نشكرك على زيارة Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصيك باستخدام متصفح محدث (أو إيقاف تشغيل وضع التوافق في Internet Explorer). في غضون ذلك، لضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط وJavaScript.
يجب أن تستهدف ناقلات الجينات لعلاج مرض الرئة التليف الكيسي الممرات الهوائية الموصلة، لأن نقل الرئة المحيطي لا يوفر فائدة علاجية. ترتبط كفاءة نقل الفيروس ارتباطًا مباشرًا بمدة إقامة الناقل. ومع ذلك، تنتشر سوائل التوصيل، مثل حاملات الجينات، بشكل طبيعي في الحويصلات الهوائية أثناء الشهيق، ويتم التخلص من الجسيمات العلاجية من أي شكل بسرعة عن طريق النقل المخاطي الهدبي. يُعد إطالة مدة إقامة حاملات الجينات في الممرات الهوائية أمرًا مهمًا ولكنه صعب التحقيق. يمكن للجسيمات المغناطيسية المقترنة بحامل الجينات، والتي يمكن توجيهها إلى سطح الممرات الهوائية، تحسين الاستهداف الإقليمي. نظرًا لتحديات التصور الحيوي، فإن سلوك هذه الجسيمات المغناطيسية الصغيرة على سطح الممرات الهوائية في وجود مجال مغناطيسي مطبق غير مفهوم جيدًا. كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام التصوير السنكروتروني لتصور الحركة الحيوية لسلسلة من الجسيمات المغناطيسية في القصبة الهوائية للفئران المخدرة، وذلك لفحص ديناميكيات وأنماط سلوك الجسيمات الفردية والكتلة في الجسم الحي. ثم قمنا أيضًا بتقييم ما إذا كان توصيل الجسيمات المغناطيسية الفيروسية العدسية في وجود مجال مغناطيسي من شأنها أن تزيد من كفاءة النقل في القصبة الهوائية للفئران. يكشف التصوير بالأشعة السينية السنكروترونية عن سلوك الجسيمات المغناطيسية في المجالات المغناطيسية الثابتة والمتحركة في المختبر وفي الجسم الحي. لا يمكن سحب الجسيمات بسهولة على طول سطح مجرى الهواء الحي باستخدام المغناطيس، ولكن أثناء النقل، تتركز الرواسب في مجال الرؤية حيث يكون المجال المغناطيسي أقوى. كما زادت كفاءة النقل ستة أضعاف عندما تم توصيل الجسيمات المغناطيسية الفيروسية العدسية في وجود مجال مغناطيسي. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن الجسيمات المغناطيسية الفيروسية العدسية والمجالات المغناطيسية قد تكون طرقًا قيمة لتحسين استهداف ناقل الجينات وزيادة مستويات النقل في مجاري الهواء الموصلة في الجسم الحي.
يحدث التليف الكيسي (CF) بسبب اختلاف في جين واحد يسمى منظم توصيل الغشاء (CFTR). بروتين CFTR هو قناة أيونية موجودة في العديد من الخلايا الظهارية في جميع أنحاء الجسم، بما في ذلك مجاري الهواء الموصلة، وهو موقع رئيسي لمرض التليف الكيسي. تؤدي عيوب CFTR إلى نقل غير طبيعي للمياه، مما يؤدي إلى تجفيف سطح مجرى الهواء وتقليل عمق طبقة سائل سطح مجرى الهواء (ASL). وهذا يضعف أيضًا قدرة نظام النقل المخاطي الهدبي (MCT) على إزالة الجسيمات المستنشقة ومسببات الأمراض من مجاري الهواء. هدفنا هو تطوير علاج جيني فيروسي عدسي (LV) لتقديم النسخة الصحيحة من جين CFTR وتحسين صحة ASL وMCT والرئة، ومواصلة تطوير تقنيات جديدة قادرة على قياس هذه المعلمات في الجسم الحي1.
تُعد نواقل البطين الأيسر من أبرز المرشحين للعلاج الجيني لمجرى الهواء في التليف الكيسي، ويرجع ذلك أساسًا إلى قدرتها على دمج الجين العلاجي بشكل دائم في الخلايا القاعدية للمجرى الهوائي (الخلايا الجذعية للمجرى الهوائي). ويكمن هذا في قدرتها على استعادة الترطيب الطبيعي وتصفية المخاط من خلال التمايز إلى خلايا سطح مجرى الهواء الوظيفية المرتبطة بالتليف الكيسي، والمصححة جينيًا، مما يؤدي إلى فوائد تدوم مدى الحياة. يجب توجيه نواقل البطين الأيسر ضد مجرى الهواء الموصل، حيث يبدأ مرض الرئة التليف الكيسي من هذا المجرى. قد يؤدي إيصال الناقل إلى عمق أكبر في الرئة إلى انتقال جيني، ولكن هذا لا يُحقق فائدة علاجية في التليف الكيسي. ومع ذلك، تهاجر السوائل، مثل حاملات الجينات، بشكل طبيعي إلى الحويصلات الهوائية عند الشهيق بعد الولادة3،4، ويتم تطهير الجسيمات العلاجية بسرعة في تجويف الفم بواسطة MCT. ترتبط كفاءة انتقال الفيروسة البطينية ارتباطًا مباشرًا بطول المدة التي يبقى فيها الناقل بجوار الخلايا المستهدفة للسماح بالامتصاص الخلوي - "وقت الإقامة"5 - والذي يُقلل بسهولة من خلال تدفق الهواء الإقليمي النموذجي، بالإضافة إلى التقاط المخاط المنسق للجسيمات وMCT. بالنسبة للتليف الكيسي، إن القدرة على إطالة زمن بقاء البطين الأيسر داخل مجرى الهواء مهمة لتحقيق مستويات عالية من انتقال السيالات في هذه المنطقة، ولكنها كانت تشكل تحديًا حتى الآن.
للتغلب على هذه العقبة، نقترح أن الجسيمات المغناطيسية للبطين الأيسر (MPs) قد تساعد بطريقتين متكاملتين. أولاً، يمكن توجيهها مغناطيسيًا إلى سطح مجرى الهواء لتحسين الاستهداف ومساعدة جزيئات حامل الجينات على الإقامة في منطقة مجرى الهواء المطلوبة؛ و (ASL) للانتقال إلى طبقة الخلية 6. وقد تم استخدام الجسيمات المغناطيسية للبطين الأيسر على نطاق واسع كمركبات مستهدفة لتوصيل الأدوية عندما ترتبط بالأجسام المضادة أو الأدوية العلاجية الكيميائية أو الجزيئات الصغيرة الأخرى التي ترتبط بأغشية الخلايا أو ترتبط بمستقبلات سطح الخلية ذات الصلة وتتراكم في مواقع الورم في وجود الكهرباء الساكنة. المجالات المغناطيسية لعلاج السرطان 7. تهدف تقنيات "فرط الحرارة" الأخرى إلى تسخين بروتينات البلازما عند تعرضها لحقول مغناطيسية متذبذبة، مما يؤدي إلى تدمير خلايا الورم. يُستخدم مبدأ النقل المغناطيسي، الذي يُستخدم فيه المجال المغناطيسي كعامل نقل لتعزيز نقل الحمض النووي إلى الخلايا، بشكل شائع في المختبر باستخدام مجموعة من ناقلات الجينات الفيروسية وغير الفيروسية لسلالات الخلايا التي يصعب نقلها. وقد ثبتت فعالية النقل المغناطيسي للبطين الأيسر، حيث تم توصيل بروتينات البلازما للبطين الأيسر إلى سلالة خلايا ظهارية قصبية بشرية في المختبر في وجود مجال مغناطيسي ثابت، مما زاد من كفاءة النقل بمقدار 186 ضعفًا مقارنةً بناقل البطين الأيسر وحده. كما طُبقت تقنية النقل المغناطيسي للبطين الأيسر على نموذج تليف كبوي في المختبر، حيث زاد النقل المغناطيسي من نقل البطين الأيسر في مزارع واجهة الهواء والسائل بمقدار 20 ضعفًا في وجود بلغم التليف الكبيبي10. ومع ذلك، لم يحظ النقل المغناطيسي للأعضاء داخل الجسم الحي باهتمام كبير نسبيًا، ولم يُقيَّم إلا في عدد قليل من الدراسات. دراسات على الحيوانات11،12،13،14،15، وخاصة في الرئتين16،17. ومع ذلك، فإن فرص النقل المغناطيسي في علاج رئة التليف الكيسي واضحة. ذكر تان وآخرون (2020) أن "دراسة إثبات المفهوم لتوصيل الجسيمات النانوية المغناطيسية الفعالة إلى الرئة ستمهد الطريق لاستراتيجيات استنشاق CFTR المستقبلية لتحسين النتائج السريرية لدى مرضى التليف الكيسي"6.
من الصعب تصور ودراسة سلوك الجسيمات المغناطيسية الصغيرة على أسطح مجرى الهواء في وجود مجال مغناطيسي مطبق، وبالتالي فهمها بشكل سيء. في دراسات أخرى، قمنا بتطوير طريقة التصوير بالأشعة السينية ذات التباين الطوري القائمة على انتشار السنكروترون (PB-PCXI) لتصور وقياس التغيرات الدقيقة في الجسم الحي في عمق ASL18 وسلوك MCT19،20 لقياس ترطيب سطح القناة الغازية بشكل مباشر واستخدامها كمؤشر مبكر لفعالية العلاج. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم طريقة تقييم MCT الخاصة بنا جزيئات بقطر 10-35 ميكرومتر تتكون من أكسيد الألومنيوم أو زجاج عالي الانكسار كعلامات MCT مرئية باستخدام PB-PCXI21. كلتا التقنيتين مناسبتان لتصور مجموعة من أنواع الجسيمات، بما في ذلك MP.
بفضل دقتها المكانية والزمانية العالية، فإن تقنيات تحليل ASL وMCT القائمة على PB-PCXI مناسبة تمامًا لفحص ديناميكيات وأنماط سلوك الجسيمات الفردية والكتلة في الجسم الحي لمساعدتنا على فهم وتحسين تقنيات توصيل جين MP. النهج الذي نستخدمه هنا مستمد من دراساتنا باستخدام خط شعاع SPring-8 BL20B2، حيث قمنا بتصور حركة السوائل بعد توصيل جرعة ناقل وهمي إلى الممرات الهوائية الأنفية والرئوية للفئران للمساعدة في تفسير أنماط التعبير الجيني غير المنتظمة التي لوحظت في دراساتنا على الحيوانات التي تحمل جرعة الجينات 3،4.
كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام السنكروترون PB-PCXI لتصور الحركات الحية لسلسلة من MPs في القصبة الهوائية للفئران الحية. تم تصميم دراسات التصوير PB-PCXI هذه لاختبار مجموعة من MPs وقوى المجال المغناطيسي والمواقع لتحديد تأثيرها على حركة MP. افترضنا أن المجال المغناطيسي المطبق خارجيًا سيساعد MP المُسلَّم على البقاء أو الانتقال إلى منطقة الهدف. سمحت لنا هذه الدراسات أيضًا بتحديد تكوينات المغناطيس التي تزيد من عدد الجسيمات المحتجزة في القصبة الهوائية بعد الترسيب. في سلسلة ثانية من الدراسات، سعينا إلى استخدام هذا التكوين الأمثل لإظهار نمط التحويل الناتج عن توصيل LV-MPs في الجسم الحي إلى مجرى الهواء للفئران، بناءً على افتراض أن توصيل LV-MPs في سياق استهداف مجرى الهواء من شأنه أن يؤدي إلى تحسين كفاءة نقل البطين الأيسر.
تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة أديلايد (M-2019-060 و M-2020-022) ولجنة أخلاقيات الحيوانات في SPring-8 السنكروترونية. تم إجراء التجارب وفقًا لإرشادات ARRIVE.
تم إجراء جميع عمليات التصوير بالأشعة السينية على خط شعاع BL20XU في السنكروترون SPring-8 في اليابان، باستخدام إعداد مماثل لما تم وصفه سابقًا21،22. باختصار، تم وضع الصندوق التجريبي على بعد 245 مترًا من حلقة تخزين السنكروترون. تُستخدم مسافة العينة إلى الكاشف 0.6 متر لدراسات تصوير الجسيمات و0.3 متر لدراسات التصوير داخل الجسم الحي لتوليد تأثيرات تباين الطور. تم استخدام طاقة شعاع أحادية اللون تبلغ 25 كيلو فولت. تم التقاط الصور باستخدام محول أشعة سينية عالي الدقة (SPring-8 BM3) متصل بكاشف sCMOS. يحول المحول الأشعة السينية إلى ضوء مرئي باستخدام وميض سمكه 10 ميكرومتر (Gd3Al2Ga3O12)، والذي يتم توجيهه بعد ذلك إلى مستشعر sCMOS باستخدام هدف المجهر × 10 (NA 0.3). كان كاشف sCMOS هو Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu تم تصميم هذا الإعداد باستخدام حجم مصفوفة 2048 × 2048 بكسل وحجم بكسل خام 6.5 × 6.5 ميكرومتر. ينتج عن هذا الإعداد حجم بكسل متساوي الخواص فعال يبلغ 0.51 ميكرومتر وحقل رؤية يبلغ حوالي 1.1 مم × 1.1 مم. تم اختيار طول التعرض 100 مللي ثانية لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء للجسيمات المغناطيسية داخل وخارج مجرى الهواء مع تقليل آثار الحركة الناجمة عن التنفس. بالنسبة للدراسات الحيوية، تم وضع مصراع الأشعة السينية السريع في مسار الأشعة السينية للحد من جرعة الإشعاع عن طريق حجب شعاع الأشعة السينية بين التعريضات.
لم يتم استخدام حامل البطين الأيسر في أي دراسات تصوير SPring-8 PB-PCXI لأن غرفة التصوير BL20XU ليست معتمدة من المستوى 2 للسلامة البيولوجية. بدلاً من ذلك، قمنا باختيار مجموعة من MPs المميزة جيدًا من موردين تجاريين - تغطي مجموعة من الأحجام والمواد وتركيزات الحديد والتطبيقات - أولاً لفهم كيفية تأثير المجالات المغناطيسية على حركة MP داخل الشعيرات الدموية الزجاجية، ثم في مجاري الهواء الحية. على السطح. تتراوح أحجام MPs من 0.25 إلى 18 ميكرومتر وتصنع من مجموعة متنوعة من المواد (انظر الجدول 1)، ولكن تركيب كل عينة، بما في ذلك حجم الجسيمات المغناطيسية داخل MP، غير معروف. بناءً على دراسات MCT المكثفة 19، 20، 21، 23، 24، نتوقع أنه يمكن رؤية MPs صغيرة تصل إلى 5 ميكرومتر على سطح مجرى الهواء القصبي، على سبيل المثال عن طريق طرح الإطارات المتتالية لرؤية رؤية محسنة لحركة MP. حجم MP واحد بحجم 0.25 ميكرومتر أصغر من دقة جهاز التصوير، ولكن من المتوقع أن يكتشف PB-PCXI تباين حجمها وحركة السائل السطحي الذي ترسبت عليه بعد الترسيب.
تم تحضير العينات لكل MP في الجدول 1 في شعيرات زجاجية سعة 20 ميكرولتر (Drummond Microcaps، PA، الولايات المتحدة الأمريكية) بقطر داخلي يبلغ 0.63 مم. تتوفر الجسيمات الجسيمية في الماء، بينما تتوفر جزيئات CombiMag في السائل الخاص بالشركة المصنعة. يتم ملء كل أنبوب حتى النصف بالسائل (حوالي 11 ميكرولتر) ووضعه على حامل العينة (انظر الشكل 1). تم وضع الشعيرات الزجاجية أفقيًا على منصة العينة في صندوق التصوير، على التوالي، ووضع حواف السائل. تم توصيل مغناطيس من النيكل بقطر 19 مم (طول 28 مم) من النيوديميوم والحديد البورون (NdFeB) (N35، رقم الكتالوج LM1652، Jaycar Electronics، أستراليا) مع مغناطيسية متبقية تبلغ 1.17 تسلا بمرحلة ترجمة منفصلة لتحقيق تغيير موضعه عن بُعد أثناء التصوير. يبدأ التقاط صورة الأشعة السينية عندما يتم وضع المغناطيس على بعد 30 مم تقريبًا فوق العينة، ويتم التقاط الصور بمعدل 4 إطارات في الثانية. أثناء التصوير، تم تقريب المغناطيس من الأنبوب الشعري الزجاجي (على بعد حوالي 1 مم) ثم نقله على طول الأنبوب لتقييم تأثيرات قوة المجال والموضع.
إعداد التصوير المختبري الذي يحتوي على عينات MP في الشعيرات الدموية الزجاجية في مرحلة ترجمة xy للعينة. يتم تمييز مسار شعاع الأشعة السينية بخط أحمر متقطع.
بمجرد تحديد الرؤية في المختبر لـ MPs، تم اختبار مجموعة فرعية منها في الجسم الحي في فئران ويستار البيضاء من النوع البري (عمرها حوالي 12 أسبوعًا، حوالي 200 جم). 0.24 مجم / كجم ميديتوميدين (Domitor®، Zenoaq، اليابان)، 3.2 مجم / كجم ميدازولام (Dormicum®، Astellas Pharma، اليابان) و 4 مجم / كجم بوتورفانول (Vetorphale®، Meiji Seika). تم تخدير الفئران بمزيج من Pharma)، Japan) عن طريق الحقن داخل الصفاق. بعد التخدير، تم إعدادهم للتصوير عن طريق إزالة الفراء حول القصبة الهوائية، وإدخال أنبوب رغامي (ET؛ قنية وريدية 16 Ga، Terumo BCT) وتثبيتهم مستلقين على لوحة تصوير مصنوعة خصيصًا تحتوي على كيس حراري للحفاظ على درجة حرارة الجسم 22. ثم تم توصيل لوحة التصوير بمرحلة ترجمة العينة في صندوق التصوير بزاوية طفيفة لمحاذاة القصبة الهوائية أفقيًا في صورة الأشعة السينية، كما هو موضح في الشكل 2أ.
(أ) إعداد التصوير الحيوي في صندوق التصوير SPring-8، تم تمييز مسار شعاع الأشعة السينية بخط أحمر متقطع. (ب، ج) تم تحديد موقع المغناطيس على القصبة الهوائية عن بعد باستخدام كاميرتين IP مثبتتين بشكل عمودي. على الجانب الأيسر من صورة الشاشة، يمكن رؤية حلقة السلك التي تحمل الرأس، وقنية التوصيل في مكانها داخل أنبوب ET.
تم توصيل نظام مضخة حقنة يتم التحكم فيه عن بعد (UMP2، World Precision Instruments، Sarasota، FL) باستخدام حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر بأنبوب PE10 (القطر الخارجي 0.61 مم، القطر الداخلي 0.28 مم) عبر إبرة مقاس 30 Ga. ضع علامة على الأنبوب للتأكد من أن الطرف في الوضع الصحيح في القصبة الهوائية عند إدخال أنبوب ET. باستخدام المضخة الدقيقة، تم سحب مكبس الحقنة بينما تم غمر طرف الأنبوب في عينة MP المراد توصيلها. تم بعد ذلك إدخال أنبوب التوصيل المحمل في الأنبوب الرغامي، مع وضع الطرف داخل أقوى جزء من المجال المغناطيسي المطبق المتوقع لدينا. تم التحكم في التقاط الصورة باستخدام كاشف تنفس متصل بصندوق التوقيت المستند إلى Arduino الخاص بنا، وتم تسجيل جميع الإشارات (مثل درجة الحرارة والتنفس وفتح/إغلاق الغالق والتقاط الصورة) باستخدام Powerlab وLabChart (AD Instruments، سيدني، أستراليا) 22. عند التصوير عندما كان العلبة تم وضع كاميرتين IP (Panasonic BB-SC382) بزاوية 90 درجة تقريبًا بالنسبة لبعضهما البعض وتم استخدامهما لمراقبة موضع المغناطيس بالنسبة للقصبة الهوائية أثناء التصوير (الشكل 2ب، ج). لتقليل آثار الحركة، تم الحصول على صورة واحدة لكل نفس أثناء هضبة التدفق في نهاية المد والجزر.
يتم توصيل مغناطيس بمرحلة ثانية يمكن وضعها عن بعد من خارج غلاف التصوير. تم اختبار أوضاع وتكوينات مغناطيسية مختلفة، بما في ذلك: تم تركيبه بزاوية 30 درجة تقريبًا فوق القصبة الهوائية (التكوينات الموضحة في الشكلين 2أ و3أ)؛ مغناطيس واحد فوق الحيوان والآخر أسفله، مع ضبط الأقطاب للجذب (الشكل 3ب)؛ مغناطيس واحد فوق الحيوان والآخر أسفله، مع ضبط الأقطاب للتنافر (الشكل 3ج)؛ ومغناطيس واحد أعلى القصبة الهوائية وعموديًا عليها (الشكل 3د). بمجرد تكوين الحيوان والمغناطيس وتحميل MP المراد اختباره في مضخة المحقنة، قم بتوصيل جرعة 50 ميكرولتر بمعدل 4 ميكرولتر/ثانية أثناء التقاط الصور. ثم يتم تحريك المغناطيس ذهابًا وإيابًا على طول القصبة الهوائية أو جانبيًا عبرها مع الاستمرار في التقاط الصور.
تكوين المغناطيس للتصوير الحيوي (أ) مغناطيس واحد فوق القصبة الهوائية بزاوية تقريبية 30 درجة، (ب) مغناطيسين مضبوطين للجذب، (ج) مغناطيسين مضبوطين للتنافر، (د) مغناطيس واحد فوق القصبة الهوائية وعمودي عليها. نظر المراقب من الفم إلى الرئتين عبر القصبة الهوائية، ومر شعاع الأشعة السينية عبر الجانب الأيسر للفأر وخرج من الجانب الأيمن. يتم تحريك المغناطيس إما على طول مجرى الهواء أو إلى اليسار واليمين فوق القصبة الهوائية في اتجاه شعاع الأشعة السينية.
كما سعينا إلى تحديد مدى وضوح وسلوك الجسيمات في مجرى الهواء في غياب التنفس المربك وحركة القلب. لذلك، في نهاية فترة التصوير، تم قتل الحيوانات بطريقة إنسانية بسبب جرعة زائدة من البنتوباربيتال (Somnopentil، Pitman-Moore، Washington Crossing، USA؛ ~65 mg/kg ip). تم ترك بعض الحيوانات على منصة التصوير، وبمجرد توقف التنفس ونبضات القلب، تم تكرار عملية التصوير، مع إضافة جرعة إضافية من MP إذا لم يكن هناك MP مرئيًا على سطح مجرى الهواء.
تم تصحيح الصور الملتقطة من حيث المجال المسطح والمجال المظلم، ثم تم تجميعها في فيلم (20 إطارًا في الثانية؛ 15-25 × سرعة طبيعية اعتمادًا على معدل التنفس) باستخدام نص مخصص مكتوب في MATLAB (R2020a، The Mathworks).
تم إجراء جميع دراسات توصيل ناقل الجينات LV في منشأة أبحاث الحيوانات المعملية في جامعة أديلايد وكان الهدف منها استخدام نتائج تجربة SPring-8 لتقييم ما إذا كان توصيل LV-MP في وجود مجال مغناطيسي يمكن أن يعزز نقل الجينات في الجسم الحي. لتقييم آثار MP والمجال المغناطيسي، تم علاج مجموعتين من الحيوانات: أعطيت مجموعة واحدة LV-MP مع وضع مغناطيس، وتلقت المجموعة الأخرى مجموعة تحكم مع LV-MP بدون مغناطيس.
تم إنشاء متجهات جين LV باستخدام الطرق الموصوفة مسبقًا 25 و 26. يعبر ناقل LacZ عن جين بيتا غالاكتوزيداز الموضعي النووي الذي يحركه مروج MPSV التكويني (LV-LacZ)، والذي ينتج منتج تفاعل أزرق في الخلايا المحولة، والذي يمكن رؤيته في واجهات أنسجة الرئة ومقاطع الأنسجة. تم إجراء المعايرة في مزارع الخلايا عن طريق العد اليدوي لعدد الخلايا الإيجابية LacZ باستخدام عداد الكريات الدموية لحساب العيار بوحدة TU/ml. يتم حفظ الناقلات بالتبريد عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، وإذابتها قبل الاستخدام، وربطها بـ CombiMag عن طريق الخلط بنسبة 1:1 واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التسليم.
تم تخدير فئران سبراغ داولي الطبيعية (ن = 3/مجموعة، حوالي 2-3) داخل الصفاق بمزيج من 0.4 ملغ/كغ ميديتوميدين (دوميتور، إيليوم، أستراليا) و60 ملغ/كغ كيتامين (إيلوم، أستراليا) عن طريق الحقن داخل الصفاق (ip) والقسطرة الفموية غير الجراحية باستخدام قسطرة وريدية مقاس 16 غالون. ولضمان أن أنسجة مجرى الهواء القصبي تتلقى نقل البطين الأيسر، تم تجهيزها باستخدام بروتوكول الاضطراب الميكانيكي الموصوف سابقًا، حيث تم فرك سطح مجرى الهواء القصبي محوريًا بسلة سلكية (N-Circle، Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH، Cook Medical، الولايات المتحدة الأمريكية) 30 ثانية28. ثم تم إجراء إعطاء LV-MP للقصبة الهوائية في خزانة أمان بيولوجية بعد حوالي 10 دقائق من الاضطراب.
تم تكوين المجال المغناطيسي المستخدم في هذه التجربة بطريقة مماثلة لدراسة التصوير بالأشعة السينية في الجسم الحي، مع تثبيت نفس المغناطيس فوق القصبة الهوائية باستخدام مشابك الدعامة التقطيرية (الشكل 4). تم توصيل حجم 50 ميكرولتر (2 × 25 ميكرولتر من أجزاء صغيرة) من LV-MP إلى القصبة الهوائية (ن = 3 حيوانات) باستخدام ماصة تحتوي على طرف هلامي كما هو موضح سابقًا. تلقت مجموعة التحكم (ن = 3 حيوانات) نفس LV-MPs دون استخدام مغناطيس. بعد اكتمال التسريب، تتم إزالة القنية من أنبوب ET ويتم إخراج الحيوان من الأنبوب. يبقى المغناطيس في مكانه لمدة 10 دقائق، ثم يتم إزالته. تلقت الفئران جرعة تحت الجلد من ميلوكسيكام (1 مل / كجم) (Ilium، أستراليا) تليها عكس التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق من هيدروكلوريد أتيبمازول 1 مجم / كجم (أنتيسيدان، زويتيس، أستراليا). تم إبقاء الفئران دافئة و يتم مراقبته حتى التعافي الكامل من التخدير.
جهاز توصيل LV-MP في خزانة أمان بيولوجية. يمكن رؤية محور Luer الرمادي الفاتح لأنبوب ET بارزًا من الفم ويتم إدخال طرف الجل للماصة الموضحة في الصورة من خلال أنبوب ET إلى العمق المطلوب في القصبة الهوائية.
بعد أسبوع واحد من إجراء جرعات LV-MP، قُتلت الحيوانات بطريقة إنسانية عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون بنسبة 100٪ وتم تقييم التعبير عن LacZ باستخدام علاج X-gal القياسي لدينا. تمت إزالة الحلقات الثلاث الغضروفية الأكثر ذنبًا للتأكد من عدم تضمين أي ضرر ميكانيكي أو احتباس السوائل من وضع أنبوب القصبة الهوائية في التحليل. تم قطع كل قصبة هوائية طوليًا لإنشاء نصفين للتحليل، وتم تثبيتهما في طبق يحتوي على مطاط السيليكون (Sylgard، Dow Inc) باستخدام إبرة Minutien (أدوات العلوم الدقيقة) لتصور السطح اللمعي. تم تأكيد توزيع ونمط الخلايا المحولة من خلال التصوير الأمامي باستخدام مجهر نيكون (SMZ1500) مع كاميرا DigiLite وبرنامج TCapture (Tucsen Photonics، الصين). تم الحصول على الصور بتكبير 20x (بما في ذلك أعلى إعداد لعرض القصبة الهوائية بالكامل)، مع تصوير طول القصبة الهوائية بالكامل خطوة بخطوة، مما يضمن تداخلًا كافيًا بين كل صورة للسماح بـ "خياطة" الصورة. تم بعد ذلك تجميع الصور من كل القصبة الهوائية في صورة مركبة واحدة باستخدام محرر الصور المركبة الإصدار 2.0.3 (Microsoft Research) باستخدام خوارزمية الحركة المستوية. تم تحديد مناطق تعبير LacZ في الصور المركبة للقصبة الهوائية من كل حيوان باستخدام برنامج MATLAB النصي الآلي (R2020a، MathWorks) كما هو موضح سابقًا، باستخدام إعدادات 0.35
تم تضمين كل القصبة الهوائية في البارافين وتم قطع أقسام 5 ميكرومتر. تم صبغ الأقسام باللون الأحمر السريع المحايد لمدة 5 دقائق وتم الحصول على الصور باستخدام مجهر Nikon Eclipse E400 وكاميرا DS-Fi3 وبرنامج التقاط العناصر NIS (الإصدار 5.20.00).
تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية في GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). وتم ضبط الأهمية الإحصائية عند p ≤ 0.05. وتم التحقق من الحالة الطبيعية باستخدام اختبار Shapiro-Wilk، وتم تقييم الاختلافات في تلطيخ LacZ باستخدام اختبار t غير المقترن.
تم فحص الجسيمات الست الموضحة في الجدول 1 باستخدام PCXI، وتم وصف الرؤية في الجدول 2. لم يكن اثنان من الجسيمات المغناطيس المصنوعة من البوليسترين (MP1 وMP2؛ 18 ميكرومتر و0.25 ميكرومتر على التوالي) مرئيين تحت PCXI، ولكن تم التعرف على بقية العينات (تظهر الأمثلة في الشكل 5). كانت الجسيمات المغناطيس 3 وMP4 (10-15% Fe3O4؛ 0.25 ميكرومتر و0.9 ميكرومتر على التوالي) مرئية بشكل خافت. وعلى الرغم من احتوائها على بعض أصغر الجسيمات التي تم اختبارها، إلا أن الجسيمات المغناطيس 5 (98% Fe3O4؛ 0.25 ميكرومتر) كانت الأكثر وضوحًا. يصعب اكتشاف منتج CombiMag MP6. وفي جميع الحالات، تم تعزيز قدرتنا على اكتشاف الجسيمات المغناطيس بشكل كبير عن طريق نقل المغناطيس ذهابًا وإيابًا بالتوازي مع الشعيرات الدموية. وعندما ابتعدت المغناطيسات عن الشعيرات الدموية، امتدت الجسيمات في سلاسل طويلة، ولكن مع اقتراب المغناطيسات وتباعد الجسيمات المغناطيسة، تزداد قوة المجال، وتقصر خيوط الجسيمات مع انتقال الجسيمات نحو السطح العلوي للشعيرة (انظر الفيديو التكميلي S1: MP4)، مما يؤدي إلى زيادة كثافة الجسيمات على السطح. وعلى العكس من ذلك، عندما تتم إزالة المغناطيس من الشعيرة، تنخفض قوة المجال وتعيد جزيئات المادة المغناطيسية ترتيبها في خيوط طويلة تمتد من السطح العلوي للشعيرة (انظر الفيديو التكميلي S2: MP4). بعد توقف المغناطيس عن الحركة، تستمر الجسيمات في الحركة لفترة قصيرة بعد الوصول إلى وضع التوازن. وبينما تتحرك جزيئات المادة المغناطيسية نحو السطح العلوي للشعيرة وبعيدًا عنه، تسحب الجسيمات المغناطيسية عادةً الحطام عبر السائل.
تختلف رؤية MP تحت PCXI بشكل كبير بين العينات. (أ) MP3، (ب) MP4، (ج) MP5 و (د) MP6. تم التقاط جميع الصور المعروضة هنا بمغناطيس يقع على بعد 10 مم تقريبًا فوق الشعيرات الدموية مباشرة. الدوائر الكبيرة الظاهرة عبارة عن فقاعات هواء محاصرة في الشعيرات الدموية، مما يُظهر بوضوح ميزات الحافة بالأبيض والأسود لتصوير التباين الطوري. يحتوي المربع الأحمر على التكبير المعزز للتباين. لاحظ أن أقطار مخططات المغناطيس في جميع الأشكال ليست وفقًا للمقياس وهي أكبر بحوالي 100 مرة من الموضحة.
عندما ينتقل المغناطيس إلى اليسار واليمين على طول الجزء العلوي من الشعيرة، تتغير زاوية سلسلة MP لتتوافق مع المغناطيس (انظر الشكل 6)، وبالتالي تحديد خطوط المجال المغناطيسي. بالنسبة لـ MP3-5، بعد أن يصل الوتر إلى زاوية عتبة، يتم سحب الجسيمات على طول السطح العلوي للشعيرة. غالبًا ما يؤدي هذا إلى تجمع MPs في مجموعات أكبر بالقرب من المكان الذي يكون فيه المجال المغناطيسي أقوى (انظر الفيديو التكميلي S3:MP5). هذا واضح أيضًا بشكل خاص عند التصوير بالقرب من نهاية الشعيرة، مما يتسبب في تجمع MPs وتركيزها عند واجهة السائل والهواء. لم يتم سحب الجسيمات في MP6، والتي كانت أكثر صعوبة في التمييز من MP3-5، أثناء تحرك المغناطيس على طول الشعيرة، ولكن سلاسل MP انفصلت، تاركة الجسيمات في مجال الرؤية (انظر الفيديو التكميلي S4:MP6). في بعض الحالات، عندما تم تقليل المجال المغناطيسي المطبق عن طريق تحريك المغناطيس لمسافة كبيرة من موقع التصوير، نزلت أي MPs متبقية ببطء إلى السطح السفلي للأنبوب بفعل الجاذبية مع بقائها في سلسلة (انظر الفيديو التكميلي S5: MP3).
تتغير زاوية سلسلة MP مع انتقال المغناطيس إلى اليمين فوق الشعيرات الدموية. (أ) MP3، (ب) MP4، (ج) MP5 و(د) MP6. يحتوي المربع الأحمر على التكبير المعزز للتباين. لاحظ أن مقاطع الفيديو التكميلية مفيدة لأنها تكشف عن بنية الجسيمات المهمة والمعلومات الديناميكية التي لا يمكن تصورها في هذه الصور الثابتة.
أظهرت اختباراتنا أن تحريك المغناطيس ببطء ذهابًا وإيابًا على طول القصبة الهوائية يسهل تصور MP في سياق الحركة المعقدة في الجسم الحي. لم يتم إجراء الاختبار في الجسم الحي لأن حبيبات البوليسترين (MP1 وMP2) لم تكن مرئية في الشعيرات الدموية. تم اختبار كل من MPs الأربعة المتبقية في الجسم الحي مع تكوين المحور الطويل للمغناطيس فوق القصبة الهوائية بزاوية حوالي 30 درجة إلى الوضع الرأسي (انظر الشكلين 2 ب و 3 أ)، حيث أدى ذلك إلى سلاسل MP أطول وكان أكثر فعالية من تكوين المغناطيس المنتهي. لم يتم الكشف عن MP3 و MP4 و MP6 في القصبة الهوائية لأي حيوانات حية. عندما تم تصوير مجاري الهواء للفئران بعد قتل الحيوانات بإنسانية، ظلت الجسيمات غير مرئية حتى عند إضافة حجم إضافي باستخدام مضخة حقنة. كان لدى MP5 أعلى محتوى من أكسيد الحديد وكان الجسيم المرئي الوحيد، وبالتالي تم استخدامه لتقييم ووصف سلوك MP في الجسم الحي.
أدى وضع المغناطيس فوق القصبة الهوائية أثناء توصيل MP إلى تركيز العديد من MPs، ولكن ليس كلها، في مجال الرؤية. يمكن ملاحظة الجسيمات التي تدخل القصبة الهوائية بشكل أفضل في الحيوانات التي يتم التضحية بها إنسانيًا. يوضح الشكل 7 والفيديو التكميلي S6: MP5 التقاطًا مغناطيسيًا سريعًا ومحاذاة الجسيمات على سطح القصبة الهوائية البطنية، مما يشير إلى أنه يمكن توجيه MPs إلى المناطق المرغوبة في القصبة الهوائية. عند البحث بشكل أبعد على طول القصبة الهوائية بعد توصيل MP، تم العثور على بعض MPs أقرب إلى الكارينا، مما يشير إلى أن قوة المجال المغناطيسي كانت غير كافية لجمع جميع MPs والاحتفاظ بها، حيث تم توصيلها من خلال منطقة أقصى قوة مجال مغناطيسي أثناء عملية السوائل. ومع ذلك، كانت تركيزات MP بعد الولادة أعلى حول المنطقة المصورة، مما يشير إلى أن العديد من MPs ظلت في مناطق مجرى الهواء حيث كانت قوة المجال المغناطيسي المطبقة هي الأعلى.
الصور من (أ) قبل و (ب) بعد توصيل MP5 إلى القصبة الهوائية لفأر تم إعدامه مؤخرًا مع وضع المغناطيس مباشرة فوق منطقة التصوير. تقع المنطقة المصورة بين حلقتي الغضروف. قبل توصيل MP، يوجد بعض السوائل في مجرى الهواء. يحتوي المربع الأحمر على التكبير المعزز للتباين. هذه الصور من الفيديو الموضح في الفيديو التكميلي S6:MP5.
أدى نقل المغناطيس على طول القصبة الهوائية في الجسم الحي إلى تغيير زاوية سلسلة MP داخل سطح مجرى الهواء بطريقة مماثلة لتلك التي شوهدت في الشعيرات الدموية (انظر الشكل 8 والفيديو التكميلي S7: MP5). ومع ذلك، في دراستنا، لم يكن من الممكن سحب MPs على طول سطح مجرى الهواء الحي كما هو الحال مع الشعيرات الدموية. في بعض الحالات، ستصبح سلسلة MP أطول مع تحرك المغناطيس إلى اليسار واليمين. ومن المثير للاهتمام أننا وجدنا أيضًا أن سلسلة الجسيمات يبدو أنها تغير عمق طبقة السائل السطحية عندما يتم تحريك المغناطيس طوليًا على طول القصبة الهوائية، وتتمدد عندما يتم تحريك المغناطيس مباشرة فوق الرأس وتدوير سلسلة الجسيمات إلى وضع رأسي (انظر الفيديو التكميلي S7). :MP5 عند 0:09، أسفل اليمين). تغير نمط الحركة المميز عندما تم نقل المغناطيس عبر الجزء العلوي من القصبة الهوائية بشكل جانبي (أي إلى اليسار أو اليمين من الحيوان بدلاً من طول القصبة الهوائية). كانت الجسيمات لا تزال مرئية بوضوح أثناء تحركها، ولكن عندما تمت إزالة المغناطيس من القصبة الهوائية، أصبحت أطراف خيوط الجسيمات مرئية (انظر الفيديو التكميلي S8:MP5، بدءًا من 0:08). وهذا يتفق مع سلوك MP الذي لاحظناه تحت مجال مغناطيسي مطبق في شعيرية زجاجية.
صور توضيحية توضح MP5 في القصبة الهوائية لفأر حي مخدر. (أ) يتم استخدام المغناطيس لالتقاط الصور أعلى القصبة الهوائية وإلى يسارها، ثم (ب) بعد ذلك يتم تحريك المغناطيس إلى اليمين. يحتوي المربع الأحمر على التكبير المعزز للتباين. هذه الصور من الفيديو الموضح في الفيديو التكميلي S7:MP5.
عندما تم تكوين القطبين في اتجاه الشمال والجنوب أعلى وأسفل القصبة الهوائية (أي الجذب؛ الشكل 3ب)، ظهرت أوتار MP أطول وكانت تقع على الجدار الجانبي للقصبة الهوائية بدلاً من السطح الظهري للقصبة الهوائية (انظر الفيديو التكميلي S9:MP5). ومع ذلك، لم يتم الكشف عن تركيزات عالية من الجسيمات في موقع واحد (أي السطح الظهري للقصبة الهوائية) بعد توصيل السوائل عند استخدام جهاز ثنائي المغناطيس، وهو ما يحدث عادةً عند استخدام جهاز أحادي المغناطيس. ثم عندما تم تكوين مغناطيس واحد لصد القطبين معكوسين (الشكل 3ج)، لم يظهر أن عدد الجسيمات المرئية في مجال الرؤية قد زاد بعد التوصيل. يعد إعداد كلا التكوينين ثنائيي المغناطيس أمرًا صعبًا بسبب قوى المجال المغناطيسي العالية التي تسحب أو تدفع المغناطيسات على التوالي. تم بعد ذلك تغيير الإعداد إلى مغناطيس واحد موازٍ للمجرى الهوائي ولكنه يمر عبر المجرى الهوائي بزاوية 90 درجة بحيث تعبر خطوط المجال جدار القصبة الهوائية بشكل عمودي (الشكل 3د)، وهو اتجاه مصمم لتحديد ما إذا كان من الممكن ملاحظة تجمع الجسيمات على الجدار الجانبي. ومع ذلك، في هذا التكوين، لم تكن هناك حركة يمكن التعرف عليها لتراكم MP أو حركة المغناطيس. بناءً على كل هذه النتائج، تم اختيار تكوين اتجاه مغناطيس واحد بزاوية 30 درجة (الشكل 3أ) لدراسات حاملات الجينات الحية.
عند تصوير الحيوان بشكل متكرر بعد قتله بوحشية، أدى غياب حركة الأنسجة المربكة إلى إمكانية تمييز خطوط جسيمات أدق وأقصر في المجال الغضروفي الواضح، وهي خطوط "متذبذبة" تتماشى مع الحركة الانتقالية للمغناطيس. ومع ذلك، لا يزال من غير الممكن رؤية وجود جسيمات MP6 وحركتها بوضوح.
كان عيار LV-LacZ هو 1.8 × 108 وحدة حرارية/مل، وبعد الخلط بنسبة 1:1 مع CombiMag MP (MP6)، تلقت الحيوانات جرعة قصبية 50 ميكرولتر من 9 × 107 وحدة حرارية/مل من مركبة البطين الأيسر (أي 4.5 × 106 وحدة حرارية/فأر). في هذه الدراسات، بدلاً من نقل المغناطيس أثناء المخاض، قمنا بتثبيت المغناطيس في موضع واحد لتحديد ما إذا كان يمكن تحسين نقل البطين الأيسر (أ) مقارنة بتوصيل الناقل في حالة عدم وجود مجال مغناطيسي، و(ب) يمكن تركيزه. يتم نقل خلايا مجرى الهواء إلى مناطق مستهدفة مغناطيسية في مجرى الهواء العلوي.
لم يبدو أن وجود المغناطيس واستخدام CombiMag مع متجهات البطين الأيسر له آثار ضارة على صحة الحيوان، كما هو الحال مع بروتوكول توصيل متجه البطين الأيسر القياسي لدينا. أشارت الصور الأمامية لمنطقة القصبة الهوائية المعرضة للاضطراب الميكانيكي (الشكل التكميلي 1) إلى وجود مستويات أعلى بشكل ملحوظ من التحويل في مجموعة الحيوانات المعالجة بـ LV-MP عندما كان المغناطيس موجودًا (الشكل 9أ). لم يكن هناك سوى كمية صغيرة من صبغة LacZ الزرقاء في المجموعة الضابطة (الشكل 9ب). أظهر تحديد كمية المناطق الملطخة بـ X-Gal الطبيعية أن إعطاء LV-MP في وجود مجال مغناطيسي أدى إلى تحسن بنحو 6 أضعاف (الشكل 9ج).
صور مركبة نموذجية توضح انتقال القصبة الهوائية بواسطة LV-MP (أ) في وجود مجال مغناطيسي و(ب) في غياب المغناطيس. (ج) تحسن كبير إحصائيًا في منطقة انتقال LacZ الطبيعية داخل القصبة الهوائية عند استخدام المغناطيس (*p = 0.029، اختبار t، n = 3 لكل مجموعة، متوسط ± SEM).
أظهرت المقاطع السريعة المحايدة الملطخة باللون الأحمر (المثال الموضح في الشكل التكميلي 2) أن الخلايا الملطخة بـ LacZ موجودة في نمط وموقع مماثل لما تم الإبلاغ عنه سابقًا.
يظل التحدي الرئيسي لعلاج الجينات في مجرى الهواء هو تحديد الموقع الدقيق لجسيمات الناقل في مناطق الاهتمام وتحقيق مستويات عالية من كفاءة النقل في الرئة المتحركة في وجود تدفق الهواء وتطهير المخاط النشط. بالنسبة لحاملي البطين الأيسر المصممين لعلاج مرض مجرى الهواء التليف الكيسي، فإن زيادة وقت إقامة جسيمات الناقل داخل مجاري الهواء الموصلة كان هدفًا بعيد المنال حتى الآن. وكما أشار كاستيلاني وآخرون، فإن استخدام المجالات المغناطيسية لتحسين النقل له مزايا مقارنة بطرق توصيل الجينات الأخرى مثل الكهرومسام، حيث يمكن أن يجمع بين البساطة والفعالية من حيث التكلفة وتحديد موقع التسليم وزيادة الكفاءة وأوقات الحضانة الأقصر، وربما جرعة ناقل أصغر10. ومع ذلك، لم يتم وصف ترسب الجسيمات المغناطيسية وسلوكها في الجسم الحي في مجاري الهواء تحت تأثير القوى المغناطيسية الخارجية، ولم يتم إثبات جدوى هذه الطريقة في الجسم الحي لتعزيز مستويات التعبير الجيني في مجاري الهواء الحية السليمة.
أظهرت تجاربنا في المسرع السنكروتروني PCXI في المختبر أن جميع الجسيمات التي اختبرناها، باستثناء البوليسترين MP، كانت مرئية في إعدادات التصوير التي استخدمناها. في وجود مجال مغناطيسي، تشكل MPs سلاسل أطوالها مرتبطة بنوع الجسيم وقوة المجال المغناطيسي (أي القرب وحركة المغناطيس). كما هو موضح في الشكل 10، فإن الأوتار التي نلاحظها تتشكل بسبب مغناطيسية كل جسيم فردي وتحريضه لمجاله المغناطيسي المحلي الخاص. تتسبب هذه المجالات المنفصلة في تجمع جسيمات أخرى مماثلة وتوصيلها، مع حركات تشبه سلسلة المجموعة بسبب القوى المحلية من قوى الجذب والتنافر المحلية للجسيمات الأخرى.
مخطط يوضح (أ، ب) قطارات الجسيمات المتولدة داخل الشعيرات الدموية المملوءة بالسوائل و (ج، د) القصبة الهوائية المملوءة بالهواء. لاحظ أن الشعيرات الدموية والقصبة الهوائية غير مرسومة حسب المقياس. تحتوي اللوحة (أ) أيضًا على وصف لـ MP، الذي يحتوي على جزيئات Fe3O4 مرتبة في سلاسل.
عندما تم تحريك المغناطيس فوق الشعيرة، وصلت زاوية سلسلة الجسيمات إلى عتبة حرجة لـ MP3-5 التي تحتوي على Fe3O4، وبعد ذلك لم تعد سلسلة الجسيمات في الموضع الأصلي، بل تحركت على طول السطح إلى موضع جديد. المغناطيس. من المرجح أن يحدث هذا التأثير لأن سطح الشعيرة الزجاجية أملس بما يكفي للسماح بحدوث هذه الحركة. ومن المثير للاهتمام أن MP6 (CombiMag) لم يتصرف بهذه الطريقة، ربما لأن الجسيمات كانت أصغر حجمًا، أو كانت لها طبقات أو شحنات سطحية مختلفة، أو أن سائل ناقل خاص أثر على قدرتها على الحركة. كما أن تباين صورة جسيمات CombiMag أضعف، مما يشير إلى أن السائل والجسيمات قد يكون لها كثافات متشابهة وبالتالي لا تتحرك بسهولة تجاه بعضها البعض. يمكن أن تتعطل الجسيمات أيضًا إذا تحرك المغناطيس بسرعة كبيرة، مما يشير إلى أن قوة المجال المغناطيسي لا يمكنها دائمًا التغلب على الاحتكاك بين الجسيمات في السائل، مما يشير إلى أنه ربما ليس من المستغرب أن تكون قوة المجال المغناطيسي والمسافة بين المغناطيس ومنطقة الهدف مهمة جدًا. تشير هذه النتائج معًا أيضًا إلى أنه في حين أن المغناطيس يمكنه التقاط العديد من MPs وبما أن الجسيمات المغناطيسية التي تتدفق عبر المنطقة المستهدفة، فمن غير المرجح أن يتم الاعتماد على المغناطيس لتحريك جزيئات CombiMag على طول سطح القصبة الهوائية. لذلك، نستنتج أن دراسات LV-MP في الجسم الحي يجب أن تستخدم مجالات مغناطيسية ثابتة لاستهداف مناطق محددة من شجرة مجرى الهواء فعليًا.
عندما يتم توصيل الجسيمات إلى الجسم، يصعب تحديدها في سياق أنسجة الجسم المتحركة المعقدة، ولكن تم تعزيز القدرة على اكتشافها عن طريق ترجمة المغناطيس أفقيًا فوق القصبة الهوائية "لتحريك" خيوط MP. وعلى الرغم من إمكانية التصوير المباشر، إلا أنه من الأسهل تمييز حركة الجسيمات بمجرد قتل الحيوان بطريقة إنسانية. كانت تركيزات MP أعلى بشكل عام في هذا الموقع عندما تم وضع المغناطيس فوق منطقة التصوير، على الرغم من أن بعض الجسيمات تم العثور عليها عادةً على طول القصبة الهوائية. وعلى النقيض من الدراسات المختبرية، لا يمكن سحب الجسيمات على طول القصبة الهوائية عن طريق ترجمة المغناطيس. يتوافق هذا الاكتشاف مع الطريقة التي تعالج بها المخاط الذي يغطي سطح القصبة الهوائية الجسيمات المستنشقة عادةً، وتحبسها في المخاط ثم يتم إزالتها بواسطة آلية التطهير المخاطي.
افترضنا أن استخدام المغناطيس للجذب فوق القصبة الهوائية وتحتها (الشكل 3ب) قد يؤدي إلى مجال مغناطيسي أكثر انتظامًا، بدلاً من مجال مغناطيسي شديد التركيز في نقطة واحدة، مما قد يؤدي إلى توزيع أكثر انتظامًا للجسيمات. ومع ذلك، لم تجد دراستنا الأولية دليلاً واضحًا يدعم هذه الفرضية. وبالمثل، فإن تكوين زوج من المغناطيسات للتنافر (الشكل 3ج) لم يؤد إلى ترسب المزيد من الجسيمات في المنطقة المصورة. توضح هاتان النتيجتان أن إعداد المغناطيس المزدوج لا يحسن بشكل كبير التحكم المحلي في استهداف MP، وأن القوى المغناطيسية القوية الناتجة يصعب تكوينها، مما يجعل هذا النهج أقل عملية. وبالمثل، فإن توجيه المغناطيس فوق القصبة الهوائية ومن خلالها (الشكل 3د) لم يزيد أيضًا من عدد الجسيمات المحتجزة في المنطقة المصورة. قد لا تكون بعض هذه التكوينات البديلة ناجحة لأنها تؤدي إلى انخفاض قوى المجال المغناطيسي داخل منطقة الترسيب. لذلك، يعتبر تكوين المغناطيس بزاوية 30 درجة واحدة (الشكل 3أ) هو الأسهل و الطريقة الأكثر فعالية لإجراء الاختبارات داخل الجسم الحي.
أظهرت دراسة LV-MP أنه عندما تم دمج متجهات LV مع CombiMag وتوصيلها بعد اضطراب فيزيائي في وجود مجال مغناطيسي، زادت مستويات النقل بشكل كبير في القصبة الهوائية مقارنة بالضوابط. واستنادًا إلى دراسات التصوير السنكروتروني ونتائج LacZ، كان المجال المغناطيسي قادرًا على ما يبدو على الحفاظ على LV داخل القصبة الهوائية وتقليل عدد جزيئات الناقل التي اخترقت على الفور عميقًا في الرئة. وقد تؤدي مثل هذه التحسينات في الاستهداف إلى فعالية أعلى مع تقليل العيارات المسلمة، والتوصيل خارج الهدف، والآثار الجانبية الالتهابية والمناعية، وتكاليف حامل الجينات. والأهم من ذلك، وفقًا للشركة المصنعة، يمكن استخدام CombiMag بالتزامن مع طرق نقل الجينات الأخرى، بما في ذلك مع ناقلات فيروسية أخرى (مثل AAV) والأحماض النووية.
وقت النشر: ١٦ يوليو ٢٠٢٢
