Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Kystisen fibroosin keuhkosairauden hoitoon tarkoitettujen geenivektorien tulisi kohdistua johtaviin hengitysteihin, koska perifeerinen keuhkotransduktio ei tarjoa terapeuttista hyötyä. Viruksen transduktiotehokkuus liittyy suoraan vektorin viipymäaikaan. Geenikantajien kaltaiset kuljetusnesteet diffundoituvat kuitenkin luonnostaan ​​keuhkorakkuloihin sisäänhengityksen aikana, ja minkä tahansa muodon terapeuttiset hiukkaset poistuvat nopeasti sylinterimäisen kuljetuksen kautta. Geenikantajien viipymäajan pidentäminen hengitysteissä on tärkeää, mutta vaikeaa saavuttaa. Geenikantajien kanssa konjugoidut magneettiset hiukkaset, jotka voidaan ohjata hengitysteiden pinnalle, voivat parantaa alueellista kohdentamista. In vivo -visualisoinnin haasteiden vuoksi tällaisten pienten magneettisten hiukkasten käyttäytymistä hengitysteiden pinnalla käytetyn magneettikentän läsnä ollessa ymmärretään huonosti. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli käyttää synkrotronikuvausta visualisoidakseen magneettisten hiukkasten sarjan liikettä in vivo nukutettujen rottien henkitorvessa, jotta voitaisiin tutkia yksittäisten ja joukkohiukkasten käyttäytymisen dynamiikkaa ja malleja in vivo. Sitten arvioimme myös, lisäisikö lentiviraalisten magneettisten hiukkasten anto magneettikentän läsnä ollessa transduktiotehokkuutta rotan henkitorvessa. Synkrotroniröntgenkuvaus paljastaa magneettisten hiukkasten käyttäytymisen. hiukkasia kiinteissä ja liikkuvissa magneettikentissä in vitro ja in vivo. Hiukkasia ei voida helposti vetää elävien hengitysteiden pintaa pitkin magneeteilla, mutta kuljetuksen aikana kertymät keskittyvät näkökenttään, jossa magneettikenttä on voimakkain. Transduktiotehokkuus kasvoi myös kuusinkertaisesti, kun lentiviraalisia magneettihiukkasia annettiin magneettikentän läsnä ollessa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että lentiviraaliset magneettihiukkaset ja magneettikentät voivat olla arvokkaita lähestymistapoja geenivektorien kohdentamisen parantamiseksi ja transduktiotasojen lisäämiseksi johtavissa hengitysteissä in vivo.
Kystinen fibroosi (CF) johtuu yhden geenin, CF-transmembraanikonduktanssisäätelijägeenin (CFTR), vaihtelusta. CFTR-proteiini on ionikanava, jota esiintyy monissa epiteelisoluissa koko kehossa, mukaan lukien johtavissa hengitysteissä, jotka ovat CF:n patogeneesin tärkein paikka. CFTR-defektit johtavat epänormaaliin vedenkuljetukseen, kuivattavat hengitysteiden pintaa ja vähentävät hengitysteiden pinnan nestekerroksen (ASL) syvyyttä. Tämä myös heikentää sylinterimäisen kuljetusjärjestelmän (MCT) kykyä poistaa hengitettyjä hiukkasia ja taudinaiheuttajia hengitysteistä. Tavoitteenamme on kehittää lentiviraalinen (LV) geeniterapia, joka toimittaa oikean kopion CFTR-geenistä ja parantaa ASL:n, MCT:n ja keuhkojen terveyttä, sekä jatkaa uusien teknologioiden kehittämistä, joilla voidaan mitata näitä parametreja in vivo1.
LV-vektorit ovat yksi johtavista ehdokkaista CF-hengitysteiden geeniterapiaan, pääasiassa siksi, että ne voivat pysyvästi integroida terapeuttisen geenin hengitysteiden tyvisoluihin (hengitysteiden kantasoluihin). Tämä on tärkeää, koska ne voivat palauttaa normaalin nesteytyksen ja liman poistumisen erilaistumalla toiminnallisiksi geenikorjatuiksi CF-assosioituneiksi hengitysteiden pintasoluiksi, mikä johtaa elinikäisiin hyötyihin. LV-vektorit tulisi suunnata johtavia hengitysteitä vastaan, koska tässä CF-keuhkosairaus alkaa. Vektorin toimittaminen syvemmälle keuhkoihin voi johtaa alveolaariseen transduktioon, mutta tällä ei ole terapeuttista hyötyä CF:ssä. Nesteet, kuten geeninkantajat, kulkeutuvat kuitenkin luonnollisesti alveoleihin sisäänhengityksen jälkeen toimituksen jälkeen3,4 ja terapeuttiset hiukkaset poistuvat nopeasti suuonteloon MCT:n avulla. LV-transduktiotehokkuus liittyy suoraan siihen, kuinka kauan vektori pysyy kohdesolujen vieressä solujen sisäänoton mahdollistamiseksi – "viipymäaika"5 – jota tyypillinen alueellinen ilmavirtaus sekä koordinoitu hiukkasten liman talteenotto ja MCT lyhentävät helposti. CF:ssä kyky pidentää LV:n viipymäaikaa hengitysteissä on tärkeää korkean transduktiotasojen saavuttamiseksi tällä alueella, mutta se on toistaiseksi ollut haastavaa.
Tämän esteen voittamiseksi ehdotamme, että LV-magneettiset hiukkaset (MP) voivat auttaa kahdella toisiaan täydentävällä tavalla. Ensinnäkin ne voidaan ohjata magneettisesti hengitysteiden pinnalle kohdentamisen parantamiseksi ja geeninkantajahiukkasten auttamiseksi pysymään halutulla hengitysteiden alueella; ja ASL) siirtymään solukerrokseen 6. MP:itä on käytetty laajalti kohdennettuina lääkkeiden kuljetusvälineinä, kun ne sitoutuvat vasta-aineisiin, kemoterapeuttisiin lääkkeisiin tai muihin pieniin molekyyleihin, jotka kiinnittyvät solukalvoihin tai sitoutuvat asiaankuuluviin solun pinnan reseptoreihin ja kerääntyvät kasvainpaikkoihin staattisen sähkön läsnä ollessa. Magneettikentät syövän hoidossa 7. Muilla "hypertermitekniikoilla" pyritään lämmittämään MP:itä, kun ne altistetaan värähteleville magneettikentille, mikä tuhoaa kasvainsoluja. Magneettisen transfektion periaatetta, jossa magneettikenttää käytetään transfektioaineena DNA:n siirron tehostamiseksi soluihin, käytetään yleisesti in vitro käyttäen erilaisia ​​ei-viraalisia ja viraalisia geenivektoreita vaikeasti transdusoitaville solulinjoille. LV-magnetotransfektion tehokkuus on osoitettu, kun LV-MP:itä on annettu in vitro ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinjaan staattisen magneettikentän läsnä ollessa, mikä lisää transduktiotehokkuutta 186-kertaisesti verrattuna pelkkään LV-vektoriin. LV-MP:tä on sovellettu myös in vitro CF-malliin, jossa magneettinen transfektio lisäsi LV:n transduktiota ilma-neste-rajapintaviljelmissä 20-kertaisesti CF-ysköksen läsnä ollessa10. Elinten in vivo -magnetotransfektio on kuitenkin saanut suhteellisen vähän huomiota, ja sitä on arvioitu vain muutamissa eläinkokeissa11,12,13,14,15, erityisesti keuhkoissa16,17. Siitä huolimatta magneettisen transfektion mahdollisuudet CF-keuhkohoidon tulokset ovat selvät. Tan ym. (2020) totesivat, että "tehokkaan magneettisten nanopartikkelien keuhkoihin annostelun konseptitutkimus tasoittaa tietä tuleville CFTR-inhalaatiostrategioille kliinisten tulosten parantamiseksi CF-potilailla"6.
Pienten magneettisten hiukkasten käyttäytymistä hengitysteiden pinnoilla magneettikentän läsnä ollessa on vaikea visualisoida ja tutkia, ja siksi sitä ymmärretään huonosti. Muissa tutkimuksissa kehitimme synkrotroni-etenemiseen perustuvan faasikontrasti-röntgenkuvantamismenetelmän (PB-PCXI), jolla voidaan visualisoida ja kvantifioida ei-invasiivisesti pieniä in vivo -muutoksia ASL-syvyydessä18 ja MCT-käyttäytymisessä19,20 kaasukanavan pinnan nesteytyksen suoraan mittaamiseksi ja sitä käytetään hoidon tehokkuuden varhaisena indikaattorina. Lisäksi MCT-arviointimenetelmämme käyttää 10–35 µm:n halkaisijaltaan olevia hiukkasia, jotka koostuvat alumiinioksidista tai korkean taitekertoimen lasista, MCT-markkereina, jotka ovat näkyvissä PB-PCXI:llä21. Molemmat tekniikat soveltuvat useiden hiukkastyyppien, mukaan lukien MP:n, visualisointiin.
Korkean spatiaalisen ja ajallisen resoluutionsa ansiosta PB-PCXI-pohjaiset ASL- ja MCT-analyysitekniikkamme soveltuvat hyvin yksittäisten ja massahiukkasten käyttäytymisen dynamiikan ja mallien tutkimiseen in vivo, mikä auttaa meitä ymmärtämään ja optimoimaan MP-geenien kuljetustekniikoita. Käyttämämme lähestymistapa on peräisin SPring-8 BL20B2 -sädelinjaa käyttäneistä tutkimuksistamme, joissa visualisoimme nesteen liikettä hiirien nenän ja keuhkojen hengitysteihin valevektoriannoksen antamisen jälkeen. Tämä auttaa selittämään geenikantajien annoseläimillä tehdyissä tutkimuksissa havaittuja epätasaisia ​​geenien ilmentymismalleja3,4.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli käyttää synkrotroni-PB-PCXI:tä visualisoidakseen useiden MP-hiukkasten liikkeitä elävien rottien henkitorvessa in vivo. Nämä PB-PCXI-kuvantamistutkimukset suunniteltiin testaamaan erilaisia ​​MP-hiukkasia, magneettikentän voimakkuuksia ja sijainteja niiden vaikutuksen MP-liikkeeseen määrittämiseksi. Oletimme, että ulkoisesti käytetty magneettikenttä auttaisi toimitettua MP:tä pysymään kohdealueella tai liikkumaan siihen. Näiden tutkimusten avulla pystyimme myös tunnistamaan magneettikonfiguraatioita, jotka maksimoivat henkitorveen jäävien hiukkasten määrän kerrostumisen jälkeen. Toisessa tutkimussarjassa pyrimme käyttämään tätä optimaalista konfiguraatiota osoittaaksemme LV-MP:iden in vivo -toiminnasta rotan hengitysteihin johtuvan transduktiokuvion. Oletuksena oli, että LV-MP:iden toimittaminen hengitysteiden kohdentamisen yhteydessä parantaisi LV-transduktiotehokkuutta.
Kaikki eläinkokeet tehtiin Adelaiden yliopiston (M-2019-060 ja M-2020-022) ja SPring-8:n synkrotronieläinten eettisen komitean hyväksymien protokollien mukaisesti. Kokeet tehtiin ARRIVE-ohjeiden mukaisesti.
Kaikki röntgenkuvaus tehtiin Japanin SPring-8-synkrotronin BL20XU-sädelinjalla käyttäen aiemmin kuvatun kaltaista laitteistoa21,22. Lyhyesti sanottuna koelaatikko sijaitsi 245 metrin päässä synkrotronin säilytysrenkaasta. Näytteen ja detektorin välinen etäisyys on 0,6 m hiukkaskuvaustutkimuksissa ja 0,3 m in vivo -kuvaustutkimuksissa vaihekontrastivaikutusten luomiseksi. Käytettiin 25 keV:n monokromaattista sädeenergiaa. Kuvat otettiin käyttämällä korkean resoluution röntgenmuunninta (SPring-8 BM3), joka oli kytketty sCMOS-detektoriin. Muunnin muuntaa röntgensäteet näkyväksi valoksi käyttämällä 10 µm paksua tuikeainetta (Gd3Al2Ga3O12), joka sitten ohjataan sCMOS-anturiin käyttämällä × 10-mikroskooppiobjektiivia (NA 0,3). sCMOS-detektori oli Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japani), jonka matriisikoko oli 2048 × 2048 pikseliä ja raakapikselikoko 6,5 × 6,5 µm. Tämä kokoonpano tuottaa efektiivisen isotrooppisen pikselikoon 0,51 µm ja näkökentän noin 1,1 mm × 1,1 mm. Valotusaikaksi valittiin 100 ms, jotta hengitysteiden sisä- ja ulkopuolella olevien magneettisten hiukkasten signaali-kohinasuhde olisi mahdollisimman hyvä ja samalla hengityksestä aiheutuvat liikeartefaktat minimoituisivat. In vivo -tutkimuksissa röntgenreitille asetettiin nopea röntgensuljin säteilyannoksen rajoittamiseksi estämällä röntgensäteen kulku valotusten välillä.
LV-kantajaa ei käytetty missään SPring-8 PB-PCXI -kuvantamistutkimuksissa, koska BL20XU-kuvantamiskammio ei ole bioturvallisuustason 2 sertifioitu. Sen sijaan valitsimme kahdelta kaupalliselta toimittajalta valikoiman hyvin karakterisoituja MP-materiaaleja – jotka kattoivat erilaisia ​​kokoja, materiaaleja, rautapitoisuuksia ja sovelluksia – ensin ymmärtääksemme, miten magneettikentät vaikuttavat MP-materiaalien liikkeeseen lasikapillaareissa ja sitten elävien hengitysteissä. pinnalla. MP:iden koko vaihtelee 0,25:stä 18 μm:iin ja ne on valmistettu useista eri materiaaleista (katso taulukko 1), mutta kunkin näytteen koostumus, mukaan lukien MP:n sisällä olevien magneettisten hiukkasten koko, on tuntematon. Laajojen MCT-tutkimustemme 19, 20, 21, 23, 24 perusteella odotamme, että jopa 5 μm:n kokoisia MP:itä voidaan nähdä henkitorven hengitysteiden pinnalla, esimerkiksi vähentämällä peräkkäisiä kuvia MP:n liikkeen paremman näkyvyyden havaitsemiseksi. Yksittäinen 0,25 μm:n kokoinen MP on pienempi kuin kuvantamislaitteen resoluutio, mutta PB-PCXI:n odotetaan havaitsevan niiden tilavuuskontrastin ja pintanesteen liikkeen, jolle ne kerrostuvat kerrostuksen jälkeen.
Taulukossa 1 olevien kunkin MP:n näytteet valmistettiin 20 μl:n lasikapillaareihin (Drummond Microcaps, PA, USA), joiden sisähalkaisija oli 0,63 mm. Korpuskulaariset hiukkaset ovat saatavilla vedessä, kun taas CombiMag-hiukkaset ovat saatavilla valmistajan omassa nesteessä. Jokainen putki on puoliksi täytetty nesteellä (noin 11 μl) ja asetettu näytetelineeseen (katso kuva 1). Lasikapillaarit asetettiin vaakasuoraan näytepöydälle kuvantamislaatikossa ja sijoitettiin nesteen reunoille. Halkaisijaltaan 19 mm (28 mm pitkä) nikkelikuorinen harvinaisten maametallien neodyymirautaboori (NdFeB) magneetti (N35, tuotenro LM1652, Jaycar Electronics, Australia), jonka jäännösmagnetismi oli 1,17 Teslaa, kiinnitettiin erilliseen siirtopöytään, jotta sen sijaintia voitaisiin muuttaa etänä kuvantamisen aikana. Röntgenkuvan ottaminen alkaa, kun magneetti on sijoitettu noin 30 mm näytteen yläpuolelle, ja kuvia otetaan 4 kuvan sekuntinopeudella. Kuvauksen aikana magneetti tuotiin lähelle lasikapillaaria. putkeen (noin 1 mm:n päässä) ja sitten siirretään putkea pitkin kentänvoimakkuuden ja sijainnin vaikutusten arvioimiseksi.
In vitro -kuvantamislaitteisto, joka sisältää MP-näytteitä lasikapillaareissa näytteen xy-suuntaisella siirtopöydällä. Röntgensäteen reitti on merkitty punaisella katkoviivalla.
Kun MP:iden näkyvyys in vitro oli varmistettu, osa niistä testattiin in vivo villityypin naaraspuolisilla albiino-Wistar-rotilla (~12 viikon ikäisillä, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidiinia (Domitor®, Zenoaq, Japani), 3,2 mg/kg midatsolaamia (Dormicum®, Astellas Pharma, Japani) ja 4 mg/kg butorfanolia (Vetorphale®, Meiji Seika). Rotat nukutettiin vatsaontelonsisäisellä injektiolla (Pharma, Japani). Anestesian jälkeen rotat valmisteltiin kuvantamista varten poistamalla karva henkitorven ympäriltä, ​​asettamalla endotrakeaalinen putki (ET; 16 Ga iv-kanyyli, Terumo BCT) ja immobilisoimalla ne selinmakuulle mittatilaustyönä valmistetulle kuvantamislevylle, joka sisälsi lämpöpussin ruumiinlämmön ylläpitämiseksi.22 Kuvantamislevy kiinnitettiin sitten kuvantamislaatikon näytesiirtoalustaan ​​pienessä kulmassa henkitorven kohdistamiseksi vaakasuunnassa röntgenkuvassa, kuten kuvassa on esitetty. 2a.
(a) In vivo -kuvantamisasetukset SPring-8-kuvantamislaatikossa, röntgensäteen reitti on merkitty punaisella katkoviivalla. (b, c) Magneetin paikantaminen henkitorveen tehtiin etänä käyttämällä kahta kohtisuoraan asennettua IP-kameraa. Näyttökuvan vasemmalla puolella näkyy päätä pitelevä lankasilmukka ja toimituskanyyli paikallaan ET-putkessa.
Kauko-ohjattava ruiskupumppujärjestelmä (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) käyttäen 100 μl:n lasiruiskua liitettiin PE10-putkeen (ulkohalkaisija 0,61 mm, sisähalkaisija 0,28 mm) 30 Ga:n neulan kautta. Merkitse putki varmistaaksesi, että kärki on oikeassa asennossa henkitorvessa, kun ET-letkua työnnetään sisään. Mikropumpulla ruiskun mäntä vedettiin pois, kun letkun kärki oli upotettu annettavaan MP-näytteeseen. Ladattu syöttöletku asetettiin sitten endotrakeaaliputkeen siten, että kärki sijoitettiin odotetun käytetyn magneettikentän voimakkaimpaan kohtaan. Kuvanottoa ohjattiin hengitysilmaisimella, joka oli kytketty Arduino-pohjaiseen ajastuslaatikkoomme, ja kaikki signaalit (esim. lämpötila, hengitys, sulkimen avautuminen/sulkeutuminen ja kuvanotto) tallennettiin Powerlabin ja LabChartin (AD Instruments, Sydney, Australia) avulla.22. Kuvattaessa Kun koteloon ei päästy käsiksi, kaksi IP-kameraa (Panasonic BB-SC382) sijoitettiin noin 90° kulmaan toisiinsa nähden ja niitä käytettiin magneetin sijainnin valvomiseen henkitorveen nähden. kuvantamisen aikana (kuva 2b, c). Liikeartefaktien minimoimiseksi otettiin yksi kuva hengitystä kohden loppuvuorovesivirtauksen tasannevaiheen aikana.
Magneetti on kiinnitetty toiseen vaiheeseen, joka voidaan sijoittaa etäältä kuvantamiskotelon ulkopuolelta. Testattiin erilaisia ​​magneettien sijainteja ja kokoonpanoja, mukaan lukien: Asennettu noin 30° kulmaan henkitorven yläpuolelle (kokoonpanot on esitetty kuvissa 2a ja 3a); yksi magneetti eläimen yläpuolelle ja toinen alapuolelle, navat asetettu puoleensa vetämään (kuva 3b); yksi magneetti eläimen yläpuolelle ja toinen alapuolelle, navat asetettu hylkimään (kuva 3c); ja yksi magneetti henkitorven yläpuolelle ja kohtisuoraan siihen nähden (kuva 3d). Kun eläin ja magneetti on konfiguroitu ja testattava MP on ladattu ruiskupumppuun, anna 50 μl:n annos nopeudella 4 μl/s samalla kun otat kuvia. Magneettia liikutetaan sitten edestakaisin henkitorvea pitkin tai sivusuunnassa samalla kun otat kuvia.
Magneetin kokoonpano in vivo -kuvantamista varten (a) yksi magneetti henkitorven yläpuolella noin 30° kulmassa, (b) kaksi magneettia puoleensa vetämään, (c) kaksi magneettia hylkimään, (d) yksi magneetti henkitorven yläpuolella ja kohtisuorassa. Tarkkailija katsoi suusta alas keuhkoihin henkitorven läpi, ja röntgensäde kulki rotan vasemman puolen läpi ja poistui oikealta puolelta. Magneettia joko liikutetaan hengitysteitä pitkin tai henkitorven yläpuolella vasemmalle ja oikealle röntgensäteen suuntaan.
Pyrimme myös määrittämään hiukkasten näkyvyyden ja käyttäytymisen hengitysteissä ilman sekoittavaa hengitystä ja sydämen liikettä. Siksi kuvantamisjakson lopussa eläimet lopetettiin inhimillisesti pentobarbitaalin yliannostuksen vuoksi (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg i.p.). Jotkut eläimet jätettiin kuvantamisalustalle, ja kun hengitys ja sydämenlyönti pysähtyivät, kuvantamisprosessi toistettiin lisäämällä ylimääräinen annos MP:tä, jos MP:tä ei näkynyt hengitysteiden pinnalla.
Hankitut kuvat korjattiin tasakentän ja tummakentän suhteen ja koottiin sitten elokuvaksi (20 kuvaa sekunnissa; 15–25 × normaalinopeus hengitystiheydestä riippuen) käyttämällä MATLABissa (R2020a, The Mathworks) kirjoitettua mukautettua skriptiä.
Kaikki LV-geenivektorien kuljetustutkimukset tehtiin Adelaiden yliopiston laboratorioeläintutkimuskeskuksessa, ja niiden tavoitteena oli käyttää SPring-8-kokeen tuloksia sen arvioimiseksi, voisiko LV-MP:n kuljetus magneettikentän läsnä ollessa parantaa geeninsiirtoa in vivo. MP:n ja magneettikentän vaikutusten arvioimiseksi käsiteltiin kahta eläinryhmää: toiselle ryhmälle annettiin LV-MP:tä, johon oli asetettu magneetti, ja toinen ryhmä sai kontrolliryhmän, joka sai LV-MP:tä ilman magneettia.
LV-geenivektorit luotiin aiemmin kuvatuilla menetelmillä 25, 26. LacZ-vektori ilmentää konstitutiivisen MPSV-promoottorin (LV-LacZ) ohjaamaa tumasoluihin lokalisoitunutta beeta-galaktosidaasigeeniä, joka tuottaa transdusoiduissa soluissa sinisen reaktiotuotteen, joka näkyy keuhkokudoksen etuosissa ja kudosleikkeissä. Titraus suoritettiin soluviljelmissä laskemalla manuaalisesti LacZ-positiivisten solujen lukumäärä hemosytometrillä tiitterin laskemiseksi TU/ml-yksiköissä. Kantaja-aineet kryosäilytetään -80 °C:ssa, sulatetaan ennen käyttöä ja sidotaan CombiMagiin sekoittamalla suhteessa 1:1 ja inkuboimalla jäillä vähintään 30 minuuttia ennen annostelua.
Normaalit Sprague Dawley -rotat (n = 3/ryhmä, ~2-3) nukutettiin vatsaontelonsisäisesti seoksella, joka sisälsi 0,4 mg/kg medetomidiinia (Domitor, Ilium, Australia) ja 60 mg/kg ketamiinia (Ilium, Australia) (kuukauden ikäiset) vatsaontelonsisäisesti injektiolla ja ei-kirurgisella suun kautta asetetulla kanyloinnilla 16 Ga:n iv-kanyylillä. Jotta varmistettaisiin, että henkitorven hengitysteiden kudos saa vasemman kammion transduktiota, se käsiteltiin aiemmin kuvatulla mekaanisella perturbaatioprotokollalla, jossa henkitorven hengitysteiden pintaa hierottiin aksiaalisesti metallikorilla (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 sekunnin ajan. LV-MP:n anto henkitorveen suoritettiin sitten biologisessa turvakaapissa noin 10 minuuttia perturbaation jälkeen.
Tässä kokeessa käytetty magneettikenttä konfiguroitiin samalla tavalla kuin in vivo -röntgenkuvantamisessa, käyttäen samoja magneetteja henkitorven yläpuolella tislausstenttiklipsien avulla (kuva 4). 50 μl:n tilavuus (2 × 25 μl:n annokset) LV-MP:tä annettiin henkitorveen (n = 3 eläintä) aiemmin kuvatulla geelikärjen sisältävällä pipetillä. Kontrolliryhmä (n = 3 eläintä) sai samat LV-MP:t ilman magneettia. Infuusion jälkeen kanyyli poistetaan endotracheaalisesta haimatulehduksesta (ET-putkesta) ja eläin ekstuboidaan. Magneetti pysyy paikallaan 10 minuuttia, minkä jälkeen se poistetaan. Rotat saivat ihonalaisen annoksen meloksikaamia (1 ml/kg) (Ilium, Australia), minkä jälkeen anestesia kumottiin antamalla niille i.p. 1 mg/kg atipamatsolihydrokloridia (Antisedan, Zoetis, Australia). Rottia pidettiin lämpiminä ja tarkkailtiin, kunnes ne toipuivat täysin anestesiasta.
LV-MP-annostelulaite biologisessa turvakaapissa. ET-putken vaaleanharmaa Luer-napa näkyy ulkonevan suusta ja kuvassa näkyvän pipetin geelikärki työnnetään ET-putken läpi haluttuun syvyyteen henkitorveen.
Viikko LV-MP-annostelun jälkeen eläimet lopetettiin inhimillisesti 100 % CO2-hengityksellä ja LacZ-ilmentymistä arvioitiin käyttämällä standardia X-gal-käsittelyämme. Kolme rustomaisinta pyrstörengasta poistettiin sen varmistamiseksi, että analyysiin ei sisällytetty endotrakeaalisen putken asettamisesta aiheutuneita mekaanisia vaurioita tai nesteen kertymistä. Jokainen henkitorvi leikattiin pituussuunnassa kahteen puolikkaaseen analyysiä varten, ja ne kiinnitettiin silikonikumia (Sylgard, Dow Inc) sisältävään astiaan Minutien-neulalla (Fine Science Tools) luminaalisen pinnan visualisoimiseksi. Transdusoitujen solujen jakautuminen ja kuvio varmistettiin etuvalokuvauksella käyttäen Nikon-mikroskooppia (SMZ1500) DigiLite-kameralla ja TCapture-ohjelmistolla (Tucsen Photonics, Kiina). Kuvat otettiin 20-kertaisella suurennuksella (mukaan lukien suurin asetus henkitorven koko leveydelle) ja henkitorven koko pituus kuvattiin askel askeleelta varmistaen riittävän päällekkäisyyden kuvien välillä kuvien "ompelun" mahdollistamiseksi. Kunkin henkitorven kuvat koottiin sitten yhdeksi... yksittäisestä yhdistelmäkuvasta Image Composite Editor v2.0.3 -ohjelmalla (Microsoft Research) käyttäen tasomaista liikealgoritmia. Kunkin eläimen henkitorven yhdistelmäkuvien LacZ-ilmentymisalueet kvantifioitiin käyttämällä automatisoitua MATLAB-skriptiä (R2020a, MathWorks) aiemmin kuvatulla tavalla käyttäen asetuksia 0,35 < Sävy < 0,58, Kylläisyys > 0,15 ja Value < 0,7. Jäljittämällä kudoksen ääriviivat luotiin manuaalisesti maski GIMP v2.10.24 -ohjelmassa jokaiselle yhdistelmäkuvalle kudosalueen tunnistamiseksi ja henkitorven kudoksen ulkopuolelta tulevien virheellisten havaintojen estämiseksi. Kunkin eläimen kaikkien yhdistelmäkuvien värjätyt alueet laskettiin yhteen kyseisen eläimen kokonaisvärjäytyneen alueen laskemiseksi. Värjätty alue jaettiin sitten maskin kokonaispinta-alalla normalisoidun alueen laskemiseksi.
Jokainen henkitorvi upotettiin parafiiniin ja niistä leikattiin 5 μm:n leikkeitä. Leikkeet vastavärjättiin neutraalilla nopealla punaisella 5 minuutin ajan ja kuvat otettiin Nikon Eclipse E400 -mikroskoopilla, DS-Fi3-kameralla ja NIS-elementtien tallennusohjelmistolla (versio 5.20.00).
Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin GraphPad Prism v9 -ohjelmistolla (GraphPad Software, Inc.). Tilastollinen merkitsevyys asetettiin arvoon p ≤ 0,05. Normaalisuus varmistettiin Shapiro-Wilk-testillä ja LacZ-värjäytymisen erot arvioitiin parittamattomalla t-testillä.
Taulukossa 1 kuvattuja kuutta MP:tä tutkittiin PCXI:llä, ja näkyvyys on kuvattu taulukossa 2. Kaksi polystyreenistä MP:tä (MP1 ja MP2; vastaavasti 18 μm ja 0,25 μm) ei näkynyt PCXI:ssä, mutta loput näytteet olivat tunnistettavissa (esimerkkejä on esitetty kuvassa 5). MP3 ja MP4 (10–15 % Fe3O4; 0,25 μm ja 0,9 μm) ovat heikosti näkyvissä. Vaikka ne sisälsivät joitakin pienimmistä testatuista hiukkasista, MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 μm) oli selkein. CombiMag-tuotetta MP6 on vaikea havaita. Kaikissa tapauksissa kykymme havaita MP:tä parani merkittävästi siirtämällä magneettia edestakaisin kapillaarin suuntaisesti. Kun magneetit liikkuivat poispäin kapillaarista, hiukkaset venyivät pitkiksi säikeiksi, mutta magneettien lähestyessä ja magneettikentän voimakkuuden kasvaessa hiukkassäikeet lyhenivät hiukkasten siirtyessä kohti kapillaarin yläpintaa (katso lisävideo S1: MP4), mikä lisäsi hiukkastiheyttä. pinnasta. Toisaalta, kun magneetti poistetaan kapillaarista, kentänvoimakkuus pienenee ja MP:t järjestäytyvät pitkiksi säikeiksi, jotka ulottuvat kapillaarin yläpinnasta (katso lisävideo S2:MP4). Kun magneetti pysähtyy, hiukkaset jatkavat liikkumistaan ​​lyhyen aikaa tasapainoasennon saavuttamisen jälkeen. Kun MP liikkuu kohti kapillaarin yläpintaa ja siitä poispäin, magneettiset hiukkaset tyypillisesti vetävät roskat nesteen läpi.
MP:n näkyvyys PCXI:ssä vaihtelee merkittävästi näytteiden välillä. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ja (d) MP6. Kaikki tässä esitetyt kuvat on otettu magneetilla, joka sijaitsi noin 10 mm suoraan kapillaarin yläpuolella. Näkyvät suuret ympyrät ovat kapillaareihin jääneitä ilmakuplia, jotka osoittavat selvästi vaihekontrastikuvauksen mustavalkoiset reunat. Punainen laatikko sisältää kontrastia parantavan suurennoksen. Huomaa, että magneettikaavioiden halkaisijat eivät ole mittakaavassa kaikissa kuvissa ja ovat noin 100 kertaa suurempia kuin esitetyt.
Kun magneetti liikkuu kapillaarin yläpäätä pitkin vasemmalle ja oikealle, MP-säikeen kulma muuttuu magneetin suuntaiseksi (katso kuva 6), mikä rajaa magneettikenttäviivat. MP3-5:ssä, kun jänne saavuttaa kynnyskulman, hiukkaset raahautuvat kapillaarin yläpintaa pitkin. Tämä johtaa usein MP:iden kasaantumiseen suurempiin ryhmiin lähelle paikkaa, jossa magneettikenttä on voimakkain (katso lisävideo S3:MP5). Tämä on myös erityisen ilmeistä kuvatessa lähellä kapillaarin päätä, mikä aiheuttaa MP:iden aggregoitumisen ja keskittymisen neste-ilma-rajapintaan. MP6:n hiukkaset, joita oli vaikeampi havaita kuin MP3-5:ssä, eivät raahautuneet magneetin liikkuessa kapillaaria pitkin, vaan MP-säikeet irtosivat, jolloin hiukkaset jäivät näkökenttään (katso lisävideo S4:MP6). Joissakin tapauksissa, kun käytettyä magneettikenttää vähennettiin siirtämällä magneettia suuri etäisyys kuvauspaikasta, kaikki jäljellä olevat MP:t laskeutuivat hitaasti putken pohjapinnalle painovoiman vaikutuksesta pysyen ketjussa (katso lisävideo S5: MP3).
MP-säikeen kulma muuttuu, kun magneetti siirtyy oikealle kapillaarin yläpuolella. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ja (d) MP6. Punainen laatikko sisältää kontrastia parantavan suurennoksen. Huomaa, että lisävideot ovat informatiivisia, koska ne paljastavat tärkeitä hiukkasrakenteita ja dynaamisia tietoja, joita ei voida visualisoida näissä staattisissa kuvissa.
Testimme osoittivat, että magneetin hidas liikuttelu edestakaisin henkitorvea pitkin helpottaa MP:n visualisointia monimutkaisten liikkeiden yhteydessä in vivo. In vivo -testausta ei tehty, koska polystyreenihelmet (MP1 ja MP2) eivät näkyneet kapillaarissa. Jäljelle jääneitä neljää MP:tä testattiin in vivo siten, että magneetin pitkä akseli oli konfiguroitu henkitorven yläpuolelle noin 30° kulmassa pystysuoraan nähden (katso kuvat 2b ja 3a), koska tämä johti pidempiin MP-ketjuihin ja oli tehokkaampi kuin magneettikonfiguraation lopettaminen. MP3:a, MP4:ää ja MP6:ta ei havaittu elävien eläinten henkitorvessa. Kun rottien hengitysteitä kuvattiin eläinten inhimillisen lopettamisen jälkeen, hiukkaset pysyivät näkymättöminä, vaikka lisätilavuutta lisättiin ruiskupumpulla. MP5:llä oli korkein rautaoksidipitoisuus ja se oli ainoa näkyvä hiukkanen, ja siksi sitä käytettiin MP:n in vivo -käyttäytymisen arviointiin ja karakterisointiin.
Magneetin asettaminen henkitorven päälle MP-annostelun aikana johti siihen, että monet, mutta eivät kaikki, MP-hiukkaset keskittyivät näkökenttään. Henkitorveen tulevat hiukkaset havaitaan parhaiten humalassa lopetetuilla eläimillä. Kuva 7 ja lisävideo S6: MP5 näyttää hiukkasten nopean magneettisen sieppauksen ja kohdistumisen henkitorven vatsanpuoleisen pinnalla, mikä osoittaa, että MP-hiukkaset voidaan ohjata haluttuihin henkitorven alueisiin. Kun etsittiin distaalisesti henkitorvea pitkin MP-annostelun jälkeen, joitakin MP-hiukkasia löytyi lähempänä karinaa, mikä viittaa siihen, että magneettikentän voimakkuus ei riittänyt kaikkien MP-hiukkasten keräämiseen ja pidättämiseen, koska ne annettiin nesteprosessin aikana magneettikentän voimakkuuden maksimaalisen alueen kautta. Synnytyksen jälkeiset MP-pitoisuudet olivat kuitenkin korkeampia kuva-alueen ympärillä, mikä viittaa siihen, että monet MP-hiukkaset pysyivät hengitysteiden alueilla, joilla käytetty magneettikentän voimakkuus oli suurin.
Kuvat (a) ennen MP5:n antamista äskettäin eutanoituneen rotan henkitorveen ja (b) sen jälkeen, kun magneetti on sijoitettu suoraan kuvausalueen yläpuolelle. Kuvausalue sijaitsee kahden rustorenkaan välissä. Ennen MP:n antamista hengitysteissä on jonkin verran nestettä. Punainen laatikko sisältää kontrastia parantavan suurennoksen. Nämä kuvat ovat lisävideossa S6:MP5 esitetyltä videolta.
Magneetin siirtäminen henkitorvea pitkin in vivo aiheutti MP-ketjun kulman muutoksen hengitysteiden pinnalla samalla tavalla kuin kapillaareissa havaitaan (katso kuva 8 ja lisävideo S7:MP5). Tutkimuksessamme MP:itä ei kuitenkaan voitu vetää elävän hengitysteiden pintaa pitkin, kuten kapillaarien tapauksessa. Joissakin tapauksissa MP-ketju pitenee magneetin liikkuessa vasemmalle ja oikealle. Mielenkiintoista kyllä, havaitsimme myös, että hiukkasjono näyttää muuttavan pintanestekerroksen syvyyttä, kun magneettia liikutetaan pituussuunnassa henkitorvea pitkin, ja laajenee, kun magneettia liikutetaan suoraan pään yläpuolelle ja hiukkasjono kierretään pystysuoraan asentoon (katso lisävideo S7). (MP5 kohdassa 0:09, alhaalla oikealla). Liikekuvio muuttui, kun magneettia siirrettiin henkitorven yläosan poikki sivusuunnassa (eli eläimen vasemmalle tai oikealle puolelle eikä henkitorven pituudelta). Hiukkaset olivat edelleen selvästi näkyvissä liikkuessaan, mutta kun magneetti poistettiin henkitorvesta, hiukkasjonojen kärjet tulivat näkyviin (katso lisävideo S8:MP5, alkaen kohdasta 0:08). Tämä on yhdenmukaista lasikapillaarissa magneettikentän vaikutuksesta havaitsemamme MP-käyttäytymisen kanssa.
Esimerkkikuvia MP5:stä elävän nukutetun rotan henkitorvessa. (a) Magneetilla otetaan kuvia henkitorven yläpuolelta ja vasemmalta puolelta, ja (b) magneettia siirretään oikealle. Punainen laatikko sisältää kontrastia parantavan suurennoksen. Nämä kuvat ovat lisävideossa S7:MP5 esitetyltä videolta.
Kun kaksi napaa konfiguroitiin pohjois-eteläsuuntaan henkitorven ylä- ja alapuolelle (eli vetämään puoleensa; kuva 3b), MP-jänteet näyttivät pidemmiltä ja sijaitsivat henkitorven sivuseinämällä pikemminkin kuin henkitorven selkäpuolella (katso lisävideo S9:MP5). Suuria hiukkaspitoisuuksia yhdessä paikassa (eli henkitorven selkäpuolella) ei kuitenkaan havaittu nesteen annostelun jälkeen, kun käytettiin kaksoismagneettilaitetta, mikä tyypillisesti tapahtuu, kun käytetään yksimagneettilaitetta. Sitten, kun yksi magneetti konfiguroitiin hylkimään navat päinvastoin (kuva 3c), näkökentässä näkyvien hiukkasten määrä ei näyttänyt lisääntyvän annostelun jälkeen. Molempien kaksoismagneettikokoonpanojen asetukset ovat haastavia johtuen suurista magneettikentän voimakkuuksista, jotka vetävät tai työntävät magneetteja vastaavasti. Asetus muutettiin sitten yhteen magneettiin, joka oli yhdensuuntainen hengitystien kanssa, mutta kulki hengitystien läpi 90 asteen kulmassa, niin että kenttäviivat ylittivät henkitorven seinämän kohtisuoraan (kuva 3d). Tämä suuntaus oli suunniteltu määrittämään, voidaanko sivuseinällä havaita hiukkasten aggregaatiota. Tässä kokoonpanossa ei kuitenkaan ollut... MP:n kertymisen tai magneetin liikkeen havaittavissa ei ollut. Kaikkien näiden tulosten perusteella in vivo -geenikantajatutkimuksia varten valittiin yhden magneetin, 30 asteen orientaatiokonfiguraatio (kuva 3a).
Kun eläintä kuvattiin toistuvasti heti inhimillisen lopettamisen jälkeen, sekoittavan kudosliikkeen puuttuminen tarkoitti, että selkeässä rustonvälisessä kentässä voitiin erottaa hienompia ja lyhyempiä hiukkasviivoja, jotka "heiluivat" magneetin translaatioliikkeen mukaisesti. Tästä huolimatta MP6-hiukkasten läsnäolo ja liike eivät vieläkään näy selvästi.
LV-LacZ-tiitteri oli 1,8 × 108 TU/ml, ja 1:1 CombiMag MP:n (MP6) kanssa sekoittamisen jälkeen eläimet saivat 50 μl:n henkitorven annoksen 9 × 107 TU/ml LV-vehikkeliä (eli 4,5 × 106 TU/rotta). Näissä tutkimuksissa magneettia ei siirretty synnytyksen aikana, vaan kiinnitettiin yhteen asentoon sen määrittämiseksi, voitaisiinko LV-transduktiota (a) parantaa verrattuna vektorin antamiseen ilman magneettikenttää ja (b) voitaisiinko sitä fokusoida. Hengitysteiden solut transdusoituvat ylempien hengitysteiden magneettisiin kohdealueisiin.
Magneettien läsnäololla ja CombiMagin käytöllä yhdessä LV-vektorien kanssa ei näyttänyt olevan haitallisia vaikutuksia eläinten terveyteen, kuten ei myöskään LV-vektorien vakiomuotoisella annosteluprotokollallamme. Henkitorven alueen etupuolen kuvat, joihin kohdistettiin mekaanista häiriötä (lisäkuva 1), osoittivat, että LV-MP:llä hoidettujen eläinten ryhmässä oli merkittävästi korkeammat transduktiotasot, kun magneetti oli läsnä (kuva 9a). Kontrolliryhmässä oli vain pieni määrä sinistä LacZ-värjäytymistä (kuva 9b). Normalisoitujen X-Gal-värjäytyneiden alueiden kvantifiointi osoitti, että LV-MP:n anto magneettikentän läsnä ollessa tuotti noin kuusinkertaisen parannuksen (kuva 9c).
Esimerkki yhdistelmäkuvista, jotka esittävät LV-MP:n aiheuttamaa henkitorven transduktiota (a) magneettikentän läsnä ollessa ja (b) ilman magneettia. (c) Tilastollisesti merkitsevä parannus normalisoidussa LacZ-transduktioalueella henkitorvessa magneettia käytettäessä (*p = 0,029, t-testi, n = 3 ryhmää kohden, keskiarvo ± SEM).
Neutraalit, nopeasti punaiseksi värjätyt leikkeet (esimerkki lisäkuvassa 2) osoittivat LacZ-värjättyjä soluja, jotka olivat samanlaisessa kuviossa ja paikassa kuin aiemmin on raportoitu.
Hengitysteiden geeniterapian keskeisenä haasteena on edelleen kantajahiukkasten tarkka lokalisointi kiinnostuksen kohteena oleville alueille ja korkean transduktiotehokkuuden saavuttaminen liikkuvassa keuhkossa ilmavirran ja aktiivisen liman poiston yhteydessä. CF-hengitysteiden sairauden hoitoon suunniteltujen LV-kantajien viipymäajan pidentäminen johtavissa hengitysteissä on ollut tähän mennessä vaikeasti saavutettavissa oleva tavoite. Kuten Castellani ym. huomauttivat, magneettikenttien käytöllä transduktion parantamiseksi on etuja verrattuna muihin geeninantomenetelmiin, kuten elektroporaatioon, koska se voi yhdistää yksinkertaisuuden, kustannustehokkuuden, annostelun lokalisaation, lisääntyneen tehokkuuden ja lyhyemmät inkubaatioajat sekä mahdollisesti pienemmän kantaja-annoksen10. Magneettisten hiukkasten in vivo -kerrostumista ja käyttäytymistä hengitysteissä ulkoisten magneettisten voimien vaikutuksen alaisena ei kuitenkaan ole koskaan kuvattu, eikä tämän menetelmän toteutettavuutta in vivo geenien ilmentymistasojen parantamiseksi ehjissä elävissä hengitysteissä ole itse asiassa osoitettu.
In vitro -synkrotroni-PCXI-kokeemme osoittivat, että kaikki testaamamme hiukkaset, polystyreeni-MP:tä lukuun ottamatta, olivat näkyvissä käyttämässämme kuvantamislaitteistossa. Magneettikentän läsnä ollessa MP:t muodostavat säikeitä, joiden pituudet liittyvät hiukkastyyppiin ja magneettikentän voimakkuuteen (eli magneetin läheisyyteen ja liikkeeseen). Kuten kuvassa 10 on esitetty, havaitsemamme säikeet muodostuvat, kun jokainen yksittäinen hiukkanen magnetoituu ja indusoi oman paikallisen magneettikentän. Nämä erilliset kentät aiheuttavat muiden samankaltaisten hiukkasten aggregoitumisen ja yhdistymisen, jolloin ryhmässä tapahtuvat säikeen kaltaiset liikkeet johtuvat muiden hiukkasten paikallisten veto- ja hylkimisvoimien aiheuttamista paikallisista voimista.
Kaaviokuva, joka esittää (a, b) nesteellä täytetyissä kapillaareissa syntyviä hiukkasjonoja ja (c, d) ilmalla täytettyä henkitorvea. Huomaa, että kapillaareja ja henkitorvea ei ole piirretty mittakaavassa. Paneeli (a) sisältää myös kuvauksen MP:stä, joka sisältää jonoihin järjestyneitä Fe3O4-hiukkasia.
Kun magneettia liikutettiin kapillaarin yläpuolella, hiukkasjonon kulma saavutti kriittisen kynnyksen Fe3O4:ää sisältävälle MP3-5:lle, minkä jälkeen hiukkasjono ei enää pysynyt alkuperäisessä asennossaan, vaan siirtyi pintaa pitkin uuteen asentoon. Tämä ilmiö on todennäköinen, koska lasikapillaarin pinta on riittävän sileä, jotta tämä liike voi tapahtua. Mielenkiintoista kyllä, MP6 (CombiMag) ei käyttäytynyt tällä tavalla, mahdollisesti siksi, että hiukkaset olivat pienempiä, niillä oli erilaiset pinnoitteet tai pintavaraukset, tai koska patentoitu kantajaneste vaikutti niiden liikkumiskykyyn. CombiMag-hiukkasten kuvan kontrasti on myös heikompi, mikä viittaa siihen, että nesteellä ja hiukkasilla voi olla samanlaiset tiheydet, eivätkä ne siksi liiku helposti toisiaan kohti. Hiukkaset voivat myös juuttua, jos magneetti liikkuu liian nopeasti, mikä osoittaa, että magneettikentän voimakkuus ei aina voi voittaa hiukkasten välistä kitkaa nesteessä. Tämä viittaa siihen, että ei ehkä ole yllättävää, että magneettikentän voimakkuus ja etäisyys magneetin ja kohdealueen välillä ovat erittäin tärkeitä. Yhdessä nämä tulokset viittaavat myös siihen, että vaikka magneetit voivat vangita monia kohdealueen läpi virtaavia MP:itä, on epätodennäköistä, että magneetteihin voidaan luottaa CombiMag-hiukkasten liikuttamisessa pitkin henkitorven pinnalla. Siksi päädymme siihen, että in vivo LV-MP-tutkimuksissa tulisi käyttää staattisia magneettikenttiä hengitysteiden tiettyjen alueiden fyysiseen kohdistamiseen.
Kun hiukkasia kulkeutuu kehoon, niitä on vaikea tunnistaa monimutkaisten liikkuvien kehon kudosten yhteydessä, mutta niiden havaitsemiskykyä parannettiin siirtämällä magneettia vaakasuunnassa henkitorven yläpuolelle MP-säikeiden "heiluttamiseksi". Vaikka reaaliaikainen kuvantaminen on mahdollista, hiukkasten liike on helpompi havaita, kun eläin on lopetettu inhimillisesti. MP-pitoisuudet olivat yleensä korkeimmat tässä kohdassa, kun magneetti oli kuvausalueen yläpuolella, vaikka joitakin hiukkasia yleensä löydettiin kauempana henkitorvesta. Toisin kuin in vitro -tutkimuksissa, hiukkasia ei voida vetää henkitorvea pitkin magneetin siirtämisen avulla. Tämä havainto on yhdenmukainen sen kanssa, miten henkitorven pintaa peittävä lima tyypillisesti käsittelee sisäänhengitettyjä hiukkasia, vangitsee ne limaan ja poistaa ne myöhemmin säikeiden puhdistumismekanismin avulla.
Oletimme, että magneettien käyttö vetovoimana henkitorven ylä- ja alapuolella (kuva 3b) saattaisi johtaa tasaisempaan magneettikenttään verrattuna yhteen pisteeseen keskittyneeseen magneettikenttään, mikä voisi johtaa hiukkasten tasaisempaan jakautumiseen. Alustava tutkimuksemme ei kuitenkaan löytänyt selkeää näyttöä tämän hypoteesin tueksi. Samoin kahden magneetin konfigurointi hylkiväksi (kuva 3c) ei johtanut hiukkasten kertymisen lisääntymiseen kuva-alueella. Nämä kaksi havaintoa osoittavat, että kaksoismagneettijärjestelmä ei paranna merkittävästi MP-kohdistuksen paikallista hallintaa ja että syntyvät voimakkaat magneettiset voimat ovat vaikeasti konfiguroitavissa, mikä tekee tästä lähestymistavasta vähemmän käytännöllisen. Vastaavasti magneetin suuntaaminen henkitorven yläpuolelle ja läpi (kuva 3d) ei myöskään lisännyt kuva-alueella pidättyneiden hiukkasten määrää. Jotkut näistä vaihtoehtoisista kokoonpanoista eivät välttämättä onnistu, koska ne johtavat pienempiin magneettikentän voimakkuuksiin kertymisalueella. Siksi yhden 30 asteen kulmassa olevan magneetin kokoonpanoa (kuva 3a) pidetään helpoimpana ja tehokkaimpana menetelmänä in vivo -testaukseen.
LV-MP-tutkimus osoitti, että kun LV-vektorit yhdistettiin CombiMagiin ja annosteltiin fyysisen perturbaation jälkeen magneettikentässä, transduktiotasot lisääntyivät merkittävästi henkitorvessa verrattuna kontrolleihin. Synkrotronikuvantamistutkimusten ja LacZ-tulosten perusteella magneettikenttä ilmeisesti kykeni säilyttämään LV:n henkitorven sisällä ja vähentämään välittömästi syvälle keuhkoihin tunkeutuneiden vektorihiukkasten määrää. Tällaiset kohdentamisen parannukset voivat johtaa suurempaan tehoon samalla, kun ne vähentävät annosteltuja tiittereitä, kohteen ulkopuolista transduktiota, tulehduksellisia ja immuunijärjestelmän sivuvaikutuksia sekä geeninkantajien kustannuksia. Valmistajan mukaan CombiMagia voidaan käyttää yhdessä muiden geeninsiirtomenetelmien kanssa, mukaan lukien muiden virusvektorien (kuten AAV) ja nukleiinihappojen kanssa.