Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, mostraremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Os vectores xénicos para o tratamento da enfermidade pulmonar con fibrose quística deben dirixirse ás vías respiratorias condutoras porque a transdución pulmonar periférica non proporciona beneficios terapéuticos. A eficiencia da transdución viral está directamente relacionada co tempo de residencia do vector. Non obstante, os fluídos de administración, como os portadores de xenes, difunden naturalmente nos alvéolos durante a inspiración e as partículas terapéuticas de calquera forma elimínanse rapidamente mediante transporte mucociliar. Prolongar o tempo de residencia dos portadores de xenes nas vías respiratorias é importante pero difícil de conseguir. As partículas magnéticas conxugadas con portadores de xenes que se poden dirixir á superficie das vías respiratorias poden mellorar a orientación rexional. Debido aos desafíos da visualización in vivo, o comportamento destas pequenas partículas magnéticas na superficie das vías respiratorias en presenza dun campo magnético aplicado non se coñece ben. O obxectivo deste estudo foi usar imaxes de sincrotrón para visualizar o movemento in vivo dunha serie de partículas magnéticas na traquea de ratas anestesiadas para examinar a dinámica e os patróns do comportamento das partículas individuais e a granel in vivo. Despois tamén avaliamos se a administración de partículas magnéticas lentivirais en presenza dun campo magnético aumentaría a eficiencia da transdución na traquea da rata. Sincrotrón As imaxes de raios X revelan o comportamento das partículas magnéticas en campos magnéticos estacionarios e en movemento in vitro e in vivo. As partículas non se poden arrastrar facilmente pola superficie das vías respiratorias vivas con imáns, pero durante o transporte, os depósitos concéntranse no campo de visión onde o campo magnético é máis forte. A eficiencia da transdución tamén se multiplicou por seis cando se administraron partículas magnéticas lentivirais en presenza dun campo magnético. Conxuntamente, estes resultados suxiren que as partículas magnéticas lentivirais e os campos magnéticos poden ser enfoques valiosos para mellorar a direccionamento dos vectores xénicos e aumentar os niveis de transdución nas vías respiratorias condutoras in vivo.
A fibrose quística (FQ) está causada pola variación nun único xene chamado regulador da condutancia transmembrana da FQ (CFTR). A proteína CFTR é un canal iónico que está presente en moitas células epiteliais de todo o corpo, incluídas as vías respiratorias condutoras, un sitio importante da patoxénese da FQ. Os defectos do CFTR provocan un transporte anormal de auga, deshidratando a superficie das vías respiratorias e reducindo a profundidade da capa líquida da superficie das vías respiratorias (ASL). Isto tamén prexudica a capacidade do sistema de transporte mucociliar (MCT) para eliminar as partículas e os patóxenos inhalados das vías respiratorias. O noso obxectivo é desenvolver unha terapia xénica lentiviral (LV) para administrar a copia correcta do xene CFTR e mellorar a ASL, a MCT e a saúde pulmonar, e continuar desenvolvendo novas tecnoloxías capaces de medir estes parámetros in vivo1.
Os vectores ventriculares esquerdos (VE) son uns dos principais candidatos para a terapia xénica das vías respiratorias na fibrose quística (FQ), principalmente porque poden integrar permanentemente o xene terapéutico nas células basais das vías respiratorias (células nai das vías respiratorias). Isto é importante porque poden restaurar a hidratación normal e a eliminación de moco ao diferenciarse en células superficiais das vías respiratorias asociadas á FQ e corrixidas por xenes funcionais, o que resulta en beneficios para toda a vida. Os vectores VE deben dirixirse contra as vías respiratorias condutoras, xa que é aí onde comeza a enfermidade pulmonar con FQ. A administración do vector máis profundamente no pulmón pode resultar nunha transdución alveolar, pero isto non ten ningún beneficio terapéutico na FQ. Non obstante, os fluídos como os portadores de xenes migran naturalmente aos alvéolos tras a inspiración despois da administración3,4 e as partículas terapéuticas son eliminadas rapidamente na cavidade oral mediante a TCM. A eficiencia da transdución do VE está directamente relacionada co tempo que o vector permanece xunto ás células diana para permitir a absorción celular (o "tempo de residencia"5), que se reduce facilmente mediante o fluxo de aire rexional típico, así como a captura coordinada de moco de partículas e a TCM. Para a FQ, a capacidade de prolongar o tempo de residencia do VE dentro das vías respiratorias é importante para lograr altos niveis de transdución nesta rexión, pero ata agora foi un reto.
Para superar este obstáculo, suxerimos que as partículas magnéticas (MP) das vías respiratorias (LV) poden axudar de dúas maneiras complementarias. En primeiro lugar, poden ser guiadas magneticamente cara á superficie das vías respiratorias para mellorar a orientación e axudar a que as partículas portadoras de xenes residan na rexión desexada das vías respiratorias; e (ASL) para que se movan á capa celular 6. As MP utilizáronse amplamente como vehículos de administración de fármacos dirixidos cando se unen a anticorpos, fármacos quimioterapéuticos ou outras pequenas moléculas que se unen ás membranas celulares ou a receptores relevantes da superficie celular e se acumulan en sitios tumorais en presenza de electricidade estática. Campos magnéticos para o tratamento do cancro 7. Outras técnicas "hipertérmicas" pretenden quentar os microplasticos (MP) cando se expoñen a campos magnéticos oscilantes, destruíndo así as células tumorais. O principio da transfección magnética, no que se usa un campo magnético como axente de transfección para mellorar a transferencia de ADN ás células, úsase habitualmente in vitro utilizando unha gama de vectores xénicos non virais e virais para liñas celulares difíciles de transducir. A eficacia da magnetotransfección de veas esquerdas (LV) foi establecida, coa administración in vitro de MP-LV a unha liña celular epiteliais bronquiais humanas en presenza dun campo magnético estático, aumentando a eficiencia da transdución en 186 veces en comparación co vector LV só. Os MP-LV tamén se aplicaron a un modelo de fibrose quística in vitro, onde a transfección magnética aumentou a transdución de LV en cultivos de interface aire-líquido en 20 veces en presenza de esputo de fibrose quística10. Non obstante, a magnetotransfección in vivo de órganos recibiu relativamente pouca atención e só se avaliou nuns poucos estudos en animais11,12,13,14,15, especialmente no pulmóns16,17. Non obstante, as oportunidades para a transfección magnética na terapia pulmonar con fibrose quística son claras. Tan et al. (2020) afirmaron que «un estudo de proba de concepto da administración pulmonar eficiente de nanopartículas magnéticas allanará o camiño para futuras estratexias de inhalación de CFTR para mellorar os resultados clínicos en pacientes con fibrose quística»6.
O comportamento das pequenas partículas magnéticas nas superficies das vías respiratorias en presenza dun campo magnético aplicado é difícil de visualizar e estudar, e polo tanto non se comprende ben. Noutros estudos, desenvolvemos un método de imaxe de raios X por contraste de fase baseado na propagación de sincrotrón (PB-PCXI) para visualizar e cuantificar de forma non invasiva cambios mínimos in vivo na profundidade do ASL18 e no comportamento do MCT19,20 para medir directamente a hidratación da superficie do canal de gas e utilizalo como indicador temperán da eficacia do tratamento. Ademais, o noso método de avaliación MCT utiliza partículas de 10 a 35 µm de diámetro compostas de alúmina ou vidro de alto índice de refracción como marcadores MCT visibles mediante PB-PCXI21. Ambas as técnicas son axeitadas para a visualización dunha variedade de tipos de partículas, incluídas as MP.
Debido á súa alta resolución espacial e temporal, as nosas técnicas de análise ASL e MCT baseadas en PB-PCXI son axeitadas para examinar a dinámica e os patróns do comportamento de partículas individuais e a granel in vivo, o que nos axudou a comprender e optimizar as técnicas de administración de xenes MP. O enfoque que empregamos aquí deriva dos nosos estudos utilizando a liña de luz SPring-8 BL20B2, na que visualizamos o movemento de fluídos despois da administración dunha dose vectorial simulada nas vías respiratorias nasais e pulmonares de ratos para axudar a explicar os nosos patróns de expresión xénica non uniformes observados nos nosos estudos en animais con doses de portadores de xenes 3,4.
O obxectivo deste estudo foi usar o sincrotrón PB-PCXI para visualizar os movementos in vivo dunha serie de MP na traquea de ratas vivas. Estes estudos de imaxe PB-PCXI foron deseñados para probar unha gama de MP, intensidades de campo magnético e localizacións para determinar o seu efecto no movemento dos MP. A nosa hipótese foi que un campo magnético aplicado externamente axudaría ao MP administrado a permanecer ou moverse á área obxectivo. Estes estudos tamén nos permitiron identificar configuracións de imáns que maximizan o número de partículas retidas na traquea despois da deposición. Nunha segunda serie de estudos, buscamos usar esta configuración óptima para demostrar o patrón de transdución resultante da administración in vivo de MP-LV ás vías respiratorias da rata, baseándonos na suposición de que a administración de MP-LV no contexto da focalización das vías respiratorias resultaría nunha mellora da eficiencia da transdución do LV.
Todos os estudos con animais realizáronse segundo os protocolos aprobados pola Universidade de Adelaida (M-2019-060 e M-2020-022) e o Comité de Ética Animal do Sincrotrón SPring-8. Os experimentos realizáronse segundo as directrices de ARRIVE.
Todas as imaxes de raios X realizáronse na liña de feixe BL20XU do sincrotrón SPring-8 no Xapón, empregando unha configuración similar á descrita anteriormente21,22. En resumo, a caixa experimental estaba situada a 245 m do anel de almacenamento do sincrotrón. Para os estudos de imaxes de partículas utilízase unha distancia mostra-detector de 0,6 m e de 0,3 m para os estudos de imaxes in vivo para xerar efectos de contraste de fase. Empregouse unha enerxía de feixe monocromática de 25 keV. As imaxes capturáronse empregando un conversor de raios X de alta resolución (SPring-8 BM3) acoplado a un detector sCMOS. O conversor converte os raios X en luz visible empregando un centelleador de 10 µm de grosor (Gd3Al2Ga3O12), que logo se dirixe a un sensor sCMOS empregando un obxectivo de microscopio × 10 (NA 0,3). O detector sCMOS foi Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Xapón) cun tamaño de matriz de 2048 × 2048 píxeles e un tamaño de píxel bruto de 6,5 × 6,5 µm. Esta configuración produce un tamaño de píxel isotrópico efectivo de 0,51 µm e un campo de visión de aproximadamente 1,1 mm × 1,1 mm. Escolleuse unha lonxitude de exposición de 100 ms para maximizar a relación sinal-ruído das partículas magnéticas dentro e fóra das vías respiratorias, minimizando ao mesmo tempo os artefactos de movemento inducidos pola respiración. Para os estudos in vivo, colocouse un obturador rápido de raios X na traxectoria dos raios X para limitar a dose de radiación bloqueando o feixe de raios X entre as exposicións.
O portador de LV non se empregou en ningún estudo de imaxe SPring-8 PB-PCXI porque a cámara de imaxe BL20XU non ten a certificación de Nivel de Bioseguridade 2. No seu lugar, seleccionamos unha gama de micromembranas ben caracterizadas de dous provedores comerciais (que abarcan unha ampla gama de tamaños, materiais, concentracións de ferro e aplicacións) primeiro para comprender como os campos magnéticos afectan o movemento das micromembranas dentro dos capilares de vidro e, a continuación, nas vías respiratorias vivas. na superficie. Os MP varían en tamaño de 0,25 a 18 μm e están feitos dunha variedade de materiais (véxase a Táboa 1), pero descoñécese a composición de cada mostra, incluído o tamaño das partículas magnéticas dentro do MP. Baseándonos nos nosos extensos estudos de MCT 19, 20, 21, 23, 24, agardamos que se poidan ver MP de ata 5 μm na superficie das vías respiratorias traqueais, por exemplo, restando fotogramas consecutivos para ver unha mellor visibilidade do movemento do MP. Un único MP de 0,25 μm de tamaño é menor que a resolución do dispositivo de imaxe, pero espérase que o PB-PCXI detecte o seu contraste de volume e o movemento do fluído superficial sobre o que se depositan despois da deposición.
As mostras para cada MP da Táboa 1 preparáronse en capilares de vidro de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EUA) cun diámetro interior de 0,63 mm. As partículas corpusculares están dispoñibles en auga, mentres que as partículas CombiMag están dispoñibles no fluído patentado do fabricante. Cada tubo énchese ata a metade con líquido (aproximadamente 11 μl) e colócase no soporte da mostra (ver Figura 1). Os capilares de vidro colocáronse horizontalmente na platina da mostra na caixa de imaxes, respectivamente, e colocáronse nos bordos do fluído. Un imán de terras raras, neodimio, ferro e boro (NdFeB) de 19 mm de diámetro (28 mm de longo) con carcasa de níquel e 19 mm de diámetro (28 mm de longo) cunha magnetización residual de 1,17 Tesla conectouse a unha platina de translación separada para conseguir cambiar a súa posición de forma remota durante a obtención de imaxes. A adquisición de imaxes de raios X comeza cando o imán se coloca aproximadamente a 30 mm por riba da mostra e as imaxes adquírense a unha velocidade de 4 fotogramas por segundo. Durante a obtención de imaxes, o imán achegouse preto do tubo capilar de vidro (a aproximadamente 1 mm de distancia) e despois desprazado ao longo do tubo para avaliar os efectos da intensidade do campo e a posición.
Configuración de imaxe in vitro que contén mostras de microscopía multifásica en capilares de vidro na etapa de translación xy da mostra. A traxectoria do feixe de raios X está marcada cunha liña vermella discontinua.
Unha vez establecida a visibilidade in vitro dos MP, probouse un subconxunto deles in vivo en ratas Wistar albinas femias de tipo salvaxe (~12 semanas de idade, ~200 g). 0,24 mg/kg de medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Xapón), 3,2 mg/kg de midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Xapón) e 4 mg/kg de butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). As ratas foron anestesiadas cunha mestura de Pharma, Xapón) por inxección intraperitoneal. Despois da anestesia, preparáronse para a obtención de imaxes eliminando o pelo arredor da traquea, inserindo un tubo endotraqueal (ET; cánula iv de 16 Ga, Terumo BCT) e inmobilizándoas en decúbito supino sobre unha placa de imaxe feita á medida que contiña unha bolsa térmica para manter a temperatura corporal22. A continuación, a placa de imaxe uniuse á platina de translación da mostra na caixa de imaxe cun lixeiro ángulo para aliñar a traquea horizontalmente na imaxe de raios X, como se mostra na Figura. 2a.
(a) Configuración de imaxes in vivo na caixa de imaxes SPring-8, a traxectoria do feixe de raios X está marcada cunha liña vermella discontinua. (b, c) A localización do imán na traquea realizouse de forma remota usando dúas cámaras IP montadas ortogonalmente. No lado esquerdo da imaxe da pantalla, pódese ver o bucle de arame que suxeita a cabeza e a cánula de administración no seu lugar dentro do tubo ET.
Un sistema de bomba de xiringa con control remoto (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) que usa unha xiringa de vidro de 100 μl conectouse a un tubo de PE10 (diámetro exterior 0,61 mm, diámetro interior 0,28 mm) mediante unha agulla de 30 Ga. Marque o tubo para asegurarse de que a punta estea na posición correcta na traquea ao inserir o tubo endotraqueal. Usando a microbomba, retirouse o émbolo da xiringa mentres a punta do tubo se mergullaba na mostra MP que se ía administrar. O tubo de administración cargado inseriuse entón no tubo endotraqueal, colocando a punta dentro da parte máis forte do noso campo magnético aplicado esperado. A adquisición de imaxes controlouse mediante un detector de respiración conectado á nosa caixa de temporización baseada en Arduino, e todos os sinais (por exemplo, temperatura, respiración, apertura/peche do obturador e adquisición de imaxes) rexistráronse usando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Ao tomar imaxes, cando o recinto era inaccesible, dúas cámaras IP (Panasonic BB-SC382) colocáronse aproximadamente a 90° entre si e usáronse para monitorizar a posición do imán en relación con... á traquea durante a obtención de imaxes (Fig. 2b, c). Para minimizar os artefactos de movemento, adquiriuse unha imaxe por respiración durante a meseta do fluxo de fin de marea.
Un imán está conectado a unha segunda etapa que se pode situar remotamente desde o exterior da carcasa de imaxe. Probáronse varias posicións e configuracións do imán, incluíndo: montado nun ángulo de aproximadamente 30° por riba da traquea (configuracións que se mostran nas figuras 2a e 3a); un imán por riba do animal e o outro por debaixo, cos polos configurados para atraer (figura 3b); un imán por riba do animal e o outro por debaixo, cos polos configurados para repeler (figura 3c); e un imán por riba e perpendicular á traquea (figura 3d). Unha vez configurado o animal e o imán e cargado o MP que se vai probar na bomba de xiringa, administrar unha dose de 50 μl a unha velocidade de 4 μl/s mentres se adquiren imaxes. O imán móvese entón cara adiante e cara atrás ao longo ou lateralmente a través da traquea mentres se continúa a adquirir imaxes.
Configuración do imán para a obtención de imaxes in vivo (a) un único imán sobre a traquea nun ángulo de aproximadamente 30°, (b) dous imáns configurados para atraer, (c) dous imáns configurados para repeler, (d) un único imán sobre e perpendicular á traquea. O observador miraba cara abaixo desde a boca ata os pulmóns a través da traquea, e o feixe de raios X pasaba polo lado esquerdo da rata e saía polo lado dereito. O imán móvese ao longo da lonxitude das vías respiratorias ou á esquerda e á dereita sobre a traquea na dirección do feixe de raios X.
Tamén procuramos determinar a visibilidade e o comportamento das partículas nas vías respiratorias en ausencia de respiración e movemento cardíaco confusos. Polo tanto, ao final do período de imaxe, os animais foron sacrificados de forma humanitaria por sobredose de pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, EUA; ~65 mg/kg ip). Algúns animais foron deixados na plataforma de imaxe e, unha vez que a respiración e os latexos do corazón cesaron, repetiuse o proceso de imaxe, engadindo unha dose adicional de MP se non había MP visible na superficie das vías respiratorias.
As imaxes adquiridas foron corrixidas en campo plano e campo escuro e logo ensambláronse nunha película (20 fotogramas por segundo; 15-25 × velocidade normal dependendo da frecuencia respiratoria) usando un script personalizado escrito en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Todos os estudos de administración de vectores xénicos de LV realizáronse no Centro de Investigación de Animais de Laboratorio da Universidade de Adelaida e o seu obxectivo era usar os resultados do experimento SPring-8 para avaliar se a administración de LV-MP en presenza dun campo magnético podería mellorar a transferencia de xenes in vivo. Para avaliar os efectos da MP e o campo magnético, tratáronse dous grupos de animais: a un grupo administróuselle LV-MP cun imán colocado e ao outro grupo recibiu un grupo de control con LV-MP sen imán.
Os vectores xénicos LV xeráronse empregando métodos descritos previamente25, 26. O vector LacZ expresa o xene da beta-galactosidase localizado no núcleo impulsado polo promotor constitutivo do MPSV (LV-LacZ), que produce un produto de reacción azul nas células transducidas, visible nas frontes do tecido pulmonar e nas seccións de tecido. A titulación realizouse en cultivos celulares contando manualmente o número de células LacZ positivas cun hemocitómetro para calcular o título en TU/ml. Os soportes crioprésérvanse a -80 °C, desconxélanse antes do seu uso e únense a CombiMag mesturándoo nunha proporción 1:1 e incubándose en xeo durante polo menos 30 minutos antes da súa entrega.
As ratas Sprague Dawley normais (n = 3/grupo, ~2-3 foron anestesiadas intraperitonealmente cunha mestura de 0,4 mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) e 60 mg/kg de ketamina (Ilium, Australia) (meses de idade) ip) e canulación oral non cirúrxica cunha cánula iv de 16 Ga. Para garantir que o tecido das vías respiratorias traqueais recibe a transdución do ventrículo esquerdo (VE), acondicionouse mediante o noso protocolo de perturbación mecánica descrito previamente, no que a superficie das vías respiratorias traqueais se fregaba axialmente cunha cesta de arame (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, EUA) durante 30 s28. A administración traqueal de MP-VE realizouse nunha cabina de seguridade biolóxica aproximadamente 10 minutos despois da perturbación.
O campo magnético empregado neste experimento configurouse de xeito similar ao estudo de imaxe de raios X in vivo, cos mesmos imáns mantidos sobre a traquea mediante clips de stent de destilación (Figura 4). Un volume de 50 μl (2 alícuotas de 25 μl) de LV-MP foi administrado na traquea (n = 3 animais) usando unha pipeta que contiña unha punta de xel como se describiu anteriormente. Un grupo de control (n = 3 animais) recibiu os mesmos LV-MP sen o uso dun imán. Unha vez completada a infusión, a cánula retírase do tubo ET e o animal é extubado. O imán permanece no seu lugar durante 10 minutos e, a continuación, retírase. As ratas recibiron unha dose subcutánea de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguida da reversión da anestesia mediante inxección intraperitoneal de 1 mg/kg de clorhidrato de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Australia). As ratas mantivéronse quentes e monitorizadas ata a recuperación completa da anestesia.
Dispositivo de administración LV-MP nunha cabina de seguridade biolóxica. Pódese ver o conector Luer gris claro do tubo ET sobresaíndo da boca e a punta de xel da pipeta que se mostra na imaxe insírese a través do tubo ET ata a profundidade desexada na traquea.
Unha semana despois do procedemento de dosificación de LV-MP, os animais foron sacrificados de forma humanitaria mediante inhalación de CO2 ao 100 % e a expresión de LacZ avaliouse mediante o noso tratamento estándar con X-gal. Os tres aneis caudais máis cartilaxinosos foron retirados para garantir que non se incluíse na análise ningún dano mecánico ou retención de líquidos derivada da colocación do tubo endotraqueal. Cada traquea cortouse lonxitudinalmente para crear dúas metades para a súa análise e montáronse nunha placa que contiña goma de silicona (Sylgard, Dow Inc) cunha agulla Minutien (Fine Science Tools) para visualizar a superficie luminal. A distribución e o patrón das células transducidas confirmáronse mediante fotografía frontal cun microscopio Nikon (SMZ1500) cunha cámara DigiLite e o software TCapture (Tucsen Photonics, China). As imaxes adquirironse cun aumento de 20x (incluíndo o axuste máis alto para o ancho completo da traquea), con toda a lonxitude da traquea fotografada paso a paso, garantindo unha superposición suficiente entre cada imaxe para permitir a "costura" das imaxes. Despois, ensambláronse imaxes de cada traquea. nunha única imaxe composta usando o Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) utilizando un algoritmo de movemento planar. As áreas de expresión de LacZ en imaxes compostas da traquea de cada animal foron cuantificadas usando un script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como se describiu anteriormente, usando configuracións de 0,35 < Ton < 0,58, Saturación > 0,15 e Valor < 0,7. Ao trazar os contornos do tecido, xerouse manualmente unha máscara en GIMP v2.10.24 para cada imaxe composta co fin de identificar a área do tecido e evitar calquera detección falsa desde fóra do tecido traqueal. As áreas tinguidas de todas as imaxes compostas de cada animal foron sumadas para xerar a área tinguida total para ese animal. A área tinguida dividiuse entón pola área total da máscara para xerar a área normalizada.
Cada traquea foi incluída en parafina e cortáronse seccións de 5 μm. As seccións foron contratungidas con vermello neutro rápido durante 5 minutos e as imaxes foron adquiridas cun microscopio Nikon Eclipse E400, unha cámara DS-Fi3 e o software de captura de elementos NIS (versión 5.20.00).
Todas as análises estatísticas realizáronse en GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). A significación estatística axustouse a p ≤ 0,05. A normalidade verificouse mediante a proba de Shapiro-Wilk e as diferenzas na tinción de LacZ avaliáronse mediante a proba t para células non pareadas.
Os seis MP descritos na Táboa 1 examináronse mediante PCXI, e a visibilidade descríbese na Táboa 2. Dous MP de poliestireno (MP1 e MP2; 18 μm e 0,25 μm, respectivamente) non eran visibles con PCXI, pero o resto das mostras eran identificables (móstranse exemplos na Figura 5). MP3 e MP4 (10-15 % de Fe3O4; 0,25 μm e 0,9 μm, respectivamente) son lixeiramente visibles. Aínda que contén algunhas das partículas máis pequenas probadas, MP5 (98 % de Fe3O4; 0,25 μm) foi a máis pronunciada. O produto CombiMag MP6 é difícil de detectar. En todos os casos, a nosa capacidade para detectar MP mellorou significativamente ao trasladar o imán cara adiante e cara atrás paralelamente ao capilar. Cando os imáns se afastaban do capilar, as partículas estendíanse en longas cordas, pero a medida que os imáns se achegaban e a intensidade do campo magnético aumentaba, as cordas de partículas acurtábanse a medida que as partículas migraban cara á superficie superior do capilar (ver Vídeo Suplementario). S1: MP4), aumentando a densidade de partículas da superficie. Pola contra, cando o imán se retira do capilar, a intensidade do campo diminúe e os MP reorganizanse en longas cordas que se estenden desde a superficie superior do capilar (véxase o vídeo complementario S2:MP4). Despois de que o imán deixe de moverse, as partículas continúan movéndose durante un curto período de tempo despois de alcanzar a posición de equilibrio. A medida que o MP se move cara adiante e lonxe da superficie superior do capilar, as partículas magnéticas normalmente arrastran os restos a través do fluído.
A visibilidade de MP baixo PCXI varía significativamente entre as mostras. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. Todas as imaxes que se mostran aquí foron tomadas cun imán situado aproximadamente a 10 mm directamente por riba do capilar. Os círculos grandes aparentes son burbullas de aire atrapadas nos capilares, o que mostra claramente as características dos bordos en branco e negro da imaxe de contraste de fase. A caixa vermella contén a ampliación para mellorar o contraste. Teña en conta que os diámetros dos esquemas dos imáns en todas as figuras non están a escala e son aproximadamente 100 veces maiores do que se mostra.
A medida que o imán se despraza á esquerda e á dereita ao longo da parte superior do capilar, o ángulo da corda de MP cambia para aliñarse co imán (véxase a Figura 6), delineando así as liñas do campo magnético. Para MP3-5, despois de que a corda alcance un ángulo limiar, as partículas son arrastradas ao longo da superficie superior do capilar. Isto a miúdo resulta en que os MP se agrupen en grupos máis grandes preto de onde o campo magnético é máis forte (véxase o Vídeo Suplementario S3:MP5). Isto tamén é particularmente evidente cando se obteñen imaxes preto do extremo do capilar, o que fai que os MP se agreguen e se concentren na interface fluído-aire. As partículas en MP6, que eran máis difíciles de discernir que en MP3-5, non foron arrastradas mentres o imán se movía ao longo do capilar, senón que as cordas de MP disociáronse, deixando as partículas no campo de visión (véxase o Vídeo Suplementario S4:MP6). Nalgúns casos, cando o campo magnético aplicado se reduciu movendo o imán unha gran distancia da localización da imaxe, calquera MP restante descendeu lentamente á superficie inferior do tubo por gravidade mentres permanecía na corda (véxase o Vídeo Suplementario S5: MP3).
O ángulo da corda MP cambia a medida que o imán se despraza cara á dereita por riba do capilar. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. A caixa vermella contén o aumento para mellorar o contraste. Teña en conta que os vídeos suplementarios son informativos, xa que revelan información importante sobre a estrutura das partículas e a dinámica que non se pode visualizar nestas imaxes estáticas.
As nosas probas demostraron que mover o imán lentamente cara adiante e cara atrás ao longo da traquea facilita a visualización do MP no contexto de movementos complexos in vivo. Non se realizaron probas in vivo xa que as esferas de poliestireno (MP1 e MP2) non eran visibles no capilar. Cada un dos catro MP restantes probouse in vivo co eixe longo do imán configurado por riba da traquea nun ángulo duns 30° con respecto á vertical (ver as figuras 2b e 3a), xa que isto resultou en cadeas de MP máis longas e foi máis eficaz que a configuración do imán terminada. MP3, MP4 e MP6 non se detectaron na traquea de ningún animal vivo. Cando se fotografaron as vías respiratorias das ratas despois de que os animais fosen sacrificados de forma humanitaria, as partículas permaneceron invisibles mesmo cando se engadiu un volume adicional usando unha bomba de xiringa. MP5 tiña o maior contido de óxido de ferro e era a única partícula visible, polo que se utilizou para avaliar e caracterizar o comportamento in vivo do MP.
Ao colocar o imán sobre a traquea durante a administración dos MP, conseguiuse que moitos MP, pero non todos, se concentrasen no campo de visión. As partículas que entran na traquea obsérvanse mellor en animais sacrificados de forma humanitaria. A Figura 7 e o Vídeo Suplementario S6: o MP5 mostran unha rápida captura magnética e aliñamento de partículas na superficie da traquea ventral, o que indica que os MP poden dirixirse ás rexións desexadas da traquea. Ao buscar máis distalmente ao longo da traquea despois da administración dos MP, atopáronse algúns MP máis preto da carina, o que suxire que a intensidade do campo magnético era insuficiente para recoller e reter todos os MP, xa que se administraban a través da rexión de máxima intensidade do campo magnético durante o proceso do fluído. Non obstante, as concentracións de MP posparto foron maiores arredor da área fotografada, o que suxire que moitos MP permaneceron nas rexións das vías respiratorias onde a intensidade do campo magnético aplicado era maior.
Imaxes de (a) antes e (b) despois da administración de MP5 na traquea dunha rata recentemente sacrificada co imán colocado directamente enriba da área de imaxe. A área da imaxe está situada entre os dous aneis de cartilaxe. Antes da administración de MP, hai algo de líquido nas vías respiratorias. A caixa vermella contén o aumento para mellorar o contraste. Estas imaxes son do vídeo que se mostra no vídeo complementario S6:MP5.
A translación do imán ao longo da traquea in vivo provocou que a cadea de partículas microplasticas cambiase de ángulo dentro da superficie das vías respiratorias dun xeito similar ao observado nos capilares (véxase a Figura 8 e o Vídeo Suplementario S7:MP5). Non obstante, no noso estudo, os partículas microplasticas non puideron ser arrastradas pola superficie das vías respiratorias vivas como poderían facelo cos capilares. Nalgúns casos, a cadea de partículas alóngase a medida que o imán se move á esquerda e á dereita. Curiosamente, tamén descubrimos que a cadea de partículas parece cambiar a profundidade da capa de fluído superficial cando o imán se move lonxitudinalmente ao longo da traquea e se expande cando o imán se move directamente por riba e a cadea de partículas se xira a unha posición vertical (véxase o Vídeo Suplementario S7). : MP5 ás 0:09, abaixo á dereita). O patrón de movemento característico cambiou cando o imán se trasladou lateralmente pola parte superior da traquea (é dicir, á esquerda ou á dereita do animal en lugar de ao longo da lonxitude da traquea). As partículas aínda eran claramente visibles mentres se movían, pero cando se retirou o imán da traquea, as puntas das cadeas de partículas fixéronse visibles (véxase o vídeo complementario S8:MP5, que comeza ás 0:08). Isto é consistente co comportamento de MP que observamos baixo un campo magnético aplicado nun capilar de vidro.
Imaxes de exemplo que mostran MP5 na traquea dunha rata anestesiada viva. (a) O imán úsase para adquirir imaxes por riba e á esquerda da traquea e, a continuación (b) despois de mover o imán á dereita. A caixa vermella contén o aumento para mellorar o contraste. Estas imaxes son do vídeo que se mostra no vídeo complementario S7:MP5.
Cando os dous polos se configuraban nunha orientación norte-sur por riba e por debaixo da traquea (é dicir, atraendo; Fig. 3b), as cordas MP parecían máis longas e estaban situadas na parede lateral da traquea en lugar de na superficie dorsal da traquea (véxase o vídeo suplementario S9:MP5). Non obstante, non se detectaron altas concentracións de partículas nunha soa localización (é dicir, a superficie dorsal da traquea) despois da administración de fluídos cando se utilizaba un dispositivo de dobre imán, o que normalmente ocorre cando se utiliza un dispositivo dun só imán. Despois, cando se configuraba un imán para repeler os polos invertidos (Fig. 3c), o número de partículas visibles no campo de visión non parecía aumentar despois da administración. A configuración de ambas configuracións de dobre imán é complexa debido ás altas intensidades do campo magnético que atraen ou empurran os imáns, respectivamente. A configuración cambiouse entón a un só imán paralelo á vía aérea pero que pasaba pola vía aérea a 90 graos para que as liñas de campo cruzasen a parede da traquea ortogonalmente (Fig. 3d), unha orientación deseñada para determinar se se podía observar agregación de partículas na parede lateral. Non obstante, neste configuración, non houbo ningún movemento identificable de acumulación de MP nin movemento do imán. Baseándose en todos estes resultados, elixiuse unha configuración de imán único con orientación de 30 graos (Figura 3a) para os estudos in vivo de portadores de xenes.
Cando se fotografaron repetidamente o animal inmediatamente despois do sacrificio humanitario, a ausencia de movemento tecido confuso significou que se podían discernir liñas de partículas máis finas e curtas no campo intercondral claro, "tambaleantes" en liña co movemento de translación do imán. Non obstante, aínda non se pode ver claramente a presenza e o movemento das partículas de MP6.
O título de LV-LacZ foi de 1,8 × 108 TU/ml e, despois dunha mestura 1:1 con CombiMag MP (MP6), os animais recibiron unha dose traqueal de 50 μl de 9 × 107 TU/ml de vehículo LV (é dicir, 4,5 × 106 TU/rata). Nestes estudos, en lugar de trasladar o imán durante o parto, fixamos o imán nunha posición para determinar se a transdución do LV (a) podía mellorar en comparación coa administración de vectores en ausencia dun campo magnético e (b) podía enfocarse. As células das vías respiratorias transdúcense a rexións diana magnéticas das vías respiratorias superiores.
A presenza de imáns e o uso de CombiMag combinado con vectores LV non pareceron ter efectos adversos sobre a saúde animal, do mesmo xeito que o noso protocolo estándar de administración de vectores LV. As imaxes frontais da rexión traqueal sometida a perturbación mecánica (Fig. suplementaria 1) indicaron que había niveis significativamente máis altos de transdución no grupo de animais tratados con LV-MP cando o imán estaba presente (Fig. 9a). Só unha pequena cantidade de tinción azul LacZ estaba presente no grupo de control (Fig. 9b). A cuantificación das áreas tinguidas con X-Gal normalizadas mostrou que a administración de LV-MP en presenza dun campo magnético produciu unha mellora de aproximadamente 6 veces (Fig. 9c).
Imaxes compostas de exemplo que mostran a transdución traqueal mediante MP-LV (a) en presenza dun campo magnético e (b) en ausencia dun imán. (c) Mellora estatisticamente significativa na área de transdución de LacZ normalizada dentro da traquea ao usar o imán (*p = 0,029, proba t, n = 3 por grupo, media ± SEM).
As seccións tinguidas con vermello rápido neutro (exemplo mostrado na figura suplementaria 2) mostraron células tinguidas con LacZ presentes nun patrón e localización similares aos informados anteriormente.
Un desafío clave para a terapia xénica das vías respiratorias segue a ser a localización precisa das partículas transportadoras nas rexións de interese e acadar altos niveis de eficiencia de transdución no pulmón en movemento en presenza de fluxo de aire e eliminación activa de moco. Para os transportadores de ventrículo esquerdo deseñados para tratar a enfermidade das vías respiratorias con fibrose quística, aumentar o tempo de residencia das partículas transportadoras dentro das vías respiratorias condutoras foi un obxectivo ata agora difícil de alcanzar. Como sinalaron Castellani et al., o uso de campos magnéticos para mellorar a transdución ten vantaxes en comparación con outros métodos de administración de xenes, como a electroporación, xa que pode combinar simplicidade, rendibilidade, localización da administración, maior eficiencia e tempos de incubación máis curtos, e posiblemente unha dose de transportador menor10. Non obstante, a deposición e o comportamento in vivo de partículas magnéticas nas vías respiratorias baixo a influencia de forzas magnéticas externas nunca se describiron, nin se demostrou realmente a viabilidade deste método in vivo para mellorar os niveis de expresión xénica en vías respiratorias vivas intactas.
Os nosos experimentos in vitro de sincrotrón PCXI mostraron que todas as partículas que probamos, coa excepción do MP de poliestireno, eran visibles na configuración de imaxe que empregamos. En presenza dun campo magnético, os MP forman cordas cuxas lonxitudes están relacionadas co tipo de partícula e a intensidade do campo magnético (é dicir, a proximidade e o movemento do imán). Como se mostra na Figura 10, as cordas que observamos fórmanse debido a que cada partícula individual se magnetiza e induce o seu propio campo magnético local. Estes campos separados fan que outras partículas similares se agreguen e conecten, con movementos semellantes ás cordas de grupo debido ás forzas locais das forzas atractivas e repulsivas locais doutras partículas.
Esquema que mostra (a, b) trens de partículas xerados dentro de capilares cheos de fluído e (c, d) traquea chea de aire. Obsérvese que os capilares e a traquea non están debuxados a escala. O panel (a) tamén contén unha descrición do microprocesador, que contén partículas de Fe3O4 dispostas en cadeas.
Cando o imán se moveu por riba do capilar, o ángulo da cadea de partículas alcanzou un limiar crítico para o MP3-5 que contén Fe3O4, despois do cal a cadea de partículas xa non permaneceu na posición orixinal, senón que se moveu ao longo da superficie ata unha nova posición. É probable que este efecto se produza porque a superficie capilar de vidro é o suficientemente lisa como para permitir que se produza este movemento. Curiosamente, o MP6 (CombiMag) non se comportou deste xeito, posiblemente porque as partículas eran máis pequenas, tiñan diferentes revestimentos ou cargas superficiais, ou un fluído portador patentado afectou á súa capacidade de movemento. O contraste da imaxe das partículas CombiMag tamén é máis débil, o que suxire que o fluído e as partículas poden ter densidades similares e, polo tanto, non se moven facilmente unhas cara ás outras. As partículas tamén poden quedar atascadas se o imán se move demasiado rápido, o que indica que a intensidade do campo magnético non sempre pode superar a fricción entre as partículas no fluído, o que suxire que quizais non sexa sorprendente que a intensidade do campo magnético e a distancia entre o imán e a área obxectivo sexan moi importantes. En conxunto, estes resultados tamén suxiren que, aínda que os imáns poden capturar moitos MP que flúen a través da área obxectivo, é pouco probable que se poida confiar nos imáns para moverse. Partículas de CombiMag ao longo da superficie da traquea. Polo tanto, concluímos que os estudos in vivo de MP-LV deberían utilizar campos magnéticos estáticos para dirixirse fisicamente a rexións específicas da árbore das vías respiratorias.
Cando as partículas chegan ao corpo, son difíciles de identificar no contexto de tecido corporal en movemento complexo, pero a capacidade de detectalas mellorouse ao trasladar o imán horizontalmente por riba da traquea para "menear" as cordas de MP. Aínda que é posible obter imaxes en directo, é máis doado discernir o movemento das partículas unha vez que o animal foi sacrificado de forma humanitaria. As concentracións de MP eran xeralmente máis altas neste lugar cando o imán se colocaba por riba da área de imaxe, aínda que algunhas partículas adoitaban atoparse máis ao longo da traquea. A diferenza dos estudos in vitro, as partículas non poden ser arrastradas ao longo da traquea trasladando o imán. Este achado é consistente coa forma en que o moco que recubre a superficie da traquea normalmente procesa as partículas inhaladas, atrapándoas no moco e posteriormente elimínaas mediante o mecanismo de eliminación mucociliar.
A nosa hipótese foi que o uso de imáns para a atracción por riba e por debaixo da traquea (Fig. 3b) podería resultar nun campo magnético máis uniforme, en lugar dun campo magnético altamente concentrado nun punto, o que podería levar a unha distribución máis uniforme das partículas. Non obstante, o noso estudo preliminar non atopou evidencias claras que apoiasen esta hipótese. Do mesmo xeito, a configuración dun par de imáns para repeler (Fig. 3c) non resultou nunha maior deposición de partículas na área fotografada. Estes dous achados demostran que a configuración de dobre imán non mellora significativamente o control local da focalización de MP e que as fortes forzas magnéticas resultantes son difíciles de configurar, o que fai que esta estratexia sexa menos práctica. Do mesmo xeito, orientar o imán por riba e a través da traquea (Fig. 3d) tampouco aumentou o número de partículas retidas na área fotografada. Algunhas destas configuracións alternativas poden non ter éxito porque resultan en intensidades de campo magnético máis baixas dentro da área de deposición. Polo tanto, a configuración dun único imán de ángulo de 30 graos (Figura 3a) considérase o método máis sinxelo e eficiente para as probas in vivo.
O estudo LV-MP demostrou que cando os vectores ventrículos esquerdos (VE) se combinaban con CombiMag e se administraban despois dunha perturbación física en presenza dun campo magnético, os niveis de transdución aumentaban significativamente na traquea en comparación cos controis. Segundo os estudos de imaxe de sincrotrón e os resultados de LacZ, o campo magnético aparentemente foi capaz de preservar o VE dentro da traquea e reducir o número de partículas vectoriais que penetraban inmediatamente no pulmón. Estas melloras na focalización poden levar a unha maior eficacia, ao tempo que reducen os títulos administrados, a transdución fóra do obxectivo, os efectos secundarios inflamatorios e inmunitarios e os custos dos portadores de xenes. É importante destacar que, segundo o fabricante, CombiMag pódese usar xunto con outros métodos de transferencia de xenes, incluídos outros vectores virais (como o AAV) e ácidos nucleicos.