Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS dəstəyi məhduddur. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan göstərəcəyik.
Kistik fibroz ağciyər xəstəliyinin müalicəsi üçün gen vektorları keçirici hava yollarını hədəf almalıdır, çünki periferik ağciyər transduksiyası terapevtik fayda vermir. Virus transduksiyasının səmərəliliyi birbaşa vektorun qalma müddəti ilə əlaqədardır. Lakin, gen daşıyıcıları kimi çatdırılma mayeləri ilham zamanı təbii olaraq alveollara yayılır və istənilən formada terapevtik hissəciklər mukosiliar nəqliyyatla sürətlə təmizlənir. Gen daşıyıcılarının hava yollarında qalma müddətini uzatmaq vacibdir, lakin buna nail olmaq çətindir. Hava yollarının səthinə yönəldilə bilən gen daşıyıcısı ilə birləşmiş maqnit hissəcikləri regional hədəfləməni yaxşılaşdıra bilər. In vivo vizuallaşdırmanın çətinliklərinə görə, tətbiq olunan maqnit sahəsinin iştirakı ilə hava yolu səthindəki bu cür kiçik maqnit hissəciklərinin davranışı zəif başa düşülür. Bu tədqiqatın məqsədi, in vivo fərdi və həcmli hissəcik davranışının dinamikasını və nümunələrini araşdırmaq üçün anesteziya edilmiş siçovulların traxeyasında bir sıra maqnit hissəciklərinin in vivo hərəkətini vizuallaşdırmaq üçün sinxrotron görüntüləmədən istifadə etmək idi. Daha sonra biz həmçinin maqnit sahəsinin iştirakı ilə lentiviral maqnit hissəciklərinin çatdırılmasının siçovullarda transduksiya səmərəliliyini artırıb-artırmayacağını qiymətləndirdik. Traxeya. Sinxrotron rentgen görüntüləməsi, in vitro və in vivo şəraitində stasionar və hərəkətli maqnit sahələrində maqnit hissəciklərinin davranışını ortaya qoyur. Maqnitlərlə hissəciklər canlı hava yolunun səthi boyunca asanlıqla sürüklənə bilməz, lakin daşınma zamanı çöküntülər maqnit sahəsinin ən güclü olduğu görünüş sahəsində cəmləşir. Lentiviral maqnit hissəcikləri maqnit sahəsinin iştirakı ilə çatdırıldıqda ötürmə səmərəliliyi də altı dəfə artmışdır. Birlikdə, bu nəticələr göstərir ki, lentiviral maqnit hissəcikləri və maqnit sahələri gen vektorunun hədəflənməsini yaxşılaşdırmaq və in vivo keçirici hava yollarında ötürmə səviyyələrini artırmaq üçün dəyərli yanaşmalar ola bilər.
Kistik fibroz (KF), KF transmembran keçiricilik tənzimləyicisi (KTT) adlanan tək bir gendə dəyişiklikdən qaynaqlanır. KTT zülalı, KF patogenezinin əsas yeri olan keçirici hava yolları da daxil olmaqla, bədənin bir çox epitel hüceyrələrində mövcud olan bir ion kanalıdır. KTT qüsurları anormal su daşınmasına, hava yolu səthinin susuzlaşmasına və hava yolu səthi mayesinin (ASL) təbəqəsinin dərinliyinin azalmasına səbəb olur. Bu, həmçinin mukosiliar nəqliyyat (MKT) sisteminin tənəffüs yollarından inhalyasiya olunan hissəcikləri və patogenləri təmizləmək qabiliyyətini pozur. Məqsədimiz KTTT geninin düzgün surətini çatdırmaq və KTT, MKT və ağciyər sağlamlığını yaxşılaşdırmaq üçün lentiviral (LV) gen terapiyası hazırlamaq və bu parametrləri in vivo1 ölçməyə qadir yeni texnologiyaların inkişaf etdirilməsinə davam etməkdir.
Sol mədəcik vektorları, əsasən terapevtik geni hava yolu bazal hüceyrələrinə (hava yolu kök hüceyrələri) daimi olaraq inteqrasiya edə bildikləri üçün CF hava yolu gen terapiyası üçün aparıcı namizədlərdən biridir. Bu vacibdir, çünki onlar funksional gen korreksiyası edilmiş CF ilə əlaqəli hava yolu səthi hüceyrələrinə differensiasiya etməklə normal nəmlənməni və selik təmizlənməsini bərpa edə bilərlər və bu da ömürlük fayda verir. Sol mədəcik vektorları keçirici hava yoluna qarşı yönəldilməlidir, çünki burada CF ağciyər xəstəliyi başlayır. Vektorun ağciyərin daha dərin hissəsinə çatdırılması alveolyar transduksiyaya səbəb ola bilər, lakin bunun CF-də heç bir terapevtik faydası yoxdur. Lakin, gen daşıyıcıları kimi mayelər doğuşdan sonra nəfəs aldıqda təbii olaraq alveollara miqrasiya edir3,4 və terapevtik hissəciklər MCT vasitəsilə ağız boşluğuna sürətlə təmizlənir. Sol mədəcik transduksiyasının səmərəliliyi, vektorun hüceyrə udulmasına imkan vermək üçün hədəf hüceyrələrin yanında qalma müddəti ilə birbaşa bağlıdır - "yaşama müddəti"5 - bu, tipik regional hava axını, eləcə də koordinasiya olunmuş hissəcik selik tutması və MCT ilə asanlıqla azaldılır. Sol mədəcik üçün, sol mədəciyin hava yolunda qalma müddətini uzatmaq qabiliyyəti bu bölgədə yüksək səviyyəli transduksiyaya nail olmaq üçün vacibdir, lakin buna malikdir çox çətin olub.
Bu maneəni aradan qaldırmaq üçün, sol mədəciyin maqnit hissəciklərinin (SMA) iki tamamlayıcı şəkildə kömək edə biləcəyini təklif edirik. Birincisi, hədəfləməni yaxşılaşdırmaq və gen daşıyıcı hissəciklərinin istənilən hava yolu bölgəsində yerləşməsinə kömək etmək üçün onlar hava yolu səthinə maqnitlə yönəldilə bilər; və ASL) hüceyrə təbəqəsinə 6 keçə bilər. SMA-lar antikorlara, kemoterapevtik dərmanlara və ya hüceyrə membranlarına yapışan və ya müvafiq hüceyrə səthi reseptorlarına bağlanan və statik elektrikin iştirakı ilə şiş yerlərində toplanan digər kiçik molekullara bağlandıqda hədəf dərman çatdırılma vasitələri kimi geniş istifadə olunur. Xərçəng Müalicəsi üçün Maqnit Sahələri 7. Digər "hipertermal" üsullar, salınan maqnit sahələrinə məruz qaldıqda MP-ləri qızdırmaq və bununla da şiş hüceyrələrini məhv etmək məqsədi daşıyır. DNT-nin hüceyrələrə ötürülməsini artırmaq üçün bir transfeksiya agenti kimi bir maqnit sahəsinin istifadə edildiyi maqnit transfeksiyası prinsipi, çətin ötürülən hüceyrə xətləri üçün bir sıra qeyri-viral və virus gen vektorlarından istifadə edərək in vitro olaraq geniş istifadə olunur. Sol mədəcik maqnitotransfeksiyasının effektivliyi müəyyən edilmişdir, LV-MP-lərin statik maqnit sahəsinin iştirakı ilə insan bronxial epiteliya hüceyrə xəttinə in vitro çatdırılması, yalnız sol mədəcik vektoru ilə müqayisədə transduksiya səmərəliliyini 186 dəfə artırmışdır. Sol mədəcik maqnitotransfeksiyası həmçinin in vitro CF modelinə də tətbiq edilmişdir, burada maqnit transfeksiyası CF bəlğəminin iştirakı ilə hava-maye interfeysi kulturalarında sol mədəcik transduksiyasını 20 dəfə artırmışdır10. Lakin, orqanların in vivo maqnitotransfeksiyası nisbətən az diqqət çəkmişdir və yalnız bir neçə heyvanda qiymətləndirilmişdir. tədqiqatlar11,12,13,14,15, xüsusən də ağciyərlərdə16,17. Buna baxmayaraq, CF ağciyər terapiyasında maqnit transfeksiyası imkanları aydındır. Tan və digərləri (2020) bildiriblər ki, "səmərəli maqnit nanopartikül ağciyər çatdırılmasının konsepsiya sübutu tədqiqatı CF xəstələrində klinik nəticələri yaxşılaşdırmaq üçün gələcək CFTR inhalyasiya strategiyaları üçün yol açacaq"6.
Tətbiq olunan maqnit sahəsinin iştirakı ilə hava yollarının səthlərində kiçik maqnit hissəciklərinin davranışını vizuallaşdırmaq və öyrənmək çətindir və buna görə də zəif başa düşülür. Digər tədqiqatlarda, qaz kanalı səthinin hidratasiyasını birbaşa ölçmək üçün ASL dərinliyində18 və MCT davranışında19,20 kiçik in vivo dəyişiklikləri qeyri-invaziv şəkildə vizuallaşdırmaq və ölçmək üçün sinxrotron yayılma əsaslı fazalı kontrastlı rentgen görüntüləmə (PB-PCXI) metodu hazırladıq və müalicənin effektivliyinin erkən göstəricisi kimi istifadə etdik. Bundan əlavə, MCT qiymətləndirmə metodumuz PB-PCXI21 istifadə edərək görünən MCT markerləri kimi alüminium oksidi və ya yüksək refraktiv indeksli şüşədən ibarət 10-35 µm diametrli hissəciklərdən istifadə edir. Hər iki üsul MP ​​də daxil olmaqla bir sıra hissəcik növlərinin vizuallaşdırılması üçün uyğundur.
Yüksək məkan və zaman qətnaməsinə görə, PB-PCXI əsaslı ASL və MCT analiz üsullarımız MP geninin çatdırılma üsullarını anlamağımıza və optimallaşdırmağımıza kömək etmək üçün tək və toplu hissəcik davranışının dinamikasını və nümunələrini in vivo araşdırmaq üçün çox uyğundur. Burada istifadə etdiyimiz yanaşma, gen daşıyıcısı dozası ilə heyvan tədqiqatlarımızda müşahidə edilən qeyri-bərabər gen ifadə nümunələrimizi izah etməyə kömək etmək üçün siçanların burun və ağciyər hava yollarına saxta vektor dozasının çatdırılmasından sonra maye hərəkətini vizuallaşdırdığımız SPring-8 BL20B2 şüa xətti istifadə edərək apardığımız tədqiqatlardan irəli gəlir 3,4.
Bu tədqiqatın məqsədi canlı siçovulların traxeyasında bir sıra MP-lərin in vivo hərəkətlərini vizuallaşdırmaq üçün sinxrotron PB-PCXI-dən istifadə etmək idi. Bu PB-PCXI görüntüləmə tədqiqatları, MP hərəkətinə təsirini müəyyən etmək üçün bir sıra MP-ləri, maqnit sahəsinin gücünü və yerlərini sınaqdan keçirmək üçün hazırlanmışdır. Xarici tətbiq olunan maqnit sahəsinin çatdırılan MP-nin hədəf bölgəsində qalmasına və ya hərəkət etməsinə kömək edəcəyi fərziyyəsini irəli sürdük. Bu tədqiqatlar həmçinin çöküntüdən sonra traxeyada saxlanılan hissəciklərin sayını maksimum dərəcədə artıran maqnit konfiqurasiyalarını müəyyən etməyə imkan verdi. İkinci bir tədqiqat seriyasında, hava yollarının hədəflənməsi kontekstində LV-MP-lərin çatdırılmasının LV transduksiya səmərəliliyinin artmasına səbəb olacağı fərziyyəsinə əsaslanaraq, bu optimal konfiqurasiyadan istifadə edərək LV-MP-lərin siçovul hava yoluna in vivo çatdırılmasından yaranan transduksiya nümunəsini nümayiş etdirməyə çalışdıq.
Bütün heyvan tədqiqatları Adelaida Universiteti (M-2019-060 və M-2020-022) və SPring-8 Sinxrotron Heyvan Etikası Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmiş protokollara uyğun olaraq aparılmışdır. Təcrübələr ARRIVE təlimatlarına uyğun olaraq aparılmışdır.
Bütün rentgen görüntüləmələri Yaponiyadakı SPring-8 sinxrotronundakı BL20XU şüa xəttində əvvəllər təsvir edilənə bənzər bir qurğu istifadə edilərək aparılmışdır21,22. Qısaca desək, eksperimental qutu sinxrotron saxlama halqasından 245 m məsafədə yerləşirdi. Faza kontrast effektləri yaratmaq üçün hissəcik görüntüləmə tədqiqatları üçün nümunədən detektora 0,6 m, in vivo görüntüləmə tədqiqatları üçün isə 0,3 m məsafə istifadə olunur. 25 keV monoxromatik şüa enerjisi istifadə edilmişdir. Şəkillər sCMOS detektoruna qoşulmuş yüksək qətnaməli rentgen çeviricisi (SPring-8 BM3) istifadə edilərək çəkilmişdir. Çevirici rentgen şüalarını 10 µm qalınlığında sintillyator (Gd3Al2Ga3O12) istifadə edərək görünən işığa çevirir, sonra isə × 10 mikroskop obyektivindən (NA 0.3) istifadə edərək sCMOS sensoruna yönəldilir. sCMOS detektoru, massiv ölçüsündə Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Yaponiya) idi. 2048 × 2048 piksel və xam piksel ölçüsü 6.5 × 6.5 µm. Bu quraşdırma 0.51 µm effektiv izotrop piksel ölçüsü və təxminən 1.1 mm × 1.1 mm görünüş sahəsi verir. Nəfəs alma ilə əlaqəli hərəkət artefaktlarını minimuma endirərkən hava yolunun içərisində və xaricində maqnit hissəciklərinin siqnal-səs-küy nisbətini maksimum dərəcədə artırmaq üçün 100 ms ekspozisiya uzunluğu seçildi. In vivo tədqiqatlar üçün, ekspozisiyalar arasında rentgen şüasını bloklamaqla radiasiya dozasını məhdudlaşdırmaq üçün rentgen yoluna sürətli rentgen çekici yerləşdirildi.
BL20XU görüntüləmə kamerası Biotəhlükəsizlik Səviyyəsi 2 sertifikatına malik olmadığı üçün LV daşıyıcısı heç bir SPring-8 PB-PCXI görüntüləmə tədqiqatında istifadə edilməmişdir. Bunun əvəzinə, əvvəlcə maqnit sahələrinin şüşə kapilyarlarında, sonra isə canlı hava yollarında MP hərəkətinə necə təsir etdiyini anlamaq üçün iki kommersiya təchizatçısından müxtəlif ölçüləri, materialları, dəmir konsentrasiyalarını və tətbiqləri əhatə edən bir sıra yaxşı xarakterizə olunmuş MP-lər seçdik. səthdə. MP-lərin ölçüləri 0,25 ilə 18 μm arasında dəyişir və müxtəlif materiallardan hazırlanır (Cədvəl 1-ə baxın), lakin MP-dəki maqnit hissəciklərinin ölçüsü də daxil olmaqla hər bir nümunənin tərkibi məlum deyil. Geniş MCT tədqiqatlarımıza 19, 20, 21, 23, 24 əsasən, məsələn, MP hərəkətinin daha yaxşı görünməsini görmək üçün ardıcıl kadrları çıxarmaqla 5 μm qədər kiçik MP-lərin traxeya hava yolu səthində görünə biləcəyini gözləyirik. Tək 0,25 μm ölçülü MP görüntüləmə cihazının qətnaməsindən daha kiçikdir, lakin PB-PCXI-nin onların həcm kontrastını və çöküntüdən sonra çökdüyü səth mayesinin hərəkətini aşkar etməsi gözlənilir.
Cədvəl 1-dəki hər bir MP üçün nümunələr daxili diametri 0,63 mm olan 20 μl şüşə kapilyarlarda (Drummond Microcaps, PA, ABŞ) hazırlanmışdır. Korpuskulyar hissəciklər suda, CombiMag hissəcikləri isə istehsalçının xüsusi mayesində mövcuddur. Hər bir boru maye ilə yarıya qədər doldurulur (təxminən 11 μl) və nümunə tutucusuna yerləşdirilir (Şəkil 1-ə baxın). Şüşə kapilyarlar müvafiq olaraq görüntü qutusundakı nümunə mərhələsinə üfüqi şəkildə yerləşdirilib və mayenin kənarları yerləşdirilib. Qalıq maqnitləşməsi 1,17 Tesla olan 19 mm diametrli (28 mm uzunluğunda) nikel qabıqlı nadir torpaq neodimium dəmir bor (NdFeB) maqniti (N35, kataloq nömrəsi LM1652, Jaycar Electronics, Avstraliya) görüntüləmə zamanı mövqeyini uzaqdan dəyişdirmək üçün ayrıca tərcümə mərhələsinə birləşdirilib. Rentgen görüntüsünün alınması maqnit nümunədən təxminən 30 mm yuxarıda yerləşdirildikdə başlayır və görüntülər saniyədə 4 kadr sürətlə əldə edilir. Görüntüləmə zamanı maqnit yaxınlaşdırılıb şüşə kapilyar boru (təxminən 1 mm məsafədə) və sonra sahə gücünün və mövqeyinin təsirlərini qiymətləndirmək üçün boru boyunca köçürülmüşdür.
Nümunə xy tərcümə mərhələsində şüşə kapilyarlarında MP nümunələri olan in vitro görüntüləmə qurğusu. Rentgen şüasının yolu qırmızı kəsikli xətt ilə işarələnmişdir.
MP-lərin in vitro görünürlüyü müəyyən edildikdən sonra, onların bir alt qrupu vəhşi tipli dişi albinos Wistar siçovullarında (~12 həftəlik, ~200 q) in vivo sınaqdan keçirildi. 0,24 mq/kq medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Yaponiya), 3,2 mq/kq midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Yaponiya) və 4 mq/kq butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika) siçovulları qarın içi inyeksiya yolu ilə Pharma), Yaponiya) qarışığı ilə anesteziya edildi. Anesteziyadan sonra, traxeyanın ətrafındakı tükləri çıxarmaqla, endotraxeal boru (ET; 16 Ga iv kanül, Terumo BCT) daxil etməklə və bədən temperaturunu 22 saxlamaq üçün termal torba olan xüsusi hazırlanmış görüntüləmə lövhəsində arxası üstə immobilizasiya etməklə görüntüləmə üçün hazırlandılar. Daha sonra görüntüləmə lövhəsi, traxeyanı rentgen görüntüsündə üfüqi şəkildə hizalamaq üçün görüntüləmə qutusundakı nümunə tərcümə mərhələsinə kiçik bir bucaq altında birləşdirildi. Şəkil 2a-da göstərildiyi kimi.
(a) SPring-8 görüntüləmə qutusundakı in vivo görüntüləmə qurğusunda rentgen şüasının yolu qırmızı kəsikli xətt ilə işarələnmişdir.(b,c) Traxeyada maqnit lokalizasiyası iki ortoqonal quraşdırılmış IP kameradan istifadə etməklə uzaqdan həyata keçirilmişdir. Ekran görüntüsünün sol tərəfində başlığı tutan məftil ilgəyi və ET borusunun içərisində çatdırılma kanülü görünür.
100 μl şüşə şpris istifadə edərək məsafədən idarə olunan şpris nasos sistemi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 30 Ga iynə vasitəsilə PE10 boruya (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) qoşuldu. ET borusunu daxil edərkən ucunun traxeyada düzgün vəziyyətdə olduğundan əmin olmaq üçün borunu işarələyin. Mikropompadan istifadə edərək, borunun ucu çatdırılacaq MP nümunəsinə batırılarkən şpris porşeni çıxarıldı. Yüklənmiş çatdırılma borusu daha sonra endotraxeal boruya daxil edildi və uc gözlənilən tətbiq olunan maqnit sahəsinin ən güclü hissəsinə yerləşdirildi. Təsvir əldə edilməsi Arduino əsaslı zamanlama qutumuza qoşulmuş tənəffüs detektoru istifadə edilərək idarə edildi və bütün siqnallar (məsələn, temperatur, tənəffüs, qapağın açılması/bağlanması və təsvir əldə edilməsi) Powerlab və LabChart (AD Instruments, Sidney, Avstraliya) 22 istifadə edilərək qeyd edildi. Təsvir zamanı Korpus əlçatmaz olduqda, iki IP kamera (Panasonic BB-SC382) bir-birinə təxminən 90° bucaq altında yerləşdirildi və istifadə edildi. görüntüləmə zamanı maqnitin traxeyaya nisbətən mövqeyini izləmək üçün (Şəkil 2b, c). Hərəkət artefaktlarını minimuma endirmək üçün, qabarma-çəkilmə axın platosu zamanı hər nəfəsdə bir görüntü əldə edildi.
Görüntüləmə korpusunun xaricindən uzaqdan yerləşdirilə bilən ikinci mərhələyə maqnit bərkidilir. Müxtəlif maqnit mövqeləri və konfiqurasiyaları sınaqdan keçirilmişdir, o cümlədən: Traxeyadan təxminən 30° yuxarıda quraşdırılmış (konfiqurasiyalar Şəkil 2a və 3a-da göstərilmişdir); biri heyvanın üzərində, digəri isə aşağıda, dirəkləri cəlb etmək üçün təyin edilmiş (Şəkil 3b); biri heyvanın üzərində, digəri isə aşağıda, dirəkləri dəf etmək üçün təyin edilmiş (Şəkil 3c); və bir maqnit traxeyanın üstündə və ona perpendikulyar (Şəkil 3d). Heyvan və maqnit konfiqurasiya edildikdən və sınaqdan keçiriləcək MP şpris nasosuna yükləndikdən sonra, görüntülər əldə edərkən 4 μl/san sürətlə 50 μl doza verin. Daha sonra maqnit görüntülər əldə etməyə davam edərkən traxeya boyunca və ya yan tərəfə irəli və irəli hərəkət etdirilir.
İn vivo görüntüləmə üçün maqnit konfiqurasiyası (a) traxeyanın üzərində təxminən 30° bucaq altında tək bir maqnit, (b) cəlb etmək üçün təyin edilmiş iki maqnit, (c) dəf etmək üçün təyin edilmiş iki maqnit, (d) traxeyanın üzərində və perpendikulyar olan tək bir maqnit. Müşahidəçi ağızdan traxeya vasitəsilə ağciyərlərə baxdı və rentgen şüası siçovulun sol tərəfindən keçib sağ tərəfindən çıxdı. Maqnit ya tənəffüs yolunun uzunluğu boyunca, ya da rentgen şüası istiqamətində traxeyanın üzərində sola və sağa hərəkət edir.
Həmçinin, tənəffüs və ürək hərəkətinin qarışıqlığı olmadığı təqdirdə tənəffüs yollarında hissəciklərin görünürlüyünü və davranışını müəyyən etməyə çalışdıq. Buna görə də, görüntüləmə dövrünün sonunda heyvanlar pentobarbitalın həddindən artıq dozası səbəbindən insani şəkildə öldürüldü (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ABŞ; ~65 mq/kq ip). Bəzi heyvanlar görüntüləmə platformasında qaldı və nəfəs alma və ürək döyüntüsü dayandıqdan sonra görüntüləmə prosesi təkrarlandı, tənəffüs yollarının səthində MP görünmədikdə əlavə MP dozası əlavə edildi.
Əldə edilən görüntülər düz və qaranlıq sahələrdə korreksiya edilmiş və daha sonra MATLAB-da yazılmış xüsusi skriptdən (R2020a, The Mathworks) istifadə edərək bir filmə yığılmışdır (saniyədə 20 kadr; tənəffüs tezliyindən asılı olaraq 15-25 × normal sürət).
Bütün sol mədəcik gen vektorunun çatdırılma tədqiqatları Adelaida Universitetinin Laboratoriya Heyvan Tədqiqatları Müəssisəsində aparılmış və SPring-8 təcrübəsinin nəticələrindən istifadə edərək maqnit sahəsinin iştirakı ilə sol mədəcik geninin çatdırılmasının in vivo gen ötürülməsini artıra biləcəyini qiymətləndirmək məqsədi daşıyırdı. MP və maqnit sahəsinin təsirlərini qiymətləndirmək üçün iki qrup heyvan müalicə edildi: bir qrupa maqnit yerləşdirilən sol mədəcik geninin verilməsi, digər qrupa isə maqnitsiz sol mədəcik geninin istifadəsi ilə nəzarət qrupu verildi.
LV gen vektorları əvvəllər təsvir edilmiş 25, 26 metodlarından istifadə etməklə yaradılmışdır. LacZ vektoru, transduksiya olunmuş hüceyrələrdə ağciyər toxumasının ön hissələrində və toxuma bölmələrində görünən mavi reaksiya məhsulu istehsal edən konstitutiv MPSV promotoru (LV-LacZ) tərəfindən idarə olunan nüvə lokal beta-qalaktozidaza genini ifadə edir. Titrləmə, hüceyrə kulturalarında LacZ pozitiv hüceyrələrinin sayını hemositometrlə əl ilə saymaqla və titri TU/ml ilə hesablamaqla həyata keçirilmişdir. Daşıyıcılar -80 °C-də dondurulur, istifadədən əvvəl əridilir və 1:1 nisbətində qarışdırılaraq və çatdırılmadan ən azı 30 dəqiqə əvvəl buz üzərində inkubasiya edilərək CombiMag-a bağlanır.
Normal Sprague Dawley siçovullarına (n = 3/qrup, ~2-3) 0,4 mq/kq medetomidin (Domitor, Ilium, Avstraliya) və 60 mq/kq ketamin (Ilium, Avstraliya) aylıq) ip) inyeksiyası və 16 Ga venadaxili kanül ilə cərrahi olmayan oral kanülasiya qarışığı ilə qarın boşluğuna anesteziya verildi. Traxeya hava yolu toxumasının sol mədəcik transduksiyasını qəbul etməsini təmin etmək üçün, əvvəllər təsvir etdiyimiz mexaniki perturbasiya protokolundan istifadə edərək kondisionerləşdirildi, bu protokolda traxeya hava yolu səthi ox boyunca məftil səbətlə (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ABŞ) 30 saniyə sürtüldü. Daha sonra sol mədəcik-MP-nin traxeyaya yeridilməsi perturbasiyadan təxminən 10 dəqiqə sonra bioloji təhlükəsizlik kabinetində həyata keçirildi.
Bu təcrübədə istifadə edilən maqnit sahəsi, in vivo rentgen görüntüləmə tədqiqatına bənzər şəkildə konfiqurasiya edilmiş, eyni maqnitlər distillə stent kliplərindən istifadə edərək traxeyanın üstündə saxlanılmışdır (Şəkil 4). Əvvəllər təsvir edildiyi kimi, gel ucu olan bir pipet istifadə edərək 50 μl həcmində (2 × 25 μl alikvot) LV-MP traxeyaya (n = 3 heyvan) daxil edilmişdir. Nəzarət qrupu (n = 3 heyvan) maqnit istifadə etmədən eyni LV-MP-ləri almışdır. İnfuziya tamamlandıqdan sonra kanül ET borusundan çıxarılır və heyvan ekstubasiya edilir. Maqnit 10 dəqiqə yerində qalır, sonra çıxarılır. Siçovullara dərialtı meloksikam dozası (1 ml/kq) (Ilium, Avstraliya) verildi və ardınca 1 mq/kq atipamazol hidroxlorid (Antisedan, Zoetis, Avstraliya) ip inyeksiyası ilə anesteziyanın geri qaytarılması həyata keçirildi. Siçovullar anesteziyadan tam sağalana qədər isti saxlanıldı və nəzarət altında saxlanıldı.
Bioloji təhlükəsizlik şkafında LV-MP çatdırılma cihazı. ET borusunun açıq boz rəngli Luer mərkəzinin ağızdan çıxdığı və şəkildə göstərilən pipetin gel ucu ET borusundan traxeyaya istənilən dərinliyə daxil edildiyi görünür.
LV-MP dozası prosedurundan bir həftə sonra heyvanlar 100% CO2 inhalyasiyası ilə insani şəkildə öldürüldü və standart X-gal müalicəmizdən istifadə edərək LacZ ifadəsi qiymətləndirildi. Endotraxeal boru yerləşdirilməsindən yaranan hər hansı mexaniki zədələnmənin və ya mayenin tutulmasının təhlilə daxil edilməməsini təmin etmək üçün üç kaudal ən qığırdaq halqası çıxarıldı. Təhlil üçün iki yarım yaratmaq üçün hər bir traxeya uzununa kəsildi və lüminal səthi görüntüləmək üçün Minutien iynəsi (Fine Science Tools) istifadə edərək silikon kauçuklu bir qaba (Sylgard, Dow Inc) quraşdırıldı. Transduksiya edilmiş hüceyrələrin paylanması və naxışı DigiLite kamerası və TCapture proqram təminatı (Tucsen Photonics, Çin) ilə Nikon mikroskopu (SMZ1500) istifadə edərək frontal fotoqrafiya ilə təsdiqləndi. Şəkillər 20x böyüdücü ilə (traxeyanın tam eni üçün ən yüksək parametr daxil olmaqla) əldə edildi, traxeyanın bütün uzunluğu addım-addım görüntüləndi və hər bir görüntü arasında kifayət qədər üst-üstə düşmə təmin edildi ki, görüntü "tikiş" üçün imkan yaransın. Şəkillərdən Daha sonra hər bir traxeya, planar hərəkət alqoritmindən istifadə edərək Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) istifadə edərək tək bir kompozit görüntüyə yığıldı. Hər bir heyvanın traxeyasının kompozit görüntülərindəki LacZ ifadə sahələri, əvvəllər təsvir edildiyi kimi, 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 və Value < 0.7 parametrlərindən istifadə edərək avtomatlaşdırılmış MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) istifadə edilərək kəmiyyətləndirildi. Toxumanın konturlarını izləməklə, toxuma sahəsini müəyyən etmək və traxeya toxumasının xaricindən hər hansı bir yalan aşkarlamanın qarşısını almaq üçün hər bir kompozit görüntü üçün GIMP v2.10.24-də əl ilə maska ​​yaradıldı. Hər bir heyvanın bütün kompozit görüntülərindən alınan ləkələnmiş sahələr cəmlənərək həmin heyvan üçün ümumi ləkələnmiş sahə yaradıldı. Daha sonra normallaşdırılmış sahə yaratmaq üçün ləkələnmiş sahə ümumi maska ​​sahəsinə bölündü.
Hər bir traxeya parafinə basdırıldı və 5 μm kəsiklər kəsildi. Kəsiklər 5 dəqiqə ərzində neytral sürətli qırmızı ilə əks boya ilə boyandı və şəkillər Nikon Eclipse E400 mikroskopu, DS-Fi3 kamerası və NIS element tutma proqramı (5.20.00 versiyası) istifadə edilərək əldə edildi.
Bütün statistik təhlillər GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) proqramında aparılmışdır. Statistik əhəmiyyət p ≤ 0.05 olaraq təyin edilmişdir. Normallıq Şapiro-Wilk testi ilə təsdiqlənmiş və LacZ boyanmasında fərqlər cütləşdirilməmiş t-testi ilə qiymətləndirilmişdir.
Cədvəl 1-də təsvir edilən altı MP PCXI istifadə edilərək araşdırıldı və görünürlük Cədvəl 2-də təsvir edilmişdir. PCXI altında iki polistirol MP (MP1 və MP2; müvafiq olaraq 18 μm və 0,25 μm) görünmürdü, lakin qalan nümunələr müəyyən edilə bilirdi (nümunələr Şəkil 5-də göstərilib). MP3 və MP4 (müvafiq olaraq 10-15% Fe3O4; 0,25 μm və 0,9 μm) zəif görünür. Test edilmiş ən kiçik hissəciklərin bəzilərini ehtiva etsə də, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) ən çox nəzərə çarpan idi. CombiMag məhsulu MP6-nı aşkar etmək çətindir. Bütün hallarda, maqniti kapilyarla paralel olaraq irəli və geri çevirməklə MP aşkar etmək qabiliyyətimiz əhəmiyyətli dərəcədə artdı. Maqnitlər kapilyardan uzaqlaşdıqda, hissəciklər uzun zəncirlər şəklində uzanırdı, lakin maqnitlər yaxınlaşdıqca və maqnit sahəsinin gücü artdıqca, hissəciklər kapilyarın üst səthinə doğru hərəkət etdikcə hissəcik zəncirləri qısaldı (Əlavə Video S1-ə baxın: MP4), səthin hissəcik sıxlığını artırır. Əksinə, maqnit kapilyardan çıxarıldıqda, sahə gücü azalır və MP-lər kapilyarın yuxarı səthindən uzanan uzun zəncirlərə çevrilir (Əlavə Video S2:MP4-ə baxın). Maqnit hərəkətini dayandırdıqdan sonra, hissəciklər tarazlıq vəziyyətinə çatdıqdan sonra qısa müddət hərəkət etməyə davam edir. MP kapilyarın yuxarı səthinə doğru və uzaqlaşdıqca, maqnit hissəcikləri adətən zibilləri mayedən sürükləyir.
PCXI altında MP-nin görünürlüyü nümunələr arasında əhəmiyyətli dərəcədə dəyişir.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 və (d) MP6. Burada göstərilən bütün şəkillər kapilyarın təxminən 10 mm yuxarısında yerləşən bir maqnitlə çəkilib. Görünən böyük dairələr kapilyarlarda ilişib qalmış hava qabarcıqlarıdır və fazalı kontrast görüntüləmənin qara və ağ kənar xüsusiyyətlərini aydın şəkildə göstərir. Qırmızı qutuda kontrastı artıran böyütmə var. Qeyd edək ki, bütün şəkillərdəki maqnit sxemlərinin diametrləri miqyaslı deyil və göstəriləndən təxminən 100 dəfə böyükdür.
Maqnit kapilyarın yuxarı hissəsi boyunca sola və sağa doğru hərəkət etdikcə, MP siminin bucağı maqnitlə uyğunlaşmaq üçün dəyişir (Şəkil 6-ya baxın) və beləliklə, maqnit sahəsi xətlərini müəyyənləşdirir. MP3-5 üçün, akkord eşik bucağına çatdıqdan sonra hissəciklər kapilyarın yuxarı səthi boyunca sürüklənir. Bu, tez-tez MP-lərin maqnit sahəsinin ən güclü olduğu yerə yaxın daha böyük qruplara bölünməsinə səbəb olur (Əlavə Video S3:MP5-ə baxın). Bu, xüsusilə kapilyar ucuna yaxın görüntüləmə zamanı özünü göstərir ki, bu da MP-lərin maye-hava sərhədində toplanmasına və cəmləşməsinə səbəb olur. MP3-5-dən daha çətin ayırd edilən MP6 hissəcikləri, maqnit kapilyar boyunca hərəkət etdikcə sürüklənmədi, lakin MP simləri dağıldı və hissəcikləri görünüş sahəsində buraxdı (Əlavə Video S4:MP6-ya baxın). Bəzi hallarda, tətbiq olunan maqnit sahəsi maqniti görüntüləmə yerindən böyük bir məsafəyə hərəkət etdirməklə azaldıldıqda, qalan MP-lər simdə qalarkən cazibə qüvvəsi ilə borunun alt səthinə yavaş-yavaş endi (Əlavə Video S5: MP3-ə baxın).
Maqnit kapilyarın üstündən sağa doğru hərəkət etdikcə MP zəncirinin bucağı dəyişir.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 və (d) MP6. Qırmızı qutuda kontrast artırıcı böyütmə var. Qeyd edək ki, əlavə videolar bu statik görüntülərdə görüntülənə bilməyən vacib hissəcik quruluşunu və dinamik məlumatları aşkar etdikləri üçün məlumatvericidir.
Testlərimiz göstərdi ki, maqnitin traxeya boyunca yavaş-yavaş irəli və geri hərəkət etməsi in vivo mürəkkəb hərəkət kontekstində MP-nin vizuallaşdırılmasını asanlaşdırır. Polistirol muncuqları (MP1 və MP2) kapilyarda görünmədiyi üçün in vivo sınaq aparılmadı. Qalan dörd MP-nin hər biri maqnitin uzun oxu traxeyanın üstündə şaquli istiqamətdə təxminən 30° bucaq altında konfiqurasiya edilmiş şəkildə in vivo sınaqdan keçirildi (Şəkil 2b və 3a-ya baxın), çünki bu, MP zəncirlərinin daha uzun olmasına səbəb oldu və maqnit konfiqurasiyasının dayandırılmasından daha təsirli oldu. MP3, MP4 və MP6 heç bir canlı heyvanın traxeyasında aşkar edilmədi. Heyvanlar insani şəkildə öldürüldükdən sonra siçovulların hava yolları görüntüləndikdə, hissəciklər şpris nasosu istifadə edərək əlavə həcm əlavə edildikdə belə görünməz qaldı. MP5 ən yüksək dəmir oksid tərkibinə malik idi və yeganə görünən hissəcik idi və buna görə də MP-nin in vivo davranışını qiymətləndirmək və xarakterizə etmək üçün istifadə olunurdu.
MP çatdırılması zamanı maqnitin traxeyanın üzərinə qoyulması MP-lərin hamısının deyil, bir çoxunun görmə sahəsində cəmləşməsinə səbəb oldu. Traxeyaya daxil olan hissəciklər insanpərvər şəkildə qurban verilən heyvanlarda ən yaxşı şəkildə müşahidə olunur. Şəkil 7 və Əlavə Video S6: MP5, ventral traxeyanın səthində hissəciklərin sürətli maqnit tutulmasını və düzülüşünü göstərir ki, bu da MP-lərin traxeyanın istənilən bölgələrinə yönəldilə biləcəyini göstərir. MP çatdırılmasından sonra traxeya boyunca daha distal axtarış aparıldıqda, bəzi MP-lər karinaya daha yaxın tapıldı ki, bu da maye prosesi zamanı maksimum maqnit sahəsinin gücü bölgəsindən keçdiyi üçün maqnit sahəsinin gücünün bütün MP-ləri toplamaq və saxlamaq üçün kifayət etmədiyini göstərir. Buna baxmayaraq, doğuşdan sonrakı MP konsentrasiyaları görüntülənən sahə ətrafında daha yüksək idi, bu da bir çox MP-nin tətbiq olunan maqnit sahəsinin gücünün ən yüksək olduğu hava yolu bölgələrində qaldığını göstərir.
Bu yaxınlarda evtanaziya edilmiş siçovulun traxeyasına MP5-in çatdırılmasından əvvəl və (b) sonra çəkilmiş şəkillər, maqnit görüntüləmə sahəsinin birbaşa üstündə yerləşdirilib. Görüntülənən sahə iki qığırdaq halqası arasında yerləşir. MP çatdırılmadan əvvəl hava yolunda bir az maye var. Qırmızı qutuda kontrast artıran böyütmə var. Bu şəkillər Əlavə Video S6:MP5-də göstərilən videodan götürülmüşdür.
Maqnitin in vivo traxeya boyunca köçürülməsi MP zəncirinin hava yolu səthindəki bucağı kapilyarlarda göründüyü kimi dəyişməsinə səbəb oldu (Şəkil 8 və Əlavə Video S7:MP5-ə baxın). Lakin, tədqiqatımızda MP-lər kapilyarlarda olduğu kimi canlı hava yolunun səthi boyunca sürüklənə bilmədi. Bəzi hallarda, maqnit sola və sağa hərəkət etdikcə MP zənciri uzanacaq. Maraqlıdır ki, biz həmçinin aşkar etdik ki, maqnit traxeya boyunca uzununa hərəkət etdikdə hissəciklər zənciri səth mayesi təbəqəsinin dərinliyini dəyişdirir və maqnit birbaşa yuxarıya doğru hərəkət etdikdə və hissəciklər zənciri şaquli vəziyyətə gətirildikdə genişlənir (Əlavə Video S7-yə baxın). : MP5 0:09-da, aşağı sağda). Maqnit traxeyanın yuxarı hissəsi boyunca yan tərəfə (yəni, traxeyanın uzunluğu boyunca deyil, heyvanın soluna və ya sağına) doğru hərəkət etdikdə xarakterik hərəkət modeli dəyişdi. Hissəciklər hərəkət etdikcə hələ də aydın görünürdü, lakin maqnit traxeyadan çıxarıldıqda, hissəcik zəncirlərinin ucları görünməyə başladı (Əlavə Video S8:MP5-ə baxın, 0:08-dən başlayır). Bu, şüşə kapilyarda tətbiq olunan maqnit sahəsi altında müşahidə etdiyimiz MP davranışı ilə uyğundur.
Canlı anesteziya edilmiş siçovulun traxeyasında MP5-i göstərən nümunə şəkillər.(a) Maqnit traxeyanın yuxarısında və solunda, sonra isə (b) maqnit sağa köçürüldükdən sonra şəkillər əldə etmək üçün istifadə olunur. Qırmızı qutuda kontrast artırıcı böyütmə var. Bu şəkillər Əlavə Video S7:MP5-də göstərilən videodan götürülmüşdür.
İki qütb traxeyanın üstündə və altında şimal-cənub istiqamətində konfiqurasiya edildikdə (yəni cəlbedici; Şəkil 3b), MP akkordları daha uzun görünürdü və dorsal traxeya səthində deyil, traxeyanın yan divarında yerləşirdi (Əlavə Video S9:MP5-ə baxın). Lakin, maye çatdırıldıqdan sonra ikili maqnit cihazı istifadə edildikdə, adətən tək maqnit cihazı istifadə edildikdə baş verən tək bir yerdə (yəni traxeyanın dorsal səthində) yüksək konsentrasiyalı hissəciklər aşkar edilmədi. Daha sonra bir maqnit qütbləri geri itələmək üçün konfiqurasiya edildikdə (Şəkil 3c), çatdırılmadan sonra görünüş sahəsində görünən hissəciklərin sayı artmadı. Hər iki ikili maqnit konfiqurasiyasının qurulması, müvafiq olaraq maqnitləri çəkən və ya itələyən yüksək maqnit sahəsi gücünə görə çətinləşir. Daha sonra quraşdırma hava yoluna paralel, lakin hava yolundan 90 dərəcədə keçən tək bir maqnitə dəyişdirildi ki, sahə xətləri traxeya divarını ortoqonal olaraq kəssin (Şəkil 3d), yan divardakı hissəciklərin aqreqasiyasının müşahidə oluna biləcəyini müəyyən etmək üçün hazırlanmış bir istiqamət. Lakin, bu konfiqurasiyada MP yığılmasının və ya maqnit hərəkətinin müəyyən edilə bilən hərəkəti yox idi. Bütün bu nəticələrə əsasən, in vivo gen daşıyıcısı tədqiqatları üçün tək maqnitli, 30 dərəcəlik oriyentasiya konfiqurasiyası (Şəkil 3a) seçildi.
Heyvan insani şəkildə öldürüldükdən dərhal sonra dəfələrlə təsvir edildikdə, qarışıq toxuma hərəkətinin olmaması, maqnitin translyasiya hərəkəti ilə uyğun olaraq "sallanan" aydın interkondral sahədə daha incə və qısa hissəcik xətlərinin fərqlənə biləcəyi demək idi. Buna baxmayaraq, hələ də MP6 hissəciklərinin varlığını və hərəkətini aydın şəkildə görə bilmir.
LV-LacZ titri 1,8 × 108 TU/ml idi və CombiMag MP (MP6) ilə 1:1 qarışdırıldıqdan sonra heyvanlara 50 μl traxeya dozasında 9 × 107 TU/ml LV vasitə (yəni 4,5 × 106 TU/siçovul) verildi. Bu tədqiqatlarda, doğuş zamanı maqniti tərcümə etmək əvəzinə, sol mədəciyin transduksiyasının (a) maqnit sahəsi olmadığı təqdirdə vektor çatdırılması ilə müqayisədə yaxşılaşdırıla biləcəyini və (b) fokuslana biləcəyini müəyyən etmək üçün maqniti bir vəziyyətdə sabitlədik. Hava yolu hüceyrələri yuxarı tənəffüs yollarının maqnit hədəf bölgələrinə ötürülür.
Maqnitlərin mövcudluğu və CombiMag-ın sol mədəcik vektorları ilə birlikdə istifadəsi, standart sol mədəcik vektor çatdırılma protokolumuz kimi, heyvan sağlamlığına mənfi təsir göstərməmişdir. Mexaniki pozulmaya məruz qalan traxeya bölgəsinin frontal görüntüləri (Əlavə Şəkil 1) göstərir ki, maqnit mövcud olduqda sol mədəcik-MP ilə müalicə olunan heyvanlar qrupunda transduksiya səviyyəsi xeyli yüksəkdir (Şəkil 9a). Nəzarət qrupunda yalnız az miqdarda mavi LacZ boyanması mövcud idi (Şəkil 9b). Normallaşdırılmış X-Gal boyanmış sahələrin kəmiyyətləndirilməsi göstərdi ki, maqnit sahəsinin iştirakı ilə sol mədəcik-MP-nin tətbiqi təxminən 6 qat yaxşılaşmaya səbəb olmuşdur (Şəkil 9c).
LV-MP tərəfindən traxeya transduksiyasını göstərən nümunəvi kompozit şəkillər (a) maqnit sahəsinin iştirakı ilə və (b) maqnit olmadığı halda.(c) Maqnit istifadə edildikdə traxeya daxilində normallaşdırılmış LacZ transduksiya sahəsində statistik cəhətdən əhəmiyyətli yaxşılaşma (*p = 0.029, t-testi, qrup başına n = 3, orta ± SEM).
Neytral sürətli qırmızı ləkələnmiş kəsiklər (nümunə Əlavə Şəkil 2-də göstərilmişdir) əvvəllər bildirildiyi kimi oxşar şəkildə və yerdə LacZ ilə boyanmış hüceyrələri göstərdi.
Hava yolu gen terapiyası üçün əsas çətinlik daşıyıcı hissəciklərin maraq bölgələrinə dəqiq lokalizasiyası və hava axını və aktiv selik təmizlənməsinin olması halında hərəkət edən ağciyərdə yüksək səviyyəli transduksiya səmərəliliyinə nail olmaqdır. KF hava yolu xəstəliyini müalicə etmək üçün hazırlanmış sol mədəcik daşıyıcıları üçün daşıyıcı hissəciklərin keçirici hava yollarında qalma müddətini artırmaq indiyə qədər çətin bir məqsəd olub. Castellani və digərlərinin qeyd etdiyi kimi, transduksiyanı yaxşılaşdırmaq üçün maqnit sahələrinin istifadəsi elektroporasiya kimi digər gen çatdırılma metodları ilə müqayisədə üstünlüklərə malikdir, çünki bu, sadəliyi, səmərəliliyi, çatdırılma lokalizasiyasını, artan səmərəliliyi və daha qısa inkubasiya müddətlərini və ehtimal ki, daha kiçik daşıyıcı dozasını birləşdirə bilər10. Lakin, xarici maqnit qüvvələrinin təsiri altında hava yollarında maqnit hissəciklərinin in vivo çökməsi və davranışı heç vaxt təsvir edilməmiş və bu metodun bütöv canlı hava yollarında gen ifadə səviyyələrini artırmaq üçün in vivo mümkünlüyü də nümayiş etdirilməmişdir.
İn vitro sinxrotron PCXI təcrübələrimiz göstərdi ki, polistirol MP istisna olmaqla, sınaqdan keçirdiyimiz bütün hissəciklər istifadə etdiyimiz görüntüləmə qurğusunda görünürdü. Maqnit sahəsinin mövcudluğunda MP-lər uzunluqları hissəcik növü və maqnit sahəsinin gücü (yəni maqnitin yaxınlığı və hərəkəti) ilə əlaqəli olan zəncirlər əmələ gətirir. Şəkil 10-da göstərildiyi kimi, müşahidə etdiyimiz zəncirlər hər bir fərdi hissəciyin maqnitləşməsi və öz lokal maqnit sahəsini induksiya etməsi səbəbindən əmələ gəlir. Bu ayrı sahələr digər oxşar hissəciklərin aqreqasiya olunmasına və birləşməsinə səbəb olur və digər hissəciklərin lokal cəlbedici və itələyici qüvvələrindən yaranan lokal qüvvələr səbəbindən qrup zəncirinə bənzər hərəkətlər baş verir.
(a,b) maye ilə dolu kapilyarların və (c,d) hava ilə dolu traxeyanın içərisində əmələ gələn hissəcik qatarlarını göstərən sxem. Qeyd edək ki, kapilyarlar və traxeya miqyasda çəkilməyib. (a) panelində həmçinin zəncirvari düzülmüş Fe3O4 hissəciklərini ehtiva edən MP-nin təsviri də var.
Maqnit kapilyarın üstündən keçirildikdə, hissəcik zəncirinin bucağı Fe3O4 ehtiva edən MP3-5 üçün kritik həddə çatdı, bundan sonra hissəcik zəncirinin artıq orijinal vəziyyətində qalmadı, əksinə səth boyunca yeni bir mövqeyə keçdi. maqnit. Bu effektin baş verməsi ehtimalı, şüşə kapilyar səthinin bu hərəkətin baş verməsinə imkan verəcək qədər hamar olması ilə bağlıdır. Maraqlıdır ki, MP6 (CombiMag) bu şəkildə davranmadı, çünki hissəciklər daha kiçik idi, fərqli örtüklərə və ya səth yüklərinə malik idi və ya xüsusi daşıyıcı maye onların hərəkət qabiliyyətinə təsir etmişdi. CombiMag hissəciklərinin görüntü kontrastı da daha zəifdir, bu da mayenin və hissəciklərin oxşar sıxlığa malik ola biləcəyini və buna görə də bir-birinə asanlıqla doğru hərəkət edə bilməyəcəyini göstərir. Maqnit çox sürətli hərəkət edərsə, hissəciklər də ilişib qala bilər ki, bu da maqnit sahəsinin gücünün mayedəki hissəciklər arasındakı sürtünməni həmişə aradan qaldıra bilməyəcəyini göstərir və bu, bəlkə də təəccüblü olmadığını göstərir. Maqnit sahəsinin gücünün və maqnitlə hədəf sahəsi arasındakı məsafənin çox vacib olması. Ümumilikdə, bu nəticələr həmçinin göstərir ki, maqnitlər hədəf sahəsindən axan bir çox MP-ni tuta bilsə də, maqnitlərə etibar etmək mümkün deyil. CombiMag hissəciklərini traxeyanın səthi boyunca hərəkət etdirin. Buna görə də, in vivo LV-MP tədqiqatlarının hava yolu ağacının müəyyən bölgələrini fiziki olaraq hədəf almaq üçün statik maqnit sahələrindən istifadə etməli olduğu qənaətinə gəlirik.
Bədənə daxil olan hissəciklər mürəkkəb hərəkət edən bədən toxuması kontekstində onları müəyyən etmək çətindir, lakin onları aşkar etmək qabiliyyəti maqnitin traxeyanın üstünə üfüqi şəkildə köçürülməsi və MP tellərini "tərpətməsi" ilə artırılmışdır. Canlı görüntüləmə mümkün olsa da, heyvan insani şəkildə öldürüldükdən sonra hissəciklərin hərəkətini ayırd etmək daha asandır. Maqnit görüntüləmə sahəsinin üstündə yerləşdirildikdə MP konsentrasiyaları ümumiyyətlə bu yerdə ən yüksək idi, baxmayaraq ki, bəzi hissəciklər adətən traxeya boyunca daha uzaqda tapılırdı. In vitro tədqiqatlardan fərqli olaraq, maqniti tərcümə etməklə hissəciklər traxeya boyunca sürüklənə bilməz. Bu tapıntı traxeyanın səthini örtən seliyin adətən inhalyasiya olunan hissəcikləri necə emal etməsi, onları selikdə tutması və sonradan mukosiliar təmizlənmə mexanizmi ilə necə təmizlənməsi ilə uyğun gəlir.
Biz fərziyyə irəli sürdük ki, traxeyanın üstündə və altında cazibə üçün maqnitlərdən istifadə (Şəkil 3b) bir nöqtədə yüksək dərəcədə cəmlənmiş maqnit sahəsi əvəzinə daha vahid maqnit sahəsinə səbəb ola bilər və bu da hissəciklərin daha vahid paylanmasına səbəb ola bilər. Lakin, ilkin tədqiqatımız bu fərziyyəni dəstəkləyəcək aydın dəlil tapmadı. Eynilə, bir cüt maqnitin dəf edilməsi üçün konfiqurasiyası (Şəkil 3c) görüntülənən ərazidə daha çox hissəcik çöküntüsünə səbəb olmadı. Bu iki tapıntı göstərir ki, ikili maqnit quruluşu MP hədəflənməsinin lokal nəzarətini əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırmır və nəticədə yaranan güclü maqnit qüvvələrinin konfiqurasiyası çətindir, bu da bu yanaşmanı daha az praktik edir. Eynilə, maqnitin traxeyanın üstündə və üzərindən yönəldilməsi (Şəkil 3d) də görüntülənən ərazidə saxlanılan hissəciklərin sayını artırmadı. Bu alternativ konfiqurasiyaların bəziləri uğurlu olmaya bilər, çünki çökmə ərazisində daha aşağı maqnit sahəsi güclərinə səbəb olur. Buna görə də, tək 30 dərəcəlik bucaqlı maqnit konfiqurasiyası (Şəkil 3a) in vivo sınaq üçün ən asan və ən səmərəli metod hesab olunur.
LV-MP tədqiqatı göstərdi ki, LV vektorları CombiMag ilə birləşdirildikdə və maqnit sahəsinin iştirakı ilə fiziki pozulmadan sonra çatdırıldıqda, traxeyada transduksiya səviyyələri nəzarət qrupu ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır. Sinxrotron görüntüləmə tədqiqatlarına və LacZ nəticələrinə əsasən, maqnit sahəsi traxeya daxilində LV-ni qoruyub saxlaya və dərhal ağciyərin dərinliyinə nüfuz edən vektor hissəciklərinin sayını azalda bilmişdir. Bu cür hədəfləmə təkmilləşdirmələri çatdırılan titrləri, hədəfdən kənar transduksiyanı, iltihabi və immun yan təsirləri və gen daşıyıcısı xərclərini azaltmaqla yanaşı daha yüksək effektivliyə səbəb ola bilər. İstehsalçıya görə, CombiMag digər virus vektorları (məsələn, AAV) və nuklein turşuları da daxil olmaqla digər gen ötürmə üsulları ilə birlikdə istifadə edilə bilər.