partikelavsättning i det avbildade området. Dessa två fynd visar att dubbelmagnetuppsättningen inte signifikant förbättrar den lokala kontrollen av MP-inriktning, och att de resulterande starka magnetiska krafterna är svåra att konfigurera, vilket gör denna metod mindre praktisk. På liknande sätt ökade inte heller antalet partiklar som kvarhölls i det avbildade området att orientera magneten ovanför och genom luftstrupen (Fig. 3d). Vissa av dessa alternativa konfigurationer kanske inte är framgångsrika eftersom de resulterar i lägre magnetfältstyrkor inom avsättningsområdet. Därför anses konfigurationen med en enda 30-graders vinkelmagnet (Figur 3a) vara den enklaste och mest effektiva metoden för in vivo-testning.
LV-MP-studien visade att när LV-vektorer kombinerades med CombiMag och administrerades efter fysisk störning i närvaro av ett magnetfält, ökade transduktionsnivåerna signifikant i luftstrupen jämfört med kontrollgruppen. Baserat på synkrotronavbildningsstudierna och LacZ-resultaten kunde magnetfältet tydligen bevara LV i luftstrupen och minska antalet vektorpartiklar som omedelbart penetrerade djupt in i lungan. Sådana förbättringar av målinriktningen kan leda till högre effektivitet samtidigt som levererade titrar, transduktion utanför målet, inflammatoriska och immunologiska biverkningar samt kostnader för genbärare minskas. Viktigt är att CombiMag enligt tillverkaren kan användas tillsammans med andra genöverföringsmetoder, inklusive med andra virala vektorer (såsom AAV) och nukleinsyror.