Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा CSS को लागि सीमित समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अद्यावधिक गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड बन्द गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट प्रदर्शन गर्नेछौं।
सिस्टिक फाइब्रोसिस फोक्सोको रोगको उपचारको लागि जीन भेक्टरहरूले सञ्चालन गर्ने वायुमार्गहरूलाई लक्षित गर्नुपर्छ किनभने परिधीय फोक्सो ट्रान्सडक्सनले उपचारात्मक लाभ प्रदान गर्दैन।भाइरल ट्रान्सडक्सन दक्षता प्रत्यक्ष रूपमा भेक्टर निवास समयसँग सम्बन्धित छ।यद्यपि, जीन वाहकहरू जस्ता डेलिभरी तरल पदार्थहरू स्वाभाविक रूपमा प्रेरणाको समयमा एल्भियोलीमा फैलिन्छन्, र कुनै पनि रूपका चिकित्सीय कणहरू म्यूकोसिलरी ट्रान्सपोर्टद्वारा द्रुत रूपमा सफा गरिन्छन्।वायुमार्गमा जीन वाहकहरूको निवास समय लम्ब्याउनु महत्त्वपूर्ण छ तर प्राप्त गर्न गाह्रो छ।जीन वाहक-संयुग्मित चुम्बकीय कणहरू जुन वायुमार्गको सतहमा निर्देशित गर्न सकिन्छ क्षेत्रीय लक्ष्यीकरण सुधार गर्न सक्छ।इन भिभो भिजुअलाइजेशनको चुनौतीहरूको कारण, लागू गरिएको चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा वायुमार्गको सतहमा यस्ता साना चुम्बकीय कणहरूको व्यवहारलाई राम्रोसँग बुझिएको छैन।यस अध्ययनको उद्देश्य एनेस्थेटाइज्ड मुसाको श्वासनलीमा चुम्बकीय कणहरूको श्रृंखलाको इन भिभो गतिलाई कल्पना गर्न सिंक्रोट्रोन इमेजिङ प्रयोग गर्नु थियो ताकि भिभोमा व्यक्तिगत र बल्क कण व्यवहारको गतिशीलता र ढाँचाहरू जाँच गर्न सकियोस्।त्यसपछि हामीले चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा लेन्टीभाइरल चुम्बकीय कणहरूको डेलिभरीले मुसामा ट्रान्सडक्सन दक्षता बढाउँछ कि गर्दैन भनेर पनि मूल्याङ्कन गर्यौं। श्वासनलिका।सिंक्रोट्रोन एक्स-रे इमेजिङले भिट्रो र इन भिभोमा स्थिर र गतिशील चुम्बकीय क्षेत्रहरूमा चुम्बकीय कणहरूको व्यवहार प्रकट गर्दछ। चुम्बकहरूले जीवित वायुमार्गको सतहमा कणहरूलाई सजिलै तान्न सकिँदैन, तर ढुवानीको समयमा, निक्षेपहरू दृश्य क्षेत्रमा केन्द्रित हुन्छन् जहाँ चुम्बकीय क्षेत्र सबैभन्दा बलियो हुन्छ। चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा लेन्टिभाइरल चुम्बकीय कणहरू डेलिभर गर्दा ट्रान्सडक्सन दक्षता पनि छ गुणा बढेको थियो। सँगै, यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि लेन्टिभाइरल चुम्बकीय कणहरू र चुम्बकीय क्षेत्रहरू जीन भेक्टर लक्ष्यीकरण सुधार गर्न र भिभोमा वायुमार्ग सञ्चालन गर्ने ट्रान्सडक्सन स्तर बढाउन मूल्यवान दृष्टिकोण हुन सक्छन्।
सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) CF ट्रान्समेम्ब्रेन कन्डक्टेन्स रेगुलेटर (CFTR) भनिने एकल जीनमा भिन्नताको कारणले हुन्छ। CFTR प्रोटीन एक आयन च्यानल हो जुन शरीरभरि धेरै उपकला कोशिकाहरूमा हुन्छ, जसमा CF रोगजननको प्रमुख साइट, कन्डक्टिङ एयरवेज समावेश छ। CFTR दोषहरूले असामान्य पानी परिवहन निम्त्याउँछ, वायुमार्गको सतहलाई निर्जलीकरण गर्छ र वायुमार्गको सतह तरल (ASL) तहको गहिराई घटाउँछ। यसले वायुमार्गबाट ​​सास लिइएका कणहरू र रोगजनकहरू सफा गर्न म्यूकोसिलरी ट्रान्सपोर्ट (MCT) प्रणालीको क्षमतालाई पनि बिगार्छ। हाम्रो लक्ष्य CFTR जीनको सही प्रतिलिपि प्रदान गर्न र ASL, MCT, र फोक्सोको स्वास्थ्य सुधार गर्न लेन्टीभाइरल (LV) जीन थेरापी विकास गर्नु हो, र vivo1 मा यी प्यारामिटरहरू मापन गर्न सक्षम नयाँ प्रविधिहरू विकास गर्न जारी राख्नु हो।
LV भेक्टरहरू CF एयरवे जीन थेरापीका लागि अग्रणी उम्मेदवारहरू मध्ये एक हुन्, मुख्यतया किनभने तिनीहरूले स्थायी रूपमा वायुमार्गको बेसल कोषहरू (वायुमार्ग स्टेम कोषहरू) मा चिकित्सीय जीनलाई एकीकृत गर्न सक्छन्। यो महत्त्वपूर्ण छ किनभने तिनीहरूले कार्यात्मक जीन-सुधार गरिएको CF-सम्बन्धित वायुमार्ग सतह कोषहरूमा भिन्नता राखेर सामान्य हाइड्रेशन र म्यूकस क्लियरेन्स पुनर्स्थापित गर्न सक्छन्, जसले गर्दा जीवनभर फाइदा हुन्छ। LV भेक्टरहरू सञ्चालन गर्ने वायुमार्ग विरुद्ध निर्देशित हुनुपर्छ, किनकि यो त्यहींबाट CF फोक्सोको रोग सुरु हुन्छ। भेक्टरको फोक्सोमा गहिरो डेलिभरीले वायुकोशीय ट्रान्सडक्सनको परिणाम हुन सक्छ, तर CF मा यसको कुनै चिकित्सीय लाभ छैन। यद्यपि, जीन वाहकहरू जस्ता तरल पदार्थहरू प्रसव 3,4 पछि प्रेरणामा स्वाभाविक रूपमा अल्भियोलीमा सर्छन् र उपचारात्मक कणहरू MCT द्वारा मौखिक गुहामा द्रुत रूपमा सफा गरिन्छ। LV ट्रान्सडक्सन दक्षता सेलुलर अपटेकलाई अनुमति दिन लक्षित कोषहरूको छेउमा भेक्टर कति समय रहन्छ भन्ने कुरासँग प्रत्यक्ष रूपमा सम्बन्धित छ - "निवास समय"5 - जुन सामान्य क्षेत्रीय वायुप्रवाह साथै समन्वित कण म्यूकस क्याप्चर र MCT द्वारा सजिलै कम गरिन्छ। CF को लागि, वायुमार्ग भित्र LV को निवास समय लम्ब्याउने क्षमता यस क्षेत्रमा उच्च स्तरको ट्रान्सडक्सन प्राप्त गर्न महत्त्वपूर्ण छ, तर अहिलेसम्म चुनौतीपूर्ण रहेको छ।
यो अवरोध पार गर्न, हामी सुझाव दिन्छौं कि LV चुम्बकीय कणहरू (MPs) ले दुई पूरक तरिकाले मद्दत गर्न सक्छन्। पहिलो, तिनीहरूलाई चुम्बकीय रूपमा वायुमार्गको सतहमा निर्देशित गर्न सकिन्छ जसले लक्ष्यीकरण सुधार गर्न र जीन वाहक कणहरूलाई इच्छित वायुमार्ग क्षेत्रमा बस्न मद्दत गर्दछ; र ASL) कोशिका तह ६ मा सार्न। MPs लाई लक्षित औषधि वितरण सवारी साधनको रूपमा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छ जब तिनीहरू एन्टिबडीहरू, केमोथेराप्यूटिक औषधिहरू, वा अन्य साना अणुहरूसँग बाँध्छन् जुन कोशिका झिल्लीहरूमा संलग्न हुन्छन् वा सान्दर्भिक कोशिका सतह रिसेप्टरहरूमा बाँधिन्छन् र स्थिर बिजुलीको उपस्थितिमा ट्यूमर साइटहरूमा जम्मा हुन्छन्। क्यान्सर उपचारको लागि चुम्बकीय क्षेत्रहरू ७. अन्य "हाइपरथर्मल" प्रविधिहरूले MP हरूलाई दोलन चुम्बकीय क्षेत्रहरूको सम्पर्कमा आउँदा तताउने लक्ष्य राख्छन्, जसले गर्दा ट्युमर कोषहरू नष्ट हुन्छन्। चुम्बकीय स्थानान्तरणको सिद्धान्त, जसमा DNA को कोषहरूमा स्थानान्तरण बढाउन चुम्बकीय क्षेत्रलाई स्थानान्तरण एजेन्टको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, सामान्यतया इन भिट्रोमा गैर-भाइरल र भाइरल जीन भेक्टरहरूको दायरा प्रयोग गरेर प्रयोग गरिन्छ। ट्रान्सड्यूस गर्न गाह्रो सेल लाइनहरूको लागि। LV म्याग्नेटोट्रान्सफेक्शनको प्रभावकारिता स्थापित भएको छ, स्थिर चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा मानव ब्रोन्कियल एपिथेलियल सेल लाइनमा LV-MPs को इन भिट्रो डेलिभरीको साथ, LV भेक्टरको तुलनामा १८६ गुणाले ट्रान्सडक्शन दक्षता बढाउँछ। LV-MP लाई इन भिट्रो CF मोडेलमा पनि लागू गरिएको छ, जहाँ चुम्बकीय स्थानान्तरणले CF थुकको उपस्थितिमा हावा-तरल इन्टरफेस संस्कृतिहरूमा LV ट्रान्सडक्शनलाई २० गुणाले बढायो। यद्यपि, अंगहरूको भिभो म्याग्नेटोट्रान्सफेक्शनले अपेक्षाकृत कम ध्यान पाएको छ र केही जनावरहरूमा मात्र मूल्याङ्कन गरिएको छ। अध्ययनहरू ११,१२,१३,१४,१५, विशेष गरी फोक्सोमा १६,१७। तैपनि, CF फोक्सो थेरापीमा चुम्बकीय संक्रमणको लागि अवसरहरू स्पष्ट छन्। Tan et al. (२०२०) ले भने कि "कुशल चुम्बकीय न्यानोपार्टिकल पल्मोनरी डेलिभरीको प्रमाण-अवधारणा अध्ययनले CF बिरामीहरूमा क्लिनिकल परिणामहरू सुधार गर्न भविष्यको CFTR इनहेलेसन रणनीतिहरूको लागि मार्ग प्रशस्त गर्नेछ"6।
लागू गरिएको चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा वायुमार्गको सतहहरूमा साना चुम्बकीय कणहरूको व्यवहार कल्पना गर्न र अध्ययन गर्न गाह्रो छ, र त्यसैले राम्रोसँग बुझिएको छैन। अन्य अध्ययनहरूमा, हामीले ग्यास नहर सतह हाइड्रेसनलाई प्रत्यक्ष रूपमा मापन गर्न ASL गहिराइ18 र MCT व्यवहार19,20 मा मिनेट इन भिभो परिवर्तनहरूलाई गैर-आक्रामक रूपमा कल्पना गर्न र परिमाण गर्न सिंक्रोट्रोन-प्रसार-आधारित चरण-कन्ट्रास्ट एक्स-रे इमेजिङ (PB-PCXI) विधि विकास गर्यौं र उपचार प्रभावकारिताको प्रारम्भिक सूचकको रूपमा प्रयोग गर्यौं। थप रूपमा, हाम्रो MCT मूल्याङ्कन विधिले PB-PCXI21 प्रयोग गरेर देखिने MCT मार्करहरूको रूपमा एल्युमिना वा उच्च अपवर्तक सूचकांक गिलासबाट बनेको 10-35 µm व्यासका कणहरू प्रयोग गर्दछ। दुबै प्रविधिहरू MP सहित कण प्रकारहरूको दायराको दृश्यावलोकनको लागि उपयुक्त छन्।
यसको उच्च स्थानिय र अस्थायी रिजोल्युसनको कारण, हाम्रो PB-PCXI-आधारित ASL र MCT विश्लेषण प्रविधिहरू MP जीन डेलिभरी प्रविधिहरू बुझ्न र अनुकूलन गर्न मद्दत गर्न भिभोमा एकल र बल्क कण व्यवहारको गतिशीलता र ढाँचाहरूको जाँच गर्न उपयुक्त छन्। हामीले यहाँ प्रयोग गर्ने दृष्टिकोण SPring-8 BL20B2 बीमलाइन प्रयोग गरेर हाम्रो अध्ययनबाट लिइएको हो, जसमा हामीले मुसाको नाक र फुफ्फुसीय वायुमार्गमा नक्कली भेक्टर डोज डेलिभरी पछि तरल पदार्थको चाललाई कल्पना गर्यौं जसले हाम्रो जीन क्यारियर डोज पशु अध्ययन 3,4 मा अवलोकन गरिएको हाम्रो गैर-एकरूप जीन अभिव्यक्ति ढाँचाहरू व्याख्या गर्न मद्दत गर्दछ।
यस अध्ययनको उद्देश्य जीवित मुसाहरूको श्वासनलीमा MPs को श्रृंखलाको इन भिभो चालहरू कल्पना गर्न सिंक्रोट्रोन PB-PCXI प्रयोग गर्नु थियो। यी PB-PCXI इमेजिङ अध्ययनहरू MP गतिमा तिनीहरूको प्रभाव निर्धारण गर्न MPs, चुम्बकीय क्षेत्र शक्तिहरू, र स्थानहरूको दायरा परीक्षण गर्न डिजाइन गरिएको थियो। हामीले परिकल्पना गर्यौं कि बाह्य रूपमा लागू गरिएको चुम्बकीय क्षेत्रले डेलिभर गरिएको MP लाई लक्षित क्षेत्रमा रहन वा सार्न मद्दत गर्नेछ। यी अध्ययनहरूले हामीलाई चुम्बक कन्फिगरेसनहरू पहिचान गर्न पनि अनुमति दियो जसले निक्षेपण पछि श्वासनलीमा राखिएका कणहरूको संख्यालाई अधिकतम बनाउँछ। अध्ययनको दोस्रो श्रृंखलामा, हामीले LV-MPs को इन भिभो डेलिभरीबाट मुसाको वायुमार्गमा परिणामस्वरूप ट्रान्सडक्सन ढाँचा प्रदर्शन गर्न यो इष्टतम कन्फिगरेसन प्रयोग गर्न खोज्यौं, वायुमार्ग लक्ष्यीकरणको सन्दर्भमा LV-MPs को डेलिभरीले LV ट्रान्सडक्सन दक्षतामा सुधार ल्याउने धारणामा आधारित।
सबै पशु अध्ययनहरू एडिलेड विश्वविद्यालय (M-2019-060 र M-2020-022) र SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee द्वारा अनुमोदित प्रोटोकल अनुसार गरिएको थियो। प्रयोगहरू ARRIVE दिशानिर्देशहरू अनुसार गरिएको थियो।
सबै एक्स-रे इमेजिङ जापानको SPring-8 सिंक्रोट्रोनमा BL20XU बीमलाइनमा गरिएको थियो, पहिले वर्णन गरिएको जस्तै सेटअप प्रयोग गरेर21,22। संक्षेपमा, प्रयोगात्मक बक्स सिंक्रोट्रोन भण्डारण रिङबाट 245 मिटर टाढा अवस्थित थियो। चरण कन्ट्रास्ट प्रभावहरू उत्पन्न गर्न कण इमेजिङ अध्ययनहरूको लागि 0.6 मिटरको नमूना-देखि-डिटेक्टर दूरी र इन भिभो इमेजिङ अध्ययनहरूको लागि 0.3 मिटर प्रयोग गरिन्छ।25 keV को मोनोक्रोमेटिक बीम ऊर्जा प्रयोग गरिएको थियो। sCMOS डिटेक्टरसँग जोडिएको उच्च-रिजोल्युसन एक्स-रे कन्भर्टर (SPring-8 BM3) प्रयोग गरेर छविहरू खिचिएका थिए। कन्भर्टरले 10 µm बाक्लो सिन्टिलेटर (Gd3Al2Ga3O12) प्रयोग गरेर एक्स-रेहरूलाई दृश्य प्रकाशमा रूपान्तरण गर्दछ, जुन त्यसपछि × 10 माइक्रोस्कोप उद्देश्य (NA 0.3) प्रयोग गरेर sCMOS सेन्सरमा निर्देशित हुन्छ। sCMOS डिटेक्टर Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, जापान) थियो जसमा २०४८ × २०४८ पिक्सेलको एरे साइज र ६.५ × ६.५ µm को कच्चा पिक्सेल साइज। यो सेटअपले ०.५१ µm को प्रभावकारी आइसोट्रोपिक पिक्सेल साइज र लगभग १.१ मिमी × १.१ मिमी को दृश्य क्षेत्र उत्पादन गर्दछ। श्वास-प्रेरित गति कलाकृतिहरूलाई कम गर्दै वायुमार्ग भित्र र बाहिर चुम्बकीय कणहरूको सिग्नल-टु-नोइज अनुपात अधिकतम बनाउन १०० मिलिसेकेन्डको एक्सपोजर लम्बाइ छनोट गरिएको थियो। इन भिभो अध्ययनहरूको लागि, एक्सपोजरहरू बीच एक्स-रे बीमलाई रोकेर विकिरण खुराक सीमित गर्न एक्स-रे मार्गमा द्रुत एक्स-रे शटर राखिएको थियो।
BL20XU इमेजिङ चेम्बर बायोसेफ्टी लेभल २ प्रमाणित नभएकोले कुनै पनि SPring-8 PB-PCXI इमेजिङ अध्ययनहरूमा LV क्यारियर प्रयोग गरिएको थिएन। यसको सट्टा, हामीले दुई व्यावसायिक आपूर्तिकर्ताहरूबाट राम्रोसँग विशेषता भएका MP हरूको दायरा चयन गर्यौं - आकार, सामग्री, फलामको सांद्रता, र अनुप्रयोगहरूको दायरा समेटेर - पहिले चुम्बकीय क्षेत्रहरूले गिलास केशिकाहरू भित्र MP गतिलाई कसरी असर गर्छ भनेर बुझ्न, र त्यसपछि जीवित वायुमार्गहरूमा। सतहमा।MP हरूको आकार ०.२५ देखि १८ μm सम्म हुन्छ र विभिन्न सामग्रीबाट बनेका हुन्छन् (तालिका १ हेर्नुहोस्), तर MP भित्रका चुम्बकीय कणहरूको आकार सहित प्रत्येक नमूनाको संरचना अज्ञात छ। हाम्रो विस्तृत MCT अध्ययन १९, २०, २१, २३, २४ को आधारमा, हामी अपेक्षा गर्छौं कि ५ μm जति सानो MP हरू श्वासनलीको वायुमार्ग सतहमा देख्न सकिन्छ, उदाहरणका लागि MP गतिको बढेको दृश्यता हेर्न लगातार फ्रेमहरू घटाएर। एकल ०.२५ μm आकारको MP इमेजिङ उपकरणको रिजोल्युसन भन्दा सानो हुन्छ, तर PB-PCXI ले तिनीहरूको भोल्युम कन्ट्रास्ट र निक्षेपण पछि जम्मा गरिएको सतह तरल पदार्थको गति पत्ता लगाउने अपेक्षा गरिएको छ।
तालिका १ मा प्रत्येक MP को लागि नमूनाहरू २० μl गिलास केशिकाहरू (ड्रमन्ड माइक्रोक्याप्स, PA, USA) मा ०.६३ मिमी भित्री व्यास भएको तयार पारिएको थियो। कर्पस्कुलर कणहरू पानीमा उपलब्ध छन्, जबकि CombiMag कणहरू निर्माताको स्वामित्वको तरल पदार्थमा उपलब्ध छन्। प्रत्येक ट्यूब तरल पदार्थले आधा भरिएको छ (लगभग ११ μl) र नमूना होल्डरमा राखिएको छ (चित्र १ हेर्नुहोस्)। गिलास केशिकाहरू क्रमशः इमेजिङ बक्समा नमूना चरणमा तेर्सो रूपमा राखिएको थियो, र तरल पदार्थको किनारहरू राखिएको थियो। १९ मिमी व्यास (२८ मिमी लामो) निकल शेल दुर्लभ पृथ्वी नियोडिमियम फलाम बोरोन (NdFeB) चुम्बक (N35, बिरालो नम्बर LM1652, जयकार इलेक्ट्रोनिक्स, अष्ट्रेलिया) १.१७ को अवशिष्ट चुम्बकीकरणको साथ टेस्लालाई इमेजिङको समयमा टाढाबाट यसको स्थिति परिवर्तन गर्न प्राप्त गर्न छुट्टै अनुवाद चरणमा जोडिएको थियो। एक्स-रे छवि अधिग्रहण सुरु हुन्छ जब चुम्बक नमूना भन्दा लगभग ३० मिमी माथि राखिएको हुन्छ, र छविहरू प्रति सेकेन्ड ४ फ्रेमको दरमा प्राप्त गरिन्छ। समयमा इमेजिङ गर्दा, चुम्बकलाई गिलास केशिका ट्यूबको नजिक ल्याइयो (लगभग १ मिमी टाढा) र त्यसपछि क्षेत्र शक्ति र स्थितिको प्रभाव मूल्याङ्कन गर्न ट्यूबसँगै अनुवाद गरियो।
नमूना xy अनुवाद चरणमा गिलास केशिकाहरूमा MP नमूनाहरू समावेश गर्ने इन भिट्रो इमेजिङ सेटअप। एक्स-रे बीमको मार्ग रातो ड्यास गरिएको रेखाले चिन्ह लगाइएको छ।
एक पटक MP हरूको इन भिट्रो दृश्यता स्थापित भएपछि, तिनीहरूको एक उपसमूह जंगली प्रकारको महिला अल्बिनो विस्टार मुसा (~१२ हप्ता पुरानो, ~२०० ग्राम) मा भिभोमा परीक्षण गरिएको थियो। ०.२४ मिलीग्राम/किग्रा मेडेटोमिडाइन (डोमिटर®, जेनोआक, जापान), ३.२ मिलीग्राम/किग्रा मिडाजोलाम (डोर्मिकम®, एस्टेलास फार्मा, जापान) र ४ मिलीग्राम/किग्रा बुटोरफानोल (भेटोरफाले®, मेइजी सेइका) मुसाहरूलाई इन्ट्रापेरिटोनियल इन्जेक्सनद्वारा फार्मा, जापान) को मिश्रणले बेहोस बनाइएको थियो। एनेस्थेसिया पछि, तिनीहरूलाई श्वासनली वरिपरिको फर हटाएर, एन्डोट्रेचियल ट्यूब (ET; १६ Ga iv क्यानुला, टेरुमो BCT) घुसाएर र शरीरको तापक्रम २२ कायम राख्न थर्मल ब्याग भएको अनुकूलित इमेजिङ प्लेटमा सुपाइन गरेर इमेजिङको लागि तयार पारिएको थियो। त्यसपछि इमेजिङ प्लेटलाई इमेजिङ बक्समा नमूना अनुवाद चरणमा थोरै कोणमा श्वासनलीलाई तेर्सो रूपमा पङ्क्तिबद्ध गर्न जोडिएको थियो। चित्र २क मा देखाइए अनुसार एक्स-रे छवि।
(a) SPring-8 इमेजिङ बक्समा भिभो इमेजिङ सेटअपमा, एक्स-रे बीमको बाटो रातो ड्यास गरिएको रेखाले चिन्ह लगाइएको छ। (b,c) दुई ओर्थोगोनल माउन्ट गरिएका IP क्यामेराहरू प्रयोग गरेर श्वासनलीमा चुम्बक स्थानीयकरण टाढाबाट गरिएको थियो। स्क्रिन छविको बायाँ छेउमा, टाउको समात्ने तार लूप देख्न सकिन्छ, र ET ट्यूब भित्र डेलिभरी क्यानुला ठाउँमा छ।
१०० μl गिलास सिरिन्ज प्रयोग गर्ने रिमोट-नियन्त्रित सिरिन्ज पम्प प्रणाली (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) लाई ३० Ga सुई मार्फत PE10 ट्युबिङ (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) मा जडान गरिएको थियो। ET ट्यूब घुसाउँदा टिप श्वासनलीमा सही स्थितिमा छ भनी सुनिश्चित गर्न ट्यूबलाई चिन्ह लगाउनुहोस्। माइक्रोपम्प प्रयोग गरेर, ट्यूबको टिप डेलिभर गरिने MP नमूनामा डुबाइँदा सिरिन्ज प्लन्जर हटाइयो। त्यसपछि लोड गरिएको डेलिभरी ट्यूबलाई एन्डोट्रेकियल ट्यूबमा घुसाइयो, टिपलाई हाम्रो अपेक्षित लागू चुम्बकीय क्षेत्रको सबैभन्दा बलियो भाग भित्र राखेर। हाम्रो Arduino आधारित समय बक्समा जडान गरिएको श्वसन डिटेक्टर प्रयोग गरेर छवि अधिग्रहण नियन्त्रण गरिएको थियो, र सबै संकेतहरू (जस्तै तापक्रम, श्वसन, शटर खोल्ने/बन्द गर्ने र छवि अधिग्रहण) Powerlab र LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) २२ प्रयोग गरेर रेकर्ड गरिएको थियो। इमेजिङ गर्दा जब घेरा पहुँचयोग्य थिएन, दुई IP क्यामेराहरू (Panasonic BB-SC382) लगभग ९०° मा राखिएको थियो। एकअर्कासँग सम्बन्धित र इमेजिङको क्रममा श्वासनलीको सापेक्ष चुम्बकको स्थिति निगरानी गर्न प्रयोग गरिएको थियो (चित्र २ख,ग)। गति कलाकृतिहरूलाई कम गर्न, अन्तिम-ज्वारभाटा प्रवाह पठारको समयमा प्रति सास एउटा छवि प्राप्त गरिएको थियो।
इमेजिङ हाउसिङ बाहिरबाट टाढाबाट अवस्थित गर्न सकिने दोस्रो चरणमा चुम्बक जोडिएको छ। विभिन्न चुम्बक स्थिति र कन्फिगरेसनहरू परीक्षण गरिएको थियो, जसमा समावेश छन्: श्वासनली माथि लगभग ३०° को कोणमा माउन्ट गरिएको (चित्र २a र ३a मा देखाइएको कन्फिगरेसनहरू); जनावर माथि एउटा चुम्बक र तल अर्को चुम्बक, आकर्षित गर्न पोलहरू सेट गरिएको (चित्र ३b); जनावर माथि एउटा चुम्बक र तल अर्को चुम्बक, ध्रुवहरू रिपेल गर्न सेट गरिएको (चित्र ३c); र माथि एउटा चुम्बक र श्वासनली माथि लम्बवत (चित्र ३d)। एक पटक जनावर र चुम्बक कन्फिगर गरिसकेपछि र परीक्षण गरिने MP सिरिन्ज पम्पमा लोड गरिसकेपछि, छविहरू प्राप्त गर्दा ४ μl/सेकेन्डको दरमा ५० μl खुराक डेलिभर गर्नुहोस्। त्यसपछि छविहरू प्राप्त गर्न जारी राख्दै चुम्बकलाई श्वासनली पारि अगाडि पछाडि वा पार्श्व रूपमा सारिन्छ।
भिभो इमेजिङको लागि चुम्बक कन्फिगरेसन (क) लगभग ३०° को कोणमा श्वासनली माथि एउटा चुम्बक, (ख) आकर्षित गर्न सेट गरिएका दुई चुम्बक, (ग) हटाउन सेट गरिएका दुई चुम्बक, (घ) श्वासनली माथि र लम्बवत एक चुम्बक। पर्यवेक्षकले मुखबाट श्वासनली हुँदै फोक्सोमा हेरे, र एक्स-रे किरण मुसाको बायाँ छेउबाट गुज्रियो र दायाँ छेउबाट बाहिर निस्कियो। चुम्बकलाई या त वायुमार्गको लम्बाइमा वा एक्स-रे बीमको दिशामा श्वासनली माथि बायाँ र दायाँ सारिन्छ।
हामीले श्वासप्रश्वास र मुटुको गतिलाई भ्रामक बनाउन नसक्दा वायुमार्गमा कणहरूको दृश्यता र व्यवहार निर्धारण गर्न पनि खोज्यौं। त्यसकारण, इमेजिङ अवधिको अन्त्यमा, पेन्टोबार्बिटल ओभरडोजको लागि जनावरहरूलाई मानवीय रूपमा मारियो (सोमनोपेन्टिल, पिटम्यान-मूर, वाशिंगटन क्रसिङ, संयुक्त राज्य अमेरिका; ~६५ मिलीग्राम/किग्रा आईपी)। केही जनावरहरूलाई इमेजिङ प्लेटफर्ममा छोडियो, र एक पटक सास फेर्न र मुटुको धड्कन बन्द भएपछि, इमेजिङ प्रक्रिया दोहोर्याइएको थियो, यदि वायुमार्गको सतहमा कुनै पनि MP देखिएन भने MP को अतिरिक्त खुराक थपिएको थियो।
प्राप्त गरिएका तस्बिरहरूलाई समतल-क्षेत्र र अँध्यारो-क्षेत्र सच्याइयो र त्यसपछि MATLAB (R2020a, The Mathworks) मा लेखिएको अनुकूलन स्क्रिप्ट प्रयोग गरेर चलचित्रमा (प्रति सेकेन्ड २० फ्रेम; श्वासप्रश्वास दरमा निर्भर गर्दै १५-२५ × सामान्य गति) भेला गरियो।
सबै LV जीन भेक्टर डेलिभरी अध्ययनहरू एडिलेड विश्वविद्यालयको प्रयोगशाला पशु अनुसन्धान सुविधामा सञ्चालन गरिएको थियो र SPring-8 प्रयोगको नतिजाहरू प्रयोग गरेर चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा LV-MP डेलिभरीले vivo मा जीन स्थानान्तरण बढाउन सक्छ कि सक्दैन भनेर मूल्याङ्कन गर्ने उद्देश्य राखिएको थियो। MP र चुम्बकीय क्षेत्रको प्रभावहरूको मूल्याङ्कन गर्न, जनावरहरूको दुई समूहलाई उपचार गरिएको थियो: एउटा समूहलाई चुम्बक राखिएको LV-MP दिइएको थियो, र अर्को समूहलाई चुम्बक बिना LV-MP भएको नियन्त्रण समूह प्राप्त गरिएको थियो।
LV जीन भेक्टरहरू पहिले वर्णन गरिएका विधिहरू 25, 26 प्रयोग गरेर उत्पन्न गरिएका थिए। LacZ भेक्टरले संरचनात्मक MPSV प्रमोटर (LV-LacZ) द्वारा संचालित आणविक-स्थानीयकृत बीटा-ग्यालेक्टोसिडेज जीनलाई व्यक्त गर्दछ, जसले ट्रान्सड्यूस्ड कोषहरूमा नीलो प्रतिक्रिया उत्पादन उत्पादन गर्दछ, जुन फोक्सोको तन्तु मोर्चा र तन्तु खण्डहरूमा देखिन्छ। TU/ml मा टिटर गणना गर्न हेमोसाइटोमिटरको साथ LacZ सकारात्मक कोषहरूको संख्या म्यानुअल रूपमा गणना गरेर कोष संस्कृतिहरूमा टाइट्रेसन गरिएको थियो। क्यारियरहरूलाई -80 °C मा क्रियोप्रिजर्भ गरिन्छ, प्रयोग गर्नु अघि पग्लिन्छ, र 1:1 अनुपातमा मिश्रण गरेर र डेलिभरी हुनुभन्दा कम्तिमा 30 मिनेट अघि बरफमा इन्क्युबेट गरेर CombiMag मा बाँधिन्छ।
सामान्य स्प्रेग डाव्ली मुसाहरू (n = ३/समूह, ~२-३) लाई ०.४ मिलीग्राम/किग्रा मेडेटोमिडाइन (डोमिटर, इलियम, अष्ट्रेलिया) र ६० मिलीग्राम/किग्रा केटामाइन (इलियम, अष्ट्रेलिया) महिना पुरानो) ip) इंजेक्शन र गैर-सर्जिकल मौखिक क्यानुलेसनको मिश्रणले १६ Ga iv क्यानुला प्रयोग गरेर इन्ट्रापेरिटोनली रूपमा बेहोस बनाइएको थियो। श्वासनलीको वायुमार्गको तन्तुले LV ट्रान्सडक्सन प्राप्त गर्छ भनी सुनिश्चित गर्न, यसलाई हाम्रो पहिले वर्णन गरिएको मेकानिकल पर्र्टबेशन प्रोटोकल प्रयोग गरेर कन्डिसन गरिएको थियो, जसमा श्वासनलीको वायुमार्गको सतहलाई तार टोकरी (N-सर्कल, निटिनोल टिपलेस स्टोन एक्स्ट्रक्टर NTSE-022115) -UDH, कुक मेडिकल, संयुक्त राज्य अमेरिका) ३० s२८ ले अक्षीय रूपमा रगडिएको थियो। त्यसपछि LV-MP को श्वासनलीको प्रशासन पर्र्टबेशन पछि लगभग १० मिनेटमा जैविक सुरक्षा क्याबिनेटमा गरिएको थियो।
यस प्रयोगमा प्रयोग गरिएको चुम्बकीय क्षेत्रलाई इन भिभो एक्स-रे इमेजिङ अध्ययन जस्तै तरिकाले कन्फिगर गरिएको थियो, जसमा डिस्टिलेसन स्टेन्ट क्लिपहरू प्रयोग गरेर श्वासनलीको माथि उही चुम्बकहरू राखिएको थियो (चित्र ४)। पहिले वर्णन गरिए अनुसार जेल टिप भएको पिपेट प्रयोग गरेर LV-MP को ५० μl भोल्युम (२ × २५ μl एलिक्वोट) श्वासनलीमा (n = ३ जनावरहरू) डेलिभर गरिएको थियो। नियन्त्रण समूह (n = ३ जनावरहरू) ले चुम्बकको प्रयोग बिना नै उही LV-MP प्राप्त गर्यो। इन्फ्युजन पूरा भएपछि, क्यानुला ET ट्यूबबाट हटाइन्छ र जनावरलाई निकालिन्छ। चुम्बक १० मिनेटको लागि ठाउँमा रहन्छ, त्यसपछि यसलाई हटाइन्छ। मुसाहरूलाई मेलोक्सिक्याम (१ मिली/किग्रा) (इलियम, अष्ट्रेलिया) को सबकुटेनियस खुराक प्राप्त भयो र त्यसपछि १ मिलीग्राम/किग्रा एटिपामाजोल हाइड्रोक्लोराइड (एन्टिसेडान, जोएटिस, अष्ट्रेलिया) को ip इंजेक्शनद्वारा एनेस्थेसिया उल्टाइयो। मुसाहरूलाई न्यानो राखिएको थियो र एनेस्थेसियाबाट पूर्ण रूपमा निको नभएसम्म निगरानी गरिएको थियो।
जैविक सुरक्षा क्याबिनेटमा LV-MP डेलिभरी उपकरण। ET ट्यूबको हल्का खैरो लुअर हब मुखबाट बाहिर निस्किएको देख्न सकिन्छ र चित्रमा देखाइएको पिपेटको जेल टिप ET ट्यूब मार्फत श्वासनलीमा इच्छित गहिराइमा घुसाइएको छ।
LV-MP डोजिङ प्रक्रियाको एक हप्ता पछि, जनावरहरूलाई १००% CO2 इनहेलेसनद्वारा मानवीय रूपमा मारियो र हाम्रो मानक X-gal उपचार प्रयोग गरेर LacZ अभिव्यक्तिको मूल्याङ्कन गरियो। विश्लेषणमा एन्डोट्रेकियल ट्यूब प्लेसमेन्टबाट कुनै पनि मेकानिकल क्षति वा तरल पदार्थ अवधारण समावेश गरिएको छैन भनी सुनिश्चित गर्न तीनवटा पुच्छर सबैभन्दा कार्टिलाजिनस रिंगहरू हटाइयो। विश्लेषणको लागि दुई भागहरू सिर्जना गर्न प्रत्येक श्वासनलीलाई अनुदैर्ध्य रूपमा काटिएको थियो, र तिनीहरूलाई ल्युमिनल सतह कल्पना गर्न मिनेटियन सुई (फाइन साइन्स टूल्स) प्रयोग गरेर सिलिकन रबर (सिलगार्ड, डाउ इंक) भएको डिशमा माउन्ट गरिएको थियो। डिजिलाइट क्यामेरा र TCapture सफ्टवेयर (टक्सन फोटोनिक्स, चीन) को साथ निकोन माइक्रोस्कोप (SMZ1500) प्रयोग गरेर फ्रन्टल फोटोग्राफीद्वारा ट्रान्सड्यूस गरिएका कोशिकाहरूको वितरण र ढाँचा पुष्टि गरिएको थियो। २०x म्याग्निफिकेसनमा छविहरू प्राप्त गरियो (ट्रेकियाको पूर्ण चौडाइको लागि उच्चतम सेटिङ सहित), श्वासनलीको सम्पूर्ण लम्बाइ चरण-दर-चरण छवि गरिएको थियो, छविको लागि अनुमति दिन प्रत्येक छवि बीच पर्याप्त ओभरल्याप सुनिश्चित गर्दै। "सिलाई"। त्यसपछि प्रत्येक श्वासनलिकाबाट छविहरू इमेज कम्पोजिट सम्पादक v2.0.3 (माइक्रोसफ्ट रिसर्च) प्रयोग गरेर समतल गति एल्गोरिथ्म प्रयोग गरेर एकल कम्पोजिट छविमा भेला गरियो। प्रत्येक जनावरबाट श्वासनलिकाको कम्पोजिट छविहरूमा LacZ अभिव्यक्ति क्षेत्रहरू पहिले वर्णन गरिए अनुसार स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) प्रयोग गरेर परिमाण गरिएको थियो, 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, र Value < 0.7 को सेटिङहरू प्रयोग गरेर। तन्तुको रूपरेखा ट्रेस गरेर, तन्तु क्षेत्र पहिचान गर्न र श्वासनलिका तन्तु बाहिरबाट कुनै पनि गलत पत्ता लगाउन रोक्नको लागि प्रत्येक कम्पोजिट छविको लागि GIMP v2.10.24 मा मास्क म्यानुअल रूपमा उत्पन्न गरिएको थियो। प्रत्येक जनावरबाट सबै कम्पोजिट छविहरूबाट दाग गरिएका क्षेत्रहरू त्यो जनावरको लागि कुल दागिएको क्षेत्र उत्पन्न गर्न संक्षेप गरिएको थियो। दागिएको क्षेत्रलाई त्यसपछि सामान्यीकृत क्षेत्र उत्पन्न गर्न कुल मास्क क्षेत्रद्वारा विभाजित गरिएको थियो।
प्रत्येक श्वासनलीलाई प्याराफिनमा इम्बेड गरिएको थियो र ५ μm खण्डहरू काटिएका थिए। खण्डहरूलाई ५ मिनेटको लागि तटस्थ द्रुत रातो रंगले प्रतिरक्षा गरिएको थियो र Nikon Eclipse E400 माइक्रोस्कोप, DS-Fi3 क्यामेरा र NIS तत्व क्याप्चर सफ्टवेयर (संस्करण ५.२०.००) प्रयोग गरेर छविहरू प्राप्त गरिएको थियो।
सबै सांख्यिकीय विश्लेषणहरू GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) मा गरिएको थियो। तथ्याङ्कीय महत्त्व p ≤ 0.05 मा सेट गरिएको थियो। Shapiro-Wilk परीक्षण प्रयोग गरेर सामान्यता प्रमाणित गरिएको थियो, र LacZ स्टेनिङमा भिन्नताहरू अनपेयर गरिएको t-परीक्षण प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
तालिका १ मा वर्णन गरिएका छ MP हरूलाई PCXI प्रयोग गरेर जाँच गरिएको थियो, र दृश्यता तालिका २ मा वर्णन गरिएको छ। PCXI अन्तर्गत दुई पोलिस्टीरिन MP (MP1 र MP2; क्रमशः १८ μm र ०.२५ μm) देखिएनन्, तर बाँकी नमूनाहरू पहिचान गर्न योग्य थिए (उदाहरणहरू चित्र ५ मा देखाइएको छ)। MP3 र MP4 (१०-१५% Fe3O4; ०.२५ μm र ०.९ μm, क्रमशः) हल्का रूपमा देखिने छन्। परीक्षण गरिएका केही साना कणहरू समावेश भए पनि, MP5 (९८% Fe3O4; ०.२५ μm) सबैभन्दा स्पष्ट थियो। CombiMag उत्पादन MP6 भेट्टाउन गाह्रो छ। सबै अवस्थामा, चुम्बकलाई केशिकाको समानान्तर अगाडि र पछाडि अनुवाद गरेर MP पत्ता लगाउने हाम्रो क्षमता उल्लेखनीय रूपमा बढाइएको थियो। जब चुम्बकहरू केशिकाबाट टाढा सर्थे, कणहरू लामो तारहरूमा विस्तारित हुन्थे, तर चुम्बकहरू नजिक आउँदा र चुम्बकीय क्षेत्रको शक्ति बढ्दै जाँदा, कणहरू केशिकाको माथिल्लो सतहतिर सर्दा कण तारहरू छोटो हुँदै गए (पूरक हेर्नुहोस्)। भिडियो S1: MP4), सतहको कण घनत्व बढ्दै। यसको विपरीत, जब चुम्बकलाई केशिकाबाट हटाइन्छ, क्षेत्र शक्ति घट्छ र MP हरू केशिकाको माथिल्लो सतहबाट फैलिएका लामो तारहरूमा पुन: व्यवस्थित हुन्छन् (पूरक भिडियो S2:MP4 हेर्नुहोस्)। चुम्बक चल्न बन्द भएपछि, कणहरू सन्तुलन स्थितिमा पुगेपछि छोटो समयको लागि चल्न जारी राख्छन्। MP केशिकाको माथिल्लो सतहतिर र टाढा सर्दै जाँदा, चुम्बकीय कणहरूले सामान्यतया तरल पदार्थको माध्यमबाट मलबेलाई तान्छन्।
PCXI अन्तर्गत MP को दृश्यता नमूनाहरू बीच उल्लेखनीय रूपमा भिन्न हुन्छ। (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 र (d) MP6। यहाँ देखाइएका सबै छविहरू केशिका माथि लगभग १० मिमी अवस्थित चुम्बकको साथ लिइएका थिए। स्पष्ट ठूला सर्कलहरू केशिकाहरूमा फसेका हावाका बुलबुले हुन्, जसले चरण कन्ट्रास्ट इमेजिङको कालो र सेतो किनारा सुविधाहरू स्पष्ट रूपमा देखाउँछन्। रातो बक्समा कन्ट्रास्ट-बढाउने म्याग्निफिकेसन समावेश छ। ध्यान दिनुहोस् कि सबै चित्रहरूमा चुम्बक योजनाहरूको व्यास मापन गर्न मिल्दैन र देखाइएको भन्दा लगभग १०० गुणा ठूला छन्।
चुम्बकलाई केशिकाको माथिल्लो भागमा बायाँ र दायाँ अनुवाद गर्दा, MP स्ट्रिङको कोण चुम्बकसँग पङ्क्तिबद्ध हुन परिवर्तन हुन्छ (चित्र ६ हेर्नुहोस्), जसले गर्दा चुम्बकीय क्षेत्र रेखाहरू रेखांकित हुन्छन्। MP3-5 को लागि, तारले थ्रेसहोल्ड कोणमा पुगेपछि, कणहरू केशिकाको माथिल्लो सतहमा तानिन्छन्। यसले प्रायः MP हरूलाई चुम्बकीय क्षेत्र सबैभन्दा बलियो भएको ठाउँको नजिक ठूला समूहहरूमा क्लस्टर गर्ने परिणाम दिन्छ (पूरक भिडियो S3:MP5 हेर्नुहोस्)। यो विशेष गरी केशिकाको छेउको नजिक इमेजिङ गर्दा पनि स्पष्ट हुन्छ, जसले MP हरूलाई तरल-वायु इन्टरफेसमा एकत्रित र केन्द्रित गर्दछ। MP6 मा कणहरू, जुन MP3-5 भन्दा छुट्याउन गाह्रो थिए, चुम्बक केशिकासँगै सर्दा तानिएको थिएन, तर MP स्ट्रिङहरू अलग भए, कणहरूलाई दृश्यको क्षेत्रमा छोडे (पूरक भिडियो S4:MP6 हेर्नुहोस्)। केही अवस्थामा, जब लागू गरिएको चुम्बकीय क्षेत्र चुम्बकलाई इमेजिङ स्थानबाट ठूलो दूरीमा सारेर घटाइएको थियो, कुनै पनि बाँकी MP हरू स्ट्रिङमा रहँदा गुरुत्वाकर्षणद्वारा ट्यूबको तल्लो सतहमा बिस्तारै तल झर्छन् (पूरक भिडियो S5: MP3 हेर्नुहोस्)।
चुम्बकलाई केशिकाको माथि दायाँतिर अनुवाद गर्दा MP स्ट्रिङको कोण परिवर्तन हुन्छ। (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 र (d) MP6। रातो बक्समा कन्ट्रास्ट-बढाउने म्याग्निफिकेसन समावेश छ। ध्यान दिनुहोस् कि पूरक भिडियोहरू जानकारीमूलक छन् किनकि तिनीहरूले महत्त्वपूर्ण कण संरचना र गतिशील जानकारी प्रकट गर्छन् जुन यी स्थिर छविहरूमा कल्पना गर्न सकिँदैन।
हाम्रा परीक्षणहरूले देखाए कि चुम्बकलाई श्वासनलीमा बिस्तारै अगाडि पछाडि सार्दा जटिल आन्दोलनको सन्दर्भमा MP को दृश्यावलोकन गर्न सजिलो हुन्छ। केशिकामा पोलिस्टीरिन मोती (MP1 र MP2) देखिँदैनथे त्यसैले भिभो परीक्षण गरिएको थिएन। बाँकी चार MP मध्ये प्रत्येकलाई श्वासनलीको माथि लगभग 30° देखि ठाडो कोणमा कन्फिगर गरिएको चुम्बक लामो अक्षको साथ भिभो परीक्षण गरिएको थियो (चित्र 2b र 3a हेर्नुहोस्), किनकि यसले MP चेनहरू लामो बनायो र चुम्बक कन्फिगरेसन समाप्त भएको भन्दा बढी प्रभावकारी थियो। कुनै पनि जीवित जनावरको श्वासनलीमा MP3, MP4 र MP6 पत्ता लागेन। जनावरहरूलाई मानवीय रूपमा मारिएपछि मुसाको वायुमार्गको छवि लिँदा, सिरिन्ज पम्प प्रयोग गरेर थप मात्रा थप्दा पनि कणहरू अदृश्य रहे। MP5 मा उच्चतम आइरन अक्साइड सामग्री थियो र यो एक मात्र देखिने कण थियो, र त्यसैले MP को इन भिभो व्यवहारको मूल्याङ्कन र विशेषता बनाउन प्रयोग गरिएको थियो।
MP डेलिभरीको समयमा श्वासनलीमा चुम्बक राख्नाले धेरै, तर सबै होइन, MP हरू दृश्य क्षेत्रमा केन्द्रित भए। श्वासनलीमा प्रवेश गर्ने कणहरू मानवीय रूपमा बलिदान गरिएका जनावरहरूमा राम्रोसँग अवलोकन गरिन्छ। चित्र ७ र पूरक भिडियो S6: MP5 ले भेन्ट्रल श्वासनलीको सतहमा कणहरूको द्रुत चुम्बकीय कब्जा र पङ्क्तिबद्धता देखाउँछ, जसले MP हरूलाई श्वासनलीको इच्छित क्षेत्रहरूमा निर्देशित गर्न सकिन्छ भनेर संकेत गर्दछ। MP डेलिभरी पछि श्वासनलीको छेउमा थप टाढा खोजी गर्दा, केही MP हरू क्यारिनाको नजिक फेला परे, जसले सुझाव दिन्छ कि चुम्बकीय क्षेत्र शक्ति सबै MP हरूलाई सङ्कलन र कायम राख्न अपर्याप्त थियो, किनकि तिनीहरू तरल प्रक्रियाको क्रममा अधिकतम चुम्बकीय क्षेत्र शक्तिको क्षेत्र मार्फत डेलिभर गरिएको थियो। यद्यपि, प्रसवोत्तर MP सांद्रता छवि गरिएको क्षेत्र वरिपरि उच्च थियो, जसले सुझाव दिन्छ कि धेरै MP हरू वायुमार्ग क्षेत्रहरूमा रहे जहाँ लागू गरिएको चुम्बकीय क्षेत्र शक्ति उच्चतम थियो।
(क) भर्खरै युथनाइज गरिएको मुसाको श्वासनलीमा MP5 डेलिभरी गर्नु अघि र (ख) पछिका तस्बिरहरू, जसमा चुम्बकलाई इमेजिङ क्षेत्रको सिधै माथि राखिएको छ। चित्रण गरिएको क्षेत्र दुई कार्टिलेज रिंगहरू बीच अवस्थित छ। MP डेलिभरी अघि, वायुमार्गमा केही तरल पदार्थ हुन्छ। रातो बक्समा कन्ट्रास्ट-बढाउने म्याग्निफिकेसन हुन्छ। यी तस्बिरहरू पूरक भिडियो S6:MP5 मा देखाइएको भिडियोबाट हुन्।
चुम्बकलाई श्वासनलीको छेउमा रूपान्तरण गर्दा MP चेनले केशिकाहरूमा देखिने जस्तै वायुमार्गको सतह भित्र कोण परिवर्तन गर्‍यो (चित्र ८ र पूरक भिडियो S7:MP5 हेर्नुहोस्)। यद्यपि, हाम्रो अध्ययनमा, MP लाई जीवित वायुमार्गको सतहमा तान्न सकिएन किनकि तिनीहरूले केशिकाहरूसँग तान्न सक्थे। केही अवस्थामा, चुम्बक बायाँ र दायाँ सर्दा MP चेन लामो हुनेछ। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले यो पनि फेला पार्यौं कि चुम्बकलाई श्वासनलीको छेउमा अनुदैर्ध्य रूपमा सार्दा कण स्ट्रिङले सतहको तरल तहको गहिराइ परिवर्तन गरेको देखिन्छ, र चुम्बकलाई सिधै माथि सार्दा र कण स्ट्रिङलाई ठाडो स्थितिमा घुमाउँदा विस्तार हुन्छ (पूरक भिडियो S7 हेर्नुहोस्)। : MP5 ०:०९ मा, तल दायाँ)। चुम्बकलाई श्वासनलीको माथिल्लो भागमा पार्श्व रूपमा अनुवाद गर्दा गतिको विशेषता ढाँचा परिवर्तन भयो (अर्थात्, श्वासनलीको लम्बाइको साथमा भन्दा जनावरको बायाँ वा दायाँतिर)। कणहरू सर्दै गर्दा अझै पनि स्पष्ट रूपमा देखिन्थे, तर जब चुम्बकलाई श्वासनलीको बाहिरी भागबाट हटाइयो, कण तारहरूको टुप्पो देखिन थाल्यो (पूरक भिडियो S8:MP5 हेर्नुहोस्, ०:०८ बाट सुरु हुँदै)। यो हामीले गिलास केशिकामा लागू गरिएको चुम्बकीय क्षेत्र अन्तर्गत अवलोकन गरेको MP व्यवहारसँग मेल खान्छ।
जीवित बेहोस गरिएको मुसाको श्वासनलीमा MP5 देखाउने उदाहरण छविहरू। (क) चुम्बकलाई श्वासनलीको माथि र बायाँ छविहरू प्राप्त गर्न प्रयोग गरिन्छ, त्यसपछि (ख) चुम्बकलाई दायाँ सारिएपछि। रातो बक्समा कन्ट्रास्ट-बढाउने म्याग्निफिकेसन समावेश छ। यी छविहरू पूरक भिडियो S7:MP5 मा देखाइएको भिडियोबाट हुन्।
जब दुई ध्रुवहरू श्वासनलीको माथि र तल उत्तर-दक्षिण अभिमुखीकरणमा कन्फिगर गरिएका थिए (अर्थात् आकर्षित गर्ने; चित्र ३ख), MP कर्डहरू लामो देखिन्थे र पृष्ठीय श्वासनलीको सतहमा भन्दा श्वासनलीको साइडवालमा अवस्थित थिए (पूरक भिडियो S9:MP5 हेर्नुहोस्)। यद्यपि, दोहोरो-चुम्बक उपकरण प्रयोग गर्दा तरल पदार्थ वितरण पछि एकल स्थानमा (अर्थात्, श्वासनलीको पृष्ठीय सतह) कणहरूको उच्च सांद्रता पत्ता लागेन, जुन सामान्यतया एकल-चुम्बक उपकरण प्रयोग गर्दा हुन्छ। त्यसपछि जब एउटा चुम्बकलाई उल्टो ध्रुवहरूलाई हटाउन कन्फिगर गरिएको थियो (चित्र ३ग), दृश्यको क्षेत्रमा देखिने कणहरूको संख्या डेलिभरी पछि बढेको देखिएन। चुम्बकहरूलाई तान्ने वा धकेल्ने उच्च चुम्बकीय क्षेत्र शक्तिहरूको कारणले गर्दा दुवै दोहोरो-चुम्बक कन्फिगरेसनहरूको सेटअप चुनौतीपूर्ण छ। त्यसपछि सेटअपलाई वायुमार्गको समानान्तर एकल चुम्बकमा परिवर्तन गरियो तर ९० डिग्रीमा वायुमार्गबाट ​​गुज्रियो ताकि क्षेत्र रेखाहरूले श्वासनलीको पर्खाललाई ओर्थोगोनल रूपमा पार गरे (चित्र ३ड), एक अभिमुखीकरण जसले कण एकत्रीकरण निर्धारण गर्न डिजाइन गरिएको हो। साइड भित्ता अवलोकन गर्न सकिन्छ। यद्यपि, यस कन्फिगरेसनमा, MP संचय वा चुम्बक चालको कुनै पहिचान योग्य चाल थिएन। यी सबै परिणामहरूको आधारमा, इन भिभो जीन क्यारियर अध्ययनहरूको लागि एकल-चुम्बक, 30-डिग्री अभिमुखीकरण कन्फिगरेसन (चित्र 3a) छनोट गरिएको थियो।
जब जनावरलाई मानव हत्या पछि तुरुन्तै बारम्बार चित्रण गरिएको थियो, भ्रामक तन्तु गतिको अनुपस्थितिको अर्थ चुम्बकको अनुवादात्मक गतिसँग मिल्दोजुल्दो स्पष्ट इन्टरकोन्ड्रल क्षेत्रमा मसिना र छोटो कण रेखाहरू पहिचान गर्न सकिन्थ्यो। यद्यपि, अझै पनि MP6 कणहरूको उपस्थिति र गति स्पष्ट रूपमा देख्न सकिँदैन।
LV-LacZ टिटर १.८ × १०८ TU/ml थियो, र CombiMag MP (MP6) सँग १:१ मिश्रण पछि, जनावरहरूले ९ × १०७ TU/ml LV सवारी साधन (अर्थात् ४.५ × १०६ TU/मुसा) को ५० μl श्वासनलीको खुराक प्राप्त गरे। यी अध्ययनहरूमा, प्रसवको समयमा चुम्बकलाई अनुवाद गर्नुको सट्टा, हामीले चुम्बकलाई एक स्थानमा स्थिर गर्यौं कि चुम्बकीय क्षेत्रको अनुपस्थितिमा भेक्टर डेलिभरीको तुलनामा LV ट्रान्सडक्सन (a) लाई सुधार गर्न सकिन्छ कि भनेर निर्धारण गर्न, र (b) केन्द्रित गर्न सकिन्छ। वायुमार्ग कोषहरू माथिल्लो वायुमार्गको चुम्बकीय लक्ष्य क्षेत्रहरूमा ट्रान्सडक्स हुन्छन्।
चुम्बकको उपस्थिति र LV भेक्टरहरूसँग मिलेर CombiMag को प्रयोगले जनावरको स्वास्थ्यमा प्रतिकूल प्रभाव पारेको देखिएन, जस्तै हाम्रो मानक LV भेक्टर डेलिभरी प्रोटोकलले देखाएको थियो। यान्त्रिक गडबडीको अधीनमा रहेको श्वासनलीको क्षेत्रको अगाडिको छविहरूले संकेत गरे कि चुम्बक उपस्थित हुँदा LV-MP सँग उपचार गरिएका जनावरहरूको समूहमा ट्रान्सडक्सनको स्तर उल्लेखनीय रूपमा उच्च थियो (चित्र 9a)। नियन्त्रण समूहमा नीलो LacZ दागको थोरै मात्रा मात्र उपस्थित थियो (चित्र 9b)। सामान्यीकृत X-Gal दाग भएका क्षेत्रहरूको परिमाणीकरणले देखाएको छ कि चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा LV-MP को प्रशासनले लगभग 6-गुणा सुधार उत्पादन गरेको छ (चित्र 9c)।
LV-MP द्वारा श्वासनली ट्रान्सडक्सन देखाउने समग्र छविहरूको उदाहरण (a) चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा र (b) चुम्बकको अनुपस्थितिमा। (c) चुम्बक प्रयोग गर्दा श्वासनली भित्र सामान्यीकृत LacZ ट्रान्सडक्सन क्षेत्रमा तथ्याङ्कीय रूपमा महत्त्वपूर्ण सुधार (*p = 0.029, t-परीक्षण, n = 3 प्रति समूह, औसत ± SEM)।
तटस्थ द्रुत रातो-दाग भएका खण्डहरू (उदाहरण पूरक चित्र २ मा देखाइएको छ) ले पहिले रिपोर्ट गरिए जस्तै समान ढाँचा र स्थानमा LacZ-दाग भएका कोषहरू देखायो।
वायुमार्ग जीन थेरापीको लागि एउटा प्रमुख चुनौती भनेको वाहक कणहरूलाई रुचिको क्षेत्रहरूमा सही स्थानीयकरण गर्नु र वायुप्रवाह र सक्रिय म्यूकस क्लियरेन्सको उपस्थितिमा चलिरहेको फोक्सोमा उच्च स्तरको ट्रान्सडक्सन दक्षता प्राप्त गर्नु हो। CF वायुमार्ग रोगको उपचार गर्न डिजाइन गरिएको LV वाहकहरूको लागि, प्रवाहकीय वायुमार्ग भित्र वाहक कणहरूको बसोबास समय बढाउनु अहिलेसम्मको मायावी लक्ष्य रहेको छ। कास्टेलानी एट अल द्वारा औंल्याए अनुसार, ट्रान्सडक्सन सुधार गर्न चुम्बकीय क्षेत्रहरूको प्रयोगले इलेक्ट्रोपोरेशन जस्ता अन्य जीन डेलिभरी विधिहरूको तुलनामा फाइदाहरू छन्, किनकि यसले सरलता, लागत-प्रभावकारिता, डेलिभरी स्थानीयकरण, बढेको दक्षता, र छोटो इन्क्युबेशन समय, र सम्भवतः सानो वाहक खुराक संयोजन गर्न सक्छ। यद्यपि, बाह्य चुम्बकीय शक्तिहरूको प्रभावमा वायुमार्गमा चुम्बकीय कणहरूको इन भिभो निक्षेपण र व्यवहार कहिल्यै वर्णन गरिएको छैन, न त अक्षुण्ण जीवित वायुमार्गहरूमा जीन अभिव्यक्ति स्तर बढाउन यो विधिको सम्भाव्यता वास्तवमा भिभोमा प्रदर्शन गरिएको छ।
हाम्रो इन भिट्रो सिंक्रोट्रोन PCXI प्रयोगहरूले देखाएको छ कि हामीले परीक्षण गरेका सबै कणहरू, पोलिस्टीरिन MP बाहेक, हामीले प्रयोग गरेको इमेजिङ सेटअपमा देखिन्थे। चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा, MP ले स्ट्रिङहरू बनाउँछन् जसको लम्बाइ कण प्रकार र चुम्बकीय क्षेत्र शक्ति (अर्थात् चुम्बकको निकटता र गति) सँग सम्बन्धित हुन्छ। चित्र १० मा देखाइएझैं, हामीले अवलोकन गर्ने स्ट्रिङहरू प्रत्येक व्यक्तिगत कण चुम्बकीकृत भएको र यसको आफ्नै स्थानीय चुम्बकीय क्षेत्र प्रेरित गरेको कारणले बन्छन्। यी छुट्टाछुट्टै क्षेत्रहरूले अन्य समान कणहरूलाई एकत्रित र जडान गर्न निम्त्याउँछन्, अन्य कणहरूको स्थानीय आकर्षक र विकर्षक बलहरूबाट स्थानीय बलहरूको कारणले गर्दा समूह स्ट्रिङ-जस्तो गतिहरू सहित।
योजनाबद्ध रूपमा (a,b) तरल पदार्थले भरिएको केशिकाहरू भित्र उत्पन्न कण रेलहरू र (c,d) हावाले भरिएको श्वासनली देखाउँदै। ध्यान दिनुहोस् कि केशिकाहरू र श्वासनलीहरू स्केलमा तानिएका छैनन्। प्यानल (a) मा MP को विवरण पनि समावेश छ, जसमा तारहरूमा व्यवस्थित Fe3O4 कणहरू छन्।
जब चुम्बकलाई केशिका माथि सारियो, कण स्ट्रिङको कोणले Fe3O4 भएको MP3-5 को लागि एक महत्वपूर्ण सीमामा पुग्यो, जस पछि कण स्ट्रिङ अब मूल स्थितिमा रहेन, तर सतहसँगै नयाँ स्थितिमा सर्यो। चुम्बक। यो प्रभाव हुने सम्भावना छ किनभने गिलास केशिका सतह यो आन्दोलन हुन अनुमति दिन पर्याप्त चिल्लो छ। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, MP6 (CombiMag) ले यसरी व्यवहार गरेन, सम्भवतः किनभने कणहरू साना थिए, फरक कोटिंग वा सतह शुल्कहरू थिए, वा स्वामित्व वाहक तरल पदार्थले तिनीहरूको सार्न सक्ने क्षमतालाई असर गर्यो। CombiMag कणहरूको छवि कन्ट्रास्ट पनि कमजोर छ, जसले सुझाव दिन्छ कि तरल पदार्थ र कणहरूको समान घनत्व हुन सक्छ र त्यसैले सजिलै एकअर्कातिर सर्दैन। चुम्बक धेरै छिटो सर्दा कणहरू पनि अड्किन सक्छन्, जसले संकेत गर्दछ कि चुम्बकीय क्षेत्र शक्तिले सधैं तरल पदार्थमा कणहरू बीचको घर्षणलाई पार गर्न सक्दैन, सुझाव दिन्छ कि सायद यो आश्चर्यजनक छैन कि चुम्बकीय क्षेत्र शक्ति र चुम्बक र लक्ष्य क्षेत्र बीचको दूरी धेरै महत्त्वपूर्ण छ। एकसाथ लिइएमा, यी नतिजाहरूले यो पनि सुझाव दिन्छ कि, चुम्बकहरूले लक्षित क्षेत्रबाट बग्ने धेरै MP हरूलाई कब्जा गर्न सक्छन्, यो असम्भव छ। श्वासनलीको सतहमा CombiMag कणहरू सार्न चुम्बकहरूमा भर पर्न सकिन्छ भन्ने निष्कर्षमा पुग्छौं। त्यसकारण, हामी निष्कर्ष निकाल्छौं कि भिभोमा LV-MP अध्ययनहरूले वायुमार्गको विशिष्ट क्षेत्रहरूलाई भौतिक रूपमा लक्षित गर्न स्थिर चुम्बकीय क्षेत्रहरू प्रयोग गर्नुपर्छ।
जब कणहरू शरीरमा डेलिभर गरिन्छ, जटिल गतिशील शरीरको तन्तुको सन्दर्भमा तिनीहरूलाई पहिचान गर्न गाह्रो हुन्छ, तर MP तारहरूलाई "हल्लाउन" श्वासनलीको माथि चुम्बकलाई तेर्सो रूपमा अनुवाद गरेर तिनीहरूलाई पत्ता लगाउने क्षमता बढाइएको थियो। यद्यपि प्रत्यक्ष इमेजिङ सम्भव छ, जनावरलाई मानवीय रूपमा मारिएपछि कण गति पत्ता लगाउन सजिलो हुन्छ। चुम्बकलाई इमेजिङ क्षेत्र माथि राखिएको बेला MP सांद्रता सामान्यतया यस स्थानमा उच्चतम थियो, यद्यपि केही कणहरू सामान्यतया श्वासनलीको छेउमा फेला परेका थिए। इन भिट्रो अध्ययनहरूको विपरीत, चुम्बकलाई अनुवाद गरेर कणहरूलाई श्वासनलीको छेउमा तान्न सकिँदैन। यो खोज श्वासनलीको सतहमा कोट गर्ने म्यूकसले सामान्यतया सास लिइएका कणहरूलाई कसरी प्रशोधन गर्छ, तिनीहरूलाई म्यूकसमा फसाउँछ र पछि म्यूकोसिलरी क्लियरेन्स मेकानिज्मद्वारा सफा गर्छ भन्ने कुरासँग मेल खान्छ।
हामीले परिकल्पना गर्यौं कि श्वासनलीको माथि र तल आकर्षणको लागि चुम्बकहरूको प्रयोगले एक बिन्दुमा अत्यधिक केन्द्रित चुम्बकीय क्षेत्रको सट्टा बढी एकरूप चुम्बकीय क्षेत्र निम्त्याउन सक्छ, जसले सम्भावित रूपमा कणहरूको अधिक एकरूप वितरण निम्त्याउँछ। यद्यपि, हाम्रो प्रारम्भिक अध्ययनले यो परिकल्पनालाई समर्थन गर्ने स्पष्ट प्रमाण फेला पारेन। त्यस्तै गरी, चुम्बकहरूको जोडीलाई हटाउन (चित्र 3c) कन्फिगर गर्नाले छवि गरिएको क्षेत्रमा बढी कण निक्षेपणको परिणाम भएन। यी दुई निष्कर्षहरूले देखाउँछन् कि दोहोरो-चुम्बक सेटअपले MP लक्ष्यीकरणको स्थानीय नियन्त्रणमा उल्लेखनीय रूपमा सुधार गर्दैन, र परिणामस्वरूप बलियो चुम्बकीय बलहरू कन्फिगर गर्न गाह्रो छ, जसले गर्दा यो दृष्टिकोण कम व्यावहारिक हुन्छ। त्यस्तै गरी, चुम्बकलाई माथि र श्वासनलीको माध्यमबाट अभिमुखीकरण गर्नाले (चित्र 3d) पनि छवि गरिएको क्षेत्रमा राखिएका कणहरूको संख्या बढेन। यी मध्ये केही वैकल्पिक कन्फिगरेसनहरू सफल नहुन सक्छन् किनभने तिनीहरूले निक्षेप क्षेत्र भित्र कम चुम्बकीय क्षेत्र शक्तिहरू निम्त्याउँछन्। त्यसकारण, एकल 30-डिग्री कोण चुम्बक कन्फिगरेसन (चित्र 3a) लाई भिभो परीक्षणको लागि सबैभन्दा सजिलो र सबैभन्दा प्रभावकारी विधि मानिन्छ।
LV-MP अध्ययनले देखाएको छ कि जब LV भेक्टरहरूलाई CombiMag सँग जोडियो र चुम्बकीय क्षेत्रको उपस्थितिमा शारीरिक गडबडी पछि डेलिभर गरियो, नियन्त्रणहरूको तुलनामा श्वासनलीमा ट्रान्सडक्सन स्तर उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो। सिंक्रोट्रोन इमेजिङ अध्ययन र LacZ नतिजाहरूको आधारमा, चुम्बकीय क्षेत्रले श्वासनलीमा LV लाई सुरक्षित गर्न र तुरुन्तै फोक्सोमा गहिरो रूपमा प्रवेश गर्ने भेक्टर कणहरूको संख्या घटाउन सक्षम थियो। यस्ता लक्ष्यीकरण सुधारहरूले डेलिभर गरिएको टाइटरहरू, अफ-टार्गेट ट्रान्सडक्सन, इन्फ्लेमेटरी र प्रतिरक्षा साइड इफेक्टहरू, र जीन क्यारियर लागतहरू घटाउँदै उच्च प्रभावकारिता निम्त्याउन सक्छ। महत्त्वपूर्ण कुरा, निर्माताका अनुसार, CombiMag अन्य भाइरल भेक्टरहरू (जस्तै AAV) र न्यूक्लिक एसिडहरू सहित अन्य जीन स्थानान्तरण विधिहरूसँग संयोजनमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।