Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu pro CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v prohlížeči Internet Explorer). Mezitím budeme web zobrazovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Genové vektory pro léčbu cystické fibrózy plic by měly cílit na vodivé dýchací cesty, protože periferní plicní transdukce neposkytuje terapeutický přínos. Účinnost virové transdukce přímo souvisí s dobou setrvání vektoru. Dodávací tekutiny, jako jsou genové nosiče, však přirozeně difundují do alveol během nádechu a terapeutické částice jakékoli formy jsou rychle odstraňovány mukociliárním transportem. Prodloužení doby setrvání genových nosičů v dýchacích cestách je důležité, ale obtížné. Magnetické částice konjugované s genovými nosiči, které lze nasměrovat na povrch dýchacích cest, mohou zlepšit regionální cílení. Vzhledem k obtížím s vizualizací in vivo je chování takových malých magnetických částic na povrchu dýchacích cest v přítomnosti aplikovaného magnetického pole špatně pochopeno. Cílem této studie bylo použít synchrotronové zobrazování k vizualizaci pohybu série magnetických částic in vivo v trachei anestetizovaných krys, abychom zkoumali dynamiku a vzorce chování individuálních a objemových částic in vivo. Poté jsme také posoudili, zda by dodávání lentivirových magnetických částic v přítomnosti magnetického pole zvýšilo účinnost transdukce v trachei krys. Synchrotronové rentgenové zobrazování odhaluje... Chování magnetických částic ve stacionárních a pohyblivých magnetických polích in vitro a in vivo. Částice nelze snadno táhnout po povrchu živých dýchacích cest magnety, ale během transportu se usazeniny koncentrují v zorném poli, kde je magnetické pole nejsilnější. Účinnost transdukce se také šestinásobně zvýšila, když byly lentivirové magnetické částice dodávány v přítomnosti magnetického pole. Tyto výsledky společně naznačují, že lentivirové magnetické částice a magnetická pole mohou být cennými přístupy ke zlepšení cílení genových vektorů a zvýšení úrovní transdukce ve vodivých dýchacích cestách in vivo.
Cystická fibróza (CF) je způsobena variací v jediném genu zvaném transmembránový regulátor vodivosti CF (CFTR). Protein CFTR je iontový kanál, který je přítomen v mnoha epiteliálních buňkách v celém těle, včetně vodivých dýchacích cest, což je hlavní místo patogeneze CF. Defekty CFTR vedou k abnormálnímu transportu vody, dehydrataci povrchu dýchacích cest a snižování hloubky vrstvy povrchové tekutiny (ASL). To také zhoršuje schopnost mukociliárního transportního systému (MCT) odstraňovat vdechované částice a patogeny z dýchacích cest. Naším cílem je vyvinout genovou terapii s lentiviry (LV), která by poskytla správnou kopii genu CFTR a zlepšila zdraví ASL, MCT a plic, a pokračovat ve vývoji nových technologií schopných měřit tyto parametry in vivo1.
Vektory levé komory (LV) jsou jedním z hlavních kandidátů pro genovou terapii dýchacích cest u pacientů s CF, zejména proto, že dokáží trvale integrovat terapeutický gen do bazálních buněk dýchacích cest (kmenových buněk dýchacích cest). To je důležité, protože mohou obnovit normální hydrataci a odstraňování hlenu diferenciací na funkční genově korigované povrchové buňky dýchacích cest asociované s CF, což vede k celoživotním přínosům. Vektory LV by měly být namířeny proti vodivým dýchacím cestám, protože právě zde začíná plicní onemocnění u pacientů s CF. Dodání vektoru hlouběji do plic může vést k alveolární transdukci, ale to nemá u pacientů s CF žádný terapeutický přínos. Tekutiny, jako jsou nosiče genů, však přirozeně migrují do alveol po inspiraci po dodání3,4 a terapeutické částice jsou pomocí MCT rychle odstraněny do ústní dutiny. Účinnost LV transdukce přímo souvisí s dobou, po kterou vektor zůstává vedle cílových buněk, aby umožnil buněčné vychytávání – „dobou setrvání“5 – kterou lze snadno zkrátit typickým regionálním prouděním vzduchu, stejně jako koordinovaným zachycením částic hlenu a MCT. U CF je schopnost prodloužit dobu setrvání levé komory v dýchacích cestách důležitá pro dosažení vysoké úrovně transdukce v této oblasti, ale dosud to bylo náročné.
Abychom tuto překážku překonali, navrhujeme, že magnetické částice (MP) levé komory (LV) mohou pomoci dvěma doplňkovými způsoby. Zaprvé, mohou být magneticky vedeny k povrchu dýchacích cest, aby se zlepšilo cílení a pomohlo částicím nosičů genů usadit se v požadované oblasti dýchacích cest; a (ASL) se přesunou do buněčné vrstvy 6. MP se široce používají jako cílené nosiče léků, když se vážou na protilátky, chemoterapeutické léky nebo jiné malé molekuly, které se vážou na buněčné membrány nebo na relevantní receptory na buněčném povrchu a hromadí se v místech nádoru za přítomnosti statické elektřiny. Magnetická pole pro léčbu rakoviny 7. Další „hypertermální“ techniky se zaměřují na zahřátí MP, když jsou vystaveny oscilujícím magnetickým polím, čímž se ničí nádorové buňky. Princip magnetické transfekce, při kterém se magnetické pole používá jako transfekční činidlo pro zvýšení přenosu DNA do buněk, se běžně používá in vitro s použitím řady nevirových a virových genových vektorů pro obtížně transdukovatelné buněčné linie. Účinnost LV magnetotransfekce byla prokázána, když in vitro dodání LV-MP do lidské bronchiální epiteliální buněčné linie v přítomnosti statického magnetického pole zvýšilo účinnost transdukce 186krát ve srovnání se samotným LV vektorem. LV-MP byl také aplikován na in vitro model CF, kde magnetická transfekce zvýšila LV transdukci v kulturách na rozhraní vzduch-kapalina 20krát v přítomnosti sputa CF10. In vivo magnetotransfekci orgánů se však věnovalo relativně málo pozornosti a byla hodnocena pouze v několika studiích na zvířatech11,12,13,14,15, zejména v plíce16,17. Nicméně možnosti magnetické transfekce v plicní terapii pacientů s cystickou fibrózou (CF) jsou jasné. Tan a kol. (2020) uvedli, že „studie ověření konceptu účinného podávání magnetických nanočástic do plic připraví cestu pro budoucí inhalační strategie CFTR ke zlepšení klinických výsledků u pacientů s CF“6.
Chování malých magnetických částic na povrchu dýchacích cest v přítomnosti aplikovaného magnetického pole je obtížné vizualizovat a studovat, a proto je špatně pochopeno. V jiných studiích jsme vyvinuli metodu fázového kontrastu s rentgenovým zobrazováním založenou na šíření synchrotronů (PB-PCXI) pro neinvazivní vizualizaci a kvantifikaci nepatrných změn in vivo v hloubce ASL18 a chování MCT19,20 pro přímé měření hydratace povrchu plynového kanálku a použití jako včasného indikátoru účinnosti léčby. Naše metoda hodnocení MCT navíc používá částice o průměru 10–35 µm složené z oxidu hlinitého nebo skla s vysokým indexem lomu jako markery MCT viditelné pomocí PB-PCXI21. Obě techniky jsou vhodné pro vizualizaci řady typů částic, včetně MP.
Díky vysokému prostorovému a časovému rozlišení jsou naše techniky analýzy ASL a MCT založené na PB-PCXI velmi vhodné pro zkoumání dynamiky a vzorců chování jednotlivých i objemových částic in vivo, což nám pomáhá porozumět a optimalizovat techniky podávání genů MP. Použitý přístup vychází z našich studií s využitím paprskové linky SPring-8 BL20B2, ve které jsme vizualizovali pohyb tekutiny po podání simulované vektorové dávky do nosních a plicních dýchacích cest myší, abychom pomohli vysvětlit naše nejednotné vzorce genové exprese pozorované v našich studiích s dávkou genového nosiče u zvířat 3,4.
Cílem této studie bylo použít synchrotron PB-PCXI k vizualizaci pohybů série mikročástic (MP) v průdušnici živých krys in vivo. Tyto zobrazovací studie PB-PCXI byly navrženy k testování řady MP, intenzit magnetického pole a umístění s cílem určit jejich vliv na pohyb MP. Předpokládali jsme, že externě aplikované magnetické pole by pomohlo dodanému MP zůstat nebo se přesunout do cílové oblasti. Tyto studie nám také umožnily identifikovat konfigurace magnetů, které maximalizují počet částic zadržených v průdušnici po depozici. V druhé sérii studií jsme se snažili použít tuto optimální konfiguraci k demonstraci transdukčního vzoru, který je výsledkem in vivo podávání LV-MP do dýchacích cest krys, na základě předpokladu, že podávání LV-MP v kontextu cílení na dýchací cesty by vedlo ke zlepšení účinnosti transdukce levé komory.
Všechny studie na zvířatech byly provedeny podle protokolů schválených Univerzitou v Adelaide (M-2019-060 a M-2020-022) a etickou komisí pro synchrotronová zvířata SPring-8. Experimenty byly provedeny podle pokynů ARRIVE.
Veškeré rentgenové zobrazování bylo provedeno na svazku BL20XU na synchrotronu SPring-8 v Japonsku s použitím nastavení podobného tomu, které bylo popsáno dříve21,22. Stručně řečeno, experimentální box byl umístěn 245 m od synchrotronového úložného prstence. Vzdálenost mezi vzorkem a detektorem 0,6 m se používá pro studie zobrazování částic a 0,3 m pro studie zobrazování in vivo pro generování efektů fázového kontrastu. Byla použita energie monochromatického svazku 25 keV. Snímky byly pořízeny pomocí rentgenového převodníku s vysokým rozlišením (SPring-8 BM3) připojeného k sCMOS detektoru. Převodník převádí rentgenové záření na viditelné světlo pomocí 10 µm silného scintilátoru (Gd3Al2Ga3O12), který je poté nasměrován do sCMOS senzoru pomocí mikroskopického objektivu × 10 (NA 0,3). SCMOS detektor byl Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonsko) s velikostí pole 2048 × 2048 pixelů a hrubá velikost pixelu 6,5 × 6,5 µm. Toto nastavení poskytuje efektivní izotropní velikost pixelu 0,51 µm a zorné pole přibližně 1,1 mm × 1,1 mm. Byla zvolena délka expozice 100 ms, aby se maximalizoval poměr signálu k šumu magnetických částic uvnitř i vně dýchacích cest a zároveň minimalizovaly artefakty pohybu vyvolané dýcháním. Pro studie in vivo byla do dráhy rentgenového záření umístěna rychlá rentgenová závěrka, která omezuje dávku záření blokováním rentgenového paprsku mezi expozicemi.
Nosič levé komory (LV) nebyl použit v žádných zobrazovacích studiích SPring-8 PB-PCXI, protože zobrazovací komora BL20XU není certifikována podle úrovně biologické bezpečnosti 2. Místo toho jsme vybrali řadu dobře charakterizovaných mikročipů (MP) od dvou komerčních dodavatelů – pokrývajících řadu velikostí, materiálů, koncentrací železa a aplikací – nejprve abychom pochopili, jak magnetická pole ovlivňují pohyb MP ve skleněných kapilárách a poté v živých dýchacích cestách. na povrchu. Velikost MP se pohybuje od 0,25 do 18 μm a jsou vyrobeny z různých materiálů (viz tabulka 1), ale složení každého vzorku, včetně velikosti magnetických částic v MP, není známo. Na základě našich rozsáhlých studií MCT 19, 20, 21, 23, 24 očekáváme, že na povrchu tracheálních dýchacích cest lze pozorovat MP o velikosti až 5 μm, například odečtením po sobě jdoucích snímků pro lepší viditelnost pohybu MP. Jeden MP o velikosti 0,25 μm je menší než rozlišení zobrazovacího zařízení, ale očekává se, že PB-PCXI detekuje jejich objemový kontrast a pohyb povrchové tekutiny, na které jsou po nanesení uloženy.
Vzorky pro každý MP v tabulce 1 byly připraveny ve skleněných kapilárách o objemu 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) s vnitřním průměrem 0,63 mm. Korpuskulární částice jsou k dispozici ve vodě, zatímco částice CombiMag jsou k dispozici v patentované kapalině výrobce. Každá zkumavka je z poloviny naplněna kapalinou (přibližně 11 μl) a umístěna na držák vzorku (viz obrázek 1). Skleněné kapiláry byly umístěny vodorovně na stolku vzorku v zobrazovací krabici a umístěny podél okrajů kapaliny. Magnet o průměru 19 mm (délka 28 mm) z niklového pláště, kovu vzácných zemin, neodymu, železa, bóru (NdFeB) (N35, kat. č. LM1652, Jaycar Electronics, Austrálie) o zbytkové magnetizaci 1,17 Tesla byl připojen k samostatnému posuvnému stolku, aby se dosáhlo dálkové změny jeho polohy během zobrazování. Pořizování rentgenového snímku začíná, když je magnet umístěn přibližně 30 mm nad vzorkem, a snímky jsou pořizovány rychlostí 4 snímků za sekundu. Během zobrazování byl magnet přiblížen k vzorku. skleněnou kapilární trubici (ve vzdálenosti asi 1 mm) a poté posunutou podél trubice za účelem posouzení vlivu intenzity pole a polohy.
Zobrazovací sestava in vitro obsahující MP vzorky ve skleněných kapilárách na stole pro xy translaci vzorku. Dráha rentgenového paprsku je označena červenou přerušovanou čarou.
Jakmile byla stanovena viditelnost mikroproteinů in vitro, byla podskupina z nich testována in vivo na divokých samicích albínských potkanů ​​Wistar (ve věku ~12 týdnů, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidinu (Domitor®, Zenoaq, Japonsko), 3,2 mg/kg midazolamu (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonsko) a 4 mg/kg butorfanolu (Vetorphale®, Meiji Seika). Potkani byli anestetizováni směsí (Pharma), Japonsko) intraperitoneální injekcí. Po anestezii byli připraveni k zobrazování odstraněním srsti kolem průdušnice, zavedením endotracheální trubice (ET; 16 Ga iv kanyla, Terumo BCT) a imobilizací v poloze vleže na zakázkové zobrazovací desce obsahující termosáček pro udržení tělesné teploty 22. Zobrazovací deska byla poté připevněna k posuvnému stolku pro vzorky v zobrazovacím boxu pod mírným úhlem, aby se průdušnice na rentgenovém snímku horizontálně zarovnala, jak je znázorněno na obrázku. 2a.
(a) Zobrazovací nastavení in vivo v zobrazovacím boxu SPring-8, dráha rentgenového paprsku je vyznačena červenou přerušovanou čarou. (b,c) Lokalizace magnetu na průdušnici byla provedena dálkově pomocí dvou ortogonálně umístěných IP kamer. Na levé straně obrazu je vidět drátěná smyčka držící hlavici a zaváděcí kanyla zavedená v ET trubici.
Dálkově ovládaný systém injekční pumpy (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) s použitím 100 μl skleněné injekční stříkačky byl připojen k hadičce PE10 (vnější průměr 0,61 mm, vnitřní průměr 0,28 mm) pomocí jehly 30 Ga. Zkumavku označte, abyste zajistili, že je hrot při zavádění endotracheální trubice ve správné poloze v trachei. Pomocí mikropumpy byl píst stříkačky vytažen, zatímco hrot zkumavky byl ponořen do vzorku MP, který měl být dodán. Naplněná podávací trubice byla poté zavedena do endotracheální trubice, přičemž hrot byl umístěn v nejsilnější části očekávaného aplikovaného magnetického pole. Pořízení obrazu bylo řízeno pomocí detektoru dýchání připojeného k našemu časovacímu boxu na bázi Arduina a všechny signály (např. teplota, dýchání, otevírání/zavírání závěrky a pořízení obrazu) byly zaznamenávány pomocí Powerlab a LabChart (AD Instruments, Sydney, Austrálie) 22. Při zobrazování Když byl kryt nepřístupný, byly dvě IP kamery (Panasonic BB-SC382) umístěny v úhlu přibližně 90° k sobě a byly použity k monitorování polohy magnetu relativně. do průdušnice během zobrazování (obr. 2b,c). Pro minimalizaci artefaktů pohybu byl během plató proudění na konci dechu pořízen jeden snímek na dech.
Magnet je připojen k druhému stupni, který lze umístit vzdáleně zvenčí zobrazovacího pouzdra. Byly testovány různé polohy a konfigurace magnetu, včetně: montáže v úhlu přibližně 30° nad průdušnicí (konfigurace znázorněné na obrázcích 2a a 3a); jeden magnet nad zvířetem a druhý pod ním, s póly nastavenými na přitahování (obrázek 3b); jeden magnet nad zvířetem a druhý pod ním, s póly nastavenými na odpuzování (obrázek 3c); a jeden magnet nad a kolmo k průdušnici (obrázek 3d). Jakmile jsou zvíře a magnet nakonfigurovány a testovaný MP je vložen do injekční pumpy, aplikujte dávku 50 μl rychlostí 4 μl/s během snímání snímků. Magnet se poté pohybuje tam a zpět podél nebo laterálně přes průdušnici a zároveň pokračuje v snímání snímků.
Konfigurace magnetu pro zobrazování in vivo (a) jeden magnet nad průdušnicí v úhlu přibližně 30°, (b) dva magnety nastavené na přitahování, (c) dva magnety nastavené na odpuzování, (d) jeden magnet nad průdušnicí a kolmo k ní. Pozorovatel se díval dolů od úst do plic skrz průdušnici a rentgenový paprsek procházel levou stranou krysy a vycházel na pravé straně. Magnet se pohyboval buď podél dýchacích cest, nebo doleva a doprava nad průdušnicí ve směru rentgenového paprsku.
Také jsme se snažili zjistit viditelnost a chování částic v dýchacích cestách za nepřítomnosti rušivého dýchání a srdečního rytmu. Proto byla na konci zobrazovacího období zvířata humánně utracena z důvodu předávkování pentobarbitalem (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg i.p.). Některá zvířata byla ponechána na zobrazovací platformě a po zastavení dýchání a srdeční činnosti byl zobrazovací proces opakován, přičemž pokud na povrchu dýchacích cest nebyl žádný MP viditelný, byla přidána další dávka MP.
Získané snímky byly korigovány v plochém a tmavém poli a poté sestaveny do filmu (20 snímků za sekundu; 15–25 × normální rychlost v závislosti na frekvenci dýchání) pomocí vlastního skriptu napsaného v MATLABu (R2020a, The Mathworks).
Všechny studie podávání LV genových vektorů byly provedeny v Laboratorním výzkumném zařízení pro zvířata na Univerzitě v Adelaide a jejich cílem bylo využít výsledky experimentu SPring-8 k posouzení, zda podávání LV-MP v přítomnosti magnetického pole může zvýšit přenos genů in vivo. Pro posouzení účinků MP a magnetického pole byly léčeny dvě skupiny zvířat: jedna skupina dostávala LV-MP s umístěným magnetem a druhá skupina dostávala kontrolní skupinu s LV-MP bez magnetu.
Genové vektory LV byly generovány za použití dříve popsaných metod 25, 26. Vektor LacZ exprimuje gen beta-galaktosidázy lokalizovaný v jádře, řízený konstitutivním promotorem MPSV (LV-LacZ), který produkuje modrý reakční produkt v transdukovaných buňkách, viditelný v čelních plochách plicní tkáně a tkáňových řezech. Titrace byla provedena v buněčných kulturách ručním spočítáním počtu LacZ pozitivních buněk pomocí hemocytometru za účelem výpočtu titru v TU/ml. Nosiče jsou kryokonzervovány při -80 °C, před použitím rozmrazeny a navázány na CombiMag smícháním v poměru 1:1 a inkubací na ledu po dobu alespoň 30 minut před podáním.
Normální krysy kmene Sprague Dawley (n = 3/skupina, ~2-3) byly anestetizovány intraperitoneálně směsí 0,4 mg/kg medetomidinu (Domitor, Ilium, Austrálie) a 60 mg/kg ketaminu (Ilium, Austrálie) ve věku jednoho měsíce ip injekcí a nechirurgickou orální kanylací pomocí 16Ga iv kanyly. Aby se zajistilo, že tkáň tracheálních dýchacích cest obdrží transdukci levé komory (LV), byly podmíněny pomocí našeho dříve popsaného protokolu mechanické perturbace, při kterém byl povrch tracheálních dýchacích cest axiálně třen drátěným košíkem (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Tracheální podání LV-MP bylo poté provedeno v biologicky bezpečné skříni přibližně 10 minut po perturbaci.
Magnetické pole použité v tomto experimentu bylo konfigurováno podobným způsobem jako v in vivo rentgenové zobrazovací studii, přičemž stejné magnety byly drženy nad průdušnicí pomocí destilačních stentových klipů (obrázek 4). Objem 50 μl (2 × 25 μl alikvotní podíly) LV-MP byl dodán do průdušnice (n = 3 zvířata) pomocí pipety s gelovou špičkou, jak bylo popsáno dříve. Kontrolní skupina (n = 3 zvířata) dostala stejné LV-MP bez použití magnetu. Po dokončení infuze byla kanyla vyjmuta z ET trubice a zvíře bylo extubováno. Magnet zůstal na místě 10 minut, poté byl odstraněn. Krysy dostaly subkutánní dávku meloxicamu (1 ml/kg) (Ilium, Austrálie) a následně byla provedena reverze anestezie ip injekcí 1 mg/kg atipamazol hydrochloridu (Antisedan, Zoetis, Austrálie). Krysy byly udržovány v teple a monitorovány až do úplného zotavení z anestezie.
Zaváděcí zařízení LV-MP v biologicky bezpečné skříni. Světle šedý Luerův náboj ET trubice je vidět vyčnívající z ústí a gelový hrot pipety zobrazený na obrázku se zavádí ET trubicí do požadované hloubky do průdušnice.
Jeden týden po dávkování LV-MP byla zvířata humánně utracena inhalací 100% CO2 a exprese LacZ byla hodnocena pomocí naší standardní léčby X-gal. Byly odstraněny tři kaudální nejvíce chrupavčité prstence, aby se zajistilo, že do analýzy nebude zahrnuto žádné mechanické poškození nebo zadržování tekutin z umístění endotracheální trubice. Každá trachea byla podélně rozříznuta, aby se vytvořily dvě poloviny pro analýzu, a byly umístěny do misky obsahující silikonovou pryž (Sylgard, Dow Inc) pomocí jehly Minutien (Fine Science Tools) pro vizualizaci luminálního povrchu. Distribuce a vzorec transdukovaných buněk byly potvrzeny frontální fotografií pomocí mikroskopu Nikon (SMZ1500) s kamerou DigiLite a softwarem TCapture (Tucsen Photonics, Čína). Snímky byly pořízeny při 20násobném zvětšení (včetně nejvyššího nastavení pro celou šířku trachey), přičemž celá délka trachey byla postupně zobrazována, přičemž bylo zajištěno dostatečné překrytí mezi jednotlivými snímky, aby bylo možné snímky „sešít“. Snímky z každé trachey byly poté sestaveny do jednoho kompozitní snímek pomocí editoru Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) s využitím algoritmu planárního pohybu. Expresní oblasti LacZ v kompozitních snímcích trachey od každého zvířete byly kvantifikovány pomocí automatizovaného skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), jak bylo popsáno dříve, s použitím nastavení 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 a Value < 0,7. Obkreslením kontur tkáně byla v programu GIMP v2.10.24 pro každý kompozitní snímek ručně vygenerována maska, aby se identifikovala oblast tkáně a zabránilo se falešným detekcím z vnějšku tracheální tkáně. Obarvené oblasti ze všech kompozitních snímků od každého zvířete byly sečteny, aby se vytvořila celková obarvená plocha pro dané zvíře. Obarvená oblast byla poté vydělena celkovou plochou masky, aby se vytvořila normalizovaná plocha.
Každá trachea byla zalita do parafínu a byly nařezány 5 μm řezy. Řezy byly kontrastně barveny neutrální rychlou červení po dobu 5 minut a snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Nikon Eclipse E400, kamery DS-Fi3 a softwaru NIS element capture (verze 5.20.00).
Všechny statistické analýzy byly provedeny v programu GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistická významnost byla stanovena na p ≤ 0,05. Normalita byla ověřena pomocí Shapiro-Wilkova testu a rozdíly v barvení LacZ byly posouzeny pomocí nepárového t-testu.
Šest MP popsaných v tabulce 1 bylo zkoumáno pomocí PCXI a jejich viditelnost je popsána v tabulce 2. Dva polystyrenové MP (MP1 a MP2; 18 μm a 0,25 μm) nebyly pod PCXI viditelné, ale zbytek vzorků byl identifikovatelný (příklady jsou uvedeny na obrázku 5). MP3 a MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm a 0,9 μm) jsou slabě viditelné. Přestože MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) obsahuje jedny z nejmenších testovaných částic, byl nejvýraznější. Produkt CombiMag MP6 je obtížné spatřit. Ve všech případech byla naše schopnost detekovat MP výrazně zvýšena posunem magnetu tam a zpět rovnoběžně s kapilárou. Když se magnety vzdálily od kapiláry, částice se natahovaly v dlouhých řetězcích, ale jak se magnety přibližovaly a síla magnetického pole se zvyšovala, řetězce částic se zkracovaly, jak částice migrovaly směrem k hornímu povrchu kapiláry (viz doplňkové video S1: MP4), čímž se zvyšovaly... Hustota částic na povrchu. Naopak, když je magnet odstraněn z kapiláry, síla pole se sníží a mikročástice se přeskupí do dlouhých řetězců vyčnívajících z horního povrchu kapiláry (viz doplňkové video S2:MP4). Poté, co se magnet přestane pohybovat, částice se po dosažení rovnovážné polohy ještě krátkou dobu pohybují. Jak se mikročástice pohybuje směrem k hornímu povrchu kapiláry a od něj, magnetické částice obvykle táhnou nečistoty tekutinou.
Viditelnost MP pod PCXI se mezi vzorky výrazně liší. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6. Všechny zde uvedené snímky byly pořízeny s magnetem umístěným přibližně 10 mm přímo nad kapilárou. Zdánlivé velké kruhy jsou vzduchové bubliny zachycené v kapilárách, které jasně ukazují černobílé okrajové prvky fázového kontrastu. Červený rámeček obsahuje zvětšení zvyšující kontrast. Všimněte si, že průměry schémat magnetů na všech obrázcích nejsou v měřítku a jsou přibližně 100krát větší, než je znázorněno.
Jak se magnet posouvá doleva a doprava podél horní části kapiláry, úhel MP řetězce se mění tak, aby se shodoval s magnetem (viz obrázek 6), čímž se vymezují siločáry magnetického pole. U MP3-5, poté, co tětiva dosáhne prahového úhlu, jsou částice taženy podél horního povrchu kapiláry. To často vede ke shlukování MP do větších skupin blízko místa, kde je magnetické pole nejsilnější (viz doplňkové video S3:MP5). To je také obzvláště patrné při zobrazování v blízkosti konce kapiláry, což způsobuje agregaci a koncentraci MP na rozhraní kapalina-vzduch. Částice v MP6, které bylo obtížnější rozeznat než v MP3-5, nebyly taženy, když se magnet pohyboval podél kapiláry, ale MP řetězce se disociovaly a částice zůstaly v zorném poli (viz doplňkové video S4:MP6). V některých případech, když bylo aplikované magnetické pole sníženo pohybem magnetu do velké vzdálenosti od místa zobrazování, všechny zbývající MP pomalu klesaly gravitací na spodní povrch trubice, zatímco zůstaly v řetězci (viz doplňkové video S5: MP3).
Úhel MP řetězce se mění, jak se magnet posouvá doprava nad kapiláru. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6. Červený rámeček obsahuje zvětšení zvyšující kontrast. Doplňující videa jsou informativní, protože odhalují důležité informace o struktuře částic a dynamické informace, které nelze na těchto statických snímcích vizualizovat.
Naše testy ukázaly, že pomalý pohyb magnetu tam a zpět podél trachey usnadňuje vizualizaci MP v kontextu komplexního pohybu in vivo. Testování in vivo nebylo provedeno, protože polystyrenové kuličky (MP1 a MP2) nebyly v kapiláře viditelné. Každý ze zbývajících čtyř MP byl testován in vivo s dlouhou osou magnetu konfigurovanou nad tracheou v úhlu přibližně 30° k vertikále (viz obrázky 2b a 3a), protože to vedlo k delším řetězcům MP a bylo to účinnější než konfigurace ukončená magnetem. MP3, MP4 a MP6 nebyly detekovány v trachei žádných živých zvířat. Při zobrazení dýchacích cest potkanů ​​po humánním usmrcení zvířat zůstaly částice neviditelné, i když byl přidán další objem pomocí injekční pumpy. MP5 měl nejvyšší obsah oxidu železa a byl jedinou viditelnou částicí, a proto byl použit k posouzení a charakterizaci chování MP in vivo.
Umístění magnetu nad průdušnici během podávání mikročipů (MP) vedlo ke koncentraci mnoha, ale ne všech, mikročipů v zorném poli. Částice vstupující do průdušnice jsou nejlépe pozorovatelné u humánně usmrcených zvířat. Obrázek 7 a doplňkové video S6: MP5 ukazuje rychlé magnetické zachycení a uspořádání částic na povrchu ventrální průdušnice, což naznačuje, že mikročipy lze nasměrovat do požadovaných oblastí průdušnice. Při hledání distálněji podél průdušnice po podání MP byly některé mikročipy nalezeny blíže k karině, což naznačuje, že síla magnetického pole nebyla dostatečná k zachycení a udržení všech mikročipů, protože byly během fluidního procesu dodávány oblastí maximální síly magnetického pole. Nicméně poporodní koncentrace MP byly v okolí zobrazené oblasti vyšší, což naznačuje, že mnoho mikročipů zůstalo v oblastech dýchacích cest, kde byla aplikovaná síla magnetického pole nejvyšší.
Snímky z bodu (a) před a (b) po podání MP5 do průdušnice nedávno utracené krysy s magnetem umístěným přímo nad zobrazovací oblastí. Zobrazená oblast se nachází mezi dvěma chrupavčitými prstenci. Před podáním MP je v dýchacích cestách tekutina. Červený rámeček obsahuje zvětšení zvyšující kontrast. Tyto snímky pocházejí z videa zobrazeného v doplňkovém videu S6:MP5.
Posun magnetu podél průdušnice in vivo způsobil změnu úhlu řetězce mikročástic (MP) na povrchu dýchacích cest podobným způsobem, jaký je pozorován u kapilár (viz obrázek 8 a doplňkové video S7:MP5). V naší studii však nebylo možné MP táhnout po povrchu živých dýchacích cest, jako by to bylo možné u kapilár. V některých případech se řetězec MP prodlužuje, jak se magnet pohybuje doleva a doprava. Zajímavé je, že jsme také zjistili, že řetězec částic zřejmě mění hloubku povrchové vrstvy tekutiny, když se magnet pohybuje podélně podél průdušnice, a roztahuje se, když se magnet pohybuje přímo nad hlavou a řetězec částic se otáčí do svislé polohy (viz doplňkové video S7). : MP5 v 0:09, vpravo dole). Charakteristický vzorec pohybu se změnil, když byl magnet posunut přes horní část průdušnice laterálně (tj. doleva nebo doprava od zvířete, spíše než podél délky průdušnice). Částice byly při pohybu stále jasně viditelné, ale když byl magnet z průdušnice odstraněn, staly se viditelné špičky řetězců částic (viz doplňkové video S8:MP5, počínaje 0:08). To je v souladu s chováním MP, které jsme pozorovali pod působením aplikovaného magnetického pole ve skleněné kapiláře.
Příklady obrázků zobrazujících MP5 v průdušnici živé anestetizované krysy. (a) Magnet se používá k pořízení snímků nad a vlevo od průdušnice, poté (b) po posunutí magnetu doprava. Červený rámeček obsahuje zvětšení zvyšující kontrast. Tyto snímky pocházejí z videa zobrazeného v doplňkovém videu S7:MP5.
Když byly dva póly konfigurovány v severojižní orientaci nad a pod průdušnicí (tj. přitahovaly se; obr. 3b), MP tětivy se jevily delší a byly umístěny na boční stěně průdušnice, nikoli na dorzálním povrchu průdušnice (viz doplňkové video S9:MP5). Vysoké koncentrace částic na jednom místě (tj. na dorzálním povrchu průdušnice) však nebyly po podání tekutiny detekovány při použití zařízení s dvojitým magnetem, což se obvykle stává při použití zařízení s jedním magnetem. Poté, když byl jeden magnet konfigurován tak, aby odpuzoval póly v opačném pořadí (obr. 3c), počet částic viditelných v zorném poli se po podání nezdálo, že by se zvýšil. Nastavení obou konfigurací s dvojitým magnetem je náročné kvůli vysokým intenzitám magnetického pole, které magnety přitahuje, respektive tlačí. Nastavení bylo poté změněno na jeden magnet rovnoběžný s dýchacími cestami, ale procházející dýchacími cestami pod úhlem 90 stupňů, takže siločáry protínaly stěnu průdušnice ortogonálně (obr. 3d), což je orientace navržená k určení, zda lze pozorovat agregaci částic na boční stěně. V této konfiguraci však... Nebyl zjištěn žádný identifikovatelný pohyb akumulace MP ani pohyb magnetu. Na základě všech těchto výsledků byla pro studie genových nosičů in vivo zvolena konfigurace s jedním magnetem a 30stupňovou orientací (obrázek 3a).
Když bylo zvíře opakovaně zobrazováno bezprostředně po humánním usmrcení, absence rušivého pohybu tkáně znamenala, že v jasném interchondrálním poli bylo možné rozeznat jemnější a kratší čáry částic, „vibrující“ v souladu s translačním pohybem magnetu. Nicméně stále nelze jasně vidět přítomnost a pohyb částic MP6.
Titr LV-LacZ byl 1,8 × 108 TU/ml a po smíchání s CombiMag MP (MP6) v poměru 1:1 zvířata dostala 50 μl tracheální dávku 9 × 107 TU/ml LV vehikula (tj. 4,5 × 106 TU/krysa). V těchto studiích jsme magnet během porodu namísto posunu magnetu fixovali v jedné poloze, abychom zjistili, zda by transdukce levé komory (a) mohla být zlepšena ve srovnání s vektorovým podáním bez magnetického pole a zda by mohla být (b) zaostřena. Buňky dýchacích cest jsou transdukovány do magnetických cílových oblastí horních cest dýchacích.
Přítomnost magnetů a použití CombiMagu v kombinaci s LV vektory se nezdálo mít nepříznivé účinky na zdraví zvířat, stejně jako náš standardní protokol pro podávání LV vektorů. Frontální snímky tracheální oblasti vystavené mechanickému působení (doplňkový obrázek 1) ukázaly, že ve skupině zvířat léčených LV-MP byly za přítomnosti magnetu významně vyšší hladiny transdukce (obr. 9a). V kontrolní skupině bylo přítomno pouze malé množství modrého barvení LacZ (obr. 9b). Kvantifikace normalizovaných oblastí obarvených X-Gal ukázala, že podávání LV-MP v přítomnosti magnetického pole vedlo k přibližně 6násobnému zlepšení (obr. 9c).
Příklad kompozitních snímků znázorňujících tracheální transdukci pomocí LV-MP (a) za přítomnosti magnetického pole a (b) za nepřítomnosti magnetu. (c) Statisticky významné zlepšení normalizované plochy transdukce LacZ v trachei při použití magnetu (*p = 0,029, t-test, n = 3 na skupinu, průměr ± SEM).
Neutrálně rychle červeně obarvené řezy (příklad znázorněný na doplňkovém obr. 2) vykazovaly buňky obarvené LacZ přítomné v podobném vzoru a umístění, jak bylo popsáno dříve.
Klíčovou výzvou pro genovou terapii dýchacích cest zůstává přesná lokalizace nosičových částic do oblastí zájmu a dosažení vysoké úrovně účinnosti transdukce v pohybujících se plicích za přítomnosti proudění vzduchu a aktivního odstraňování hlenu. U nosičů levé komory (LV) určených k léčbě onemocnění dýchacích cest s cystickou fibrózou (CF) bylo prodloužení doby setrvání nosičových částic ve vodivých dýchacích cestách dosud nedosažitelným cílem. Jak zdůraznili Castellani a kol., použití magnetických polí ke zlepšení transdukce má ve srovnání s jinými metodami podávání genů, jako je elektroporace, výhody, protože může kombinovat jednoduchost, cenovou efektivitu, lokalizaci podání, zvýšenou účinnost a kratší inkubační doby a případně i menší dávku nosiče10. Nicméně in vivo depozice a chování magnetických částic v dýchacích cestách pod vlivem vnějších magnetických sil nebyly nikdy popsány, ani nebyla in vivo prokázána proveditelnost této metody pro zvýšení hladin genové exprese v intaktních živých dýchacích cestách.
Naše synchrotronové PCXI experimenty in vitro ukázaly, že všechny testované částice, s výjimkou polystyrenového MP, byly viditelné v použitém zobrazovacím nastavení. V přítomnosti magnetického pole tvoří MP řetězce, jejichž délky souvisí s typem částice a intenzitou magnetického pole (tj. blízkostí a pohybem magnetu). Jak je znázorněno na obrázku 10, řetězce, které pozorujeme, vznikají v důsledku zmagnetizace každé jednotlivé částice a indukce vlastního lokálního magnetického pole. Tato oddělená pole způsobují agregaci a spojování dalších podobných částic se skupinovými pohyby podobnými řetězcům v důsledku lokálních sil z lokálních přitažlivých a odpudivých sil ostatních částic.
Schéma znázorňující (a,b) částicové sledy generované uvnitř kapilár naplněných tekutinou a (c,d) vzduchem naplněné průdušnice. Všimněte si, že kapiláry a průdušnice nejsou nakresleny v měřítku. Panel (a) také obsahuje popis MP, který obsahuje částice Fe3O4 uspořádané do řetězců.
Když byl magnet přesunut nad kapiláru, úhel řetězce částic dosáhl kritické prahové hodnoty pro MP3-5 obsahující Fe3O4, po které řetězec částic již nezůstal v původní poloze, ale pohyboval se po povrchu do nové polohy. magnet. K tomuto efektu pravděpodobně dochází, protože povrch skleněné kapiláry je dostatečně hladký, aby umožnil tento pohyb. Je zajímavé, že MP6 (CombiMag) se takto nechoval, pravděpodobně proto, že částice byly menší, měly odlišné povlaky nebo povrchové náboje, nebo proto, že patentovaná nosná kapalina ovlivnila jejich schopnost pohybu. Kontrast obrazu částic CombiMag je také slabší, což naznačuje, že kapalina a částice mohou mít podobné hustoty, a proto se k sobě snadno nepohybují. Částice se mohou také zaseknout, pokud se magnet pohybuje příliš rychle, což naznačuje, že síla magnetického pole nemůže vždy překonat tření mezi částicemi v kapalině, což naznačuje, že možná není překvapivé, že síla magnetického pole a vzdálenost mezi magnetem a cílovou oblastí jsou velmi důležité. Dohromady tyto výsledky také naznačují, že i když magnety dokáží zachytit mnoho MP, které proudí cílovou oblastí, je nepravděpodobné, že by se na magnety dalo spolehnout, že se budou pohybovat. Částice CombiMag podél povrchu průdušnice. Proto jsme dospěli k závěru, že studie in vivo LV-MP by měly využívat statická magnetická pole k fyzickému cílení na specifické oblasti dýchacích cest.
Když jsou částice dodávány do těla, je obtížné je identifikovat v kontextu složitého pohybu tělesné tkáně, ale schopnost jejich detekce byla zvýšena horizontálním posunem magnetu nad průdušnicí, aby se „pohybovaly“ mikrotubulární vlákna. Ačkoli je živé zobrazování možné, je snazší rozeznat pohyb částic, jakmile je zvíře humánně usmrceno. Koncentrace mikrotubulárního vlákna byly obecně nejvyšší v tomto místě, když byl magnet umístěn nad zobrazovací oblastí, ačkoli některé částice se obvykle nacházely dále podél průdušnice. Na rozdíl od studií in vitro nelze částice táhnout podél průdušnice posunem magnetu. Toto zjištění je v souladu s tím, jak hlen, který pokrývá povrch průdušnice, obvykle zpracovává vdechnuté částice, zachycuje je v hlenu a následně je odstraňuje mechanismem mukociliární clearance.
Předpokládali jsme, že použití magnetů pro přitahování nad a pod průdušnicí (obr. 3b) by mohlo vést k rovnoměrnějšímu magnetickému poli, spíše než k magnetickému poli, které je vysoce koncentrované v jednom bodě, což by potenciálně vedlo k rovnoměrnějšímu rozložení částic. Naše předběžná studie však nenalezla jasné důkazy, které by tuto hypotézu podpořily. Podobně konfigurace dvojice magnetů pro odpuzování (obr. 3c) nevedla k větší depozici částic v zobrazené oblasti. Tato dvě zjištění ukazují, že nastavení s dvojitým magnetem významně nezlepšuje lokální kontrolu cílení MP a že výsledné silné magnetické síly je obtížné konfigurovat, což tento přístup činí méně praktickým. Podobně orientace magnetu nad a skrz průdušnici (obr. 3d) také nezvýšila počet částic zadržených v zobrazené oblasti. Některé z těchto alternativních konfigurací nemusí být úspěšné, protože vedou k nižším intenzitám magnetického pole v oblasti depozice. Proto je konfigurace s jedním 30stupňovým magnetem (obr. 3a) považována za nejjednodušší a nejúčinnější metodu pro testování in vivo.
Studie LV-MP ukázala, že když byly vektory LV kombinovány s CombiMag a dodány po fyzické perturbaci v přítomnosti magnetického pole, hladiny transdukce byly v trachei významně zvýšeny ve srovnání s kontrolami. Na základě synchrotronových zobrazovacích studií a výsledků LacZ bylo magnetické pole zřejmě schopno zachovat levou komoru (LV) v trachei a snížit počet vektorových částic, které okamžitě pronikly hluboko do plic. Takové zlepšení cílení může vést k vyšší účinnosti a zároveň ke snížení dodaných titrů, transdukce mimo cíl, zánětlivých a imunitních vedlejších účinků a nákladů na genové nosiče. Důležité je, že podle výrobce lze CombiMag použít ve spojení s jinými metodami genového přenosu, včetně jiných virových vektorů (jako je AAV) a nukleových kyselin.