Kea leboha ka ho etela Nature.com.Mofuta oa sebatli oo u o sebelisang o na le ts'ehetso e fokolang bakeng sa CSS.Bakeng sa boiphihlelo bo botle ka ho fetisisa, re khothaletsa hore u sebelise sebatli se ntlafalitsoeng (kapa tima mokhoa oa ho lumellana ho Internet Explorer).Khabareng, ho netefatsa tšehetso e tsoelang pele, re tla bonts'a sebaka sena ntle le mekhoa le JavaScript.
Likokoana-hloko tsa liphatsa tsa lefutso bakeng sa phekolo ea lefu la cystic fibrosis matšoafo li lokela ho lebisa litsela tsa ho tsamaisa moea hobane phetisetso ea matšoafo ha e fane ka melemo ea phekolo. Tšebeliso ea kokoana-hloko ea transduction e amana ka ho toba le nako ea ho lula ha vector. nako ea bajari ba liphatsa tsa lefutso litseleng tsa moea ke ea bohlokoa empa ho thata ho e fihlela.Likaroloana tsa makenete tsa Gene carrier-conjugated tse ka lebisoang holim'a litsela tsa moea li ka ntlafatsa sepheo sa libaka.Ka lebaka la liphephetso tsa pono ea in vivo, boitšoaro ba likaroloana tse nyane joalo tsa makenete holim'a sebaka sa moea boteng ba matla a khoheli a sebelisitsoeng ha bo utloisisoe hantle. likaroloana tse ka har'a trachea ea likhoto tse nang le anesthetized ho hlahloba matla le mekhoa ea boitšoaro ba motho ka mong le ea bongata ka har'a vivo. Re ile ra boela ra hlahloba hore na ho fana ka likaroloana tsa lentiviral magnetic ka pel'a matla a khoheli ho ka eketsa katleho ea phetoho ho trachea ea rat. hula ka holim'a moea o phelang ka limatlase, empa nakong ea lipalangoang, li-depositi li tsepamisitsoe sebakeng sa pono moo matla a khoheli a matla ka ho fetesisa.Transduction katleho e ile ea boela ea eketseha ka makhetlo a tšeletseng ha likaroloana tsa lentiviral magnetic li ne li fanoa ka boteng ba magnetic field.Together, liphello tsena li fana ka maikutlo a hore likaroloana tsa lentiviral magnetic fields le matla a khoheli e ka 'na ea e-ba mekhoa ea bohlokoa ea ho ntlafatsa mekhoa ea ho ntlafatsa liphatsa tsa lefutso le liphatsa tsa lefutso.
Cystic fibrosis (CF) e bakoa ke ho fapana ha gene e le 'ngoe e bitsoang CF transmembrane conductance regulator (CFTR) .Protheine ea CFTR ke mocha oa ion o teng liseleng tse ngata tsa epithelial ho pholletsa le' mele, ho kenyelletsa le li-airways tse tsamaisang, sebaka se seholo sa CF pathogenesis. lera.Sena se boetse se sitisa bokhoni ba tsamaiso ea mucociliary transport (MCT) ho tlosa likaroloana tse huloang le likokoana-hloko tse tsoang moeeng.Sepheo sa rona ke ho hlahisa mofuta oa lentiviral (LV) gene therapy ho fana ka kopi e nepahetseng ea lefutso la CFTR le ho ntlafatsa bophelo ba ASL, MCT, le matšoafo, le ho tsoela pele ho hlahisa mekhoa e mecha ea theknoloji e khonang ho metha.
Li-vectors tsa LV ke e 'ngoe ea likhetho tse ka sehloohong bakeng sa phekolo ea CF airway gene therapy, haholo-holo hobane li ka kenyelletsa ka ho sa feleng liphatsa tsa lefutso tsa phekolo ho lisele tsa moea tsa moea (airway stem cells) . Sena ke sa bohlokoa hobane ba ka tsosolosa mokhoa o tloaelehileng oa ho ntša metsi le ho tlosoa ha li-mucus ka ho khetholla ho sebetsa ka liphatsa tsa lefutso tse amanang le CF tse amanang le tsela ea moea ea moea, e leng se fellang ka tsela e tobileng ea ho tsamaisa moea, e leng se etsang hore ho be le melemo ea bophelo bohle. Lefu la matšoafo la CF le qala.Ho hlahisoa ha vector ho teba ka har'a matšoafo ho ka etsa hore alveolar transduction, empa sena ha se na molemo oa phekolo ho CF. Leha ho le joalo, metsi a kang liphatsa tsa lefutso ka tlhaho a fallela alveoli holim'a pululelo ka mor'a ho pepa3,4 le likaroloana tsa phekolo li hlakoloa ka potlako ka har'a molomo oa LV ho ea ho transduction ea molomo ho ea ho nako e amanang le MCT e amanang ka ho toba le lisele tsa MCT. lumella ho kenngoa ha cellular - "nako ea bolulo" 5 - e fokotsoang habonolo ke moea o tloaelehileng oa libaka hammoho le ho kopanngoa ha likaroloana tsa mucus cap le MCT. Bakeng sa CF, bokhoni ba ho lelefatsa nako ea ho lula ha LV ka har'a tsela ea sefofane ke ea bohlokoa ho finyella maemo a phahameng a transduction sebakeng sena, empa ho fihlela joale e bile phephetso.
Ho hlōla tšitiso ena, re fana ka maikutlo a hore LV magnetic particles (MPs) e ka 'na ea thusa ka litsela tse peli tse tlatsanang.Ntlha ea pele, li ka tataisoa ka matla ho ea sebakeng sa moea ho ntlafatsa ho lebisa tlhokomelo le ho thusa likaroloana tsa liphatsa tsa lefutso li lula sebakeng se lakatsehang sa sefofane; le ASL) ho fallela liseleng tsa 6.MPs li 'nile tsa sebelisoa haholo e le likoloi tsa ho tsamaisa lithethefatsi tse lebisitsoeng ha li tlama ho li-antibodies, chemotherapeutic drugs, kapa limolek'hule tse ling tse nyenyane tse khomarelang li-membrane tsa lisele kapa li tlama ho li-receptors tse amehang holim'a lisele le ho bokella libakeng tsa hlahala ka boteng ba motlakase o tsitsitseng. Magnetic Fields for Cancer Treatment 7. Mekhoa e meng ea "hyperthermal" e ikemiselitse ho futhumatsa litho tsa MP ha li pepesehetse ho oscillating magnetic fields, ka tsela eo li senya lisele tsa tumor.Molao-motheo oa magnetic transfection, oo matla a khoheli a sebelisoang e le phetiso ea phetisetso ea DNA ho lisele, e atisa ho sebelisoa ka vitro ho sebelisa mefuta e mengata ea li-non-viral le kokoana-hloko e sebetsang hantle ea lisele tsa LV. magnetotransfection e thehiloe, ka in vitro nehelano ea LV-MPs ho motho bronchial epithelial cell line ka pel'a static matla a khoheli, ho eketsa matla a transduction ka makhetlo a 186 ha ho bapisoa le LV vector feela. sputum10. Leha ho le joalo, in vivo magnetotransfection ea litho tsa 'mele e fumane tlhokomelo e batlang e fokola' me e 'nile ea hlahlojoa feela lithutong tse seng kae tsa liphoofolo11,12,13,14,15, haholo-holo matšoafong16,17.Leha ho le joalo, menyetla ea phetisetso ea makenete kalafong ea matšoafo ea CF e hlakile.Tan et20 bopaki bo matla ba thuto ea "magnetic" e boletse hore "20" thuto ea "magnetic" e boletse. nanoparticle pulmonary delivery e tla bula tsela bakeng sa maano a nakong e tlang a ho hema CFTR ho ntlafatsa sephetho sa kliniki ho bakuli ba CF”6.
Boitšoaro ba likaroloana tse nyane tsa matla a khoheli holim'a boteng ba matla a khoheli a sebelisitsoeng ho thata ho bona le ho ithuta, 'me ka hona ha li utloisisoe hantle.Lithutong tse ling, re thehile mokhoa oa synchrotron-propagation-based phase-contrast X-ray imaging (PB-PCXI) mokhoa oa ho bona le ho lekanya metsotso e feto-fetohang ka har'a vivo ho ASL ho ea ho ASL20 ka ho toba le hydration ea M192, le ho lekanya metsotso e ka bang metsotso e seng mekae. e sebelisoang e le sesupo sa pele sa katleho ea phekolo.Ho feta moo, mokhoa oa rona oa tlhahlobo ea MCT o sebelisa likaroloana tsa bophara ba 10–35 µm tse entsoeng ka alumina kapa khalase e phahameng ea refractive e le matšoao a MCT a bonahalang a sebelisa PB-PCXI21. Mekhoa eo ka bobeli e loketse bakeng sa pono ea mefuta e mengata ea likaroloana, ho akarelletsa le MP.
Ka lebaka la tharollo e phahameng ea sebaka le ea nakoana, mekhoa ea rona ea tlhahlobo ea ASL le MCT e thehiloeng ho PB-PCXI e loketse hantle bakeng sa ho hlahloba matla le mekhoa ea boitšoaro bo le bong le bo bongata ka vivo ho re thusa ho utloisisa le ho ntlafatsa mekhoa ea ho fana ka liphatsa tsa lefutso tsa MP. li-nasal le pulmonary airways tsa litoeba ho thusa ho hlalosa mekhoa ea rona ea Liphatsa tsa lefutso tse sa tšoaneng tse hlokometsoeng lithutong tsa liphoofolo tsa liphoofolo tse tsamaisang liphatsa tsa lefutso 3,4.
Sepheo sa thuto ena e ne e le ho sebelisa synchrotron PB-PCXI ho bona ka mahlo a kelello ho sisinyeha ha litho tsa MP ka har'a trachea ea likhoto tse phelang. Letotong la bobeli la lithuto, re ile ra batla ho sebelisa tlhophiso ena e nepahetseng ho bonts'a mokhoa oa phetisetso o bakoang ke ho fana ka li-LV-MPs ho ea tseleng ea moea ea likhoto, ho ipapisitse le maikutlo a hore phepelo ea li-LV-MPs molemong oa phetisetso ea moea.
Lithuto tsohle tsa liphoofolo li ile tsa etsoa ho ea ka liprothokholo tse amoheloang ke Univesithi ea Adelaide (M-2019-060 le M-2020-022) le Komiti ea Boitšoaro ea Liphoofolo ea SPring-8 Synchrotron. Liteko li ile tsa etsoa ho latela tataiso ea ARRIVE.
Litšoantšo tsohle tsa X-ray li ne li etsoa BL20XU beamline ho SPring-8 synchrotron Japane, ho sebelisa setupong se tšoanang le se hlalositsoeng pele21,22. Ka bokhutšoane, lebokose la liteko le ne le le 245 m ho tloha selikalikoe sa polokelo ea synchrotron. Sehole sa sampuli-to-detector sa 0.6 m se sebelisoa bakeng sa lithuto tsa particle imaging tsa 0vo3 mA bakeng sa lithuto tsa particle imaging mA. Ho ile ha sebelisoa matla a beam a monochromatic a 25 keV. Litšoantšo li ile tsa nkuoa ho sebelisoa mochine oa X-ray oa boemo bo phahameng (SPring-8 BM3) o kopantsoeng le mochine oa sCMOS.Mofetoleli o fetolela mahlaseli a X-ray hore a be khanyeng e bonahalang a sebelisa scintillator e teteaneng ea 10 µm (Gd3Al2Ga3C3O12) ka nako eo e leng microscope e lebisitsoeng ho MOS1. (NA 0.3) mm. Bolelele ba ho pepeseha ba 100 ms bo ile ba khethoa ho eketsa karo-karolelano ea pontšo-ho-lerata ea likaroloana tsa khoheli ka hare le ka ntle ho tsela ea moea ha ho ntse ho fokotsa lintho tse entsoeng ka letsoho tse susumetsoang ke ho phefumoloha.Bakeng sa lithuto tsa vivo, shutter e potlakileng ea X-ray e ile ea behoa tseleng ea X-ray ho fokotsa tekanyo ea mahlaseli ka ho thibela mahlaseli a X-ray pakeng tsa ho pepeseha.
Sesebelisoa sa LV ha sea ka sa sebelisoa lithutong leha e le life tsa litšoantšo tsa SPring-8 PB-PCXI hobane kamore ea litšoantšo ea BL20XU ha e tiisetsoe ka Biosafety Level 2. Ho e-na le hoo, re ile ra khetha mefuta e mengata ea litho tsa MP tse nang le mekhoa e metle ho tsoa ho bafani ba babeli ba khoebo-e koahelang mefuta e mengata ea boholo, lisebelisoa, likhahla tsa tšepe, le lits'ebetso tse ka hare ho likhalase tse phelang ka har'a likhalase tsa MP, pele ho utloisisa hore na ho na le li-MP . litsela tsa moea. ka holim'a metsi.MPs e fapana ka boholo ho tloha ho 0,25 ho isa ho 18 μm mme e entsoe ka thepa e sa tšoaneng (sheba Lethathamo la 1), empa sebopeho sa sampole e 'ngoe le e' ngoe, ho kenyelletsa le boholo ba likaroloana tsa makenete ka har'a MP, ha e tsejoe.Ho ipapisitsoe le lithuto tsa rona tse pharaletseng tsa MCT 19, 20, 21, 23, 24, re lebelletse hore 5 μ tseleng e ka bonoang ka holim'a trache. ho tlosa liforeimi tse latellanang ho bona ponahalo e ntlafetseng ea motsamao oa MP. MP e le 'ngoe ea boholo ba 0.25 μm e nyane ho feta tharollo ea sesebelisoa sa ho nka litšoantšo, empa PB-PCXI e lebelletsoe ho lemoha phapang ea bona ea molumo le ho sisinyeha ha mokelikeli o ka holim'a metsi oo li behoang ho oona ka mor'a ho behoa.
Mehlala bakeng sa MP ka 'ngoe ho Lethathamo la 1 e ne e lokiselitsoe ka 20 μl khalase ea capillaries (Drummond Microcaps, PA, USA) e nang le bophara bo ka hare ba 0.63 mm. Corpuscular particles e fumaneha ka metsing, ha likaroloana tsa CombiMag li fumaneha ka metsi a nang le thepa ea moetsi.Tube e' ngoe le e 'ngoe e tletse halofo ea metsi (hoo e ka bang 1 ea μ) 1) .The likhalase capillaries ba ile ba behoa rapameng sethaleng sa mohlala ka lebokose la litšoantšo, ka ho latellana, 'me beha metshetshe ya mokelikeli.A 19 limilimithara bophara (28 limilimithara bolelele) nickel khetla rare lefatše neodymium tšepe boron (NdFeB) magnet (N35, cat. no. LM1652, Australia1 magnetization of Electronics. e ne e khomaretsoe sethaleng se arohaneng sa phetolelo ho finyella Fetola boemo ba eona ka thōko nakong ea ho nka litšoantšo.Ho fumana setšoantšo sa X-ray ho qala ha makenete e behiloe hoo e ka bang 30 mm ka holimo ho sampuli, 'me litšoantšo li fumanoa ka tekanyo ea liforeimi tse 4 motsotsoana. Nakong ea ho nka litšoantšo, makenete o ile a atametsoa haufi le khalase ea capillary tube (e ka bang 1 mm hole) ebe e fetoleloa hammoho le tube ho ea ho matla.
In vitro imaging setup e nang le lisampole tsa MP ka har'a li-capillari tsa khalase sethaleng sa phetolelo ea xy. Tsela ea leballo ea X-ray e tšoailoe ka mola o mofubelu o motsu.
Hang ha ponahalo ea in vitro ea MPs e thehiloe, karolo e nyenyane ea bona e ile ea lekoa ka vivo ka litoeba tsa mofuta o hlaha oa albino Wistar (~ libeke tse 12, ~ 200 g) .0.24 mg / kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japane), 3.2 mg / kg midazolam (Dormicum®, Astella, Astella Japan) buts (Vetorphale®, Meiji Seika) Likhoto li ne li tšeloa ka motsoako oa Pharma), Japane) ka ente ea intraperitoneal. 22 .Letlapa la litšoantšo le ne le kenyelelitsoe sethaleng sa phetolelo ea sampuli lebokoseng la litšoantšo ka lehlakoreng le lenyenyane ho hokahanya trachea ka ho rapama setšoantšong sa X-ray, joalokaha ho bontšitsoe setšoantšong sa 2a.
(a) In vivo imaging setup ka lebokoseng la litšoantšo la SPring-8, tsela ea sefate sa X-ray e tšoauoa ka mohala o mofubelu o mofubelu. (b, c) Sebaka sa Magnet sebakeng sa trachea se ne se etsoa ka thōko ho sebelisoa lik'hamera tse peli tsa IP tse kentsoeng ka orthogonally.
Sistimi ea pompo ea syringe e laoloang ka thōko (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) e sebelisang sering ea khalase ea 100 μl e ne e amana le PE10 tubing (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) ka nale ea 30 Ga. Tšoaea tube ho etsa bonnete ba hore ntlha e sebakeng se nepahetseng ha u kenya tube e nepahetseng. syringe plunger e ile ea ntšoa ha ntlha ea tube e qoelisoa ka har'a sampuli ea MP e lokelang ho fanoa. Thepa e laetsoeng e ile ea kenngoa ka har'a tube ea endotracheal, e beha ntlha ka hare ho karolo e matla ka ho fetisisa ea magnetic field ea rona e neng e lebeletsoe. Ho fumanoa ha setšoantšo ho ne ho laoloa ho sebelisoa mochine oa ho hema o kopantsoeng le Arduino ea rona e thehiloeng ho nako ea nako, le lebokose la nako ea ho koala, le ho bula setšoantšo sa mocheso / ho koala setšoantšo. ho fumana) li ile tsa ngoloa ho sebelisoa Powerlab le LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Ha ho etsoa litšoantšo Ha sebaka se koaletsoeng se ne se sa khonehe, lik'hamera tse peli tsa IP (Panasonic BB-SC382) li ne li behiloe hoo e ka bang 90 ° ho tse ling 'me li ne li sebelisetsoa ho shebella boemo ba magnete e amanang le trachea, Fig2. lintho tse entsoeng ka matsoho, setšoantšo se le seng se ile sa fumanoa ka phefumoloho ka 'ngoe nakong ea sehlabeng sa ho phalla ha metsi.
Makenete o khomaretsoe mothating oa bobeli o ka fumanehang hole le kantle ho ntlo ea litšoantšo.Maemo a fapaneng a makenete le litlhophiso li ile tsa lekoa, ho kenyelletsa: Ho behiloe ka lehlakoreng la hoo e ka bang 30 ° ka holim'a trachea (litlhophiso tse bontšitsoeng ho Figures 2a le 3a); makenete e le 'ngoe ka holim'a phoofolo le e' ngoe e ka tlase, e nang le lipalo tse behiloeng ho hohela (Setšoantšo sa 3b); makenete e 'ngoe ka holim'a phoofolo le e' ngoe e ka tlase, e nang le lipalo tse behiloeng ho leleka (Setšoantšo sa 3c); 'me makenete e le 'ngoe ka holimo le e pota-potileng ho trachea (Setšoantšo sa 3d).Ha phoofolo le makenete li se li hlophisitsoe' me MP e lokelang ho lekoa e kenngoa ka har'a pompo ea syringe, fana ka tekanyo ea 50 μl ka sekhahla sa 4 μl / sec ha u ntse u fumana litšoantšo.Makete e ntan'o suthisoa morao le pele ha a ntse a tsoela pele ho fumana trachea.
Tlhophiso ea Magnet bakeng sa imaging in vivo (a) makenete a le mong ka holim'a trachea ka lehlakoreng la hoo e ka bang 30°, (b) limakete tse peli tse behiloeng ho hohela, (c) limakete tse peli tse behiloeng ho leleka, (d) makenete e le 'ngoe ka holimo le e perpendicular trachea. lehlakoreng
Hape re ne re batla ho tseba hore na ponahalo le boitšoaro ba likaroloana tsa moea ha ho na phefumoloho e ferekanyang le ho sisinyeha ha pelo.Ka lebaka leo, qetellong ea nako ea ho nahana, liphoofolo li ile tsa bolaoa ka botho bakeng sa overdose ea pentobarbital (Somnopenil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg / kg e ne e le sethaleng hang-hang, le ho hema liphoofolo tse ling li ile tsa emisa sethaleng sa ho nahana). ts'ebetso ea ho nahana e ile ea phetoa, ho eketsa tekanyo e eketsehileng ea MP haeba ho se MP e neng e bonahala holim'a moea.
Lits'oants'o tse fumanoeng li ne li le sephara 'me lebala le lefifi li ile tsa lokisoa' me tsa bokelloa filiming (liforeimi tse 20 motsotsoana; 15-25 × lebelo le tloaelehileng ho latela sekhahla sa phefumoloho) ho sebelisoa mongolo o tloaelehileng o ngotsoeng ho MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Lithuto tsohle tsa phano ea liphatsa tsa lefutso tsa LV li ile tsa etsoa Setsing sa Patlisiso ea Liphoofolo tsa Laboratori Univesithing ea Adelaide 'me li ne li reretsoe ho sebelisa liphetho tsa liteko tsa SPring-8 ho lekola hore na phano ea LV-MP ka boteng ba matla a khoheli e ka ntlafatsa phetiso ea liphatsa tsa lefutso ka vivo. makenete.
Li-vector tsa liphatsa tsa lefutso tsa LV li ile tsa hlahisoa ho sebelisoa mekhoa e hlalositsoeng pele 25, 26. Vector ea LacZ e hlahisa liphatsa tsa lefutso tsa beta-galactosidase ea nuclear-localized beta-galactosidase e tsamaisoang ke constitutive MPSV promoter (LV-LacZ), e hlahisang sehlahisoa sa 'mala o moputsoa liseleng tse fetotsoeng, tse bonahalang ka mahlakoreng a lisele tsa matšoafo le likarolo tsa lisele. hemocytometer ho bala titer ho TU / ml. Bajari ba cryopreserved ho -80 ° C, ba qhibiliha pele ba sebelisoa, 'me ba tlameletsoe ho CombiMag ka ho kopanya ka tekanyo ea 1: 1 le ho incubating holim'a leqhoa bonyane metsotso ea 30 pele ho pepa.
Litoeba tse tloaelehileng tsa Sprague Dawley (n = 3 / sehlopha, ~ 2-3 li ne li e-na le anesthetized intraperitoneally ka motsoako oa 0.4 mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) le 60 mg / kg ketamine (Ilium, Australia) ea khoeli le khoeli) ip) ente le ho se buuoe ka mokhoa o sa buuoeng o ka khonang ho etsa bonnete ba hore ho kenngoa ha molomo ka molomo. e amohela transduction ea LV, e ne e entsoe ka ho sebelisa protocol ea rona e hlalositsoeng pele ea ho ferekanngoa ha mochine, moo sebaka sa tracheal airway se neng se ts'oaroa ka axially ka baskete ea terata (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28.Tracheal cabinet e ne e etsoa ka mor'a metsotso e ka bang LV-1MP ea tšireletso ea LV-MP.
Matla a khoheli a sebelisitsoeng tekong ena a ile a hlophisoa ka mokhoa o ts'oanang le thuto ea litšoantšo tsa X-ray ea in vivo, e nang le makenete a ts'oanang a ts'oaretsoeng ka holim'a trachea a sebelisa li-distillation stent clips (setšoantšo sa 4) . Molumo oa 50 μl (2 × 25 μl aliquots) oa LV-MP o ile oa fetisetsoa trachea (n = A-tiptte liphoofolo tse hlalositsoeng pele) = Liphoofolo tse 3) li fumane li-LV-MPs tse tšoanang ntle le tšebeliso ea makenete.Ka mor'a hore infusion e phethoe, cannula e tlosoa tube ea ET 'me phoofolo e ntšoe.Makete e lula e le teng ka metsotso e 10, ebe e tlosoa.Likhoto li ile tsa fumana subcutaneous lethal dose ea meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australia ea ente ea atiles ea atipas ea atiles ea Australia) hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia) .Likhoto li ne li bolokoa li futhumetse 'me li behiloe leihlo ho fihlela li hlaphoheloa ka ho feletseng ho tloha ho anesthesia.
Sesebelisoa sa ho fana ka LV-MP ka k'haboteng ea ts'ireletso ea likokoana-hloko. Lekhalo le khanyang la Luer Hub ea ET tube e ka bonoa e tsoa molomong 'me ntlha ea gel ea pipette e bontšitsoeng setšoantšong e kenngoa ka ET tube ho ea botebo bo batlang ka har'a trachea.
Beke e le 'ngoe ka mor'a ts'ebetso ea LV-MP ea dosing, liphoofolo li ile tsa bolaoa ka botho ke 100% CO2 inhalation le polelo ea LacZ e ile ea hlahlojoa ho sebelisoa phekolo ea rona e tloaelehileng ea X-gal. Mehele e meraro ea caudal ka ho fetisisa ea cartilaginous e ile ea tlosoa ho netefatsa hore tšenyo leha e le efe ea mechine kapa ho boloka metsi ho tloha ho endotracheal tube placement e ne e sa kenyelletsoa tlhahlobo. sejana se nang le rabara ea silicone (Sylgard, Dow Inc) ho sebelisa nale ea Minutien (Fine Science Tools) ho bona bokaholimo ba leseli bophara ba trachea), ka bolelele bohle ba trachea setšoantšo ka mohato, ho etsa bonnete ba ho kopana ho lekaneng pakeng tsa setšoantšo ka seng ho lumella setšoantšo "ho roka". automated MATLAB script (R2020a, MathWorks) joalo ka ha ho hlalositsoe pejana, ho sebelisoa litlhophiso tsa 0.35
Trachea e 'ngoe le e' ngoe e ne e kenngoa ka parafine 'me likarolo tsa 5 μm li ne li khaotsoe.
Litlhahlobo tsohle tsa lipalo-palo li ile tsa etsoa ka GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).
Li-MP tse tšeletseng tse hlalositsoeng ho Lethathamo la 1 li ile tsa hlahlojoa ho sebelisoa PCXI, 'me ponahalo e hlalositsoe ho Lethathamo la 2. Li-MP1 tse peli tsa polystyrene (MP1 le MP2; 18 μm le 0.25 μm, ka ho latellana) li ne li sa bonahale tlas'a PCXI, empa lisampole tse ling kaofela li ne li tsejoa (mehlala e bontšitsoe ho 5% (5) MP1 le MP2 . 0.25 μm le 0.9 μm, ka ho latellana) li bonahala ka mokhoa o fokolang.Le hoja e na le tse ling tsa likaroloana tse nyenyane tse lekiloeng, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) e ne e tsejoa ka ho fetisisa.The CombiMag sehlahiswa MP6 ho thata ho e bona.Maemong ohle, bokgoni ba rona ba ho bona MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) e ne e le e tsebahalang haholo. Ha makenete a tloha ho capillary, likaroloana li atolosoa ka likhoele tse telele, empa ha limakete li ntse li atamela 'me matla a matla a khoheli a ntse a eketseha, likhoele tsa likaroloana li ile tsa khutsufatsoa ha likaroloana li fallela sebakeng se kaholimo sa capillary (sheba Supplementary Video S1: MP4), e ntseng e eketseha The particle density of the field magnets is the surface, the field magnets is e fokotseha 'me litho tsa MP li hlophisa bocha likhoele tse telele tse tsoang karolong e ka holimo ea capillary (sheba Supplementary Video S2: MP4) . Ka mor'a hore makenete e khaotse ho tsamaea, likaroloana li tsoela pele ho tsamaea ka nako e khutšoanyane ka mor'a hore li fihle boemong ba ho lekana.
Ponahalo ea MP tlas'a PCXI e fapana haholo lipakeng tsa disampole.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 le (d) MP6. Litšoantšo tsohle tse bontšitsoeng mona li nkuoe ka makenete e fumanehang hoo e ka bang 10 mm ka holim'a capillary. Li-circles tse bonahalang tse kholo ke li-bubble tsa moea tse qabeletsoeng ka har'a li-capillaries, tse bontšang ka ho hlaka phapang e ntšo le e tšoeu ea mohatla o mofubelu. magnification.Ela hloko hore bophara ba meralo ea makenete lipalong tsohle ha boa lokela ho sekala 'me bo boholo ka makhetlo a ka bang 100 ho feta kamoo ho bontšitsoeng.
Ha makenete e fetoleloa ka ho le letšehali le ka ho le letona ka holimo ho capillary, angle ea MP e fetoha ho ikamahanya le makenete (sheba setšoantšo sa 6), kahoo e hlalosa melapo ea matla a khoheli.Bakeng sa MP3-5, ka mor'a hore sekhahla se fihle ka lehlakoreng la monyako, likaroloana li huleloa ka holim'a karolo e ka holimo ea capillary. Supplementary Video S3:MP5).Sena se boetse se bonahala ka ho khetheha ha ho etsoa litšoantšo haufi le capillary end, e leng se etsang hore MPs e kopane le ho tsepamisa mohopolo ho sebopeho sa mokelikeli-moea.Particles in MP6, eo ho neng ho le thata ho e lemoha ho feta MP3-5, ha ea ka ea huloa ha makenete e ntse e tsamaea ka capillary, empa MP ea lithapo li siea karoloana ea video. S4: MP6) .Maemong a mang, ha matla a khoheli a sebelisitsoeng a fokotsehile ka ho tsamaisa makenete sebaka se seholo ho tloha sebakeng sa litšoantšo, litho tsa MP tse setseng li ne li theohela butle-butle karolong e ka tlaase ea tube ka matla a khoheli ha li ntse li le khoeleng (sheba Supplementary Video S5: MP3).
Lebokose la khoele ea MP le fetoha ha makenete e fetoleloa ka ho le letona ka holim'a capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 le (d) MP6. Lebokose le khubelu le na le magnification a ntlafatsang.Hlokomela hore livideo tsa tlatsetso li ruta ha li ntse li senola sebopeho sa bohlokoa le lintlha tse matla tse ke keng tsa bonoa litšoantšong tsena tse sa fetoheng.
Liteko tsa rona li bontšitse hore ho tsamaisa makenete butle-butle ho ea pele le morao haufi le trachea ho nolofatsa pono ea MP maemong a ho sisinyeha ho rarahaneng ka vivo. Teko ea vivo e ne e sa etsoa e le lifaha tsa polystyrene (MP1 le MP2) li ne li sa bonahale ka capillary.E 'ngoe le e 'ngoe ea li-MPs tse' nè tse setseng li ile tsa lekoa ka vivo le magnet e telele axis configured at the angle configured at the angle to 30 Lipalo 2b le 3a), kaha sena se ile sa fella ka liketane tse telele tsa MP 'me se ne se sebetsa ho feta tlhophiso ea makenete e felisitsoeng.MP3, MP4 le MP6 ha lia ka tsa fumanoa ka har'a trachea ea liphoofolo leha e le life tse phelang. ka hona e ile ea sebelisoa ho lekola le ho supa boitšoaro ba MP.
Ho beha makenete holim'a trachea nakong ea ho fana ka MP ho ile ha fella ka hore litho tse ngata tsa MP li tsepame tšimong ea pono.Likarolo tse kenang ka har'a trachea li hlokomeloa ka ho fetisisa liphoofolong tse entsoeng sehlabelo ka batho.Figure 7 and Supplementary Video S6: MP5 shows rapid magnetic capture and alignment of particles on the surface of the ventral ventral that MPased to the trachea can be indic. Ho batlisisa ka thōko ho trachea ka mor'a ho pepa ha MP, litho tse ling tsa MP li ile tsa fumanoa haufi le carina, li fana ka maikutlo a hore matla a khoheli a ne a sa lekana ho bokella le ho boloka litho tsohle tsa MP, kaha li ne li tsamaisoa sebakeng sa matla a maholo a khoheli nakong ea ts'ebetso ea mokelikeli.
Litšoantšo tse tsoang ho (a) pele le (b) ka mor'a hore MP5 e belehe trachea ea rat e sa tsoa bolaeloa e nang le makenete e behiloeng ka holim'a sebaka sa setšoantšo. Sebaka sa setšoantšo se pakeng tsa mehele e 'meli ea lefufuru
Ho fetolela makenete hammoho le trachea ka har'a vivo ho ile ha etsa hore ketane ea MP e fetole angle ka har'a sebaka sa moea ka mokhoa o ts'oanang le o bonoang ho li-capillaries (bona Figure 8 and Supplementary Video S7:MP5). Leha ho le joalo, thutong ea rona, litho tsa MPs li ne li sitoa ho hula ka holim'a tsela e phelang ea moea kamoo li ka khonang ka li-capillaries. e boetse e fumane hore khoele ea phatsa e bonahala e fetola botebo ba lera la mokelikeli o ka holim'a metsi ha makenete e tsamaisoa ka nako e telele ka har'a trachea, 'me e atoloha ha makenete e tsamaisoa ka ho toba holimo' me khoele ea phatsa e fetisetsoa sebakeng se otlolohileng (sheba Supplementary Video S7). : MP5 ka 0:09, tlase ka ho le letona).Sebopeho sa sebopeho sa motsamao se ile sa fetoha ha makenete e ne e fetoleloa ka holim'a trachea ka thōko (ke hore, ho ea ka ho le letšehali kapa ho le letona la phoofolo ho e-na le bolelele ba trachea). 0:08).Sena se lumellana le boitšoaro ba MP boo re bo boneng tlas'a matla a khoheli a sebelisoang ka har'a capillary ea khalase.
Mohlala oa litšoantšo tse bontšang MP5 trachea ea rat e hlabosang e phelang.(a) Makenete e sebelisoa ho fumana litšoantšo ka holimo le ka ho le letšehali la trachea, ebe (b) ka mor'a hore makenete e isoe ka ho le letona.Lebokose le khubelu le na le kholo e matlafatsang phapang.Litšoantšo tsena li tsoa videong e bontšitsoeng ho Supplementary Video S7:MP5.
Ha lipalo tse peli li ne li lokisoa ka lehlakoreng le ka leboea-boroa ka holimo le ka tlas'a trachea (ke hore ho hohela; Setšoantšo sa 3b), likhetho tsa MP li ile tsa hlaha nako e telele 'me li ne li le ka lehlakoreng la mokokotlo oa trachea ho e-na le holim'a mokokotlo oa mokokotlo (bona Supplementary Video S9: MP5) . pelehi ha ho ne ho sebelisoa sesebelisoa sa makenete a mabeli, seo hangata se etsahalang ha ho sebelisoa sesebelisoa sa makenete a le mong. Joale ha makenete e le 'ngoe e lokisetsoa ho khutlisa lipalo tse khelohileng (setšoan makenete e le 'ngoe e tsamaisanang le tsela ea sefofane empa e feta ka tsela ea moea ka likhato tse 90 e le hore mela ea tšimo e tšele lerako la tracheal orthogonally (setšoantšo sa 3d), mokhoa o etselitsoeng ho fumana hore na ho bokellana ha likaroloana leboteng le lehlakoreng ho ka hlokomeloa. tlhophiso ea sebopeho (setšoantšo sa 3a) se khethiloe bakeng sa lithuto tsa mojari oa liphatsa tsa lefutso tsa vivo.
Ha phoofolo e ne e etsoa setšoantšo khafetsa hang ka mor'a hore motho a bolaoe, ho se be teng ha motsamao oa linama o ferekanyang ho ne ho bolela hore mela e menyenyane le e mekhutšoanyane e ka bonoa sebakeng se hlakileng sa interchondral, "ho sisinyeha" tumellanong le motsamao oa phetolelo oa makenete. Leha ho le joalo, ha ke bone hantle boteng le ho sisinyeha ha likaroloana tsa MP6.
LV-LacZ titer e ne e le 1.8 × 108 TU / ml, 'me ka mor'a hore 1: 1 e kopane le CombiMag MP (MP6), liphoofolo li fumane tekanyo ea 50 μl ea tracheal ea 9 × 107 TU / ml LV koloi (ke hore 4.5 × 106 TU / rat). ) Lithutong tsena, ho e-na le ho fetolela makenete nakong ea mosebetsi, re ile ra lokisa makenete sebakeng se le seng ho fumana hore na transduction ea LV (a) e ka ntlafatsoa ha e bapisoa le phano ea vector ha ho se na matla a khoheli, 'me (b) e ka ba e tsepamisitsoeng Lisele tsa Airway li fetisetsoa libakeng tse lebisitsoeng tsa khoheli tsa moea o ka holimo.
Ho ba teng ha li-magnets le tšebeliso ea CombiMag e kopantsoeng le li-vectors tsa LV ha lia ka tsa bonahala li e-na le liphello tse mpe bophelong ba liphoofolo, joalo ka ha ho ne ho e-na le protocol ea rona e tloaelehileng ea ho fana ka li-vector tsa LV. Litšoantšo tse ka pele tsa sebaka sa tracheal se tlas'a ho ferekanngoa ha mechine (Supplementary Fig. 1) e bontšitse hore ho na le maemo a phahameng haholo a transduction ho sehlopha sa liphoofolo ha ho ne ho tšoaroa ka magnets e nyenyane ea LV-MP. palo ea mabala a buluu a LacZ a ne a le teng sehlopheng sa taolo (setšoantšo sa 9b) . Tekanyetso ea libaka tse tloaelehileng tsa X-Gal tse silafetseng li bontšitse hore tsamaiso ea LV-MP ka pel'a matla a khoheli e hlahisitse hoo e ka bang ntlafatso ea 6 (Fig. 9c).
Mohlala litšoantšo tse entsoeng tse bontšang transduction ea tracheal ka LV-MP (a) boteng ba matla a khoheli le (b) ha ho se na makenete. (c) Ntlafatso ea lipalo-palo sebakeng se tloaelehileng sa transduction LacZ ka har'a trachea ha ho sebelisoa makenete (*p = 0.029, t-test, n = 3 ka sehlopha, ho bolela ± SEM).
Likarolo tse sa jeleng paate tse nang le mabala a bofubelu bo sa jeleng paate (mohlala o bontšitsoeng ho Supplementary Fig. 2) e bontšitse lisele tse nang le LacZ-stained tse teng ka mokhoa o ts'oanang le sebaka joalokaha ho tlalehiloe pele.
Phephetso e ka sehloohong bakeng sa phekolo ea liphatsa tsa lefutso ea moea e ntse e le sebaka se nepahetseng sa likaroloana tse tsamaisang libaka ho ea libakeng tse thahasellisang le ho finyella litekanyetso tse phahameng tsa phetisetso ka har'a matšoafo a tsamaeang ka pel'a moea o phallang le ho tlosoa ha mamina a sebetsang. ho ntlafatsa phetisetso e na le melemo ha e bapisoa le mekhoa e meng ea ho fana ka liphatsa tsa lefutso tse kang electroporation, kaha e ka kopanya bonolo, theko e tlaase, ho fana ka sebaka, ho eketseha ha katleho, le linako tse khuts'oane tsa ho incubation, 'me mohlomong le tekanyo e nyane ea ho tsamaisa liphatsa tsa lefutso. maemo a tsela e phelang hantle.
Liteko tsa rona tsa in vitro synchrotron PCXI li bontšitse hore likaroloana tsohle tseo re li lekiloeng, ntle le polystyrene MP, li ne li bonahala setšoantšong sa litšoantšo tseo re li sebelisitseng.Boteng ba matla a khoheli, litho tsa MPs li theha likhoele tseo bolelele ba tsona bo amanang le mofuta oa likaroloana le matla a matla a khoheli (ke hore, ho atamela le ho sisinyeha ha makenete). inducing its own local magnetic field.Makarolo ana a arohaneng a etsa hore likaroloana tse ling tse tšoanang li kopane le ho hokahana, ka metsamao e kang ea likhoele tsa sehlopha ka lebaka la matla a sebaka a tsoang ho matla a lehae a khahlang le a manyala a likaroloana tse ling.
Schematic display (a,b) particle trains generated ka hare ho li-capillaries tse tletseng mokelikeli le (c,d) moea o tletseng trachea. Hlokomela hore li-capillaries le trachea ha li huleloe ho sekaleng.Panel (a) e boetse e na le tlhaloso ea MP, e nang le likaroloana tsa Fe3O4 tse hlophisitsoeng ka likhoele.
Ha makenete e ne e sisinyeha ka holim'a capillary, angle ea khoele ea phatsa e fihlile moeling oa bohlokoa bakeng sa MP3-5 e nang le Fe3O4, ka mor'a moo khoele ea phatsa ha e sa hlola e lula sebakeng sa pele, empa e ile ea fallela holim'a sebaka se secha. likaroloana li ne li le nyane, li na le lirafshoa tse fapaneng kapa litefello tsa holim'a metsi, kapa mokelikeli o tsamaisang thepa o ile oa ama bokhoni ba bona ba ho sisinyeha. Phapang ea setšoantšo sa likaroloana tsa CombiMag e boetse e fokola, ho fana ka maikutlo a hore mokelikeli le likaroloana li ka 'na tsa e-ba le li-densities tse tšoanang' me kahoo li se ke tsa tsamaea habonolo. Ha ho makatse hore ebe matla a khoheli le sebaka se pakeng tsa makenete le sebaka seo ho shebiloeng ho sona se bohlokoa haholo. Ha li nkuoa hammoho, liphetho tsena li boetse li fana ka maikutlo a hore, leha limakete li ka hapa litho tse ngata tsa MP tse phallang sebakeng seo ho shebiloeng ho sona, ho ke ke ha etsahala hore limakete li ka tšeptjoa ho tsamaisa likaroloana tsa CombiMag ka holim'a trachea. sefate.
Ha likaroloana li fanoa 'meleng, ho thata ho li khetholla ho latela moelelo oa lisele tsa' mele tse tsamaeang tse rarahaneng, empa bokhoni ba ho li lemoha bo ile ba matlafatsoa ka ho fetolela makenete ka holimo ho trachea ho "tsokotsa" likhoele tsa MP. Le hoja litšoantšo tse phelang li ka khoneha, ho bonolo ho lemoha ho sisinyeha ha liphatsa tsa lefutso hang ha phoofolo e 'nile ea e-ba teng ka holim'a makhabane a batho. Likarolo tse ling li ne li atisa ho fumanoa ka ho eketsehileng haufi le trachea.Ho fapana le lithuto tsa in vitro, likaroloana li ke ke tsa huloa ka har'a trachea ka ho fetolela makenete.Ho fumanoa hona ho lumellana le kamoo mucus e apereng holim'a trachea ka tloaelo e sebetsanang le likaroloana tse huloang, ho li tšoasa ka har'a li-mucus ebe ka mor'a moo li hloekisoa ke mokhoa oa ho hlakola mucociliary.
Re nahana hore tšebeliso ea limatlase bakeng sa ho hohela ka holimo le ka tlase ho trachea (setšoantšo sa 3b) se ka 'na sa etsa hore ho be le matla a khoheli a tšoanang, ho e-na le matla a khoheli a tsitsitseng haholo ka nako e le' ngoe, a ka 'nang a lebisa ho ajoa ka mokhoa o ts'oanang oa likaroloana. more particle deposition in the imaged area.Liphuputso tsena tse peli li bontša hore ho hlophisoa ha makenete habeli ha ho ntlafatse haholo taolo ea sebaka sa MP targeting, le hore sephetho sa matla a matla a khoheli a thata ho se lokisa, ho etsa mokhoa ona o se nang thuso.Ka mokhoa o ts'oanang, ho tsamaisa makenete ka holimo le ka trachea (setšoantšo sa 3d) le tsona ha lia ka tsa eketsa palo ea likaroloana tse bolokiloeng sebakeng se seng ka lebaka la ts'ebetso e 'ngoe e ka bolokoang sebakeng sa bona. ka matla a tlase a matla a khoheli ka har'a sebaka sa deposition.Ka hona, tlhophiso e le 'ngoe ea magnete angle 30-degree (Setšoantšo sa 3a) e nkuoa e le mokhoa o bonolo le o sebetsang ka ho fetesisa oa tlhahlobo ea vivo.
Phuputso ea LV-MP e bontšitse hore ha li-vector tsa LV li kopantsoe le CombiMag 'me li fanoa ka mor'a ho ferekanngoa ha' mele ka pel'a matla a khoheli, maemo a phetisetso a ile a eketseha haholo ka har'a trachea ha a bapisoa le li-control.Ho itšetlehile ka lithuto tsa litšoantšo tsa synchrotron le liphello tsa LacZ, matla a khoheli a ne a bonahala a khona ho boloka LV ka har'a trachea le ho fokotsa likaroloana tse tebileng tsa ntlafatso ea vector hang-hang. e ka lebisa katlehong e phahameng ha e ntse e fokotsa li-titers tse fanoeng, ho fetisoa ha sepheo, litla-morao tsa ho ruruha le ho itšireletsa mafung, le litšenyehelo tsa liphatsa tsa lefutso.Habohlokoa, ho ea ka moetsi, CombiMag e ka sebelisoa hammoho le mekhoa e meng ea ho fetisetsa liphatsa tsa lefutso, ho akarelletsa le likokoana-hloko tse ling tsa kokoana-hloko (tse kang AAV) le nucleic acids.
Nako ea poso: Jul-16-2022
