نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
ينبغي أن تستهدف النواقل الجينية لعلاج مرض التليف الكيسي الرئوي المسالك الهوائية الموصلة، لأن النقل الجيني في محيط الرئة لا يُحقق فائدة علاجية. ترتبط كفاءة النقل الفيروسي ارتباطًا مباشرًا بفترة بقاء الناقل. ومع ذلك، تنتشر سوائل التوصيل، مثل نواقل الجينات، بشكل طبيعي في الحويصلات الهوائية أثناء الشهيق، ويتم التخلص من الجسيمات العلاجية، مهما كان شكلها، بسرعة عن طريق النقل المخاطي الهدبي. يُعد إطالة فترة بقاء نواقل الجينات في المسالك الهوائية أمرًا مهمًا ولكنه صعب التحقيق. يمكن للجسيمات المغناطيسية المرتبطة بنواقل الجينات، والتي يمكن توجيهها إلى سطح المسالك الهوائية، تحسين الاستهداف الموضعي. نظرًا لتحديات التصوير الحيوي، فإن سلوك هذه الجسيمات المغناطيسية الصغيرة على سطح المسالك الهوائية في وجود مجال مغناطيسي مطبق لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام التصوير السنكروتروني لتصوير الحركة الحيوية لسلسلة من الجسيمات المغناطيسية في القصبة الهوائية للفئران المخدرة لدراسة ديناميكيات وأنماط سلوك الجسيمات الفردية والجماعية في الجسم الحي. ثم قمنا أيضًا بتقييم ما إذا كان توصيل الفيروسات البطيئة المغناطيسية تزيد الجسيمات المغناطيسية في وجود مجال مغناطيسي من كفاءة نقل الإشارة في قصبة الفئران. يكشف التصوير بالأشعة السينية السنكروترونية سلوك الجسيمات المغناطيسية في مجالات مغناطيسية ثابتة ومتحركة في المختبر وفي الجسم الحي. لا يمكن سحب الجسيمات بسهولة على سطح مجرى الهواء الحي باستخدام المغناطيس، ولكن أثناء النقل، تتركز الرواسب في مجال الرؤية حيث يكون المجال المغناطيسي في أقوى حالاته. كما زادت كفاءة نقل الإشارة ستة أضعاف عند إيصال الجسيمات المغناطيسية الفيروسية البطيئة في وجود مجال مغناطيسي. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن الجسيمات المغناطيسية الفيروسية البطيئة والمجالات المغناطيسية قد تكون أساليب قيّمة لتحسين استهداف ناقلات الجينات وزيادة مستويات نقل الإشارة في مجاري الهواء الموصلة في الجسم الحي.
ينجم التليف الكيسي عن خلل في جين واحد يُسمى منظم التوصيل عبر الغشاء في التليف الكيسي (CFTR). بروتين CFTR هو قناة أيونية موجودة في العديد من الخلايا الظهارية في جميع أنحاء الجسم، بما في ذلك المسالك الهوائية، وهي موقع رئيسي في نشأة التليف الكيسي. تؤدي عيوب CFTR إلى اضطراب نقل الماء، مما يُسبب جفاف سطح المسالك الهوائية وتقليل عمق طبقة السائل السطحي للمسالك الهوائية (ASL). كما يُضعف هذا قدرة نظام النقل المخاطي الهدبي (MCT) على إزالة الجزيئات المُستنشقة ومسببات الأمراض من المسالك الهوائية. هدفنا هو تطوير علاج جيني باستخدام الفيروسات البطيئة (LV) لإيصال النسخة الصحيحة من جين CFTR وتحسين ASL وMCT وصحة الرئة، ومواصلة تطوير تقنيات جديدة قادرة على قياس هذه المعايير في الجسم الحي.
تُعدّ النواقل الفيروسية البطيئة (LV) من أبرز المرشحين للعلاج الجيني لمجرى الهواء في التليف الكيسي، ويعود ذلك أساسًا إلى قدرتها على دمج الجين العلاجي بشكل دائم في الخلايا القاعدية لمجرى الهواء (الخلايا الجذعية لمجرى الهواء). وهذا أمر بالغ الأهمية لأنها تُعيد الترطيب الطبيعي وإزالة المخاط عن طريق تمايزها إلى خلايا سطحية وظيفية لمجرى الهواء مرتبطة بالتليف الكيسي، مُعدّلة جينيًا، مما يُؤدي إلى فوائد طويلة الأمد. يجب توجيه النواقل الفيروسية البطيئة نحو مجرى الهواء الموصل، حيث يبدأ مرض الرئة في التليف الكيسي. قد يُؤدي إيصال الناقل إلى أعماق الرئة إلى نقل الجينات إلى الحويصلات الهوائية، ولكن هذا لا يُحقق فائدة علاجية في التليف الكيسي. مع ذلك، تنتقل السوائل، مثل نواقل الجينات، بشكل طبيعي إلى الحويصلات الهوائية عند الشهيق بعد الإيصال، ويتم التخلص من الجسيمات العلاجية بسرعة إلى تجويف الفم عن طريق نقل المخاط. ترتبط كفاءة نقل الجينات بواسطة النواقل الفيروسية البطيئة ارتباطًا مباشرًا بمدة بقاء الناقل بجوار الخلايا المستهدفة للسماح بامتصاصها الخلوي - "مدة الإقامة" - والتي يُمكن تقليلها بسهولة عن طريق تدفق الهواء الإقليمي المعتاد، بالإضافة إلى التقاط المخاط المُنسق للجسيمات ونقل المخاط. بالنسبة للتليف الكيسي، تُعدّ القدرة على إن إطالة فترة بقاء الفيروس البطيء داخل مجرى الهواء أمر مهم لتحقيق مستويات عالية من النقل في هذه المنطقة، ولكنه كان يمثل تحديًا حتى الآن.
للتغلب على هذه العقبة، نقترح أن الجسيمات المغناطيسية ذات الحجم المنخفض (LP) قد تساعد بطريقتين متكاملتين. أولاً، يمكن توجيهها مغناطيسيًا إلى سطح مجرى الهواء لتحسين الاستهداف ومساعدة جسيمات حامل الجينات على الاستقرار في منطقة مجرى الهواء المطلوبة؛ وثانيًا، يمكن توجيهها مغناطيسيًا إلى طبقة الخلايا 6. وقد استُخدمت الجسيمات المغناطيسية على نطاق واسع كناقلات لتوصيل الأدوية الموجهة عندما ترتبط بالأجسام المضادة أو الأدوية الكيميائية أو الجزيئات الصغيرة الأخرى التي تلتصق بأغشية الخلايا أو ترتبط بمستقبلات سطح الخلية ذات الصلة وتتراكم في مواقع الورم في وجود الكهرباء الساكنة. المجالات المغناطيسية لعلاج السرطان 7. تهدف تقنيات "فرط الحرارة" الأخرى إلى تسخين الجسيمات المغناطيسية عند تعرضها لمجالات مغناطيسية متذبذبة، مما يؤدي إلى تدمير الخلايا السرطانية. يُستخدم مبدأ النقل المغناطيسي، الذي يُستخدم فيه المجال المغناطيسي كعامل نقل لتعزيز نقل الحمض النووي إلى الخلايا، بشكل شائع في المختبر باستخدام مجموعة من نواقل الجينات الفيروسية وغير الفيروسية لسلالات الخلايا التي يصعب نقل الجينات إليها. وقد ثبتت فعالية النقل المغناطيسي باستخدام الفيروسات البطيئة، حيث أدى توصيل الجسيمات المغناطيسية الحاملة للفيروسات البطيئة في المختبر إلى سلالة خلايا ظهارية قصبية بشرية في وجود مجال مغناطيسي ثابت إلى زيادة كفاءة النقل بمقدار 186 ضعفًا مقارنةً بالناقل الفيروسي البطيء وحده. كما طُبقت الجسيمات المغناطيسية الحاملة للفيروسات البطيئة على نموذج التليف الكيسي في المختبر، حيث زاد النقل المغناطيسي من نقل الفيروسات البطيئة في مزارع واجهة الهواء والسائل بمقدار 20 ضعفًا في وجود بلغم التليف الكيسي. ومع ذلك، لم يحظَ النقل المغناطيسي للأعضاء في الجسم الحي إلا باهتمام ضئيل نسبيًا، ولم يُقيّم إلا في عدد قليل من الحيوانات. أظهرت الدراسات 11، 12، 13، 14، 15، وخاصة في الرئتين 16، 17، أن فرص النقل المغناطيسي في علاج التليف الكيسي الرئوي واضحة. وذكر تان وآخرون (2020) أن "دراسة إثبات المفهوم لتوصيل الجسيمات النانوية المغناطيسية الفعالة إلى الرئة ستمهد الطريق لاستراتيجيات استنشاق CFTR المستقبلية لتحسين النتائج السريرية لدى مرضى التليف الكيسي" 6.
يُعدّ سلوك الجسيمات المغناطيسية الصغيرة على أسطح المسالك الهوائية في وجود مجال مغناطيسي مطبق أمرًا صعبًا من حيث التصوير والدراسة، وبالتالي فهو غير مفهوم بشكل كافٍ. في دراسات أخرى، طوّرنا طريقة تصوير بالأشعة السينية تعتمد على انتشار السنكروترون وتباين الطور (PB-PCXI) لتصوير وتحديد التغيرات الدقيقة في عمق طبقة السائل المبطن للمسالك الهوائية (ASL) وسلوك الجسيمات المغناطيسية (MCT) في الجسم الحي بطريقة غير جراحية، وذلك لقياس ترطيب سطح القناة الغازية بشكل مباشر، واستخدامها كمؤشر مبكر لفعالية العلاج. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم طريقة تقييم الجسيمات المغناطيسية (MCT) لدينا جسيمات بقطر 10-35 ميكرومتر مصنوعة من الألومينا أو الزجاج ذي معامل الانكسار العالي كعلامات للجسيمات المغناطيسية (MCT) يمكن رؤيتها باستخدام PB-PCXI. كلتا التقنيتين مناسبتان لتصوير مجموعة متنوعة من أنواع الجسيمات، بما في ذلك الجسيمات المغناطيسية الدقيقة (MP).
بفضل دقتها المكانية والزمانية العالية، تُعد تقنيات تحليل ASL وMCT القائمة على PB-PCXI مناسبة تمامًا لدراسة ديناميكيات وأنماط سلوك الجسيمات المفردة والجماعية في الجسم الحي، مما يساعدنا على فهم وتحسين تقنيات توصيل الجينات باستخدام الجسيمات الدقيقة. ويستند النهج الذي نستخدمه هنا إلى دراساتنا التي أجريناها باستخدام خط شعاع SPring-8 BL20B2، حيث قمنا بتصوير حركة السوائل بعد توصيل جرعة وهمية من ناقل الجينات إلى المسالك الهوائية الأنفية والرئوية للفئران، وذلك للمساعدة في تفسير أنماط التعبير الجيني غير المنتظمة التي لاحظناها في دراساتنا الحيوانية لجرعة ناقل الجينات 3،4.
هدفت هذه الدراسة إلى استخدام جهاز PB-PCXI المتزامن لتصوير حركة مجموعة من الجسيمات الدقيقة داخل القصبة الهوائية للفئران الحية. صُممت دراسات التصوير هذه لاختبار نطاق واسع من الجسيمات الدقيقة، وقوة المجال المغناطيسي، والمواقع، لتحديد تأثيرها على حركة الجسيمات الدقيقة. افترضنا أن تطبيق مجال مغناطيسي خارجي سيساعد الجسيمات الدقيقة على البقاء أو الانتقال إلى المنطقة المستهدفة. كما سمحت لنا هذه الدراسات بتحديد تكوينات مغناطيسية تزيد من عدد الجسيمات المحتجزة في القصبة الهوائية بعد الترسيب. في سلسلة ثانية من الدراسات، سعينا إلى استخدام هذا التكوين الأمثل لتوضيح نمط التحويل الناتج عن توصيل الجسيمات الدقيقة منخفضة التردد إلى مجرى الهواء للفئران، بناءً على افتراض أن توصيل هذه الجسيمات في سياق استهداف مجرى الهواء سيؤدي إلى تحسين كفاءة التحويل.
أُجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة أديلايد (M-2019-060 و M-2020-022) ولجنة أخلاقيات الحيوان في SPring-8 Synchrotron. أُجريت التجارب وفقًا لإرشادات ARRIVE.
أُجريت جميع عمليات التصوير بالأشعة السينية على خط شعاع BL20XU في مسرع الجسيمات SPring-8 في اليابان، باستخدام إعداد مشابه لما وُصف سابقًا^21،22. باختصار، وُضع صندوق التجربة على بُعد 245 مترًا من حلقة تخزين السنكروترون. استُخدمت مسافة 0.6 متر بين العينة والكاشف لدراسات تصوير الجسيمات، و0.3 متر لدراسات التصوير الحيوي لتوليد تأثيرات تباين الطور. استُخدمت طاقة شعاع أحادي اللون تبلغ 25 كيلو إلكترون فولت. التُقطت الصور باستخدام مُحوِّل أشعة سينية عالي الدقة (SPring-8 BM3) مُقترن بكاشف sCMOS. يُحوِّل المُحوِّل الأشعة السينية إلى ضوء مرئي باستخدام مُضَخِّم بسمك 10 ميكرومتر (Gd3Al2Ga3O12)، والذي يُوجَّه بعد ذلك إلى مستشعر sCMOS باستخدام عدسة مجهرية ×10 (NA 0.3). كان كاشف sCMOS من نوع Orca-Flash4.0 (Hamamatsu). تم استخدام جهاز (من شركة فوتونيكس، اليابان) بمصفوفة حجمها 2048 × 2048 بكسل، وحجم بكسل خام يبلغ 6.5 × 6.5 ميكرومتر. يوفر هذا الإعداد حجم بكسل متساوي الخواص فعال يبلغ 0.51 ميكرومتر، ومجال رؤية يبلغ حوالي 1.1 × 1.1 مليمتر. تم اختيار مدة تعريض تبلغ 100 مللي ثانية لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء للجسيمات المغناطيسية داخل وخارج مجرى الهواء إلى أقصى حد، مع تقليل التشوهات الناتجة عن حركة التنفس. في الدراسات الحية، وُضع مصراع سريع للأشعة السينية في مسار الأشعة السينية للحد من جرعة الإشعاع عن طريق حجب شعاع الأشعة السينية بين عمليات التعريض.
لم يتم استخدام حامل LV في أي من دراسات التصوير SPring-8 PB-PCXI لأن حجرة التصوير BL20XU ليست معتمدة من المستوى 2 للسلامة البيولوجية. بدلاً من ذلك، اخترنا مجموعة من الجسيمات الدقيقة الموصوفة جيدًا من موردين تجاريين - تغطي مجموعة من الأحجام والمواد وتركيزات الحديد والتطبيقات - أولاً لفهم كيفية تأثير المجالات المغناطيسية على حركة الجسيمات الدقيقة داخل الشعيرات الدموية الزجاجية، ثم في المسالك الهوائية الحية. على السطح. تتراوح أحجام الجسيمات المغناطيسية الدقيقة من 0.25 إلى 18 ميكرومتر، وهي مصنوعة من مواد متنوعة (انظر الجدول 1)، ولكن تركيبة كل عينة، بما في ذلك حجم الجسيمات المغناطيسية داخلها، غير معروفة. بناءً على دراساتنا المكثفة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب متعدد الفوتونات (MCT) 19، 20، 21، 23، 24، نتوقع أن تُرى جسيمات مغناطيسية دقيقة بحجم 5 ميكرومتر على سطح مجرى الهواء الرغامي، على سبيل المثال عن طريق طرح إطارات متتالية لتحسين وضوح حركة الجسيمات المغناطيسية الدقيقة. يُعد حجم جسيم مغناطيسي دقيق واحد يبلغ 0.25 ميكرومتر أصغر من دقة جهاز التصوير، ولكن من المتوقع أن يكشف جهاز PB-PCXI عن تباين حجمها وحركة السائل السطحي الذي تترسب عليه بعد الترسيب.
تم تحضير عينات لكل جسيم دقيق في الجدول 1 في أنابيب شعرية زجاجية سعة 20 ميكرولتر (Drummond Microcaps، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية) بقطر داخلي 0.63 مم. تتوفر الجسيمات الحُبيبية في الماء، بينما تتوفر جسيمات CombiMag في سائل خاص بالشركة المصنعة. يُملأ كل أنبوب حتى نصفه بالسائل (حوالي 11 ميكرولتر) ويوضع على حامل العينة (انظر الشكل 1). وُضعت الأنابيب الشعرية الزجاجية أفقيًا على منصة العينة في صندوق التصوير، بحيث تُحاذي حواف السائل. تم توصيل مغناطيس نيوديميوم حديد بورون (NdFeB) ذي غلاف من النيكل بقطر 19 مم (طول 28 مم) (N35، رقم الكتالوج LM1652، Jaycar Electronics، أستراليا) بقوة مغناطيسية متبقية تبلغ 1.17 تسلا بمنصة تحريك منفصلة لتغيير موضعه عن بُعد أثناء التصوير. يبدأ التقاط صور الأشعة السينية عندما يكون المغناطيس على بُعد 30 مم تقريبًا فوق يتم أخذ العينة، ويتم الحصول على الصور بمعدل 4 إطارات في الثانية. أثناء التصوير، تم تقريب المغناطيس من الأنبوب الشعري الزجاجي (على بعد حوالي 1 مم) ثم تم تحريكه على طول الأنبوب لتقييم تأثيرات قوة المجال وموضعه.
إعداد تصوير في المختبر يحتوي على عينات MP في أنابيب شعرية زجاجية على منصة تحريك العينة xy. مسار شعاع الأشعة السينية محدد بخط متقطع أحمر.
بعد التأكد من إمكانية رؤية الجسيمات الدقيقة في المختبر، تم اختبار مجموعة فرعية منها في الجسم الحي على إناث فئران ويستار البيضاء من النوع البري (عمرها حوالي 12 أسبوعًا، ووزنها حوالي 200 غرام). تم تخدير الفئران بمزيج من هذه المواد عن طريق الحقن داخل الصفاق. بعد التخدير، تم تحضيرها للتصوير بإزالة الفراء المحيط بالقصبة الهوائية، وإدخال أنبوب رغامي (قنية وريدية قياس 16، تيرومو بي سي تي)، وتثبيتها في وضعية الاستلقاء على لوحة تصوير مصممة خصيصًا تحتوي على كيس حراري للحفاظ على درجة حرارة الجسم. ثم تم تثبيت لوحة التصوير على منصة تحريك العينة في صندوق التصوير بزاوية طفيفة لمحاذاة القصبة الهوائية. أفقيًا في صورة الأشعة السينية، كما هو موضح في الشكل 2أ.
(أ) إعداد التصوير الحيوي في صندوق التصوير SPring-8، مسار شعاع الأشعة السينية مُحدد بخط أحمر متقطع. (ب، ج) تم تحديد موضع المغناطيس على القصبة الهوائية عن بُعد باستخدام كاميرتين IP مثبتتين بشكل متعامد. على الجانب الأيسر من صورة الشاشة، يمكن رؤية حلقة السلك التي تثبت الرأس، وقنية التوصيل في مكانها داخل أنبوب التنفس.
تم توصيل نظام مضخة حقن يتم التحكم فيه عن بُعد (UMP2، شركة World Precision Instruments، ساراسوتا، فلوريدا) باستخدام محقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر بأنبوب PE10 (قطر خارجي 0.61 مم، قطر داخلي 0.28 مم) عبر إبرة قياس 30. يجب وضع علامة على الأنبوب للتأكد من أن طرفه في الموضع الصحيح داخل القصبة الهوائية عند إدخال أنبوب التنفس. باستخدام المضخة الدقيقة، تم سحب مكبس المحقنة بينما كان طرف الأنبوب مغمورًا في عينة المجال المغناطيسي المراد توصيلها. ثم تم إدخال أنبوب التوصيل المحمل في أنبوب التنفس، مع وضع الطرف داخل أقوى جزء من المجال المغناطيسي المتوقع تطبيقه. تم التحكم في عملية التقاط الصور باستخدام كاشف تنفس متصل بصندوق توقيت قائم على أردوينو، وتم تسجيل جميع الإشارات (مثل درجة الحرارة، والتنفس، وفتح/إغلاق الغالق، والتقاط الصور) باستخدام برنامجي Powerlab وLabChart (شركة AD Instruments، سيدني، أستراليا). عند التصوير، في حال تعذر الوصول إلى الحاوية، تم استخدام جهازي تصوير بالرنين المغناطيسي. تم وضع الكاميرات (Panasonic BB-SC382) بزاوية 90 درجة تقريبًا بالنسبة لبعضها البعض، واستُخدمت لمراقبة موضع المغناطيس بالنسبة للقصبة الهوائية أثناء التصوير (الشكل 2ب، ج). ولتقليل تشوهات الحركة، تم التقاط صورة واحدة لكل نفس خلال مرحلة استقرار تدفق نهاية الزفير.
يُثبَّت مغناطيس على مرحلة ثانية يمكن وضعها عن بُعد من خارج غلاف التصوير. تم اختبار أوضاع وتكوينات مغناطيسية مختلفة، منها: التثبيت بزاوية 30 درجة تقريبًا فوق القصبة الهوائية (كما هو موضح في الشكلين 2أ و3أ)؛ مغناطيس واحد فوق الحيوان والآخر أسفله، مع ضبط الأقطاب للتجاذب (الشكل 3ب)؛ مغناطيس واحد فوق الحيوان والآخر أسفله، مع ضبط الأقطاب للتنافر (الشكل 3ج)؛ ومغناطيس واحد فوق القصبة الهوائية وعمودي عليها (الشكل 3د). بعد ضبط الحيوان والمغناطيس، وتحميل الميكروسكوب المراد اختباره في مضخة الحقن، يتم حقن جرعة 50 ميكرولتر بمعدل 4 ميكرولتر/ثانية مع التقاط الصور. ثم يُحرَّك المغناطيس ذهابًا وإيابًا على طول القصبة الهوائية أو جانبيًا عبرها مع الاستمرار في التقاط الصور.
تكوين المغناطيس للتصوير الحيوي: (أ) مغناطيس واحد فوق القصبة الهوائية بزاوية 30 درجة تقريبًا، (ب) مغناطيسين مضبوطان للتجاذب، (ج) مغناطيسين مضبوطان للتنافر، (د) مغناطيس واحد فوق القصبة الهوائية وعمودي عليها. نظر الفاحص من الفم إلى الرئتين عبر القصبة الهوائية، ومرّ شعاع الأشعة السينية عبر الجانب الأيسر للفأر وخرج من الجانب الأيمن. يُحرّك المغناطيس إما على طول مجرى الهواء أو يمينًا ويسارًا فوق القصبة الهوائية في اتجاه شعاع الأشعة السينية.
سعينا أيضًا إلى تحديد مدى وضوح الجسيمات وسلوكها في المسالك الهوائية في غياب حركة التنفس والقلب. ولذلك، في نهاية فترة التصوير، تم قتل الحيوانات بطريقة رحيمة نتيجة جرعة زائدة من البنتوباربيتال (سومنوبنتيل، بيتمان-مور، واشنطن كروسينغ، الولايات المتحدة الأمريكية؛ حوالي 65 ملغم/كغم عن طريق الحقن داخل الصفاق). تُركت بعض الحيوانات على منصة التصوير، وبمجرد توقف التنفس ونبض القلب، أُعيدت عملية التصوير، مع إضافة جرعة إضافية من الجسيمات الدقيقة إذا لم تكن مرئية على سطح المسالك الهوائية.
تم تصحيح الصور الملتقطة باستخدام تصحيح المجال المسطح والمجال المظلم، ثم تم تجميعها في فيلم (20 إطارًا في الثانية؛ 15-25 × السرعة العادية اعتمادًا على معدل التنفس) باستخدام برنامج نصي مخصص مكتوب بلغة MATLAB (R2020a، The Mathworks).
أُجريت جميع دراسات توصيل ناقلات الجينات LV في مرفق أبحاث حيوانات المختبر بجامعة أديلايد، وهدفت إلى استخدام نتائج تجربة SPring-8 لتقييم ما إذا كان توصيل LV-MP في وجود مجال مغناطيسي يمكن أن يعزز نقل الجينات في الجسم الحي. ولتقييم تأثيرات MP والمجال المغناطيسي، عُولجت مجموعتان من الحيوانات: أُعطيت إحدى المجموعتين LV-MP مع وضع مغناطيس، بينما تلقت المجموعة الأخرى مجموعة تحكم مع LV-MP بدون مغناطيس.
تم توليد نواقل جينات LV باستخدام الطرق الموصوفة سابقًا 25، 26. يعبر ناقل LacZ عن جين بيتا-جالاكتوزيداز الموجود في النواة تحت سيطرة محفز MPSV التكويني (LV-LacZ)، والذي ينتج عنه ناتج تفاعل أزرق اللون في الخلايا المحولة، يظهر في واجهات أنسجة الرئة ومقاطع الأنسجة. أُجريت المعايرة في مزارع الخلايا عن طريق العد اليدوي لعدد الخلايا الموجبة لـ LacZ باستخدام عداد خلايا الدم لحساب العيار بوحدة TU/مل. تُحفظ الحوامل بالتجميد عند -80 درجة مئوية، وتُذاب قبل الاستخدام، وتُربط بـ CombiMag عن طريق الخلط بنسبة 1:1 والحضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التسليم.
تم تخدير فئران سلالة سبريج داولي الطبيعية (ن = 3/مجموعة، ~2-3 أشهر) عن طريق الحقن داخل الصفاق بمزيج من 0.4 ملغ/كغ من ميديتوميدين (دوميتور، إيليوم، أستراليا) و60 ملغ/كغ من كيتامين (إيلوم، أستراليا) عن طريق الفم غير الجراحي باستخدام قنية وريدية قياس 16. ولضمان وصول إشارات نقل الفوتون البطيء إلى نسيج مجرى الهواء الرغامي، تم تحضيره باستخدام بروتوكول التحفيز الميكانيكي الموصوف سابقًا، حيث تم فرك سطح مجرى الهواء الرغامي محوريًا بسلة سلكية (N-Circle، مستخرج أحجار نيتينول بدون طرف NTSE-022115) -UDH، كوك ميديكال، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 30 ثانية. ثم تم إعطاء الفوتون البطيء-ميديتوميدين عن طريق القصبة الهوائية في خزانة السلامة البيولوجية بعد حوالي 10 دقائق من التحفيز.
تم ضبط المجال المغناطيسي المستخدم في هذه التجربة بطريقة مشابهة لدراسة التصوير بالأشعة السينية في الجسم الحي، حيث تم تثبيت نفس المغناطيسات فوق القصبة الهوائية باستخدام مشابك دعامة التقطير (الشكل 4). تم حقن 50 ميكرولتر (2 × 25 ميكرولتر) من LV-MP في القصبة الهوائية (ن = 3 حيوانات) باستخدام ماصة ذات طرف هلامي كما هو موضح سابقًا. تلقت مجموعة ضابطة (ن = 3 حيوانات) نفس LV-MPs بدون استخدام مغناطيس. بعد اكتمال الحقن، تم إزالة القنية من أنبوب التنفس وتم فصل الحيوان عن جهاز التنفس. بقي المغناطيس في مكانه لمدة 10 دقائق، ثم تمت إزالته. تلقت الفئران جرعة تحت الجلد من ميلوكسيكام (1 مل/كجم) (إيليوم، أستراليا) متبوعة بعكس التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق بـ 1 ملجم/كجم من هيدروكلوريد أتيبمازول (أنتيسيدان، زويتيس، أستراليا). تم الحفاظ على دفء الفئران ومراقبتها حتى اكتمال التعافي من التخدير.
جهاز توصيل LV-MP في خزانة السلامة البيولوجية. يمكن رؤية محور Luer الرمادي الفاتح لأنبوب ET بارزًا من الفم، ويتم إدخال طرف الجل الخاص بالماصة الموضحة في الصورة من خلال أنبوب ET إلى العمق المطلوب في القصبة الهوائية.
بعد أسبوع من إجراء جرعة LV-MP، تم قتل الحيوانات بطريقة رحيمة عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون بنسبة 100%، وتم تقييم تعبير LacZ باستخدام معالجة X-gal القياسية لدينا. أُزيلت الحلقات الغضروفية الثلاث الأخيرة لضمان عدم تضمين أي تلف ميكانيكي أو احتباس سوائل ناتج عن وضع أنبوب التنفس في التحليل. قُطعت كل قصبة هوائية طوليًا لإنشاء نصفين للتحليل، ووُضعت في طبق يحتوي على مطاط السيليكون (Sylgard، Dow Inc) باستخدام إبرة Minutien (Fine Science Tools) لتصوير السطح الداخلي. تم تأكيد توزيع ونمط الخلايا المحولة بواسطة التصوير الأمامي باستخدام مجهر Nikon (SMZ1500) مزود بكاميرا DigiLite وبرنامج TCapture (Tucsen Photonics، الصين). تم الحصول على الصور بتكبير 20x (بما في ذلك أعلى إعداد لعرض القصبة الهوائية بالكامل)، مع تصوير طول القصبة الهوائية بالكامل خطوة بخطوة، مما يضمن تداخلًا كافيًا بين كل صورة. للسماح بدمج الصور، جُمعت صور كل قصبة هوائية في صورة مركبة واحدة باستخدام برنامج Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) باستخدام خوارزمية الحركة المستوية. حُددت مساحات التعبير عن جين LacZ في الصور المركبة للقصبة الهوائية لكل حيوان باستخدام برنامج MATLAB آلي (R2020a، MathWorks) كما وُصف سابقًا، باستخدام الإعدادات التالية: 0.35 < Hue < 0.58، Saturation > 0.15، وValue < 0.7. من خلال تتبع محيط النسيج، أُنشئ قناع يدويًا في برنامج GIMP v2.10.24 لكل صورة مركبة لتحديد منطقة النسيج ومنع أي اكتشافات خاطئة من خارج نسيج القصبة الهوائية. جُمعت المساحات المصبوغة من جميع الصور المركبة لكل حيوان لحساب إجمالي المساحة المصبوغة لذلك الحيوان. ثم قُسمت المساحة المصبوغة على إجمالي مساحة القناع لحساب المساحة المعيارية.
تم تضمين كل قصبة هوائية في البارافين وتم تقطيع مقاطع بسمك 5 ميكرومتر. تم تلوين المقاطع بشكل معاكس باللون الأحمر المحايد السريع لمدة 5 دقائق وتم الحصول على الصور باستخدام مجهر Nikon Eclipse E400 وكاميرا DS-Fi3 وبرنامج التقاط العناصر NIS (الإصدار 5.20.00).
تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية في برنامج GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). تم تحديد الدلالة الإحصائية عند p ≤ 0.05. تم التحقق من التوزيع الطبيعي باستخدام اختبار Shapiro-Wilk، وتم تقييم الاختلافات في تلوين LacZ باستخدام اختبار t غير المقترن.
تم فحص الجسيمات الدقيقة الستة الموضحة في الجدول 1 باستخدام تقنية PCXI، ويُبين الجدول 2 مدى وضوحها. لم تكن جسيمتان دقيقتان من البوليسترين (MP1 وMP2؛ 18 ميكرومتر و0.25 ميكرومتر على التوالي) مرئيتين تحت تأثير PCXI، بينما كانت بقية العينات قابلة للتمييز (أمثلة موضحة في الشكل 5). كانت الجسيمتان MP3 وMP4 (10-15% Fe3O4؛ 0.25 ميكرومتر و0.9 ميكرومتر على التوالي) مرئيتين بشكل خافت. على الرغم من احتوائها على بعض أصغر الجسيمات المختبرة، كانت الجسيمة MP5 (98% Fe3O4؛ 0.25 ميكرومتر) هي الأكثر وضوحًا. يصعب رصد منتج CombiMag، MP6. في جميع الحالات، تحسنت قدرتنا على اكتشاف الجسيمات الدقيقة بشكل ملحوظ بتحريك المغناطيس ذهابًا وإيابًا بالتوازي مع الأنبوب الشعري. عندما ابتعدت المغناطيسات عن الأنبوب الشعري، امتدت الجسيمات في سلاسل طويلة، ولكن مع اقتراب المغناطيسات وازدياد شدة المجال المغناطيسي، أصبحت الجسيمات غير مرئية. مع ازدياد شدة المجال المغناطيسي، تقصر سلاسل الجسيمات أثناء هجرة الجسيمات نحو السطح العلوي للأنبوب الشعري (انظر الفيديو التكميلي S1: MP4)، مما يزيد من كثافة الجسيمات على السطح. وعلى العكس، عند إزالة المغناطيس من الأنبوب الشعري، تنخفض شدة المجال المغناطيسي، وتعيد الجسيمات المغناطيسية ترتيب نفسها في سلاسل طويلة تمتد من السطح العلوي للأنبوب الشعري (انظر الفيديو التكميلي S2: MP4). بعد توقف المغناطيس عن الحركة، تستمر الجسيمات في التحرك لفترة وجيزة بعد وصولها إلى وضع التوازن. وبينما تتحرك الجسيمات المغناطيسية باتجاه السطح العلوي للأنبوب الشعري وبعيدًا عنه، فإنها عادةً ما تسحب الحطام عبر السائل.
تختلف وضوحية MP تحت تأثير PCXI اختلافًا كبيرًا بين العينات. (أ) MP3، (ب) MP4، (ج) MP5، و(د) MP6. جميع الصور المعروضة هنا التُقطت باستخدام مغناطيس موضوع على بُعد 10 مم تقريبًا فوق الأنبوب الشعري مباشرةً. الدوائر الكبيرة الظاهرة هي فقاعات هواء محصورة في الأنابيب الشعرية، تُظهر بوضوح ملامح الحواف بالأبيض والأسود لتصوير تباين الطور. يحتوي المربع الأحمر على التكبير المُحسِّن للتباين. تجدر الإشارة إلى أن أقطار مخططات المغناطيس في جميع الأشكال ليست متناسبة مع المقياس، وهي أكبر بحوالي 100 مرة من الموضحة.
مع تحريك المغناطيس يمينًا ويسارًا على طول الجزء العلوي من الأنبوب الشعري، تتغير زاوية سلسلة الجسيمات المغناطيسية لتتماشى مع المغناطيس (انظر الشكل 6)، مما يُحدد خطوط المجال المغناطيسي. بالنسبة للجسيمات من MP3 إلى MP5، بعد أن يصل الوتر إلى زاوية عتبة معينة، تُسحب الجسيمات على طول السطح العلوي للأنبوب الشعري. غالبًا ما يؤدي هذا إلى تجمع الجسيمات المغناطيسية في مجموعات أكبر بالقرب من المنطقة التي يكون فيها المجال المغناطيسي أقوى (انظر الفيديو التكميلي S3: MP5). ويتضح هذا بشكل خاص عند التصوير بالقرب من نهاية الأنبوب الشعري، مما يتسبب في تجمع الجسيمات المغناطيسية وتركزها عند سطح التماس بين السائل والهواء. أما الجسيمات في MP6، والتي كان من الصعب تمييزها مقارنةً بالجسيمات من MP3 إلى MP5، فلم تُسحب مع تحرك المغناطيس على طول الأنبوب الشعري، ولكن سلاسل الجسيمات المغناطيسية تفككت، تاركةً الجسيمات في مجال الرؤية (انظر الفيديو التكميلي S4: MP6). في بعض الحالات، عندما تم تقليل المجال المغناطيسي المُطبق عن طريق تحريك المغناطيس مسافة كبيرة من موقع التصوير، نزلت أي جسيمات مغناطيسية متبقية ببطء إلى السطح السفلي للأنبوب بفعل الجاذبية بينما بقيت في السلسلة (انظر الفيديو التكميلي S5: MP3).
تتغير زاوية سلسلة الجسيمات المغناطيسية عند تحريك المغناطيس إلى اليمين فوق الأنبوب الشعري. (أ) MP3، (ب) MP4، (ج) MP5، و(د) MP6. يحتوي المربع الأحمر على تكبير لتحسين التباين. تجدر الإشارة إلى أن مقاطع الفيديو التكميلية مفيدة لأنها تكشف عن بنية الجسيمات المهمة ومعلومات ديناميكية لا يمكن رؤيتها في هذه الصور الثابتة.
أظهرت اختباراتنا أن تحريك المغناطيس ببطء ذهابًا وإيابًا على طول القصبة الهوائية يُسهّل رؤية الجسيمات الدقيقة في سياق حركتها المعقدة داخل الجسم الحي. لم تُجرَ اختبارات داخل الجسم الحي لأن حبيبات البوليسترين (MP1 وMP2) لم تكن مرئية في الأنبوب الشعري. تم اختبار كل من الجسيمات الدقيقة الأربعة المتبقية داخل الجسم الحي مع توجيه المحور الطويل للمغناطيس فوق القصبة الهوائية بزاوية 30 درجة تقريبًا عن الوضع الرأسي (انظر الشكلين 2ب و3أ)، حيث أدى ذلك إلى سلاسل أطول من الجسيمات الدقيقة وكان أكثر فعالية من وضع المغناطيس المغلق. لم يتم الكشف عن الجسيمات الدقيقة MP3 وMP4 وMP6 في قصبة أي من الحيوانات الحية. عند تصوير مجاري الهواء للفئران بعد قتلها بطريقة رحيمة، ظلت الجسيمات غير مرئية حتى عند إضافة حجم إضافي باستخدام مضخة حقن. احتوى MP5 على أعلى نسبة من أكسيد الحديد وكان الجسيم المرئي الوحيد، ولذلك استُخدم لتقييم وتوصيف سلوك الجسيمات الدقيقة داخل الجسم الحي.
أدى وضع المغناطيس فوق القصبة الهوائية أثناء إيصال الجسيمات الدقيقة إلى تركيز العديد من هذه الجسيمات، وليس جميعها، في مجال الرؤية. وتُلاحظ الجسيمات الداخلة إلى القصبة الهوائية بشكل أفضل في الحيوانات التي تم التضحية بها بطريقة رحيمة. يوضح الشكل 7 والفيديو التكميلي S6: MP5 التقاطًا مغناطيسيًا سريعًا ومحاذاة للجسيمات على سطح القصبة الهوائية البطنية، مما يشير إلى إمكانية توجيه الجسيمات الدقيقة إلى المناطق المطلوبة من القصبة الهوائية. عند البحث في مناطق أبعد على طول القصبة الهوائية بعد إيصال الجسيمات الدقيقة، وُجدت بعض الجسيمات أقرب إلى نقطة تفرع القصبة الهوائية، مما يوحي بأن قوة المجال المغناطيسي لم تكن كافية لجمع جميع الجسيمات الدقيقة والاحتفاظ بها، حيث تم إيصالها عبر منطقة أقصى قوة للمجال المغناطيسي أثناء عملية إيصال السائل. ومع ذلك، كانت تركيزات الجسيمات الدقيقة بعد الولادة أعلى حول المنطقة المصورة، مما يشير إلى أن العديد من الجسيمات الدقيقة بقيت في مناطق مجرى الهواء حيث كانت قوة المجال المغناطيسي المطبقة في أعلى مستوياتها.
صور من (أ) قبل و(ب) بعد إدخال مادة MP5 إلى القصبة الهوائية لفأر تم قتله حديثًا، مع وضع المغناطيس مباشرة فوق منطقة التصوير. تقع منطقة التصوير بين حلقتي الغضروف. قبل إدخال المادة، يوجد بعض السائل في مجرى الهواء. يحتوي المربع الأحمر على التكبير المُحسِّن للتباين. هذه الصور مأخوذة من الفيديو المعروض في الفيديو التكميلي S6:MP5.
أدى تحريك المغناطيس على طول القصبة الهوائية داخل الجسم الحي إلى تغيير زاوية سلسلة الجسيمات الدقيقة داخل سطح مجرى الهواء بطريقة مشابهة لتلك التي تُرى في الشعيرات الدموية (انظر الشكل 8 والفيديو التكميلي S7:MP5). مع ذلك، في دراستنا، لم يكن من الممكن سحب الجسيمات الدقيقة على طول سطح مجرى الهواء الحي كما هو الحال مع الشعيرات الدموية. في بعض الحالات، تزداد سلسلة الجسيمات الدقيقة طولًا مع تحرك المغناطيس يمينًا ويسارًا. ومن المثير للاهتمام، أننا وجدنا أيضًا أن سلسلة الجسيمات تُغير عمق طبقة السائل السطحي عند تحريك المغناطيس طوليًا على طول القصبة الهوائية، وتتمدد عند تحريك المغناطيس مباشرة فوق الرأس وتدوير سلسلة الجسيمات إلى وضع رأسي (انظر الفيديو التكميلي S7). (انظر الفيديو التكميلي S8:MP5، عند الدقيقة 0:09، أسفل اليمين). تغير نمط الحركة المميز عند تحريك المغناطيس جانبيًا عبر الجزء العلوي من القصبة الهوائية (أي إلى يسار أو يمين الحيوان بدلًا من تحريكه على طول القصبة الهوائية). ظلت الجسيمات مرئية بوضوح أثناء حركتها، ولكن عند إزالة المغناطيس من القصبة الهوائية، أصبحت أطراف خيوط الجسيمات مرئية (انظر الفيديو التكميلي S8:MP5، بدءًا من الدقيقة 0:08). يتوافق هذا مع سلوك الجسيمات المغناطيسية الذي لاحظناه تحت تأثير مجال مغناطيسي مطبق في أنبوب شعري زجاجي.
صور توضيحية تُظهر وجود المغناطيس MP5 في القصبة الهوائية لفأر حي مُخدَّر. (أ) يُستخدم المغناطيس لالتقاط صور أعلى القصبة الهوائية وإلى يسارها، ثم (ب) بعد تحريك المغناطيس إلى اليمين. يحتوي المربع الأحمر على تكبير لتحسين التباين. هذه الصور مأخوذة من الفيديو المعروض في الفيديو التكميلي S7:MP5.
عندما وُضِعَ القطبان في اتجاه شمال-جنوب أعلى وأسفل القصبة الهوائية (أي في اتجاه التجاذب؛ الشكل 3ب)، بدت أوتار الجسيمات المغناطيسية أطول، وظهرت على الجدار الجانبي للقصبة الهوائية بدلاً من سطحها الظهري (انظر الفيديو التكميلي S9:MP5). مع ذلك، لم تُكتشف تراكيز عالية من الجسيمات في موقع واحد (أي السطح الظهري للقصبة الهوائية) بعد ضخ السائل عند استخدام جهاز مغناطيسي مزدوج، وهو ما يحدث عادةً عند استخدام جهاز مغناطيسي أحادي. ثم عندما وُضِعَ أحد المغناطيسين في اتجاه تنافر مع عكس القطبين (الشكل 3ج)، لم يظهر ازدياد في عدد الجسيمات المرئية في مجال الرؤية بعد الضخ. يُعدّ إعداد كلا التكوينين المغناطيسيين المزدوجين أمرًا صعبًا نظرًا لشدة المجال المغناطيسي العالية التي تجذب أو تدفع المغناطيسين، على التوالي. بعد ذلك، تم تغيير الإعداد إلى مغناطيس واحد موازٍ للمجرى الهوائي، ولكنه يمر عبره بزاوية 90 درجة، بحيث تتقاطع خطوط المجال مع جدار القصبة الهوائية بشكل متعامد. (الشكل 3د)، وهو توجيه مصمم لتحديد ما إذا كان من الممكن ملاحظة تجمع الجسيمات على الجدار الجانبي. ومع ذلك، في هذا التكوين، لم تكن هناك حركة ملحوظة لتراكم الجسيمات الدقيقة أو حركة المغناطيس. بناءً على كل هذه النتائج، تم اختيار تكوين توجيه أحادي المغناطيس بزاوية 30 درجة (الشكل 3أ) لدراسات ناقلات الجينات في الجسم الحي.
عندما تم تصوير الحيوان بشكل متكرر مباشرة بعد قتله بطريقة رحيمة، أدى غياب حركة الأنسجة المربكة إلى إمكانية تمييز خطوط جسيمات أدق وأقصر في المجال الغضروفي الواضح، متذبذبة بما يتماشى مع الحركة الانتقالية للمغناطيس. ومع ذلك، لا يزال من غير الممكن رؤية وجود جسيمات MP6 وحركتها بوضوح.
بلغ تركيز LV-LacZ 1.8 × 10⁸ وحدة ناقلة/مل، وبعد مزجه بنسبة 1:1 مع CombiMag MP (MP6)، تلقت الحيوانات جرعة رغامية مقدارها 50 ميكرولتر من ناقل LV بتركيز 9 × 10⁷ وحدة ناقلة/مل (أي 4.5 × 10⁶ وحدة ناقلة/جرذ). في هذه الدراسات، بدلاً من تحريك المغناطيس أثناء المخاض، قمنا بتثبيته في موضع واحد لتحديد ما إذا كان نقل LV (أ) يمكن تحسينه مقارنةً بتوصيل الناقل في غياب المجال المغناطيسي، و(ب) يمكن تركيزه. يتم نقل خلايا مجرى الهواء إلى مناطق مستهدفة مغناطيسية في مجرى الهواء العلوي.
لم يظهر أن وجود المغناطيس واستخدام CombiMag مع نواقل LV له آثار سلبية على صحة الحيوانات، كما هو الحال مع بروتوكول توصيل نواقل LV القياسي لدينا. أشارت الصور الأمامية لمنطقة القصبة الهوائية المعرضة للاضطراب الميكانيكي (الشكل التكميلي 1) إلى وجود مستويات أعلى بكثير من النقل في مجموعة الحيوانات المعالجة بـ LV-MP عند وجود المغناطيس (الشكل 9أ). وُجدت كمية ضئيلة فقط من صبغة LacZ الزرقاء في المجموعة الضابطة (الشكل 9ب). أظهر قياس مساحات X-Gal المصبوغة المعيارية أن إعطاء LV-MP في وجود مجال مغناطيسي أدى إلى تحسن بمقدار 6 أضعاف تقريبًا (الشكل 9ج).
صور مركبة مثال توضح نقل الإشارة في القصبة الهوائية بواسطة LV-MP (أ) في وجود مجال مغناطيسي و (ب) في غياب المغناطيس. (ج) تحسن ذو دلالة إحصائية في مساحة نقل الإشارة LacZ المعيارية داخل القصبة الهوائية عند استخدام المغناطيس (*p = 0.029، اختبار t، n = 3 لكل مجموعة، المتوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط).
أظهرت المقاطع المصبوغة باللون الأحمر السريع المحايد (مثال موضح في الشكل التكميلي 2) خلايا مصبوغة بـ LacZ موجودة بنمط وموقع مماثلين لما تم الإبلاغ عنه سابقًا.
لا يزال التحدي الرئيسي في العلاج الجيني للمسالك الهوائية هو تحديد موقع الجسيمات الحاملة بدقة في المناطق المستهدفة، وتحقيق مستويات عالية من كفاءة النقل الجيني في الرئة المتحركة في ظل تدفق الهواء وإزالة المخاط النشطة. بالنسبة لحوامل الفيروسات البطيئة المصممة لعلاج أمراض المسالك الهوائية في التليف الكيسي، كان زيادة مدة بقاء الجسيمات الحاملة داخل المسالك الهوائية الموصلة هدفًا صعب المنال حتى الآن. وكما أشار كاستيلاني وآخرون، فإن استخدام المجالات المغناطيسية لتحسين النقل الجيني له مزايا مقارنة بطرق توصيل الجينات الأخرى مثل التثقيب الكهربائي، حيث يمكنه الجمع بين البساطة، والفعالية من حيث التكلفة، وتحديد موقع التوصيل، وزيادة الكفاءة، وتقصير فترات الحضانة، وربما استخدام جرعة حاملة أصغر. ومع ذلك، لم يتم وصف ترسب الجسيمات المغناطيسية وسلوكها في المسالك الهوائية تحت تأثير القوى المغناطيسية الخارجية، كما لم يتم إثبات جدوى هذه الطريقة في تعزيز مستويات التعبير الجيني في المسالك الهوائية الحية السليمة.
أظهرت تجاربنا المخبرية باستخدام مطياف الأشعة السينية المتزامنة (PCXI) أن جميع الجسيمات التي اختبرناها، باستثناء جسيمات البوليسترين الدقيقة، كانت مرئية في جهاز التصوير المستخدم. في وجود مجال مغناطيسي، تُشكّل الجسيمات الدقيقة سلاسل يتناسب طولها مع نوع الجسيم وشدة المجال المغناطيسي (أي قرب المغناطيس وحركته). وكما هو موضح في الشكل 10، تتشكل السلاسل التي نلاحظها نتيجةً لمغنطة كل جسيم على حدة، مما يُولّد مجاله المغناطيسي المحلي الخاص. وتتسبب هذه المجالات المنفصلة في تجمع الجسيمات المماثلة الأخرى وربطها، مُحدثةً حركات شبيهة بالسلاسل نتيجةً للقوى المحلية الناتجة عن قوى التجاذب والتنافر المحلية بين الجسيمات الأخرى.
رسم تخطيطي يوضح (أ، ب) سلاسل الجسيمات المتولدة داخل الأنابيب الشعرية المملوءة بالسوائل و(ج، د) القصبة الهوائية المملوءة بالهواء. لاحظ أن الأنابيب الشعرية والقصبة الهوائية ليست مرسومة وفقًا للمقياس. تحتوي اللوحة (أ) أيضًا على وصف للجسيمات الدقيقة، والتي تحتوي على جسيمات Fe3O4 مرتبة في سلاسل.
عند تحريك المغناطيس فوق الأنبوب الشعري، وصلت زاوية سلسلة الجسيمات إلى عتبة حرجة بالنسبة للجسيمات MP3-5 المحتوية على Fe3O4، وبعدها لم تعد سلسلة الجسيمات تبقى في موضعها الأصلي، بل تحركت على طول السطح إلى موضع جديد. من المرجح أن يحدث هذا التأثير لأن سطح الأنبوب الشعري الزجاجي أملس بما يكفي للسماح بهذه الحركة. ومن المثير للاهتمام أن الجسيمات MP6 (CombiMag) لم تتصرف بهذه الطريقة، ربما لأن الجسيمات كانت أصغر حجمًا، أو لها طبقات طلاء أو شحنات سطحية مختلفة، أو أن سائلًا حاملًا خاصًا أثر على قدرتها على الحركة. كما أن تباين صورة جسيمات CombiMag أضعف، مما يشير إلى أن السائل والجسيمات قد يكون لهما كثافات متشابهة، وبالتالي لا يتحركان بسهولة باتجاه بعضهما البعض. يمكن أن تعلق الجسيمات أيضًا إذا تحرك المغناطيس بسرعة كبيرة، مما يشير إلى أن قوة المجال المغناطيسي لا يمكنها دائمًا التغلب على الاحتكاك بين الجسيمات في السائل، مما يشير إلى أنه ربما ليس من المستغرب أن تكون قوة المجال المغناطيسي والمسافة بين المغناطيس والمنطقة المستهدفة مهمة للغاية. تشير هذه النتائج مجتمعة أيضًا إلى أنه على الرغم من قدرة المغناطيس على التقاط العديد من الجسيمات الدقيقة التي تتدفق عبره، في المنطقة المستهدفة، من غير المرجح الاعتماد على المغناطيس لتحريك جزيئات CombiMag على طول سطح القصبة الهوائية. لذلك، نستنتج أن دراسات LV-MP في الجسم الحي يجب أن تستخدم مجالات مغناطيسية ثابتة لاستهداف مناطق محددة من شجرة مجرى الهواء بشكل فعلي.
عند دخول الجسيمات إلى الجسم، يصعب تحديدها وسط حركة أنسجة الجسم المعقدة، ولكن تم تحسين القدرة على رصدها بتحريك المغناطيس أفقيًا فوق القصبة الهوائية لتحريك خيوط الجسيمات الدقيقة. ورغم إمكانية التصوير المباشر، إلا أنه من الأسهل تمييز حركة الجسيمات بعد قتل الحيوان بطريقة رحيمة. كانت تركيزات الجسيمات الدقيقة أعلى عمومًا في هذا الموقع عندما وُضع المغناطيس فوق منطقة التصوير، مع أن بعض الجسيمات وُجدت عادةً على امتداد القصبة الهوائية. وعلى عكس الدراسات المختبرية، لا يمكن سحب الجسيمات على طول القصبة الهوائية بتحريك المغناطيس. تتوافق هذه النتيجة مع كيفية معالجة المخاط الذي يغطي سطح القصبة الهوائية للجسيمات المستنشقة، حيث يحبسها في المخاط ثم يُزال بواسطة آلية التصفية المخاطية الهدبية.
افترضنا أن استخدام المغناطيسات للجذب أعلى وأسفل القصبة الهوائية (الشكل 3ب) قد يُؤدي إلى مجال مغناطيسي أكثر تجانسًا، بدلًا من مجال مغناطيسي مُركّز بشدة في نقطة واحدة، مما قد يُؤدي إلى توزيع أكثر تجانسًا للجسيمات. مع ذلك، لم تجد دراستنا الأولية دليلًا واضحًا يدعم هذه الفرضية. وبالمثل، لم يُؤدِّ ضبط زوج من المغناطيسات للتنافر (الشكل 3ج) إلى زيادة ترسب الجسيمات في المنطقة المصورة. تُوضح هاتان النتيجتان أن إعداد المغناطيس المزدوج لا يُحسِّن بشكل ملحوظ التحكم الموضعي في استهداف الجسيمات الدقيقة، وأن القوى المغناطيسية القوية الناتجة يصعب ضبطها، مما يجعل هذا النهج أقل عملية. وبالمثل، لم يُؤدِّ توجيه المغناطيس فوق القصبة الهوائية وعبرها (الشكل 3د) أيضًا إلى زيادة عدد الجسيمات المُحتفظ بها في المنطقة المصورة. قد لا تنجح بعض هذه التكوينات البديلة لأنها تُؤدي إلى انخفاض شدة المجال المغناطيسي داخل منطقة الترسب. لذلك، يُعتبر تكوين المغناطيس الواحد بزاوية 30 درجة (الشكل 3أ) الطريقة الأسهل والأكثر كفاءة. للاختبارات الحيوية.
أظهرت دراسة LV-MP أنه عند دمج نواقل LV مع CombiMag وإيصالها بعد تحفيزها فيزيائيًا في وجود مجال مغناطيسي، ارتفعت مستويات النقل الجيني بشكل ملحوظ في القصبة الهوائية مقارنةً بالمجموعات الضابطة. واستنادًا إلى دراسات التصوير السنكروتروني ونتائج LacZ، بدا أن المجال المغناطيسي قادر على الحفاظ على LV داخل القصبة الهوائية وتقليل عدد جزيئات الناقل التي تخترق الرئة بعمق. قد تؤدي هذه التحسينات في الاستهداف إلى فعالية أعلى مع تقليل تركيزات الفيروس المُوصَّل، والنقل الجيني خارج الهدف، والآثار الجانبية الالتهابية والمناعية، وتكاليف ناقل الجينات. والأهم من ذلك، وفقًا للشركة المصنعة، يمكن استخدام CombiMag بالتزامن مع طرق نقل الجينات الأخرى، بما في ذلك النواقل الفيروسية الأخرى (مثل AAV) والأحماض النووية.