Kea leboha ha le etetse Nature.com. Mofuta wa sebatli seo o se sebedisang o na le tshehetso e fokolang bakeng sa CSS. Bakeng sa boiphihlelo bo botle ka ho fetisisa, re kgothaletsa hore o sebedise sebatli se ntjhafaditsweng (kapa o tima mokgwa wa ho tsamaisana le Internet Explorer). Ho sa le jwalo, ho netefatsa tshehetso e tswelang pele, re tla bontsha sebaka sena sa marang-rang ntle le mekgwa le JavaScript.
Li-vector tsa liphatsa tsa lefutso bakeng sa kalafo ea lefu la matšoafo la cystic fibrosis li lokela ho shebana le litsela tsa ho tsamaisa moea hobane phetisetso ea matšoafo a ka ntle ha e fane ka melemo ea kalafo. Bokhoni ba phetisetso ea vaerase bo amana ka ho toba le nako ea ho lula ha vector. Leha ho le joalo, maro a ho isa a kang a jarang liphatsa tsa lefutso a kenella ka tlhaho ho alveoli nakong ea pululelo, 'me likaroloana tsa phekolo tsa mofuta ofe kapa ofe li hloekisoa ka potlako ke lipalangoang tsa mucociliary. Ho lelefatsa nako ea ho lula ha bajari ba liphatsa tsa lefutso liphaposing tsa moea ho bohlokoa empa ho thata ho li finyella. Likaroloana tsa makenete tse kopantsoeng le jere tse ka lebisoang holim'a litsela tsa moea li ka ntlafatsa sepheo sa libaka. Ka lebaka la liphephetso tsa pono ea in vivo, boitšoaro ba likaroloana tse nyane joalo tsa makenete holim'a moea ha bo le teng matla a makenete a sebelisitsoeng ha bo utloisisoe hantle. Sepheo sa thuto ena e ne e le ho sebelisa setšoantšo sa synchrotron ho bona motsamao oa in vivo oa letoto la likaroloana tsa makenete ka har'a trachea ea litoeba tse anesthesia ho hlahloba matla le mekhoa ea boitšoaro ba motho ka mong le ba bongata ba likaroloana ka har'a vivo. Re ile ra boela ra hlahloba hore na ho tlisoa ha likaroloana tsa makenete tsa lentiviral ha bo le teng matla a makenete ho tla eketsa bokhoni ba phetisetso ho rat. trachea.Setšoantšo sa X-ray sa Synchrotron se senola boitšoaro ba likaroloana tsa makenete masimong a makenete a sa sisinyeheng le a tsamaeang ka har'a vitro le ka har'a vivo. Likaroloana li ke ke tsa huloa habonolo holim'a moea o phelang ka makenete, empa nakong ea lipalangoang, li-depositi li bokellana tšimong ea pono moo matla a makenete a leng matla ka ho fetisisa. Bokhoni ba phetisetso ea phetisetso ea mali bo boetse bo eketsehile ka makhetlo a tšeletseng ha likaroloana tsa makenete tsa lentiviral li ne li fanoa boteng ba matla a makenete. Hammoho, liphetho tsena li bontša hore likaroloana tsa makenete tsa lentiviral le matla a makenete e ka ba mekhoa ea bohlokoa ea ho ntlafatsa sepheo sa vector ea liphatsa tsa lefutso le ho eketsa maemo a phetisetso ea mali ho tsamaiseng mekhoa ea phetisetso ea mali ka har'a vivo.
Cystic fibrosis (CF) e bakoa ke phetoho ea liphatsa tsa lefutso tse le 'ngoe tse bitsoang CF transmembrane conductance regulator (CFTR). Protheine ea CFTR ke kanale ea ion e teng liseleng tse ngata tsa epithelial ho pholletsa le 'mele, ho kenyeletsoa le litsela tsa moea tse tsamaisang, sebaka se seholo sa pathogenesis ea CF. Liphoso tsa CFTR li lebisa ho tsamaisong e sa tloaelehang ea metsi, e ntša metsi holim'a moea le ho fokotsa botebo ba lera la metsi a holim'a moea (ASL). Sena se boetse se sitisa bokhoni ba sistimi ea mucociliary transport (MCT) ba ho hlakola likaroloana tse hemang le likokoana-hloko ho tsoa liphatseng tsa moea. Sepheo sa rona ke ho nts'etsapele phekolo ea liphatsa tsa lefutso ea lentiviral (LV) ho fana ka kopi e nepahetseng ea liphatsa tsa lefutso tsa CFTR le ho ntlafatsa bophelo bo botle ba ASL, MCT le matšoafo, le ho tsoela pele ho nts'etsapele mahlale a macha a khonang ho lekanya liparamente tsena ka har'a vivo1.
Li-vector tsa LV ke e 'ngoe ea likhetho tse ka sehloohong bakeng sa phekolo ea liphatsa tsa lefutso tsa CF, haholo-holo hobane li ka kopanya ka ho sa feleng liphatsa tsa lefutso tsa phekolo liseleng tsa basal tsa moea (lisele tsa motheo tsa moea). Sena se bohlokoa hobane li ka khutlisa metsi a tloaelehileng le ho tlosoa ha mucus ka ho li arola liseleng tse sebetsang tsa moea tse amanang le CF tse lokisitsoeng ke liphatsa tsa lefutso, tse fellang ka melemo ea bophelo bohle. Li-vector tsa LV li lokela ho lebisoa khahlanong le moea o tsamaisang, kaha ke hona moo lefu la matšoafo la CF le qalang teng. Ho tlisoa ha vector ka botebo matšoafong ho ka fella ka phetisetso ea alveolar, empa sena ha se na melemo ea phekolo ho CF. Leha ho le joalo, maro a kang a bajari ba liphatsa tsa lefutso ka tlhaho a fallela alveoli ha a bululeloa kamora ho pepa3,4 'me likaroloana tsa phekolo li hloekisoa ka potlako ka har'a molomo ke MCT. Bokhoni ba phetisetso ea LV bo amana ka ho toba le bolelele ba nako eo vector e lulang haufi le lisele tse reriloeng ho lumella ho monngoa ha sele - "nako ea bolulo"5 - e fokotsoang habonolo ke phallo e tloaelehileng ea moea oa libaka hammoho le ho tšoaroa ha mucus ea likaroloana le MCT. Bakeng sa CF, bokhoni ba ho lelefatsa nako ea bolulo ea LV ka har'a moea bo bohlokoa ho fihlella maemo a holimo a phetisetso sebakeng sena, empa bo bile joalo e bile phephetso e kgolo.
Ho hlola tšitiso ena, re fana ka maikutlo a hore likaroloana tsa makenete tsa LV (MPs) li ka thusa ka litsela tse peli tse tlatsanang. Ea pele, li ka tataisoa ka makenete ho ea holim'a moea ho ntlafatsa sepheo le ho thusa likaroloana tsa jene tse tsamaisang liphatsa tsa lefutso ho lula sebakeng se lakatsehang sa moea; le ASL) ho fallela lera la sele 6. Li-MP li 'nile tsa sebelisoa haholo e le likoloi tse reretsoeng ho fana ka meriana ha li tlama ho li-antibodies, meriana ea chemotherapeutic, kapa limolek'hule tse ling tse nyane tse khomarelang lera la sele kapa tse tlamang ho li-receptor tse amehang tsa bokaholimo ba sele le ho bokellana libakeng tsa hlahala ha ho na le motlakase o sa fetoheng. Masimo a Magnetic bakeng sa Kalafo ea Kankere 7. Mekhoa e meng ea "hyperthermal" e ikemiselitse ho futhumatsa li-MP ha li pepesehetse masimo a makenete a sisinyehang, ka hona li senya lisele tsa hlahala. Molao-motheo oa phetisetso ea makenete, moo matla a makenete a sebelisoang e le moemeli oa phetisetso ho ntlafatsa phetisetso ea DNA liseleng, o sebelisoa hangata ka har'a vitro ho sebelisoa mefuta e fapaneng ea li-vector tsa liphatsa tsa lefutso tse seng tsa vaerase le tsa vaerase bakeng sa mela ea sele e thata ho e fetisa. Katleho ea LV magnetotransfection e se e thehiloe, ka ho tlisoa ha li-LV-MP ka har'a vitro ho mola oa sele ea epithelial ea bronchial ea motho boteng ba tšimo ea makenete e sa fetoheng, ho eketsa katleho ea phetisetso ka makhetlo a 186 ha ho bapisoa le vector ea LV feela. LV-MP e boetse e sebelisitsoe mohlaleng oa CF oa in vitro, moo phetisetso ea makenete e ekelitseng phetisetso ea LV litsong tsa sebopeho sa moea le metsi ka makhetlo a 20 boteng ba sputum ea CF10. Leha ho le joalo, phetisetso ea magnetotransfection ea litho tsa 'mele ea in vivo e fumane tlhokomelo e nyane haholo 'me e hlahlobiloe feela liphoofolong tse' maloa. lithuto11,12,13,14,15, haholo-holo matšoafong16,17. Leha ho le jwalo, menyetla ya phetisetso ya makenete kalafong ya matshwafo ya CF e hlakile. Tan et al. (2020) ba boletse hore "thuto ya bopaki ba mohopolo wa ho pepa ka katleho ka magnetic nanoparticle pulmonary e tla bula tsela bakeng sa maano a nakong e tlang a ho hema a CFTR ho ntlafatsa diphetho tsa bongaka ho bakudi ba CF"6.
Boitšoaro ba likaroloana tse nyane tsa makenete holim'a libaka tsa moea ha ho na le matla a makenete a sebelisitsoeng bo thata ho bo bona le ho bo ithuta, 'me ka hona ha bo utloisisoe hantle. Lithutong tse ling, re qapile mokhoa oa ho etsa litšoantšo tsa X-ray tse thehiloeng ho synchrotron-propagation-based phase-contrast X-ray imaging (PB-PCXI) ho bona ka mokhoa o sa hlaseleng le ho lekanya liphetoho tsa motsotso ka har'a vivo botebong ba ASL18 le boitšoaro ba MCT19,20 ho lekanya ka kotloloho khase metsi a holim'a kanale 'me ba sebelisoa e le sesupo sa pele sa katleho ea kalafo. Ho phaella moo, mokhoa oa rona oa tlhahlobo ea MCT o sebelisa likaroloana tse bophara ba 10-35 µm tse entsoeng ka alumina kapa khalase e phahameng ea refractive index joalo ka matšoao a MCT a bonahalang a sebelisoa ho sebelisoa PB-PCXI21. Mekhoa ena ka bobeli e loketse ho bona mefuta e fapaneng ea likaroloana, ho kenyeletsoa MP.
Ka lebaka la tharollo e phahameng ea sebaka le ea nako, mekhoa ea rona ea tlhahlobo ea ASL le MCT e thehiloeng ho PB-PCXI e loketse hantle bakeng sa ho hlahloba matla le mekhoa ea boitšoaro ba likaroloana tse le 'ngoe le tse ngata ka har'a 'mele ho re thusa ho utloisisa le ho ntlafatsa mekhoa ea ho fana ka liphatsa tsa lefutso tsa MP. Mokhoa oo re o sebelisang mona o tsoa lithutong tsa rona re sebelisa beamline ea SPring-8 BL20B2, eo ho eona re ileng ra bona motsamao oa mokelikeli ka mor'a ho fana ka tekanyo ea vector ea sham ka har'a li-airway tsa nko le matšoafo tsa litoeba ho thusa ho hlalosa mekhoa ea rona ea ho hlahisa liphatsa tsa lefutso tse sa tšoaneng e bonoang lithutong tsa rona tsa liphoofolo tsa tekanyo ea jene ea carrier ea liphatsa tsa lefutso 3,4.
Sepheo sa phuputso ena e ne e le ho sebedisa synchrotron PB-PCXI ho bona metsamao ya in vivo ya letoto la di-MP ka hara trachea ya dikhoto tse phelang. Diphuputso tsena tsa ho nka ditshwantsho tsa PB-PCXI di ne di etseditswe ho leka mefuta e fapaneng ya di-MP, matla a matla a makenete, le dibaka ho fumana phello ya tsona motsamaong wa MP. Re ile ra nahana hore matla a makenete a sebediswang ka ntle a tla thusa MP e tlisitsweng ho dula kapa ho fallela sebakeng seo e se rerilweng. Diphuputso tsena di boetse di re dumella ho hlwaya dibopeho tsa makenete tse eketsang palo ya dikarolwana tse bolokilweng trachea kamora ho bewa. Letotong la bobedi la diphuputso, re ile ra batla ho sebedisa tlhophiso ena e ntle ho bontsha mohlala wa phetisetso o hlahang ka ho fetisetswa ha di-LV-MP ka hara vivo ho ya tseleng ya phetisetso ya rat, ho itshetlehile ka kgopolo ya hore ho fetisetswa ha di-LV-MP maemong a ho shejwa ha tsela ya phetisetso ho tla fella ka katleho e ntlafetseng ya phetisetso ya LV.
Lithuto tsohle tsa liphoofolo li entsoe ho latela melaoana e amohetsoeng ke Univesithi ea Adelaide (M-2019-060 le M-2020-022) le Komiti ea Boitšoaro ba Liphoofolo ea SPring-8 Synchrotron. Liteko li entsoe ho latela litataiso tsa ARRIVE.
Litšoantšo tsohle tsa X-ray li entsoe moleng oa BL20XU ho synchrotron ea SPring-8 Japane, ho sebelisoa mokhoa o tšoanang le o hlalositsoeng pele21,22. Ka bokhutšoanyane, lebokose la liteko le ne le le 245 m ho tloha lesale la polokelo ea synchrotron. Sebaka sa sampole ho ea ho detector sa 0.6 m se sebelisoa bakeng sa lithuto tsa litšoantšo tsa likaroloana le 0.3 m bakeng sa lithuto tsa litšoantšo tsa in vivo ho hlahisa litlamorao tsa phapang ea mekhahlelo. Ho sebelisitsoe matla a monochromatic beam a 25 keV. Litšoantšo li ile tsa nkuoa ho sebelisoa converter ea X-ray ea qeto e phahameng (SPring-8 BM3) e kopantsoeng le detector ea sCMOS. Converter e fetola mahlaseli a X-ray khanyeng e bonahalang ho sebelisoa scintillator e teteaneng ea 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), e ntan'o lebisoa ho sensor ea sCMOS ho sebelisoa sepheo sa microscope sa × 10 (NA 0.3). Detector ea sCMOS e ne e le Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japane) e nang le boholo ba array ba Dipiksele tsa 2048 × 2048 le boholo ba pixel bo sa tsoakoang ba 6.5 × 6.5 µm. Setha sena se hlahisa boholo bo sebetsang ba pixel ea isotropic ea 0.51 µm le sebaka sa pono sa hoo e ka bang 1.1 mm × 1.1 mm. Bolelele ba ho pepesehela ba 100 ms bo khethiloe ho eketsa karolelano ea lets'oao-lerata la likaroloana tsa makenete ka hare le ka ntle ho moea ha ka nako e ts'oanang ho fokotsa lintho tse entsoeng ka motsamao o bakoang ke ho hema. Bakeng sa lithuto tsa in vivo, shutter ea X-ray e potlakileng e ile ea beoa tseleng ea X-ray ho fokotsa tekanyo ea mahlaseli ka ho thibela mahlaseli a X-ray pakeng tsa ho pepesehela.
Sekepe sa LV ha sea ka sa sebelisoa lithutong life kapa life tsa litšoantšo tsa SPring-8 PB-PCXI hobane kamore ea litšoantšo ea BL20XU ha ea netefatsoa ke Biosafety Level 2. Ho e-na le hoo, re khethile mefuta e fapaneng ea li-MP tse nang le litšobotsi tse ntle ho tsoa ho bafani ba babeli ba khoebo—ba akaretsang mefuta e fapaneng ea boholo, thepa, mahloriso a tšepe le lits'ebetso—pele ho utloisisa hore na masimo a makenete a ama motsamao oa MP joang ka har'a li-capillaries tsa khalase, ebe ka mor'a moo litseleng tsa moea tse phelang. holim'a metsi. Li-MP li fapana ka boholo ho tloha ho 0.25 ho isa ho 18 μm 'me li entsoe ka thepa e fapaneng (sheba Tafole ea 1), empa sebopeho sa sampole ka 'ngoe, ho kenyeletsoa le boholo ba likaroloana tsa makenete tse ka har'a MP, ha se tsejoe. Ho latela lithuto tsa rona tse pharaletseng tsa MCT 19, 20, 21, 23, 24, re lebeletse hore li-MP tse nyane tse ka bang 5 μm li ka bonoa holim'a moea oa tracheal, mohlala ka ho tlosa liforeimi tse latellanang ho bona ponahalo e ntlafalitsoeng ea motsamao oa MP. MP e le 'ngoe ea boholo ba 0.25 μm e nyane ho feta qeto ea sesebelisoa sa ho nka litšoantšo, empa PB-PCXI e lebelletsoe ho lemoha phapang ea bophahamo ba tsona le motsamao oa mokelikeli oa bokaholimo oo li behiloeng ho oona kamora ho beoa.
Disampole tsa MP ka 'ngoe ho Tafole ea 1 li lokisitsoe ka har'a li-capillaries tsa khalase tsa 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) tse nang le bophara ba ka hare ba 0.63 mm. Likaroloana tsa corpuscular li fumaneha ka metsing, ha likaroloana tsa CombiMag li fumaneha ka har'a mokelikeli oa moetsi. Phaephe ka 'ngoe e tlatsitsoe halofo ka mokelikeli (hoo e ka bang 11 μl) 'me e beoa holim'a sets'oants'o sa sampole (sheba Setšoantšo sa 1). Li-capillaries tsa khalase li behiloe ka ho otloloha sethaleng sa sampole ka lebokoseng la litšoantšo, ka ho latellana, 'me li behile mathōko a mokelikeli. Khetla ea nickel ea bophara ba 19 mm (bolelele ba 28 mm) ea rare earth neodymium iron boron (NdFeB) makenete (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) e nang le makenete a setseng a 1.17 Tesla e ile ea hokelloa mohatong o arohaneng oa phetolelo ho fihlela Fetola boemo ba eona hole nakong ea ho nka litšoantšo. Ho fumana setšoantšo sa X-ray ho qala ha makenete e behiloe hoo e ka bang 30 mm ka holimo ho sampole, 'me litšoantšo li fumanoa ka sekhahla sa liforeimi tse 4 ka motsotsoana. Nakong ea ho nka litšoantšo, makenete e ile ea tlisoa haufi le khalase tube ea capillary (e ka bang 1 mm hole) ebe e fetoleloa ka har'a tube ho lekola litlamorao tsa matla a tšimo le boemo.
Setaele sa ho nka ditshwantsho tsa in vitro se nang le disampole tsa MP ka hara methapo ya khalase mohatong wa phetolelo ya sampole ya xy. Tsela ya lehlasedi la X-ray e tshwailwe ka mola o mofubedu o nang le matheba.
Hang ha ponahalo ea li-MP ka har'a vitro e se e thehiloe, sehlopha sa tsona se ile sa lekoa ka har'a likhoto tse tšehali tsa mofuta oa Wistar tse hlaha (tse lilemo li ka bang libeke tse 12, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japane), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japane) le 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika) Likhoto li ile tsa fuoa anesthesia ka motsoako oa Pharma), Japane) ka ente ea intraperitoneal. Kamora anesthesia, li ile tsa lokisetsoa ho etsa litšoantšo ka ho tlosa boea bo potolohileng trachea, ho kenya tube ea endotracheal (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) le ho li thibela ho tsamaea li lutse ka poleiting ea litšoantšo e entsoeng ka mokhoa o ikhethileng e nang le mokotla oa mocheso ho boloka mocheso oa 'mele 22. Poleiti ea litšoantšo e ile ea hokelloa mohatong oa phetolelo ea sampole ka lebokoseng la litšoantšo ka sekhutlo se senyenyane ho hokahanya trachea ka ho rapama setšoantšong sa X-ray, joalo ka ha ho bontšitsoe ho Setšoantšo sa 2a.
(a) Ho seta ditshwantsho tsa in vivo ka lebokoseng la ditshwantsho la SPring-8, tsela ya lehlasedi la X-ray e tshwailwe ka mola o mofubedu o nang le matheba.(b,c) Sebaka sa makenete hodima trachea se entswe hole ho sebediswa dikhamera tse pedi tsa IP tse kentsweng ka orthogonally. Ka lehlakoreng le letshehadi la setshwantsho sa skrine, sekgoqetsane sa terata se tshwereng hlooho se ka bonwa, mme cannula ya ho tlisa e le sebakeng sa yona ka hara tube ya ET.
Sistimi ea pompo ea syringe e laoloang ka hole (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) e sebelisang syringe ea khalase ea 100 μl e hokahantsoe le tube ea PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) ka nale ea 30 Ga. Tšoaea tube ho netefatsa hore ntlha e boemong bo nepahetseng trachea ha u kenya tube ea ET. Ha u sebelisa pompo ea micro, syringe plunger e ile ea huloa ha ntlha ea tube e qoelisoa sampole ea MP e lokelang ho tlisoa. Tube ea ho tlisa e jereng e ile ea kenngoa ka har'a tube ea endotracheal, ea beha ntlha ka har'a karolo e matla ka ho fetisisa ea matla a rona a makenete a neng a lebelletsoe. Ho fumana setšoantšo ho ile ha laoloa ka ho sebelisa sesebelisoa sa ho lemoha ho hema se hokahantsoeng le lebokose la rona la nako le thehiloeng ho Arduino, 'me matšoao 'ohle (mohlala, mocheso, ho hema, ho bula/ho koala ha shutter le ho fumana setšoantšo) a ile a rekotoa ho sebelisoa Powerlab le LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Ha ho etsoa litšoantšo Ha ho ne ho sa fihlellehe, lik'hamera tse peli tsa IP (Panasonic BB-SC382) li ne li behiloe hoo e ka bang 90° ho e mong le e mong mme di ne di sebediswa ho lekola boemo ba makenete mabapi le trachea nakong ya ditshwantsho (Setshwantsho sa 2b, c). Ho fokotsa dintho tse entsweng ka motsamao, setshwantsho se le seng se ile sa fumanwa ka ho hema nakong ya phallo ya maqhubu a lewatle.
Makenete e hoketsoe mohatong oa bobeli o ka fumanoang hole ho tloha kantle ho ntlo ea litšoantšo. Maemo le litlhophiso tse fapaneng tsa makenete li ile tsa lekoa, ho kenyeletsoa: E kentsoe ka sekhutlo sa hoo e ka bang 30° ka holim'a trachea (litlhophiso tse bontšitsoeng ho Setšoantšo sa 2a le sa 3a); makenete e 'ngoe ka holim'a phoofolo le e 'ngoe ka tlase, ka lipalo tse behiloeng ho hohela (Setšoantšo sa 3b); makenete e 'ngoe ka holim'a phoofolo le e 'ngoe ka tlase, ka lipalo tse behiloeng ho retelehela (Setšoantšo sa 3c); le makenete e 'ngoe ka holimo 'me e otlolohile ho trachea (Setšoantšo sa 3d). Hang ha phoofolo le makenete li hlophisitsoe 'me MP e lokelang ho lekoa e kentsoe ka pompong ea syringe, fana ka tekanyo ea 50 μl ka sekhahla sa 4 μl/sec ha u ntse u fumana litšoantšo. Makenete ebe e fetisetsoa pele le morao ho pholletsa le trachea ha u ntse u tsoela pele ho fumana litšoantšo.
Sebopeho sa makenete bakeng sa ho nka ditshwantsho tsa in vivo (a) makenete e le nngwe ka hodima trachea ka sekhutlo sa hoo e ka bang 30°, (b) makenete a mabedi a behiloeng ho hohela, (c) makenete a mabedi a behiloeng ho leleka, (d) makenete e le nngwe ka hodimo mme e otlolohile ka hara trachea. Mohlokomedi o ile a sheba fatshe ho tloha molomong ho ya matshwafong ka trachea, mme lehlasedi la X-ray le feta ka lehlakoreng le letshehadi la rat mme la tswa ka lehlakoreng le letona. Makenete a tsamaiswa boleleleng ba tsela ya moya kapa ka letsohong le letshehadi le le letona ka hodima trachea ka lehlakoreng la lehlasedi la X-ray.
Re boetse ra batla ho fumana ponahalo le boits'oaro ba likaroloana tse ka har'a mekhoa ea ho hema ntle le ho hema ho ferekanyang le motsamao oa pelo. Ka hona, qetellong ea nako ea ho nka litšoantšo, liphoofolo li ile tsa bolaoa ka botho ka lebaka la ho sebelisa pentobarbital overdose (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Liphoofolo tse ling li ile tsa siuoa sethaleng sa ho nka litšoantšo, 'me hang ha ho hema le ho otla ha pelo ho emisa, ts'ebetso ea ho nka litšoantšo e ile ea phetoa, ho eketsoa tekanyo e eketsehileng ea MP haeba ho se na MP e bonahalang holim'a tsela ea ho hema.
Litšoantšo tse fumanoeng li ile tsa lokisoa lebaleng le bataletseng le lebaleng le lefifi ebe li kopanngoa hore e be filimi (liforeimi tse 20 ka motsotsoana; lebelo le tloaelehileng la 15-25 × ho latela sekhahla sa ho hema) ho sebelisoa sengoloa se ikhethileng se ngotsoeng ka MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Lithuto tsohle tsa ho fana ka vector ea liphatsa tsa lefutso tsa LV li entsoe Setsing sa Lipatlisiso tsa Liphoofolo sa Laboratori Univesithing ea Adelaide 'me li ne li reretsoe ho sebelisa liphetho tsa teko ea SPring-8 ho lekola hore na ho fana ka LV-MP ka pel'a tšimo ea makenete ho ka ntlafatsa phetiso ea liphatsa tsa lefutso ka har'a 'mele. Ho lekola litlamorao tsa MP le tšimo ea makenete, lihlopha tse peli tsa liphoofolo li ile tsa phekoloa: sehlopha se seng se ile sa fuoa LV-MP ka makenete e behiloeng, 'me sehlopha se seng sa fumana sehlopha sa taolo se nang le LV-MP ntle le makenete.
Li-vector tsa liphatsa tsa lefutso tsa LV li hlahisitsoe ho sebelisoa mekhoa e hlalositsoeng pele 25, 26. Vector ea LacZ e hlahisa gene ea beta-galactosidase e fumanehang ka har'a nuclear-located e tsamaisoang ke constitutive MPSV promoter (LV-LacZ), e hlahisang sehlahisoa sa karabelo e putsoa liseleng tse fetotsoeng, tse bonahalang mahlakoreng a lisele tsa matšoafo le likarolo tsa lisele. Titration e entsoe litsong tsa lisele ka ho bala palo ea lisele tse ntle tsa LacZ ka letsoho ka hemocytometer ho bala titer ho TU/ml. Lijari li bolokoa ka cryoprepreserved ho -80 °C, li qhibilihisoa pele li sebelisoa, 'me li tlameletsoe ho CombiMag ka ho kopanya ka karolelano ea 1:1 le ho futhumala leqhoang bonyane metsotso e 30 pele ho pepa.
Likhoto tse tloaelehileng tsa Sprague Dawley (n = 3/sehlopha, ~2-3 li ile tsa kenngoa ka har'a peritone ka motsoako oa 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) le ente ea 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australia) ea khoeli) ip) le cannulation ea molomo e seng ea opereishene e nang le cannula ea 16 Ga iv. Ho netefatsa hore lisele tsa moea oa tracheal li fumana phetisetso ea LV, e ile ea lokisoa ho sebelisoa mokhoa oa rona oa ho thiba o hlalositsoeng pele oa mechine, moo bokaholimo ba moea oa tracheal bo ileng ba hohla ka lehlakoreng le leng ka baskete ea terata (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Tsamaiso ea LV-MP ea tracheal e ile ea etsoa ka har'a khabinete ea polokeho ea baeloji metsotso e ka bang 10 kamora ho thiba.
Matla a makenete a sebedisitsweng tekong ena a hlophisitswe ka tsela e tshwanang le thuto ya X-ray ya in vivo, ka makenete a tshwanang a tshwerweng ka hodima trachea ho sebediswa distillation stent clips (Setshwantsho sa 4). Bophahamo ba 50 μl (2 × 25 μl aliquots) ba LV-MP bo ile ba kenngwa ka hara trachea (n = diphoofolo tse 3) ho sebediswa pipette e nang le ntlha ya gel jwalo ka ha ho hlalositswe pele. Sehlopha sa taolo (n = diphoofolo tse 3) se fumane di-LV-MP tse tshwanang ntle le ho sebedisa makenete. Kamora hore infusion e phethehe, cannula e tloswa tube ya ET mme phoofolo e a epollwa. Makenete a dula sebakeng sa ona metsotso e 10, ebe a a tloswa. Dikhoto di ile tsa fumana tekanyo ya meloxicam e ka tlasa letlalo (1 ml/kg) (Ilium, Australia) e latelwa ke ho kgutliswa ha anesthesia ka ente ya ip ya 1 mg/kg ya atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia). Dikhoto di ile tsa bolokwa di futhumetse mme tsa bewa leihlo ho fihlela di fola ka botlalo ho tswa ho anesthesia.
Sesebelisoa sa ho tsamaisa sa LV-MP ka har'a khabinete ea polokeho ea baeloji. Sebaka sa Luer se bohlooho bo bobebe sa tube ea ET se ka bonoa se hlahella molomong 'me ntlha ea gel ea pipette e bontšitsoeng setšoantšong e kenngoa ka tube ea ET ho ea botebong bo lakatsehang ka har'a trachea.
Beke kamora mokhoa oa ho lekanya LV-MP, liphoofolo li ile tsa bolaoa ka botho ka ho hema CO2 ka 100% 'me ponahalo ea LacZ e ile ea hlahlojoa ho sebelisoa kalafo ea rona e tloaelehileng ea X-gal. Masale a mararo a cartilaginous a ile a tlosoa ho netefatsa hore tšenyo efe kapa efe ea mechini kapa ho bolokoa ha mokelikeli ho tsoa sebakeng sa tube ea endotracheal ha ea kenyelletsoa tlhahlobong. Trachea ka 'ngoe e ile ea khaoloa ka bolelele ho etsa likarolo tse peli bakeng sa tlhahlobo, 'me ea kenngoa ka sejaneng se nang le rabara ea silicone (Sylgard, Dow Inc) ho sebelisoa nale ea Minutien (Fine Science Tools) ho bona bokaholimo ba leseli. Kabo le mokhoa oa lisele tse fetotsoeng li tiisitsoe ka ho nka lifoto ka pele ho sebelisoa microscope ea Nikon (SMZ1500) ka khamera ea DigiLite le software ea TCapture (Tucsen Photonics, China). Litšoantšo li fumanoe ka keketseho ea 20x (ho kenyeletsoa le sebaka se phahameng ka ho fetisisa bakeng sa bophara bo felletseng ba trachea), ka bolelele bohle ba trachea bo bontšitsoeng mohato ka mohato, ho netefatsa hore setšoantšo se seng le se seng sea kopana ho lekana ho lumella setšoantšo "ho roka". Litšoantšo tse tsoang ho e 'ngoe le e 'ngoe Ka mor'a moo, trachea e ile ea kopanngoa hore e be setšoantšo se le seng se kopaneng ho sebelisoa Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ho sebelisoa algorithm ea motsamao oa planar. Libaka tsa tlhahiso ea LacZ litšoantšong tse kopaneng tsa trachea ho tsoa phoofolong ka 'ngoe li ile tsa lekanngoa ho sebelisoa sengoloa sa MATLAB se iketsang (R2020a, MathWorks) joalo ka ha ho hlalositsoe pele, ho sebelisoa litlhophiso tsa 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, le Boleng < 0.7. Ka ho latela libopeho tsa lisele, maske e ile ea hlahisoa ka letsoho ho GIMP v2.10.24 bakeng sa setšoantšo se seng le se seng se kopaneng e le ho khetholla sebaka sa lisele le ho thibela ho fumanoa ha bohata ho tsoa ka ntle ho lisele tsa trachea. Libaka tse silafalitsoeng ho tsoa litšoantšong tsohle tse kopantsoeng ho tsoa phoofolong ka 'ngoe li ile tsa akaretsoa ho hlahisa sebaka se silafalitsoeng kaofela bakeng sa phoofolo eo. Sebaka se silafalitsoeng se ile sa aroloa ke sebaka se akaretsang sa maske ho hlahisa sebaka se tloaelehileng.
Trachea ka 'ngoe e ne e kentsoe ka parafini 'me likarolo tsa 5 μm li ile tsa khaoloa. Likarolo li ile tsa hanyetsoa ka bofubelu bo potlakileng bo sa nke lehlakore ka metsotso e 5 'me litšoantšo li ile tsa fumanoa ho sebelisoa microscope ea Nikon Eclipse E400, khamera ea DS-Fi3 le software ea ho hapa likarolo tsa NIS (mofuta oa 5.20.00).
Litlhahlobo tsohle tsa lipalo-palo li entsoe ho GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Bohlokoa ba lipalo-palo bo behiloe ho p ≤ 0.05. Boemo bo tloaelehileng bo netefalitsoe ho sebelisoa teko ea Shapiro-Wilk, 'me liphapang tsa ho taka ha LacZ li ile tsa hlahlojoa ho sebelisoa teko ea t e sa kopantsoeng.
Li-MP tse tšeletseng tse hlalositsoeng ho Tafole ea 1 li hlahlobiloe ho sebelisoa PCXI, 'me ponahalo e hlalositsoe ho Tafole ea 2. Li-MP tse peli tsa polystyrene (MP1 le MP2; 18 μm le 0.25 μm, ka ho latellana) li ne li sa bonahale tlas'a PCXI, empa lisampole tse ling kaofela li ne li tsebahala (mehlala e bontšitsoe ho Setšoantšo sa 5). MP3 le MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm le 0.9 μm, ka ho latellana) li bonahala hanyane. Le hoja li na le tse ling tsa likaroloana tse nyane ka ho fetisisa tse lekiloeng, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) e ne e le eona e hlahelletseng ka ho fetisisa. Sehlahisoa sa CombiMag MP6 se ​​thata ho se bona. Maemong 'ohle, bokhoni ba rona ba ho lemoha MP bo ile ba ntlafatsoa haholo ka ho fetolela makenete morao le morao ho bapile le capillary. Ha makenete a tloha ho capillary, likaroloana li ile tsa atoloha ka likhoele tse telele, empa ha makenete a ntse a atamela 'me matla a matla a makenete a ntse a eketseha, likhoele tsa likaroloana li ile tsa khutsufala ha likaroloana li ntse li fallela holimo ho capillary. (sheba Video e Tlatsetsang S1: MP4), e eketsa Botenya ba dikarolwana tsa bokahodimo. Ka lehlakoreng le leng, ha makenete e tloswa ho capillary, matla a tshimo a a fokotseha mme di-MP di hlophisa botjha ka dithapo tse telele tse atolohang ho tloha bokahodimong bo ka hodimo ba capillary (sheba Video e Tlatsetsang S2:MP4). Kamora hore makenete e kgaotse ho tsamaya, dikarolwana di tswela pele ho tsamaya ka nako e kgutshwane kamora ho fihla boemong ba tekano. Ha MP e ntse e tsamaya ho ya le hole le bokahodimo ba capillary, dikarolwana tsa makenete hangata di hula ditshila ka hara mokelikeli.
Ponahalo ea MP tlas'a PCXI e fapana haholo lipakeng tsa disampole.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 le (d) MP6.Litšoantšo tsohle tse bontšitsoeng mona li nkiloe ka makenete e fumanehang hoo e ka bang 10 mm ka ho toba ka holim'a capillary.Li-circles tse kholo tse bonahalang ke li-bubble tsa moea tse tšoasitsoeng ka har'a capillaries, li bontša ka ho hlaka likarolo tse ntšo le tse tšoeu tsa moeli oa setšoantšo sa phapang ea mekhahlelo.Lebokose le lefubelu le na le keketseho e ntlafatsang phapang.Hlokomela hore bophara ba li-schematics tsa makenete lipalong tsohle ha lia lekana 'me li kholo ka makhetlo a ka bang 100 ho feta tse bontšitsoeng.
Ha makenete e fetoleloa ka letsohong le letšehali le le letona holim'a capillary, sekhutlo sa khoele ea MP se fetoha ho lumellana le makenete (sheba Setšoantšo sa 6), kahoo se hlalosa mela ea matla a makenete. Bakeng sa MP3-5, ka mor'a hore chord e fihle sekhutlong sa moeli, likaroloana li huloa holim'a capillary. Hangata sena se fella ka hore li-MP li kopane ka lihlopha tse kholoanyane haufi le moo matla a makenete a leng matla ka ho fetisisa (sheba Video e Eketsehileng S3:MP5). Sena se boetse se bonahala haholo ha ho etsoa litšoantšo haufi le pheletso ea capillary, e leng se etsang hore li-MP li kopane 'me li tsepamise mohopolo sebopehong sa mokelikeli le moea. Likaroloana tse ho MP6, tse neng li le thata ho li lemoha ho feta MP3-5, ha lia ka tsa huloa ha makenete e ntse e tsamaea ka capillary, empa likhoele tsa MP li ile tsa arohana, tsa siea likaroloana tšimong ea pono (sheba Video e Eketsehileng S4:MP6). Maemong a mang, ha matla a makenete a sebelisitsoeng a ne a fokotsoa ka ho tsamaisa makenete sebaka se seholo ho tloha sebakeng sa litšoantšo, li-MP tse setseng li ile tsa theohela butle-butle holim'a tube ka matla a khoheli ha li ntse li le khoeleng (sheba Video e Eketsehileng S5: MP3).
Sekhutlo sa khoele ea MP sea fetoha ha makenete e fetoleloa ka letsohong le letona ka holim'a capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 le (d) MP6. Lebokose le lefubelu le na le keketseho e ntlafatsang phapang.Hlokomela hore livideo tse tlatsetsang li na le tlhaiso-leseling kaha li senola sebopeho sa bohlokoa sa likaroloana le tlhahisoleseling e matla e ke keng ea bonoa litšoantšong tsena tse sa fetoheng.
Liteko tsa rona li bontšitse hore ho tsamaisa makenete butle-butle ho ea pele le morao ho pholletsa le trachea ho nolofatsa pono ea MP maemong a motsamao o rarahaneng ka har'a vivo. Teko ea in vivo ha ea etsoa kaha li-polystyrene beads (MP1 le MP2) li ne li sa bonahale ka har'a capillary. E 'ngoe le e 'ngoe ea li-MP tse 'ne tse setseng e ile ea lekoa ka har'a vivo ka axis e telele ea makenete e behiloeng ka holim'a trachea ka sekhutlo sa hoo e ka bang 30° ho ea holimo (sheba Litšoantšo tsa 2b le 3a), kaha sena se ile sa fella ka liketane tse telele tsa MP 'me se ne se sebetsa hantle ho feta sebopeho sa makenete se emisitsoeng. MP3, MP4 le MP6 ha lia ka tsa fumanoa ka har'a trachea ea liphoofolo life kapa life tse phelang. Ha litsela tsa moea tsa rat li ne li nkuoa setšoantšo ka mor'a hore liphoofolo li bolaoe ka tsela ea botho, likaroloana li ile tsa lula li sa bonahale leha bophahamo bo eketsehileng bo ne bo eketsoa ho sebelisoa pompo ea syringe. MP5 e ne e e-na le tekanyo e phahameng ka ho fetisisa ea oxide ea tšepe 'me e ne e le eona feela karoloana e bonahalang, 'me ka hona e ne e sebelisoa ho hlahloba le ho hlalosa boitšoaro ba in vivo ba MP.
Ho beha makenete holim'a trachea nakong ea ho fana ka MP ho ile ha fella ka hore li-MP tse ngata, empa eseng kaofela, li lule li le ngata tšimong ea pono. Likaroloana tse kenang trachea li bonoa hantle liphoofolong tse hlabiloeng ka botho. Setšoantšo sa 7 le Video e Tlatsetsang S6: MP5 e bontša ho tšoaroa ka matla a makenete le ho lumellana ha likaroloana holim'a trachea ea ventral, ho bontšang hore li-MP li ka lebisoa libakeng tse lakatsehang tsa trachea. Ha ho batloa hole haholo ka har'a trachea kamora ho fana ka MP, li-MP tse ling li ile tsa fumanoa haufi le carina, ho fana ka maikutlo a hore matla a matla a makenete a ne a sa lekana ho bokella le ho boloka li-MP tsohle, kaha li ne li tlisoa sebakeng sa matla a maholo a matla a makenete nakong ea ts'ebetso ea mokelikeli. Leha ho le joalo, mahloriso a MP ea kamora ho pepa a ne a le holimo ho potoloha sebaka se bontšitsoeng, ho fana ka maikutlo a hore li-MP tse ngata li ile tsa sala libakeng tsa moea moo matla a matla a makenete a sebelisitsoeng a neng a le holimo ka ho fetisisa.
Litšoantšo tse tsoang ho (a) pele le (b) kamora ho kenngoa ha MP5 ka har'a trachea ea rat e sa tsoa bolaoa 'me makenete e behiloe ka ho toba ka holim'a sebaka sa litšoantšo. Sebaka se bontšitsoeng se pakeng tsa masale a mabeli a lefufuru. Pele ho ho kenngoa ha MP, ho na le mokelikeli moeeng. Lebokose le lefubelu le na le keketseho e ntlafatsang phapang. Litšoantšo tsena li tsoa videong e bontšitsoeng ho Supplementary Video S6:MP5.
Ho fetolela makenete ho pholletsa le trachea ka hare ho vivo ho entse hore ketane ea MP e fetole sekhutlo ka hare ho bokaholimo ba moea ka tsela e tšoanang le e bonoang ka har'a li-capillaries (sheba Setšoantšo sa 8 le Video e Eketsehileng S7: MP5). Leha ho le joalo, thutong ea rona, li-MP li ne li ke ke tsa huleloa holim'a moea o phelang joalo ka ha li ka huleloa ka li-capillaries. Maemong a mang, ketane ea MP e tla ba telele ha makenete e tsamaea ka letsohong le letšehali le le letona. Hoa thahasellisa hore re boetse re fumane hore khoele ea likaroloana e bonahala e fetola botebo ba lera la mokelikeli oa bokaholimo ha makenete e tsamaisoa ka bolelele ho pholletsa le trachea, 'me ea atoloha ha makenete e tsamaisoa ka ho toba holimo 'me khoele ea likaroloana e potoloha ho ea boemong bo otlolohileng (sheba Video e Eketsehileng S7). : MP5 ka 0:09, ka tlase ho le letona).Mokgwa o ikgethang wa motsamao o ile wa fetoha ha makenete e ne e fetisetswa hodimo ho trachea ka mahlakoreng (ke hore, ka letsohong le letshehadi kapa le letona la phoofolo ho ena le bolelele ba trachea).Dikaroloana di ne di ntse di bonahala hantle ha di ntse di tsamaya, empa ha makenete e tloswa ho trachea, dintlha tsa dithapo tsa dikarolwana di ile tsa bonahala (sheba Video e Tlatsetsang S8:MP5, ho qala ka 0:08).Sena se dumellana le boitshwaro ba MP boo re bo boneng tlasa matla a makenete a sebediswang ka hara capillary ya khalase.
Mehlala ea litšoantšo tse bontšang MP5 ka har'a trachea ea rat e phelang e anesthesia.(a) Makenete e sebelisoa ho fumana litšoantšo tse ka holimo le ka letsohong le letšehali la trachea, ebe (b) ka mor'a hore makenete e isoe ka ho le letona. Lebokose le lefubelu le na le keketseho e ntlafatsang phapang. Litšoantšo tsena li tsoa videong e bontšitsoeng ho Supplementary Video S7:MP5.
Ha lipalo tse peli li ne li hlophisitsoe ka tsela e shebaneng le leboea-boroa ka holimo le ka tlase ho trachea (ke hore, li hohela; Setshwantsho sa 3b), li-chord tsa MP li ne li bonahala li le telele 'me li ne li le lehlakoreng la trachea ho fapana le holim'a tracheal ea mokokotlo (sheba Video e Eketsehileng S9: MP5). Leha ho le joalo, mahloriso a phahameng a likaroloana sebakeng se le seng (ke hore, bokaholimo ba mokokotlo ba trachea) ha aa ka a fumanoa ka mor'a ho tlisoa ha mokelikeli ha ho sebelisoa sesebelisoa sa makenete a mabeli, seo hangata se etsahalang ha ho sebelisoa sesebelisoa sa makenete a le mong. Ebe ha makenete a le mong a hlophisitsoe ho leleka lipalo tse khutlisitsoeng morao (Setshwantsho sa 3c), palo ea likaroloana tse bonahalang tšimong ea pono ha ea ka ea bonahala e eketseha ka mor'a ho tlisoa. Ho hlophisoa ha litlhophiso ka bobeli tsa makenete a mabeli ho thata ka lebaka la matla a maholo a matla a makenete a hulang kapa a sutumetsang makenete, ka ho latellana. Ho hlophisoa ho ile ha fetoloa makenete a le mong a bapileng le tsela ea moea empa a feta tseleng ea moea ka likhato tse 90 e le hore mela ea tšimo e tšele lebota la tracheal ka mokhoa o ikhethileng (Setshwantsho sa 3d), tataiso e etselitsoeng ho fumana hore na ho kopana ha likaroloana ka lehlakoreng ho ka etsahala. lebota le ne le ka bonoa. Leha ho le jwalo, tlhophisong ena, ho ne ho se na motsamao o tsebahalang wa pokello ya MP kapa motsamao wa makenete. Ho latela diphetho tsena tsohle, tlhophiso ya makenete e le nngwe, ya di-degree tse 30 (Setshwantsho sa 3a) e kgethilwe bakeng sa dithuto tsa ho jara dijini ka hara vivo.
Ha phoofolo e ne e nkuwa setshwantsho kgafetsa hang ka mora polao e nang le botho, ho se be teng ha motsamao o ferekanyang wa dinama ho ne ho bolela hore mela e menyenyane le e kgutshwane ya dikarolwana e ka lemohuwa tshimong e hlakileng ya di-interchondral, e "thekesela" ho ya ka motsamao wa phetolelo wa makenete. Leha ho le jwalo, e ntse e sa bone ka ho hlaka boteng le motsamao wa dikarolwana tsa MP6.
Tekanyo ea LV-LacZ e ne e le 1.8 × 108 TU/ml, 'me ka mor'a ho kopana le CombiMag MP (MP6) ka 1:1, liphoofolo li ile tsa fumana tekanyo ea 50 μl ea tracheal ea koloi ea LV ea 9 × 107 TU/ml (ke hore 4.5 × 106 TU/rat). Lithutong tsena, ho e-na le ho fetolela makenete nakong ea pelehi, re ile ra lokisa makenete sebakeng se le seng ho fumana hore na phetisetso ea LV (a) e ka ntlafatsoa ha e bapisoa le phetisetso ea vector ha ho se na matla a makenete, 'me (b) e ka tsepamisoa. Lisele tsa Airway li fetisetsoa libakeng tse reretsoeng makenete tsa moea o ka holimo.
Boteng ba makenete le tšebeliso ea CombiMag hammoho le li-vector tsa LV ha hoa ka ha bonahala ho e-na le litlamorao tse mpe bophelong ba liphoofolo, joalo ka mokhoa oa rona o tloaelehileng oa ho fana ka vector ea LV. Litšoantšo tse ka pele tsa sebaka sa tracheal se ileng sa hlaseloa ke mechine (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 1) li bontšitse hore ho ne ho e-na le maemo a phahameng haholo a phetisetso sehlopheng sa liphoofolo tse phekoloang ka LV-MP ha makenete a ne a le teng (Setšoantšo sa 9a). Ke palo e nyane feela ea ho taka ha LacZ e putsoa e neng e le teng sehlopheng sa taolo (Setšoantšo sa 9b). Ho baloa ha libaka tse nang le matheba a X-Gal tse tloaelehileng ho bontšitse hore tsamaiso ea LV-MP boteng ba matla a makenete e hlahisitse ntlafatso e ka bang makhetlo a 6 (Setšoantšo sa 9c).
Mehlala ea litšoantšo tse kopantsoeng tse bontšang phetisetso ea trachea ke LV-MP (a) boteng ba matla a makenete le (b) boteng ba makenete.(c) Ntlafatso e kholo ea lipalo-palo sebakeng se tloaelehileng sa phetisetso ea LacZ ka har'a trachea ha ho sebelisoa makenete (*p = 0.029, t-test, n = 3 ka sehlopha, karolelano ± SEM).
Likarolo tse se nang lehlakore tse nang le matheba a mafubelu a potlakileng (mohlala o bontšitsoeng ho Setshwantsho se Tlatsetsang sa 2) li bontšitse lisele tse nang le matheba a LacZ li le teng ka mokhoa le sebaka se tšoanang joalo ka ha ho tlalehiloe pele.
Phephetso ea bohlokoa bakeng sa phekolo ea liphatsa tsa lefutso tsa moea e ntse e le sebaka se nepahetseng sa likaroloana tse tsamaisang moea libakeng tse khahlisang le ho fihlella maemo a holimo a katleho ea phetisetso matšoafong a tsamaeang ha moea o phalla le ho tlosoa ha mucus ho sebetsang. Bakeng sa bajari ba LV ba etselitsoeng ho phekola lefu la moea la CF, ho eketsa nako ea bolulo ea likaroloana tse tsamaisang moea ka har'a litsela tsa moea tse tsamaisang moea e bile sepheo se sa hlakang ho fihlela joale. Joalokaha ho boletsoe ke Castellani et al., tšebeliso ea masimo a makenete ho ntlafatsa phetisetso e na le melemo ha e bapisoa le mekhoa e meng ea phano ea liphatsa tsa lefutso joalo ka electroporation, kaha e ka kopanya bonolo, katleho ea litšenyehelo, sebaka sa phano, katleho e eketsehileng, le linako tse khutšoane tsa ho ikatisa, mohlomong le tekanyo e nyane ea mojari10. Leha ho le joalo, ho kenngoa ha likaroloana tsa makenete ka har'a moea le boitšoaro ba likaroloana tsa makenete ka har'a litsela tsa moea tlas'a tšusumetso ea matla a makenete a kantle ha ho so ka ho hlalosoa, leha e le hore ho khoneha ha mokhoa ona ha hoa bontšoa ka har'a moea ho ntlafatsa maemo a tlhahiso ea liphatsa tsa lefutso liphaposing tsa moea tse phelang tse sa senyehang.
Liteko tsa rona tsa in vitro synchrotron PCXI li bontšitse hore likaroloana tsohle tseo re li lekileng, ntle le polystyrene MP, li ne li bonahala ho setup ea litšoantšo tseo re li sebelisitseng. Ha ho na le tšimo ea makenete, li-MP li theha likhoele tseo bolelele ba tsona bo amanang le mofuta oa likaroloana le matla a tšimo ea makenete (ke hore, ho ba haufi le motsamao oa makenete). Joalokaha ho bontšitsoe ho Setšoantšo sa 10, likhoele tseo re li bonang li thehoa ka lebaka la hore karoloana ka 'ngoe e na le makenete 'me e susumetsa matla a eona a makenete a sebakeng seo. Masimo ana a arohaneng a etsa hore likaroloana tse ling tse tšoanang li kopane 'me li hokahane, ka metsamao e kang ea khoele ea sehlopha ka lebaka la matla a sebakeng seo a tsoang ho matla a hohelang le a nyonyehang a libaka tse ling.
Ho bonts'a di-schematic (a,b) dikarolwana tse hlahiswang ka hare ho di-capillaries tse tletseng mokelikeli le (c,d) trachea e tletseng moya.Hlokomela hore di-capillaries le trachea ha di hulwe ho ya ka sekala.Phanele (a) e boetse e na le tlhaloso ya MP, e nang le dikarolwana tsa Fe3O4 tse hlophisitsweng ka dithapo.
Ha makenete e ne e sisinyeha ka hodima capillary, sekhutlo sa khoele ya dikarolwana se fihlile moeding wa bohlokwa bakeng sa MP3-5 e nang le Fe3O4, ka mora moo khoele ya dikarolwana ha e a ka ya hlola e dula boemong ba pele, empa ya tsamaya hodima bokahodimo ho ya boemong bo botjha. makenete. Phello ena e ka etsahala hobane bokahodimo ba capillary ya khalase bo boreleli ho lekana ho dumella motsamao ona ho etsahala. Hoa thahasellisa hore MP6 (CombiMag) ha e a ka ya itshwara ka tsela ena, mohlomong hobane dikarolwana di ne di le nyane, di ne di na le dikobo tse fapaneng kapa ditefiso tsa bokahodimo, kapa mokelikeli o jereng o ikemetseng o amme bokgoni ba tsona ba ho tsamaya. Phapang ya setshwantsho sa dikarolwana tsa CombiMag le yona e fokola, e leng se bontshang hore mokelikeli le dikarolwana di ka ba le bongata bo tshwanang mme ka hona ha di tsamaelane habonolo. Dikarolwana di ka boela tsa kgomarela haeba makenete e tsamaya ka potlako haholo, e leng se bontshang hore matla a makenete a ke ke a hlola kgohlano pakeng tsa dikarolwana tse mokelikeling, e leng se bontshang hore mohlomong ha ho makatse hore matla a makenete le sebaka se pakeng tsa makenete le sebaka se rerilweng ke sa bohlokwa haholo. Ha di kopantswe, diphetho tsena di boetse di bontsha hore, le hoja makenete a ka hapa di-MP tse ngata tse phallang sebakeng se rerilweng ke sa bohlokwa, ho ke ke ha etsahala hore makenete a ka tshepuwa. ho tsamaisa dikarolwana tsa CombiMag hodima trachea. Ka hona, re etsa qeto ya hore dithuto tsa in vivo LV-MP di lokela ho sebedisa masimo a makenete a sa fetoheng ho shebana le dibaka tse itseng tsa sefate sa moya.
Ha dikarolwana di ntshwa mmeleng, ho thata ho di hlwaya moelelong wa dinama tse rarahaneng tsa mmele tse tsamayang, empa bokgoni ba ho di lemoha bo ile ba ntlafatswa ka ho fetolela makenete ka ho rapama ka hodima trachea ho "suthisa" dithapo tsa MP. Le hoja ho nka ditshwantsho tse phelang ho ka kgoneha, ho bonolo ho lemoha motsamao wa dikarolwana hang ha phoofolo e bolailwe ka botho. Maemo a MP ka kakaretso a ne a le hodimo sebakeng sena ha makenete e ne e le ka hodima sebaka sa ditshwantsho, le hoja dikarolwana tse ding hangata di ne di fumanwa hole le trachea. Ho fapana le dithuto tsa in vitro, dikarolwana di ke ke tsa hulwa ho ya ka trachea ka ho fetolela makenete. Phihlello ena e dumellana le kamoo mucus e kwahelang bokahodimo ba trachea e atisang ho sebetsana le dikarolwana tse hemiwang, e di tshwasa ka hara mucus mme hamorao e hlakolwe ke mokgwa wa ho tlosa mucociliary.
Re ne re nahana hore tšebeliso ea makenete bakeng sa ho hohela ka holimo le ka tlase ho trachea (Setšoantšo sa 3b) e ka fella ka matla a makenete a tšoanang haholoanyane, ho e-na le matla a makenete a kopaneng haholo ka nako e 'ngoe, e leng se ka lebisang kabong e tšoanang haholoanyane ea likaroloana. Leha ho le joalo, thuto ea rona ea pele ha ea ka ea fumana bopaki bo hlakileng bo tšehetsang khopolo-taba ena. Ka ho tšoanang, ho hlophisa para ea makenete ho leleka (Setšoantšo sa 3c) ha hoa ka ha fella ka ho beoa ha likaroloana tse ngata sebakeng se bontšitsoeng. Liphuputso tsena tse peli li bontša hore ho hlophisoa ha makenete a mabeli ha ho ntlafatse haholo taolo ea lehae ea ho shebana le MP, le hore matla a matla a makenete a hlahang a thata ho a hlophisa, e leng se etsang hore mokhoa ona o se ke oa sebetsa haholo. Ka ho tšoanang, ho lebisa makenete ka holimo le ka har'a trachea (Setšoantšo sa 3d) le hona ha hoa ka ha eketsa palo ea likaroloana tse bolokiloeng sebakeng se bontšitsoeng. Tse ling tsa litlhophiso tsena tse ling li kanna tsa se atlehe hobane li fella ka matla a tlase a matla a makenete ka har'a sebaka sa ho beoa. Ka hona, tlhophiso e le 'ngoe ea makenete ea angle ea likhato tse 30 (Setšoantšo sa 3a) e nkoa e le mokhoa o bonolo le o sebetsang ka ho fetisisa bakeng sa tlhahlobo ea in vivo.
Phuputso ea LV-MP e bontšitse hore ha li-vector tsa LV li ne li kopanngoa le CombiMag 'me li ne li hlahisoa ka mor'a ho khathatseha ha' mele boteng ba matla a khoheli, maemo a phetisetso a ne a eketseha haholo trachea ha a bapisoa le li-control. Ho latela lithuto tsa synchrotron imaging le liphetho tsa LacZ, matla a khoheli a ne a bonahala a khona ho boloka LV ka har'a trachea le ho fokotsa palo ea likaroloana tsa vector tse ileng tsa kenella ka hare ho matšoafo hang-hang. Lintlafatso tse joalo tsa ho shebana li ka lebisa katlehong e phahameng ha li ntse li fokotsa li-titers tse tlisoang, phetisetso e seng ea sepheo, litla-morao tsa ho ruruha le tsa 'mele, le litšenyehelo tsa ho jara liphatsa tsa lefutso. Habohlokoa, ho ea ka moetsi, CombiMag e ka sebelisoa hammoho le mekhoa e meng ea phetisetso ea liphatsa tsa lefutso, ho kenyeletsoa le li-vector tse ling tsa vaerase (joalo ka AAV) le li-nucleic acid.