Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη για CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Οι φορείς γονιδίων για τη θεραπεία της πνευμονικής νόσου κυστικής ίνωσης θα πρέπει να στοχεύουν τους αεραγωγούς αγωγούς, επειδή η περιφερική μεταγωγή των πνευμόνων δεν παρέχει θεραπευτικό όφελος. Η αποτελεσματικότητα της μεταγωγής του ιού σχετίζεται άμεσα με τον χρόνο παραμονής του φορέα. Ωστόσο, τα υγρά χορήγησης, όπως οι φορείς γονιδίων, διαχέονται φυσικά στις κυψελίδες κατά την εισπνοή και τα θεραπευτικά σωματίδια οποιασδήποτε μορφής απομακρύνονται ταχέως μέσω της βλεννοκροσσωτής μεταφοράς. Η παράταση του χρόνου παραμονής των φορέων γονιδίων στους αεραγωγούς είναι σημαντική αλλά δύσκολο να επιτευχθεί. Τα μαγνητικά σωματίδια συζευγμένα με φορείς γονιδίων που μπορούν να κατευθυνθούν στην επιφάνεια των αεραγωγών μπορούν να βελτιώσουν την περιφερειακή στόχευση. Λόγω των προκλήσεων της οπτικοποίησης in vivo, η συμπεριφορά τέτοιων μικρών μαγνητικών σωματιδίων στην επιφάνεια των αεραγωγών παρουσία ενός εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου δεν είναι επαρκώς κατανοητή. Στόχος αυτής της μελέτης ήταν η χρήση απεικόνισης σύγχροτρον για την οπτικοποίηση της κίνησης in vivo μιας σειράς μαγνητικών σωματιδίων στην τραχεία αναισθητοποιημένων αρουραίων, για να εξεταστεί η δυναμική και τα πρότυπα της συμπεριφοράς των ατομικών και μαζικών σωματιδίων in vivo. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε επίσης εάν η χορήγηση μαγνητικών σωματιδίων φακοϊού παρουσία μαγνητικού πεδίου θα αύξανε την αποτελεσματικότητα της μεταγωγής στην τραχεία αρουραίου. Η απεικόνιση ακτίνων Χ σύγχροτρον αποκαλύπτει τη συμπεριφορά των μαγνητικών σωματιδίων. σωματίδια σε ακίνητα και κινούμενα μαγνητικά πεδία in vitro και in vivo. Τα σωματίδια δεν μπορούν να συρθούν εύκολα κατά μήκος της επιφάνειας του ζωντανού αεραγωγού με μαγνήτες, αλλά κατά τη μεταφορά, οι εναποθέσεις συγκεντρώνονται στο οπτικό πεδίο όπου το μαγνητικό πεδίο είναι ισχυρότερο. Η αποτελεσματικότητα της μεταγωγής αυξήθηκε επίσης έξι φορές όταν τα μαγνητικά σωματίδια φακοϊού χορηγήθηκαν παρουσία μαγνητικού πεδίου. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα μαγνητικά σωματίδια φακοϊού και τα μαγνητικά πεδία μπορεί να είναι πολύτιμες προσεγγίσεις για τη βελτίωση της στόχευσης γονιδιακών φορέων και την αύξηση των επιπέδων μεταγωγής στους αεραγωγούς in vivo.
Η κυστική ίνωση (ΚΙ) προκαλείται από παραλλαγή σε ένα μόνο γονίδιο που ονομάζεται ρυθμιστής διαμεμβρανικής αγωγιμότητας ΚΙ (CFTR). Η πρωτεΐνη CFTR είναι ένα ιοντικό κανάλι που υπάρχει σε πολλά επιθηλιακά κύτταρα σε όλο το σώμα, συμπεριλαμβανομένων των αεραγωγών αγωγών, μιας σημαντικής θέσης παθογένεσης της ΚΙ. Τα ελαττώματα της CFTR οδηγούν σε ανώμαλη μεταφορά νερού, αφυδατώνοντας την επιφάνεια των αεραγωγών και μειώνοντας το βάθος του στρώματος επιφανειακού υγρού των αεραγωγών (ASL). Αυτό επίσης επηρεάζει αρνητικά την ικανότητα του συστήματος βλεννοκροσσωτής μεταφοράς (MCT) να απομακρύνει τα εισπνεόμενα σωματίδια και τους παθογόνους παράγοντες από τους αεραγωγούς. Στόχος μας είναι να αναπτύξουμε μια γονιδιακή θεραπεία με λεντοϊό (LV) για να παραδώσουμε το σωστό αντίγραφο του γονιδίου CFTR και να βελτιώσουμε την υγεία των ASL, MCT και των πνευμόνων, και να συνεχίσουμε να αναπτύσσουμε νέες τεχνολογίες ικανές να μετρήσουν αυτές τις παραμέτρους in vivo1.
Οι φορείς της αριστερής κοιλίας (LV) είναι ένας από τους κορυφαίους υποψηφίους για γονιδιακή θεραπεία αεραγωγών με κυστική ίνωση (CF), κυρίως επειδή μπορούν να ενσωματώσουν μόνιμα το θεραπευτικό γονίδιο στα βασικά κύτταρα των αεραγωγών (βλαστικά κύτταρα αεραγωγών). Αυτό είναι σημαντικό επειδή μπορούν να αποκαταστήσουν την φυσιολογική ενυδάτωση και την απομάκρυνση της βλέννας διαφοροποιούμενοι σε λειτουργικά, γονιδιακά διορθωμένα, επιφανειακά κύτταρα αεραγωγών που σχετίζονται με την Κυστική ίνωση, με αποτέλεσμα δια βίου οφέλη. Οι φορείς της αριστερής κοιλίας (LV) θα πρέπει να κατευθύνονται έναντι του αγώγιμου αεραγωγού, καθώς εκεί ξεκινά η πνευμονοπάθεια με κυστική ίνωση (CF). Η χορήγηση του φορέα βαθύτερα στον πνεύμονα μπορεί να οδηγήσει σε κυψελιδική μεταγωγή, αλλά αυτό δεν έχει θεραπευτικό όφελος στην Κυστική ίνωση. Ωστόσο, υγρά όπως οι φορείς γονιδίων μεταναστεύουν φυσικά στις κυψελίδες κατά την εισπνοή μετά την χορήγηση3,4 και τα θεραπευτικά σωματίδια απομακρύνονται ταχέως στην στοματική κοιλότητα μέσω της MCT. Η αποτελεσματικότητα της μεταγωγής της αριστερής κοιλίας (LV) σχετίζεται άμεσα με το χρονικό διάστημα που ο φορέας παραμένει δίπλα στα κύτταρα-στόχους για να επιτρέψει την κυτταρική πρόσληψη - τον «χρόνο παραμονής»5 - ο οποίος μειώνεται εύκολα από την τυπική περιφερειακή ροή αέρα, καθώς και από τη συντονισμένη δέσμευση βλέννας από σωματίδια και την MCT. Για την Κυστική ίνωση, η ικανότητα παράτασης του χρόνου παραμονής της αριστερής κοιλίας (LV) εντός του αεραγωγού είναι σημαντική για την επίτευξη υψηλών επιπέδων μεταγωγής σε αυτήν την περιοχή, αλλά μέχρι στιγμής έχει αποδειχθεί... προκλητικός.
Για να ξεπεραστεί αυτό το εμπόδιο, προτείνουμε ότι τα μαγνητικά σωματίδια (MPs) της αριστερής κοιλίας (LV) μπορούν να βοηθήσουν με δύο συμπληρωματικούς τρόπους. Πρώτον, μπορούν να οδηγηθούν μαγνητικά στην επιφάνεια των αεραγωγών για να βελτιωθεί η στόχευση και να βοηθηθούν τα σωματίδια-φορείς γονιδίων να βρίσκονται στην επιθυμητή περιοχή των αεραγωγών και ASL (Asgleichal-Silverband) να μετακινηθούν στην κυτταρική στιβάδα 6. Τα MPs έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως στοχευμένα οχήματα χορήγησης φαρμάκων όταν συνδέονται με αντισώματα, χημειοθεραπευτικά φάρμακα ή άλλα μικρά μόρια που προσκολλώνται σε κυτταρικές μεμβράνες ή συνδέονται με σχετικούς υποδοχείς στην κυτταρική επιφάνεια και συσσωρεύονται σε θέσεις όγκων παρουσία στατικού ηλεκτρισμού. Μαγνητικά Πεδία για τη Θεραπεία του Καρκίνου 7. Άλλες «υπερθερμικές» τεχνικές στοχεύουν στη θέρμανση των μικροσκοπικών πεδίων (MPs) όταν εκτίθενται σε ταλαντούμενα μαγνητικά πεδία, καταστρέφοντας έτσι τα καρκινικά κύτταρα. Η αρχή της μαγνητικής διαμόλυνσης, στην οποία ένα μαγνητικό πεδίο χρησιμοποιείται ως παράγοντας διαμόλυνσης για την ενίσχυση της μεταφοράς DNA στα κύτταρα, χρησιμοποιείται συνήθως in vitro χρησιμοποιώντας μια σειρά μη ιικών και ιικών γονιδιακών φορέων για κυτταρικές σειρές που είναι δύσκολο να μετατραπούν. Η αποτελεσματικότητα της μαγνητομεταμόλυνσης της αριστερής κοιλίας (LV) έχει τεκμηριωθεί, με in vitro χορήγηση LV-MPs σε μια ανθρώπινη βρογχική επιθηλιακή κυτταρική σειρά παρουσία στατικού μαγνητικού πεδίου, αυξάνοντας την αποτελεσματικότητα της διαμόλυνσης κατά 186 φορές σε σύγκριση με τον φορέα LV μόνο. ​​Η LV-MP έχει επίσης εφαρμοστεί σε ένα in vitro μοντέλο CF, όπου η μαγνητική διαμόλυνση αύξησε τη διαμόλυνση της αριστερής κοιλίας σε καλλιέργειες διεπιφάνειας αέρα-υγρού κατά 20 φορές παρουσία πτυέλων CF10. Ωστόσο, η in vivo μαγνητομεταμόλυνση οργάνων έχει λάβει σχετικά μικρή προσοχή και έχει αξιολογηθεί μόνο σε λίγες μελέτες σε ζώα11,12,13,14,15, ειδικά στην πνεύμονες16,17. Παρ' όλα αυτά, οι ευκαιρίες για μαγνητική διαμόλυνση στη θεραπεία πνευμόνων με κυστική ίνωση είναι σαφείς. Οι Tan et al. (2020) δήλωσαν ότι «μια μελέτη απόδειξης της ιδέας για την αποτελεσματική πνευμονική χορήγηση μαγνητικών νανοσωματιδίων θα ανοίξει το δρόμο για μελλοντικές στρατηγικές εισπνοής CFTR για τη βελτίωση των κλινικών αποτελεσμάτων σε ασθενείς με κυστική ίνωση»6.
Η συμπεριφορά μικρών μαγνητικών σωματιδίων στις επιφάνειες των αεραγωγών παρουσία εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου είναι δύσκολο να απεικονιστεί και να μελετηθεί και, ως εκ τούτου, είναι ελάχιστα κατανοητή. Σε άλλες μελέτες, αναπτύξαμε μια μέθοδο απεικόνισης ακτίνων Χ αντίθεσης φάσης (PB-PCXI) βασισμένη σε διάδοση σύγχροτρον για την μη επεμβατική απεικόνιση και ποσοτικοποίηση μικρών in vivo αλλαγών στο βάθος ASL18 και τη συμπεριφορά MCT19,20 για την άμεση μέτρηση της ενυδάτωσης της επιφάνειας του αεραγωγού και τη χρήση της ως πρώιμου δείκτη αποτελεσματικότητας της θεραπείας. Επιπλέον, η μέθοδος αξιολόγησης MCT που χρησιμοποιούμε χρησιμοποιεί σωματίδια διαμέτρου 10-35 µm που αποτελούνται από αλουμίνα ή γυαλί υψηλού δείκτη διάθλασης ως δείκτες MCT ορατούς χρησιμοποιώντας PB-PCXI21. Και οι δύο τεχνικές είναι κατάλληλες για την απεικόνιση μιας σειράς τύπων σωματιδίων, συμπεριλαμβανομένων των MP.
Λόγω της υψηλής χωρικής και χρονικής τους ανάλυσης, οι τεχνικές ανάλυσης ASL και MCT που βασίζονται στο PB-PCXI είναι κατάλληλες για την εξέταση της δυναμικής και των προτύπων της συμπεριφοράς μεμονωμένων και μαζικών σωματιδίων in vivo, για να μας βοηθήσουν να κατανοήσουμε και να βελτιστοποιήσουμε τις τεχνικές χορήγησης γονιδίων MP. Η προσέγγιση που χρησιμοποιούμε εδώ προέρχεται από τις μελέτες μας χρησιμοποιώντας τη δέσμη SPring-8 BL20B2, στην οποία οπτικοποιήσαμε την κίνηση υγρών μετά από χορήγηση ψευδούς δόσης φορέα στις ρινικές και πνευμονικές αεραγωγούς ποντικών, για να εξηγήσουμε τα μη ομοιόμορφα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης που παρατηρήθηκαν στις μελέτες μας σε ζώα με δόση φορέα γονιδίων 3,4.
Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η χρήση του συγχρότρου PB-PCXI για την απεικόνιση των in vivo κινήσεων μιας σειράς μικροσκοπικών μορφοπλαστικών (MPs) στην τραχεία ζωντανών αρουραίων. Αυτές οι μελέτες απεικόνισης PB-PCXI σχεδιάστηκαν για να ελέγξουν μια σειρά από μικροσκοπικά μορφοπλαστικά (MPs), τις εντάσεις του μαγνητικού πεδίου και τις θέσεις τους, ώστε να προσδιοριστεί η επίδρασή τους στην κίνηση των μικροσκοπικών μορφοπλαστικών (MPs). Υποθέσαμε ότι ένα εξωτερικά εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο θα βοηθούσε τα χορηγούμενα μικροσκοπικά μορφοπλαστικά (MPs) να παραμείνουν ή να μετακινηθούν στην περιοχή-στόχο. Αυτές οι μελέτες μας επέτρεψαν επίσης να εντοπίσουμε διαμορφώσεις μαγνητών που μεγιστοποιούν τον αριθμό των σωματιδίων που συγκρατούνται στην τραχεία μετά την εναπόθεση. Σε μια δεύτερη σειρά μελετών, επιδιώξαμε να χρησιμοποιήσουμε αυτήν τη βέλτιστη διαμόρφωση για να δείξουμε το πρότυπο μεταγωγής που προκύπτει από την in vivo χορήγηση μικροσκοπικών μορφοπλαστικών (MPs) της αριστερής κοιλίας (LV) στον αεραγωγό του αρουραίου, με βάση την υπόθεση ότι η χορήγηση μικροσκοπικών μορφοπλαστικών (MPs) της αριστερής κοιλίας (LV) στο πλαίσιο της στόχευσης των αεραγωγών θα είχε ως αποτέλεσμα βελτιωμένη αποτελεσματικότητα μεταγωγής της αριστερής κοιλίας.
Όλες οι μελέτες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρωτόκολλα που έχουν εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο της Αδελαΐδας (M-2019-060 και M-2020-022) και την Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων του Σύγχροτρον SPring-8. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του ARRIVE.
Όλες οι απεικονίσεις ακτίνων Χ πραγματοποιήθηκαν στη γραμμή δέσμης BL20XU στο συγχρότρον SPring-8 στην Ιαπωνία, χρησιμοποιώντας μια διάταξη παρόμοια με αυτήν που περιγράφηκε προηγουμένως21,22. Εν συντομία, το πειραματικό κουτί βρισκόταν 245 m από τον δακτύλιο αποθήκευσης συγχρότρου. Χρησιμοποιείται απόσταση δείγματος-ανιχνευτή 0,6 m για μελέτες απεικόνισης σωματιδίων και 0,3 m για μελέτες απεικόνισης in vivo για τη δημιουργία εφέ αντίθεσης φάσης. Χρησιμοποιήθηκε μονοχρωματική ενέργεια δέσμης 25 keV. Οι εικόνες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας έναν μετατροπέα ακτίνων Χ υψηλής ανάλυσης (SPring-8 BM3) συνδεδεμένο με έναν ανιχνευτή sCMOS. Ο μετατροπέας μετατρέπει τις ακτίνες Χ σε ορατό φως χρησιμοποιώντας έναν σπινθηριστή πάχους 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), ο οποίος στη συνέχεια κατευθύνεται σε έναν αισθητήρα sCMOS χρησιμοποιώντας έναν αντικειμενικό φακό μικροσκοπίου × 10 (NA 0,3). Ο ανιχνευτής sCMOS ήταν ο Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Ιαπωνία) με μέγεθος συστοιχίας 2048 × 2048 pixel και μέγεθος ακατέργαστου pixel 6,5 × 6,5 µm. Αυτή η ρύθμιση αποδίδει ένα αποτελεσματικό ισότροπο μέγεθος pixel 0,51 µm και οπτικό πεδίο περίπου 1,1 mm × 1,1 mm. Επιλέχθηκε μήκος έκθεσης 100 ms για τη μεγιστοποίηση της αναλογίας σήματος προς θόρυβο των μαγνητικών σωματιδίων εντός και εκτός του αεραγωγού, ελαχιστοποιώντας παράλληλα τα αντικείμενα κίνησης που προκαλούνται από την αναπνοή. Για μελέτες in vivo, τοποθετήθηκε ένα γρήγορο κλείστρο ακτίνων Χ στη διαδρομή ακτίνων Χ για να περιοριστεί η δόση ακτινοβολίας μπλοκάροντας τη δέσμη ακτίνων Χ μεταξύ των εκθέσεων.
Ο φορέας LV δεν χρησιμοποιήθηκε σε καμία μελέτη απεικόνισης SPring-8 PB-PCXI, επειδή ο θάλαμος απεικόνισης BL20XU δεν είναι πιστοποιημένος με Επίπεδο Βιοασφάλειας 2. Αντ' αυτού, επιλέξαμε μια σειρά από καλά χαρακτηρισμένους μικροσκοπικούς παράγοντες (MPs) από δύο εμπορικούς προμηθευτές - που καλύπτουν μια σειρά μεγεθών, υλικών, συγκεντρώσεων σιδήρου και εφαρμογών - πρώτα για να κατανοήσουμε πώς τα μαγνητικά πεδία επηρεάζουν την κίνηση των μικροσκοπικών παραγόντων (MPs) μέσα σε γυάλινα τριχοειδή αγγεία και στη συνέχεια σε ζωντανούς αεραγωγούς. στην επιφάνεια. Τα MPs κυμαίνονται σε μέγεθος από 0,25 έως 18 μm και κατασκευάζονται από μια ποικιλία υλικών (βλ. Πίνακα 1), αλλά η σύνθεση κάθε δείγματος, συμπεριλαμβανομένου του μεγέθους των μαγνητικών σωματιδίων μέσα στο MP, είναι άγνωστη. Με βάση τις εκτεταμένες μελέτες MCT 19, 20, 21, 23, 24, αναμένουμε ότι MPs μεγέθους έως και 5 μm μπορούν να παρατηρηθούν στην επιφάνεια των τραχειακών αεραγωγών, για παράδειγμα αφαιρώντας διαδοχικά καρέ για να δούμε βελτιωμένη ορατότητα της κίνησης του MP. Ένα μόνο MP μεγέθους 0,25 μm είναι μικρότερο από την ανάλυση της συσκευής απεικόνισης, αλλά το PB-PCXI αναμένεται να ανιχνεύσει την αντίθεση όγκου τους και την κίνηση του επιφανειακού υγρού στο οποίο εναποτίθενται μετά την εναπόθεση.
Δείγματα για κάθε MP στον Πίνακα 1 παρασκευάστηκαν σε γυάλινα τριχοειδή αγγεία των 20 μl (Drummond Microcaps, PA, ΗΠΑ) με εσωτερική διάμετρο 0,63 mm. Τα σωματίδια σωματιδίων διατίθενται σε νερό, ενώ τα σωματίδια CombiMag διατίθενται στο ιδιόκτητο υγρό του κατασκευαστή. Κάθε σωλήνας είναι γεμάτος κατά το ήμισυ με υγρό (περίπου 11 μl) και τοποθετείται στη θήκη δείγματος (βλ. Σχήμα 1). Τα γυάλινα τριχοειδή τοποθετήθηκαν οριζόντια στη βάση δείγματος στο κουτί απεικόνισης, αντίστοιχα, και τοποθετήθηκαν στις άκρες του υγρού. Ένας μαγνήτης νεοδυμίου σιδήρου-βορίου (NdFeB) με κέλυφος νικελίου διαμέτρου 19 mm (μήκους 28 mm) (N35, αρ. καταλ. LM1652, Jaycar Electronics, Αυστραλία) με υπολειμματική μαγνήτιση 1,17 Tesla προσαρτήθηκε σε ξεχωριστό στάδιο μετάφρασης για να επιτευχθεί αλλαγή της θέσης του από απόσταση κατά την απεικόνιση. Η λήψη εικόνας ακτίνων Χ ξεκινά όταν ο μαγνήτης τοποθετείται περίπου 30 mm πάνω από το δείγμα και οι εικόνες λαμβάνονται με ρυθμό 4 καρέ ανά δευτερόλεπτο. Κατά τη διάρκεια της απεικόνισης, ο μαγνήτης πλησίασε το γυάλινο τριχοειδή σωλήνα (περίπου 1 mm μακριά) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε κατά μήκος του σωλήνα για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις της έντασης και της θέσης του πεδίου.
Διάταξη απεικόνισης in vitro που περιέχει δείγματα MP σε γυάλινα τριχοειδή αγγεία στο στάδιο μετάφρασης xy του δείγματος. Η διαδρομή της δέσμης ακτίνων Χ σημειώνεται με κόκκινη διακεκομμένη γραμμή.
Μόλις διαπιστώθηκε η ορατότητα των MP in vitro, ένα υποσύνολο αυτών δοκιμάστηκε in vivo σε θηλυκούς αλμπίνους αρουραίους Wistar άγριου τύπου (~12 εβδομάδων, ~200 g). 0,24 mg/kg μεδετομιδίνης (Domitor®, Zenoaq, Ιαπωνία), 3,2 mg/kg μιδαζολάμης (Dormicum®, Astellas Pharma, Ιαπωνία) και 4 mg/kg βουτορφανόλης (Vetorphale®, Meiji Seika). Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ένα μείγμα Pharma (Ιαπωνία) με ενδοπεριτοναϊκή ένεση. Μετά την αναισθησία, προετοιμάστηκαν για απεικόνιση αφαιρώντας το τρίχωμα γύρω από την τραχεία, εισάγοντας έναν ενδοτραχειακό σωλήνα (ET, κάνουλα 16 Ga iv, Terumo BCT) και ακινητοποιώντας τους σε ύπτια θέση σε μια ειδικά κατασκευασμένη πλάκα απεικόνισης που περιείχε μια θερμική σακούλα για τη διατήρηση της θερμοκρασίας του σώματος 22. Η πλάκα απεικόνισης στη συνέχεια προσαρτήθηκε στο στάδιο μετάφρασης δείγματος στο κουτί απεικόνισης υπό μικρή γωνία για να ευθυγραμμιστεί η τραχεία οριζόντια στην εικόνα ακτίνων Χ, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2α.
(α) Ρύθμιση απεικόνισης in vivo στο κουτί απεικόνισης SPring-8, η διαδρομή της δέσμης ακτίνων Χ σημειώνεται με μια κόκκινη διακεκομμένη γραμμή. (β,γ) Ο εντοπισμός μαγνήτη στην τραχεία πραγματοποιήθηκε εξ αποστάσεως χρησιμοποιώντας δύο ορθογώνια τοποθετημένες κάμερες IP. Στην αριστερή πλευρά της εικόνας οθόνης, φαίνεται ο βρόχος σύρματος που συγκρατεί την κεφαλή και ο καθετήρας χορήγησης στη θέση του μέσα στον σωλήνα ET.
Ένα τηλεχειριζόμενο σύστημα αντλίας σύριγγας (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) που χρησιμοποιούσε γυάλινη σύριγγα 100 μl συνδέθηκε με σωλήνα PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) μέσω βελόνας 30 Ga. Σημειώστε τον σωλήνα για να βεβαιωθείτε ότι η άκρη βρίσκεται στη σωστή θέση στην τραχεία κατά την εισαγωγή του σωλήνα ET. Χρησιμοποιώντας τη μικροαντλία, το έμβολο της σύριγγας τραβήχτηκε ενώ η άκρη του σωλήνα βυθίστηκε στο δείγμα MP που θα χορηγούνταν. Ο φορτωμένος σωλήνας χορήγησης εισήχθη στη συνέχεια στον ενδοτραχειακό σωλήνα, τοποθετώντας την άκρη μέσα στο ισχυρότερο μέρος του αναμενόμενου εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου. Η λήψη εικόνας ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή αναπνοής συνδεδεμένο με το κιβώτιο χρονισμού που βασίζεται στο Arduino και όλα τα σήματα (π.χ. θερμοκρασία, αναπνοή, άνοιγμα/κλείσιμο κλείστρου και λήψη εικόνας) καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας Powerlab και LabChart (AD Instruments, Σίδνεϊ, Αυστραλία) 22. Κατά την απεικόνιση, όταν το περίβλημα ήταν απρόσιτο, δύο κάμερες IP (Panasonic BB-SC382) τοποθετήθηκαν σε γωνία περίπου 90° μεταξύ τους και χρησιμοποιήθηκαν. για την παρακολούθηση της θέσης του μαγνήτη σε σχέση με την τραχεία κατά την απεικόνιση (Εικ. 2β,γ). Για την ελαχιστοποίηση των σφαλμάτων κίνησης, λήφθηκε μία εικόνα ανά αναπνοή κατά τη διάρκεια του πλατό της τελοπαλιρροιακής ροής.
Ένας μαγνήτης είναι προσαρτημένος σε ένα δεύτερο στάδιο που μπορεί να τοποθετηθεί απομακρυσμένα από το εξωτερικό του περιβλήματος απεικόνισης. Δοκιμάστηκαν διάφορες θέσεις και διαμορφώσεις μαγνητών, όπως: Τοποθετημένοι υπό γωνία περίπου 30° πάνω από την τραχεία (διαμορφώσεις που φαίνονται στα Σχήματα 2α και 3α), ένας μαγνήτης πάνω από το ζώο και ο άλλος κάτω, με τους πόλους ρυθμισμένους να έλκονται (Σχήμα 3β), ένας μαγνήτης πάνω από το ζώο και ο άλλος κάτω, με τους πόλους ρυθμισμένους να απωθούνται (Σχήμα 3γ) και ένας μαγνήτης πάνω και κάθετα στην τραχεία (Σχήμα 3δ). Μόλις διαμορφωθούν το ζώο και ο μαγνήτης και το MP που πρόκειται να δοκιμαστεί φορτωθεί στην αντλία σύριγγας, χορηγήστε μια δόση 50 μl με ρυθμό 4 μl/sec κατά τη λήψη εικόνων. Στη συνέχεια, ο μαγνήτης κινείται εμπρός και πίσω κατά μήκος ή πλευρικά στην τραχεία, ενώ συνεχίζει να λαμβάνει εικόνες.
Διαμόρφωση μαγνήτη για απεικόνιση in vivo (α) ένας μόνο μαγνήτης πάνω από την τραχεία υπό γωνία περίπου 30°, (β) δύο μαγνήτες ρυθμισμένοι να έλκονται, (γ) δύο μαγνήτες ρυθμισμένοι να απωθούνται, (δ) ένας μόνο μαγνήτης πάνω και κάθετα στην τραχεία. Ο παρατηρητής κοίταξε προς τα κάτω από το στόμα προς τους πνεύμονες μέσω της τραχείας και η δέσμη ακτίνων Χ πέρασε από την αριστερή πλευρά του αρουραίου και εξήλθε από τη δεξιά πλευρά. Ο μαγνήτης είτε κινείται κατά μήκος του αεραγωγού είτε αριστερά και δεξιά πάνω από την τραχεία προς την κατεύθυνση της δέσμης ακτίνων Χ.
Επιδιώξαμε επίσης να προσδιορίσουμε την ορατότητα και τη συμπεριφορά των σωματιδίων στους αεραγωγούς απουσία συγχυτικής αναπνοής και καρδιακής κίνησης. Επομένως, στο τέλος της περιόδου απεικόνισης, τα ζώα θανατώθηκαν με ανώδυνο τρόπο για υπερδοσολογία πεντοβαρβιτάλης (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ΗΠΑ· ~65 mg/kg ip). Ορισμένα ζώα αφέθηκαν στην πλατφόρμα απεικόνισης και, μόλις σταμάτησαν η αναπνοή και ο καρδιακός παλμός, η διαδικασία απεικόνισης επαναλήφθηκε, προσθέτοντας μια επιπλέον δόση MP εάν δεν ήταν ορατή MP στην επιφάνεια των αεραγωγών.
Οι εικόνες που αποκτήθηκαν διορθώθηκαν σε επίπεδο και σκοτεινό πεδίο και στη συνέχεια συγκεντρώθηκαν σε μια ταινία (20 καρέ ανά δευτερόλεπτο, 15-25 × κανονική ταχύτητα ανάλογα με τον αναπνευστικό ρυθμό) χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο σενάριο γραμμένο σε MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Όλες οι μελέτες χορήγησης φορέα γονιδίων LV διεξήχθησαν στο Εργαστηριακό Κέντρο Έρευνας Ζώων στο Πανεπιστήμιο της Αδελαΐδας και στόχευαν στη χρήση των αποτελεσμάτων του πειράματος SPring-8 για να αξιολογηθεί εάν η χορήγηση LV-MP παρουσία μαγνητικού πεδίου θα μπορούσε να ενισχύσει τη μεταφορά γονιδίων in vivo. Για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις της MP και του μαγνητικού πεδίου, υποβλήθηκαν σε θεραπεία δύο ομάδες ζώων: η μία ομάδα έλαβε LV-MP με τοποθετημένο μαγνήτη και η άλλη ομάδα έλαβε ομάδα ελέγχου με LV-MP χωρίς μαγνήτη.
Οι φορείς γονιδίων LV δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας προηγουμένως περιγραφείσες μεθόδους 25, 26. Ο φορέας LacZ εκφράζει το γονίδιο βήτα-γαλακτοσιδάσης που εντοπίζεται στον πυρήνα και καθοδηγείται από τον συστατικό υποκινητή MPSV (LV-LacZ), ο οποίος παράγει ένα μπλε προϊόν αντίδρασης σε μεταδιεγερμένα κύτταρα, ορατό σε μέτωπα πνευμονικού ιστού και τομές ιστών. Η τιτλοδότηση πραγματοποιήθηκε σε κυτταροκαλλιέργειες μετρώντας χειροκίνητα τον αριθμό των θετικών για LacZ κυττάρων με αιμοκυτταρόμετρο για τον υπολογισμό του τίτλου σε TU/ml. Οι φορείς κρυοσυντηρούνται στους -80 °C, αποψύχονται πριν από τη χρήση και συνδέονται με το CombiMag με ανάμειξη σε αναλογία 1:1 και επώαση σε πάγο για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την παράδοση.
Φυσιολογικοί αρουραίοι Sprague Dawley (n = 3/ομάδα, ~2-3 αναισθητοποιήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με μείγμα 0,4 mg/kg μεδετομιδίνης (Domitor, Ilium, Αυστραλία) και 60 mg/kg κεταμίνης (Ilium, Αυστραλία) μηνών) ενδοπεριτοναϊκά) και μη χειρουργική στοματική καθετηριασμό με καθετήρα 16 Ga ενδοφλέβια. Για να διασφαλιστεί ότι ο ιστός των τραχειακών αεραγωγών λαμβάνει μεταγωγή της αριστερής κοιλίας (LV), υποβλήθηκε σε προετοιμασία χρησιμοποιώντας το προηγουμένως περιγραφέν πρωτόκολλο μηχανικής διαταραχής, στο οποίο η επιφάνεια των τραχειακών αεραγωγών τρίφτηκε αξονικά με ένα συρμάτινο καλάθι (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ΗΠΑ) 30 s28. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε τραχειακή χορήγηση LV-MP σε θάλαμο βιολογικής ασφάλειας περίπου 10 λεπτά μετά τη διαταραχή.
Το μαγνητικό πεδίο που χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το πείραμα διαμορφώθηκε με παρόμοιο τρόπο με τη μελέτη απεικόνισης ακτίνων Χ in vivo, με τους ίδιους μαγνήτες να συγκρατούνται πάνω από την τραχεία χρησιμοποιώντας κλιπς stent απόσταξης (Σχήμα 4). Ένας όγκος 50 μl (2 × 25 μl κλάσματα) LV-MP χορηγήθηκε στην τραχεία (n = 3 ζώα) χρησιμοποιώντας μια πιπέτα που περιείχε μια άκρη γέλης όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Μια ομάδα ελέγχου (n = 3 ζώα) έλαβε τα ίδια LV-MPs χωρίς τη χρήση μαγνήτη. Μετά την ολοκλήρωση της έγχυσης, η κάνουλα αφαιρείται από τον σωλήνα ET και το ζώο αποσωληνώνεται. Ο μαγνήτης παραμένει στη θέση του για 10 λεπτά και στη συνέχεια αφαιρείται. Οι αρουραίοι έλαβαν υποδόρια δόση μελοξικάμης (1 ml/kg) (Ilium, Αυστραλία) ακολουθούμενη από αναστροφή της αναισθησίας με ενδοπεριτοναϊκή ένεση υδροχλωρικής ατιπαμαζόλης 1 mg/kg (Antisedan, Zoetis, Αυστραλία). Οι αρουραίοι διατηρήθηκαν ζεστοί και παρακολουθήθηκαν μέχρι την πλήρη ανάρρωση από την αναισθησία.
Συσκευή χορήγησης LV-MP σε θάλαμο βιολογικής ασφάλειας. Ο ανοιχτόχρωμος γκρι ομφαλός Luer του σωλήνα ET φαίνεται να προεξέχει από το στόμα και η άκρη γέλης της πιπέτας που φαίνεται στην εικόνα εισάγεται μέσω του σωλήνα ET στο επιθυμητό βάθος μέσα στην τραχεία.
Μία εβδομάδα μετά τη διαδικασία δοσολογίας LV-MP, τα ζώα θανατώθηκαν με ανώδυνο τρόπο με εισπνοή 100% CO2 και η έκφραση LacZ αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την τυπική θεραπεία X-gal. Οι τρεις ουραίοι χόνδρινοι δακτύλιοι αφαιρέθηκαν για να διασφαλιστεί ότι οποιαδήποτε μηχανική βλάβη ή κατακράτηση υγρών από την τοποθέτηση ενδοτραχειακού σωλήνα δεν συμπεριλήφθηκε στην ανάλυση. Κάθε τραχεία κόπηκε κατά μήκος για να δημιουργηθούν δύο μισά για ανάλυση και τοποθετήθηκαν σε ένα τρυβλίο που περιείχε σιλικονούχο καουτσούκ (Sylgard, Dow Inc) χρησιμοποιώντας μια βελόνα Minutien (Fine Science Tools) για την απεικόνιση της επιφάνειας του αυλού. Η κατανομή και το μοτίβο των μεταγόμενων κυττάρων επιβεβαιώθηκαν με μετωπιαία φωτογραφία χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Nikon (SMZ1500) με κάμερα DigiLite και λογισμικό TCapture (Tucsen Photonics, China). Οι εικόνες λήφθηκαν με μεγέθυνση 20x (συμπεριλαμβανομένης της υψηλότερης ρύθμισης για το πλήρες πλάτος της τραχείας), με ολόκληρο το μήκος της τραχείας να απεικονίζεται βήμα προς βήμα, εξασφαλίζοντας επαρκή επικάλυψη μεταξύ κάθε εικόνας για να επιτρέπεται η "συρραφή" της εικόνας. Οι εικόνες από κάθε τραχεία στη συνέχεια συναρμολογήθηκαν σε μία μόνο σύνθετη εικόνα χρησιμοποιώντας Το Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) χρησιμοποιεί έναν αλγόριθμο επίπεδης κίνησης. Οι περιοχές έκφρασης LacZ σε σύνθετες εικόνες της τραχείας από κάθε ζώο ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο σενάριο MATLAB (R2020a, MathWorks) όπως περιγράφηκε προηγουμένως, χρησιμοποιώντας ρυθμίσεις 0,35 < Απόχρωση < 0,58, Κορεσμός > 0,15 και Τιμή < 0,7. Ανιχνεύοντας τα περιγράμματα του ιστού, δημιουργήθηκε χειροκίνητα μια μάσκα στο GIMP v2.10.24 για κάθε σύνθετη εικόνα, προκειμένου να αναγνωριστεί η περιοχή του ιστού και να αποφευχθούν τυχόν ψευδείς ανιχνεύσεις εκτός του τραχειακού ιστού. Οι χρωματισμένες περιοχές από όλες τις σύνθετες εικόνες από κάθε ζώο αθροίστηκαν για να δημιουργηθεί η συνολική χρωματισμένη περιοχή για αυτό το ζώο. Η χρωματισμένη περιοχή στη συνέχεια διαιρέθηκε με τη συνολική περιοχή της μάσκας για να δημιουργηθεί η κανονικοποιημένη περιοχή.
Κάθε τραχεία ενσωματώθηκε σε παραφίνη και κόπηκαν τομές πάχους 5 μm. Οι τομές χρώστηκαν με ουδέτερο γρήγορο κόκκινο για 5 λεπτά και οι εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Nikon Eclipse E400, κάμερα DS-Fi3 και λογισμικό καταγραφής στοιχείων NIS (έκδοση 5.20.00).
Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε σε p ≤ 0,05. Η κανονικότητα επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Shapiro-Wilk και οι διαφορές στη χρώση LacZ αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μη ζευγαρωμένη δοκιμή t.
Τα έξι MP που περιγράφονται στον Πίνακα 1 εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας PCXI και η ορατότητα περιγράφεται στον Πίνακα 2. Δύο MP πολυστυρενίου (MP1 και MP2, 18 μm και 0,25 μm, αντίστοιχα) δεν ήταν ορατά υπό PCXI, αλλά τα υπόλοιπα δείγματα ήταν αναγνωρίσιμα (παραδείγματα φαίνονται στο Σχήμα 5). Τα MP3 και MP4 (10-15% Fe3O4, 0,25 μm και 0,9 μm, αντίστοιχα) είναι αμυδρά ορατά. Αν και περιείχαν μερικά από τα μικρότερα σωματίδια που δοκιμάστηκαν, το MP5 (98% Fe3O4, 0,25 μm) ήταν το πιο έντονο. Το προϊόν CombiMag MP6 είναι δύσκολο να εντοπιστεί. Σε όλες τις περιπτώσεις, η ικανότητά μας να ανιχνεύουμε MP ενισχύθηκε σημαντικά μετατοπίζοντας τον μαγνήτη εμπρός και πίσω παράλληλα με το τριχοειδές. Όταν οι μαγνήτες απομακρύνθηκαν από το τριχοειδές, τα σωματίδια εκτάθηκαν σε μακριές χορδές, αλλά καθώς οι μαγνήτες πλησίαζαν και η ένταση του μαγνητικού πεδίου αυξανόταν, οι χορδές των σωματιδίων βραχύνονταν καθώς τα σωματίδια μετανάστευαν προς την άνω επιφάνεια του τριχοειδούς (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S1: MP4), αυξάνοντας το πυκνότητα σωματιδίων της επιφάνειας. Αντίθετα, όταν ο μαγνήτης αφαιρείται από το τριχοειδές, η ένταση του πεδίου μειώνεται και τα μαγνητικά σωματίδια (MPs) αναδιατάσσονται σε μακριές χορδές που εκτείνονται από την άνω επιφάνεια του τριχοειδούς (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S2:MP4). Αφού ο μαγνήτης σταματήσει να κινείται, τα σωματίδια συνεχίζουν να κινούνται για μικρό χρονικό διάστημα αφού φτάσουν στη θέση ισορροπίας. Καθώς το μαγνητικό σωματίδιο κινείται προς και μακριά από την άνω επιφάνεια του τριχοειδούς, τα μαγνητικά σωματίδια συνήθως σύρουν τα υπολείμματα μέσα στο ρευστό.
Η ορατότητα του MP υπό PCXI ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των δειγμάτων. (α) MP3, (β) MP4, (γ) MP5 και (δ) MP6. Όλες οι εικόνες που εμφανίζονται εδώ λήφθηκαν με έναν μαγνήτη που βρίσκεται περίπου 10 mm ακριβώς πάνω από το τριχοειδές. Οι φαινομενικοί μεγάλοι κύκλοι είναι φυσαλίδες αέρα παγιδευμένες στα τριχοειδή, δείχνοντας σαφώς τα χαρακτηριστικά των μαύρων και λευκών άκρων της απεικόνισης αντίθεσης φάσης. Το κόκκινο πλαίσιο περιέχει τη μεγέθυνση ενίσχυσης της αντίθεσης. Σημειώστε ότι οι διάμετροι των σχηματικών μαγνητών σε όλα τα σχήματα δεν είναι σε κλίμακα και είναι περίπου 100 φορές μεγαλύτερες από αυτές που φαίνονται.
Καθώς ο μαγνήτης μετατοπίζεται αριστερά και δεξιά κατά μήκος της κορυφής του τριχοειδούς, η γωνία της χορδής MP αλλάζει για να ευθυγραμμιστεί με τον μαγνήτη (βλ. Σχήμα 6), οριοθετώντας έτσι τις γραμμές του μαγνητικού πεδίου. Για το MP3-5, αφού η χορδή φτάσει σε μια γωνία κατωφλίου, τα σωματίδια σύρονται κατά μήκος της άνω επιφάνειας του τριχοειδούς. Αυτό συχνά έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση MP σε μεγαλύτερες ομάδες κοντά στο σημείο όπου το μαγνητικό πεδίο είναι ισχυρότερο (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S3:MP5). Αυτό είναι επίσης ιδιαίτερα εμφανές κατά την απεικόνιση κοντά στο άκρο του τριχοειδούς, γεγονός που προκαλεί τη συσσώρευση και τη συγκέντρωση των MP στη διεπαφή ρευστού-αέρα. Τα σωματίδια στο MP6, τα οποία ήταν πιο δύσκολο να διακριθούν από το MP3-5, δεν σύρθηκαν καθώς ο μαγνήτης κινήθηκε κατά μήκος του τριχοειδούς, αλλά οι χορδές MP διασπάστηκαν, αφήνοντας τα σωματίδια στο οπτικό πεδίο (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S4:MP6). Σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν το εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο μειώθηκε μετακινώντας τον μαγνήτη σε μεγάλη απόσταση από τη θέση απεικόνισης, τυχόν εναπομείναντα MP κατέβηκαν αργά στην κάτω επιφάνεια του σωλήνα με τη βαρύτητα ενώ παρέμειναν στη χορδή (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S5: MP3).
Η γωνία της χορδής MP αλλάζει καθώς ο μαγνήτης μετατοπίζεται προς τα δεξιά πάνω από το τριχοειδές. (α) MP3, (β) MP4, (γ) MP5 και (δ) MP6. Το κόκκινο πλαίσιο περιέχει τη μεγέθυνση ενίσχυσης της αντίθεσης. Σημειώστε ότι τα συμπληρωματικά βίντεο είναι ενημερωτικά, καθώς αποκαλύπτουν σημαντικές πληροφορίες για τη δομή των σωματιδίων και τη δυναμική που δεν μπορούν να απεικονιστούν σε αυτές τις στατικές εικόνες.
Οι δοκιμές μας έδειξαν ότι η αργή κίνηση του μαγνήτη εμπρός και πίσω κατά μήκος της τραχείας διευκολύνει την απεικόνιση του MP στο πλαίσιο σύνθετης κίνησης in vivo. Δεν πραγματοποιήθηκαν δοκιμές in vivo, καθώς τα σφαιρίδια πολυστυρενίου (MP1 και MP2) δεν ήταν ορατά στο τριχοειδές. Κάθε ένα από τα υπόλοιπα τέσσερα MP δοκιμάστηκε in vivo με τον μακρύ άξονα του μαγνήτη διαμορφωμένο πάνω από την τραχεία υπό γωνία περίπου 30° προς την κατακόρυφο (βλ. Σχήματα 2b και 3a), καθώς αυτό είχε ως αποτέλεσμα μεγαλύτερες αλυσίδες MP και ήταν πιο αποτελεσματικό από τη διαμόρφωση του μαγνήτη που τερματίστηκε. Τα MP3, MP4 και MP6 δεν ανιχνεύθηκαν στην τραχεία κανενός ζωντανού ζώου. Όταν οι αεραγωγοί των αρουραίων απεικονίστηκαν μετά την ανώδυνη θανάτωση των ζώων, τα σωματίδια παρέμειναν αόρατα ακόμη και όταν προστέθηκε επιπλέον όγκος χρησιμοποιώντας αντλία σύριγγας. Το MP5 είχε την υψηλότερη περιεκτικότητα σε οξείδιο του σιδήρου και ήταν το μόνο ορατό σωματίδιο και ως εκ τούτου χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση και τον χαρακτηρισμό της in vivo συμπεριφοράς του MP.
Η τοποθέτηση του μαγνήτη πάνω από την τραχεία κατά τη χορήγηση της μικροσκοπικής έγχυσης είχε ως αποτέλεσμα τη συγκέντρωση πολλών, αλλά όχι όλων, των μικροσκοπικών μορφωμάτων (ΜΜ) στο οπτικό πεδίο. Τα σωματίδια που εισέρχονται στην τραχεία παρατηρούνται καλύτερα σε ζώα που έχουν θυσιαστεί με ανώδυνο τρόπο. Το Σχήμα 7 και το Συμπληρωματικό Βίντεο S6: MP5 δείχνουν ταχεία μαγνητική σύλληψη και ευθυγράμμιση σωματιδίων στην επιφάνεια της κοιλιακής τραχείας, υποδεικνύοντας ότι τα ΜΜ μπορούν να κατευθυνθούν σε επιθυμητές περιοχές της τραχείας. Κατά την αναζήτηση πιο περιφερικά κατά μήκος της τραχείας μετά την χορήγηση της μικροσκοπικής έγχυσης, ορισμένα ΜΜ βρέθηκαν πιο κοντά στην τρόπιδα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ένταση του μαγνητικού πεδίου ήταν ανεπαρκής για τη συλλογή και τη συγκράτηση όλων των ΜΜ, καθώς χορηγήθηκαν μέσω της περιοχής μέγιστης έντασης μαγνητικού πεδίου κατά τη διάρκεια της υγρής διαδικασίας. Παρ' όλα αυτά, οι συγκεντρώσεις ΜΜ μετά τον τοκετό ήταν υψηλότερες γύρω από την απεικονιζόμενη περιοχή, υποδηλώνοντας ότι πολλά ΜΜ παρέμειναν στις περιοχές των αεραγωγών όπου η εφαρμοζόμενη ένταση του μαγνητικού πεδίου ήταν υψηλότερη.
Εικόνες από (α) πριν και (β) μετά την χορήγηση MP5 στην τραχεία ενός πρόσφατα ευθανατωμένου αρουραίου με τον μαγνήτη τοποθετημένο ακριβώς πάνω από την περιοχή απεικόνισης. Η απεικονιζόμενη περιοχή βρίσκεται ανάμεσα στους δύο χόνδρινους δακτυλίους. Πριν από την χορήγηση MP, υπάρχει κάποιο υγρό στον αεραγωγό. Το κόκκινο πλαίσιο περιέχει τη μεγέθυνση ενίσχυσης της αντίθεσης. Αυτές οι εικόνες προέρχονται από το βίντεο που εμφανίζεται στο Συμπληρωματικό Βίντεο S6:MP5.
Η μετατόπιση του μαγνήτη κατά μήκος της τραχείας in vivo προκάλεσε την αλλαγή γωνίας της αλυσίδας MP εντός της επιφάνειας των αεραγωγών με τρόπο παρόμοιο με αυτόν που παρατηρείται στα τριχοειδή αγγεία (βλ. Σχήμα 8 και Συμπληρωματικό Βίντεο S7:MP5). Ωστόσο, στη μελέτη μας, τα MP δεν μπορούσαν να συρθούν κατά μήκος της επιφάνειας των ζωντανών αεραγωγών όπως θα μπορούσαν με τα τριχοειδή αγγεία. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η αλυσίδα MP θα επιμηκυνθεί καθώς ο μαγνήτης κινείται αριστερά και δεξιά. Είναι ενδιαφέρον ότι διαπιστώσαμε επίσης ότι η αλυσίδα σωματιδίων φαίνεται να αλλάζει το βάθος του επιφανειακού στρώματος υγρού όταν ο μαγνήτης κινείται διαμήκως κατά μήκος της τραχείας και διαστέλλεται όταν ο μαγνήτης κινείται ακριβώς από πάνω και η αλυσίδα σωματιδίων περιστρέφεται σε κατακόρυφη θέση (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S7). : MP5 στο 0:09, κάτω δεξιά). Το χαρακτηριστικό μοτίβο κίνησης άλλαξε όταν ο μαγνήτης μετατοπίστηκε κατά μήκος της κορυφής της τραχείας πλευρικά (δηλαδή, αριστερά ή δεξιά του ζώου και όχι κατά μήκος της τραχείας). Τα σωματίδια ήταν ακόμα καθαρά ορατά καθώς κινούνταν, αλλά όταν ο μαγνήτης αφαιρέθηκε από την τραχεία, οι άκρες των χορδών των σωματιδίων έγιναν ορατές (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S8:MP5, ξεκινώντας από το 0:08). Αυτό συμφωνεί με τη συμπεριφορά MP που παρατηρήσαμε υπό εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο σε γυάλινο τριχοειδές.
Παραδείγματα εικόνων που δείχνουν την MP5 στην τραχεία ενός ζωντανού αναισθητοποιημένου αρουραίου. (α) Ο μαγνήτης χρησιμοποιείται για τη λήψη εικόνων πάνω και αριστερά της τραχείας, στη συνέχεια (β) αφού ο μαγνήτης μετακινηθεί προς τα δεξιά. Το κόκκινο πλαίσιο περιέχει τη μεγέθυνση ενίσχυσης της αντίθεσης. Αυτές οι εικόνες προέρχονται από το βίντεο που εμφανίζεται στο Συμπληρωματικό Βίντεο S7:MP5.
Όταν οι δύο πόλοι διαμορφώθηκαν σε προσανατολισμό βορρά-νότου πάνω και κάτω από την τραχεία (δηλαδή, έλξη· Εικ. 3β), οι χορδές MP εμφανίστηκαν μακρύτερες και βρίσκονταν στο πλευρικό τοίχωμα της τραχείας και όχι στην ραχιαία επιφάνεια της τραχείας (βλ. Συμπληρωματικό Βίντεο S9:MP5). Ωστόσο, υψηλές συγκεντρώσεις σωματιδίων σε μία μόνο θέση (δηλαδή, στην ραχιαία επιφάνεια της τραχείας) δεν ανιχνεύθηκαν μετά την χορήγηση υγρού όταν χρησιμοποιήθηκε συσκευή διπλού μαγνήτη, κάτι που συνήθως συμβαίνει όταν χρησιμοποιείται συσκευή μονού μαγνήτη. Στη συνέχεια, όταν ένας μαγνήτης διαμορφώθηκε για να απωθεί τους πόλους ανεστραμμένους (Εικ. 3γ), ο αριθμός των σωματιδίων που είναι ορατά στο οπτικό πεδίο δεν φάνηκε να αυξάνεται μετά την χορήγηση. Η ρύθμιση και των δύο διαμορφώσεων διπλού μαγνήτη είναι δύσκολη λόγω των υψηλών εντάσεων μαγνητικού πεδίου που έλκουν ή ωθούν τους μαγνήτες, αντίστοιχα. Η ρύθμιση στη συνέχεια άλλαξε σε έναν μόνο μαγνήτη παράλληλο με τον αεραγωγό αλλά που διέρχεται από τον αεραγωγό σε γωνία 90 μοιρών, έτσι ώστε οι γραμμές πεδίου να διασχίζουν το τραχειακό τοίχωμα ορθογώνια (Εικ. 3δ), ένας προσανατολισμός που σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει εάν μπορούσε να παρατηρηθεί συσσωμάτωση σωματιδίων στο πλευρικό τοίχωμα. Ωστόσο, σε αυτή τη διαμόρφωση, υπήρχε καμία αναγνωρίσιμη κίνηση συσσώρευσης MP ή κίνηση μαγνήτη. Με βάση όλα αυτά τα αποτελέσματα, επιλέχθηκε μια διαμόρφωση μονού μαγνήτη, προσανατολισμού 30 μοιρών (Σχήμα 3α) για μελέτες γονιδιακών φορέων in vivo.
Όταν το ζώο απεικονίστηκε επανειλημμένα αμέσως μετά την θανάτωση με μη ανθρωπιστικό τρόπο, η απουσία συγχυτικής κίνησης των ιστών σήμαινε ότι λεπτότερες και βραχύτερες γραμμές σωματιδίων μπορούσαν να διακριθούν στο καθαρό μεσοχονδρικό πεδίο, «ασταθείς» σύμφωνα με την κίνηση μετατόπισης του μαγνήτη. Παρ' όλα αυτά, εξακολουθεί να μην μπορεί να διακριθεί καθαρά η παρουσία και η κίνηση των σωματιδίων MP6.
Ο τίτλος LV-LacZ ήταν 1,8 × 108 TU/ml και μετά από ανάμειξη 1:1 με CombiMag MP (MP6), τα ζώα έλαβαν τραχειακή δόση 50 μl 9 × 107 TU/ml φορέα LV (δηλαδή 4,5 × 106 TU/αρουραίο). Σε αυτές τις μελέτες, αντί να μεταφέρουμε τον μαγνήτη κατά τη διάρκεια του τοκετού, σταθεροποιήσαμε τον μαγνήτη σε μία θέση για να προσδιορίσουμε εάν η μεταγωγή της LV (α) θα μπορούσε να βελτιωθεί σε σύγκριση με την χορήγηση φορέα απουσία μαγνητικού πεδίου και (β) θα μπορούσε να εστιαστεί. Τα κύτταρα των αεραγωγών μεταγωγούνται σε μαγνητικές περιοχές-στόχους των ανώτερων αεραγωγών.
Η παρουσία μαγνητών και η χρήση του CombiMag σε συνδυασμό με φορείς LV δεν φάνηκαν να έχουν δυσμενείς επιπτώσεις στην υγεία των ζώων, όπως και το τυπικό πρωτόκολλο χορήγησης φορέων LV. Οι μετωπικές εικόνες της τραχειακής περιοχής που υποβλήθηκε σε μηχανική διαταραχή (Συμπληρωματικό Σχήμα 1) έδειξαν ότι υπήρχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα μεταγωγής στην ομάδα των ζώων που έλαβαν θεραπεία με LV-MP όταν υπήρχε ο μαγνήτης (Σχήμα 9α). Μόνο μια μικρή ποσότητα μπλε χρώσης LacZ υπήρχε στην ομάδα ελέγχου (Σχήμα 9β). Η ποσοτικοποίηση των κανονικοποιημένων περιοχών που είχαν χρωματιστεί με X-Gal έδειξε ότι η χορήγηση LV-MP παρουσία μαγνητικού πεδίου παρήγαγε περίπου 6 φορές βελτίωση (Σχήμα 9γ).
Παραδείγματα σύνθετων εικόνων που δείχνουν την τραχειακή μεταγωγή από LV-MP (α) παρουσία μαγνητικού πεδίου και (β) απουσία μαγνήτη. (γ) Στατιστικά σημαντική βελτίωση στην κανονικοποιημένη περιοχή μεταγωγής LacZ εντός της τραχείας κατά τη χρήση του μαγνήτη (*p = 0,029, t-test, n = 3 ανά ομάδα, μέσος όρος ± SEM).
Τα ουδέτερα γρήγορα χρωματισμένα με κόκκινο χρώμα τμήματα (παράδειγμα που φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 2) έδειξαν κύτταρα χρωματισμένα με LacZ που υπάρχουν σε παρόμοιο μοτίβο και θέση όπως αναφέρθηκε προηγουμένως.
Μια βασική πρόκληση για τη γονιδιακή θεραπεία των αεραγωγών παραμένει ο ακριβής εντοπισμός σωματιδίων-φορέων σε περιοχές ενδιαφέροντος και η επίτευξη υψηλών επιπέδων αποτελεσματικότητας μεταγωγής στον κινούμενο πνεύμονα παρουσία ροής αέρα και ενεργού απομάκρυνσης βλέννας. Για τους φορείς της αριστερής κοιλίας που έχουν σχεδιαστεί για τη θεραπεία της νόσου των αεραγωγών με κυστική ίνωση, η αύξηση του χρόνου παραμονής των σωματιδίων-φορέων εντός των αγώγιμων αεραγωγών ήταν ένας μέχρι τώρα άπιαστος στόχος. Όπως επισημαίνουν οι Castellani et al., η χρήση μαγνητικών πεδίων για τη βελτίωση της μεταγωγής έχει πλεονεκτήματα σε σύγκριση με άλλες μεθόδους χορήγησης γονιδίων, όπως η ηλεκτροπόρωση, καθώς μπορεί να συνδυάσει απλότητα, σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας, εντοπισμό χορήγησης, αυξημένη αποτελεσματικότητα και μικρότερους χρόνους επώασης, και πιθανώς μικρότερη δόση φορέα10. Ωστόσο, η εναπόθεση και η συμπεριφορά in vivo μαγνητικών σωματιδίων στους αεραγωγούς υπό την επίδραση εξωτερικών μαγνητικών δυνάμεων δεν έχει περιγραφεί ποτέ, ούτε έχει αποδειχθεί στην πραγματικότητα η σκοπιμότητα αυτής της μεθόδου in vivo για την ενίσχυση των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης σε άθικτους ζωντανούς αεραγωγούς.
Τα πειράματά μας με PCXI σύγχροτρον in vitro έδειξαν ότι όλα τα σωματίδια που εξετάσαμε, με εξαίρεση το πολυστυρένιο MP, ήταν ορατά στη διάταξη απεικόνισης που χρησιμοποιήσαμε. Παρουσία μαγνητικού πεδίου, τα MP σχηματίζουν χορδές των οποίων τα μήκη σχετίζονται με τον τύπο του σωματιδίου και την ένταση του μαγνητικού πεδίου (δηλαδή την εγγύτητα και την κίνηση του μαγνήτη). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 10, οι χορδές που παρατηρούμε σχηματίζονται λόγω του ότι κάθε μεμονωμένο σωματίδιο μαγνητίζεται και προκαλεί το δικό του τοπικό μαγνητικό πεδίο. Αυτά τα ξεχωριστά πεδία προκαλούν τη συσσωμάτωση και τη σύνδεση άλλων παρόμοιων σωματιδίων, με ομαδικές κινήσεις που μοιάζουν με χορδές λόγω τοπικών δυνάμεων από τις τοπικές ελκτικές και απωστικές δυνάμεις άλλων σωματιδίων.
Σχηματική απεικόνιση (α, β) αλληλουχιών σωματιδίων που παράγονται μέσα σε τριχοειδή αγγεία γεμάτα με υγρό και (γ, δ) τραχείας γεμάτα με αέρα. Σημειώστε ότι τα τριχοειδή αγγεία και η τραχεία δεν έχουν σχεδιαστεί σε κλίμακα. Το πλαίσιο (α) περιέχει επίσης μια περιγραφή του MP, το οποίο περιέχει σωματίδια Fe3O4 διατεταγμένα σε χορδές.
Όταν ο μαγνήτης μετακινήθηκε πάνω από το τριχοειδές, η γωνία της αλληλουχίας των σωματιδίων έφτασε σε ένα κρίσιμο όριο για το MP3-5 που περιέχει Fe3O4, μετά το οποίο η αλληλουχία των σωματιδίων δεν παρέμεινε πλέον στην αρχική θέση, αλλά μετακινήθηκε κατά μήκος της επιφάνειας σε μια νέα θέση. Αυτό το φαινόμενο είναι πιθανό να συμβεί επειδή η επιφάνεια του γυάλινου τριχοειδούς είναι αρκετά λεία για να επιτρέψει αυτήν την κίνηση. Είναι ενδιαφέρον ότι το MP6 (CombiMag) δεν συμπεριφέρθηκε με αυτόν τον τρόπο, πιθανώς επειδή τα σωματίδια ήταν μικρότερα, είχαν διαφορετικές επιστρώσεις ή επιφανειακά φορτία ή ένα ιδιόκτητο ρευστό φορέα επηρέασε την ικανότητά τους να κινούνται. Η αντίθεση εικόνας των σωματιδίων CombiMag είναι επίσης ασθενέστερη, υποδηλώνοντας ότι το ρευστό και τα σωματίδια μπορεί να έχουν παρόμοιες πυκνότητες και επομένως να μην κινούνται εύκολα το ένα προς το άλλο. Τα σωματίδια μπορούν επίσης να κολλήσουν εάν ο μαγνήτης κινείται πολύ γρήγορα, υποδεικνύοντας ότι η ένταση του μαγνητικού πεδίου δεν μπορεί πάντα να ξεπεράσει την τριβή μεταξύ των σωματιδίων στο ρευστό, υποδηλώνοντας ότι ίσως δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι η ένταση του μαγνητικού πεδίου και η απόσταση μεταξύ του μαγνήτη και της περιοχής-στόχου είναι πολύ σημαντικές. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν επίσης ότι, ενώ οι μαγνήτες μπορούν να συλλάβουν πολλά MP που ρέουν μέσω της περιοχής-στόχου, είναι απίθανο να μπορούν να βασιστούν οι μαγνήτες για μετακινούν τα σωματίδια CombiMag κατά μήκος της επιφάνειας της τραχείας. Συνεπώς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι μελέτες LV-MP in vivo θα πρέπει να χρησιμοποιούν στατικά μαγνητικά πεδία για να στοχεύουν φυσικά συγκεκριμένες περιοχές του δέντρου των αεραγωγών.
Όταν τα σωματίδια μεταφέρονται στο σώμα, είναι δύσκολο να αναγνωριστούν στο πλαίσιο σύνθετων κινούμενων ιστών του σώματος, αλλά η ικανότητα ανίχνευσής τους ενισχύθηκε με την οριζόντια μετατόπιση του μαγνήτη πάνω από την τραχεία για να «κουνά» τις χορδές των μικροσκοπικών σωματιδίων. Παρόλο που η ζωντανή απεικόνιση είναι δυνατή, είναι ευκολότερο να διακριθεί η κίνηση των σωματιδίων μόλις το ζώο θανατωθεί με ανώδυνο τρόπο. Οι συγκεντρώσεις μικροσκοπικών σωματιδίων ήταν γενικά υψηλότερες σε αυτήν την τοποθεσία όταν ο μαγνήτης τοποθετήθηκε πάνω από την περιοχή απεικόνισης, αν και ορισμένα σωματίδια συνήθως βρίσκονταν πιο μακριά κατά μήκος της τραχείας. Σε αντίθεση με τις μελέτες in vitro, τα σωματίδια δεν μπορούν να συρθούν κατά μήκος της τραχείας με τη μετατόπιση του μαγνήτη. Αυτό το εύρημα είναι συνεπές με τον τρόπο με τον οποίο η βλέννα που επικαλύπτει την επιφάνεια της τραχείας συνήθως επεξεργάζεται τα εισπνεόμενα σωματίδια, παγιδεύοντάς τα στη βλέννα και στη συνέχεια απομακρύνοντάς τα μέσω του μηχανισμού βλεννοκροσσωτής κάθαρσης.
Υποθέσαμε ότι η χρήση μαγνητών για έλξη πάνω και κάτω από την τραχεία (Εικ. 3β) θα μπορούσε να οδηγήσει σε ένα πιο ομοιόμορφο μαγνητικό πεδίο, αντί για ένα μαγνητικό πεδίο που είναι ιδιαίτερα συγκεντρωμένο σε ένα σημείο, οδηγώντας ενδεχομένως σε μια πιο ομοιόμορφη κατανομή των σωματιδίων. Ωστόσο, η προκαταρκτική μας μελέτη δεν βρήκε σαφή στοιχεία που να υποστηρίζουν αυτήν την υπόθεση. Ομοίως, η διαμόρφωση ενός ζεύγους μαγνητών για απώθηση (Εικ. 3γ) δεν οδήγησε σε περισσότερη εναπόθεση σωματιδίων στην απεικονιζόμενη περιοχή. Αυτά τα δύο ευρήματα καταδεικνύουν ότι η ρύθμιση διπλού μαγνήτη δεν βελτιώνει σημαντικά τον τοπικό έλεγχο της στόχευσης των μαγνητών και ότι οι προκύπτουσες ισχυρές μαγνητικές δυνάμεις είναι δύσκολο να διαμορφωθούν, καθιστώντας αυτήν την προσέγγιση λιγότερο πρακτική. Ομοίως, ο προσανατολισμός του μαγνήτη πάνω και μέσα από την τραχεία (Εικ. 3δ) επίσης δεν αύξησε τον αριθμό των σωματιδίων που συγκρατούνται στην απεικονιζόμενη περιοχή. Ορισμένες από αυτές τις εναλλακτικές διαμορφώσεις μπορεί να μην είναι επιτυχείς επειδή οδηγούν σε χαμηλότερες εντάσεις μαγνητικού πεδίου εντός της περιοχής εναπόθεσης. Επομένως, η διαμόρφωση ενός μαγνήτη γωνίας 30 μοιρών (Εικ. 3α) θεωρείται η ευκολότερη και πιο αποτελεσματική μέθοδος για δοκιμές in vivo.
Η μελέτη LV-MP έδειξε ότι όταν οι φορείς της αριστερής κοιλίας (LV) συνδυάστηκαν με CombiMag και χορηγήθηκαν μετά από φυσική διαταραχή παρουσία μαγνητικού πεδίου, τα επίπεδα μεταγωγής αυξήθηκαν σημαντικά στην τραχεία σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Με βάση τις μελέτες απεικόνισης με σύγχροτρον και τα αποτελέσματα του LacZ, το μαγνητικό πεδίο ήταν προφανώς σε θέση να διατηρήσει την αριστερή κοιλία (LV) εντός της τραχείας και να μειώσει τον αριθμό των σωματιδίων φορέα που διείσδυσαν αμέσως βαθιά στον πνεύμονα. Τέτοιες βελτιώσεις στοχευμένης δράσης μπορεί να οδηγήσουν σε υψηλότερη αποτελεσματικότητα, μειώνοντας παράλληλα τους χορηγούμενους τίτλους, την μεταγωγή εκτός στόχου, τις φλεγμονώδεις και ανοσολογικές παρενέργειες και το κόστος των γονιδιακών φορέων. Σημαντικό είναι ότι, σύμφωνα με τον κατασκευαστή, το CombiMag μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους μεταφοράς γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων άλλων ιικών φορέων (όπως AAV) και νουκλεϊκών οξέων.